Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот, рестриктирующие нуклеазы и организация генома экстремально термофильных архебактерий

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот, рестриктирующие нуклеазы и организация генома экстремально термофильных архебактерий"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДГА

На правах рукописи

■ПРАНГИШВИЛИ Давид Александрович

Уда 577.15:576.85

ФЕРМЕНТЫ БИОСИНТЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, РЕСТРИКТИЕУЩИЕ НУКЛЕАЗЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА ЭКСТРЕМАЛЬНО ТЕРМОФИЛЬНЫХ АРХЕБАКТЕРИЙ

(03.00.03 - молекулярная биология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1988

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и биологической физики АН ГССР

Официальные оппоненты: «лен-корреспондент АН СССР,

доктор химических наук„профессор А.А.БОГДАНОВ

член-корреспондент АН СССР,

доктор биологических наук,профессор Г.А.ЗАВАРЗИН доктор биологических наук,

профессор Л.Л,КИСЕЛЕВ

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР

Зашита состоится " Ж * ^ЬС*. года в (О часов

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР по адресу: 117984 Москва В-334, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан «4« 1983

года

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук СУ'' / А.М'.Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

^.......Актуальность проблемы. Обнаружение в живом мире третьей таксономической группы высшего ранга - царства архебактерий, члены которого отличаются как от истинных бактерий (эубактерий), так и от эукариот, является одним из наиболее значительных открытий естествознания за последние годы. Око во многом изменило взгляды на клеточную эволюцию и сделало очевидным важность исследования различных аспектов молекулярной организации архебактерий для решения ряда крупнейших проблем эволюционной биологии. Исследования такого рода могут совершенствовать наши представления об организации древнейших организмов, населявших Землю; они также дают возможность проследить пути эволюции жизненно-важных молекул и становления особенностей регуляции биологических процессов; существенно, что у представителей архебактерий могут быть обнаружены клеточные процессы и макромолекулы, отсутствующие у эубактерий и эукариот, а также оригинальные решения таких обоих проблем, как организация генома и регуляция экспрессии генов.

Изучение молекулярных характеристик архебактерий может оказаться крайне ценным и для бистехнологических разработок. Оснований для этого утверждения более чем достаточно: многие представители архебактерий в ходе жизнедеятельности образуют метан; подавляющее большинство известных видов архебактерий существует в экстремальных условиях - экстремально высоких температурах и концентрациях солей, низких значениях рН и т.п.; свойства белков, выделенных из архебактерий, как правило, отражают экстремофилию организмов (например, ферменты, выделенные из экстремально термофильных архебактерий, высокотермостабильны и термофильны), что и определяет их высокий технологический потенциал.

Представление об архебактериях, как представителях самостоятельной линии в эволюции, было сформировано в ходе филогенетического анализа по данным количественной оценки гомологий нуклеотид-ных последовательностей 16й(18з) рибосомкых РНК (иоозэ,гох, 1977), Результаты, полученные с помощью такого малоапробированного подхода, нуждаются в подтверждении со стороны данных, более привычных для систематики; указанный подход имеет и другие недостатки, например, он не дает возможность установить в удовлетворительном приближении степень древности архебактерий и эволюционные взаимоотношения между предками современных архебактерий, эубактерий и оукарнот. Для решения всех этих проблем в настоящее время важное значение имеет изучение характерных признаков фенотипа архебактерий, в частности, качественных особенностей их субклеточных структур и макромолекул.

Цель и задачи работы. Цель настоящей работы состояла в выявлении особенностей фенотипа архебактерий на молекулярном уровне. Для достижения указанной цели потребовался всесторонний анализ литературы по проблеме и проведение специального исследования некоторых компонентов генетического аппарата экстремально термофильных архебактерий, сведения о свойствах которых к моменту начала работы отсутствовали, либо носили эпизодический характер. Основной задачей исследования было изучение свойств ДНК-зависимых ДНК-полимераз, ДНК-зависимых РНК-полимераз и рестриктирующих эндонуклеаз экстремально термофильных архебактерий и структурной организации генома этих микроорганизмов, в частности, наличия в его составе структурных элементов генома эукариот. В задачи работы входило также уточнение таксономического положения в царстве архебактерий тех видов, которые служили объектом исследования.

Научная новизна работы. Впервые изучение таксономии архебактерий проведено на основании измерения параметров гетерологических

гибридов ДНК и I6S рРНК разных видов архебактерий. Предложен новый порядок царства архебактерий Tbormoproteuiea, объединяющий восстанавливающие серу экстремально термофильные анаэробы родов ©м-.-шо-protaus, Theraiophilum и Daaulfurocoocua, Показано, что представители этого порядка вместе с окисляющими серу экстремально термофильными бактериями рода Sulfolobus образуют одну из двух ветвей царства архебактерий; метанобразущие и экстремально галофильше архебактерий, а также термоацкдофил Taermoplaama acidophilus образуют вторую ветвь царства.

Впервые выделены, очищены и изучены ДНК-зависимые РНК-полиме-разы из архебактерий порядка Thersioprotealeo - ИЗ Th entapióte из tenax, Desulfurococcus mucosus и Daaulfurococcus аоЩ1з, Показано, что по субъединичноьфг строению и чувствительности к ингибиторам ферменты отличаются от РНК-полимераз эубактерий и проявляют сходство с РНК-полимеразами А эукариот. Показано также, что субъединичный состав РНК-полимеразы организма может служить филогенетическим маркером, отличающим представителей двух ветвей царства архебактерий. Впервые удалось осуществить la vitro асимметрическую транскрипцию ДНК архебактериальной РНК-полимеразой.

Впервые изучены ДНК-зависимые ДНК-полшеразы архебактерий. Разработаны методики выделения и очистки ферментов из термофилов Sulfolobus acidocaldarius и Theniopl a.-Jna acidopftllum . На примере sulfolobus acidocaldarius показано, что в клетках архебактерий присутствуют три ДНК-полимеразы - А, В и С (из . Thermoplasma acidophilum выделена только ДНК-полимераза В), различающиеся по физико-химическим, биохимическим и иммунохимичееким свойствам. Выявлено, что ДЩ-полимеразы С и В имеют некоторые характерные черты зукариотических ДНК-полимераз ■< . и з , соответственно, а ДНК-полимераза А похожа на эубактериальные ДНК-полимеразы типа I или II.

Впервые обнаружено наличие рестриктирувдей эндонуклеазы у архебактерии, представляющей ветвь серозависимых экстремальных термофилов - у Giilfolobuu aoidocaitiariu3 . Фермент, обозначенный как Suai , является изошизомером эубактериальных рестриктаз типа ВврН1 . Разработаны методики очистки фермента, исследованы его каталитические свойства.

Впервые изучен ряд особенностей структурной организации генома архебактерий. В составе геномов экстремально термофильной архебактерии suliolobus ecidocaldailua и экстремально галофильной архебактерии iialobacteriua halobium обнаружены короткие участки простых последовательностей, состоящих из одного повторяющегося нуклеотида или двух тандемно повторяющихся нуклеотидов, наличие которых является характерным признаком генома эукариот. На примере генома Sulfolobua acidocaldarlua выяснено, что простые последовательности архебактериального генома обладают теми же основными характеристиками, что и простые последовательности генома эукариот. Впервые показано, что в геноме архебактерии suifolobus acidocalda-rlus отсутствуют повторяющиеся последовательности.

Научная и практическая значимость работы. Полученный экспериментальный материал способствует уточнению наших представлений об эволюционных взаимоотношениях трех существующих царств живого. Он свидетельствует об одновременном' наличии у архебактерий молекулярных признаков фенотипа, присущих либо только эубактериям, либо только эукаркотам, и вкупе с существующими данными литературы указывает на возможность близости архебактериального фенотипа к анце-стральному. Такая точка зрения предполагает, что либо архебактерии древнее, чем оубактерии и оукариоты, и дали начало этим последним, либо же, если у трех царств был один общий предок, то архебактерии в наибольшей степени сохранили сходство с ним.

Свидетельствуя о структурно-функциональных особенностях организации архебактерий на молекулярном уровне, результаты работы создают основу для нового направления исследований - молекулярной биологии архебактерий.

Полученные данные дают возможность вплотную подойти к выяснению путей эволюции аппаратов репликации и транскрипции; разработка методов выделения и характеристика ДНК-зависимых ДНК-полимераз и РНК-полимераз экстремально термофильных архебактерий представляется необходимой предпосылкой для успешного изучения этих вопросов.

Все ферменты, выделенные и очищенные из экстремально термофильных архебактерий - ДНК-зависимые ДНК-полимеразы, ДНК-зависимые РНК-полимеразы, рестриктирушие нуклеазы - высокотермостзбильны и термофильны и могут быть использованы для научных и практических целей в условиях, когда обычные мезофильные ферменты либо денатурируются, либо находятся в неактивном состоянии. Полученные препараты указанных ферментов используются в лабораторных исследованиях в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ АМН СССР и Новосибирском Институте биоорганической химии Сибирского отделения АН СССР.

Результаты работы вошли в курс "Молекулярная биология и генная инженерия", читаемый студентам Физического факультета Тбилисского государственного университета.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 1-ой международной конференции по архебактериям (Мартинсрид-Мюнхен, 1981г.), 1У-ом советско-французском симпозиуме "Структура и функция белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982г.), всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы в природе и практике народного хозяйства" (Москва, 1983г.), симпозиуме Федерации европейских микробиологических обществ "Эволюция прокариот" (Мюнхен, 1984г.), У1-ом всесоюзном симпозиуме "Конформационные изменения биополимеров в раст-

ворах" (Тбилиси, 1985г.), УП-ом съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985 г.), П-ом рабочем совещании "Ёнэимология матричного синтеза нуклеиновых кислот " (Новосибирск, 1986 г.), республиканской конференции "Современные достижения' микробилогии и вирусологии в сельском хозяйстве и промышленности" (Тбилиси, 1986 г.), У1-ом всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987 г.), рабочем совещании по архебактериям (Цушино, 1987 г.), международном симпозиуме "Физико-химия ДОК и молекулярные механизмы функционирования генома" (Тбилиси, 1987 г.), международной конференции по биохимии (Пекин,1987г.), У-ом съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987 г.), Х1У-ом международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988 г.); выставлялись в павильоне АН ГССР на ВДНХ ГССР (Тбилиси, 19EP7-I988 г.г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава I), описания условий эксперимента (глава 2), изложения результатов экспериментальных исследований и их обсуждения (глава 3), заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 289 страницах, содержит 47 рисунков и 25 таблиц. Список литературы включает 349 наименований, в том числе 32 на русском языке.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование таксономических отношений между архебактериями по результатам перекрестной гибридизации ДИК и lös рибо-сомной РНК.

Критерием, по которому обычно организм относят к архебактериям и определяют его положение среди известных видов архебактерий, служит характер нуклеотидньгх последовательностей I6S рРНК или ее фрагментов. Учитывая трудоемкость секвенирования 16s рРНК, мы задались целью разработать относительно простую процедуру, позволяющую судить о принадлежности организмов к архебактериям и их положении в царстве на основании сходства первичных структур lös рРНК с первичными структурами I6S рРНК репрезентативных видов архебактерий. Оценну сходства первичных структур I6S рРНК проводили по методу, предложенному ДеЛеем и ДеШмедтом - по характеристикам гетерологических гибридов 1бз рРНК и ДНК; I6S рРНК метили радиоактивным изотопом, а ДНК денатурировали и иммобилизовали на нитроцеллюлозных фильтрах (DaLej, Desmedt, 1975). Конкретно задача сводилась к выбору параметров гибридов I6s рРНК - ДНК, позволяющих построение филогенетического дерева архебактерий, построению этого дерева и апробации метода для установления таксономического положения шести новых изо-лятов, предположительно относящихся к архебактериям: трех метаноб-разующих видов, обозначенных как Methanotmeraua fervidus, SH1 И МЗ, и трех метаболизирутацих серу экстремально термофильных видов, обозначенных как Theraoproteua tenax, Deaulfurococcu3 mucosus И "упрутие нити"; эти организмы были выделены из гидротермальных источников Исландии и Италии В.Циллигом и К.О.Штеттером.

42

lös рРНК метили Р in vivo и выделяли из 7 видов архебактерий, представлявших все предполагаемые порядки царства (определенные по сравнению первичных структур фрагментов 16з рРНК): ¡¿ethano-

coccus voltee, Methanobact0rf.ua theraoautotrophicum, ¿,'attianogonium maxinlprls, Halooactorlua balobium, 'Cbermoplaatua acidophilus!., Sul-folobua acldocoldarius, SuJLfolobus зрсс. B6, а также из нового серозависимого экстремального термофила 'xhermoproteus tenaoc. Эти FHK гибридизовали с иммобилизованными на фильтрах ДНК из 17 разных организмов: из шести вышеуказанных новых изолятов, из архебактерий Methanococcus voltae, Methanobacteriusi tuernoautotrophicum, Ketha-nogenium marinigrls, wethanoearcina barkori, Haiobactai-iuia halo-biun, Halococcua morrhuae, Thersiopl asiaa acidophilus!, Sulfolobua acidocaldarius, из эубактерии Escherichia coll и из эукариот -Saccharonjcea cere-risiae и тимуса теленка.

Определяли два типа параметров: а) количество радиоактивности (имл/мин), связывающееся с I мкг ДНК при 60°С; б) температуру, при которой с фильтра элюируется 50$ связанной РНК (Тм) - для ее определения строили кривые плавления гибридов: фильтры с гибридами, находящиеся в буфере, прогревали в течение 15 мин при 65, 70, 75, ВО, 85, 90 и 9ЕРС, после каждого прогрева удаляли буфер и определяли оставщуюся на фильтре радиоактивность. Для того, чтобы иметь возможность соотнести друг с другом результаты разных опытов, а также для того, чтобы в случае данных типа "а" исключить влияние размера генома и количества генов I6s рРНК в геноме, оперировали стандартизованными величинами. Данные типа "а" представляли как отношение количества радиоактивности в гибридах к количеству радиоактивности в гибриде той же РНК с гомологичной ДНК; эту величину мы обозначили как "эффективность гибридизации". Данные типа "б" представляли как отношение разницы мевду Тм и температурой гибрвди-зации к разнице между Тм гомологичного гибрида и температурой гибридизации; эту величину мы обозначили как "парциальная стабильность гибридов". В таблице I приведены результаты определения указанных

Таблица I.

Эффективность гибридизации (а) и парциальная стабильность гибридое (Ъ) ДНК и I6s рРНК разных архебактерий

Mothano- Kethano- Kethano- Halo- Thermo- Sulfolo- Thermo-coccub bacterium genlum bacterium plasma bue B6 proteue

ab a b a b a b a b ab a b

Kethanococcua 1 1 0,05 0,71 0,06 0,55 0,35 0,28 0,25 0,36 0,04 0,45 0,03 0,24

SKI 0,4 0,94 0,03 0,85 0,05 0,45 0,35 0,33 0,23 0,36 0,05 0,46 0,03 0,24

Kethanobact erium 0,26 0,65 1 1 0,07 0,55 0,64 0,42 0,40 0,37 0,06 0,33 0,06 0,25

"ethanothermus 0,22 0,68 0,19 0,83 0,06 0,49 0,40 0,44 0,39 0,46 0,09 0,48 0,07 0,26

Metbanogenium 0,10 0,44 0,05 0,62 1 1 0,42 0,38 0,20 0,53 0,10 0,17 0,05 0,18

Kethanosarcina 0,12 0,46 p.05 0,58 0,11 0,62 0,50 0,42 0,31 0,41 0,07 0,17 0,03 0,19

M3 0,10 0,43 0,04 0,62 0,16 0,59 0,50 0,37 - - - 0,02 0,18

halobacterium 0,04 0,39 0,01 0,54 0,02 0,54 1 1 0,11 0,28 0,01 0,33 0,02 0,14

Halococcre 0,03 0,41 0,01 0,57 0,01 0,40 0,51 0,63 0,06 0,3B 0,01 0,29 0,01 0,14

Thermoplasma 0,03 0,47 0,01 0,53 0,01 0,36 0,08 0,24 1 1 0,02 0,30 0,01 0,11

Sulfolobus (^Si¿639) 0,12 0,46 0,03 0,40 0,05 0,22 0,24 0,28 0,31 0,35 of (if 0,12 0,49

Thermoprotsus 0,10 0,39 0,04 0,52 0,08 0,33 0,38 0,33 0,49 0,35 \ » / 0,34 0,46 1 1

"упругие нити" - - - - 0,09 0,31 - - 0,40 0,40 0,38 0,53 0,60 0,67

Pesulfurococcus 0,25 0,33 0,04 0,48 0,08 - 0,36 0,32 0,42 0,34 0,21 0,56 0,30 0,57

Значение в скобках относится к гибриду ДНК Sulfolobus DSK639 И Хбд рРНК Sulfolobus D31T639

величин для всех возможных пар из исследованных ДНК и lös рРНК. Данные о гибридах I&3 рРНК архебактерий с ДНК эубактерий и эукариот в таблице не приведены: в условиях опыта стабильные гибриды такого рода не образовывались.

Из данных таблицы I очевидна предпочтительность использования парциально" стабильности гибридов для целей таксономического анализа; использование для этих целей эффективности гибридизации осложняется рядом обстоятельств; например, значения этой величины относительно высоки только для пар ДНК - I6S рРНК близкородственных организмов и с увеличением эволюционного расстояния падают очень резко, ее значения не совпадают для обратных пар (ДНК /А/ - lös рРНК /Б/ и ДНК /В/ - loa рРНК /А/).

На рис.1 приведена дендрограмма парциальной стабильности гибридов межд7 lös рРНК и ДНК архебактерий (построена по данным табл.1), которую в определенном приближении можно рассматривать как дендро-грамму филогенетических отношений мевду архебактериями. Вследствие

05

1.0 павд'АШАЯ сишшль

Milhanococcus voüce Sit)

(Wnonogemum Melhonosarcino ИЗ

КИНКШЮШ

MeihonoSoctenum Hclhcnobocteriocwe иггишпялтсшК ШШоШетм НйЬопоВигамем МЕИШЫИ«.ию*и>

Sullolobus acidocQMatius Sullotrtms spit. 8 .

HEIMHICRÜBIAIES

«ДШВЛС1ЮА1Е5 THEBKCPIASKAIES SUIFOLOBAIES

г---Tlrermoprolwis Ihermaproteoceae

_J-L--"jcrame шсг»" IHEJNOPÜOltAtK

•----Oesulfuratoccus tesulfurotoctacioi

Рис. I. Дендрограмма парциальной стабильности гибридов ДНК и lös рРНК разных архебактерий.

того, что каяздый порядок архебактерий в опытах был представлен одной РНК, внутрипорядковые расстояния определяли только при помощи одной РНК и парциальную стабильность пар наиболее близких родственников считали за внутрипорядковый уровень ветвления. Для определения расстояния между порядками усредняли все измеренные расстояния между представителями порядков, включая и значения для обратных пар. Построение начинали группируя попарно (по возможности) наиболее близкие виды. После объединения: пары видов их считали за один вид и усредняли расстояния, отделяющие их от других пар (или от не образовавших пары видов). По усредненным данным опять выявляли родственные пары и процедуру повторяли до полного объединения.

Все шесть новых изолятов оказались относящимися к архебакте-риям. Как видно из дендрограмш, метанобразуюший вид МЗ относится к порядку Ке^апоа1сгоЬ1а1ее к судя по величине расстояния между МЗ и мвЪЬаповеп1иа и мекду МЗ и МеШ8пооагс1па , которое сопоставимо с расстоянием между семействами, этот вид представляет по крайней мере новы?, вид, а то и новое семейство порядка ыеЬЬапо-microbial.es. Метанобразукщий вид зк 1 представляется настолько близким родственником ¡ге-Ышпососоиз уо1Ъао , что его мо;хно считать представителем рода МеМгааососсиз . Метаноген ИвЬЪ.т.оЫ\опаха Таг-г!йив относятся к порядку Ывъггапов&сгоЫаХез И, возможно, представляет новое семейство Ке-Ыгашлиогаасвав этого порядка. Расстояния между тремя новыми серозависимыми экстремальными термофилами (сравнимые с расстоянием между МЗ, КеШалозагсАпа и КеЪЬапобвп1ит) и расстояния между каждым из них и другими представителями архебактерий (сравнимые с расстоянием между представителями известных порядков) позволяют считать ТЬегшорпЛвиа tenax, Х)ваи1Гогоооосио яи-соаив и "упругие нити" представителями различных семейств и объеди-

нить эти семейства в один порядок, обозначенный как Theroop rotéalas . Дальнейшее изучение указанных организмов (МЗ был обозначен как Kethanoplanus limícola, SIÍ1 - как Mathenocoecus tüenDolltho-trophiouG , а "упругие нити" - как TheraopMlum pendens ) подтвердило правомерность выводов об их таксономии.

.Таким образом, описанный подход к классификации архебактерий, хотя и является несколько грубым и поверхностным, позволяет в удовлетворительном приближении определить таксономическое положение новых организмов, а вопрос об их принадлежности к архебактериям -реиать однозначно. Наиболее надежным на основании описанных экспериментов по гибридизации представляется отнесение образца с неизвестным таксономическим псло;хением к тому или иному порядку; для внутрипорядкоБЫх гибридов значения парциальной стабильности и эффективности гибридизации очень высоки и близки друг к другу, что не дает возможности делать убедительные выводы о внутрипорядковых отношениях.

Одним из важных выводов, следующих из дендрограммы парциальной стабильности гибридов, является очевидное деление царства архебактерий на две ветви - одн", объединяющую три порядка метаногенов, один порядок экстремальных галоф:;лов, а также порядок, единственным представителем которого является термоацидофил Tharmoplasma acidc • philum , и вторую, в состав которой входят два порядка серозави-симых экстремальных термофилов: Sulfolobales к Biermoproteales.

Деление архебактерий на две указанные ветви следует иметь в виду при изучении особенностей молекулярной организации архебактерий. Свойства, которые являются общими для нескольких представителе». каждой ветви можно с большой вероятностью обобщать и считать характерными для архебактерий в целом. Б исследованиях генетического аппарата архебактерий, о которых сообщается ниже, мы пытались охва-

тить представителей обеих архебактериальных ветчей.

С дендрограммой, представленной на рис.1, почти идеально совпадает уточненный вариант дендрограммы, построенной по результатам сравнительного анализа частичных последовательностей I6s рРНК (fox, 1985). Многие вывода о филогении архебактерий, следующие из дендрограммы, получили подтверждение и в результате сравнения полнчх первичных структур I6S рРНК архебактерий ( тгоорэ , Olsen, 1986).

2. .ДНК-зависимые РНК-полимеразы серозависишх экстремально.. термофильных архебактерий порядка Kiermoprotealas

Ко времени начала наших исследований были выделены и изучены ДНК-зависимые РНК-полимеразы из нескольких представителей архебактерий: из метаногена Uethanobacterium thernoautotrophlcun, из экстремального галофила н al о о ас te Пив. haiotoiua,, термоацидофила Theraoplaana acidophilun и сероокисляших экстремальных термофилов порядка Sulfolobale3 . Ферменты характеризовались сложным субъединичным строением, отличающим их от известных РНК-полимераз эубакте-рий; кроме того, они оказались нечувствительными к рифампнцину и стрептолидигину - сильным специфическим ингибиторам эубактериальшх РНК-полимераз. Обнаружение новых видов экстремально термофильных серозосстанавливающих архебактерий и их выделение в новый порядок Therao-protealeB , который вместе с Sulfolo boles оказался отнесенным к отдельной ветви царства архебактерий (см.предыдущий раздел), поставили на повестку дня вопрос о свойствах РНК-полимераз представителей порядка Thernoprotéales. Основными вопросами, которые требовали ответа, были: а.) обладают ли РНК-полимеразы порядка Thersso-proteales теми же свойствами, которые оказались общими для РНК-полимераз других рхебактерий; б) отражено ли сушествование в царстве архебактерий двух основных i:твей в свойствах РНК-полимераз;

в) обладают ли РНК-полимеразы представителей ТЬегторгойеа1еа способностью осуществлять 1а у!5го специфическую циклическую транскрипцию матриц - свойством, отсутствующим у известных архебактериаль-ных РНК-полимераз, Для получения ответов на эти вопросы нами были выделены и изучены РНК-полимеразы из трех видов ТЬвгяорго1гва1вз1 ТЬепворгоЪеиэ Ъ сл&х, 1)е;виЗ.£цгососсиз шисо&иа и Вез иЛэГигососсиз аоЫ11в. Температурный оптимум роста организмов находится в пределах 85-88°С; организмы являются строгими анаэробами, вследствие чего все этапы выделения и очистки ферментов проводили в анаэробной камере при полнои удалении кислорода.

Начальные этапы выделения и очистки всех трех ферментов были одинаковыми: после лизиса клеток нуклеиновые кислоты и связывающиеся с ними белки осавдали полиэтиленимином, белки элюирсвали из осадка буфером, содержащем 1,2 М нв^с!, переосаждали их добавлением к раствору сернокислого аммония и собирали центрифугированием. Последующие этапы очистки ферментов т^епах и п. шисозиз указаны на ркс.2; для дальнейшей очистки фермента Б. аоЫЛЛз использовали антисыворотку, полученную к РНК-пслимеразе V. иисоеиз : ее в избытке добавляли к белковому раствору, образовавшийся осадок промывали к суспендировали в буфере, прогревали (90°С, 10 мин), осадок уда- • ляли центрифугированием - РНК-полимераза оставалась в супернатанте. На рис.3 приведены электрофореграммы конечных препаратов РНК-полимераз в денатурируюием'полиакриламидном геле (ПААГ); для сравнения здесь же приведены электрофореграммы РНК-полимераз архебактерий 5.ас1с!оса1(1аг3.ив и Т.ас1с1орМ1ит , а также еубактерии В.соИ.

Все полипептидные цепи, видимые на электрсфореграммах (обозначены А-? ) РНК-полимераз Трапах и и. аисоаиа, можно считать истинными компонентами ферментов, т.к. они строго соочшаются друг с другом и ферментативной активностью в ходе по крайней мере трех

Desulfurocoacus mucos ua 07 (Thermoproteua

Ьвпеае dsm 2078)

Лизис + полиэтиленимия (0,5$) 1

Центрифугирование при 25000 в, 15 мин | осадок

Элюция из осадка^1,2 М-ным Ш4С1

+ (ИН^^О^ до 70% от насыщения

Центрифугирование при 25000 в , 20 мин

| осадок Хроматография на ДЭАЭ-целлшозе

| элюат при 0,2 М то4С1 Хроматография на гепарин-целлюлозе

| элюат при 0,6 Мнн С1 Хроматография на Т4 ДНК-целлюлозе

| элюат при 0,2 М ш 01

Центрифутир! сахарозы /г.

РНК-полимераза r.tenex

'Ование в г сахарозы /глицерина

енте -30/10%)

_________ ______________ — удельная активность: 950 ед.акт./мг

выход: 2,05хЮ4 ьд.акт./20 г биомассы РНК-полимераза р.mucosцз - удельная активность 1295 ед.акт./мг

выход: 2,4x10 ед.акт./20 г биомассы

Рис. 2. Схема выделения и очистки РНК-полимераз из I).mucosus и т.ten ах . Единица активности - количество фермента, катализирующее включение I нмоляР'УАМР в кислогонерастворимый материал за 10 мин при 85°С в стандартной инкубационной системе, содержащей: 30 мМ Трис-KCl , pH 8, 20 мМ MgCl2 , 100 мМ KCl, 100 мкг/мл матрицы (ДНК фага Т7) и т 0,1 мМ каждого из otp, dip, ct? и Г4с]атр.

f 2 3 4 б В -»I»

о' _ ■

е _ _ - _

F

G.H — I.J - • —

Рис. 3. Электрофореграммы конечных препаратов РНК-полимераз D.mucosus (1,6), T.tenax (2) и D.taobilie (7); на ' остальных дорожках РНК-полимераэы S.ocidocaldarius (3! 2?. acidophilus (4) и В.coll (5). Электрофоретическое разделения полипептидов здесь и далее проводили в 5--25^-ном градиентном полкакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.

последних стадий очистки. Молекулярные массы компонент РНК-полиме-раз, вычисленные из сравнения-их электрофоретической подвижности с подвижностью белков-маркеров, приведены в табл.2.

Таблица 2

Молекулярные массы компонент РНК-полимераз T.tenax и D.nrucosus

РНК-полимераза Молекулярная масса (кДа) компонента

А' В С d с р G Н I J

T.tenax 124 99 42 - 32 22 15 12,6 11,8 11,2 10,8

В. писоаиз 130 101 44 38 30 22 14,2 12,2 12,0 10,9 10,7

« ?

Компонентный состав мономера РНК-полимераз T.tenax и В. mucosus определяли, сопоставляя интенсивности окрашиваемых полос на электрофореграммах с молекулярными массами компонент; при этом до-цускалось, что компонент А представлен в молекуле фермента один раз. Расчет показал, что каяадый из компонент А,В,С,Е и G представлен в мономере ферментов одной копией; содержание компонента D в ферменте в.аиооаиз и компонента ? в обоих ферментах является суб-стехиометрическим; компонент Н в мономере фермента I). mucosus , по-видимому, предстазлен несколькими копиями, а компонент I в мономерах обоих ферментов - двазады.

В T.teaax обнаруживается только одна форма РНК-полимеразы, а в d.mucosus наряду с основной формой фермента (форма I) обнаруживается и вторая - минорная (форма II), отличающаяся от формы I наличием дополнительного компонента (Cj) с молекулярной массой 08 кДа, присутствующего в одной копии в мономере фермента.

Для проявления каталитической активности РНК-полпмераэ необходимо наличие в реакционной среде матрицы, чгтчрех ют и ионов магния или марганца. В таблице 3 приведены данные об удельной активности (

Таблица 3

Активность РНК-полимераз T.tonax и d. mucosus на разных матрицах

Удельная активность (нмоль'мг^.мин-^)

Матрица

РНК-полимеразы

T.tenax

РШ-полимеразы

Р.mucosus

ДНК фага ¡6 Н ДНК фага Т7 ДНК фага Т5 ДНК фага Т4 ДНК фага А ДНК T.tenax

ДНК S.- acidocaLdai-Aus Однонитевая ДНК тимуса теленка

0,7 73,9 95,3 58,1

23.0 66,6 69,3

41.1

0,6 71,3 129,5 13,9 12,7 40,5 62,7 39,5

поли [d (A-T)j . коли [а (Т

i

ферментов на разных матрица::. Активность обоих ферментов ка натив-ньтх двухцелочечных матрицах максимальна в присутствии 20 мМ Мб01

2

или 3 мМ 1Й1С12 • Оптимальное значение концентрации Ш1 равно 100 мМ. '

• Исследуемые РНК-полимеразы высокотермостабильны» особенно фермент т.-Ьепах , который вследствие более чем 2-х часового прогрева при Ю0°С (в стандартной инкубационной системе в отсутствии матрицы и ИГР ) терял всего лишь около 50% своей уделььой активности. Ферменты также и термофильны - максимум их активности на ДНК фага Т7 наблюдается при 85°С (рис.4). Оптимальные значения рК для активности ферментов находятся в интервале рН 8-8,5.

Рис. 4. Зависимость каталитической активности РНК-полимзраз

т.tenas и D.mucosus (°) от температуры. Активность фермента членах -определяли на ДНК фага >ЗН, а фермента d.mucosus на ДНК фага Т7.

Оказалось, что РНК-полимераза D.mucosus , также как и РНК-полк -.ераза е. сои , транскрибирует цепи ДНК колифага Т7 асимметрично: при гибридизации транскрипта с разделенными цепями этой ДНК, он почти полностью (98$) связывался только с одной, тяжелой цепью ДНК. Гибридизация по методу Саузерна транскрипта с фрагмен-

о

. с i

50 60 70 80 SO tCO 'С

тами ДНК фага Т7, полученными с помощью рестриктазы Epail , показала, что транскрипт гибрядизуется со многими фрагментами ДНК, но не с ее тграйним левым фрагментом длиной 500 п.о. (рис.5, дорожка 2)

, Рис. 5. Гибридизация по методу Саузерна

Hpall-йрагментов ДНК фага Т7 с меченными полинуклеотидами, синтезированными РНК-полимеразой .D.oucosus на нативной ДНК фага Т7 (2) и на ДНК фага Т7, расщепленной рестриктазой н^ ХГ. (3), Стрелка на дорожке 2 указывает положение крайнего левого фрагмента ДНК; стрелки на дорожке 3 указывают положение фрагментов ДНК, транскрибируемых с высокой и низкой эффективностью. На дорожке I контроль: нрап-фрагменты ДНК фага Т7, меченные по 5'-концу.

Если в качестве матрицы использовали набор нраИ-фра^ментов ДНК фага Т7, то РНК-полимераза D.muoosua транскрибировала некоторое фрагменты предпочтительно, а некоторые - не транскрибировала вовсе (рис.5, дорожка 3). РНК-полимераза о.иисозиз является единственной известной архебактериальной РШ-полимера. ¿й, способной vitro осуществлять хоть какое-то подобие специфической циклической транскрипции; остальные известные РНК-полимеразы архебактерий in •vitro транскрибируют любые матрицы не дискриминируя цепи и не

узнавая сигнальные последовательности. 'j

На рис.б приведены электрофореграммы известных РНК-полимераз архебактерий в денатурирующем ПААГ; для сравнения приведены олеюгро-фореграммы РНК-полимераз эубактерий и эукариот. Как видно, изученные нами РНК-полимеразы серозависимых экстремально термофильных архебактерий порядка Thermoprotealea (дорожки Ь-7), вместе с ферментами представителей порядка sulfolobales (дорожки 2-1I), образуют относительно однородную группу: у ферментов одинаковое коли-

»234 5 6 7 6 9 В tl 313 14 15 И 1?

1 :tt*t8

Рис. 6. Злектрофореграммы РНК-полимераз эубактерий, архебак-тзрий и эукариот; I - lactobacillus curvatus, 2 -а. coli, 3 - н.iialobiuai,4 - K.thermoaütotrophicua, 5 - D. aucosus (форма I), б - D. mucosus (форма II), 7 -T.tenax.B -E.coli, 9 -ü.aciüocalcariua, 10,11 - два разных штамма s.solfataricus(pl иЬ ), 12 - Т. ocidopbilvaa, 13 - Saccbarosyces cerevisiaa (РНК-полкмераза В), 14 - a. cerovisiae (РНК-полю,:e-раза А), 15 -schlüosaccharoajces рошЪв(РНК-полиме-раза А), 16 -Candida tropicalis (РНК-полимераза А), 17 - стандарты молекулярной массы.

чество компонент, взаимное расположение компонент на электрофо-реграммах - по крайней мере пести самых больших из них - схоже и эти же сесть компонент представлены в молекуле фермента не более, чем одной копией. По. компонентному составу очень похожа на рассматриваемые ферменты и РНК-полимераза т.acidophllum (дорожка 12). Как видн«-1 из рисунка, ферменты метаногена К.thennoaut otrophicura и экстремального галофила H.halobium проявляют несколько отличающийся компонентный состав.

Таким образом, по физико-химическим свойствам РНК-полимераэ, также как по характеристикам гетерологических гибридоа ДНК и 16$ рРНК (см. предыдущий раздел), царство архебактерий делится на две ветви. Единственным примером несовпадения деления царства по этим двум критериям является термоацидофил Т. acidophilus ; по генотипи-ческим характеристикам он относится к ветви метаногенов - экстремальных галофилов, а свойства РНК-полимеразы у него подобны серо-зависимым термофилам.

На рис.б наглядно видно различие компонентного состава РНК-полиыераз эубактерий (дорожки 1,2,8) и экстремально термофильных архебактерий. Ферменты различаются по количеству компонент, а также по соотношению размеров двух самых больших компонент. Далее, у архебактериальных РНК-полимераз отсутствует компонент, подобный компоненту 6 эубактериальных РНК-полимераз, с молекулярной массой промежуточной между двумя самыми большими компонентами и компонентом с молекулярной массой 40 кДа, И, наконец, компонент с молекулярной массой 40 кДа, всегда представленный в мономере эубактериальных ферментов дважды (.<<), в составе архебактериальных РНК-полимераз присутствует всего один раз. Различие между РКК-полимеразами эубактерий и архебактерий проявляется м в функциональных свойствах: РНК-полимеразы штаммов дикого типа всех эубактерий ингибируются антибиотиками рифампицином и стрептолидигином, а РНК-полимеразы архебактерий к этим ингибиторам не чувствительны.

Как видно на рис.6, по многим характеристикам компонентного состава РНК-полимеразы экстремально термофильных архебактерий проявляют значительное сходство с РНК-полимеразами А и В эукариотичес-ких клеток (дорожки 12-15). Нечувствительность архебактериальных ферментов к ¿-аманитину - специфическому ингибитору РНК-полимеразы В - можно, по-видимому, считать свидетельством большей близости ферментов к РНК-полимеразе А.

Представления об отличии эубактериальных РНК-полимераз от РНК-полимераз архебакгерий и о сходстве этих последних с РНК-поли-меразами зукариот в самое последнее время получили значительную поддержку. В пользу данной точки зрения свидетельствуют данные Циллига с сотр. об иммунохимических свойствах ферментов и о первичной структуре самых больших компонент разных РНК-полимераз, а также тот факт, что промоторы, узнаваемые архебактериальными РНК-полиме-разами, оказались почти полностью идентичными промотору РНК-поли-меразы В зукариот.

3. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы экстремально термофильных архебактерий S. aoldocaldarlua и Т. acidophilus

Ко времени начала работы в литературе отсутствовали сведения о ДНК-полимеразах, также как и о других компонентах репликационного аппарата архебактерий. Нами были выделены и изучены три ДНК-полимеразы - А, В и С (произвольная номенклатура) серозависимой экстремально термофильной архебактерии в.acldoculdarius (оптимум роста 70-75°С, рН 2,5) и ДК-полимераэа В термоацидофильной архебактерии х,acidophilum(onT№.yM роста 59°С, рН 1,3),

На рис.7 представлена схема выделения и очистки ферментов. ДЩ-полимеразную активность, обнаруживаем^ в клеткахs.aoldocal-dariue, при г-ель фильтрации на сефарозе CL -6В элюировали в виде двух пиков (рис.8): один пик элюировали сразу после свободного объема коленки в области элюции белков с молекулярной массой более 500 кДа (фракции 17-20), а второй пик - после элюции примерно половины колоночного объема (фракции 32-39). Полипептидный состав фракция этих двух пиков, как видно на рис.8, полностью различен. ДНК-аолимеразу большого белкового комплекса обозначали как ДНК-полиме-

Sulfolobus Лизис асidoealäarius dsu 639

Thermoplasma aeidophilum AMHC 914-

Центрифугирование при 25000 g , I ч

| супернатант ДЭАЭ-целлюлоза

промывочная жидкость

Биорекс-70.

элюат при 0,1-0,2 M

Сефароза CL-6B

НИ

ДНК-полимераза С 4000 ед.акт./мг выход 160 ед.акт. /80 г биомассы

Гепарин-целлюлоза

| промывочная | жидкость

Центрифугирование в градиенте сахарозы глицерина (10/5-30/10%)

ДНК-полимераза А ДНК-полимераза В 1750 ед.акт./мг 43000 ед.акт./мг

выход: 1300 ед.акт./80г биомассы

Лизис

I

Центрифугирование при 25Ö00 g , I ч

I супернатант ДЭАЭ-целлюлоза

промывочная I жидкость

Фосфоцеллюлоза P-II

элюат при ♦ 0,16 и HCl

Биорекс-70

элюат при t 0,1 M KCl

Голубая сефароза сх-бв

I элюат при | 0,12 M KGI

Тойоперл Kvr-50

ДНК-полимераза В 4200 ед.акт./мг выход: 1400 ед.акт. /8,5 г биомассы

Рис. 7. Схема выделения и очистки ДНК-полимераз из s. ас ido-

cal darius и T.acidophilum . Единица активности - количество фермента, катализирующее включение I нмоля радиоактивно меченого предшественника в кислото-нерастворимый материал за 30 мин при 60-63°С в стандартной итерационной системе, содержащей: 50 мМ Трис-НСI рН 7,9; 20 мМ KCI, 2-5 мМ MgCl2 , 10 мкг/мл активированной ДНК и по 0,1 мМ каждого из dGTP, dTTP, dCTP и [32р] dGTP.

разу С; ее дальнейшая очистка была сильно затруднена - при разрушении белкового комплекса происходило резкое падение ДЩ-полимеразной активности. Во втором пике ДНК-полимеразная активность фракций коррелирует с присутствием во фракциях двух полипептидов с молекулярными массами в области 104 и 40 кДа (рис,8). Частично разделить эти

** -¿з-е

Г.* ' '

Рис. 8. Электрофореграммы фракций, полученных гель-фильтрацией на сефарозе сь-бВ в ходе очистки ДНК-полимераз а.ас1<1о-са1(1аг1иа, и включение [32рЬсмр в кислотонераствори-мый продукт, катализируемое наносишм на гель количеством соответствующих фракций. И - РНК-полимераза 8.ас14оса1<1аг1ив; справа - молекулярные массы компонент фермента (кДа).

полипептиды удалось аффинной хроматографией на гепарин-целлюлозе (рис.9); примерно одинаковая ферментативная активность равных по объему аликвот промывочной жидкости, обогащенной низкомолекулярным белком, и фракций (№ 11-17) элюата, обогащенных белком массой 105 кДа (рис.9), свидетельствует о том, что ДНК-полимеразиая активность присуща обоим этим белкам. Дальнейшего разделения двух ДНК-полимераз достигали препаративным центрифугированием в градиенте

5»

-иг

Рис. 9. Электрофореграммы фракций, полученных аффинной хроматографией на гепарин-целлюлозе в ходе очистки ДНК-полимераз 5.ас1<1оса1с1;1г1из , и каталитическая активность наносимого на гель количества соответствующих фракций.

а - фракция, наносимая на гепарин-целлюлозу; б - промывочная жидкость; и - РНК-полимераза 3.аоЫоса1<1аг1из.

концентраций сахарозы / глицерина (рис.10). Определение ДНК-поли-меразной активности фракций, полностью лишенных примесей белка с молекулярной массой 105 кДа, дает возможность оценить удельную активность низкомолекулярной ДНК-полимеразы (ДНК-полимераза В) -она равна 1750 ед.активности/мг; удельная активность ДНК-полимеразы с молекулярной массой 105 кДа (ДНК-полимераза А) оказывается в таком случае равной 43000 ед.активности/мг. Такая оценка удельной

Рис. 10. Электрофореграммы фракций, собранных после препаративного центрифугирования в ходе очистки ДНК-полимераз 3. ас1(1оса1с1аг1из , и каталитическая активность наносимого на гель количества соответствующих фракций, а - конечный препарат ДНК-полимеразы т.ас1(1орЫ1иш •, М - РНК-полимераза а. лсМосаЫаг!;».

активности ферментов соответствует результатам тех опытов, при которых во фракциях, содержащих оба фермента, активность ДНК-поли-меразы В была полностью ингибирована присутствием антител к этому белку.

В результате процедуры выделения и очистки, использованной в случае T.ecldophilum (рис.7), получали в высокоочищенном состоянии только одну ДНК-полимеразу с молекулярной массой в области 42 кДа; злектрофореграмма конечного препарата этого фермента приведена на рис.10 (дорожка а).

Об иммунохимическом сходстве выделенных ДНК-полимераз судили по образованию специфических комплексов ферментов с антителами, полученными к гомогенноиу препарату ДНК-полимеразы В s.acidocaida-rius. Фракции, полученные на различных этапах очистки ферментов, после электрофоретического разделения содержащихся в них белков переносили на нитроцеллюлозный фильтр и инкубировали с антисывороткой. В результате опыта оказалось, что антитела к ДНК-полимеразе В связываются только с этим ферментом и с /ЩК-полимеразой Т. acldophl-lun ¡ ни с ДНК-полимеразой А 3. aeidocaldaxius « ни с белками фракций, содержащих ДНК-полимеразу С s.aoidocaldariua • специфические комплексы не образовывались. Не наблюдали взаимодействия антител ни с ДНК-полимеразой ji печени крысы. Результаты дают возможность полагать, что низкомолекулярная ДНК-полимераза В s.acido-с aidaxius не является продуктом протеолитической деградации ДНК-полимераз А и С этого организма; свидетельствуют они также и о тесных родственных связях ДНК-полимеразы, выделенной из T.acldophi-lum , с ДНК-полимеразой В 3. acldoealdariua.

Наличие матрицы, затравки, четырех dNTP и ионов ug2* или необходимо для проявления каталитической активности ферментов. В таблице 4 приведены данные об активности ферментов на разных ыат-

Таблица 4

Каталитическая активность ДНК-полимераз s. acidooaidaríua и т. асldophllum на разных матрицах

Включение ffip] ДТЫР, пмоль

Матрица ДО-полимеразами ДНК-полимеразоЙ

S. ас ldoc aldarlúa T.acldophilum

________ABC _

Нативная ДНК 3. ас1Лоса1йаг1из <10 <10 <10 -

Активированная ДНК 8. ас1йооа1а&г1ио 1195 1850 820 -

Нативная ДНК тюуса теленка <10 <10 <10 <10

Активированная ДНК тимуса теленка 1363 2148 828 1157

Денатурированная ДНК тимуса теленка 97 82 49 <10

ДНК фага и-|3трю <10 <10 <10 -

ДНК фага М13трЮ ♦ ¿(СССАСТАСОСАСОТ) 1250 17 21 675 -

Поли (А) <10 <10 <10 <10

поли (А)«олиго(41)^2-16 <10 <10 <10 <10

Поли (ОА) <10 <10 <10 <10

поли (¿а)+ ^ ыМ иТР <10 <10 <10 <10

ПОЛИ (ЗА) •0ЛИГ0(сШ^2_1д 121 167 196 165

ПОЛИ (¿А)»ОЛИГО(Т)|21_18 195 179 115 207

При использовании синтетических гомополимеров, а также ДЖ фага тзюрЮ > реакцию сначала проводили при 43°С в течение 10 мин, а затем - при 56°С в течение 30 мин.

рицах-затравках. В реакции на активированной ДНК (двунитевой ДНК с однонитевыми разрывами) оптимальные концентрации ионов Mg2+ для ДНК-полимераз S. acido cal dar lus находятся в области 5-15 мМ, а для ДНК-полимеразк т. aeidophilum - при 3 мМ; оптимальные концентрации ионов цп2+ во всех случаях примерно на порядок ниже.

На рис.11 представлена зависимость скорости катализируемой ' ферментами реакции на активированной ДНК от температуры реакции. Как видно, температурный оптицум активности даК-полимеразыТ,acldo-philum совпадает с оптимальной температурой роста организма, а в случае ДНК-полимеразз.ас1^еа1йаг1из он несколько ниже этой температуры. Термостабильность ферментов оценивали по остаточной удельной активности после преинкубации в стандартной инкубационной системе в отсутствии ДНК и аЭТР. 20-минутная преинкубация при 70°С не вызывала потери удельной активности ДНК-полимераз s. acidooalda-riua , при 80°С уменьшала ее на 30-50$, а при 98°С полностью инак-

Рис. II. Зависимость каталитической активности ДНК-полимераз от температуры:

а - ДНК-полимераз А (о), В (•) и С ( а ) s.aoldocal-dariusi

б - ДНК-полимеразы Т. acldophílum.

тивировала ферменты. Менее термостабильной оказалась ДНК-полкмераза Т.ао1йЬрЫХ\1Д : она полностью инактивировалась в результате 20-минутной преинкубации при 80°С.

Активность ДНК-полимеразы С з. ас 1йос алааПиа ингибируется 8Н -блокирующим агентом И -этилмалеимидом (5мМ - полное ингибиро-вание) и тетрациклическим дитерпеноидом афидиколином (50 мкг/мл -70%-ое ингибирование). Остальные три ДНК-полимеразы к этим агентам не чувствительны.

Ни одна из исследован;тых ДНК-полимераэ не обладает 5'-.3'-экзо-нуклеазной активностью: инкубация конечных препаратов ферментов в стандартных условиях определения ДНК-полимеразной активности (в от-

чр ,

сутствии <Ш!Р ) с меченной Р по 5 -концу ДкС фага Т7 не вызывала уменьшения радиоактивной метки в кислотонерастворимом материале. Конечный препарат ДНК-полимеразы А з.ас1с1оса1с1аг1иа проявлял -экзонуклеазную активность. Ее регистрировали по понижению

ор

радиоактивности ДНК плазмиды рВнз22 , меченной Р по 3 -концу,

о о

а также по уменьшению длин меченных Р фрагментов ДНК фага тзшрю. Внесение в реакционную систему аитр ингибировало деградацию ДНК, что можно считать указанием на то обстоятельство, что наблюдаемая З'-^б' - экзонуклеазная активность вероятно ассоциирована с самой ДНК-полимеразой. ДНК-полшераза В 5.ьо1йооаЛЛвг1чз и ДНК-полиыэ-раэа т. ас1йорЫ1иа 3'-5' - экзонуклеазной активностью не обладают.

Была исследована способность днк-полимеразы а 5.&с1йос«й<1а~ г1иа использовать в качестве субстратов 14 разных аналогов <тар , модифицированных по фуранозному кольцу. Большинство исследованных аналогов включалось ферментом в растущую цепь днк вместо одноименного (по основании) природного аятР и необратимо терминировало дальнейшее удлинение цепи. Наиболее сильными ингибиторами оказались 3* -амино-2' ,3'-дидеэокситимидин-5'-трифосфат и 3 '-амино-З '-дезокси-

арабиноцитидин-5'-трифосфат. Специфические ингибиторы обратной транскриптазы ашг З'-азидо и З'-метокси производные <шз? в качестве субстратов ферментом не использовались. Сравнение полученных нами результатов с данными литературы показало, что по общей картине чувствительности к модификациям э сахарных остатках dNTp ДНК-полимераза A S. acldooaldarlus отличается от ДНК-полимераз ы и fi зукариот и ДНК-полимеразы I E.eoli.

После завершения данного этапа работы в литературе стали появляться сообщения о свойствах архебактериальных ДНК-полимераз. Были описаны'еще раз ДНК--полимеразы S.acidocaldarius (Kümczak et ai., 1985; Porftarre et &l., 1986), а также ДНК-полимеразы s.solfa-t arlcus (Rosal et al., 1986), Metboapcoccua Yanalelll (Zabel et al., 1985), Jíb.theraoautotropiiicu» (Kllwssak et al. , 1986) и H.&alobl- . um (Kohijama et al., 1986). В указанных работах изучено по одноцу ферменту (два в случае H.halobium ). Каждую из этих ДНК-пслимера» можно с определенной долей условности считать аналогом одной из охарактеризованных нами ДНК-похгимераз s.aoidooaldaxius-А, В или С,.

При попытке провести аналогии меяду ДНК-полимеразами архебак-терий и известными классами ДЩ-полимераз эубактерий и аукариот в первую очередь следует отметить чувствительность ДНК-полимеразы С к афидиколину - специфическому ингибитору ДНК-полимеразы << зукариот. Сходство ДНК-полимеразы С с ДНК-полимеразоЙ «< этим не ограничивается. Оба фермента ингибируются lí-зтилмалекмидом, оба обнаруживаются в больших цультиполипептцдных комплексах и, по-видимому, оба являются репликативными ДНК-полимеразами: свидетельством того, что архе-бактериальная ДШ-полимераза С является основной репликазой, можно считать данные литературы о подавлении афидиколинок роста клеток рада архебактерий. . . '

Очевидна возможность проведения параллели между ДНК-полимера-

зой В архебактерий и ДНК-полимеразой j3 эукариот. Оба фермента состоят из полипептидной цепи с молекулярной массой в области 40 кДа, лишены ассоциированных нуклеазных активностей, нечувствительны к афидиколину и N-этилмалеимиду. Несколько уменьшает вероятность существования близких родственных отношений между ферментами упомянутый выше результат об отсутствии у ферментов обаих антигенных детерминант.

Не все архебактериал;чые ДНК-полимеразы проявляют характерные черты ДКК-полимераз эукариот. ДНК-полимераза А, будучи поли-пвптидом с молекулярной массой в области 105 кДа с ассоциированной 3'-^ -экзоцуклеазной активностью, в гораздо большей степени похожа на ДНК-полимеразы I или II эубактерий, чем на какой-либо из эукариотических ферментов.

4. Рестриктируюшие нуклеазы архебактерий S.aoidooaldarlus И T.acldophilum,

На многих стадиях очистки ДНК-полимераз S.acidocaldarius и т. acidophilus. с ферментами соочищались рестриктируюше нуклеазы типа II. Рестриктирукпая нуклеаза, регистрированная в Т. acido-phllum , оказалась идентичной описанной в литературе рестриктазе Thai (McConnell et al., 1987) - единственной известной архебак-териальной рестриктазе к моменту начала работы. Она отделялась от ДНК-полимеразы в ходе аффинной хроматографии на голубой сефарозе CIr-бВ (рис.7). Дальнейшая очистка рестриктазы гель-фильтрацией на сефадексе Г-150 дала возможность получить практически гомогенный препарат фермента (судя по электрофореграмме, подученной в денатурирующем ПААГ) и определить, что фермент состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой в области X кДа. Удельная активность конечного препарата рестриктазы составила 8x10 единиц активности на I мг белка, а выход фермента - К)6 еди_

ниц активности из 20 г биомассы. Было показано, что рестриктаэа Thaï проявляет максимум каталитической активности при 60°С, pH 8,5 в присутствии 2 мМ MßCl2 и 20 ыМ KCl и высокостабильна в этих условиях.

Данные о наличии рестриктирутоих нуклеаэ в S.acidoealdariuo в литературе отсутствовали. Рестриктазу, обнаруженную в этой архебактерии, ш обозначили как Suai (обозначение Sael , точнее соответствующее принятой номенклатуре, было уже использовано для другой рестриктазы). На рис.12 приведена схема выделения и очистки этого фермента. Конечный препарат рестриктазы Suai был свободен от примесей 3'-*5'~ и б'-З'-экзонуклеаз, неспецифических эндонук-леаз и ДНК-полимераз.

Рестриктаэа suai расщепляет ДНК плазмиды рвн.522 , образуя более десяти фрагментов (рис.13а). Длины II наибольших фрагментов точно совпадают с длинами фрагментов ДНК плазмиды pBR322 . образованных под воздействием рестриктазы зарй1 , и равны 587, 540, 458, 434, 267, 234, 213, 192, 184 и 124 парам оснований(п.о.)

На рис.136 приведены образцы расщепления ДНК плазмид pBR322 и рис19 рестриктазами suai ,BsPRl и обеими рестриктазами одно временно. Фрагменты, полученные во всех трех случаях, идентичны, что указывает на то обстоятельство, что Suai узнает тот же тетрануклеотид GGCC , что л BspRi.

Для решения вопроса о том, образует ли рестриктаэа Suai пр расщеплении ДНК фрагменты с неспаренными основаниями на концах или же фрагменты с тупыми концами, предприняли попытку дотировать suai -фрагменты ДНК с ДК вектора, расщепленного рестриктазой H ine II , образующей тупые концы. С помощью Suai выщелляли из клона Dml , содержащего гены рРНК Drosoptiila melar»ca3tor , фрагмент длиной 3 т.п.о. и лигировали его с ДНК плазмиды puci9 , рас-

SulfoXobus Лизис

acldoealdarlue I

DSM 639 |

Центрифугкрование при 25000 g , I ч

| супернатант ДЭАЭ-целлюлоза

| промывочная жгдкость Фосфоцеллюлоза

элюат при 0,16-0,28 M KCl Сефароэа сх-бв

J

Оксиапатит

Рестриктирушая нуклеаза Suai

удельная активность: 6x10^ ед.акт,/мг выход: 1,43x10^ ед.акт./46 г биомассы

Рис. 12. Схема выделения и очистки рестриктируиаей цуклеазы Suai из S. acldocaldartua . Единица активности -количество фермента, катализирующее полное специфическое расщепление I шсг ДНК плазшуш рвнзгг за. 60 мин при 65°С в стандартной инкубационной системе, содержащей: 50 ыЫ Трис-HCI, рН 7,8; 5 мМ MgCl2 , 25 иИ KCI, 1,6 иЫ 2-меркаптозтанол, 0,1 мт/мл бычьего сывороточного" альбумина и 1-2 мкг ДНК.

Рис. 13. Sual-фрагменты ДНК ллазмидьг р0Н322 . . разделенные электрофорезом в êçS-hom ЛААГ (слева указаны длины фрагментов в парах оснований) (а) и фрагменты ДНК плазмид РВН322 и р1Ю19 , разделенные электрофорезом в 2$-ном агарозном геле (б). 1,4 - расшепление рестриктазой BspRl , 2,5 - расщепление рестриктазой Suai , 3,6 - двойное растепление рестриктазами вэрН1 и Suai.

тепленной Hlncii . Лигирование проводили при соотношении концов фрагмента с концами вектора, равном 50:1; процент рекомбинантных клонов был равен 7. Все десять из десяти проанализированных клонов содержали вставки, идентичные по электрофоретической подвижности клонированному фрагменту. .Факт успешного клонирования можно считать свидетельством того, что рестриктаза Suai при расщеп-

лении ДНК образует фрагменты со спаренными основаниями на концах и, соответственно, расщепляет тетрануклеотид узнавания симметрично (GGJCC ), Таким образом, рестриктаза Suai является изошизомером эубактериальных рестриктаз типа ВзрЮС.

Рестриктаза Suai не расщепляет ДНК 3.асldocaidarius. Причина этого, по~видимо»у, в том, что узнаваемая последовательность в ДНК модифицирована; по данным Янулайтиса с сотр. в составе ДНК s.aoidooaldarlus обглруживается Н^-метилцезоксицитозин.

Для проявления каталитической активности рестриктазы Suai необходимо присутствие ионов К£2+ ; оптимальная концентрация MgClg равна 6 мМ. KCI в концентрациях до 25 idi не влияет на активность фермента, но в более высоких концентрациях заметно снижает скорость реакции.

На рис.14 представлена зависимость каталитической активности фермента от температуры реакции. Резкое падение скорости реакции с повышением температуры выше 85°С, по-видимому, обусловлено ла-

t z з v s s т ». $ ю

Рис. 14. Электрофореграммы в 1%-ном агарозном геле Биа1-фрагментов ДНК плазмиды рВС19, образованных в стандартной инкубационной системе при.различных . температурах реакции: I - 45°, 2 - 50°, 3 - 55°, 4 - 60°, 5 - 65°, 6 - 70°, 7 - 75°, 8 - 80°, 9 - 85°, 10 - 98°С.

бильностью фермента в этих условиях: в результате 20-минутной преинкубации при 90°С его удельная активность уменьшалась примерно на 50%« При более низких температурах фермент стабилен: 20-минутная преинкубация при 50-75°С не вызывала уменьшения удельной активности.

Обнаружение рестриктируших нуклеаэ у &с1<1огaldarJ.ua и Т«.ас1аорЬ11иа - представителей обеих ветвей царства архебактерий, дает основание полагать, что наличие этих ферментов в клетке является таким же характерным признаком архебактериального фенотипа, как и эубактериального. К настоящему времени рестриктазы выделены еще из двух представителей архебактерий - двух видов метаногенов рода Ме№алососсиз(Гвt а1., 1984; КвзаХвг <гЬ а1.„1985) . Тот факт, что гомологичные ДНК архебактериальными рестриктазами не гидролизувтся, наводит на предположение о том, что в архебакте-риях, также как и в эубактериях, рестриктазы являются частью системы рестрикции-модификации. Существуют и прямые свидетельства существования у архебактерий рода Нал.obacteri.ua системы рестрикции - модификации (0ал1е18, \tais, 1984).

5. Структурная организация генома архебактерии 8. а с )Лос а! da г 1«в.

Обнаружение в составе генома экстремально галофияьных архебактерий рода нalobact9rlua структурных элементов генома эукариот-умеренно-повторяшихся последовательностей \Sapienaa, 1йо.иив , 1982) и интронов (0вп1о1з ^ а!., 1985), поставило на повестку дня вопрос об общем характере сходства структурной организации геномов архебактерий и эукариот. К этому времени уже было известно о наличии интронов в геноме представителей и другой ветви архебактериального царства - серозависимых экстремальных термофилов (КаШе ейах.,

1983); что касается повторяющихся последовательностей, то данные об их существовании в геноме этих архебактерий в литературе отсутствовали. Одной из задач работы было выяснение указанного вопроса на примере генома з. acldocaldarius . Для полноты картины было также изучено распространение в геноме архебактерий еще одного характерного структурного элемента эукариотического генома -коротких участков (длиной 15-50 п.о.) простых последовательностей типа поли[й(&-т)] -поли [d(C-A)], поли[а(С-А)] -пол., [¿КС-т>], поли [d(G-C)].m^H[d(c-G)] , по"и(йс>.поли(<зс) и поли^^.полиСйТ).^

Отсутствие повторяющихся последовательностей в геноме s. aci-doeaidariu3 . Для выявления повторявдихся последовательностей в геноме 5, acidocaldarivß ДНК организма метили Р и гибридизо-вали с клонами геномного банка S. acldocaldarius (его получали в плаэмиде pBßjjaa по KindlII - сайту). Условия гибридизации подбирали таким образом, что в случае, если последовательность клонированного фрагмента многократно повторяется в геноме, сигнал гибридизации меченной ДНК с соответствующим клоном должен был заметно превосходить по интенсивности сигнал с клонами, содержащими уникальные последовательности; при этом, соотношение интенсивности сигналов должно было соответствовать степени повторяемости последовательности.

ng

Меченную Р ДНК s.acldocaldarius гибридизовали с примерно

2000 рекомбинантными клонами из геномного банка s. acldocaldarius.

На фоне относительно однородных сигналов выделялся ряд сигналов

повышенной интенсивности. На основании вышесказанного можно было

предположить наличие в соответствующих клонах повторяющихся после-

Далее будем обозначать типы простых последовательностей» указывая по два повторяющихся нуклеотида из кавдой цепи; при таком обозначении различные типы простых последовательностей в приведенном порядке выглядят как GT/CA, GVCT, Gc/CG, GG/CC и

довательностей. Для большей уверенности в этом из семи таких клонов БЗ, 33, ¿4-, 35, 36 и "3 ) выделяли ДНК и гибридизовали в пятнах с меченной Р ДНК з. ос!<1осаЫ&г1из. В качестве контроля на нитроцеллюлозный фильтр наносили ДНК из клона 37 , дающего сигнал фоновой интенсивности. Результаты гибридизации представлены на рис.15. Полученные данные указывают на низкую степень

* О о

О о •

• о

450 )500 >чоо

НПО tena 350

п а 700

51 5Z ы

S4 SS S6

57 56

42

Рис. 15. Гибридизация меченной Р Л® s.acidocaldarius с ДНК клонов геномного банка s.eoidooaldari.ua . В точку наносили 2 мет ДНК клона. Указано количество радиоактивности (имп/мин) в соответствующих пятнах.

возможной повторяемости последовательностей в геноме (в пределах 2-10 копий). Она настолько низка, что наблюдаемая картина могла являться следствием неоднородности длин клонированных фрагментов, а не разной степени их повторяемости в геноме; условия опыта подразумевали, что чем длиннее клонированный фрагмент, тем больше радиоактивной метки должно было с ним связываться. Это предположение стало более вероятным после оценки длин клонированных фрагментов. В то время как длина вставок в клонах, предположительно содержащих уникальные'последовательности, была равна 3-5 т.п.о,,

в клонах, содержащих "повторяющиеся последовательности, их длина варьировала в пределах 9-17 т.п.о.

Чтобы окончательно выяснить правильность предположения был изучен клон В5 (длина вставки 17 т.п.о.), ДНК которого давала наиболее интенсивный сигнал гибридизации. ДНК з.ао1йооаЫаг1иа гидролиэовали рестриктаэой Н4лй1Л , фрагменты фракционировали электрофорезом, переносили на нитроцеллюлозный флльтр и гибриди-зовалк с меченной Р ДНК шелона Э5« Только один Н1п<Ш1-фраг- . ыент ДНК длиной 17 т.п.о. гибридизовался с ДНК клона в? , показывая тем самым, что последовательность вставки клона з$ в геноме не повторяется. Было также выяснено, что сама по себе эта зстав ка не содержит внутренние повторы»

Результаты об отсутствии умеренно-повторяющихся последовательностей в геноме з.ас 1<1осaldari.ua показывают невозможность экстраполяции вывода о наличии этих последовательностей в геноме экстремального галофила н.Иа1оЬ1ит на архебактериальный геном в целом.

Простые последовательности в геномах архебактерий. Наличие

простых последовательностей в геномах архебактерий исследовали

на примере представителей обеих ветвей царства - серозависимого

термофила 3. ас 1йосаЫаг1из и экстремального галофила н.Ьа1оЪ1-

ид и его фага 0И. ДНК этих организмов наносили на нитроцеллюлоз-1

оо '

ные фильтры и гибридизовали с меченными Р простыми последовательностями пята разных типов. В качестве контроля на фильтры наносили ДНК с.ае1ааоказ1»г и двух эубактерий - Б.ооН ш sta-рЬу1оеоссиа аигвив . Использованные условия гибридизации (Таийа , 1963) давали возможность регистрировать в ДНК относительно короткие блоки простых последовательностей, но не короче 2р п.о. На рис.16 представлены результаты гибридизации. Видно, что во всех

acute

GA/CT

GCKO

' * •

♦ • • • ♦ * • *

11.1 2 3

• ¡4 1 5. Ь

ОТ/CA

QP

Рис, 16, Гибридизация меченных Р простых последовательностей с пятнами ДНК из архебактерий, эубактерий и эукариот: I - фага 0Н; 2 - H.halobiua ; 3 - s.aci-docaldarius ; 4 _ E.coli | 5 - St,aureus ; 6 - D.melanogaster (в пятнах 1-5 по 2 мет ДНК, в пятне 6-5 мкг ДНЮ.

исследуемых архебактериальных и эукариотических образцах содержатся простые последовательности типа GG/oc, GA/CT и GT/GA . Последовательность типа АА/ГГ обнаруживается в ДНК D.aelanogaater и 3. acidocaidarlua , а последовательность типа GC/CG содержится только в зукариотической ДНК. Ни один из исследованных типов простых последовательностей, как и следовало ожидать судя по данным литературы, не был обнаружен в составе ДНК эубактерий.-

Простые последовательности архебактериального генома детально исследовали на примере ДНК s.acidocaidarius.

Процентное содержание простых последовательностей в геноме определяли по количеству клонов геномного банка s.acidocaidarius даших положительный сигнал при гибридизации с меченными поли-дезоксирибонуклеотидами. С GT/CA гибридизовалось^1,65% клонов, с г,А/ст - 1,20%, с GG/CG - 1,15%, а с АА/ТГ - 0,15%. Таким

образом, блоки простых последовательностей составляют заметную часть генома в. асЫосаЫах^ия и, по всей видимости, многократно повторяются в геноме.

Распределение простых последовательностей в геноме изучали гибридизуя меченные полидезоксирибонуклеотиды с разделенными электрофорезом и перенесенными на фильтр ВаяН! - фрагментами ДНК 3.ас1с1оса1йаг1и8 . Результаты гибридизации представлены на рис.17.

с*1а ЧР!«' еж* **т

Рис. 17. Гибридизация меченных Р простых последовательностей с ВатН! -фрагментами ДНК 8. ас idocal dari.ua.

Многие фрагменты ДНК, различающиеся по длинам, гибридизуются с последовательностями одного и того ке типа - са/ст, (Ю/сс или м'/са . Это может быть следствием того обстоятельства, что простые последовательности указанных типов разбросаны по всей длине ДНК. Последовательности типа АА/ГТ гибридизуются только с одним фрагментом ДНК длиной б т.п.о. и, вероятно, локализуются в одном участке молекулы ДЦК.

Первичную структуру фрагментов ДНК а.ао1доса1ааг1иэ , содер-

жшпих простые последовательности, исследовали на примере клона За219 , гибридизуотегося с ^-АА/ГТ. Вставку длиной 3,5 т.п.о. этого клона гидролиэовали рестриктазой йаа1 и полученные фрагменты субклонировали в плазмиде риС19 п0 Н1п(Ш-сайту. ДНК только одного из полученных субклонов (бриАЗ ) гибридизовалась

лл

с Р-АА/ГГ. Секвенирование этой ДНК проводили по модифицированному методу Сэнгера. На рис.18 представлена авторадиограмма части се^венирушего геля. Несовершенный АА/ТТ-элемен? имеет длину 18 п.о. - в положений 14 пара А-Т замешена на пару в-с.

А С С Т

Рис. 18. Радиоавтограмма части секвенируппего геля для ДНК клона SpUA3.

О транскрипции простых последовательностей в s.acidocalda-rius судили по результатам гибридизации ^%-полидезоксирибонук-леотидов с суммарной РНК 3. acidocaldarluj , фракционированной электрофорезом и перенесенной на нитроцеллюлозный фильтр. В составе РНК обнаруживались последовательности, комплементарные GG/CC , GT/CA , GA/CT и АА/ГГ,- которые можно рассматривать как транскрипты этих простых последовательностей генома. Длины FHK, содержание

транскрипты СГ/СА и (Ю/СС, находились в области 3-4 т.п.н.; более гетерогенными по длинам оказались РНК, содержащие транскрипты вА/ст и АА/ГТ.

Суммируя приведенные данные можно сделать вывод, что простые последовательности генома архебактерий проявляют те же основные характеристики, что и простые последовательности генома эукариот. В обоих случаях эти последовательности составляют заметную часть генома, рассеяны по неьфг, транскрибируются и обнаруживаются в РНК разных длин. Результаты указывают на отличие геномных характеристик архебактерий и эубактерий и свидетельствуют о сходстве структурной организации геномов архебактерий и эукариот.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы таксономические отношения мелузу архебакте-риями на основании данных о перекрестной гибридизации ДНК и 163 рибосомных РНК разных архебактерий. Предложен новый порядок царства архебактерий ТЬегаор1оЬеа1ва , объединяющий не классифицированные ранее три рода серовосстанавливаюиих анаэробных экстремальных термофилов*. ТЬегторгоЪеив, ХьегторЬИиа И Веви1£игососсив. Установлено, что царство архебактерий делится на две ветви: одну -объединяющую метанобразующие бактерии, экстремальные галофилы и термоацидофил ТЬагтор1авпа ас1<1орМ1ша и вторую - представленную серозависимыми экстремально термофильными бактериями порядков Би1£о1оЬа1ея и ТЬвгторго1еа1ве.

2. Выделены и очищены ДНК-зависимые РНК-полимераэы архебактерий порядка Т1гагторгс^еа1ев - ТЬегторгс^еиа Ьвпеис, Веви1^иго-соссие шисоеив и Сееи1Гигососсив тоЬШв; изучены физико-химические и каталитические свойства ферментов. Результаты исследования позволяют оценить степень эволюционного родства ферментов с

РНК-иолимеразами эубактерий и эукариот. Показано, что архебакте-риальные ферменты от РНН-полимераз эубактерий отличает: наличие в составе фермента 10 разных компонент, молекулярные массы этих компонент, находящиеся в пределах от 130 до 10 кДа, присутствие в мономере фермента по одной копии каждого из по крайней мере шести самых больших компонент, а также нечувствительность каталитической активности к рифампицину и стрептолидигицу. Выявлено, что по этим же свойствам ферменты архебактерий проявляют высокую степень гомологии с РШ-полимера'зами А и В эукариот» Установлено наличие в ДНК колифага Т7 регуляторных структур, влияющих на транскрипцию, катализируемую in vitro РНК полимеразой D.muco-aus. Показано, что деление царства .архебактерий на две ветви проявляется в свойствах РНК-полимераз: ферменты представителей порядков Thermoprotealea и sulfolobalea по характеру компонентного состава и по массе компонент образуют однородную группу, отличающуюся от ферментов метанобразуюшх и экстремально галофиль-ных архебактерий.

3. Выделены, очищены и изучены ДНК-зависимые ДНК-полимервзы А, В и С архебактерии sulfolobus acidocaidarius и ДНК-полимераэа В архебактерий тьегшор1азша acidophilus „ Показано, что ферменты типа А, В и С различаются по физико-химическим, иммунохттческт и каталитическим свойствам. Выявлена возможность существования близкого родства ферментов с известными классами ДНК-полимераз эубактерий и эукариот: ДНК-полкмеразы С, обнаруживаемой в мульти-полипептидном комплексе с молекулярной массой более 500 кДа и чувствительной к афидиколину и к-этилмалеимиду _ с ДНК-полимера-зой oi эукариот; ДНК-полимеразы В, состоящей из протомеров с молекулярной массой 40+5 кДа и лишенной ассоциированных нуклеазных активностей - с ДНК-полимераэой Is эукариот; ^ЦНК-полимеразы А,

состоящей из одного полипептида с молекулярной массой 105+10 кДа с ассоциированной 3'-5*-экзо}!уклеазной активностью - с ДНК-полимера зами I или II эубактерий. Установлено, что по способности использовать в качестве субстратов модифицированные по фуранозному кольцу dKTP , ДНК-полимераза А отличается от ДНК-полимеразы I Bsohe-richia coli и зукариотических ДНК-полимераз < и j3 .

4. Обнаружена, выделена и изучена рестриктирующая нуклеаза архебактерии s.aciûocaidarlua . Установлено, что фермент, обозначенный suai , является изошизомером эубактериальных рестриктаз типа BspHI ; он узнает тетрануклеотид G03C и расщепляет ДНК

в центре этой последовательности. Показано, что рестриктируюшая нуклеаза suai не гидролизует гомологичную ДНК, пероятно, вследствие наличия в ее составе модифицированных оснований.

5. Установлено, что температурный оптимум активности высоко-очитенных РНК-полимераз экстремальных термофилов т.tenax и D.nucoaua , ДНК-полимераз и рестриктируших нуклеаз ацидофильных экстремальных термофилов S. aeidoealdarlua .и T. acidopUilua находится в области оптимальных температур роста организмов (60-68°С)

и что ферменты высокостабильны при этих температурах. Показано, что ферменты ацидофильных видов не активны при оптимальных значениях рН роста организмов (рН 1,3-2,5) и проявляют максимум активности в интервале рН 7,5-8,5.

6. Исследованы особенности структурной организации генома архебактерии з.aoidocaldari.ua . С помощью гибридизационного анализа показано отсутствие в геноме умеренно- и высокоповторяюшихся последовательностей. В составе генома обнаружены короткие участки простых последовательностей типа поли [d( а-т)] .поли^ (С-А)], поли [d( G-A)] -поли [d(C-T)j, поли( dG ) *поли( dC ) и поли( dA )-поли( dî ), наличие которых является характерным признаком геномов эукариот.

Последовательности первых трех типов обнаружены и в составе генома экстремально галофильной архебантерии Halobacterlum haioblua. Показано, что простые последовательности составляют значительную часть генома s.aoidocaldariue , рассеяны по нему и транскрибируются. Установлена первичная структура фрагмента ДНК s.acido-caldarlus » содержащего блок поли(йА)•поли(dT) длиной 18 п.о.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих статьях:

1. Prangishvili D.A., Zillig Я., Gierl A., Biesert Ь., Hola Ii DNA-dependent ЯКА polyraerases of therraoacidophilic archeebac-teria. - European Journal of Biochemistry, 1982, v. 122, No; 3, p. 471-477.

2. Tu J., Prangishvili D.A., Huber H., Wildgruher 0., Zilllg VS., Stetter K.O., Taxonomic relatione between archaebacteria including б novel genera examined by стовв hybridization of PlfAs and 16S RHAs. - Journal of Kolecular Evolution, 1992, v, 18, p. 109-114.

3. Zillig W., Stetter K.O., Prangishvili U.A., Schafer W., Wunderl S., Janekovic D., Holz I., Palm P. Deeulfurococcaceae, the second fajnily of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-respiring Thermoprotealea. - Ins Archaebacteria /0.Kandier (ed.), GuBtav-Fischer-Verlag, Stuttgart - Hew York, 19Э2,

p. 304-317.

4. Прангишвили Д.А. Молекулярная биология архебактерий. - Молекулярная биология, 1983, т.17, № 2, с.234-248.

5. Чинчаладэе Д.З., Прангишвили Д.А., Качабава Л.А., Заалишвшги М.М. ДНК-зависимая ДНК-полимераза терчоацидофильной архебак-терии Thermoplasma acidophilun. - Сообщения АН ГССР, 1984, т. 113, !." I, с.161-164.

6. Prangiehvlli D.A., Vashakidze K.P., Chelidae M.G., ßabriadae I.Y, A raetrictio» endbimclease Suai from tha thermoacidophilio ar-ohaabacteriua Sulfolobus aoidocaldarius. - FEBS Letters, 1985,

v. 192, Ho. 1, p. 57-60.

7. Чинчаладзв Д.З., Прангишвили Д.А„, Качабава Л.А., Заалшвили М.Ы. ДО{-эависимая ДНК-полимераза термоацидофильной архебак-терии îliermoplaema acidophilus. - Молекулярная биология, 1985, т.19, № 6, с.I466-1476.

8. Прангишвили Д.А. , Чинчаладзе Д.З, Нуклеазные активности ДНК-зависимых ДЦК-полимераз термоацидофильных архебактерий. - Известия АН ГССР, серия биологическая, 1987, тЛЗ, № I, C.57-6Ï.

9. Прангишвили Д.А. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы термоацидофильной архебактерий Sulfolobus acidocaldariue. - Молекулярная биология, I98G, т.20, № 2, с.477-488.

10. Прангишвили Д.А., Важакидзе Р.П., Челидзе М.Г., Чинчаладзе Д.З., Далкаламанидзе H.ß. Выделение к свойства эндонуклеазы рестрикции Suaî из термоацидофильной архебактерии Sulfolobua acido- • caldarlUB. - Биохимия, 1987, т.52, № 6, с.1043-1050.

11. Чинчаладзе Д.З., Качабава Л.А., Прангишвили Д.А. Рестриктаза Thal из термоацидофичьной архео'астерии îhermoplasma acidophilus; : выделение, очистка, свойства. - Известия АН ГССР, серия биологическая, 1987, т.13, № 2, с.140-144.

12. Вашакидзе P.II., Прангишвили Д.А. Последовательности поли [(дГ-дТ) • (дД-дД)] , поли[(дГ-дА).(дЦ-дТ)] , поли [(дГМдЦ)] и поли [(дАЫдТ)]в геномах архебактерий. - Доклады АН СССР,

' 1987, т.293, Í? 5, с. 1243-1246.

13. фангишвили Д.А., Чинчаладзе Д.А,, Челидзе М.Г. Термостабиль-нссть ферментов матричного синтеза нуклеиновых кислот и эндо-нуклеаз рестрикции из экстремально термофильных архебактерий. -Биотехнология, 19S7. т.Я № 4, с.440-446.

14. Вашакидзе Р.П., Прангишвили Д.А., Чхеидзе А.К., Чинчаладзе Д.З. Структурная организация геномов архебактерий. I. Простые последовательности в геномах архебактерий. - Молекулярная биология, 1987, т.21, » 3, с.696-703.

15. Вашакидзе Р.П., Чинчаладзе Д.З., Прангишвили Д.А. Структурная организация геномов архебактерий. II. Отсутствие повторявшихся последовательностей в геноме серозввисимой термофильной архе-бактерии Sulfolobue aeldocaldaxiue.- Молекулярная биология, 1987, т.21, » 4, с.1056-1059.

16. Vaehakldee R.P., Prarigiehvili D.A. Siopl« repetitiTe uequencee la the genomes of arehnebacteria. - ?KBS Letters, 1987» r. 216» Ho; 2, p. 217-220.

17. VaehaJtidze H.?.p Chinehaladse S.Z., Prsagiehrill S.A. The genome of the ihermoaoidophilie arcbaebaeterlua Sulfolobue acldocaldarius does not contain repetitive sequences'. - Molecular Biology Reports, 1987, T. 12, p<, 123-126.

18. Прангишвили Д.А. Молекулярные аспекты организации архебактерий. - В кн.: Успехи микробиологии. М.: Наука, 1988, вып.22, с.34-70.

J3 . JI к Оил !«Ul ёсх

(оазоо йвюЗ^б^дЬ до зйг>6г,г>Э,чосо

О^Ь^ЛобосяЛсхо войЗтзотабо Бд^г;аоБЫ> ддозойлЬ &оиЬобид'ЬоЬ до^об&о^0»

АайдЬбйоЗцоЛо&очп бадчо^о&о' <?•> аобябль

пА&обпЪодпа

(Ло^эч обЛо)

Бесплатно Тиран 100;

Заказ *2ЧЗЭ

УЭ 02455;

Издательство "Мащшареба", Тбилиси, 380060, ул„Кутузова, 19. Типография АН ГССР, Тбыкси, 380060, ул„ Кутузова, 19.