Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ДНК полимераз термофильных бактерий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ДНК полимераз термофильных бактерий"

На правах рукописи.

БОЛЬШАКОВА Елена Вячеславовна.

ИЗУЧЕНИЕ ."ДНК ПОЛИМЕР АЗ ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ.

(03.00.03 - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандитата биологических наук.

Москва- 1997

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики анаэробов Института молекулярной генетики РАН (Москва).

Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, каф. молекулярной биологии.

Защита состоится " 10 июня " 1997 года в" 14 " часов на заседании Диссертационного совета Д 098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: Москва, 113545, 1 -ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан " 10 " мая 1997 г

Ученый секретарь Диссертационного совета,

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Великодворская Г.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Машко С.В.

кандидат биологических наук Патрушев Л.И.

кандидат биологических наук

Щербакова В.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы, ДНК полимеразы являются основными ферментами клетки, обеспечивающими сохранение, воспроизведение и изменение генетической информации.

В настоящее время хорошо изучены ДНК полимеразы многих мезофильных организмов. Наиболее полно охарактеризована ДНК полимераза I E.coli, являющаяся односубьединичным белком. Представления о структуре и свойствах ДНК полимераз термофильных эубактерий сформировались, в основном, при изучении ферментов из разных видов бактерий одного рода - Thermits. Практически не исследованы ДНК полимеразы группы экстремально термофильных эубактерий, объединяющей микроорганизмы с оптимумами роста выше 70°С. Отсутствие такой информации не позволяет делать обобщающие заключения об особенностях молекулярного строения ферментов, обеспечивающих метаболизм ДНК при температурах, близких к точке ее плавления.

Изучение новых термостабильных ДНК полимераз интересно и с практической точки зрения. При этом можно найти "идеальный фермент" амплификации ДНК в цепной полимеразной реакции (ПЦР), который характеризовался бы высокой процессивкостыо и точностью работы. Кроме того, новые ферменты могут обладать еще неизвестными полезными свойствами.

Цель работы н задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении структуры генов и характеристике рекомбинантных ДНК полимераз двух малоизученных экстремально-термофильных анаэробных бактерий Thermotoga neapolitana u Anaerocellum thermophilum.

В ходе работы решались следующие задачи:

- разработка стратегии клонирования генов ДНК полимераз термофильных бактерий и выделение соответствующих генов из геномных библиотек Thermotoga neapolitana u Anaerocellum thermophilum.

- определение их нуклеотидной последовательности;

- изучение свойств рекомбинантных ферментов и оценка возможности их использования для ПЦР;

- оценка точности репликации ДНК рекомбинантными ферментами в модельной системе in vitro.

Научная новшна и практическая ценность работы. Предложена простая и эффективная стратегия клонирования генов, кодирующих термостабильные ДНК полимеразы, основанная на прямом отборе из плазмидных геномных библиотек клонов, синтезирующих термостабильный фермент.

Определена нуклеотидная последовательность генов ДНК полимераз Т. neapolitana (TNE) и A. thermophilum (АТН) и проведен структурно-функциональный анализ кодируемых ими полипептидов. Обнаружено, что ДНК полимеразы АТН и TNE относятся к семейству А ( Pol I подобных) ДНК полимераз. Показано, что ДНК полимер аза TNE является единственным термостабильным структурным и функциональным аналогом ДНК полимеразы IЕ. coli, известным в настоящее время.

Изучены основные параметры ДНК полимеразной реакции, термостабильность рекомбинантных ферментов АТН и TNE, а также присутствие дополнительных экзонуклеазных активностей. Обнаружено существенное влияние N-концевого (5'- 3'- экзонуклеазного) домена ДНК полимеразы TNE на 3'-5'-экзонуклеазную активность и на термостабильность фермента.

Показана возможность использования TNE М284 ( укороченной формы ДНК полимеразы TNE ) для амплификации ДНК в ПЦР. Исследована точность синтеза ДНК в системе фага М13шр2 in vitro полноразмерной TNE и ее укороченным вариантом TNE М284.

Таким образом, результатом проведенной работы является предварительная характеристика двух новых термостабильных ДНК полимераз.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на семинарах в компании Promega (США), на семинарах Лаборатории Молекулярной Генетики Анаеробов ИМГ РАН и ежегодной научной конференции ИМГ РАН (1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложения результатов исследования и их обсуждения, а также заключения,

выводов и списка цитируемой литературы (__ литературных источника). Работа

изложена на_страницах машинописного текста, содержит_таблиц и__рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание банков генов бактерий Т. пеароШапа и Л. ЛегторЫЫт. Отбор клонов, продуцирующих термостабильную ЛИК полимеразу.

Библиотека генов бактерии Т. пеароШапа была сконструирована на основе вектора рТХ19Я. Частично расщепленная по ЗаиЗА1 и фракционированная по размеру ( 3-8 т.п.н.) хромосомная ДНК была интегрирована в НатШ сайт вектора.

Для получения геномной библиотеки А. 1кегторМ1ит использовали рестриктазу НтЛ\\. Фрагменты хромосомной ДНК, полученные при частичном гидролизе этим ферментом и фракционированные по размеру (4-10 т.п.н.), были интегрированы в НЫЛ\\ сайт плазмидного вектора р1)С 18 .

Созданные после трансформации штамма Е.соМ ТО! клонотеки Т.пеароШапа и А. гИегторЫЫт были представлена 3000 и 2000 1ас-негативными клонами соответственно, что обеспечивало 2х кратное перекрывание размера генома. В каждом случае, клоны были перенесены в 96 луночные иммунологические плашки со 100 мкл ЬВ/ашр и инкубировались ночь при 30°С. После добавления в каждую лунку равного объема 30% глицерина ( с ЬВ и 50 мкг/мл Атр) клонотеки хранили при -70°С.

Для проведения анализа клонотеку высевали на агаризованную среду с ампициллином и инкубировали ночь при 30°С. Скрининг на термостабильную ДНК полимеразную активность проводился в пулах, являющихся смывами с чашек. Остаточную ДНК полимеразную активность тестировали после разрушения биомассы ультразвуком в 1 мл буфера следующего состава:

50 мМ Трис-НС1, рН 7.2 (Т. пеароШапа) и рН 7.5 (А. ЛетторЫЫт ), 1мМ ЭДТА и 5 мМ ФМСФ при охлаждении во льду. При анализе клонотеки А. ЛетторШит. в буфер добавляли 0.01% Ти>ееп20, обладающий стабилизирующим и противосорбционным действием.

Для инактивации ДНК полимераз Е.соН клеточные экстракты прогревали в течении 20 мин при 70°С для клонотеки А. хЬетторЫЫт и 75°С для клонотеки Т. пеароШапа, при температуре, близкой к оптимуму роста этих бактерий, охлаждали во льду и центрифугировали. ДНК полимеразную активность тестировали в аликвотах полученных осветленных экстрактов ( 5-25 мкл) в буфере, включавшем: 25 мМ Трис-НС1, рН 7.6-8.0,

10 мМ М^СЬ, 4 мкг ДНК ( "активированной" или денатурированной щелочью или кипячением ), 50 мкМ каждого из ёЫТР и 1.5 мкКи меченного нуклеотидтрифосфата на пробу (конечный объем реакционной смеси 50 мкл). Пробы инкубировали при температуре 65-75°С 1 час, после чего определяли включение меченного нуклеотида в ДНК.

Из 30 проанализированных пулов 29, в случае анализа клонотеки Т.пеароШапа, давали фоновое включение меченного нуклеотида (100-150 срт). В одном случае получили пятикратное превышение счета над фоновым значением. На этой чашке был обнаружен клон, продуцирующий термостабильную ДНК полимеразу Т .пеароШапа.

При скрининге клонотеки А. гкетторЫ1ит было обнаружено 5 пулов, превышающих фоновое включение в 150-400 раз. В результате было изолировано 7 клонов, продуцирующих термостабильную ДНК полимеразу (Таблица 1).

Таблица. 1. Характеристика рекомбинантных клонов, синтезировавших терн оста бильную ДНК полимеразу.

Клон и плазмида Вставка, т.п.н. Набор Нш<ИИ фрагментов, т.п.н. Удельная активность термостабильной ДНК полимеразы в экстрактах, ед\мг белка Средняя продуктивность клонов, ед\мл ночной культуры

АпИ; 2 12.1 0.1,0.25,0.55, 0.6x2, 1.1,2.3,3.8 70 44

Ал13; 4 4.5 0.1, 0.6, 3.8 330 233

Ап15 6.15 0.1,0.25,0.6, 1.4, 3.8 96 76

АШ7 4.65 0.25, 0.6, 3.8 47 34

АШ8 6.05 0.25, 0.6, 1.4,3.8 60 45

Теп 3.4 1 6.3

Методом гибридизации по Саузерну показано, что общими для всех плазмид серии рАхи является фрагмент ДНК размером 3,8 т.п.н. Этот фрагмент был изолирован из плазмиды рАгиЗ и перенесен в вектор риС19 в обеих ориетациях. Соответствующие рекомбинантные клоны с плазмидами рНЬЗ и рНЬ4 также синтезировали термостабильную ДНК полимеразу. Удельная активность ферментов в экстрактах из ночной культуры составляла 80 % от значения, полученного для клона А1Ш. Таким

образом, ген ДНК полимеразы расположен в HindiII фрагменте хромосомной ДНК размером 3.8 т.п.н..

Анализ нгуклеотндной последовательности гена ДНК полимеразы Т. neapolitana

Полная нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомной ДНК Т. neapolitana, клонированного в составе плазмиды рТеп (3400 п.н.) была определена по двум цепям ДНК по методу Сэнгера после субклонирования и получения однонаправленных делеций. Так как она не депонирована в EMBL Data Base, мы полностью приводим ее в настоящей работе ( Рис. 1).

В данном фрагменте ДНК находится одна открытая рамка считывания максимальной длиной 2679 т.п.н., ограниченная ATG и TGA кодонами в положениях 70 и 2749 соответственно. Кодируемый ею полипептид состоит из 893 аминокислотных остатков с рассчитанным молекулярной массой белка 102043 Да. Потенциальный участок связывания с рибосомой (AGGGGG) удален от стартовой точки трансляции на 10 п.н.. В отличие от изученного в нашей лаборатории гена ß-ксиланазы ХупА из Т. neapolitana в 3'-некодирующем участке (651 п.н.) нет палиндромных последовательностей, сходных с р-независимыми терминаторами транскрипции. Возможно, что у этой бактерии, как и у E.coli, существует и другой тип терминации транскрипции, связанный с действием дополнительных белковых факторов.

Как было показано Лиао и Деннис (Liao & Dennis), промоторы генов Thermotoga сходны с каноническими последовательностями E.coli, распознаваемыми основной РНК полимеразой с о70 субъединицей. Мы не нашли подобные последовательности в предшествующем инициирующему кодону фрагменте ДНК (69 п.н). Направление транскрипции гена ДНК полимеразы в плазмиде рТеп противоположно Lac-промотору вектора, что исключает возможность экспрессии рамки за счет его фоновой транскрипции. Можно предположить, что транскрипция этого гена в плазмиде рТеп осуществляется дополнительными РНК полимеразами E.coli.

1 10 20 30 40 50 RBS 60

qatcaatcqtqatcccacatctqaqacqqqcqqtggattttctggaggagctcagqgcrqa 70 80 90 100 110 120

tgcaggaaaATGGCGAGACTATTTCTCTTTGATGGCACAGCCCTGGCCTACAGGGCATAT 1 MARLFLFDGTALAYRAY

tacgccctcgacagatccctttccacatccacaggaattccäacgaacgccgtctatggc 180 YALDRSLSTSTGIPTNAVYG

gttgccaggatgctcgttaäattcataaaggaacacattatacccgaaaaggactacgcg 24 0

VARMLVKFIKEHIIPEKDYA gctgtggccttcgacaagaaggcagcgacgrtcasacacaaactgctcgaagcgtacaag 300

AVAF DKKAATFRHKLLEAYK gcgcaaaggccaaagacgccggatcttctagttcagcagctaccttacatcaagcggctg 360

AQRPKTPDLLVQQLPYIKRL atagaagctcttggtttcaaagtgctggagctggaaggatacgaagcagacgatatcatc 420

IEALGFKVLELEGYEADDII gccacgcttgcagtcaagggctgcacgttttttgatgagattttcataataaccggtgac 480

ATLAVXGCTFFDEIFIITGD aaggatatgcttcaacttgîaaacgagaagataaaggtctggagaatcgtcaaggggata 540

KDMLQLVNEKIKVWRIVKGI tcggatcttgagctttacgattcgaaaaaggtgaaagaaagatacggtgtggaaccacat 600

SDLELYDSKKVKERYGVEPH cagataccggatcttctagcactgacgggagacgagatagacaacattcccggtgtaacg 660

QIPDLLALTGDEIDNIPGVT ggaataggtgaaaagaccgctgtacagcttctcggcaagtacagaaatcttgaagacatt 720

GIGEKTAVQbLGKYRNLEDI ctggagcatgcccgtgaactcccccagagagtgagaaaggctctcttgagagacagggaa 780

LEHARELPQRVRKALLRDRE gttgccatcctcagtaaaaaacttgcaactctggtgacgaacgcacctgttgaagtggac 84 0

V A I LSKKLATLVTNAPVEVD tgggaagagatgaaat acagaggatacgacaagagaaaactactt ccgat attgaaagaa 900 WEEMKYRGYDKRKLbPILKE ctggagtttgcttccatcatgaaggaacttcaactgtacgaagaagcagaacccaccgga 960

LEFASIMKEIiQLXEEAEPTG tacgaaatcgtgaaggatcataagaccttcgaagatctcatcgaaaagctgaaggaggtt 1020

YEIVKDHKTFEDLIEKLKEV ccatcttttgccctggaccttgaaacgtcctcccttgacccgttcaactgtgagatagtc 1080

PSFALDLETSSLDPFNCEIV ggcatctccgtgtcgttcaaaccgaaaacagcttattacattccacttcatcacagaaac 1140

GISVSFKPKTAYYIPLHHRM gcccagaatcttgatgaaacactggtgctgtcgaagttgaaagagatccicgaagacccg 1200

AQNLD ETLVLSKLKEILEDP tcttcgaagattgtgggtcägaacctgaagtacgactacaaggttcttatggtaaagggt 1260

S SKIVGQNLKYDYKVLMVKG atatcgccagtttatccgcattttgacacgatgatagctgcatatttgctggagccaaac 1320

I SPVYPHFDTMIAAYLLEPN gagaaaaaattcaatctcgaagatctgtctttgaaatttctcggatacaaaatgacgtct 1380

EKKFNLEDLSLXFLGYKMT S tatcaggaactgatgtcgttttcctcaccactttttggtttcagctttgcggatgttccg 1440

YQELMSFSSPLFGFSFADVP gtagacaaggctgcgaactactcctgcgaggatgcagacatcacttataggctctacaag 1500

VDKAANYSCEDADITYRLYK atactcagcatgaagctccatgaagcggaacttgagaacgtcttctacaggatagagatg 15 60

ILSMKLHEAELENVFYRIEM ccgcttgtgaacgttcttgcacgcatggaattgaacggggtgtatgtggacacagaattc 1620

PLVNVLARMELNGVYVDTEF ctgaaaaagctctcggaggagtacggcaaaaagctcgaggaactggccgaaaaaatctac 1680

LKKLSEEYGKKLEELAEKIY cagatagcaggagagcccttoaacatcaattctccaaaacaggittcaaagatccttttt 1740

QIAGEPFNINSPKQVSKILF gagaagctgggaataaaaccccgtggaaaaacgacaaaaacaggagcgtactctaccagg 1800

EKLGIKPRGKTTKTGAYSTR atagaggtgttggaagagatagcgaatgagcacgagatagtacccctcattctcgagtac 18 60

IEVLEEIANEHEIVPLILEY agaaagatccagaaactgaaatcgacctacatagacacccttccgaaacttgtgaacccg 1920

RKIQKLKSTYIDTLPKLVNP aaaaccggaagaattcatgcatctttccaccagacgggtaccgccactggcaggttgagt 1980

кхвктн&зрядтбглтскьз

А5САСТеАТССАААТСТТСА0ААТСТТСС0АСАААеА5ССААСАССеААААБАААТТАвА 2040

ЗЗПРНХ.(21111РТКЗЕЕеКЕ111 АААССОАТТСТ6ССССА6<ЗДТССАвАСТеОТСОАТССТСАСТСС5САТТАТТСССАААТА 2100 КА1УР520РВИИ1УЗА05ГЗО!

вААСТСАбААТССТСССТСАТСТСАОТССТЕАТОАОААССТ ТСТ(*ДА(3<Х:СТТСеА13С5Ав 2160

ООСАТСЯАТВТССАСАССТТСАСТОССТССАСОАТСТАСААССТАААОССАСААСААСТО 2220

GIDVHTLTASRIYNVKPEEV ААСвААеАААТ0С5АССССТТССАААСАТССТСААСТТСТСТАТААТАТАС0СТ6ТСАСА 2280

НЕЕМКК7вКМУНГ31 I У С V Т ССОТАС65ТСТТТСТеТ5А5АСТТСОААТАССООТТАААСААОСАСААДАеАТОАТТАТС 2340

РХгЬЗУЯ!.ОХРУКЕАЕКМ11 АОСТАТТТСЛСАСТСТАТССАААССТСССАЛОСТАСАТССАЭСАЗОТТОТТОСАСАОССА 2400

ЗУГТЬУРКУЯЗУХОО^/УАЕА АЛАСАСААбСОСТАСбТСАСКЖГТСТСТГТввААОАААААСАСАТАТТССССАеСТСАТв 24 60

КЕКвХУЯХ1.РС11ККОХР{21.М ССААОБОАСААСААСАСССАСТСССААСССеДААеААТСЕСААТАААСАСССССАТТСАС 2520

АКГК11ТС!ЗЕОЕЯ1А1ИТР10 5СААС9ОССесАеАТАТААТААААТТ6ССТАТСАТАЗАТАТАСАС0А50А6СТ5А0АААА 258 0

GTAADIIKLA.MIDIDEEI.RK АОАААСАТСАААТССА6ААТ5АТСАТТСАОСТТСАТСАСОААСТООТСТТС5А55ТТССС 2640

ЯКМКЗКМ1 ХЙУНОЕЬТ/ГЕУР САТ6АССАААААСААСААСТАСТТСАТСТ06Т&АА6ААСААААТ6АСАААТ6Т50Т6ААА 2700

DEEKEELVDX,VKNKMTNVVK CTCTCTGTGCCTCTTGAGGTTSACATAAGCATCGGAAAAAGCTGGTCTTGAaggaggaat 2760

ьзур1>гуп131вкзпз -893 tggtatggatgcgaagatagtgaacgccctcattggatctgtgtacgagaccataaaaag 2820 tgtgttgagggtggaaccaaaactgggaaagccgtctgcggtgtcgcacatagagattcc 288 0 cccactcggtggt:taccgttatcggt:gtgacgggtagtatagaaggaagcctgatttatt 294 0 ctttttcttcagaaacggctctgaaggtcgtttctgcaatgatgggcatggagtacggtc 3000 agcttgacgagcttgccatgagcgccataggagagcttggaaacatgacggctggaaaac 3060 tcgcgatgaaacttgaaacccttggaaaacacgttgatatcacacct:cccacggtggtga 3120 gtggaaaagacctcaagataaaaagcttcggaactgttttgaaactaccgatctctgttt 3180 tctcaaacgaggacttcgaccttcatctgtct:gtaaaaagtggagggtgatgcatatttc 324 0 aaagaatctttttagggactttgggaaat.acaacatggttgtcatgtttactacaacgtt 3300 gatatcgaacatagtggtaggggctttgctggggtactatctggacaaatggacgttcaa 3360 ааасддаа^^ас^ъ^д^^сасаа^^аддда^*** 3400

Рис. ]. Нуклеоэддная последовательность фрагмента ДНК, клонированного в составе рекомбинашной плазмиды рТеп и аминокислотная последовательность ДНК попимеразы 'ГМЕ. РВЯ-прсдполагаемый участок связывания РНК с рибосомой.

2-Й.Структура фрагмента хромосомной ДНК А. ШегторИИит, содержащего ген ДНК полимер азы.

Нуклеотидная последовательность ШпЛII фрагмента размером 3771 п.н. была определена по методу Сэнгера по двум цепям ДНК после получении серии делеций. Данная нуклеотидная последовательность депонирована в ЕМВЬ (ас Х98575).

Секвенированный фрагмент ДНК содержит открытую рамку считывания размером

2550 п.н., способную кодировать полипетид из 850 аминокислотных остатков, что соответствует теоретической молекулярной массе белка 98214 Да. Открытая рамка считывания начинается АТвкодоном в положении 366 и заканчивается TAG ко доном в положении 2915. Поиск потенциальных промоторов E.coli, распознаваемых основной а" в предшествующем гену фрагменте (365 п.н.), выявил несколько кандидатов на роль последовательностей "-35", "-10" (Рис.2). Возможно, что именно множественная инициация транскрипции в сочетании с эффективным RBS (AGGGG) приводит к хорошей экспрессии гена в клетках E.coli.

1 ИВЮШ 20 40 60

даgetttqttctttgacaqgaaaaqaaataaaaacttttattqaaaaactcatcggtgag

70 a 90 a' 110

atagaatggcatattataaaaaacaataaatttttcacagatgagactttgatgaatata 140 160 180

gaagagtttgataaaaaatttgagaatggaatatatccaaatgaagctctaacaatatat

190 210 230

acttgttatgagttgtacaggtttctctttaactactttgaagatttaagctactataaa 260 280 300

acaaqtaatqacttaaaqqctttattqtttctatactatgatttcaagtttgaacacttt

jb 330 Ь' 350 с

tataaaaacaactattcattcaaaaaaqaaqaacttttaaqaattaatqaaaqqgqagat с' RBS

366 380 400 420

agaaaATGAAACTGGTTATATTCGATGGAAACÄGCATTTTGTACAGAGCCTTTTTTGCTC 1 M К L V I F DGNSILYRAFFA IB

I 5'-зкзонуклеазнъш домен

Рис.2 Структура ир^иеат участка гена ДНК нолимеразы АТН.

Указаны промотороподобные последовательности , потенциальный участок связывания с рибосомой (КВЗ) и начало гена.

Структурно-функциональный анализ ДНК полимераз TNE и АТН В соответствие с предложенной классификацией ( Ito J. & D.K. Braithwaite, 1991) ДНК полимеразы подразделяют на 4 основных семейства, гомологичные по аминокислотным последовательностям ДНК полимеразе I (семейство А), ДНК полимеразе II ( семейство В ), ДНК полимеразе Ш (семейство С) Е. coli и семейство X.

Проведенное нами сравнение аминокислотных последовательностей ДНК полимераз АТН и TNE с другими ДНК полимеразами позволило отнести эти два фермента к семейству А.

В N-концевой части аминокислотные последовательности АТН и TNE гомологичны 5'-экзонуклеазным доменам других ДНК полимераз, причем оба фермента сохраняют все консервативные аминокислотные остатки, существенные для формирования активного центра ( Рис. 3). Можно предположить, что АТН и TNE , как и ДНК полимераза TAQ, помимо ДНК полимеразной активности будут проявлять и 5'-3' экзонуклеазную. Исходя из гомологии последовательностей можно предположить, что соответствующие домены АТН и TNE сформированы аминокислотными остатками 1-278 и 1-280 соответственно. В С-концевой части молекулы расположены полимеразные домены, сформированные аминокислотными остатками 449-850 (АТН) и 491-893(TNE) .

Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей ДНК полимераз АТН и TNE с ферментами, для которых установлена пространственная структура. Консервативные участки аминокислотной последовательности ( мотивы ), обнаруженные у бактериальных и фаговых ДНК полимераз семейства А, обозначены в соответствии с работой P.D.Gutman & K.W.Minton, 1993. Аминокислотные мотивы Exol, ExoII и ЕхоШ указаны в соответствии с работой Bernard A. et al, 1989. Вертикальные стрелки и выделенные аминокислоты обозначают границы доменов в ДНК полимеразах с известной структурой, а также предполагаемое домепиое разграничение в TNE и АТН.

мотип A LLLVDG----F

ECO MVQI-----PQNPLTI.VDGSSYLYRAYEAF-PPLTMSAGEPTGAMYGVT.N 44

TNE MAR----------LFLFDGTALAYRAYYALDRSLSTSTGIPTNAVYGVAR 40

АТН M-----------KLVIFDGN5ILYRAFFAX-PELTTSNNT PTNAIYGFVN 38

TAQ MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHAL—KGLTTSRGEPVQAVYGFAK 49

* ** +* + * + + * + +

мотив 3 ГУЬ-F-D FR-E-----YK--R мотив С

ECO MLRSLIMQY---KPTHAAWFDAKGKTFRDELFEHYKSHRPPMPDDLRAQ 91

TNE MLVKFIKEHIIPEKDYAAVAFDKKAATFRHKLLEAYKAQRPKTPDLLVQQ 90

ATH VTLKYTjEQE---KPDYVAVAFDKRGREARKSEYEEYXANRKPMPDNLQVQ 8 5

TAQ SLLKALKE----DGDAVIWFDAKAP S FRHEAYGGYKAGRAPT PEDFPRQ 9 b

*** * * * * * *

мотив D EADDV-A-L мотив E IIS-DKD

ECO IEPLHAMVKAMGLPLLAVSGVEADDVIGTLAREAEKAGRPVLISTGDKDM 141

TNE LPYIKRLIEALGFKVbELEGYEADDIIATIAVKGCTFFDEIFIITGDKDM 140

ATH IPYVREILYAFNIPIIEFEGYEADDVIGSLVNQFKNTGLDIVIITGDRDT 135

TAQ LALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVIASLAKKAEKEGYEVRILTADKDL 145

eco tne ATH taq

мотив F L-G

aqlvtpnitl---intmïnt---il-gpeewnkygvppeliidflalmg 184

iqlvnekikvwrivkgisdl---elydskkvkerygvephqipdllaltg 187

lqi-bbknvw-ki'vstkfdktvedlytvenvkekygvwanqvpdykalvg 18 4

yqllsdrihvlh--------pegylitpawlwekyglrpdqwadyraltg 187

eco tne ATH taq

D—SDNI-GV-G-G L

dssdnipgvpgvgektaqablqglggldtlyaepekiaglsfrgaktmaa 234

deidnipgvtgigektavqblgkyrnxedileharelp-------qrvrk 230

dqsdnipgvkgigeksaqklleeyssleeiyqnldkiks-------sire 227

desdnlpgvkgigektakklleewgsleallknldrlkp-------aire 230

* ++ * + + Jr *** * ** *

eco tne ath. taq

kleqnkevaylsyqlatiktdveleltceqlevqqpaaeeilglfkkyef 284

allrdrevail s kklatlvtnapvevdweemkyrgydkrkllpilkelef 280

kleackdmaflskrlativcdlplnvkledlrtkehmkerlyeilvqlef 277

kiiahmddlklswdlakvrtdlplevdfa--krrepdrerlrai'leri,ef 278

tne ath taq

Kleziov fragment i

krwtadveagkwlqakgakpaakpqet svadeapevtat vis ydnyvt il 334 1ж M 284 i

--------------------asljfelcelqlyeeaeptg--------yeivk 302

к--------------------siikrlglse--------wqfe------ 293

--------------------gsllhefgllespkaleea----------- 297

ECO TNE

Exo X * *

deetlkawiaklekapvfafbtgrdsbdni sànlvgl s fai epgvaayip i i 111 i i i i ii i i i iii i lili

dhktfedlieklkevpsfaidlbissxdpfnceivgisvsfkpktayyip

352

ath taq

--fvqqrtdipeve-qkelesisqirskeiplmf-vqgekcfyl--pwpppegafvgfvxsrk----epmwadlialaaarggrvh---r

333

334

eco tne

ATH TAQ

Exo II * *

vahdyidapdqisreralellkplledekalkvgqin,kyragilanrygie 434

I lililí I I I I I I I I I II

lhhr---naqnldetlvlsklkeiledpsskivgqnlkypykvimvkgis 3 99

----ydqesntvfitsnkllieeilksdtvkim-ydlknifhqlnledtn 37 8

apepykalrd--------------lkeargl-----lakdl s vlalregl 3 65

384

ECO LKGIJVFDTMLESYILNSVAGRKDMDSLAERWLKHKTITFEEIAGKGKN— 482

I I I I I I I II I

TNE PVYPHFDTMIAAYLLEPNEKKFNbEDLSLKFLGYKMTSYQEI-MSFSSPLF 4 49

ATH NIKNCEDVMIASYVLDSTRSSYELETLFVSYL------------------------------------410

TAQ GLPPGDDPMLLAYLLDPSNT—TPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLF 413

* *i ......

Exo XXX * * j * Pol domai.il

ECO QLTFNQIAlEEAGRrRAEDADVTlQLHLKMWPDLQKHKGPl-N---VFEN 528

I II I I I I

TNE GFSFADVPVDKAÄNrSCEPADITYRLYKIL—SMKLHEAELEN---VFYR 494

ATH -----NTDIEAVKK---DKKIVSVVLLKRLWDEL—IiRLIDLNSCQFLYES 451

TAQ А---------------------------MLWGRLEGEERLL----WLYRE 432

eco lemplvpvxsrierngvkidpkvlhnhseeitlrbaelekkmieiageef 578-928

TNE iemplvnvbarmelngvyvdtefi.kkbseeygkkleelaekiyglagepf 544-893

ath ierplipvbyemektgfkvdrdaliqytkeienkilkletqiyqiagewf 501-850

taq verpl5avlahmeatgvrldvaylralslev7veeiarleaevfrlaghpf 482-831

Наиболее близок по последовательности аминокислот к 5'-экзонуклеазным доменам обоих ДНК полимераз соответствующий домен ДНК полимеразы из термофильной бактерии Bacillus caldotenex. Полимеразный домен АТН также наиболее гомологичен соответствующему домену бациллярного фермента, а полимеразный домен TNE наибольшую степень гомологии проявляет с ДНК полимеразой I E.coli ( табл. 2, А и Б).

Как и в случае ДНК полимераз из других источников, различия в длине полипептидной цепи АТН и TNE обусловлены длиной центральной части молекулы, у многих ДНК полимераз формирующей 3'-5' экзонуклеазный домен. Известно, что по аминокислотной последовательности он практически не гомологичен у разных ферментов. Исключение составляют три коротких аминокислотных мотива Exol, ExoII и ЕхоШ, участвующие в формировании активного центра 3'-5'-экзонуклеазы и обнаруженные почти у всех ферментов с этой активностью, в том числе и у относящихся к другим структурным семействам.

Нам не удалось обнаружить мотивы Exol, ExoII и ЕхоШ в центральной части молекулы АТН, что говорит о возможном отсутствии 3'- 5' -экзонуклеазной функции у этого фермента.

В отличие от ЛТП, центральная часть молекулы TNE проявляет высокую степень гомологии с 3'-5'-экзонуклеазным доменом ДНК-полимеразы I ( АК 330-517 ) по всей длине ( АК 297-483, 33-34% идентичности и 14% сходства с Poll ), в том числе найдены последовательности Exol, ExoII и ExoIII. Можно предположить, что TNE являтся полным функциональным аналогом Poll E.coli, т.е помимо ДНК полимеразной будет обладать 3'-5' и 5'-3' экзонуклеазными активностями, и может иметь сходную с ней укладку полипептидной цепи по всей длине молекулы.

Я ,г/. Анализ клонов, продуцирующих термостабильные ДНК полимеразы.

Для дальнейшей работы из 5 индивидуальных Ant клонов был выбран наиболее продуктивный- Ant3.

По сравнению с контрольной векторной плазмидой pUC18 плазмида pAnt3, а также рНЬЗ и рНЬ4, определяют синтез двух дополнительных мажорных полипептидов, проявляющих ДНК полимеразную активность. Один из них, по данным электрофореза в денатурирующих условиях, имеет молекулярную массу 97 кДа, что хорошо согласуется с рассчитанным по гену значением 98214Да. Другой полипептид, представляющий основную массу ДНК полимеразной активности, характеризуется молекулярным весом 92000 и видимо, является продуктом частичной деградации исходного белка. Отметим, что специфический протеолиз полипептидов описан и для некоторых других полимераз, таких как РНК полимераза фага Т7 ( S. Tabor & С.С. Richardson, 1985 ) и ДНК полимераза архебактерии Sulfolobus acidocaldaricus (L. Klimczak et al, 1985). Исследование динамики синтеза ДНК полимеразы в клоне Ant3 показало, что удельная активность фермента в клеточном экстракте постоянна, что говорит о конститутивном синтезе этого белка Независимо от стадии роста культуры в экстракте присутствуют обе формы ДНК полимеразы.

В прогретом экстракте клеток E.coli-pTen не удалось обнаружить полипептиды в зонах, соответствующих ДНК полимеразной активности на зимограмме, что коррелирует с очень низкой продукцией фермента ( 2.6 ед/мл стационарной ночной культуры). На зимограмме основная ДНК полимеразная активность представлена набором полипептидов с молекулярными массами 77, 72 и 67 кДа, а на долю белка с молекулярной массой около 100 кДа, являющимся полноразмерным белком, приходится менеее 2% суммарной активности

Таблица 2. Гомология аминохислотных последовательностей ДНК полимер аз АТН (А) и ТКЕ (Ь) с бактериальными ДНК полимер азам и семейства А. Процент гомологии рассчитан как отношение общего числа идентичных и сходных аминокислотных остатков к длине перекрывающегося фрагмента.

А АТН N-концевой ( 5'-3'экзоиуклеазиыи ) С-концевой (полимеразный) домен:

домен: AK 1-278 АК 449-850

Фермент координаты % область координаты % область

гомологич- гомологии перекрывания гомологич- гомологии перекрывания

ного АК ного АК

фрагмента фрагмента

i Tma 2-280 41.4 280 491-893 52.2 402

2 Tne 2-280 42.5 280 491-893 51.0 402

3 Mtu 15-292 38.1 278 500-903 45.8 402

4 Mía 16-293 37.4 278 504-910 44.0 405

5 Bca 3-278 43.2 278 473-876 54.8 405

6 Str 4-284 40.8 282 473-877 53.1 407

7 Taq 2-279 41.7 276 429-831 47.2 405

8 Tfl 10-278 41.3 276 428-830 47.9 405

9 Eco 7-285 38.9 283 525-928 48.8 400

10 Dra 2-283 39.6 278 519-921 48.4 405

Tma - Thermotoga maritima; Mtu - Micobacterium tuberculosis; Mla -Micobacierium laepra; Bca - Bacillus caldotenex\ Str - Streptococcus pheumonia\ Taq - Thermus aqualicus: Tfl- Thermus flavus; Eco - E.coli; Dra -Deinococcus radiodurance._

Б TNE N-концевой ( 5'-3'экзоиуклеазный ) домен: С-концевой ( полимеразный ) домен: АК 491-893

АК 1-280

Фермент координаты % область координаты % область

гомологич- ГОМОЛОГИИ перекрывания гомологич- гомологии перекрывания

ного АК ного АК

фрагмента фрагмента

i Tma 1-280 86.1 280 491-893 89.6 403

2 Ath 1-277 42.5 280 448-847 51.0 402

3 Mtu 14-291 36.0 278 500-900 43.2 400

4 Mla 15-292 357 280 504-907 41.1 404

5 Bca 2-278 43.7 279 473-874 50.4 403

6 Str 3-283 39.6 283 472-874 48.0 404

7 Taq 1-278 41.9 279 428-828 49.8 402

8 Tfl 10-277 40.9 279 428-827 50.0 402

9 Eco 6-284 39.8 284 525-925 51.5 402

10 Dra 1-282 38.9 280 519-918 46.0 402

3. Некоторые свойства рекомбинантных ДНК полимераз TNE и АТН.

Рекомбинантные ДНК полимеразы TNE были выделены д-ром F. Huang (Promega, США). Помимо полноразмерной ДНК полимеразы, (FL TNE , молекулярный вес около 100 ООО) нам была предоставлена модифицированная форма фермента, полученная при трансляции гена с Met284 (TNE М284). Получающийся при этом полипетид (молекулярный вес 70 ООО) по своей доменной организации аналогичен фрагменту Кленова ДНК полимеразы I E.coli. Удельные активности выделенных ферментов на матрице "активированная ДНК" составили около 100 000 ед/мг белка.

Для характеристики рекомбинантной ДНК полимеразы АТН мы использовали частично очищенный фермент, полученный путем прогрева экстракта клона Ant3, удаления ДНК полиэтиленимином, фракционирования сульфатом аммония и афинной хроматографией на двунитевой ДНК-целлюлозе. При этом нам не удалось разделить две формы ДНК полимеразы, различающиеся по молекулярному весу (97 000 и 92 ООО ). Удельная активность препарата составила около 50 000 ед/мг белка.

3.1 Оптимальные условия ДНК полимеразной реакции и термостабильность ферментов.

Были изучены оптимальные условия ДНК полимеразной реакции и температурная стабильность ферментов. Как показано на рисунке 4 , оба фермента сходны по рН зависимости ДЕК полимеразной реакции. Максимальная активность проявлялась при рН 8.0. ДНК полимеразная реакция абсолютно зависима от присутствия ионов Mg++ и скорость ее мало изменяется в интервале концентраций от 1 до 10 мМ. Слабый оптимум проявляется при 2-4 мМ MgCh в случае ДНК полимеразы АТН и при 1-2 мМ в случае FL TNE. Ферменты существенно различались по чувствительности к КС1. Так, при концентрации 100 мМ КС1 TNE сохраняла 80% максимальной активности, в то время как фермент АТН всего лишь 40%, что говорит о существенном вкладе заряда либо в стабилизацию молекулярной структуры фермента, либо в процесс связывания с субстратами.

Обе ДНК полимеразы имеют температурный оптимум ДНК полимеразной реакции при 75°С, однако АТН проявляет несколько большую, чем TNE, активность при температурах 40-65°С, что и ожидалось, исходя из сравнения температурных зависимостей кривых роста исходных организмов.

Для оценки возможности использования рекомбинантных ферментов в ПЦР была исследована их стабильность при 95°С в отсутствие субстрата . После прогрева в буфере: 25мМ Трис-IICl, рН 8.8, 10 мМ MgCh , 0.01% Tween20 , измерялась остаточная ДНК полимеразная активность при оптимальных условиях реакции. ДНК полимераза FL TNE имеет период полуинактивации около 8 мин, что несколько ниже значения, полученного для ДНК полимеразы TAQ (12 мин). Интересно, что аналог фрагмента Клеиова - TNE М284 существенно более устойчив к тепловой денатурации - период его полуинактивации равен 24 мин, что в 3 раза больше, чем для полноразмерной TNE и в 2 раза больше, чем дня TAQ. Впервые эффект повышения стабильности при удалении 5'-3'- экзонуклеазного домена молекулы был обнаружен Лойер (Layer et. al, 1993) при исследовании ДНК полимеразы TAQ. По-видимому, у ДНК полимераз из термофильных бактерий наименее термостабильным является 5'- экзонуклеазный домен. Разрушение его пространственной укладки могло бы приводить к изменению субстрат- связывающих свойств фермента, и, как следствие, к потере тестируемой ДНК полимеразной активности даже при сохранении структуры остальных доменов.

Выделенный препарат ДНК полимеразы АТН был нестабилен при 95°С независимо от присутствия субстрата ( 2% активности сохраняется после одноминутного прогрева при 95°С).

3.2 Дополнительные энзиматнческие активности, присутствующие в ДНК полимеразах АТН и TNE.

Многие ДНК полимеразы помимо полимеразной активности проявляют и нуклеазные активности. Из анализа первичной структуры TNE и АТН можно предположить, что у первого фермента имеется 3'-5'-экзонуклеазная активность, а у второго она отсутствует. Мы подтвердили эти предположения экспериментально. В качестве субстрата были использованы ЕсоЮ фрагменты ДНК фага X. меченные по 3'- концу в присутствие <х-32Р dATP. Существенная деградация меченного субстрата была отмечена для FLTNE. Интересно, что укороченный вариант данного полипетида TNE М284 имеет сниженную приблизительно на 30% 3'- экзонуклеазную активность.

Рис. 4. Графики зависимости ДНК полимеразной реакции от величины рН (А), концентрации иопов М§++ (В), концентрации ионов К+ (С) и температуры. (О). Зависимости снимались на матрице "активированная ДНК" в 100 шд реакционной смеси, включавшей 25 иМ Трис-НС1, 200 мМ сИМТР, ¡2.5 мкг ДНК при 72 °С: А-при 10 мМ и изменяющемся рН ; В-прирН8.0; С- при 10 мМ Мд++ и рН 8.0; О - при рН 8.0, 10 мМ и изменяющейся температуре. За 100%

принято максимальное получешюе значение включения нуклеотидов в ДНК за 10 мин.

. На модели пространственной структуры ДНК полимеразы TAQ ( Youngsoo Kim et al, 1995 ) аминокислотные остатки 281-289, предположительно гомологичные району 284 -292 у TNE , формируют короткую спираль L', которая совместно со спиралью К' ( АК 266-276) 5-3' экзонуклеазного домена, по-видимому, формирует междоменный контакт. Возможно, что взаимодействие N-концевого и центрального доменов ДНК полимеразы TNE необходимо для правильного фунционирования 3'-5'-экзонуклеазного домена фермента.

Для проверки 5'-3'-экзонуклеазной активности использовали плазмиду pBR322 линеаризованную по EcóVCV сайту и меченную по 5'-концу с помощью полинуклеотидкиназы Т4. Пробы инкубировали в буфере (50 мкл), содержащем 10 мМ Трис-НС1 ( рН 9.0 при 25°С), 50 мМ КС1, 0.1% Triton Х-100, 1.5 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из dNTP , 50 нг меченного субстрата (12000 ерш) и 5 единиц фермента. После инкубации в течение 1 часа при 72°С , реакцию останавливали добавлением ЭДТА. Эффективность деградации субстрата измеряли по уменьшению количества радиоактивно меченной ДНК, способной связываться с бумагой DE-81 (Whatman). ДНК полимераза FL TNE разрушает 7-10%, а АТН 5-7 % меченного субстрата, что говорит о присутствие 5'-3'- экзонуклеазной активности у обоих ферментов.

4. Использование ДНК полимераз TNE для ПЦР.

Как полноразмерный рекомбинантный фермент, так и его укороченная форма достаточно стабильны при температурах плавления ДНК, что говорит о принципиальной возможности их использования в ПЦР. Оптимизированный буфер для ПЦР включал в себя следующие компоненты: 10 мМ Tris-HCl, рН 9.0 ( при 25 °С), 10 мМ КС1, 1.5 мМ MgCl2, 0.01% Tween20 и 40 мкМ смесь dNTP. Мы использовали два набора праймеров , позволявших амплифицировать фрагмент контрольной плазмиды размером 500 п.н., и фрагмент ДНК фага X размером 6.8 т.п.н. Условия цикла для амплификации последовательности 500 п.н.: 96 °С 2 мин, и 25 циклов, состоящих из стадий денатурации при 95 °С - 30 сек, отжига при 65 °С - 30 сек, элонгации 72 иС - I мин. Для амплификации фрагмента ДНК фага X условия реакции следующие: 95 °С - 2 мин, и 25 циклов , состоящих из стадий денатурации 94 °С -15 сек, отжига 65 °С - 1 мин, элонгации 72 "С - 7 мин. В качестве контроля использовали выделенную из природного организма ДНК полимеразу

TAQ ( Promega ) и рекомендованный для этого фермента буфер: 10 мМ Трис-НС1 ( рН 9.0, при 25 °С ), 50 мМ КС1, 1.5 мМ MgCb, 0.1% Triton Х-100. Продукты ожидаемых размеров 500 п.н. и 6800 п.н. были получены при использовании фермента TNE М284 и ДНК полимеразы TAQ. При амплификации короткой мишени с помощью фермента T.neapolitana количество продукта было на 40% больше, чем в случае с ДНК полимеразой TAQ. При амплификации фрагмента 6.8 т.п.н. TNE М284 имела преимущество в специфичности. Нам не удалось получить амплификацию ни короткой, ни длинной мишени при использовании FL TNE . Так как этот фермент является достаточно стабильным при 95°С, то отсутствие продукта амплификации, скорее всего, связано с его высокой нуклеазной активностью, приводящей к деградации праймеров или матрицы.

5. Точность работы ферментов TNE при репликации ДНК.

Эксперименты по измерению точности работы ДНК полимераз были выполнены на фирме Promega.TaK как ДНК полимеразы TNE можно использовать для ПЦР, интересно было оценить точность работы этих ферментов по сравнению с ДНК полимеразой TAQ. Ожидалось, что ферменты TNE будут делать существенно меньше ошибок, так как они имеют редактирующую активность в составе того же полипептида.

Мы использовали метод, предложенный Томасом Канклом (T.Kunkel, 1988 ), в котором измеряется точность синтеза ДНК в единичном раунде репликации модельной матрицы. Был выбран так называемый Forward Mutational Assay, так как он позволяет учитывать все типы репликационных ошибок (замены нуклеотидов и мутации сдвига рамки). Принцип метода основан на измерении частоты мутагенеза фага М13тр2, индуцируемого ДНК полимеразами при копировании гена а-пептида LacZ (258н). Матрицей является репликативная форма ДНК , у которой этой области молекулы соответствует однонитевой участок (gap) размером 407 п.н. Замены аминокислот в а-пептиде снижают его способность к комплементации, что приводит к появлению р-галактозидазы с измененными свойствами. Фаги, синтезирующие этот фермент, характеризуются измененной окраской бляшек при выращивании на среде с X-Gal.

В качестве котрольных мы приняли условия, при которых TAQ ДНК полимераза делает наименьшее число ошибок в данной системе ( т.е. сбалансированный пул dNTP

при равенстве суммарной концентрации нуклеотидов и ионов Mg++ : 1 мМ MgCh , 1мМ dNTP).

Буфер для ДНК полимераз TNE соответствовал оптимальному для ПЦР: 10 мМ Трис-НС1 рН9.0 при 25 °С, 10 мМ КС), 0.01% Tween 20, 1.5 мМ MgCh и 40 мкМ каждого из четырех dNTP. Полноту прохождения реакции контролировали электрофорезом в 0.8% агарозном геле в ТАЕ буфере, содержащем 0.5 мкг/мл EtBr. В этих условиях происходит полное разделение частично однонитевой формы ДНК фага М13 являющейся субстратом реакции от полностью двухцепочечной с единичным разрывом, являющейся ее продуктом.

Результаты эксперимента представлены в Таблице 3. Определенная нами частота мутагенеза для фермента TAQ хорошо совпадает со значением 18-20 хЮ ■* , полученным К. Эккерт и Т.Канклом (Eckert К.А. & Т. Kunkel, 1990). Как видно из таблицы, фермент FL TNE в наших условиях равен по точности ДНК полимеразе TAQ, у которой нет редактирующей активности. По-видимому, существующее представление о более точной репликации ДНК ферментами, обладающими редактирующей активностью по сравнению с ферментами, не имеющими ее, ошибочно. Необходима тщательная проверка каждого фермента в конретных условиях эксперимента.

Удаление 5'-3'-экзонуклеазного домена белка приводит к снижению точности репликации ДНК в 1.8 раза по сравнению с полноразмерным ферментом. Возможно, это является следствием сильного уменьшения З'-экзонуклеазной активности у TNE М284 по сравнению с FL TNE. Можно предположить, что высокая нуклеазная активность ДНК полимеразы Thermotoga компенсирует относительно низкую селективность фермента при выборе комплиментарного нуклеотида. По этому признаку FL TNE может быть функционально сходна с ДНК полимеразой фага Т4.

В статье С. Papanicolaou & L.S. Ripley,1989, было показано, что точность работы фрагмента Кленова примерно в 1,5 раза ниже, чем у ДНК полимеразы I. Это может свидетельствовать о сходстве пространственной укладки ДНК полимераз TNE и Poll.

Таблица 3. Точность работы ДНК полимераз в единичном раунде репликации

( Forward mutational assay)

Фермент Всего LacZ Частота мутаций х 10(4)

бляшек дефектных

среднее - фон

FLTNE 4755 13 27.3 29 21

3924 12 30.6

TNE М284 4675 21 44.9

6811 30 44.0 44 35

5676 24 42.2

TAQ 7236 23 31.8 30 22

10216 29 28.4

контроль 10454 8 7.6

13252 12 9.1 8.35

Таким образом, рекомбинантная модифицированная ДНК полимераза ТЫЕ М284 может быть использована вместо ДНК полимеразы ТАР в экспериментах, для которых количество амплифицируемого продукта более важно, чем точность синтеза ДНК. Известно, что эффективная амлификация ДНК часто связана с низкой точностью работы фермента, позволяющей ему удлинять некомплементарный нуклеотид на З'-конце растущей цепи ( Н.А. ЕгИсЬ е1 а1, 1991). Возможно, что этот эффект проявился в нашей работе, так как использованный нами реакционный буфер был оптимизирован для получения максимального количества продукта в ПЦР. В таком случае, измеренная нами точность работы ферментов близка к ее минимальному значению. Изменение состава или рН реакционного буфера, используемого для амплификации ДНК, например, выравнивание концентраций нуклеотидов и концентрации ионов М§++ , могло бы повысить точность копирования матрицы.

Выводы.

1. Предложен способ клонирования генов термостабильных ДНК полимераз, и из геномных библиотек термофильных анаеробных бактерий T.neapolitana и Л. thermophilum изолированы два гена, кодирующие термостабильные ДНК полимеразы.

2. Определена нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомной ДНК

Т. neapolitana (3400 п.н.) и A. thermophilum (3771 п.н.), содержащих гены ДНК полимераз. Соответствующие открытые рамки считывания кодируют полипептиды из 893 (Т. neapolitana) и 850 (A. thermophilum) аминокислотных остатков. ДНК полимеразы АТН и TNE относятся к семейству А ДНК полимераз.

3. Установлены оптимальные условия ДНК полимеразной реакции для ферментов

FL TNE (полноразмерный белок) и АТН. ДНК полимераза ATII проявляет 5'-3' экзонуклеазную активность и не имеет 3'-5' экзонуклеазной активности. Фермент нестабилен при 95°С. ДНК полимераза FL TNE проявляет как 5'-3', так и 3'-5' экзонуклеазные активности. Период полуинактивации ДНК полимеразы FL TNE при 95°С в отсутствие субстрата равен 8 мин.

4. Модифицированная ДНК полимераза TNE М284 характеризуется 30% снижением 3'-5'- экзонуклеазной активности и увеличением периода полуинактивации при 95°С

в 3 раза по сравнению с полноразмерным белком. TNE М284 способна амплифицировать ДНКвПЦР.

5. Определена точность работы ферментов FL TNE и TNE М284 в единичном раунде репликации ДНК (Forward mutational assay). Частота мутаций, вносимых FL TNE при репликации модельной матрицы составляет 21x10"'- Точность работы полноразмерного фермента равна точности ДНК полимеразы TAQ. Удаление 5'-3' экзонуклеазного домена приводит к снижению точности репликации ДНК в 1.8 раза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. E.V. Bolchakova, A. A. Ponomariev, A. A. Novikov, V.A. Svetlichnyi, G.A. Velikodvorskaya. Cloning and expression of genes coding for carbohydrate degrading enzymes of АпаетосеПит thermophilum in E. coli. BBRC, 1994, v202, ppl076-1080.

2. M. R. Slater, J.R. Hartnett, F. Huang, E. V. Bolchakova, Storts, D.R, Otto, P., A. A. Novikov, G. A. Velikodvorskaya. Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana, 06.07. 1995, USA Patent Applications, № 08/484,661

3. Bolchakova E.V. " Nucleotide sequence of the DNA polymerase gene of АпаетосеПит thermophilum ", 1996, EMBL ас. X98575.