Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции

Глухов, Александр Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции"

ПРАВИТЕЛЬСТВО МОСКВЫ

КОМИТЕТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Г. МОСКВЫ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ЭКОЛОГИИ

На правах рукописи

РГ6 ОД

УДК 577.213.32: 578. 825.13.

/ 6 ИЮЛ 1935

ГЛУХОВ Александр Иванович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ ДНК-ПОЛИМЕРАЗ ДЛЯ АНАЛИЗА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВИРУСНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук в виде научного доклада

Москва. 1998г.

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии и Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения.

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Е.С. Северин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

член корреспондент РАН и РАМН В.А. Ткачук

доктор биологических наук, профессор О.В. Евграфов

доктор биологических наук, профессор П.Г. Свешников

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 25 июня 1998 г. в и часов

на заседании Специализированного совета Д. 171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан"

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы

Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) произвело революционный переворот в молекулярной биологии и диагностике (Mullís К. et al. 1986). За открытие данного метода американский ученый Карл Мюллис был удостоен в 1993 году Нобелевской премии по химии.

Одной из важнейших проблем молекулярной биологии является проблема детекции малых количеств ДНК и РНК. Стандартные методы анализа нуклеиновых кислот либо очень трудоемки, либо требуют большого количества исследуемой ДНК или РНК. Открытие метода ПЦР дало в руки исследователей самый чувствительный метод анализа нуклеиновых кислот. С помощью данного метода даже из нескольких молекул ДНК можно получить необходимое количество копий ее специфического фрагмента. Использование гермостабильных ДНК-полимераз привело к возможности автоматизировать метод ПЦР (Sairi R.K. 1986, Krawets S.A. et al. 1989). Кроме того, было показано, что некоторые термостабильные ДНК-полимеразы обладают обратнотранскриптазной (ОТ) активностью (Tse W. Т., Forget B.G. 1990). Это свойство позволяет использовать данные ферменты для непосредственной детекции молекул РНК методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР) (Myers W. Th., Gelfand D.H. 1991), что решает ряд проблем, связанных с негативным влиянием вторичной структуры РНК на эффективность синтеза кДНК. Одной из первых была изучена Taq-полимераза, выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus YT1 (Каледин A.C. и соавт. 1980, Saiki R.K. et al. 1988). В настоящее время осуществлен и ведется поиск новых источников термостабильных ДНК-полимераз, обладающих рядом преимуществ по сравнению с Taq-полимеразой, например, более высокой термостабильностью, способностью амплифицировать участки ДНК большей протяженности, низкой частотой ошибок при синтезе, ярко выраженной ОТ-активностью (Francine В.Р. 1996).

В настоящее время амплификационная ДНК/РНК-диагностика основанная на методах ПЦР и ОТ/ПЦР, все шире и шире используется I лабораторной и медицинской практике. Основными преимуществами этой метода, делающими его незаменимым в диагностике, являются, как уж( отмечалось выше, высокая чувствительность, а также быстрота анализа (5-1( ч), позволяющая создавать тест-системы со специфичностью приближающейся к 100%.

В последнее время к проблемам распространения СПИД, инфекционны> гепатитов, герпетических инфекций, особоопасных инфекций (холера, чума) туберкулеза, стафилококковых инфекций и хламидиоза приковано само« пристальное внимание ученых и медиков. Однако нужно отметить, что быстро« выявление возбудителей данных заболеваний на сегодняшний день остаетс5 пока единственным реальным средством их профилактики. Таким образом разработка высокочувствительных тест-систем на основе ПЦР является одно? из важных задач современной науки и медицины.

Использование термостабильных ДНК-полимераз, способны* катализировать ОТ/ПЦР и позволяющих тем самым детектировать молекулк мРНК различных белковых факторов, является ключевым моментом в РНК-диагностике. В частности, анализ в клиническом материале мРНК СО^ рецептора, через который происходит инфицирование клеток вирусов иммунодефицита человека, вызывающего СПИД, а также мРНК ген; множественной лекарственной устойчивости (ЖЖ-1) может иметь важное значение с научной и медицинской точки зрения.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы состояла в отработке метода выделения и очисткъ термостабильной ТЛ ДНК-полимеразы из штамма термофильной бактерш-ТЬегтш &егторЫ1ш КТП и в использовании полученного гомогенной: препарата фермента для подбора оптимальных условий анализа ДНК методои-ПЦР и РНК методом ОТ/ПЦР. Кроме того, целью настоящей работы былс

создание и использование в медицинской практике амплификационных тест-:истем на основе метода ПЦР с рекомбинантной Taq ДНК-полимеразой для анализа специфических ДНК или РНК вирусов и бактерий , патогенных для человека.

Во время выполнения работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Отработать методику выделения и очистки Tth-полимеразы из штамма Thermus thermophilus КТП.

2. Исследовать оптимальные условия проведения ПЦР с Tth-полимеразой на модельной системе с ДНК фага X в качестве матрицы и влияние ряда параметров (концентрации АТР, пирофосфата, неионных детергентов) на способность фермента катализировать полимеразную реакцию.

3. Изучить оптимальные условия проведения ОТ/ПЦР с Tth-полимеразой при анализе синтетической РНК интерлейкина 2а (IL-2a), мРНК CD-4 рецептора, мРНК MDR-1 и 16S рибосомной РНК (рРНК) из Bacillus subtilis.

4. Проанализировать влияние двухвалентных металлов Со2+, Cu2+, Cd2+, Mn2+, Mg2+ и неорганической термостабильной пирофосфатазы на способность Tth-полимеразы катализировать ОТ/ПЦР.

5. Исследовать оптимальные условия анализа методом "гнездовой" ПЦР (гПЦР) с Taq-полимеразой генетических последовательностей патогенных для человека вирусов: вируса Эпнггейна-Барр (EBV), цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса 1 и 2 типов (HSV1 и HSV2), вируса иммунодефицита человека 1 типа (HTV1), вирусов гепатита А и В (HAV и HBV);

6. Изучить оптимальные условия анализа методом гПЦР генетических последовательностей патогенных для человека бактерий: возбудителя холеры (Vibrio cholerae), возбудителя чумы (Yersinia pestis), возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis complex-MTC), возбудителя стафилококковой инфекции (Staphylococcus aureus) и возбудителя хламидиоза (Chlamydia trachomatis).

7. Выяснить эпидемиологическую роль для человека ряда природны> штаммов V. cholerae с использованием разработанной амплификационной тест системы для анализа ДНК возбудителя холеры;

8. Проанализировать возможную этиологическую роль EBV в развита» одного из вариантов кожной Т-клеточной лимфомы человека (Mycosii fungoides) с использованием разработанной амплификационной тест-системь для анализа ДНК данного вируса.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния нативная Tti ДНК-полимераза из штамма Thermus termophilus КТГТ. Отработан мсто^ выделения Tth-полимеразы, позволяющий получать фермент с гомогенностыс более 90%.

Впервые показана возможность использования фермента в ОТ/ПЦР реакции. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР и ОТ/ПЦР с использованием Tth-полимеразы. На основании проведенных исследований продемонстрирована возможность синтеза и амплификации больших фрагментов к ДНК на матрице рРНК из В. subtilis.

Впервые был предложен метод прямого определения экспрессии генов MDR-1 и CD-4 рецептора с использованием Tth ДНК-полимеразы.

Созданы специфические и высокочувствительные амплификационные тест-системы на основе метода гПЦР с Taq-полимерэзой с оригинальными праймерами для детекции генетических последовательностей патогенных для человека вирусов (EBV, HSV1, HSV2, HIV1, CMV, HBV и HAV) и бактерий (возбудители холеры, чумы, туберкулеза, хламидиоза, стафилококковой инфекции).

С использованием разработанных тест-систем впервые была установлена патогенность для человека ряда штаммов-изолятов V. cholerae и показана возможная этиологическая роль EBV в развитии кожной Т-клеточной лимфомы человека (Mycosis fungoides).

Выполненная работа имеет важное практическое значение. Возможность нуллифицировать непосредственно рибосомальные РНК, являющиеся ¡ажнейнпш таксономическим признаком, имеет практическую ценность с точки зрения систематики микроорганизмов. Возможность детекции мРНК CD-[ рецепторов поможет в исследовании популяции CD-4 позитивных клеток 1ериферической крови, так как данные рецепторы связаны с проникновением ilVl в клетку человека. Прямое определение экспрессии гена MDR-1 позволит зыстро и эффективно следить за качеством химиотерапии и применять тодивидуальные схемы лечения онкологических больных.

Высокая степень чувствительности и специфичности ПЦР и ОТ/ПЦР с «пользованием Tth-полимеразы позволит широко использовать ее для прямой детекции молекул РНК, а также в генно-инженерных исследованиях.

Разработанные амплификационные тест-системы для анализа хнетических последовательностей вирусов и бактерий, патогенных для геловека, позволят с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять зозбудителей заболеваний в различном клиническом материале и объектах окружающей среды. В настоящее время амплификационная тест-система для шализа С. trachomatis внедрена в медицинскую практику (ТУ-9398-402-L8137053-96).

Основные положения, выносимые на защиту

отработка методики и очистка нативной Tth ДНК-полимеразы; оптимизация методов ПЦР и ОТ/ПЦР с Tth ДНК-полимеразой для шализа нуклеиновых кислот;

создание амплификационных тест-систем на основе метода гПЦР с эекомбинантной Taq-полимеразой для специфического выявления ряда вирусов и бактерий, патогенных для человека;

использование разработанных амплификационных тест-систем для исследования возможной этиологической роли ЕВУ в развитии кожной Т-

клеточной лимфомы и для анализа патогенности для человека ряда штаммоЕ V. сЬокгае. Апробация работы

Результаты были представлены на 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы" (Рига, 1989), на совещании специалистов стран-членов СЭВ "Персональные ЭВМ в задачах проектирования и поддержки решений" (Суздаль, 1989), на 8-м Международном конгрессе по вирусологии (Берлин, 1990), на Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990), на 1-й и 2-й Всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1990, 1991), на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), на Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербург, 1992), на Международной биотехнологической конференции АТВ-92 и АТВ-95 (Милан, 1992, 1995), на Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" (Пермь, 1993), на ежегодной Международной конференции Р.Галло "Ретровирусы" (Ныо Йорк, 1995), на городском научно-практическом семинаре "Диагностические системы Московского НИИ медицинской экологии" (Москва, 1997), на Международной конференции "Агробиотехнологии растений и животных" (Киев, 1997), на Международном симпозиуме "Особоопасные инфекции: эпидемиология, экспресс-диагностика и профилактика" (Киров, 1997). Материалы и методы исследования

В работе использовались следующие реактивы: трис, хлористый цезий, ДНК из спермы лосося и фага X, фенол, хлороформ, протеиназа К, твин-20, сульфат аммония, М§С12, агароза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (<1АТР, сЮТР, сЮТР, сГГТР), ЗББ, хлорид натрия, гидроокись натрия, хлорид калия, ЕБТА,

полимин Р, хлорид марганца, бромистый этидий, АТР, пирофосфат натрия , акрил амид, TEMED, МДЧ-метиленбисакриламид, персульфат аммония, борная кислота, дитиотреитол, EGTA, Р-меркаптоэтанол, глицерин ("Sigma", США); фосфоцеллюлоза ("Whatman", Англия); маркеры молекулярной массы белков ["Pharmacia", Швеция); [а-32Р] dCTP, [3Н] dTTP, маркеры молекулярной массы ДНК, буфер для ДНК-гибридизации, мембранные фильтры Hybond N+ '"Amersham", Англия), маркеры молекулярной массы ДНК, AMV и MMLV эевертазы ("Promega", США); однозамещенный и двузамещенный фосфат калия ("Merk", Германия).

Фермент Tth-полимераза выделяли из штамма Thermus thermophilus КТР. Биомассу обрабатывали ультразвуком, фермент осаждали полимином Р, фракционировали сульфатом аммония и очищали последовательными фоматографиями на фосфоцеллюлозе и на FPLC -колонке с ионообменником Mono Q HR 5/5 ("Pharmacia", Швеция). Активность Tth-полимеразы эпределяли по включению [а32Р] dCTP в "активированную" ДНК спермы юсося по методу (Cantoni G.L. 1966). Гомогенность препарата фермента определяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в трисутствии SDS (Laemmli U.K. 1970). Концентрацию белка в растворах определяли по известному методу (Lowry О.Н. et al. 1951). Выделение ДНК доводили ставдартным фенольно-хлороформным методом с использованием тротеиназы К и SDS (Maniatis T. et al. 1984).

'екомбинантную Taq-полимеразу (BIOTAQ) выделяли из штамма-продуцента 3VG-A1 по методу (Патрушев Л.И. и соавт. 1993).

Синтетическую РНК IL-2a получали методом транскрипции in vitro (Kolosov vlJ. et al. 1992) с использованием плазмиды pGEM-IL-2ct. Суммарную клеточную РНК выделяли описанным ранее методом (Chomczynski and Sacchi N. 1987).

Перенос фрагментов ДНК из агарозного геля на мембранные фильтрь диффузным методом и их анализ дот-блот-гибридизацией с мечеными ДНК зондами проводили по описанной ранее методике (Maniatis Т. et al. 1984). ДНК-зонды метили дигоксигенином (DIG) и проводили иммунодетекцик образовавшихся ДНК: ДНК-комплексов с помощью коммерческого набор: "DIG DNA labeling and Detection Kit" ("Boehringer", Германия).

Подбор праймеров для ПЦР и ОТ/ПЦР осуществляли с помощью компьютерных программ "Microgenia" ("Beckman", США), "Oligo5" (NCI США) и "Праймер" разработанной в ВНЦМДЛ (Россия). Синтез праймеро! проводили на автоматическом ДНК-синтезаторе "Applied biosystem 380А' (США) и очищали электрофорезом в полиакриламидном геле.

ПЦР проводили в инкубационной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рЕ 7.0-9.0 (при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2S04,0.01% (в/о) твин-20, 1.28-5.2 мМ MgCl2 0.02-0.9 мМ каждого dNTP, 0.1-1 мкМ каждого праймера, 2-8 нг ДНК фага или 0.5-1 мкг геномной клеточной ДНК, или 0.05-10 мг плазмидной ДНК, 1-4 ед. Tth-полимеразы или BIOTAQ

ОТ-активность Tth -полимеразы или Taq-полимеразы ("Cetus Percin Elmer". США) определяли в реакционной смеси, содержащей 67мМ Трис-HCl, рН8.8: 16.6мМ (NH4)2S04,16 пмоль праймера RT54, 108 копий РНК IL-2a. 1мМ МпС1; 0.25мМ каждого dNTP, ImkKu [3Н] dTTP (83Ки/ммоль), 5ед. Tth-полимерази или Taq-полимеразы. Реакцию проводили по описанному ранее методу (Maniatis Т. et al. 1984).

ОТ/ПЦР проводили в реакционном буфере содержащем 67мМ Трис-НС1. рН8.8, 16.6 мМ (NH4)2S04, 0.01% (в/о) твин-20 по методу (Myers W.Th. and Gelfand D.H. 1991).

При разработке амплификадионных тест-систем в качестве положительных контрольных образцов были использованы следующие очищенные препараты нуклеиновых кислот: ДНК В95-8 (EBV+), ДНК L2 verc (HSV1+), ДНК ßH vero (HSV2+), ДНК культуры клеток фибробластов человека.

инфицированных CMV, ДНК рВНЮ, содержащая геном HIV1, ДНК pHBV, содержащая геном HBV, ДНК культуры клеток, инфицированных C.trachomatis штамм L-1), ДНК штаммов М. tuberculosis H37Rv, M. avium, M. bovis BCG, ЦНК штамма S. aureus FRJ-722 (H), РНК HAV штамма HM175. Данные трепараты, а также клинический материал от пациентов, инфицированных тем 1ли иным возбудителем, образцы от здоровых доноров и онкологических 5ольных были любезно предоставлены Институтом микробиологии и Дентральным госпиталем г. Бреша (Италия). ДНК штаммов V. cholerae, Y. testis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis и токсигенных штаммов Е. coli шли получены из коллекции РосНИИПЧИ "Микроб" (г. Саратов).

Анализ вышеуказанных возбудителей проводили методом гПЦР (Frohman vT.A. and Martin G.R. 1989) в течение 35 циклов с "внешними" и 25 циклов с 'внутренними" праймерами. ДНК из клинических образцов выделяли с «пользованием системы "Instra-Gene Purification Matrix" фирмы ("Bio-Rad", HILA). Анализ РНК HAV проводили комбинированным методом ОТ с эевертазой M-MLV и гПЦР (Kawasaki К. et al. 1988).

Анализ провирусной ДНК вируса Т-клеточной лейкемии человека 1 типа HTLV1) у пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой (MF) проводили с «пользованием стандартного ПЦР-набора ("Cetus", США). 1родукты ПЦР и ОТ/ПЦР исследовали известным методом (Loening V.E. Í967). В ряде случаев негативы фотографий гелей на пленке "Polaroid 655" жанировали на приборе "Ultra Scan XL" (LKB, Швеция) с целью :равнительного анализа эффективности выхода ПЦР-продуктов. ПЦР-фодукты очищали центрифугированием в пробирках "Centricon 100" "Amicon", США) и секвенировали методом ПЦР (Verhasselt P. et al. 1992). Экзонуклеазные активности (5'-3' и 3'-5') и эндонуклеазную активность Tth-юлимеразы определяли известными методами (Maniatis T. et. al. 1980).

Результаты и обсуждение 1. Выделение нативной Tth ДНК-полимеразы

Стандартные условия выделения термостабильной Taq ДНК-полимеразы включали четыре последовательные стадии хроматографии на DEAE-колонке, фосфоцеллюлозе или гидроксиаппатите, ДНК-колонке и на DEAE-целлюлозе или гидроксиаппатите (Edgar D.B. 1974, Chien A. et al. 1976, Каледин А.С. и соавт. 1980). По аналогичной схеме проводилось выделение Tth ДНК-полимеразы из штамма Thermus thermophilus BQB-8. Однако была обнаружена гетерогенность среди Tth-полимераз (А-, В- и С-формы), которая выражалась в различии молекулярных масс ферментов (от 110 до 120 кДа) и их температурных оптимумов реакции (от 50°С до 63°С) (Ruttimann С. et al. 1985).

Рядом авторов были выделены Tth-полимеразы с молекулярными массами 67 кДа (Carballeria N. et al. 1990) и 85 кДа (Sellman Е. et al. 1992), которые имели температурный оптимум реакции 74°С. Клонирование Tth-полимеразы из вышеуказанного штамма показало, что расчетная молекулярная масса для фермента должна быть 94 кДА (Asakura К. et al. 1993).

Такая гетерогенность в формах фермента непонятна, однако это может являться результатом наличия продуктов нескольких генов, протеолитической деградацией одного продукта, либо его посттрансляционной модификацией (Perler F.B. et al. 1996).

В своей работе мы выделяли нативную Tth-полимеразу из штамма Thermus thermophilus КТТ1 (коллекционный номер ВКПМ: В-4892), сократив количество стадий хроматографии до двух.

На первой стадии очистки мы использовали осаждение Tth-полимеразы полимином Р, оптимальная концентрация которого оказалась равной 0.35%. После элюции фермента из комплекса с полимином Р (0.4М КС1) проводили фракционирование сульфатом аммония, добавляя его до 75% насыщения.

На следующей стадии очистки была проведена хроматография на фосфоцеллюлозе. Фермент элюировали с колонки линейным градиентом

0.08М-0.4М KCl, при этом ДНК-полимеразная активность эшоировалась при ).15М KCl. Интересно отметить, что в аналогичных условиях нативная Taq-толимераза элюируется с колонки при 0.22М KCl (Каледин A.C. и соавт. 1980).

На последней стадии очистки проводили хроматографию методом FPLC и колонке с ионообменником Mono-Q-HR 5/5. Tth-полимеразу элюировали с солонки линейным градиентом NaCl (от 0 до 0.5М). ДНК-полимеразная истивность элюировалась с колонки при 0.28М NaCl и соответствовала ¡имметричному белковому пику. Электрофорез в полиакриламидном геле в 1рисутствии SDS показал, что данный белковый пик состоит из гомогенного юлипептида с молекулярной массой около 92 кДа, обладающего гермостабильной ДНК-полимеразной активностью (рис. 1).

1—э_

'ис. 1 Анализ гомогенности препарата ТШ-полимеразы методом ЗОБ-электрофореза в 10% полиакриламидном геле: 1- на гель нанесено 20ед. активности фермента, 2- стандарты молекулярной массы белков

т___ кДа

« к» К-?4 еэ

—ч>

4-40 4-30

С) <~20

Таким образом, в результате использования предложенной нами методики, являющейся более быстрой, чем использованные ранее методы ¡ыделения термостабильных ДНК-полимераз, удалось очистить ТЛ-юлимеразу из штамма Т. ЛеппорЬПиз КТП до состояния, близкого к омогенному (табл. 1)

Полученный гомогенный препарат фермента обладал 5'-3'-кзонуклеазной активностью и не проявлял 3'-5'-экзонуклеазной активности. ЩК-полимераза не содержала эндонуклеазной активности и имела емпературный оптимум реакции 75°С.

Таблица 1. Очистка Tth-полимеразы из Т. thermophilus КТП.

Стадия очистки Суммарная активность, ед. Количество белка, мг Удельная активность, ед./мг Степень очистки

Суспензия клеток, обработанная ультразвуком 57800 1190 48.57 -

Фракционирование полимином Р и сульфатом аммония 13289 194 68.5 1.4

Хроматография на фосфоцеллюлозе 6575 2.91 2259.4 46.5

РРЬС хроматография на МопоС! 6000 0.3 20000 411.8

2. Оптимизация условий проведения ПЦР с Tth-полимеразой

Данные исследования проводили на модельной системе, применяя е качестве матрицы ДНК фага X. В ПЦР в качестве "прямого" праймера использовали олигонуклеотид Lampl в комбинации с различными "обратными" праймерами (табл.2).

Таблица 2. Структура праймеров, используемых для ПЦР-амплификации

ДНК фага А.

UpafiMep Последовательность (5'--3') Позиция на Х-ДНК

Lamp 1 GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG 7131-7155

Lamp 2 GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC 7606-7630

Lamp 3 TTCCCAGCCACACGCTGCATGACAT 8377-8401

Lamp 4 CTGCATCAGCACATCATCTTCAGGC 10375-10399

Lamp 5 CCTCCTTCGTGAAGACAAACTCACC 12801-12825

Lamp 6 TCGATCACACTCAGCAACTGCGTGG 15563-15587

Lamp 7 TCAGATGACTCACACCGGTATCCCC 19106-19130

Основная часть исследований по оптимизации условий ПЦР была проведена с парой Ьашр1/Ьатр2, дающей специфический ПЦР-продукт размером 500 Ьр.

2.1. Влияпие концентраций и сИЧТР на эффективность ПЦР

Анализ выхода ПЦР-продукта при различных концентрациях в

реакционной смеси и постоянной концентрации каждого сЮТР, равной 0.2мМ, показал, что отношение концентраций к общей концентрации сЙЧТР

(М^<ЮТР) влияет на эффективность ПЦР (рис. 2, А). При соотношениях

Mg/dNTP, равных 5 и 6.5, наблюдалось сильное ингибирование синтеза ПЦР-продукта. С другой стороны, для данной системы ПЦР (праймеры, матрица, буфер, температурный режим) с Tth-полимеразой оптимальное значение Mg/dNTP находится в пределах от 1.5 до 2. Эти результаты согласуются с данными большинства работ по амплификации с Taq-полимеразой других ДНК-матриц (Mullís К.В. et al. 1994). На основании статистических экспериментов установлено, что максимальный выход продукта ПЦР в данной системе наблюдался при соотношении Mg/dNTP, равном 1.87.

При концентрации каждого dNTP 0.9mM наблюдалось снижение выхода продукта ПЦР за счет увеличения неспецифического синтеза ДНК. Оптимальная концентрация каждого dNTP для данной системы составила Э.2мМ. Полученные нами данные показывают, что эффективность ПЦР зависит эт концентраций Mg2+ и dNTP.

1 2 3 4 5 6 7 8 1

3 4 5 6

500 bp

Рис. 2 Эффективность выхода продукта ПЦР (20 циклов).

А- выход продукта ПЦР при различных концентрациях (мМ) Мз2+ (в скобках указано молярное соотношение М^сШТР: 1-1.28 (1.6); 2-1.6 (2);3-4 (5); 4-5.2 (6.5); 5-0.88 (1.1); 6-1.2 (1.5); 7-1.44 (1.8); 8-2.88 (3.6).

Б- выход продукта ПЦР при различных концентрациях <1КТР и соотношении М^ШЧТР, равном 1.87. Суммарная концентрация ¿КГР (мМ) составляла: 1-3.6; 2-1.6; 3-0.8; 4-0.4; 50.2; 6-0.08

Нами было показано, что изменение концентрации dNTP влияло на >ффективность ПЦР (рис. 2, Б).

Очевидно, что в инкубационной смеси должно быть достаточно Mg2+ для )ффективного образования комплексов (Mg+dNTP) и (Mg+пpaймep+мaтpицa).

2.2. Влияние ионной силы (I) и рН на эффективность ПЦР

Исследования показали, что для данной системы оптимальное значение ; соответствует 0.08 (рис. 3, А). При этом значении I наблюдался наиболыдш выход специфического продукта ПЦР. При значении I, равном 0.2 происходило полное ингибирование выхода продукта ПЦР.

Таким образом, при подборе условий для ПЦР необходимо учитывал вклад компонентов смеси (Мц2+, буфер, сГМТР и другие солевые добавки) I ионную силу раствора, так как увеличение концентрации того или иногс компонента может существенно снизить эффективность выхода продукта ПЦР Для Тад-полимеразы оптимальное значение I соответствует 0.065 (5аИа Л.К. е а1.1988).

1 2 3 4 5 6

500 Ьр-^j - i^iTTi4**"'" -

'til? -о» -- . '............

■ -г

-500 bp

Рис. 3 Влияние ионной силы (А) и рН (Б) на эффективность выхода продукта ПЦР. А-значение 11 реакционной смеси: 1-0.04; 2-0.06; 3-0.08; 4-0.1; 5-0.15; 6-0.2. Б-значение рН в реакционно* среде: 1-7.0; 2-7.5; 3-8.0; 4-8.5; 5-8.8; 6-9.0. Значите I равнялось 0.08.

Tth-полимераза обладает ярко выраженной способностью катализировать синтез ДНК в щелочной среде. Как показали эксперименты, оптимум значения рН для данной системы ПЦР с Tth-полимеразой соответствует 8.8 (рис. 3, Б). При значении рН, равном 7.5, наблюдалось заметное снижение выхода продукта ПЦР, а при значении рН, равном 7.0, - практически полное ингибирование выхода данного продукта. Нужно отметить, что оптимум значения рН для Taq-полимеразы соответствует 8.3 (Watson R. 1989).

2.3. Влияние пирофосфата, ATP и термостабильной пирофосфатазы на эффективность ПЦР

В своей работе мы исследовали влияние различных концентраций АТР и пирофосфата на эффективность выхода продукта ПЦР. Согласно литературным данным, интенсивность синтеза ДНК, осуществляемого ДНК-полимеразой I, повышается при добавлении пирофосфата (Abbotis J., Loeb L.A. 1985). Это может происходить за счет участия пирофосфата в реакции пирофосфоролиза при удалении ошибочного нуклеотидного остатка при кинетической остановке, вызванной включением неправильного звена в 3'-положении праймера 'Doubleday О.Р. et al. 1983) Кроме того, активность многих ДНК-полимераз I стимулируется АТР. АТР увеличивает сродство ДНК-полимераз к ДНК 'Lowton К. G. et al. 1984), повышает стабильность комплекса (фермент»-ДНК), стимулирует полимеризацию, процессивность и другие параметры синтеза Xonig Н. et al. 1983, Show Е.Т. et al. 1984). Однако в случае ПЦР с Tth-полимеразой наблюдалось полное ингибирование выхода продукта ПЦР при шнцентрации пирофосфата, равной 0.25 мМ (рис. 4, А). Нужно отметить, что шгибирование пирофосфатом синтеза ДНК показано для целого ряда ДНК-полимераз (Abbots J., Loeb L.A. 1985).

1 2 3 4 5 6 7

500 bp-

Рис. 4 Влияние различных концентраций пирофосфата (А) и АТР (Б) на выход продукта ПНР;

А - реакционная смесь с различными концентрациями пирофосфата (мМ): 1- 0.0 (контроль); 2 - 0.03; 3 - 0.06; 4 - 0.125; 5 - 0.25; 6 - 0.5; 7 - 1.0; 8 - 1.5. Б - реакционная смесь с различными концентрациями АТР (мМ): 1 - 0.0 (контроль); 2 - 0.015; 3 - 0.03; 4 - 0.06; 5 -0.125; 6-0.25; 7-0.5; 8- 1.0

Аналогичный эффект имел место при добавлении в реакционную смесь АТР (рис. 4, Б). Полное ингибирование выхода продукта ПЦР наблюдалось при концентрации АТР, равной 1мМ. Скорее всего, АТР и пирофосфат ингибирует ПЦР, конкурируя с dNTP в реакционной среде.

Для повышения эффективности ПЦР мы провели эксперименты по снижению ингибирующего эффекта пирофосфата (как продукта ДНК-полимеразной реакции) путем добавления в реакционную смесь

термостабильной пирофосфатазы из Thermus thermophilus КТР.

1 2 3 4 5 6

Рис. 5 Влияние термостабильной пирофосфатазы на эффективность ПЦР. Реакционная смесь содержала различные количества ДНК фага X (ng): 1, 2 - 0.1; 3, 4 -0.25; 5, 6 - 0.5. ПЦР (25 циклов) проводили с праймерами Lampl/Lamp4, дающими продукт ПЦР размером 5700 bp (+)- реакционная смесь содержала 0.25 ед. пирофосфатазы

Результаты исследования показали, что добавление пирофосфатазы в реакционную смесь повышало выход специфического продукта ПЦР в несколько раз (рис. 5).

5700 bp —Ы . -

* ' SÏ

is»»®«®

2.4. Влияние концентрации "ПЬ-полимеразы, праймеров и ДНК-матрицы на эффективность ПЦР

Проведенные нами исследования показали, что оптимальная концентрация ТШ-полимеразы в реакционной смеси соответствует 2 ед. активности фермента (рис.6, А). В случае добавления 3 и 4 ед. фермента наблюдалось появление неспецифического фона ДНК в виде "шмера". Нужно отметить, что при добавлении от 1 до 4 ед. фермента выход продукта ПЦР практически не изменялся.Учигывая возможность того, что фермент может частично инактивироваться при проведении большого числа циклов (более 30 циклов) или за счет неспецифической сорбции на ДНК, мы добавляли во всех экспериментах в реакционную смесь 2.5 ед. ТШ-полимеразы по аналогии с использованием Taq-пoлимepaзы (Байа К..К. е! а1.1988).

Анализ эффективности выхода продукта ПЦР показал, что он зависит от концентрации праймеров в реакционной смеси. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы ПЦР составила приблизительно О.ЗмкМ, что соответствует соотношению праймер/матрица, равному 5x104 (рис. 6, Б).

Исследования зависимости эффективности ПЦР от количества анализируемой ДНК-матрицы в пробе показали, что избыток ДНК (107-108 копий ДНК для данной системы ПЦР) может приводить к существенному искажению вида специфического продукта ПЦР в агарозном геле (рис.6, В). Возможно, это происходит за счет значительной наработки неспецифических продуктов ПЦР.

2 3 4 5

500 Ьр-М

1 2 3 4 5

Щщя§шввШ»

Рис. 6 Влияние концентраций ТЛ-полимеразы (А), праймеров (Б) и матрицы (В) на эффективность ПЦР;

А- реакционная смесь содержала различное количество ТЛ-полимеразы (ед.): 1 - 4; 2 - 3; 3 -2; 4 - I; (20 циклов ПЦР);

Б- реакционная смесь содержала различные концентрации каждого из праймеров (мкМ): 1 • 1.0; 2 - 0.65; 3 - 0.3; 4 - 0.2; 5 - 0.08 (20 циклов ПЦР);

В- реакционная смесь содержала различное число копий ДНК фага к (количество молекул в пробе): 1 - 10в; 2 - 107; 3 - 104; 4 - 103; 5 - 10 (40 циклов ПЦР)

2.5. ПЦР-амплифнкацпя фрагментов различной длины

Исследования показали, что ТШ-полимераза обладает способностью амплифицировать фрагменты ДНК значительной протяженности (рис. 7).

1 2 3 4 5 М

8457 Ьр 5695 Ьр 3269 Ьр

1271 Ьр -

500 Ьр-

Рис. 7 Эффективность ПЦР-амплификащш фрагментов ДНК различной длины. Проводили 20 циклов ПЦР с различными парами праймеров на ДНК фага X (см. табл. 2). Размер ПЦР-продуктов (Ьр): 1 - 500; 2 -1271; 3 - 3269; 4 - 5695; 5 - 8457; М -маркеры молекулярпой массы ДНК (Есог1/Нтс1Ш)

Без использования специально подобранных температурных режимов ПЦР для амплификации длинных фрагментов ДНК нам удалось с высокой эффективностью получить с ТЛ-полимеразой продукты ПЦР длиной от 1271 до 8457 Ьр.

2.6. Влияние некоторых веществ на эффективность ПЦР с ТЛ-нолнмеразой

Нами было показано, что сильным ингибирующим эффектом на ПЦР обладает желатин (табл. 3), который часто присутствует в качестве добавки в

препаратах Taq-полимеразы (например, фирмы "Cetus Perkin Elmer"), хотя и обладает ингибирующим эффектом на этот фермент (Yang J. et al. 1989). Таблица 3. Влияние различных веществ на эффективность ПЦР.

(+) - усиление эффективности, (-) - снижение эффективности, (0) - отсутствие эффекта по отношению к контролю.

Вещество (концентрация) Эффекты Вещество (концентрация) Эффекты

Дитиотреитол (1мМ) (-) EDTA (5мкМ) (0)

5-меркаптоэтанол (1 ОмМ) (0) DMSO (10%) (-)

БСА (0.1мг/мл) (0) Формамид (3%) (0)

БСА (0.2 мг/мл) (0) NP-40 (0.01%) (+)

Желатин (0.1мг/мл) (-) Тритон Х-100 (0.01%) (+)

NaCl (50мМ) (-) Твин-20 (0.01%) (+)

KCl (50мМ) (-) Твин-20 (0.1%) (+)

Ингибирующее действие на ПЦР с Tth-полимеразой оказывало добавление KCl, NaCl, DMSO и дитиотреитол.

Добавление неионных детергентов в несколько раз усиливало эффективность ПЦР с Tth-полимеразой. Это стимулирующее действие детергентов можно объяснить, с одной стороны, их влиянием на активность фермента, с другой стороны, детергенты могут препятствовать адсорбции фермента, праймеров и матрицы на стенках пробирки. Кроме того, с повышением температуры согласно уравнению Аррениуса может происходить агрегация молекул фермента за счет гидрофобных взаимодействий и, следовательно, его инактивация. Детергент может препятствовать этому процессу и тем самым повышать эффективность катализа ПЦР Tth-долимеразой.

5. Анализ РНК методом ОТ/ПЦР с Tth- полимерами

Согласно литературным данным Taq-полимераза не обладает высокой эффективностью синтеза кДНК на РНК-матрицах (Каледин A.C. и соавт. 1980), тогда как рекомбинантная Tth-полимераза из штамма T.thermophilus HB 8 с

высокой эффективностью катализировала ОТ/ПЦР в присутствии ионов Mr (Myers Th. W., Gelfand D.H. 1991). Используя полученный нами препарат нативной Tth-полимеразы, мы исследовали его возможность катализировать ОТ-реакцию и ОТ/ПЦР.

Праймеры, используемые нами в работе по анализу различных РНК. представлены в табл. 4.

Таблица 4. Структура праймеров, использованных дня анализа РНК методом ОТ/ПЦР.

Праймер Последовательность 5' 3' 16S рРНК B.Subtilis

Р291 AAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTC 1514-1539

Р289 AGACTTTGATCCTGGCTCAG 14-34

кДНК1Ь-2а

RT54 ACTGCTGGATTTAGAGATGATTTTGAATGG 54-84

Р355 GAAATTCTACAATGGTTGCTGTCTCATCAG 355-325

кДНКЩЖ-1

MDRP1 TACAGTGGAATTGGTGCTGG 776-795

MDRP2 GTTAGCTTCCAACCACGTGT 1049-1068

MDRP3 AGCTGACAGTCCAAGAAGAG 1091-1111

кДНК CD-4

AR1 CAGGGCCCCAAAGTGGTGCTGGGCAAA 145-174

AR2 GGTCAGGGTCAGGCTCTGCCCCTGAAGCAG 501-472

3.1. Анализ ОТ-активности ТШ-полимеразы

Для характеристики ОТ-активности была определена зависимое« количества (Зн) аттр, включенного в кислотонерастворимую фракцию, от времени инкубации на синтетической матрице РНК 1Ь-2а для Тад-полимеразь и ТЛ-полимеразы (рис. 8). В ОТ-реакции использовали праймер 11Т54, а I качестве двухвалентного катиона Мп2+. Начальная скорость ревертазно{ реакции, а также максимальное количество (3Н) dTTP, включенного I кислотонерастворимую фракцию, у ТЛ-полимеразы была выше, чем у Тац полимеразы.

Рис. 8 Кинетика включения (3Н) dTTP в кнслотонерастворимую фракцию при ОТ с использованием Tth-полимеразы и Taq -полимеразы

Реакционная смесь содержала 2.5мМ МпС12, Ю8 копий РНК IL-2a и 5ед Tth-полимеразы или Taq-полимеразы. Эти различия оказались не столь высоки, как эбсуждалось в литературе (Kawasaki E.S. et al. 1988, Shaffer A.L. et al. 1990), что по-видимому, может объясняться использованием в качестве матрицы короткой синтетической РНК и отсутствием в ней сложных вторичных структур, характерных для природных молекул РНК, при дестабилизации которых Мп является более эффективным, чем Mg (Eihgorn Т.М. 1978). 3.2. Анализ спптетнческой РНК IL-2a методом ОТ/ПЦР

Исследования показали, что Tth-полимераза может катализировать ЭТ/ТЩР при использовании синтетической РНК в качестве матрицы (рис.9, А, В).

Было установлено, что использование КС1 и NaCl в составе реакционного эуфера является менее эффективным, чем (NIL^SC^ (рис.9, А). Оптимальное шачение рН для ОТ/ПЦР имело значение около 8.8 (рис. 9, А).

При анализе РНК с использованием "сенс"-праймера в ОТ-реакции, тродукт ОТ/ПЦР не синтезировался, что подтверждает специфичность доводимого нами анализа (рис.9, Б). Кроме того, специфичность анализа юдтверждалась результатом появления продукта ОТ/ПЦР при использовании в ЭТ-реакции "сенс"-праймера плазмидной ДНК, содержащей ген IL-2a.

dTTPt3H], киопь

М 1 2 3 4 5 6

302 bp-

■ 302 bp

А Б

Рис. 9 Анализ синтетической РНК IL-2a методом ОТ/ПЦР; А-влияние солевых компонентов буфера: 1 - 50мМ KCl; 2 - 50мМ NaCl; 3 - 16.6мМ (NH4)2S04 и pH (4 - 8.0; 5 - 8.8; 6 - 9.5), М-маркеры ДНК (100-1000Ьр) на ОТ/ПЦР. Б-подтверждение специфичности ОТ/ПЦР: ОТ-реакция с "антисенс"-праймером (1, 5) и "сенс"-праймером (2, 6). 3- ОТ-реакция с "сенс"- и "ангисенс'-праймерами; 4-контаминационный контроль (без добавления РНК). В реакции использовали в качестве матрицы РНК (1-3) и плазмодную ДНК pTZ18 IL-2oc (5,6)

3.3. Анализ мРНК рецептора СБ-4 методом ОТ/ПЦР

Исследования показали, что ТА-полимераза является достаточно эффективной при анализе специфической мРНК СЮ-4 рецептора в составе тотальной клеточной РНК. При исследовании суммарной РНК, выделенной из трех СЮ-4-позитивных клеточных линий, был получен специфический продукт ОТ/ПЦР размером 356 Ьр (рис. 10).

При использовании геномной ДНК человека в качестве матрицы и при проведении ОТ-стадии с праймером АЛ1, не комплементарным мРНК, специфический продукт ОТ/ПЦР отсутствовал, что доказывало специфичность реакции.

М 1 2 3 4 5 6

500 Ьр 400 Ьр

зоо Ьр =4

200 Ьр = 100 Ьр —

- 356 Ьр

Рис.10 Анализ методом ОТ/ПЦР рецептора СБ-4 в составе тотальной РНК (ОДмкг) из клеточных линий: СЕМ (1), С

8166 (2) и Н9 (3). В контроле использовали 0.1мкг геномной ДНК человека (6). ОТ-стадшо проводили с "сенс"-праймером АЮ (5). Реакционная смесь не содержала РНК (4); М-маркеры молекулярной массы ДНК (100-ЮООЬр)

Изучение чувствительности анализа мРНК СБ-4 рецептора методом ОТ/ПЦР с ТЛ-полимеразой показал, что специфическая мРНК детектируется при использовании 20 нг тотальной клеточной РНК в качестве матрицы (рис.

11). Сравнительный анализ мРНК СО-4 рецептора в 0.4 мкг клеточной РНК показал, что эффективность ОТ/ПЦР при детекции специфической мРНК одинакова для нативной ПЬ-полимеразы и рекомбинантной ТШ-полимеразы фирмы "СеШэ" (гТЛ-полимераза).

1 23456789М

356 Ьр-

Рис. 11 Анализ мРНК СО-4 рецептора методом ОТ/ПЦР с ТШ-полимеразой (1-6) и гТЛ-полимеразой (7, 8). Содержание суммарной клеточной РНК линии Н9 (мкг): 1 - 0.005; 2 - 0.02; 3 - 0.05; 4 - 0.1; 5 - 0,4; 6, 7, 8 - 0.4. Дорожка 9 - 0.1мкг геномной ДНК человека. Синтез кДНК с АЯ2 (1-5, 7, 9) и с АКЛ (6,8). М-маркеры рВЮ22/ЛЫ

Использование Тая-полимеразы ("СеШэ") в ОТ/ПЦР показало, что данный фермент менее эффективен при анализе природной мРНК по сравнению с ТЛ-полимеразой (рис. 12).

12 3 м 4 5 6

«-356 bp

Рис. 12 Анализ мРНК СО-4 методом ОТ/ПЦР с Тая-полимеразой (1-3) и ТЛ-полимеразой (4-6). Содержание суммарной РНК клеточной линии ССКР-СЕМ в пробе (мкг): 1, 4 - 0.2; 2, 5 - 0.05; 3, 6 - 0.03. М-маркеры рВМ22/А1и1.

Согласно литературным данным Taq-полимераза способна осуществлять синтез кДНК, причем чувствительность метода составляет 1-5 мкг РНК (Jones Vl.D., Foulkner N.S. 1989, Shaffer A.L. etal. 1990).

Таким образом, эффективность анализа природных молекул РНК с гативной Tth-полимеразой приблизительно в 100 раз выше, чем с Taq-толимеразой. Аналогичная ситуация характерна и для rTth-полимеразы (Myers fh.W., Gelfand D.H. 1991).

3.4. Определение продукта экспрессии гена МОН-1 методом ОТ/ПЦР

Нами были подобраны специфические праймеры (ЖЖР2 и ШЖРЗ), имеющие различные места посадки на мРНК М1Ж-1, и праймер ЖЖР1, комплементарный кДНК, имеющий одно место посадки. В результате анализа РНК из клеточной линии 8КУЬВ, содержащей мРНК МОЯ-1, были получены специфические продукты ОТ/ПЦР размером 282 Ьр (МЖР2/МЖР1) и 335 Ьр (ШЖРЗ/М1ЖР1) (рис. 13). Специфичность данных продуктов подтверждалась проведением ОТ/ПЦР с геномной ДНК человека и тотальной РНК из клеточной линии МТ-4, не содержащей мРНК МОЯ-1.

, ¡¡11 б г $ м Рис. 13 Анализ мРНК МБЯ-1 методом ОТ/ПЦР в

составе 0.1 мкг тотальной клеточной РНК ЯЮЛ.В (1-4), РНК МТ-4 (5, 6) и 0.1 мкг геномной ДНК человека (7, 8). ОТ-стадию проводили с праймерами: МБКР2 (1, 5, 7); МОЫ'З (3, 6,8); MDR.P1 (2,4). М-маркеры рВЮ22/А1и1.

Таким образом, нами был разработан быстрый и эффективный метод определения экспрессии гена ШЖ-1, кодирующего Р-глико протеин, определяющего лекарственную устойчивость опухолевых клеток человека.

3.5. Оптимизация условий проведения ОТ/ПЦР на синтетических н природных РНК-матрицах

Основные исследования были направлены на анализ эффективности выхода продуктов ОТ/ПЦР в зависимости от рН реакционной среды и от концентрации в ней ионов двухвалентных металлов (табл. 5).

Таблица 5. Влияние двухвалентных катионов и pH на эффективность ОТ/ПЦР.

Параметр реакции Оптимальное значение или концентрация в ОТ-реакдаи Выход продукта ОТ/ПЦР относительно максимального выхода, (%)

Синтетическая РНК Нативная мРНК

рн 8.5 100 50

8.8 100 100

9.0 100 10

МпС12 ImM 100 100

1.5mM 100 30

СиС12 1.5 mM 100 0

2 тМ 90 0

MgCl2 ЗмМ 30 0

CdCb 1.5 тМ 25 0

СоС12 1хпМ 50 0

* — Максимальный выход продуктов ОТ/ПЦР всегда наблюдался при pH 8.8. и концентрации

МпС]2 равной 1 мМ

В случае анализа синтетической РНК максимальный выход продукта ОТ/ПЦР наблюдался в интервале рН от 8.5 до 9.0, тогда как в случае анализа мРНК оптимальное значение рН равнялось 8.8.

Различные ионы могут влиять как на полимеразную, так и на ревертазную реакции. Такие ионы как Cu2+, Co2+,Cd2+, Мп2+ мохуг облегчить дестабилизацию вторичной структуры РНК при определенных температурах (Blanchard J.S. 1984). Для синтетической РНК эффективность воздействия двухвалентных катионов на ревертазную стадию ОТ/ПЦР убывает в ряду: Mn2+>Cu2+>Mg2+>Cd2+»Co2+. Известно, что константы устойчивости комплексов Си-ДНК и Мл-ДНК близки по величине (Eisinger J. et al. 1965). Оба иона способны раскручивать двойную спираль ДНК при повышенной температуре (Eihgorn Т.М. 1978).

Сс12+связывается с ДЬЖ слабее, чем Си2+, что, возможно, некоторым образом влияет на ОТ/ПЦР. В присутствии Со2+ эффективность ОТ/ПЦР была наименьшей, что может объясняться высоким избирательным сродством данного иона только к пуриновым основаниям (Е11щогп Т.М. 1978). Ионы Мп2+ оказались наиболее эффективными в ОТ/ПЦР при анализе природных мРНК. Добавление в реакционную среду Со2+, Си2+ и Сс12+ оказалось неэффективным. Известно, что данные ионы могут как дестабилизировать упорядоченную вторичную структуру РНК, так и стабилизировать ее, нейтрализуя фосфатные группы дуплексных РНК.

3.6. Амплификация длинных фрагментов 16Б рРНК В. виЫШв методом ОТ/ПЦР

С учетом проведенных исследований по оптимизации условий проведения ОТ/ПЦР с ТЛ-полимеразой, мы исследовали способность фермента амплифицировать высокоструктурированные участки РНК достаточно большой протяженности. Результатом амплификации 168 рРНК В. эиЬйПз методом ОТ/ПЦР был синтез двух специфических продуктов размером 1506 Ьр и 800 Ьр, являющихся результатом наличия двух мест посадки праймера р291 на РНК (рис. 14).

168 рРНК была обработана РН-азой А в течение 60 мин (2) и 10 мин (4). При этом эффективность выхода продуктов ОТ/ПЦР при использовании ТЙ1-полимеразы и при использовании в ОТ-стадии мезофильной ревертазы АМУ была одинакова. Однако в случае использования АМУ наблюдалось появление двух неспецифических продуктов реакции.

Таким образом, термостабильная ТА-полимераза из Т. ЛегторЫкБ КТП может быть использована при анализе различных молекул РНК методом ОТ/ПЦР, в отличие от Taq-пoлимepaзы.

1 2 3 4 М

1506 Ьр->

800 Ьр-

Рис. 14 Анализ 165 рРНК В. виЫШэ методом ЮОООЬр ОТ/ПЦР с ТЛ-полимеразой (1, 2, 4) и ревертазой -3000 Ьр дМу (3). М-маркеры ДНК

•<-1000 Ьр

"300 Ьр

4. Создание амплпфикациопных тест-систем на оспове метода ПЦР для анализа специфических ДНК или РНК вирусов п бактерий, патогенных для человека

На данном этапе работы мы использовали метод "гнездовой" ПЦР (гПЦР), который позволяет с помощью "внешних" и "внутренних" праймеров проводить анализ ДНК, исключая стадию ДНК-гибридизации при подтверждении специфичности продуктов ПЦР.

В качестве фермента мы использовали рекомбинантный вариант Taq-полимеразы (ВЮТАС?), которую выделяли по методу, разработанному в ВНЦМДЛ (Патрушев Л.И. и соавт. 1993). Мы не использовали нативную ТЛ-полимеразу, так как выход данного фермента в расчете на единицу биомассы существенно ниже, чем для рекомбинантной ВЮТАС>.

Оптимизацию условий проведения с каждой парой праймеров, ВЮТА(2 и специфической ДНК (РНК)-матрицей проводили по схеме, описанной в разделе 2. Специфичность каждой тест-системы подтверждалась в экспериментах с использованием различных вирусных, бактериальных и эукариотических ДНК (РНК) в качестве матриц (30 различных вариантов).

4.1. Анализ методом гПЦР генетических последовательностей патогенных для человека вирусов

Структуры использованных в данных исследованиях праймеров приведены в табл. 6.

Таблица 6. Структура праймеров для проведения анализа ДНК (РНК) вирусов методом

гПЦР (ОТ/гПЦР).

Наименование праймера Последовательность (5'--3') Положение на геноме Объект (Вирусы)

CMVTE1 TGACCTCCATAGAAGACACC 547-566 CMV

CMVE2 CATTCTGCAAACATCCTCCC 2128-2109 CMV

CMVIE3 CCGTCCTTGACACGATGGAGTCC 1465-1487 CMV

CMVIE4 GTTCTGCCAGGACATCTTTCTCG 1823-1801 CMV

HSV1P5 GGTCTCTTTTGTGTGGTGCG 210-229 HSV1

HSV1/2P4 TGTGT(A/G)ATCTCCGTCCAGTC 841-822 863-882 HSV1/HSV2

HSV1P1 CGAAGACGTCCGGAAACAACCC 563-584 HSV1

HSV1/2P2 CTCCGTCCAGTCGTTTATCTTC 833-812 874-853 HSV1/HSV2

HSV2P3 CGTGTTTACCACATTCAGCC 455-474 HSV2

HSV2P1 TGGTATCGCATGGGAGACAA 644-663 HSV2

EBVP1 GGGTGTTAGAGACAACCAGT 8407-8426 EBV

EBVP2 GAACAGTAAGGTGTATGTGA 8811-8792 EBV

EBVP3 GGGTGAGGCCCAGCCCCCTC 13822-13841 EBV

EBVP4 CATTTGTGTGGACTCCTGGC 14411-14392 EBV

EBVP5 GGAAGCGGGTCTATGGTTGG 14138-14157 EBV

EBVP6 GTCCCCCTCCCTAGAACTGA 14339-14320 EBV

HTVGP1 GAAGGCTTTCAGCCCAGAAG 1269-1288 HIV-1

HTVGP2 TCTCCTACTGGGATAGGTGG 1565-1546 HIV-1

HTVGP3 ACCATCAATGAGGAAGCTGC 1396-1415 HTV-1

HIVGP4 TATTTGTTCCTGAAGGGTAC 1527-1508 HIV-1

HAVP5 AACCTAAATGCCCCTGAGTA 712-693 HAV

HAVP6 TACCTCAGAGGCAAACACCA 694-675 HAV

НАУР7 ТТТААСаССАААТСОТСТТТ 614-595 НАУ

НАУР8 СААСАвТССАаСТОТСААТС 660-641 НАУ

НВР1 ТСОСТАТСССТССАТОТОТС 237-256 НВУ

НВР2 САОСАААССССААААСАССС 894-875 НВУ

НВРЗ СССССТТТСТССТСТАСТТС 339-358 НВУ

НВР4 ТАТСТТСТТССаСТАААаТА 795-776 НВУ

Температурные профили ПЦР для анализа ДНК вирусов отличались по температуре "отжига" пар праймеров (Та), которая была подобрана экспериментально (табл. 7). Стадии денатурации и полимеризации проводили при температуре 95°С и 72°С соответственно. Таблица 7. Пары праймеров для проведения анализа методом гПЦР.

Пара праймеров Та Размер продукта ПЦР Объект

(°С) (Ьр) (Вирусы)

СМУ1Е1 - СМУШ2 65 1601 СМУ

СМУ1ЕЗ - СМУЕ4 65 381

НЭУ1Р5 - ШУ1/2Р4 57 632 ЩУ1

ШУ1Р1 - Н8У1/2Р2 57 271

НБУ2РЗ - Н8У1/2Р4 57 428 ШУ2

Н8У2Р1 - Н8У1/2Р2 57 231

ЕВУР1-ЕВУР2 56 405 ЕВУ

ЕВУРЗ - ЕВУР4 56 590

ЕВУР5 - ЕВУР6 56 202

ШУОР1-ШУОР2 56 297 Н1У-1

ШУОРЗ - ШУОР4 56 132

НАУР5 - НАУР6 50 512 НАУ

НАУР7 - НАУР8 50 172

НВР1 - НВР2 55 658 НВУ

НВРЗ - НВР4 52 457

4.1.1. Анализ ДНК HSV1 и HSV2 методом гПЦР

По данным ВОЗ, заболевания, обусловленные HSV, занимают второе место после гриппа как причина смертности от вирусных инфекций (Assad F., Borocca I. 1978). Герпес может сопровождаться поражением ЦНС, глаз, печени, слизистых оболочек и кожных покровов (Баринский И.Ф. и соавт. 1986). Дифференциальная диагностика HSV1 и HSV2 является актуальной для медицины. Герпетическое заболевание глаз, например, вызвано HSV1-инфекцией, тогда как генитальный герпес является результатом инфицирования вирусом HSV2.

В данный момент нами были подобраны специфические праймеры на область ДНК D-гликолротеинов HSV1 и HSV2 (табл. 6,7). На рис.15 представлены результаты анализа на содержание ДНК HSV1 образцов слезной жидкости от 3 пациентов с диагнозом "офтальмогерпес" и 5 здоровых доноров.

Рис. 15. Детекция ДНК HSV1 методом гПЦР в слезной жидкости пациентов. Четные дорожки- ПЦР с "внешними" праймерами; нечетные дорожки - ПЦР с "внутренними" праймерами. 1-6-образцы слезной жидкости от 3 пациентов с диагнозом офтальмогерпес; 9-18-образцы слезной жидкости от 5 здоровых доноров; 7, 8- положительный контрольный образец; М-маркеры ДНК фХ174/Нае Ш

Как видно из рисунка, у 3 пациентов с вышеуказанным диагнозом после проведения гПЦР-анализа обнаружена ДНК HSV1. Необходимо отметить, что в данных образцах не была обнаружена ДНК HSV2.

На рис. 16 видно, что у всех 3 больных в материале соскобов после гПЦР-анализа присутствует ДНК HSY2. ДНК HSV1 в данных клинических образцах не обнаружена.

м 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

.„■у.,. ,„. -----

632 Ьр-^ 271 bp-»»

М 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 12 13 14 15 16 17 18 М

28 bp _¡> 31 bp

'ис. 16. Детекция ДНК HSV2 методом гПЦР в образцах соскобов из цервикального канала женщин. Нечётные дорожки - гПЦР с "внешними" праймерами; чётные - с "внутренними"; 1-6 -образцы ДНК от 3 женщин с диагнозом гештгальньш герпес; 9-18 - образцы ДНК от 5 здоровых женщин; 7, 8 - положительный контрольный образец; М - маркеры ДНК фХ174/Нае Ш

1.1.2. Анализ ДНК EBV методом ПЦР

EBV является этиологическим фактором ряда заболеваний, таких как [имфома Баркитта (De The G. et al. 1978), назофарингиальная карцинома Glaser R. et al. 1976), инфекционный мононуклеоз (Heble G. et al. 1968). У доровых серопозитивных по EBV людей только 1 из 106 лимфоцитов латентно шфицирован вирусом (Yao Q.V. et al. 1985).

Праймеры для анализа генома EBV были подобраны на области ДНК W-ювтора (для анализа методом гПЦР) и репликона вируса (для анализа методом

ЩР).

На рис. 17 представлены результаты анализа ДНК, полученной из клеток юриферической крови пациентов с лимфомой Micosis fungoides, на удержание генома EBV.

Как видно на рис. 17, после проведения ПЦР у 3 обследованных пациентов i клетках периферической крови обнаружено высокое содержание генома EBV, ;оторое практически идентично содержанию генома вируса в контрольной ЩК В95-8. По различным данным, количество вирусных частиц EBV в )асчете на клетку В95-8 находится в пределах от 180 до 370 (Muller Т.М. et al. 976). При анализе ДНК здорового взрослого донора специфических продуктов ТЦР не наблюдалось, что говорит об очень низком содержании генома EBV в слетках периферичекой крови здоровых индивидуумов.

м 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 м

Рис. 17. Детекция ДНК EBV методом ПЦР в клетках периферической крови 3 пациентов (1-3,4-6, 79 соответственно) с лимфомой Micosis fimgoides и здорового донора (10-12). Дорожки 1, 4. 7, 10, 13-ПЦР с праймерами на область решшкона EBV. гПЦР с "внешними" (2, 5, 8, 11, 14) и "внутренними" (3, 6, 9, 12, 15) праймерами на область W-повтора EBV. Положительный кошрольный образец (13-15); М-маркеры ДНК фХ174/Нае Ш

4.1.3. Анализ ДНК CMV методом гПЦР

На сегодняшний день нет абсолютно надежных средств профилактики развития симптоматической CMV-инфекции (Мойсюк Я.Г. и соавт. 1996). До сих пор диагностика CMV-инфекции осуществлялась вирусологическими и серологическими методами. Вирусологический метод является длительным (10 дней и более) и имеет низкую чувствительность (Landini М.Р. 1993). Серологическая диагностика затруднена из-за высокого уровня инфицированности населения и сложности интерпретации результатов (Wolß С. et al. 1996).

Для специфического анализа ДНК CMV мы использовали праймеры на область ДНК раннего антигена (ЕА) вируса (табл. 6, 7). Разработанная тест-система была использована, в частности, для подтверждения косвенного диагноза CMV-инфекция ЦНС у ребенка в возрасте 2 лет, который был серонегативен в отношении CMV. Диагноз был поставлен на основании томографического исследования мозга на кафедре Детских болезней ММА им. И.М. Сеченова (зав. кафедрой академик А А.Баранов).

;о1 ь

381 Ьр->

'ис. 18. Детекция ДНК СМУ методом гПЦР с "внешними" (нечетные дорожки) и "внутренними" праймерами (четные дорожки). Дорожки: 1,2- положительный контрольный образец; 3, 4 -ДНК, выделенная из клеточного материала мочи пациента с диагнозом СМУ-инфекция ЦНС; 5,6 - ДНК здорового донора; М-маркеры ДНК.

Анализ образца ДНК на содержание генома СМУ в клеточном материале 13 мочи ребенка методом гПЦР показал присутствие в образце ДНК СМУ (рис. 18). Причем, специфический продукт ПЦР виден только в случае 1мплификации с "внутренней" парой праймеров. Данный результат годтверждает большую эффективность анализа ДНК методом гПЦР по ¡равнению с обычной ПЦР.

1.1.4. Анализ провирусной ДНК ШУ1 методом гПЦР

К проблеме СПИД в последнее время приковано самое пристальное шимание ученых и медиков. Использование метода ПЦР для анализа тровирусной ДНК ШУ является важным моментом в диагностике СПИД или 'ШУ1 -инфекции" в связи с низким содержанием вируса в периферической срови (1 копия ДНК ШУ1 на 104 геномов хозяина) (Ои С.У. 1988). Для анализа провирусной ДНК ШУ1 методом гПЦР мы использовали 1раймеры на область Gag-гeнa Н1У1.

На рис. 19 представлены результаты анализа провирусной ДНК ШУ1 в слетках периферической крови 5 здоровых доноров и 2 пациентов с диагнозом

Из рисунка видно, что у здоровых доноров полностью отсутствует 1ровирусная ДНК ШУ1. У пациентов с диагнозом СПИД после ПЦР с 'внешними" праймерами помимо специфического продукта (297 Ьр), габлюдается присутствие других фрагментов ДНК различной молекулярной

:пид.

массы. Однако ПЦР с "внутренними" праймерами (продукт 132 Ьр) четко подтверждает присутствие провирусной ДНК IIIVI в образцах от больных пациентов.

м x 234567 89 юм

...............Ч".1'

11 12 13 14 15 16 м

ч " ь -

к-297 ь£

Ь£

Рис. 19. Исследование содержания провирусной ДНК ШУ1 методом гПЦР в клетках периферической крови пациентов; гПЦР с "внешними" (нечетные дорожки) и с "внутренними" праймерами (четные дорожки).

Дорожки: 1 - 10 - образцы ДНК от 5 здоровых доноров; 11 - 14 - образцы от 2 пациентов с диагнозом СПИД; 15, 16 - положительный контрольный образец; М-маркеры ДНК фХ174/НаеШ

4.1.5. Анализ генетических последовательностей возбудителен инфекционных гепатитов В и А методами гПЦР и ОТ/гПЦР

Для анализа ДНК НВУ методом гПЦР были подобраны специфические праймеры на область Б-гена вируса. Разработанная амплификационная тест-система была использована для выявления ДНК НВУ в плазме пациентов позитивных по НВбАв, и здоровых доноров. Результаты представлены на

рис.20.

м 1 2

10 11 12 13 14 15 16 м

Ьр

Рис. 20. Анализ ДНК НВУ в плазме пациентов методом гПЦР с "внешними" (четные дорожки) и "внутренними" (нечетные дорожки) праймерами. Дорожки: 7 - 14-образцы от 4 пациентов, позитивных по НВзАз; 15, 16 - положительный контрольный образец; М - маркеры ДНК фХ174/Нае Ш

Из рисунка видно, что ДНК HAV практически отсутствует в плазме щоровых доноров. Из 4 позитивных по HBsAg пациентов, только у 2 было >бнаружено высокое содержание ДНК HBV. Подобная ситуация носительства TBsAg известна в клинической практике, в связи с чем метод ПЦР приобретает ¡се большее значение для верификации данного возбудителя (Пак С.Г., Зднилкин Б.К. 1997).

Другим представителем, вызывающим инфекционный гепатит, является 'НК-содержащий вирус HAV.

Нами были подобраны специфические праймеры на область УРЗ-гена IAV. Анализ РНК HAV проводили методом ОТ/гПЦР. Предварительно нами )ыли исследованы оптимальные условия ОТ/ПЦР, которые позволили •ффективно проводить в одной реакционной смеси ОТ-реакцию с мезофильной )евертазой MMLV и ПЦР с BIOTAQ ("one-tube" RT/PCR). Нужно отметить, что vlMLV была достаточно активна в используемом нами стандартном ПЦР-5уфере. ОТ-стадию проводили при 42°С в течение 60 мин.

Мы использовали разработанную нами тест-систему для анализа РНК 1AV в сыворотке и фекалиях пациентов с диагнозом инфекционный гепатит А рис.21 А и Б). Как видно из рис. 21 (А), в составе тотальной РНК из сывороток \ больных во всех случаях была обнаружена РНК HAV, причем у 3 пациентов >на обнаружена лишь после ПЦР с "внутренней" парой. При анализе образцов >НК из фекалий 4 пациентов во всех случаях также была обнаружена РНК 1AV (рис.21, Б).

Нужно отметить, что иммунологические методы анализа HAV в фекалиях фактически не эффективны (Gust I.D., Feinstone S.M. 1988), что делает метод )Т/гПЦР незаменимым при исследовании данного материала на содержание 1ируса.

4.2. Анализ методом гПЦР генетических последовательностей бактерий, патогенных для человека

Структура использованных в данных исследованиях праймеров приведет в табл. 8. Комбинации пар праймеров для гПЦР и их экспериментальное значение Та приведены в табл. 9. Стадии денатурации и полимеризации проводили как описано в разделе 4.1.

512 Ьр 172 Ьр

чг .уЛ

Рнс. 21. Анализ РНК НАУ методом ОТ/гПЦР в сыворотке (А) и фекалиях (Б) пациентов с инфекционным гепатитом А. Нечетные дорожки - ОТ/ПЦР с "внешними" праймерами; четные дорожки - ПЦР с "внутренними" праймерами. Дорожки: 1, 2 (А) и 9, 10 (Б) -положительный контрольный образец; 3-10 (А) и 1 - 8 (Б) - образцы РНК из клинического материала 4 пациентов. ОТ-стадию проводили с 10 ед. ММЬУ.

Таблица 8. Структура праймеров дли проведения анализа бактерий методом гПЦР.

Наименование Последовательность Положение Объект

праймера (5'--3') на геноме (Бактерии)

мустиз СТОСААААСААОТССййТСС 366-385 М.ШЬегси^в

МУСТШ АЗСТССАаСССАААСОТОТТ 805-786

МУСТШ САСАТСОАССТССАССАТСС 423-442

МУСТШ ТССТТОСССАССТТОТССАТ 760-741

СНЬАМРЗ АСАСССаТСАААТАОАвСА 2364-2382 С.^асЬотаЙБ

СНЬАМР4 СААТССАСАААТТСААТСССТ 3462-3442

СНЬАМР1 ТАОТААСТСССАСТТСАТСА 2541-2560

СШАМР2 ТТССССТТСТААТТССТТаС 2741-2722

УОхР1 СТСАСАСССОАТТТОТТАйОСАСС 712-735 У.сЬо1егае

УСЬсР2 ТСТАТСТСТСТАОССССТАТТАСЕ 1013-990

УОхРЗ ТАТСССААСАССАСАСАСТСАОТА 635-658

УС1хР4 САТССАТСАТСТТССАССАТ 1154-1135

УР1 ААСГТСТАТТСТСССААСС 285-303 У.ревйв

УР2 СААСССАТАТТССАСАСС 1212-1195

УР1а СТСАСАССТТТАСАСТТССАСС 368-389

УР2а САСТССТТТССССААОТТТССС 825-804

РпА1/1 ТТТАСАТТАСТТТТАТТСАТТССССТААСС 16-45 Б.аигеиз

РНА1/2 ТАТСААТАТССАТСТТТТСАОАБТТААТСО 754-725

РГ1А2/1 ААССТААААСТЕААААТАААСАбАБТСАСС 176-205

РпА2/2 АСТССТОААСАвТТАСАТТТТТСТТАТТСС 535-506

Таблица 9. Пары праймеров для проведения анализа методом гПЦР.

Пара праймеров Та Размер продукта ПЦР Объект

(°С) (Ьр) (Бактерии)

МУСТОЗ - МУСТШ 57 440 М.1иЬегси1оз15

МУСТШ - МУСШ4 57 338

СН1ЛМРЗ - СНЬАМР4 56 1120 СЛгасИота^

СНЬАМР1 - СНЬАМР2 55 201

УСЬсРЗ - УОхР4 54 520 УсЬо1егае

УОхР1 - УОхР2 54 302

УР1 - УР2 58 928 У.рез^з

УР1а-УР2а 58 458

РпА1/1 - РпА1/2 58 739 Б.аигеиз

РпА2/1 - РпА2/2 58 360

4.2.1. Анализ ДНК С. trachomatis методом гПЦР

В данной работе нами были использованы праймеры на критическую плазмиду бактерии, которая присутствует в количестве 10 копий на клетку ; всех сероваров С. trachomatis (табл. 8 и 9).

На рис. 22 приведены результаты анализа методом гПЦР ДНК С trachomatis в материале соскобов из цервикального канала 2 женщин и и уретры мужчины, больных хламидиозом. Как видно из рисунка, в клиническо! материале от данных пациентов обнаружена ДНК С. trachomatis.

к 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 м

Рис. 22. Анализ ДНК С. trachomatis методом гПЦР в образцах соскобов из цервикального канала:

уретры. гПЦР с "внешними" праймерами (нечетные дорожки) и с "внутренними праймерами (четные дорожки).

Дорожки: 1-4 - ДНК из соскобов цервикального канала 2 женщин и 5, 6 - ДНК соскоба и уретры мужчины (пациенты с диагнозом хламвдиоз); 7-10 - ДНК, полученная от 2 здоровы доноров (мужчины и женщины соответственно); 11-14; 17, 18 - -ДНК C.pneumoniae, С psittaci, Mycoplasma pneumoniae соответственно; 15, 16 - положительный контрольны образец;. М - маркеры ДНК фХ174/Нае Ш

Специфичность анализа была подтверждена при проведении гПЦР с ДШ С. pneumoniae, С. psittaci, Mycoplasma pneumoniae, а также с ДНК от : здоровых доноров. Во всех случаях не наблюдалось появления специфические продуктов ПЦР (рис. 22). В случае гПЦР с ДНК С. psittaci в присутствш "внешних" праймеров наблюдалось появление лишь неспецифически: фрагментов ДНК (дорожка 13).

Удельный вес наиболее чувствительных методов диагностики хламидиоза применяемых при обследовании мужчин и женщин, по данным МЗ РФ

составляет: культуральный метод-9%; ПИФ-метод-24.3%; ИФА-2%. Очевидно, что в области разработки эпидемиологического надзора за 'рогенитальными хламидиозами отечественное здравоохранение находится в 1ачале пути.

Разработанная нами тест-система для анализа ДНК C.trachomatis внедрена I медицинскую практику (ТУ-9398-402-18137053-96), что позволяет надеяться га более эффективное использование метода ПЦР для диагностики ламидийных инфекций.

1.2.3. Анализ ДНК возбудителей туберкулеза методом гПЦР

В работе были использованы праймеры на область ДНК мембранного .нтигена (65 кДА) патогенных микобактерий, которые позволяют юуществлять первичный скрининг патогенов, общих для человека и швотных.

Прежде всего это микобактерии входящие в комплекс МТС (М. uberculosis, М. bovis BCG и М. bovis) и микобактерии вызывающие шпортунистические инфекции (М. avium и М. intracellulare).

Разработанная тест-система была использована для выявления содержания [атогенных микобактерий в мокроте пациентов с диагнозами подозрения на уберкулез и туберкулез (рис. 23, А, Б).

Как видно из рис. 23, А, в мокроте пациентов с подозрением на туберкулез одержание микобактерий различно и в ряде случаев выявляется лишь после [роведения ПЦР с "внутренними" праймерами. В случае пациентов, больных уберкулезом, ДНК патогенных микобактерий в мокроте, обнаруживается уже юсле ПЦР с "внешними" праймерами (рис. 23, Б).

м 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1q 11 12 13 14 15 16 м

440 bp 338 bp

Рис. 23. Анаши ДНК патогенных микобактерий в мокроте пациентов методом гПЦР с "внешними (нечетные дорожки) и "внутренними" праймерами (четные дорожки); М-маркеры ДН фХ174/НаеШ.;

А - анализ ДНК 6 пациентов с диагнозом подозрение на туберкулез (1-12) и 1 пациента ОРЗ (15, 16). Положительный контрольный образец (13, 14). Б-анализ ДНК 7 пациентов диагнозом туберкулез (1-14). Положительный контрольный образец (15,16)

Несмотря на то, что данная тест-система не позволяет идентифицироват] конкретный вид микобактерий, она является незаменимой с точки зрени быстрого (8 часов) первичного скрининга клинического материала н; содержание в нем их патогенных форм.

Необходимо отметить, что быстрый метод микроскопии, используемы! для выявления микобактериальной инфекции, является нечувствительны» (требуется более 10.000 бактерий на мл) (Bates J.H. 1979), < микробиологические методы анализа занимают очень много времени (2-Í недель) (Vestal A.L. 1975).

4.2.4. Анализ ДНК стафилококка методом гПЦР

В данных исследованиях были использованы праймеры на reí энтеротоксина A S. aureus.

Разработанная тест-система применялась для анализа ДНК золотистогс стафилококка, являющегося основным возбудителем стафилококковые заболеваний (Черкес Ф.К. и соавт. 1987). На рис. 24 представлены результата

по определению ДНК S. aureus в рвотных массах у пациента с пищевым травлением и в гнойной жидкости пациента с фурункулезом.

Как видно из рисунка 24, у 2 пациентов с пищевой интоксикацией и >урункулезом обнаружена ДНК S. aureus. Специфичность используемых нами [раймеров была подтверждена в экспериментах с ДНК здорового донора и с (НК бактерий, содержащих гены различных энтеротоксинов (дорожки 7-14).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

ис. 24. Анализ ДНК S. aureus методом гПЦР с "внешними" праймерами (нечетные дорожки) и с "внутренними" праймерами (четные дорожки).

Дорожки: 1,2- положительный контрольный образец; 3, 4 - анализ ДНК стафилококка в рвотных массах пациеита с пищевым отравлением; 5, б - анализ ДНК стафилококка в гнойной жидкости пациента с фурункулезом. гШДР с различными ДНК: V. cholerae (7, 8); Salmonella thyphimurium (9,10); Е. coliKS1651 (11,12); здоровый донор (13,14)

.2.5. Анализ ДНК возбудителен особоопасных инфекций методой гПЦР .2.5.1. Анализ ДНК возбудителя холеры методом гПЦР

В настоящее время установлено, что патогенность холерных вибрионов пределяется их способностью продуцировать холерный энтеротоксин, оторый кодируется ctx АВ-генами (или vet АВ-генами). При этом штаммы с гнами холерного токсина являются эпидемически опасными (Kaper G.B. et al. 981).

В своей работе мы использовали оригинальные праймеры на область ДНК перона vet AB генов штамма 2125 V. cholerae.

Результаты исследования методом гПЦР содержания vet АВ генов у • патогенных и 2 непатогенных штаммов V. cholerae представлены на рис. 25 (/ -В).

Как видно из рисунка, все 3 патогенных штамма содержат ДНК vet АВ -генов, в отличие от непатогенных штаммов. Необходимо отметить, что данньи патогенные штаммы относились к различным серогруппам, таким образом созданная нами тест-система позволяет идентифицировать токсигенност] различных штаммов V. cholerae независимо от их сероспецифичности, а таюю даёт возможность выявлять эпидемиологически опасные некультивируемьл штаммы V. cholerae из природных источников (Четина Е.В. и соавт. 1992).

*»

520 Ьр-302 bp-

t ¡и

ШШг

12 3

5 6

■ WL ¿JH m.i JH'L Ш) J

Ik'jtf&b&Vb''- -

-520 bp "302 bp

4-520 bp 4-302 bp

Рис. 25. Анализ ДНК vet АВ-генов различных штаммов V. cholerae методом гПЦР. А - патогенны штамм RV79 (1, 2 - ДНК человека; 3, 4 и 5, 6 - ДНК RV79 из 500 и 5000 клетет соответственно); Б - непатогенный штамм 19306 (1, 2 - ДНК го 5000 клеток) и патогенны штамм Р16064 (3,4 и 5,6 - ДНК из 500 и 5000 клеток соответственно); В - непатогенный штамм С197 (1,2 - ДНК из 5000 клеток) и патогенный штамм 569В (3,4: 5,6 - ДНК из 500 и 5000 клеток соответственно). гПЦР с "внешними" (нечетные дорожки): с "внутренними" праймерами (четные дорожки); М - маркеры ДНК DRIgest Ш

4.2.5.2. Анализ ДНК возбудителя чумы методом гПДР

Для анализа ДНК Y. pestis методом гПЦР нами были подобраны праймеры ¡а ДНК гена активатора плазминогена (Sodeinde О.А., Goguen J.D. 1989), вляющегося важным видовым маркером.

Результаты анализа ДНК Y. pestis методом гПЦР представлены на рис. 25. 1з рисунка видно, что данная тест-система дает возможность четко нализировать даже небольшое количество ДНК Y. pestis (100 бактериальных леток). При анализе ДНК Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis продуктов ПЦР не наблюдалось, что говорит об очень высокой специфичности анализа.

ис. 26 Анализ ДНК Y. pestis методом гПЦР с "внешними" (нечетные дорожки) и "внутренними" праймерами (четные дорожки). Анализ ДНК из различного количества клеток Y. pestis: 102 (1, 2); 103 (3, 4); 104 (7, 8) и образцы различных ДНК: человека (5, 6); блохи Hoplosyllus anomalus (9, 10); Y. enterocolitica (11, 12); Y. pseudotuberculosis (13, 14); M - маркеры ДНК (201-1600bp)

В настоящее время диагностика чумы основана на данных пидемиологического анализа, клинической картины и результатов абораториых исследований, которые связаны с выделением возбудителя, пределением антигена в исследуемом материале, обнаружением пецифических антител в сыворотке, биологическими пробами на морских винках и мышах. В отличие от традиционных методов анализа, тест-система а основе ПЦР позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью етектировать малые количества возбудителя чумы, что является важным оментом при раннем выявлении заболевания у людей, а также при истематических обследованиях энзоотичной по чуме территории с целью бнаружения эпизоотий среди грызунов.

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14

5. Использование некоторых разработанных амплификационных тест систем в медицинской и эпидемиологической практике

В настоящем разделе на примере двух разработанных нами тест-систе; продемонстрированы потенциальные возможности их применения медицинской практике. Амплификационная тест-система для анализа ДН возбудителя холеры была использована для установления патогенности ряд новых штаммов V. cholerae, полученных от больных из районов Дагестана : Таджикистана.

Вторая тест-система для анализа ДНК EBV была использована дл установления возможной этиологической роли данного вируса в развита разновидности кожной Т-клеточной лимфомы человека-"грибовидного микоза (Mycosis fungoides).

5.1. Использование амплификационной тест-системы для анализа ДШ возбудителя холеры с целью определения патогенности ряда природны штаммов V. cholerae

Начиная с 1961 года мир переживает 7-ю пандемию холеры, вызванную \ cholerae 01 биотипа El Tor. В конце 1992 г. в Бангладеш вспыхнула крупна эпидемия холеры, возбудителем которой был V. cholerae новой серогрупт 0139. Как уже отмечалось выше (раздел 4.2.4.1), эпидемически опасным являются штаммы V. cholerae, содержащие гены, кодирующие синте холерного токсина (vet АВ-гены).

Было показано, что токсигенные штаммы представляют собой генетическ гомогенную популяцию независимо от времени и места выделения (Гинзбур АЛ. и соавт. 1989). Это дало основание высказать достаточно обоснованно предположение о том, что на наблюдаемых территориях в течение многи сезонов циркулирует один и тот же эпидемически значимый штамм.

Анализируемые нами 4 штамма V. cholerae были представлен] РосНИИПЧИ "Микроб" и относились к биотипу El Tor (табл. 10).

Анализ данных штаммов показал, что все они содержат vet АВ-гены и, шедовательно, являются патогенными для человека (рис. 27).

Это означает, что на данных территориях (Дагестан и Таджикистан) щркулируют эпидемически значимые штаммы холерного вибриона биовара Е1 Гог, которые способны вызвать эпидемию или вспышку холеры.

Таблица 10. Характеристика исследуемых штаммов V. cholerae.

Штамм Место и год выделения Объект выделения Наличие генов холерпого токсина

/.cholerae М045 серогруппа 0139) Бангладеш 1992г. ах АВ(+)

/.cholerae 427-Д ElTor) Дагестан 1993г. испражнения больной холерой не изучено

/.cholerae 167-Д El Tor) Дагестан 1993г. испражнения больной холерой не изучено

f .cholerae 320-T El Tor) Таджикистан 1993г. испражнения вибрионосителя не изучено

cholerae 641-T El Tor) Таджикистан 1993г. испражнения больной холерой не изучено

1 2 3 4 5 6 7 М М" 8 9 10 11121314

520 Ьр_

4—302 bp

ис. 27, Исследование содержания генов холерного токсина в 4 природных штаммах V. сЬо1егае методом г1ЩР с "внешними" (1-7) и "внутренними" праймерами (8-14); М и М" - маркеры ДНК ПЖ^ез! Ш и V соответственно. Дорожки 7, 14 - геномная ДНК человека. Анализ ДНК из штаммов: М045 (1, 8); 427-Д (2, 9); 167-Д (3, 10); 320-Т (4, 11); 641-Т (5, 12). Положительный контрольный образец (ЯУ19) - 6,13

5.2. Использование амплификационной тест-системы для анализа ДН1 EBV с целью выяснения возможной этиологической роли данного вируса развитии кожной Т-клсточной лнмфомы человека

EBV, являясь этиологическим агентом лимфомы Баркитта, был обнаруже в тканях пациентов с другими видами лимфом (Shearer W.T. et al. 1985, Weis L.M. et al. 1989). Мы предположили, что EBV может играть этиологическу! роль в развитии кожной Т-клеточной лимфомы Mycosis fungoides (MF), так ка 69% пациентов с данным заболеванием имели повышенный титр антител ядерному антигену EBV (EBNA), который является фактором репликаци вируса (Lee P.Y.P. et al. 1990).

В работе использовали образцы ДНК из мононуклеарных клето периферической крови 29 пациентов (22 мужчин и 7 женщин) в возрасте от 2 до 85 лет, имеющих продолжительность заболевания от 3 месяцев до 15 лс Распределение пациентов по стадиям заболевания было следующим: 13 (стади I А), 10 (I В), 1 (II А), 1 (II В) и 4 (III). Лечение пациентов проводил облучением УФ. Девяти пациентам проводили дополнительное лечени интерфероном. Никому из пациентов не проводили переливания крови.

Ранее было установлено, что этиологическим фактором MF является виру HTLV1 (Gallo R.C. et al. 1987, Hall W.W. et al. 1991). В связи с этим мы провел анализ ДНК пациентов методом ПЦР на содержание в ней провирусной ДН HTLV1 (рис. 28). Только у 10 пациентов из 29 (34%) была обнаружен провирусная ДНК HTLV1. Согласно литературным данным, HTLV выявляете в 1-60% случаев у больных с кожной Т-лимфомой (Hall W.W. et al. 1991).

1 23 45 67 8 9 10 11 12

г,. -Ч <•* - - 1 . '* -

t \, s \ ^ т-. - * ^11 э Ьр

[С. 28. Анализ продуктов ПЦР-амплификации pol-гена HTLV1 методом дот-блот-гибрщшзации со специфической DIG-меченой ДНК-пробой. Представлены результаты анализа 10 HTLV1-нозитивных пациентов с MF (1-10) и одного здорового донора (И). Положительный контрольный образец (12). Стрелкой указан специфический продукт ИТ TP (119 Ьр)

Анализ ДНК пациентов с MF на содержание в ней генома EBV показал у 9 ищентов из 29 (31%) высокое содержание данного вируса (рис. 29).

: 1 2 з к- к+

m'i 2 з"| г з"1 2 з' 1 2 3 1 2 3 М

г—:——~—^—п

590 Ьр „ Л

405 Ьр —"

гог ьр-^

590 Ьр f . * * '

405 Ьр^ Г:^ - ^

гог Ьр "'s - " " •*-

1_—............

М12312 3, 123123123М »-11-11-»1-11-i

4 5 6 К- К+

с. 29. Анализ ДНК EBV у 6 пациентов и 2 здоровых доноров (А и В). Дорожки: 1 (А и В)- ПЦР анализ области репликона EBV; 2, 3 (А и В) - гПЦР-анализ W-повтора EBV с "внешними" праймерами соответственно; К - (А и В)-ДНК здоровых доноров. К+ (А и В) -положительный контрольный образец (ДНК В95-8); М - маркеры ДНК фХ 174/Нас Ш

При анализе ДНК в образцах от 20 здоровых доноров содержания ДН EBV обнаружено не было.

Гибридизационный анализ продукта ПЦР, полученного при проведени ПЦР с праймерами на область репликона EBV, и сравнение этих данных калибровочными пробами данного продукта показали, что эффективность ПЦ составила 76-79% (рис. 30), исходя из уравнения: (l+X)n=Y, где У, эффективность ПЦР, п-количество циклов ПЦР, Y-выход специфическог ПЦР-продукта. При этом содержание вируса в расчете на клетку рассчитывал! используя известные данные по линии В95-8 (180-370 копий на клетку, Mulle Т.М. et al. 1976).

Рис. 30. Исследование эффективности ПЦР-анализа ДНК ЕВУ у 6 пациентов с МИ (35 циклов ПЦР А - ПЦР амплификация области репликона ЕВУ пациентов (1-6).

Калибровочные стандарты продукта ПЦР, эквивалентные различному количеству вируснь копий: ЗхЮ'2, 1.5x10й, 7x10й, ЗхЮ11, 1.5x10м, 7хЮ10, ЗхЮ9, 1.5х109 копий ЕВУ (7-1 соответственно); Б - гибридизационный анализ по Саузерну продуктов ПЦР геля А с ЭК меченой ДНК- пробой еЪЛ (5'-СССТССТСТСОССОТСС-3'); М - маркеры ДНК фХ174/Н Ш

Гибридизационный анализ амплифицированных образцов ДНК здоровы доноров не показал даже присутствия минорных количеств продукта ПЦР (ри 31). Это объясняется очень низким содержанием ЕВУ у здоровых лкда которое составляет всего несколько копий вируса на 106 клетс периферической крови (Yao й а1. 1985, РеёпеаиИ Ь., Ка1г В., 1993).

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14

М 123456789 10 11

405 Ьр

405 bp

* 4

Tic. 31. Амплификация ДНК здоровых доноров (36 циклов ПЦР) с праймерами на область репликона EBV. А - анализ продуктов ПЦР в агарозном геле. Дорожки: 2-11 - образцы от 10 здоровых доноров, 1 - положительный контрольный образец (ДНК В95-8); М - маркеры ДНК фХ174/Нае Ш;

Б - гибридизационный анализ продуктов ПЦР геля А с DIG-меченой пробой ebvZ

Нами также были проведены исследования по выяснению содержания 1BV в образцах ДНК от пациентов с другими видами лимфом и кожным аболеванием, таким как парапсориаз (табл. 11).

аблица 11. Анализ ДНК EBV у здоровых доноров н у пациентов с азлнчнымн заболеваниями.

аболеванпс Общее количество пациентов Количество пациентов, позитивных по EBV EBV-позитивные пациенты, %

[ycosis fungoides :ожная Т-лимфома) 29 9 ~31

арапсориаз 22 0 0

on-Hodgkin's 1мфома 16 1 ~6

оликлональные шфомы 18 2 -И

ц-рессивные" шфомы неясной иологии 21 1 ~5

даровые взрослые шоры 20 0 0

■ н

Как видно из табл. 11 количество позитивных по EBV пациентов другими лимфомами очень незначительно. У больных парапсориазом гене EBV в ДНК клеток периферической крови не обнаружен.

Выяснение этиологической роли того или иного вируса в развит! определенного заболевания является довольно сложной задачей. Одна] достаточно высокий уровень встречаемости EBV-позитивных пациентов сред больных MF, по сравнению со здоровыми донорами и пациентами с другил заболеваниями, может указывать на наличие связи между EBV и этиологш MF. Кроме того, среди больных MF количество позитивных по HTL\ (этиологический агент MF) и по EBV пациентов практически совпадает, ч-также подтверждает сделанное выше заключение. Более того, в случ; лимфомы Баркитта, этиологическим агентом которой является EBV, у больнъ в лимфоцитах может как присутствовать, так и отсутствовать геном данно] вируса (Bazarbachi A.F. et al. 1993).

Для выяснения вопроса, каким типом EBV инфицированы пациенты с М мы провели секвенирование продуктов ПЦР (590 Ьр и 405 Ьр), содержанц последовательности W-повтора и oriP-участка репликона вируса, использ; метод ПЦР с BIOTAQ и праймерами ebvPl и ebvP3. Известно, что А- и В-тип EBV отличаются по ДНК-последовательностям WYH-кластера, кодирующе! вирусный антиген EBNA2 (Dambangh Т. et al. 1984).

При секвенировании фрагмента W-повтора у 4 пациентов с MF бьи обнаружена точковая мутация G—»A в положении 13956 по геному EBV В95-При установлении нуклеотидной последовательности в oriP-участке реплико! EBV у 1 пациента обнаружена делеция ТСТ (положение 8453-8455), а у пациентов имела место мутация С-»А (положение 8573) и вставка +С (Сб-»( в положении 8751).

Сравнение полученных нами данных с последовательностями А- и 1 типов EBV показало, что у всех 9 пациентов с MF присутствует вирус А-типа.

1ыводы

Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния термостабильная Ith Днк-полимераза из штамма Thermus thermophilus КТП. Отработана оригинальная методика получения препарата данного фермента. Показана возможность использования нативной Tth ДНК-полимеразы в ПЦР. Исследована эффективность катализа ПЦР в зависимости от соотношения компонентов реакционной смеси и других параметров реакции. Подобраны оптимальные условия амплификации участков ДНК большой протяженности.

Исследована возможность использования нативной Tth ДНК-полимеразы для проведения совмещенных реакций ОТ/ПЦР на матрицах РНК в присутствии ионов Мп2+. Изучено влияние двухвалентных катионов на ОТ/ПЦР.

Разработаны эффективные тест-системы анализа 16S рибосомной РНК из В. subtilis, мРНК рецепторного белка CD-4 и мРНК белка множественной лекарственной устойчивости (MDR-1).

На основе использования рекомбинантной Taq ДНК-полимеразы и оригинальных праймеров разработаны амллификационные тест-системы для анализа генетических последовательностей патогенных для человека вирусов Эпштейна-Барр, простого герпеса 1 и 2 типов, иммунодефицита человека 1 типа, гепатита А и В и цитомегаловируса. Созданы амплификационные тест-системы для анализа ДНК бактерий возбудителей хламидиоза, туберкулеза, холеры, чумы и стафилококковой инфекции. Тест-система для анализа ДНК С. trachomatis внедрена в медицинскую практику.

С использованием разработанной тест-системы для анализа ДНК возбудителя холеры выявлена патогенность для человека ряда штаммов V. cholerae, циркулирующих на территориях Дагестана и Таджикистана.

8. С применением созданной тест-системы для анализа ДНК виру Эпштейна-Барр установлена возможная этиологичекая роль данно: вируса типа А в развитии кожной Т-клеточной лимфомы Mycos fungoides.

Список работ, опубликованных по теме диссертация

1. А.И. Глухов, С.Л. Васильев. Программа обучения методике работы геномом вируса Эпштейна-Барр //Тезисы докладов Совещаш специалистов стран членов СЭВ "Персональные ЭВМ в задач; проектирования и поддержки решений". Суздаль, 1989. С. 11.

2. А.В. Кабанов, В.И. Киселев, М.Д. Чикиндас, И.В. Астафьев, А.И. Глухс С.А. Гордеев, В.А. Изумрудов, А.Б. Зезин, А.В. Левашов, Е.С. Севери В.А. Кабанов. Повышение трансформирующей активности плазмидю ДНК путем ее включения в интерполиэлектролитный комплекс карбоцепным поликатионом //Доклады Академии наук СССР. 1989. Т. 31 (1). С. 226-229.

3. А.И. Глухов, Е.С.Северин, В.И. Киселев, В.М. Крамаров, О.И. Киселг Штамм Thermus thermophilus КТП-продуцент термостабильной ДН полимеразы. (1989). Заявка о выдаче Российского патента №4745580/1 решение о выдаче патента от 26. 11 90.

4. A.I. Glukhov, S.A. Gordeev, V.I. Kiselev. DNA amplification for dirt detection of Epstein-Barr virus in cell lines and peripheral blood eel //Abstracts of VIII th International congress of virology. (!990). p.291. Berli GDR.

5. A.I. Glukhov, S.A. Gordeev, S.V. Vinogradov, V.M. Kramarov,V.I. Kisele O.I. Kiselev, E.S. Severin. Amplification of DNA sequences of Epstein-B; and human immunodeficiency viruses using DNA polymerase from Therm thermophilus //Mol. Cell. Probes. 1990. V. 4. PP. 435-443.

6. А.И. Глухов, C.A. Гордеев, С.Л. Васильев. Прямая детекция ДНК виру иммунодефицита человека в клетках периферической крови метод

амплификации in vitro с Tth ДНК-полимеразой. //Тезисы докладов Всесоюзной школы-семинара "Молекулярная биология и медицина". Ленинград, 1990. С. 75,.

А.И. Глухов, СЛ. Васильев. Программная система для выполнения высокотемпературной циклической реакции амплификации с целью прямой детекции вируса Эпштейна-Барр в клеточных линиях //Там же. С. 76.

А.И. Глухов, С.А. Гордеев, C.JI. Васильев. Амплификация специфической последовательности ДНК вируса Этлтейна-Барр с целью его детекции в различных клеточных линиях и клетках периферической крови //Там же. С. 77.

И.М. Колосова, А.И. Глухов, C.B. Виноградов, В.И. Киселев, И.Н. Курочкин. Гибридизационный анализ ДНК вируса Эпштейна-Барр ковалентноиммобилизованной на твердой подложке //Молекулярная вирусология и медицинская биотехнология". Ленинград. 1990. С. 71-76.

A.И. Глухов, С.А. Гордеев, C.B. Виноградов, В.И. Киселев. Использование циклической полимеразной реакции с Tth Днк-полимеразой с целью детекции ДНК вируса иммунодефицита человека в клетках периферической крови //Там же. С. 33-36.

С.Л. Кальнов, А.И. Глухов, С.А. Гордеев, C.B. Виноградов, О.В. Борисова,

B.И. Киселев. Детекция вируса Эпштейна-Барр в клетках крови методом полимеразной цепной реакции с Tth ДНК-полимеразой //Там же. С. 36-40. А.И. Глухов, С.А. Гордеев, C.B. Виноградов, В.И. Киселев, В.М. Крамаров, О.И. Киселев, Е.С. Северин. Амплификация последовательностей ДНК вируса Эпштейна-Барр и вируса иммунодефицита человека с использованием ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus //Молекулярная биология. 1990. Т.24 (3). С. 781-787.

А.И. Глухов, С.А. Гордеев, М.Е. Трофимова, C.B. Виноградов, И.В. Алексюк, В.М. Крамаров. Разработка фундаментальных и методических

основ ДНК-диагностики с использованием реакции высокотемпературно циклической амплификации //Тезисы докладов I Всесоюзной плановс отчетной конференции "Генная и клеточная инженерия". Пущино-на-Ок 1990. С. 11-12.

14. М.В. Никулин, А.И. Глухов, В.И. Киселев. Клонирование области ДН большого внутреннего повтора генома вируса Эпштейна-Бар] содержащей цис-активные регуляторные последовательности //Тезис докладов П Всесоюзного симпозиума "Теоретические и прикладнь аспекты молекулярной биологии". Самарканд. 1991. С. 148.

15. М.Е. Трофимова, Т.В. Гребенникова, С.А. Гордеев, А.И. Глухов, B.I Грабовецкий. Оптимизация условий проведения полимеразной цепне реакции с Tth ДНК-полимеразой //Там же. С. 194.

16. А.И. Глухов, М.Е. Трофимова, С.А. Гордеев, Т.В. Гребенникова, СЛ Виноградов, В.И. Киселев, В.М. Крамаров. Амплификащ последовательностей ДНК фага X методом полимеразной цепной реакщ с использованием термостабильной ДНК-полимеразы //Молекулярн< биология. 1991. Т. 25 (6). С. 1602-1610.

17. A.I. Glukhov, T.V. Grebennikova, V.I. Kiselev. Use of thermostable TETDNA polimerase in RNA detection by coupled RT/PCR reactions //Abstracts -ATB-92 conference "Advanced technology for the clinical laboratory ai biotechnology" Milan, Italy. 1992. P. 20.

18. А.И. Глухов. Разработка фундаментальных и методических основ ДШ диагностики с использованием реакции высокотемпературнс циклической амплификации //Тезисы докладов П Всесоюзной планов отчетной конференции "Генная и клеточная инженерия". Пущино-на Ок 1992. С. 13-14.

19. V.I. Kiselev, A.I. Glukhov, E.S. Severin. New methods of diagnosis of vii infections //Abstracts of International symposium" 100 years of virology", f Petersburg. 1992. P. 108.

0. А.И. Глухов, С.А. Гордеев, М.В. Воронин, В.Й. Киселев. Создание амплификационной тест-системы для детекции заболеваний вирусной и бактериальной этиологии //Материалы докладов Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" Пермь. 1993. С. 36-37.

. N. Manca, Е. Piacentini, М. Gelmi, A. Glukhov, P. Calzavara, F. Gargiulo, F. Pirali, A. Turano. Persistence of Human T- Cell Lymphotropic Virus Type 1 (HTLV-1) Sequences in Peripheral Blood Mononuclear Cells from Patients with Mycosis Fungoides // J. Exp. Medicine. 1994. V. 180. PP. 1973-1978.

. А.И. Глухов, E.B. Гребенникова, В.И. Киселев. Е.С. Северин. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции мРНК рецептора CD-4 //Молекулярная биология. 1995. Т. 29 (4). С. 941-949.

. Т.В. Гребенникова, А.И. Глухов, Л.Г. Чистякова, В.И. Киселев, Е.С. Северин. Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2а и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1) //Молекулярная биология. 1995. Т. 29(4). С. 930-941.

. A.I. Glukhov, T.V. Grebennikova. Effect of divalent cations on the efficiency of RT/PCR reactions with TET-Z polymerase //Abstracts of ATB-95 conference "Abvanced technology for the clinical laboratory and biotechnology. Milan, Italy. 1995. P. 32.

N. Manca, A. Glukhov, A. Turano. Epstein-Barr virus and Mycosis fungoides //Reports of Annual International conference "Retroviruses". Rockefeller University Press, New York, USA. 1995. P. 31-33.

26. A.I. Glukhov, T.V. Grebennikova, V.I. Kiselev, E.S. Severin. "Detection CD-4 receptor mRNA by combined reverse transcription and amplificati using Thermus thermophilus DNA polymerase //Mol.Biology. 1995. V. 29 № part 2. PP.548-552.

27. T.V. Grebennikova, A.I.Glukhov, L.G. Chistyakova, V.I. Kiselev, E.S. Sever Detection of interleukin-2 RNA and determination of MDR-1 gene expressi by combined reverse transcription and amplification using Them thermophilus DNA-polymerase //Mol. Biology. 1995. V.29 № 4, part 2. I 542-547.

28. А.И. Глухов. C.A. Гордеев, JI.B. Аврамова, В.И. Киселев, Е.С. Север! Детекция инфекционных агентов вирусной и бактериальной этиолог методом полимеразной цепной реакции //Клиническая лаборагорг диагностика. Москва; "Медицина", 1996. Т. 1. С. 32-35.

29. А.И. Глухов, Г.Г. Онищенко, С.А. Гордеев, С.В. Грачев, В.Н. Верясов, Е Северин, Ю.А. Попов, А.Н. Куличенко, А.В. Наумов. Определен содержания гена холерного токсина в составе ДНК из штаммов Vib cholerae методом "гнездовой" полимеразной цепной реакции //Журк микробиологии. 1996. № 5. С. 20-22.

30. А.И. Глухов, М.В. Воронин, С.Е. Северин. Использован рекомбинантных термостабильных ДНК-полимераз (Biotaq и rTth) молекулярной диагностике //Тезисы докладов Международн конференции "Агробиотехнология растений и животных". К» Республика Украина. 1997. С. 15-16.

31. S.A. Gordeev, A.I. Glukhov. Development of super-sensetive test systems bas on the polymerase chain reaction (PCR) method for quick detection of Di agents of cholera, plague and tuberculosis //Reports of the Internatioi symposium "Severe infection deseases: express-diagnostics and preventioi Киров. 1997. С. 121-122.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Глухов, Александр Иванович, Москва

ПРАВИТЕЛЬСТВО МОСКВЫ

КОМИТЕТ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Г. МОСКВЫ

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОЙ ЭКОЛОГИИ

На правах рукописи уда 577.213.32: 578.825.13.

ГЛУХОВ Александр Иванович

Москва. 1998г.

Научный консультант:

член-корреспондент РАН, доктор химических наук Е.С. Северин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

член корреспондент РАН и РАМН В.А. Ткачу**

доктор биологических наук, профессор (Г

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Биология*!*, ал

Защита состоится 25 июня 1998 г. в

на заседании Специализированного совета 1.02.01. при Центе медике ■ биологических и экологических проблем РАЕН по I 13Ы>, Москва,

Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН. 1 ' -..

Автореферат разослан " ^ " 1998г.

' Я и' * яь *

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Актуальность проблемы

Одной из важнейших проблем молекулярной биологии является проблема детекции малых количеств ДНК и РНК. Стандартные методы анализа нуклеиновых кислот либо очень трудоемки, либо требуют большого количества исследуемой ДНК или РНК. Открытие метода ПЦР дало в руки исследователей самый чувствительный метод анализа нуклеиновых кислот. С помощью данного метода даже из нескольких молекул ДЕЖ можно получить необходимое количество копий ее специфического фрагмента. Использование термостабильных ДНК-полимераз привело возможности автоматизировать метод ПЦР (Sairi R.K. 1986, Krawets S.A. et al. 1989). Кроме того, было показано, что некоторые термостабильные ДНК-полимеразы обладают обратнотранскриптазной (ОТ) активностью (Tse W. Т., Forget B.G. 1990). Это свойство позволяет использовать данные ферменты для непосредственной детекции молекул РНК методом совмещенных реакций обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР) (Myers W. Th, Gelfand D.H. 1991), что решает ряд проблем, связанных с негативным влиянием вторичной структуры РНК на эффективность синтеза кДНК. Одной из первых была изучена Taq-полимераза, г>енная го термофильной бактерии Thermus aquaticus YT1 (Каледин А.С. и . V-Q80, Saiki R.K. et al. 1988). В настоящее время осуществлен и ведется жк новых источников термостабильных ДНК-полимераз, обладающих «дам преимуществ по сравнению с Taq-полимеразой, например, более !сг>кой термостабильностью, способностью амплифицировать участки ДНК чфьшей протяженности, низкой частотой ошибок при синтезе, ярко

хфаженной ОТ-активностью (Francine В.Р, 1996). »

В настоящее время амплификационная ДНК/РНК-диагностика, основанная на методах ПЦР и ОТ/ПЦР, все шире и шире используется в лабораторной и медицинской практике. Основными преимуществами этого метода, делающими его незаменимым в диагностике, являются, как уже отмечалось выше, высокая чувствительность, а также быстрота анализа (5-10 ч), позволяющая создавать тест-системы со специфичностью, приближающейся к 100%.

В последнее время к проблемам распространения СПИД, инфекционных гепатитов, герпетических инфекций, особоопасных инфекций (холера, чума), туберкулеза, стафилококковых инфекций и хламидиоза приковано самое пристальное внимание ученых и медиков. Однако нужно отметить, что быстрое выявление возбудителей данных заболеваний на сегодняшний день остается пока единственным реальным средством их профилактики. Таким образом, разработка высокочувствительных тест-систем на основе ПЦР является одной из важных задач современной науки и медицины.

Использование термостабильных ДНК-полимераз, способных катализировать ОТ/ПЦР и позволяющих тем самьм детектировать молекулы мРНК различных белковых факторов, является ключевым моментом в РНК-диагностике. В частности, анализ в клиническом материале мРНК СВ-4 рецептора, через который происходит инфицирование клеток вирусом иммунодефицита человека, вызывающего СПИД, а также мРНК гена множественной лекарственной устойчивости (ШЖ-1) может иметь важное значение с научной и медицинской точки зрения.

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы состояла в отработке метода выделения и очистки термостабильной ТЙ1 ДНК-полимеразы из штамма термофильной бактерии ТЬегтш ЛегторЫкю КТП и в использовании полученного гомогенного препарата фермента для подбора оптимальных условий анализа ДНК методом ПЦР и РНК методом ОТ/ПЦР. Кроме того, целью настоящей работы было

создание и использование в медицинской практике амплификационных тест-систем на основе метода ПЦР с рекомбинантной Taq ДНК-полимеразой для анализа специфических ДНК или РНК вирусов и бактерий , патогенных для человека.

Во время выполнения работы были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Отработать методику выделения и очистки Tth-полимеразы из штамма Thermus thermophilus КТП.

5. Исследовать оптимальные условия анализа методом "гнездовой" ПЦР (гПЦР) с Taq-полимеразой генетических последовательностей патогенных для человека вирусов: вируса Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловируса (CMV), вируса простого герпеса 1 и 2 типов (HSV1 и HSV2), вируса иммунодефицита человека 1 типа (HTV1), вирусов гепатита А и В (HAV и HBV);

7. Выяснить эпидемиологическую роль для человека ряда природных штаммов V. cholerae с использованием разработанной амплификационной тест-системы для анализа ДНК возбудителя холеры;

8. Проанализировать возможную этиологическую роль EBV в развитии одного из вариантов кожной Т-клеточной лимфомы человека (Mycosis fungoides) с использованием разработанной амплификационной тест-системы для анализа ДНК данного вируса.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые выделена и очищена до гомогенного состояния нативная Tth ДНК-полимераза из штамма Thermus termophilus КТП. Отработан метод выделения Tth-полимеразы, позволяющий получать фермент с гомогенностью более 90%.

Впервые показана возможность использования фермента в ОТ/ПЦР реакции. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР и ОТ/ПЦР с использованием Tth-полимеразы. На основании проведенных исследований продемонстрирована возможность синтеза и амплификации больших фрагментов кДНК на матрице рРНК из В. subtilis.

Созданы специфические и высокочувствительные амплификационные тест-системы на основе метода гПЦР с Taq-полимеразой с оригинальными праймерами для детекции генетических последовательностей патогенных для человека вирусов (EBV, HSV1, HSV2, HTV1, CMV, HBV и HAV) и бактерий (возбудители холеры, чумы, туберкулеза, хламидиоза, стафилококковой инфекции).

С использованием разработанных тест-систем впервые была установлена патогенность для человека ряда шгаммов-изолятов V. cholerae и показана возможная этиологическая роль EBV в развитии кожной Т-клеточной лимфомы человека (Mycosis fungoides).

Выполненная работа имеет важное практическое значение. Возможность амплифицировать непосредственно рибосомальные РНК, являющиеся важнейшим таксономическим признаком, имеет практическую ценность с точки зрения систематики микроорганизмов. Возможность детекции мРНК CD-4 рецепторов поможет в исследовании популяции CD-4 позитивных клеток периферической крови, так как данные рецепторы связаны с проникновением HIV1 в клетку человека. Прямое определение экспрессии гена MDR-1 позволит быстро и эффективно следить за качеством химиотерапии и применять индивидуальные схемы лечения онкологических больных.

Высокая степень чувствительности и специфичности ПЦР и ОТ/ПЦР с использованием Tth-полимеразы позволит широко использовать ее для прямой детекции молекул РНК, а также в генно-инженерных исследованиях.

Разработанные амплификационные тест-системы для анализа генетических последовательностей вирусов и бактерий, патогенных для человека, позволят с высокой специфичностью и чувствительностью выявлять возбудителей заболеваний в различном клиническом материале и объектах окружающей среды. В настоящее время амплификационная тест-система для анализа С. trachomatis внедрена в медицинскую практику (ТУ-9398-402-18137053-96).

Основные положения, выносимые на защиту

отработка методики и очистка нативной Tth ДНК-полимеразы; оптимизация методов ПЦР и ОТ/ПЦР с Tth ДНК-полимеразой для анализа нуклеиновых кислот;

создание амплификационных тест-систем на основе метода гПЦР с рекомбинантной Taq-полимеразой для специфического выявления ряда вирусов и бактерий, патогенных для человека;

использование разработанных амплификационных тест-систем для исследования возможной этиологической роли EBV в развитии кожной Т-

клеточной лимфомы и для анализа патогенности для человека ряда штаммов V. сЬо1егае. Апробация работы

Результаты были представлены на 2-й Всесоюзной конференции "Интерполимерные комплексы" (Рига, 1989), на совещании специалистов стран-членов СЭВ "Персональные ЭВМ в задачах проектирования и поддержки решений" (Суздаль, 1989), на 8-м Международном конгрессе по вирусологии (Берлин, 1990), на Всесоюзной школе-семинаре "Молекулярная биология и медицина" (Ленинград, 1990), на 1-й и 2-й Всесоюзных планово-отчетных конференциях по направлению "Генная и клеточная инженерия" (Пущино-на-Оке, 1990, 3991), на 2-м Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), на Международном симпозиуме "100 лет вирусологии" (С.-Петербург, 1992), на Международной биотехнологической конференции АТВ-92 и АТВ-95 (Милан, 1992, 1995), на Всероссийской научно-практической конференции "Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики" (Пермь, 1993), на ежегодной Международной конференции Р.Галло "Ретровирусы" (Нью Йорк, 1995), на городском научно-практическом семинаре "Диагностические системы Московского НИИ медицинской экологии" (Москва, 1997), на Международной конференции "Агробиотехнологии растений и животных" (Киев, 1997), на Международном симпозиуме "Особоопасные инфекции: эпидемиология, экспресс-диагностика и профилактика" (Киров, 1997). Материалы и методы исследования

В работе использовались следующие реактивы: трис, хлористый цезий, ДНК из спермы лосося и фага X, фенол, хлороформ, протеиназа К, твин-20, сульфат аммония, MgCl2, агароза, дезоксинуклеозидтрифосфаты (с1АТР, сЮТР, ёСТР, сЛТР), БВБ, хлорид натрия, гидроокись натрия, хлорид калия, БОТА,

полимин Р, хлорид марганца, бромистый этидий, АТР, пирофосфат натрия , акриламид, TEMED, КГ,1\'-метиленбисакриламид, персульфат аммония, борная кислота, дитиотреитол, EGTA, ß-меркаптоэтанол, глицерин ("Sigma", США); фосфоцеллюлоза ("Whatman", Англия); маркеры молекулярной массы белков ("Pharmacia", Швеция); [а-32Р] dCTP, [3Н] dTTP, маркеры молекулярной массы ДНК, буфер для ДНК-гибридизации, мембранные фильтры Hybond N+ ("Amersham", Англия), маркеры молекулярной массы ДНК, AMV и MMLV ревертазы ("Promega", США); однозамещенный и двузамещенный фосфат калия ("Merk", Германия).

Фермент Tth-полимераза выделяли из штамма Thermus thermophilus КТР. Биомассу обрабатывали ультразвуком, фермент осаждали полимином Р, фракционировали сульфатом аммония и очищали последовательными хроматографиями на фосфоцеллюлозе и на FPLC -колонке с ионообменником Mono Q HR 5/5 ("Pharmacia", Швеция). Активность Tth-полимеразы определяли по включению [а32Р] dCTP в "активированную" ДНК спермы лосося по методу (Cantoni G.L. 1966). Гомогенность препарата фермента определяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (Laemmli U.K. 1970). Концентрацию белка в растворах определяли по известному методу (Lowry О.Н. et al. 1951). Выделение ДНК проводили стандартным фенольно-хлороформным методом с использованием протеиназы К и SDS (Maniatis Т. et al. 1984).

Рекомбинантную Taq-полимеразу (BIOTAQ) выделяли из штамма-продуцента PVG-A1 по методу (Патрушев Л.И. и соавт. 1993).

Синтетическую РНК IL-2a получали методом транскрипции in vitro (Kolosov M.I. et al. 1992) с использованием плазмиды pGEM-IL-2a. Суммарную клеточную РНК выделяли описанным ранее методом (Chomczynski P. and Sacchi N. 1987).

Pi & -ч' i ^ ч;' 'У J" 'V :

Перенос фрагментов ДНК из агарозного геля на мембранные фильтры диффузным методом и их анализ дот-блот-гибридизацией с мечеными ДНК-зондами проводили по описанной ранее методике (Maniatis Т. et al. 1984). ДНК-зонды метили дигоксигенином (DIG) и проводили иммунодетекцию образовавшихся ДНК: ДНК-комплексов с помощью коммерческого набора "DIG DNA labeling and Detection Kit" ("Boehringer", Германия).

Подбор праймеров для ПЦР и ОТ/ПЦР осуществляли с помощью компьютерных программ "Microgenia" ("Beckman", США), "01igo5" (NCI, США) и "Праймер" разработанной в ВНЦМДЛ (Россия). Синтез праймеров проводили на автоматическом ДНК-синтезаторе "Applied biosystem 380А" (США) и очищали электрофорезом в полиакриламидном геле.

ПЦР проводили в инкубационной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 7.0-9.0 (при 25°С), 16.6 мМ (NH4)2S04,0.01% (в/о) твин-20, 1.28-5.2 мМ MgCl2, 0.02-0.9 мМ каждого dNTP, 0.1-1 мкМ каждого праймера, 2-8 нг ДНК фага "К или 0.5-1 мкг геномной клеточной ДНК, или 0.05-10 мг плазмидной ДНК, 1-4 ед. Tth-полимеразы или BIOTAQ

ОТ-активность Tth -полимеразы или Taq-полимеразы ("Cetas Percin Elmer", США) определяли в реакционной смеси, содержащей 67мМ Трис-HCl, рН8.8, 16.6мМ (NH4)2S04,16 пмоль праймера RT54, 10s копий РНК IL-2a. 1мМ МпС12 0.25мМ каждого dNTP, ImkKu [3Н] dTTP (83Ки/ммоль), 5ед. Tth-полимеразы или Taq-полимеразы. Реакцию проводили по описанному ранее методу (Maniatis Т. et al. 1984).

ОТ/ПЦР проводили в реакционном буфере содержащем 67мМ Трис-HCl, рН8.8, 16.6 мМ (NH4)2S04, 0.01% (в/о) твин-20 по методу (Myers W.Th. and Gelfand D.H. 1991).

При разработке амплификационных тест-систем в качестве положительных контрольных образцов были использованы следующие очищенные препараты нуклеиновых кислот: ДНК В95-8 (EBV+), ДНК L2 vero (HSV1+), ДНК fffi vero (HSV2+), ДНК культуры клеток фибробластов человека,

инфицированных CMV, ДНК рВНЮ, содержащая геном HIV1, ДНК pHBV, содержащая геном HBV, ДНК кулыуры клеток, инфицированных С.trachomatis (штамм L-1), ДНК штаммов М. tuberculosis H37Rv, M. avium, M. bovis BCG, ДНК штамма S. aureus FRJ-722 (H), РНК HAV штамма HM 175. Данные препараты, а также клинический материал от пациентов, инфицированных тем или иным возбудителем, образцы от здоровых доноров и онкологических больных были любезно предоставлены Институтом микробиологии и Центральным госпиталем г. Бреша (Италия). ДНК штаммов V. cholerae, Y. pestis, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis и токсигенных штаммов Е. coli были получены из коллекции РосНИИПЧИ "Микроб" (г. Саратов).

Анализ вышеуказанных возбудителей проводили методом гПЦР (Frohman М.А. and Martin G.R. 1989) в течение 35 циклов с "внешними" и 25 циклов с "внутренними" праймерами. ДНК из клинических образцов выделяли с использованием системы "Instra-Gene Purification Matrix" фирмы ("Bio-Rad", США). Анализ РНК HAV проводили комбинированным методом ОТ с ревертазой M-MLV и гПЦР (Kawasaki К. et al. 1988).

Анализ провирусной ДНК вируса Т-клеточной лейкемии человека 1 типа (HTLV1) у пациентов с кожной Т-клеточной лимфомой (MF) проводили с использованием стандартного ПЦР-набора ("Cetus", США). Продукты ПЦР и ОТ/ПЦР исследовали известным методом (Loening V.E. 1967). В ряде случаев негативы фотографий гелей на пленке "Polaroid 655" сканировали на приборе "Ultra Scan XL" (LKB, Швеция) с целью сравнительного анализа эффективности выхода ПЦР-продуктов. ПЦР-продукты очищали центрифугированием в пробирках "Centricon 100" ("Amicon", США) и секвенировали методом ПЦР (Verhasselt P. et al. 1992). Экзонуклеазные активности (5'-3' и 3'-5') и эндонуклеазную активность Tth-полимеразы определяли известными методами (Maniatis T. et. al. 1980).

Результаты и обсуждение 1. Выделение нативной Tth ДНК-полимеразы

Ста�

Информация о работе

Глухов, Александр Иванович
доктора биологических наук
Москва, 1998
ВАК 03.00.04

Диссертация

Использование термостабильных ДНК-полимераз для анализа возбудителей вирусных и бактериальных инфекций методом полимеразной цепной реакции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы