Комплексные технологии фракционирования клеточных экстрактов и получение на их основе ферментов обмена нуклеиновых кислот, полинуклеотидов и их предшественников

Хомов, Виктор Васильевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Комплексные технологии фракционирования клеточных экстрактов и получение на их основе ферментов обмена нуклеиновых кислот, полинуклеотидов и их предшественников
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Комплексные технологии фракционирования клеточных экстрактов и получение на их основе ферментов обмена нуклеиновых кислот, полинуклеотидов и их предшественников"

<\П На правах рукописи

ХОМОВ ВИКТОР ВАСИЛЬЕВИЧ

КОМПЛЕКСЖ1Е ТЕХНОЛОГИИ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ 1ЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ И ПОЛУЧЕНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ФЕРМЕНТОВ ОБМЕНА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ И ИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Бердск 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском конструк-торско-технологическом институте биологически активных веществ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Научный консультант: доктор биологических наук,профессор Загребельный С. Н.

академик РАН, профессор Кнорре Д. Г.

доктор химических наук, профессор Малыгин Э. Г.

доктор биологических наук Дегтярев 0. X

Р<-дутая организация: Новосибирский институт биоорганической химии,СО РАН

Защита состоится "_" Хо^.Д_ 1997г. в часов

на заседании диссертационного совета Д 074. 20.01. в Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии "Вектор". 6331 59, Новосибирская область, п. Кольцово

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор"

Официальные оппоненты:

Аьтореферат диссертации разослан

1997г.

Ученый секретарь диссертационного Совета

Шубина Т. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Развертывание работ по химико-ферментативному синтезу генетического материала, исследований в области молекулярной биологии, генной диагностики и генной терапии Еыдвинуло задачу разработки опытно- промышленной технологии получения ферментов обмена нуклеиновых кислот и создание на их основе нуклеотидной базы.

Одним из перспективных направлений , позволяющих решить задачу создания экономичной промышленной технологии получения ферментных препаратов является:

- унифицирование процедур фракционирования бесклеточных экстрактов;

- разработка технологий, нацеленных на комплексное использование микробиологического, животного сырья, позволяющих получать целый ряд ферментных препаратов из одного образца биомассы в рамках единой технологической схемы.

Для опытно-промышленного производства нуклеотидов,нуклео-тидполифосфатов и полинуклеотидов наиболее целесообразно использование иммобилизованных ферментов. В связи с этим была поставлена задача разработки технологии получения данных соединений, основанной на применении биореакторов проточного типа с иммобилизованными ферментами.

В последнее время повысился интерес к экстрактам эмбриональных тканей высших животных как к перспективному источнику получения препаратов, используемых для лечения иммунных расстройств, онкозаболеваний,заболеваний крови и т.д. Фракционирование эмбриональных экстрактов с целью выделения из них препаратов широкого спектра действия, определения их молекулярной природы и выяснения механизма действия приобретает актуальное ан^ение.

Цель работы. Основная цель исследований - разработка препаративно-технологической базы получения компонентов системы нуклеинового обмена:

а.Ферментная база

- исследование поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании бесклеточных экстрактов Е.соП.ВасШиз зЬеагоЬЬегторНШиз.а также поведение РНК-азы при фракционировании бесклеточного экстракта поджелудочной железы. На основе этих исследований предстояло выбрать наиболее рациональные методы фракционирования упомянутых ферментов и

разработать перспективную для масштабирования комплексную технологию их очистки.

б.Компоненты нуклеиновых кислот и полинуклеотиды

- разработка опытно-промышленной технологии производства ри-бонуклеозиддифосфатов, дезокси- и рибонуклеозидмонофосфатов.а также полйрйбонуклеотидов"с~исполь зованием-проточных-биореакторов — с иммобилизованными ферментами.

Кроме того,целью работы было исследование биологических свойств эмбриональных экстрактов тканей птиц семейства Galleñada, определение действующего начала эмбриональных экстрактов.об-ладающих высокой биологической активностью и разработка технологии получения препарата иммуностимулирующего действия.

Научная новизна и практическая ценность работы.

- разработана и внедрена в опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" комплексная технология одновременного получения ряда ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников (ДНК-полимераза I, фрагмент Кленова, ДНК-зависимая РНК-поли-мераза полный фермент, ДНК-зависимая РНК-полимераза минимальный фермент., полинуклеотидфосфорилаза, суммарный препарат нуклеоти-дилкиназ с ацетокиназой, суммарный препарат:нуклеозиодизоксирибо-зилтрансфераз) при фракционировании клеточного экстракта Е. col i MRE-6Q0, а также термофильных ферментов (Вз^.полимераза .полинуклеотидфосфорилаза) при фракционировании клеточного ' экстракта Bac.stearothermophillus. Организовано серийное-производство указанных ферментов в объемах,обеспечивающих потрёбности более 300 научно-исследовательских организаций;

- разработана и внедрена в опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" технология получения- дезоксирибонуклеозид-5'- -трифосфатов с использованием суммарного препарата нуклеотидилки-наз с ацетокиназой,организовано их серийное-производство;

- разработана новая эффективная технология" получения' нуклеа-зиддифосфатов ферментативным фосфоролизом .природных РНК, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинук-леотидфосфорилазой из E.coli; ' ' '

- разработана технология ферментативного получения полирибо-нуклеотидов из рибонуклеозиддифосфатов, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазой из E.coli. Новые технологии применены для производства противовирусного лекарственного препарата "Полудан".Организовано систематическое производство опытных образцов препарата "Полудан" для проведения клинических испытаний;

-• разработана.новая высокоэффективная технология получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-5'-монофосфатов ферментативным гидролизом природных нуклеиновых кислот, основанная на использовании проточного реактора с иммобилизованной S'-нуклеазой из Aspergillus orizae.

Получаемые по разработанной технологии препараты ферментов и нуклеозидполифосфатов используются в качестве компонентов наборов реагентов для ник-трансляции,мульти-праймер-трансляции и секвени-рования. Наборы серийно производятся в Опытном производстве НИКТИ БАВ ГНЦ "Вектор" и регулярно поставляются заказчикам.

' Разработана новая эффективная комплексная опытно-промышленная ■технология получения лекарственного препарата "РНК-аза аморфная" .основанная на использовании в качестве сырья отходы производства инсулина.

Впервые установлено, что эмбриональные экстракты птиц семейства Gallenacia обладают иммуностимулирующим действием. Показано, что иммуностимулирующее действие эмбриональных экстрактов тканей птиц определяется пулом поли-А-мРНК. На основе полученных данных разработана технология получения препарата "Фагостим",обладающего иммуностимулирующими,гепатопротекторными и адьювантными свойствами.

Апробация работы. Отдельные части работы доложены и обсуждены на Всесоюзных конференциях с международным участием "Методы получения и анализа биохимических препаратов"(Рига,1982),"Мембранные процессы в биотехнологии,медицине и пищевой промышленности" (Москва,1991),"Новые фармакологические средства в ветеринарии" (С. Петербург ,1995) ."Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства"(Степногорск,1995).По материалам работы получено 3 патента и 5 авторских свидетельства, опубликовано 15 статей в научных журналах.

Структура диссертации. Диссертация содержит 265 страниц машинописного текста и состоит из введения, литературного обзора, 5 глав собственных исследований , выводов и приложения. Список цитируемой литературы включает 274 источников. Работа иллюстрирована 68 рисунками и 33 таблицами.

Работа выполнена в соответствии с выполнением Отраслевой научно-технической программой "Ферментная бага", а также с планом научно-технических работ научно-иссдедсват^лт-ского конструкторе-

ко-технологического института биологически активных веществ (НИКТИ ВДВ) ГНЦ ВБ "Вектор" по темам "Совершенствование технологии получения рибонуклеазы аморфной"(регистрационный номер ВК-4588);,"Разработка препарата Полудан на основе отечественных компонентов" [регистрационный номер ВП-4,(1,4)3 и "Определение молекулярной природы БАВ из эмбриональных тканей птиц и изучение их иммунотропного действия" [регистрационный номер ВФ-33 (2.10)].

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I.Разработка комплексной технологии получения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников.

Как правило,методы выделения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников в качестве первого этапа очистки включают стадию удаления из клеточного экстракта нуклеиновых кислот, присутствие которых затрудняет проведение'процедур фракционирования белков. Используемые при выделении ферментов методы удаления нуклеиновых кислот автолизом,осаждением протаминсульфа-том,стрептомицином,использованием двухфазной системы ПЭГ-декс-тран,имеют ряд существенных недостатков. В частности, недостаточно полное осаждение нуклеиновых кислот,неспецифическая и, зависящая от множества факторов, сорбция белков на протаминовом и стрептомициновом осадках,плохая воспроизводимость процедур удаления нуклеиновых кислот,проблематичность масштабирования процедур удаления нуклеиновых кислот,аллергические свойства реагентов и др.

Наиболее эффективным методом удаления нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов является метод осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином. Полиэтиленимимн, поликатион с молекулярной массой 20 - 25 кДа, эффективно осаждает из клеточных экстрактов полианионы, включая кислые белки и нуклеиновые кислоты. Об эффективности осаждения нуклеиновых кислот можно судить по изменению спектрального отношения Д280/Д260," которое достигает значения 1,66 при концентрации полиэтиленимина в клеточном экстракте равной IX. Образующийся осадок хорошо удаляется низкоскоростным центрифугированием.

Основным достоинством данного метода является то,что вместе с нуклеиновыми кислотами из клеточного экстракта соосавдаются и ферменты,имеющие сродство к нуклеиновым кислотам. Это означает, что процедуру осаждения нуклеиновых кислот полиэтиленимином

можно использовать и как этап очистки ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников. В процессе фракционирования клеточного экстракта полиэтиленимином мы исследовали распределение ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников между полиэтилениминовым осадком и супернатантом в зависимости от концентрации полиэтиленимина в клеточном экстракте (рис.1). Видно, что нуклеотидилкиназы с ацетокиназой и нуклеозиддезоксирибо-зилтрансферазы,как ферменты, не имеющие сродства к нуклеиновым кислотам,не осаждаются полиэтиленимином и остаются в супернатан-те. РНК-полимераза и полинуклеотидфосфорилаза (ПНФ-аза) соосажда-ются при 0,4 - 0,57.,а ДНК-полимераза и фрагмент Кленова при более высоких концентрациях полиэтиленимина.

Таким образом,добавление к клеточному экстракту полиэтиленимина до концентрации 0,5% в клеточном экстракте с последующим фракционированием сульфатом аммония приводит к получению 3-х обогащенных фракций,содержащих следующие ферменты (рис.2):

- фракция I - фрагмент Кленова;

- фракция II - ДНК-полимеразу I,нуклеотидилкиназы с ацетокиназой и нуклеозиддезоксирибозилтрансферазы;

- фракция III - РНК-полимеразу и ПНФ-азу.

При фракционировании ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников полиэтиленимином достигается 10 - 20 -кратная очистка с выходом ферментов по стадии не менее 802.Для сравнения (А.Корнберг,1977),осаждение нуклеиновых кислот стрептоми-цинсульфатом с последующим автолизом при выделении ДНК-полимеразы I,приводит к потере более 60% целевого фермента,при этом достигается лишь 5-6-кратная его очистка..

Учитывая высокие требования к качеству ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот,использующихся в тонких генно-инженерных манипуляциях, финишные этапы фракционирования ферментов мы проводили предпочтительно на аффинных сорбентах. В частности,мы импользова-ли фосфоцеллюлозе Р11 (Whatman),а также ДНК-агарозу и голубой-дек-стран-агарозу собственого приготовления.На рис.3 приведена комплексная технологическая схема получения 5 ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот,а также суммарного ферментного препарата нук-леотидилкинаэ с ацетокиназой и суммарного ферментного препарата нуклеозиддезоксирибозилтрансфераз.

Ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот,получаемые по данной комплексной технологической схеме,имеют высокую удельную актив-

я о

Е4

я ф

С,

>е< л

Еч

о о к

В) ¡4

н «

0,3 0,2

0,1

• 60

! 40

!. 20

15 10

40 20

«- • —« -

НУКДЕОЗДЩ-КИНАЗЫ---

ФРАГМЕНТ КЛБНОВА

ДНК-ПОЛ. I

ЕНК-ПОЛИМЕРАЗА

ПНФ -аза

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 % полиэ тиленилшна

Рис Д. Фракционирование полизтяленямином

КЛЕТОЧНЬЙ ЭКСТРАКТ Е.соИ МКЕ-600

Фракционирование полиэтиленимином

СУПЕРНАТАНТ

(ДНК-полимераза I, фрагмент Кленова, нуклеотидилкиназы с ацетокиназой и нуклеозид-дезоксирибозилтрансферазы)

Фракционирование сульфатом аммония

СУПЕРНАТАНТ

(фрагмент Кленова)

Фракция I

ОСАДОК

(РНК-полимераза, ПНФ-аза)

Фракция III

ОСАДОК

(ДНК-полимераза I, нуклеотидилкиназы с ацетокиназой, нуклеозиддезокси-рибозилтрансферазы)

Фракция II

Рис.2 Схема начальных этапов фракционирования ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников

ность и чистоту. Показано,что стехиометрия ковалентного присоединения аффинных реагентов соответствует числу активных центров фрагмента Кленова и ДНК-полимеразы 1,что указывает на отсутствие в препаратах данных ферментов неактивных (денатурированных) молекул белка.

Показано,что суммарные препараты нуклеотидилкиназ с ацетоки-назой пригодны для получения полного набора как дезокси- , так и рибонуклеозид-5'-трифосфатов ферментативным фосфорилированием соответствующих дезокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов.

Суммарный препарат нуклеозиддезоксирибозилтрансфераз пригодны для осуществления трансрибозилирования нуклеозидов.

Выход ферментов по комплексной технологии в 2-10 раз превышает выход ферментов,выделенных по традиционным методикам (табл.1). Кроме того, реализация комплексной технологической схемы позволяет существенно снизить себестоимость получаемых ферментных препаратов за счет рационального использования сырья,сорбентов, технологического оборудования..

Принцип аффинности (использование аффинных реагентов,аффинных сорбентов), примененный в комплексной технологии очистки ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников, хорошо экстраполируется и на другие микробиологические объекты, в частности, на полученные генноинженерным способом суперпродуцент-ные штаммы С401 и штаммы термофильных бактерий.

При поиске продуцентов термофильных ферментов нами был выделен штамм,идентификация которого позволила отнести его к виду Вас. еаго1егторМ11иэ. Данный штамм оказался высокопродуктивным по 4-м ферментам: ДНК-полимеразе I,ПНФ-азе,щелочной фосфатазе и сайт-специфической зндонуклеазе (изошизомер ВсЬ I). На основе исследования поведения данных ферментов при фракционировании экстракта клеток Вас. БЬеаго^егторЬШиз полиэтиленимином и на различных сорбентах нами была разработана комплексная технология выделения всех 4-х ферментов (рис.4).

Ферменты охарактеризованы по физико-химическим свойствам.Вы-сокая удельная активность и чистота перечисленных ферментов позволяет использовать данные ферменты в различных областях молекулярной биологии и препаративной биохимии.

(ДНК-полимераза,Фр.Кленова, . ,, нуклеотидилкиназы с ацетокиназой,• нуклеозиддезоксирибозилтрансферазы) .

Фракционирование ^_сульфатом аммония

У'

СУПЕРНАТАНТ

(Фрагмент кленова)

СЕФАДЕКС й-100 ФООТОДЕЛЛШОЗА Р 11

ГОЛУБОЙ ДЕКСТРАН АГАРОЗА

ОСАДОК

(ДНК-пол.I нуклеотидилкиназы с ацетокиназой,дезоксирибо-нуклеозидтрансферазы)

сеф!декс 6-100

«ООЮЦЕЛЛЮЙОЗА Р 11

ДНК-АГАРОЗА

I *

8РАГМЕНТ КЛЕНОВА

ДНК КОЛИМЕРАЗА

ОСАДОК

(РНК-полимераза, ПНФ- аза)

Экстракция

ДНК-АГАРОЗА

биогель А-5М

фоогоцеллшоза Р. 11

«5

ДЕАЕ,СЕФАДЕКС . . А-50

РНК-ПОЛИМЕРАЗА полный, минимальный фермент

ПОЛИНУКЛЕОТИДФОСФОРИЛАЗА

Рис.з Комплексная технологическая схема получения

ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников

Таблица 1.

Очистка ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников [27,32,14,301

Наименование фермента Удельная активность, е.а./мг Выход, 7.

традиционная технология комплексная технология традиционная технология комплексная технология

ДНК-полимераза 8000 10000 22 47

Фрагмент •

Кленова 8000 10000 29 48

РНК-полимераза. 1500 4000 21 48

ПНФ-аза

Нуклеотидилки-

назы 0,35 3.7 28 65

Нуклеозиддезок-

сирибозилтранс-

феразы 0,08 1,9 2,5 50

При поиске продуцентов биологически активных веществ для молекулярной биологии нами был выделен штамм, идентификация которого позволила отнести его к виду Bacillus stearothermophilus.Данный штамм оказался продуктивным по четырем ферментам:ДНК-полимера-зе,щелочной фосфагазе.полинуклеотидфосфорилазе и сайт-специфической эндонуклеазе (изошизомер Bel 1).На основе исследования поведения данных ферментов при фракционировании экстракта клеток Bac.stearothenrophillus полиэтиленимином,сульфатом аммония и различных сорбентах была разработана -комплексная технология получения всех 4-х ферментов (рис.4).'

Выход ДНК-полймеразы (Bst-полимеразы) составил 500 ед акт на 1г клеточной массы,удельная активность фермента составляла 10 ООО ед.акт./мг белка.При SDS-электрофорезе в полиакриламидном геле Bst-полимераза ведет себя как белок с молекулярной массой около 100 кДа. Анализ с использованием гельфильтрации на сефакриле S-200 показал,что молекула Bst-полимеразы представляет собой одну полипептидную .цепь с молекулярной массой 94 кДа.Фермент проявляет максимальную активность в диапазоне температур 65-70°С.Нагревание ВБ^полимеразы при температуре 90°С в течение 5-10 мин не отражалась. на активности фермента.,что позволило использовать его для амплификации фрагментов ДНК в реакции полимеразного копирования.

В ходе экспериментов по оптимизации температурных и временных режимов процесса амплификации с использованием Bst-полимеразы были ойределены следующие оптимальные параметры:тепловая денатурация ДНК- 95°С,время инкубации - 0,5мин;отжиг ДНК с праймерами -"45°С,время инкубации - 1,5 мин;полимеразное копирование ДНК -70°С,время инкубации - 2 мин.В таких условиях Bst-полимераза выдерживает не менее 30 циклов амплификации,обеспечивая значительное повышение целевого фрагмента ДНК. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pUC 18 со вставкой размером 600 нуклеотидных пар в полилинкерной области.Условия экспериментов аналогичны описанным для полимеразы из Thennus aquaticus.3a 25 циклов амплификации удается заметно повысить доли целевого фрагмента в общей массе рестриктов.

Bst-полимераза была также использована в экспериментах по секвенированию фрагментов ДНК методом Сзнгера.В частности,радиоавтограф, полученный в экспериментах по секвенированию фрагмента ^ ДНК фага М13,структура которого известна .хорошо читается и соответствует известным данным.

грубый экстракт

фракционирование , лолимином,0,5Х '

супернатант

(ДНК-псдимераза.фосфатаза, эндонуклеаза Ейь-??!)

фракционирование полимином,0,8%

СУПЕРНАТАНТ

(фосфатаза)

ДЕАЕ-целлюлоза »

щелочная фосфатаза

ОСАДОК

(ДНК-полимераза, эндонуклеаза )

экстракция 1М ПаС1

Фосфоцеллюлоза Р 11

Элюат 0,ЗМ МаС1 ( эндонуклеаза)

ОСАДОК

( ПНФ-аза)

экстракция 1М ИаС1

ДЕАЕ-целлюлоза

ДЕАЕ-сефадекс

ПНФ-аза

Элюат 0,6М ЫаС1 (ДНК-полимераза)

Г А П

ЭНДОНУКЛЕАЗА ^ 771

ДНК-агароза

ДНК-полимераза

Рис, 4 Комплексная технологическая схема получения

термофильных ферментов из Вас^еагс^епторШиэ.

В частности,термофильная ДНК-полимераза (Bst-полимераза) была испытана в PCR-реакциях. В ходе экспериментов по оптимизации температурных и временных режимов процесса амплификации с использованием Bst-полимеразы были определены следующие оптимальные параметры: тепловая денатурация ДНК- 95°С,время инкубации 0,5мин; отжиг ДНК с лраймерами - 45°С,время инкубации - 1,5 мин; полимеразное копирование ДНК -70°С,время инкубации - 2 мин.В таких условиях Bst-полимераза выдерживает не менее 30 циклов амплификации, обеспечивая значительное повышение целевого фрагмента ДНК. В качестве матрицы использовали ДНК плазмиды pUC 18 со вставкой размером 600 нуклеотидных пар в лолилинкерной области. За 25 циклов амплификации удается заметно повысить долю целевого фрагмента в общей массе рестриктов.

Bst-полимераза была также использована в экспериментах по секвенированию фрагментов ДНК методом Сэнгера.В частности,радиоавтограф, полученный в экспериментах по секвенированию фрагмента ДНК фага М13,структура которого'известна .хорошо читается и соответствует известным данным.

Выход Bst-полимеразы составляет 500 ед.акт. на грамм биомассы (45%), с удельной активностью 10 ОООед.акт./мг.

Выход термофильной полинуклеотидфосфорилазы составил 240 ед.акт. на грамм клеточной массы (39%), с удельной активностью 86 ед.акг./мг. Фермент проявляет максимальную активность в интервале температур 70 - 80°С. Это позволяет надеяться на возможность получения полирибогуаниловой кислоты,известную как интерфероноген-ное средство "Полигуацил", гетерогенным катализом с иммобилизованной термофильной ПНФ-азой.

Выход эндонуклеазы рестрикции Bst 771 (изошизомер Bel I) составлял 14 ООО ед.акт. на грамм клеточной массы (33%).

Выход щелочной фосфатазы составлял 18 ООО ед.акт.на грамм клеточной массы (44%) и активностью около 4000 ед.акт./мл.

Штамм Bac.stearothermophilus и технология получения перечисленных ферментов защищены авторским свидетельством [266).организовано серийное производство термофильной ДНК-полимеразы (Bst-no-лимеразы).

Таким образом,поиск универсальных подходов к фракционированию ферментов с помошью простых подходов типа использования поли-этиленимина,сульфата аммония,этилового спирта и т.д..позволил уже на уровне экстрактов проводить эффективное разделение различных ферментов.Использование полизтиленимина оказалось важным и уни-

версальным в плане создания опытно-промышленной технологии очистки основных ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и, их пред1. шественников.. Универсальность метода заключается также и в том,что он предельно прост и удобен при работе с экстрактами кле-; ток любого объема. После первичного фракционирования и получения

отдельных целевых фракций ^существенно —упрощается —дальнейшая-_

очистка упомянутых ферментов. Наиболее перспективным на данный ; момент оказалось использование простых и доступных аффинных сорбентов, позволяющих получать гомогенные препаратов ферментов. Со временем возможно появление новых более эффективных сорбентов.од- . нако маловероятно,что предложенные методы первичного фракционирования данных ферментов потеряют значимость.в результате техничес-/. кого прогресса.

2.Разработка комплексной технологии получения лекарственного препарата рибонуклеаза аморфная из поджелудочной железы

Перспективным объектом в качестве источника ферментов животного происхождения является поджелудочная железа крупного рогатого скота. Из измельченной поджелудочной железы кислой экстракцией можно извлечь целый ряд ферментов гидролазного действия, таких как трипсин,химотрипсин.дезокси- и рибонуклеазу и др. Из поджелудочной железы крупного рогатого скота получают также инсулин -гормон, широко используемый в медицине как препарат,регулирующий обмен глюкозы в организме. • ■

Наиболее интересным ферментом поджелудочной железы является рибонуклеаза ( РНК-аза ). В настоящее.время препарат панкреатической РНК-азы,названной рибонуклеаза аморфная, -широко применяется при лечении вирусного клещевого'энцефалита,вирусного серозного менингита,синуситов,гингвитов, парадонтозов,вирусных отитов.везикулярных стоматитов. ' •

Потребность Минздрава Российской Федерации Г в '.препарате РНК-азы аморфной составляет 10-15 миллионов доз. В то же время годовой выпуск данного препарата в стране' составляет около 10% потребности (1,5 - 1,7 ) миллионов доз.- -Увеличение производства РНК-азы аморфной до необходимого объема затруднено .технологическими проблемами и отсутствием,необходимого количества поджелудочной железы. Кроме того, обращает на йебя внимание наличие ряда противопоказаний и осложнений,наблюдаемых-при внутримышечном введении больших доз коммерческого препарата 'рибонуклеазы аморфной, необходимых при лечении таких тяжелых вирусных заболеваний, как клещевой энцефалит .

Наличие противопоказаний и осложнений при применении РНК-азы объясняется,очевидно,низкой чистотой коммерческого препарата. Электрофоретический анализ коммерческого препарата РНК-азы показал наличие в нем до 80% примесных (балластных ) белков.

Учитывая наличие большого количества примесных белков в коммерческом препарате РНК-азы,а также недостаточную обеспеченность Минздрава в поджелудочной железе,возникла необходимость в усовершенствовании такой технологии.Цель усовершенствования технологии - повышение удельной активности и увеличение выхода фермента на единицу веса поджелудочной железы.

Наши исследования показали,что более простой и эффективной процедурой очистки РНК-азы на начальных этапах является фракционирование белков 'Экстракта поджелудочной железы этанолом.РНК-аза осаждается в достаточно узком интервале ( 45-75 %) концентраций этанола (рис.5).В этом диапазоне концентраций этанола вместе с РНК-азой соосаждается около 30% суммарного белка экстракта и в результате достигается 3-кратная очистка фермента.

Одним из технологических неудобств осаждения белков органическими растворителями,особенно в промышленных масштабах,является требование проведения процедуры фракционировали при низких температурах. При температуре выше 10°С становится заметным денатурирующее действие органического растворителя.Денатурация связана с изменением молекулярных гидрофобных взаимодействий,стабилизирующих структуру белка.Как правило,денатурация многих белков при проведении процедуры фракционирования при температурах выше 10°С носит необратимый характер.При диспергировании белкового осадка в буфере денатурированные в таких условиях белки перевести в растворимую форму,как правило,не удается.

Из литературы известно,что РНК-аза обладает поразительной термостабильностью.Известно также,что денатурированная РНК-аза способна спонтанно восстанавливать исходную 3-мерную структуру, специфичность и каталитическую активность после удаления денатурирующего агента.Мы исследовали влияние температурного фактора при фракционировании белков клеточного экстракта поджелудочной железы этанолом. Оказалось,что добавление к клеточному экс-

тракту этанола до концентрации 75%. при температуре 60-70°С приводит к полному ссаждению РНК-азы,при этом соосождается около 50% суммарного белка экстракта.

250

200

ra 150

P-i л

glOO

S 50

2,5

2.0

1.5

o ■o

1.0 S

0.5

25 50 75 со

Рис.5.Фракционирование РНК-азы этанолом I - активность РНК-азы в надосадочной жидкости,ед.акт./мл;

2 - концентрация белка в надосадочной жидкости,мг/мл.

Диспергирование полученного таким способом осадка в буфере приводит к полной экстракции РНК-азы с сохранением ее исходной активности и специфичности,в то время как соосажденные вместе с ней балластные белки необратимо денатурируют и могут быть отделены от РНК-азы простой процедурой центрифугирования.

Метод может быть применен в промышленных масштабах,так как при такой высокой концентрации этанола (75%) седиментация белков происходит достаточно быстро при 1 з (т.е.при стоянии смеси),что позволяет при больших объемах смеси декантировать большую часть надосадочной жидкости,а остальную часть центрифугировать на центрифугах, создающих ускорение всего в несколько тысяч Метод осаждения белков смешивающимися с водой растворителями достаточно широко используется при выделении белков в промышленных масштабах, в частности при выделении белков плазмы,получении инсулина.

Инсулин - пептидный гормон поджелудочной железы широко применяется в медицине как терапевтическое средство в случаях инсу-линзависимого диабета/Начальные стадии технологического процесса получения инсулина из поджелудочной железы крупного рогатого скота включают стадию диспергирования измельченной поджелудочной железы горячим (70°С) этанолом,в результате которого инсулин экстрагируется и переходит в спиртовую фазу.После фильтрации спиртовой суспензии фильтрат,содержащий инсулин подвергают дальнейшей очистке,а оставшийся после фильтрации осадок (спиртовый шрот) отбрасывают.

Учитывая собственные данные по фракционированию РНК-азы этанолом, представлялось интересным проанализировать отходы производства инсулина - спиртовый шрот на наличие в нем РНК-азы.Анализ спиртового шрота показал,что в спиртовом шроте тестирует-

ся свыше 90% исходной РНК-азы.Из спиртового шрота РНК-аза легко извлекается диспергированием шрота в слабокислом растворе серной кислоты.В связи с этим была поставлена задача разработки опытно-промышленной технологии получения РНК-азы,ориентированной на использование в качестве сырьевого источника данного фермента отходы производства инсулина - спиртовый шрот поджелудочной железы.

Наиболее перспективным методом дальнейшей очистки экстрагированной из спиртового шрота РНК-азы,учитывая объемы производства инсулина,является метод ультрафильтрации на установках,оснащенных колонками с полыми волокнами.

Учитывая молекулярную массу РНК-азы,которая составляет 13 кДа.мы разработали технологическую схему процесса очистки РНК-азы из отходов производства инсулина с использованием технологии ультрафильтрации на отечественных установках, укомплектованных колонками с полыми волокнами (рис.7).Технологическая схема очистки РНК-азы включает следующие основные стадии:

1. Экстракция РНК-азы из спиртового шрота 1мМ раствором сер-'. ной кислоты.

2. Ультрафильтрация РНК-азы на установке ВПА 15ПА с селективностью колонки 15 кДа.

3. Концентрирование и обессолевание РНК-азы на установке ВПА-5ПА с селективностью колонки 5кДа.

4. Очистка РНК-азы на активированном угле.

5. Получение лекарственной формы рибонуклеазы аморфной. "

Данные очистки РНК-азы по разработанной технологии приведены в табл. 2.1.

Таблица 2.1.

Очистка РНК-азы из спиртового шрота

1 I Стадии очистки 1 |Суммарный 1 |Суммарная 1 Удельная 1 1 1 Выход, |

| белок,мг |активность, активность, 1 % 1

|ед.акт. ед.акт./мг

|Экстракт |16640 |15860000 9530 | 100 , 1

I спиртового *

|шрота

¡Ультрафильтрат | 4100 |12188000 29700 1 76,8' . |

1 (15 кДа) 1 -75,9 |

|Концентрат I 4000 |12020000 ■ 30050 •

1 (5кДа)

¡Очистка на | 4000 ¡11182000 ■ 30000 " / 1 74,9 .' |

|активированном

¡угле | | ' 1 . 1 • р. - 1

Сравнительный анализ по основным показателям препарата рибо-• нуклеазы,полученной по новой технологии и рибонуклеазы,полученной по технологии завода медпрепаратов г.С.Петербурга представлены в табл.2.2.

Рис.6 Технологическая схема получения РНК-азы.

Таблица 2.2.

Сравнительные данные РНК-азы.полученной по базовой и новой технологии

Наименование показателя Рибонуклеаза

базовая технология новая технология

Суммарная активность во флаконе,ед.акт. не менее 20 ООО 2"ООО-- ООО не менее 20 000

Удельная активность ед.акт./мг белка 20 000

Содержание белка во флаконе,мг 10 1»

Выход РНК-азы, доз/кг железы 10 - 15 350 -360

* - 1мг РНК-азы + 9мг полиглюкина

Полученная по разработанной технологии РНК-аза по физико-химическим и фармакологическим свойствам соответствует требованиям ВФС на данный препарат.

Таким образом,разработанная новая технология получения препарата рибонуклеазы аморфной позволяет:

- использовать в качестве сырья отходы производства инсулина, тем самым, существенно снизить себестоимость препарата;

- заменить трудоемкие стадии фракционирования экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония,растворителями (ацетон, этанол) на высокоэффективную технологию ультрафильтрации на колонках с полыми волокнами;

- получать гомогенный по чистоте препарат РНК-азы с высокой удельной активностью (80 ОООед.акт./мг);

- существенно повысить выход препарата на кг поджелудочной железы и совместить процесс получения РНК с процессом получения инсулина в рамках комплексной технологической схемы.

Разработанный метод получения РНК-азы защищен патентом РФ .41],на технологический процесс оформлен лабораторный регламент ¡" этльтаты исследований доложены на Международной (г.Степногорск)

■ ¿V/-;; „'-практической конференции.

3.Методы и технология получения предшественников безмзтрич-ного биосинтеза нуклеиновых кислот

разработанная ферментативная база создала реальные возможности для разработки методов и технологий получения нуклеоти-дов.нуклеотидполифосфатов и их комплексов - препаратов,представляющих большой интерес для молекулярной биологии.

Интерес к рибонуклеозиддифосфатам.в частности, определяется возможностью получать из них полирибонуклеотиды и полирибонуклео-тидные комплексы с помощью ПНФ-азы.Полирибонуклеотидные комплексы обладают интерфероногенной активностью и,в связи с этим,используются в качестве лекарственных средств.В частности препарат "Полу-дан", представляющий собой двуспиральный комплекс поли-А*по-ли-У,широко применяется в терапии вирусных конъюктивитов и кератитов. Данный препарат получают на покровском химфармзаводе из субстанции,закупаемой зарубежом,поскольку в нашей стране до сих пор не налажено производство рибонуклеозиддифосфатов.

В 80-х годах в НИКГИ БАВ была разработана технология получения рибонуклеозиддифосфатов ферментативным дефосфорилированием соответствующих рибонуклеозидтрифосфатов.

Высокая стоимость получаемых рибонуклеозиддифосфатов из соответствующих рибонуклеозидтрифосфатов вызвала необходимость поиска других путей синтеза данных соединений.

Мы исследовали возможность получения рибонуклеозиддифосфатов фосфоролитическим расщеплением РНК с помощью бактериальной лоли-нуклеотидфосфорилазы выделенной из E.coli по схеме:

РНК + Ф1 -------п АДФ + п ГДФ + п УДФ +п ЦДФ

Основным преимуществом предлагаемого метода является возможность получения полного набора всех четырех рибонуклеозиддифосфатов в одну стадию.

Данный способ не нашел до сих пор практического применения, поскольку в ряде работ показано,что природные РНК (тРНК.рРНК) подвергаются фосфоролизу лишь частично - на 30-40%.Это связано, очевидно, с наличием в молекулах РНК спирализованных участков и фосфоролиз затрагивает возможно лишь неспирализованные участки таких молекул.

Исследования зависимости глубины фосфоролиза'поли-А.РНК из-дрожжей и РНК из E.coli от температуры показали,'что.максимальная глубина фосфоролиза перечисленных нуклеиновых кйслот достигается -в интервале температур 50-60°С,т.е. температуре,близкой - к ТПл- -данных нуклеиновых кислот. • ; ; ~ ~—г-—

В биотехнологических процессах,рассчитанных' 'на получение -значительных объемов продукции во многих случаях целесообразно' применение иммобилизованных ферментов.Эта целесообразность определяется многими факторами,в том числе и тем,:что зачастую при им- /■ мобилизации заметно повышается термостабильность иммобилизованного фермента. Надежда на это и определило цели иммобилизации" -ПНФ-азы. • "

3.1.Иммобилизация полинуклеотидфосфорилазы : • В' нашей работе в качестве матрицы для иммобилизации ,'полинук- . леотидфосфорилазы предложен предварительно активированный т-лута-; • ровым альдегидом аминопропилсилохром.Большая удельная поверхность этих матриц позволяет надеяться на получение препаратов иммобили- ■" зованных ферментов с высоким, содержанием белка.Емкость ' активиро-^ ванного таким способом аминопропилсилохррма . составляла в.наших опытах 150 - 200 мкг-экв/г. ■'■-.''

Размеры пор силохромов значительно , больше' размера -(700 т-; 1000 ангстрем) известных .органических матриц .таких, как Сефароза 2В, биогель Р 300. СИлохромы, кроме ,того, имеют.во много раз превосходящий (в сравнениии с сефарозой или биогелем) модуль упру-" ' гости,что особенно важно в случаях иммобилизации ферментов,ката-' лизирующих превращения высокомолекулярных- субстратов.

Иммобилизацию ПНФ-азы проводили.*следующим способом: 1400 мг" предварительно активированного глутаровЫм.-альдегидом аминопропил-силохрома С-3, заливали 0,1М боратным'буфером .и дегазировали по вакуумом.Активированный силохром загружали в колонку il,7x101см, '■ снабженную рубашкой и уравновешивали .0„1М обратным буфером.' Раствор ПНФ-азы (10мл) с концентрацией-.- белка 15 'мг/мл многократно пропускали через колонку со скоростью- 40-45 мл/час. • "./«,.\.

Связывание фермента с матрицей тестировали по уменьшению, специфической активности фермента в злюате?*' '..Количество белка,ко- ■- -валентно связавшегося с альдегидосилохромом,рассчитывали-по ба- ' ; лансу между исходным и десорбированным белком,определенным-по ме- ■ тоду Лоури. .',.'.'

Ковалентной связью с активированным силохромом в наших эксперимента^ связывалось 60,?мг белка на грамм силохрома.

Разработанным нами методом иммобилизации ПНФ-азы на широкопористых 'силоХромах удается получить -иммобилизованную высокоочи-щенную ПНФ-азу с сохранением 68% исходной активности и удельной .активностью 1400 ед.акт./г активированного силохрома,что в два раза выше,чем,например, при иммобилизации ПНФ-азы на целлюлозе активированной BrCN. • •

На рисунках 7,8 представлены зависимость скорости , реакции фосфоролиза поли-А и скорости полимеризации аденозин-5-дифосфата от температуры.КаК видно-из рисунков, в, обеих реакциях имеет место смещение оптимальной' температуры' в, область низких значений. Так, при 47°С скорость полимеризации АДФ иммобилизованной ПНФ-азой составляет 88% максимальной,в то время как скорость реакции полимеризации растворимой ПНФ-азой -• 60%.Скорость реакции фосфоролиза поли-А иммобилизованной ПНФ-азой при .47°G составляет 94%,а в случае растворимого фермента - 47% от'максимальной.

На рис.9 представлены сравнительные данные .Q термостабильности растворимой и иммобилизованной ПНФ-азы.Термостабильность ПНФ-азы исследовали,выдерживая , фермент в'течение 20мин при различных температурах в 0,1М трйс-НС1 .буфере,-рН 8,0.Как видно из рисунка,термостабильность 'иммобилизованной,' ПНФ-азы существенно выше,по-крайней мере, в интервале температур 37-77°С'.Так,при 57°С уже через 20мин активность' растворимого фермента снижается.на 50%,тогда как активность, иммобилизованного-остается' неизмен- . ной.Повышенная термостабильность иммобилизованной ПНФ-азы - весьма существенная положительная' характеристика фермента,позволяющая • надеяться на перспективность использования его в реакции фосфоролиза природных РНК при повышенных температурах,!

В наших экспериментах с иммобилизованной' ЩФ-азой мы использовали проточный реактор с вытеснением - . термостатированную колонку объема V с иммобилизованным- ферментом,' через.-которую со скйростью.и прокачивают.раствор субстрата.- V _■■■:'"-

■ 'Для сравнения кинетических параметров, бйореактора с кинетическими параметрами растворимого фермента были определены параметры Кт 'и Vjnax .в реакции фосфоролиза ' РНК - -наивной ' и'иммобилизованной ПНФ-азой. Представленные на рис.10. экспериментальные данные для биореактора в координатах Лайнуивера-Берка позволяют сделать ряд выводов:

27 37 47 37 67 77

температура, С0

Рис.7. Зависимость скорости реакции фосфоролиза поли-А от температуры для растворимой (I) и иммобилизованной (2) ПНФ-азы.

/7\у

V V •

« « I т_ь

37 47 ет 67 77

температура, С0

Рис.8. Зависимость скорости реакции полимеризации АДФ от температуры для растворимой (I) и иммобилизованной (2) ПНФ-азы.

100

а §

2 50

Я О

о м

ы о

Рис.9. Термостабильность растворимой (I) и иммобилизованной (2) ПНФ-азы.

Рис.10.График Лайнуивера-Берка для растворимой (1) и иммобилизованной (2) формы ПНФ-азы.

- кинетическое поведение иммобилизованной на альдегидосилох-роме ПНФ-азы подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен;

- величина Vmax не изменяется;

- незначительное увеличение Кщ свидетельствует о том,что стецифичнс^ь-шмобилизованной-4ШФ^^ьи4с^риродным_ЕНК_в__ реакции фосфоролиза практически не отличается от специфичности нативного фермента;

- иммобилизованная на активированном аминопропилсилохроме ПНФ-аза пригодна для использования в биореакторе проточного типа.

На кинетические параметры данного биореактора накладывают

некоторые ограничения эффект ингибирования продуктом реакции.Как видно из представленных на рис.11 данных,при низких значения объемной скорости протока (V/t) глубина фосфоролиза уменьшается. Наибольшая эффективность работы биореактора данного типа наблюдается при скорости протока реакционной смеси 2-3 объема реактора в час.

Биореактор проточного типа в наших экспериментах представлял собой термостатируемую колонку с иммобилизованным ферментом объемом 10 мл, через которую пропускали реакционную смесь, содержащую РНК, либо рибонуклеозиддифосфат.

Максимальная эффективность работы биореактора в режиме фосфоролиза достигалась при объемной скорости протока реакционной смеси ( V/t), равной двум объемам в час и концентрации РНК, равной 20 иг/л.

Максимальная эффективность работы биореактора в режиме полимеризации достигалась при объемной скорости протока реакционной смеси ( V/t), равной одному объему в час и концентрации рибонук-леозиддифосфата, равной 120 мг/л..

Продукты фосфоролиза разделяли ионобменной хроматографией на Dowex 1x2 в градиенте хлористого натрия.

Основные физико-химические показатели рибонукдеозиддифосфа-тов, полученных методом фосфоролиза РНК соответствовали показателям качества ' препаратов, получаемых традиционными способами (табл.3.1.)

Рибонуклеозиддифосфаты были испытаны в качестве субстратов для синтеза полирибонуклеотидов с использованием ПНФ-азы. Максимальная степень превращения рибонуклеозиддифосфатов в полирибо-нуклеотид иммобилизованной ПНФ-азой практически не отличалась от степени превращения рибонуклеозиддифосфссов в полимер растворимой. ПНФ-азы.

% фосфоролиза

100-

50-

Ч/Х

Рис. 11 Зависимость степени конзерсии субстрата от объемной скорости протока.

1 -

2 -3 -

концентрация субстрата 2 мг/мл концентрация субстрата 10 мг/мл концентрация субстрата 20 мг/мл

Таблица 3.1.

Характеристика рибонуклеозиддифосфатов,полученных фосфоролизом РНК с использованием иммобилизованной ПНФ-азы

Показатель ГДФ ЦДФ АДФ УДФ

Вн шний вид порошок порошок порошок порошок

Содержан,:.- нуклео-

тидного материала

% не менее 9,5 99,7 99,6 98,6

Весовая экстинкция, 13,7 13,2 15,4 10,0

о. е./мг

Соотношение оптиче-

ских плотностей,

рН 2.0

Д250/Д260 1,15 0,46 0,78 0.73

Д280/Д260 0,66 2,07 0,16 0,39

Хроматографическая

однородность,% не 98 97 96 98

менее

Разработка биореактора с иммобилизованной ПНФ-азой,работающего как в режиме фосфоролиза РНК, так и полимеризации рибонукле-озиддифосфатов позволила построить технологическую схему получения препарата "Полудан" из отечественных компонентов (рис.12).

- фосфоролиз природных РНК с использованием проточного биореактора с иммобилизованной ПНФ-азой;

- разделение продуктов реакции фосфоролиза хроматографией на Дауксе 1x2;

- синтез поли-А и поли-У с использованием проточного биореактора с иммобилизованной ПНФ-азой;

- получение двуспирального комплекса поли-А*поли-У (субстанция) ;

- получение лекарственной формы препарата "Полудан".

Структура полученных комплексов, а также их противовирусная и ин-терферониндуцирующая активности сопоставима с таковыми, полученными по технологии Покровского химфармзавода.Препарат "Полудан", полученный по новой технологии соответствует всем требованиям ВФС 42-133183.

4.Методы и технология получения дезокси- и рибснуклеозидмоно-

фосфатов

В связи с интенсивным развитием генной инженерии, генной диагностики и терапии, в настоящее время остро возникает проблема создания нуклеотидной и нуклеозидной базы для обеспечения работ в данных областях.

Одним из способов получения дезокси- и рибонуклеотидов является ферментный гидролиз нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) с использованием панкреатической ДНК-азы и фосфодиэстеразы змеиного яда с последующим разделением продуктов гидролиза ионообменной хроматографией. Данный способ положен в основу промышленного производства дезокси - и рибонуклеотидов на Омутнинском химическом заводе. Использование в ферментативном гидролизе нуклеиновых кислот таких дорогостоящих препаратов как фссфодиэстераза змеиного яда и панкреатическая ДНК - аза существенно сказывается на стоимости получаемых нуклеотидов.

Одним из путей снижения себестоимости дезоксирибонуклеозид-монофосфатов является поиск более доступных и дешевых ферментных препаратов, например микробных, способных осуществлять гидролиз нуклеиновых кислот до нуклеозид-5"-монофосфагов.

Рис.12. Технологическая схема получения препарата Полуда!

Мы остановились на З^нуклеазе из Asp.oryzae.Фермент выделяется из амилоризина ( аналог такаамилазы).представляющего собой богатый источник различных нуклеаз, в том числе и 21-нуклеа-зы.Амилоризин.как продукт микробиологической промышленности, достаточно дешев и доступен.Нами разработана эффективная технология очистки Б1-нуклеазы из амилоризина П 10х ОСТ 59-7-72 производства Рассказовского биохимического завода.

Учитывая свойство 51-нуклеазы гидролизовать одноцепочечные нуклеиновые кислоты,доступность амилоризина,мы исследовали возможность применения 31-нуклеазы для препаративного получения де-зокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов.

4.1.Оптимизация условий гидролиза нуклеиновых кислот водо-раапворимой S'-нуклеазой.

Экспериментально установлено, что гидролиз природных РНК оптимально протекает при 50° С с эффективностью не менее 95Z в широком интервале концентраций РНК до 20мг/мл. Очевидно, при данной температуре происходит деспирализация молекул природных РНК, содержащих короткие, не вполне совершенные спирализованные участки, в составе которых находится от 40 до 70% всех нуклеотидов.

Гидролиз предварительно денатурированных нагреванием молекул ДНК оптимально протекает при 50°С с эффективностью не менее 957. в широком интервале концентраций до 2,5 мг/мл.

В технологических процессах, расчитанных на получение значительных объемов продукции, экономически целесообразно использование иммобилизованных форм ферментов.В связи с этим была исследована возможность иммобилизации Si-нуклеазы с целью последующей разработки технологии гидролиза нуклеиновых кислот на ее основе.

4.2. Иммобилизация 51-нуклеазы.

Для иммобилизации Si-нуклеазы использовали предварительно активированный глутаровым альдегидом аминопропилсилохром (АПС), уравновешенный калий-фосфатным буфером. Иммобилизацию проводили следующим образом: 1400 мг активированного амгогопропилсилохрома упаковывали в колонку [1,7 х 10]см, уравновешивали боратным буфером и пропускали через нее' раствор S* -нуклеазы с удельной активностью 65 ООО ед. а^т./мг и концентрации белка 12 мг/мл.Ковалент-ной связью в наших экспериментах связывалась 37,8 мг белка на грамм активированного аминопропилсилохрома. Несвязавшийся белок отмывали 1 М NaCL до отсутствия в злюате оптической плотности.

Стабилизацию ковалентной связи проводили раствором бор-

гидрида натрия.

Разработанным методом иммобилизации Б1-нуклеазы на активированном аминопропилсилохроме удается получить иммобилизованный фермент с сохранением 43% исходной активности.

Эксперименты по иммобилизации 51-нуклеазы на аминопропилси-"710хрометтозволили^сщгчитЕ~водшераствс1ришет1роизводные—фермента, эффективно гидрслизующие природные нуклеиновые кислоты в широком интервале концентраций.Основными достоинствами таких производных является то, что носитель имеет большую механическую прочность и большой диаметр пор (700 - 1000 А).Последний показатель имеет важное значение,поскольку носитель должен обеспечивать возможность проникновения высокополимерного субстрата, в нашем случае нуклеиновых кислот,внутрь гранул. Полученные производные достаточно стабильны, хранение их в течение года в 20 мМ ИаАс буфере, рН-4,6, содержащем 1мМ 2п504 и 500 мМ N301 не приводит к заметной десорбции белка с носителя и уменьшению активности. Дополнительным достоинством иммобилизованной формы фермента является повышение его термостабильности. Как следует из данных по гидролизу РНК нативной и иммобилизованной форм фермента, приведенных на рис.13, наблюдается смещение оптимальной температуры реакции в область высоких значений с одновременным уширением температурного интервала реакции,

4.3. Исследование кинетических свойств иммобилизованной Б1-нуклеазы в реакциях гидролиза нуклеиновых кислот.

Наиболее технологичным методом получения дезокси- и ри-бо-нуклеозид-5'-монофосфатов представляется схема гидролиза природных нуклеиновых кислот иммобилизованной Эа-нуклеазой с использованием биореактора проточного типа с вытеснением.

В наших экспериментах с иммобилизованной Б1-нуклеазой мы использовали проточный биореактор с вытеснением:термостатированную колонку объема V с иммобилизованным ферментом,через которую со скоросуью I) прокачивают раствор субстрата (ДНК или РНК).

Для сравнения кинетических параметров биореактора проточного типа с кинетическими параметрами растворимого фермента были определены Кщ и Ущах в реакции гидролиза ДНК и РНК растворимой и иммобилизованной формой 31-нуклеазы. Экспериментальные данные для биореактора в координатах Лайнуивера-Берка позволяют сделать ряд выводов:

- кинетическое поведение иммобилизованной Б^нуклеазы подчиняется уравнению Михаэлиса-Ментен;

Рис.13. Зависимость скорости реакции гидролиза ДНК от температуры для растворимой (I) и иммобилизованной (2) Б'-нуклеазы.

- величины Км реакции тидролиза ДНК и реакции гидролиза ■ РНК изменились не . существенно по сравнению с растворимой формой фермента; • ■

- величины Vmax не .изменяются при иммобилизации;- . ' -

- иммобилизованный препарат З'Цнуклеазы пригоден для использования его в биореакторе. ■' .' " -'...'_■■'

4.4. Получение дезокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов с -использованием проточного биореактора с иммобилизованной > S^kyK- • леазой. , . .

Биореактор проточного-типа в наших экспериментах представлял, собой термостатированную колонку с иммобилизованной Б^нуклеазой объемом 10 см3, ..через .которую пропускали реакционную смесь,содер-' жащую РНК или предварительно денатурированную нагреванием'ДНК. - В ходе экспериментов по оптимизации работы биореактора'с'иммиобйли-зованной Б^нуклеазой мы исследовали Влияние концентрации;ДНК и-РНК,' а также объемной скорости протока реакционной cMecH(V/t) на■• •. глубину реакции гидролиза. ■ ', ' •

Максимальная эффективность -биореакт'ора -в. -режиме гидролиза ДНК достигалась при концентрации ДНК'равной .2,5 мг/мл,объемной'; скорости протока реакционной -смеси. (V/t) равной .4 .объемам колонки в час, ( 40 мл/час) и температуре бО^С (рис: 14).. ."/ . •

. Максимальная'эффективность' работы биор.еактора в'.режиме.'^ид-' ролиза РНК достигалась при концентрации- РНК равной 2Смг/«л, - объемной- скорости протока реакционной смеси-(V/t) равной-4-.-. 6 •объ-'-емов колонки в час (40-60мл/час) и температуре'50°с' (рис.1'4).; '■„'• . ' . Продукты гидролиза разделяли. ". ионобиенноЁ .. хроматографией на отечественном,анионообменнике АВ17х2 в система'NaCl

- hcv- . - ■ . ' -'-'л ,/■' ".'>'■•' :- '

.Дезокси- и , рибону^слеозид-5'-монофосфаты -'были Испытаны 'в"- ка-, честве субстратов для биосинтеза Дезокси- и рибонуклеозвд-5'-три-•-'' фосфатов в системе нуклеогидилкиназ с ацетокиназой. Максимальная' степёнь 'и скорость фосфорилирования'бУли -сравшам со ; степенью-/й скоростью фосфоршшрования дезокси- и рибонуклеозид-5'-монрфосфа- ; тов,производимых ведущими зарубежными фирмами.'- .' ' '•^'■ . '

' В табл. 4.1 и 4.2 приведены показатели качества "дезокси- и • •рибонуклеозид-Б'-монофосфатов,полученных по разработанной технологии. По основным показателям препараты_не-отличаются от коммерческих препаратов ведущих зарубежных фиш.

100

^ ' • " \ 2

I \

1 '

\ , \ . Ч

4 6 8 10

объемная. скорость

Рис. 14." Зависимость стёпени конверсии ' " субстрата от объемной- скорости - ' протбка'реаедионной смеси"

1 - ДНК; -

2 - РНК

Таблица 4.1.

Характристика рибонуклеозид-б'-монофосфатов, получаемых из РНК гидролизом в биореакторе проточного типа.

Показатель ГМФ ЦМФ АМФ УМФ

Внешний вид порошок порошок порошок порошок

Содержание нуклео-

тидного материала

% не менее 99,5 99,7 99,6 98,6

Весовая экстинкция, 32,1 30 32,4 20,4

о.е./мг

Соотношение оптиче-

ских плотностей,

рН 2.0

Д250/Д260 0,97 0,42 0,85 0.77

Д280/Д260 0,68 2,02 0,19 0,33

Хроматографическая 98 97

однородностьД не 96 98

менее

Разработанная технология позволила значительно (в 4 раза) снизить себестоимость дезокси- и рибонуклеозидмонофосфатов в сравнении с традиционными технологиями.

Таблица 4.2.

Характристика дезоксирибонуклеозид-5'-монофосфатов, получаемых из РНК гидролизом в биореакторе проточного типа.

Показатель дГМФ ДЦМФ дАМФ дТМФ

Внешний вид порошок порошок порошок порошок

Содержание нуклео-тидного материала % не менее 99,5 ■ 99,7 99,6 98,6

Весовая экстинкция, о.е./мг 31,2 29,8 31,8 19,6

Соотношение оптических плотностей, рН 2.0 Д250/Д260 1,02 0,43 0,82 0.67

Д280/Д260 0,70 2,03. 0,22 0,76

Хроматографическая однородность,% не менее 98 97 96 98 '

5.Методы и технология получения препарата иммуностимулирующего действия из эмбриональных тканей птиц семейства Gallenacia.

Выше описаны подходы к совершенствованию технологии получения известных биологически активных веществ с известными свойствами - ферментов,нуклеотидов,нуклеозидполифосфатов, нуклеиновых кислот и их комплексов.

Для конструирования технологических процессов получения продуктов новых (с неизвестными свойствами) необходимы предварительные исследования с целью выяснения природы целевого продукта и его некоторых свойств. Такая необходимость возникла при постановке задачи определения действующего начала эмбриональных экстрактов, обладающих высокой биологической активностью.

Об интересе к экстрактам эмбриональных и плацентарных тканей высших животных-как перспективному источнику биологически активных веществ, свидетельствуют современные работы ряда авторов по использованию таких экстрактов в терапии широкого спектра различных заболеваний.

Удобным объектом для проведения таких исследований могут служить эмбриональные ткани кур Gallenacia domesticus и перепелов Coturnics coturnicus. Эмбрионы кур и перепелов являются классическим объектом эмбриогенеза,поэтому имеющиеся литературные данные позволяют надежно идентифицировать стадии развития эмбрионов по морфологическим признакам. Немаловажным фактором,кроме того, при разработке препаратов и технологии их получения является доступность такого эмбрионального материала.

5.1.Исследование свойств экстрактов эмбриональных тканей птиц семейства Gallenacia.

5.1.1.Получение эмбрионального экстракта и изучение его биохимического состава.

Известно,что выбор способа гомогенизации эмбриональных тканей оказывает значительное влияние на биологические свойства эмбрионального экстракта .

Нами были исследованы различные способы гомогенизации тканей: гомогенизация в механическом гомогенизаторе.гомогенизация в гомогенизаторе Поттера,замораживание и оттаивание с последующей гомогенизацией,растирание тканей в ступке с окисью алюминия и др. Наиболее эффективным методом по извлечению биологически ак-

тивных веществ и сохранении при этом их активности оказался комбинированный метод глубокого замораживания и оттаивания эмбрионов с последующей их гомогенизацией в гомогенизаторе Поттера. . г •

Изучение состава'экстракта из эмбрионов кур первой трети . эмбрионального срока развития показало,что экстракт представляет собой сложную смесь белков,нуклеиновых кислот,липополисахари-дов. Нуклеиновые кислоты представлены фрагментами ДНК и широким спектром РНК. Интересным моментом является повышение относительного содержания нуклеиновых, кислот в экстрактах эмбрионов с 5-суточным сроком развития. .Поскольку на данные стадии' приходится закладка внутренних-органов,организма,можно предположить,что такое повышение содержания' нуклеиновых кислЬт (примерно в 2 раза) в' данный период связано с началом органо- -и гистогенеза.

Злектрофоретический анализ эмбрионального экстракта показал, что экстракт содержит;белки с молекулярно-весовым распределением от 5 до 250' кДа. Спектрофотометрический анализ показал также наличие выраженного пика в видимой области спектра с максимумом поглощения при 410 нм,что свидетельствует о высоком содержании в экстракте гемо- и оксигемоглобйна. * '.

5Л.г.Изучение биологических свойств эмбрионального экспрак-' та птиц семейства Gallenacia., ,'

При постановке задачи экспериментальных исследований предва-. рительно были поставлены опыты по выяснению фазы р&звития.' эмбрионов, на которой наблюдается максимальная биологическая активность эмбриональных экстрактов. . ..'•■'.

В экспериментах на белых беспородные мышах была проведена первичная оценка иммуномодулируюШдх свойств эмбриональных экстрактов перепелов и кур различного срока развития.

Детальное изучение влияния эмбриональных экстрактов кур й переделов, на иммунную систему показало,что экстракты эмбрионов со сроком развития до четырех суток, включительно,не оказывают, сколько-нибудь заметного влияния на ,иммунную систему подопытных животных: ■ .

При использовании экстрактов эмбрионов со. сроком развития шесть .суток наблюдалось максимальное фагоцитозстимулирухщее действие в дозе 0,1 мг/кг массы животного и сохранялось в тбчение 72 часов ( рис.15).

Доза препарата, нг/кг

Рис.15 Влияние' зкртракта из эмбрионов кур 6-и суточного развития на фагоцитоз перитонеальных макрофагов мышей в различные сроки после введения. 1- через 3 часа; ■ 2- через 24 часа; 3- через 72 часа.

* - различия с контролем достоверны ,(Р<0,05)

Максимальное стимулирующее действие на антителогенез также наблюдалось при использовании эмбриональных экстрактов со сроком развития шесть суток и проявлялось в дозе 0,1 мкг/кг.

Активация антителогенеза при введении экстракта эмбрионов со сроком развития шесть суток сопровождалась усилением синтеза белка, о чем свидетельствует появление в протещограмме крови интенсивной полосы фракции бета-глобулинов.

Особый интерес представляют исследования влияния биологически активных веществ эмбрионального происхождения на иммунную систему при иммунодепрессиях и иммунодефицитах различной этиологии. Показано,что введение экстракта эмбрионов со сроком развития шесть суток способствует восстановлению иммунореактивности имму-нодепрессированных рентгеновским облучением подопытных животных.

Стимулирующее влияние экстракта на гуморальный ответ проявлялось также в условиях Т-клеточного иммунодефицита,вызванного предварительным введением гидрокортизона. . .

Таким образом,установлено,что эмбриональные экстракты птиц семейства Gallenacia обладают выраженным влиянием на иммунную систему животных.В частности наблюдалось:

- значительное повышение функциональной активности и фагоцитарного индекса перитонеальных макрофагов (на 300 и ZOOZ соответственно);

- существенное повышение уровня продукции антител в ответ на вводимый антиген;

- стимулирование гуморального и клеточного иммунитета.

Установлено,что наибольшая иммуномодулирующая активность

наблюдается при использовании экстрактов эмбрионов со сроком развития шесть суток,в связи с чем эксперименты по■фракционированию проводили на таких экстрактах.

5.2.Фракционирование эмбрионального экстракта и выяснение химической природы веществ ,определяющих иммуномодули-рукщее действие эмбриональных экстрактов.

Одной из основных задач данной работы была разработка методов фракционирования эмбрионального экстракта с целью выделения биологически активных веществ, определяющих иммуномодулируюшие свойства эмбрионального экстракта, конкретно фагоцитозстимулирую-щее действие.

Для приблизительной оценки области молекулярных весов имму-нологически активных молекул эмбрионального экстракта мы использовали сефарозу 4В,гель-фильтрация на которой позволяет фракционировать макромолекулы в диапазоне до 2 мДа включительно. На рисунке 16 представлена хроматограмма фракционирования эмбрионального экстракта на сефарозе СЬ-4В. Анализ биологических испытаний полученных фракций показал, что основная масса иммунологически активных молекул имеет молекулярную массу менее 100 кДа. В связи с этим,для фракционирования эмбрионального экстракта мы использовали такие сефадексы.у которых интервал фракционирования составляет 150 ООО - 400 ООО д.

Наиболее удачное,- на 'наш взгляд, фракционирование эмбрионального экстракта было получено при использовании сефадекса 6-75. В результате гель-фильтрации на данном,сефадексе получено три индивидуальных фракций с коэффициентом разрешения, близким к единице ( рис.17).

В результате изучения фагоцитозстимулирующей активности этих фракций установлено, что наиболее' высокий, процент прироста функциональной активности макрофагов (более'100%) тестируется во второй фракции. Фагоцитозстимулирующая активность в первой и третьей фракциях была низкой (процент прироста функциональной активности макрофагов составлял около 20%).

Хроматография иммуннологичеЬки активной фракции на гидрокси-лапатите показала, что в составе фракции содержится 80% РНК, 10% фрагментов ДНК и 10% белков. Молекулярно-весовое распределение белков этой фракции находится в области 15-45 кДа.

Для индетификации класса молекул, определяющих иммуннологи-ческую активность второй были проведены следующие эксперименты:

- получение тотальной белковой фракции добавлением ко второй фракции ДНК-азы и РНК-азы;

- получение тотальной фракции РНК добавлением ко второй фракции ДНК-азы и фенола;

- получение тотальной фракции ДНК добавлением ко второй фракции РНК-азы и фенола.

Биологический анализ полученных фракций показал, что феноль-ная депротеинизация фракции и/или обработка ее ДНК-азой не приводила к снижению иммуномодулирующей активности фракции. Обработка фракции панкреатической РНК-азой приводила к полной потере иммунологических свойств (табл.5.1).

Рис. 16 Хроматография цельного .эмбрионального экстракта кур 6-и суточного срока развития на Сефарозе' СЬ 4В. .-

- оптическая плотность • '

---* фагоцитозотимулирующая активность.(процент

прироста функциональной активностимакрофа-' г'ов)' . . ' ' ' ' ■

Рис.17. Хроматография цельного эмбрионального экстракта кур 6-и суточного срока развития на Сефадексе &-75.

- оптическая плотность

*—*—* фагоцитозстимулирующая активность (процент прироста функциональной активности макрофагов)

Таблица 5.1

Биологическая активность различных классов биологически активных веществ иммунологически активной фракции эмбрионального экстракта.

Группа веществ Доза препарата мг/кг веса Показатели фагоцитоза

фагоцитарная активность % к контролю

Тотальная фракция белков 0,01 0,10 контроль 6,7 ± 0,5 7,7 ± 1,8 6,9 ± 0,9 97 111

Тотальная фракция ДНК 0,01 0,10 контроль 35,2 ± 2,6 32,5 ± 4,0 30,5 ± 3,4 112 "108

. Тотальная фрак" ция РНК ' 0,01 0,10 контроль 35,6 ± 5,6* 32,8 ± 4,1* 12,4 ± 0,1 231 264

* - различия с контролем достоверны (Р<0,05)

Полученные результаты дают основание предположить, что имму-нотропную активность эмбриональных экстрактов определяют содержащиеся. в них рибонуклеиновые кислоты.

5.3. Разработка технологии получения препарата иммуностимулирующего действия.

Как было показано выше, фагоцитозстимулирующая"активность эмбриональных экстрактов определяется наличием в них нуклеиновых кислот. В связи с этим технология получения препарата фагоцитозс-тимулирующего действия может быть сведена к процедуре получения данного класса соединений. •'

В процессе поиска оптимального метода выделения рибонуклеиновых кислот мы попытались воздержаться от 'использования агрессивных и высокотоксичных, веществ. В связи с этим,мы исследовали возможность разделения нуклеиновых кислот - и белков этанольным' фракционированием. Оптимальную концентрацию спирта для полного осаждения РНК определяли ступенчатым повышением концентрации этанола в эмбриональном экстракте,анализируя содержание нуклеиновых кислот, и белка в спиртовом супернатанте. Результаты экспериментов приведены на рис.18. Из рисунка видно, что при увеличении концентрации .этанола в экстракте до 50% в осадок переходит значительное (около 80%) количество белка, в то время как основные количества нуклеиновых кислот остаются в растворе. При увеличении концентрации спирта, в экстракте до -75% в осадок переходят практи-

о я

§ 50

§,25

ы я

<и

% о

15 30 45 60

концентрация этанола,%

Рис.18. Фракционирование эмбрионального экстракта этанолом

1 - белок, мг/мл

2 - нуклеиновые кислоты, X

чески все нуклеиновые кислоты,о чем можно судить по увеличению значения спектрального отношения Д280/Дг60 в спиртовом суперна-танте с 0,58 до 1.66. В связи с этим, спиртовое фракционирование эмбрионального экстракта проводили ступенчато: вначале удаляли из экстракта основные количества белка добавлением к экстракту этанола до концентрации 50%.

После удаления денатурированных белков центрифугированием нуклеиновые кислоты осаждали добавлением к экстракту этанола до конечной концентрации его в экстракте 75%. Проведением такой дробной процедуры фракционирования экстракта тем не менее не удается полностью отделить фетальный гемоглобин,оксигемоглобин и другие низкомолекулярные белки.

Гемоглобин и оксигемоглобин отделяли хроматографией' на КМ-целлюлозе.КМ-целлюлоза,как катионообменник,не сорбирует нуклеиновые кислоты. Кроме того,КМ-целлюлоза сочетает в себе свойства и ионообменника и,в какой-то степени,аффинного сорбента,учитывая свойства гемоглобина связываться с высокой степенью сродства с карбокси-группами. Как показали эксперименты,способ удаления гемоглобина и оксигемоглобина хроматографией на КМ-целлюлозе оказался чрезвычайно эффективным,так как высокая аффинность гема к карбокси-группам приводила к необратимому связыванию его на сорбенте. Кроме того,данная хроматография позволила освободиться также от ряда положительно заряженных белков.

Финишную очистку иммунологически активного материала проводили хроматографией на поли-У-целлюлозе.Выделенная таким образом поли-А-РНК, проявляла фагоцитозстимулирующую активность в дозе 500 нг/кг.

5.4. Построение технологической схемы получения препарата иммуностимулирующего действия.

На основе полученных данных по фракционированию эмбриональный экстрактов нами была построена технология получения препарата, обладающего иммуномодулируюпщми свойствами и названного нами "Фагостим". В окончательном виде технология получения препарата "Фагостим" влючает следующиЕ" основные стадии: .

- получение эмбрионального экстракта;

- фракционирование эмбрионального экстракта этанолом;

- хроматография на КМ-целлюлозе;

- хроматография на поли-У-целлшозе.

В таблице 5.2 приведены данные по очистке препарата. Видно, что разработанная технологическая процедура позволяет достичь 200-кратной очистки целевого продукта.

Таблица 5.2

Результаты экспериментов по выделению иммунологически активной субстанции по разработанной технологии.

Этап очистки Объем фракции, мл Величина наименьшей дозы, при которой наблюдался фагоцитоз стимулиру ющий эффект, мг/кг Содержание белка, мг/мл Содержание иммунологически активного материала, % Степень очистки (отношение содержания белка в цельном экстракте к содержанию белка на стадии)

Цельный эмбриональный экстракт 100 0,1 7±1 100 1

Экстракт спиртового осадка 100 0,1 2,5±0,5 100 4

Хроматография на КМ-целлюлозе 80 0,01 0Л2±0,05 85 60

Хроматография на поли(У)-целлюлозе . 10 5*10~4 0,03 10 200

Таким образом,в результате проведенных исследований показано:

1.Экстракты эмбриональных тканей птиц семейства 6а11епас1а обладают иммуномодулирующими свойствами.

2.Иммуномодулируюшие свойства экстрактов эмбриональных тканей определяются содержащими в них рибонуклеиновыми кислотами.

3. Разработаца высокоэффективная технология получения рибонуклеиновых кислот из экстрактов эмбриональных тканей.

4. Высокай иммуномодулирующая активность рибонуклеиновых кислот ■ эмбрионального происхождения позволила создать' на их основе

препарат "Фагостйм", . который.прошел предварительные испытания на животных в качестве ветеринарного препарата широкого спектра действия.

Испытания препарата "Фагостим" проводились на собаках различных пород в Омском Государственном ветеринарном институте в качестве корректора иммунодефицитных состояний/ комплексной про-' филактики и лечения кишечных и респираторных болезней вирусной'' и . бактериальной этиологии.

Получен положительный отзыв при лечении "Фагостимом" парво-' вирусного энтерита и чумы плотоядных. Эффективность лечения пар-вовирусного энтерита составила от 94,3% до 100 %, 'Чумы плотоядных - в среднем 96%. При этом отмечалось усиление фагоцитарной активности лейкоцитов, улучшались гематологические показатели крови, общее физиологическое состояние и уменьшалось количество осложнений после перенесения того или иного заболевания у собак.

Получены хорошие результаты при использовании '"Фагостима" в комплексной терапии других.вирусных и бактериальных .заболеваний.

Показано,что введение препарата"Фагостим", в стандартную схему лечения острых инфекционных заболеваний,включающую антибиотикоте-рапию, снижает длительность лечения в среднем на. 50%, а возникновение рецидивов- на 90% . ■..'••

Показана эффективность использования препарата "Фагостим". при лечении животных, страдающих различными формами вторичных им-' мунодефицитов и иммунодепрессий. ... ■ .

Поскольку, известно, что препараты на основе нуклеиновых -кислот проявляют адъювантную активность, нами были проведены эксперименты по стимуляции выработки антител на вводимую вакцину. В процессе экспериментов тестировали уровень специфических' антител в сыворотке крови животных. ' Кроме того,об эффективности вак-■, цинации судили по количеству заболевших животных при наблюдении, в ■ течение года. Эффективность вакцинации на фоне введения "Фагостима" существенно превышает вакцинацию^о традиционной схеме , что ' характеризует его высокие адгювантные свойства.

В целом препарат '.'Фагостим" рекомендован .для широкого ис- . пользования в качестве лечебного средства, оказывающего на восстановление врожденных и приобретенных нарушений клеточного к гу-^ морального иммунитета, повышающий антибактериальную и противовирусную резистентность организма, а также в качестве адъюванта.'.

выводы

1. На основании различия в поведении ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании клеточных экстрактов E.coli MRE-600 и Bac-.stearothermophilus разработана препаративно-технологическая база получения основных компонентов системы нуклеинового обмена:

а.Ферментная база

- разработана и внедрена в - опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" комплексная технология одновременного получения ряда ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников ( ДНК-полимераза I, фрагмент Кленова, ДНК-зависимая РНК-полимераза полный фермент, ДНК-зависимая РНК-полимераза минимальный фермент, полинуклеотндфосфорила-за, суммарный препарат нуклеотидилкиназ с ацетокиназой, суммарный препарат нуклеозидезоксирибозилтрансфераз) из одного образца биомассы E.coli MRE-600.Организовано серийное производство указанных ферментов в объемах, обеспечивающих потребности институтов ГНЦ ВБ "Вектор" и . более 300 научно-исследовательских организаций;

- разработана и внедрена в Опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" комплексная технология получения высокоочи-щенных термофильных ферментов (Вэ1;-полимераза,полинуклео-тидфосфорилаза,щелочная фосфатаза,сайт-специфическая эндо-нуклеаза рестрикции Bst I) из одного образца биомассы Вас.stearothermophilus;

б.Компоненты нуклеиновых кислот и полинуклеотиды

- разработана и внедрена в Опытное производство НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" технология производства дезокси- и рибонук-леозид-5;-трифосфатов,основанная на использовании суммарного препарата нуклеотидилкиназ,получаемого по комплексной технологии. Организовано серийное производство нуклеотидов в объемах, обеспечивающих потребности более 300 научно-исследовательских организаций;

- разработана новая высокоэффективная комплексная технология . получения нуклеозиддифосфатов фосфоролизом природных РНК, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинуклеотидфосфорилазой;

- разработана технология ферментативного получения полири-бонуклеотидов из рибонуклеозиддифосфатов, основанная на применении проточного реактора с иммобилизованной полинуклео-тидфосфорилазой. НоЕые технологии применены для производства противовирусного лекарственного препарата "Полудан". Организовано систематическое производство опытных оОразцовдля проведения клинических испытаний . К настоящему времени наработано 50 тыс. доз (10 г) препарата,соответствующего по всем показателям требованиям ВФС 42-133183 ; - разработана новая высокоэффективная технология получения дезокси- и рибонуклеозид-5'-монофосфатов ферментативным гидролизом природных нуклеиновых кислот,основанная на использовании биореакторов проточного типа с иммобилизованной Б^-нуклеазой из Asp.oryzae.

Получаемые по разработанной технологии препараты ферментов и нуклеозидполифосфатов используются в качестве компонентов реагентов для ник-трансляции, мульти-праймер-трансляции и секвенирования нуклеиновых кислот. Наборы серийно производятся в Опытном производстве НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ "Вектор" и регулярно поставляются заказчикам.

2. На основании различия в поведении рибонуклеазы и инсулина при фракционировании клеточного экстракта поджелудочной железы разработана новая эффективная комплексная технология получения высокоочищенного противовирусного препарата "Рибо-нуклеаза аморфная",основанная на использовании в качестве сырья отходов производства инсулина. Технология защищена патентом РФ. Препарат по своим показателям соответствует требованиям ФС 42-2673-89. В экспериментах на животных препарат проявил высокую противовирусную активность.

3. Разработанные в процессе фракционирования ферментов технологические решения использованы для фракционирования эмбриональных экстрактов тканей птиц семейства Gallenacia,обладающих иммуномодулирующими свойствами (показано впервые). Установлено, что иммуномодулирующие свойства эмбриональных экстрактов определяются пулом поли-А-мРНК. На основании полученных данных разработана технология получения препарата "Фагостим".обладающего иммуностимулирующими,гепагтаротектор-

ными и адьювантнымы свойствами.

Список литературы опубликованный по теме диссертации

1. Токарев К.А., Хомов В.В. Совмещенная технология выделения ферментов нуклеинового обмена / Методы получения и анализа биохимических препаратов .-Рига .-1982 .- 4.1 .-С. 82

2. Хсмов В.В., Загребельный С.Н., Орешкона С.Ф. Поведение большого фрагмента ДНК-полимеразы 1 при фракционировании бесклеточного экстракта E.coll MRE-600 // Прикл. биохим. и микробиол. -1987.-Т.23,ВЫП.4.-С.530-535.

3. Хомов В.В., Загребельный С.Н., Токарев К.А. Распределение ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании экстракта E.coli МНЕ-600 // Прикл. биохим. и микробиол.-1987.-Т.23,вып.2.-С. 179-184.

4. Хсмов В.В. , Лаврик С.И. Модификация кленовского фрагмента ДНК-полимеразы 1 из E.coli по остаткам тирозина // Молекуляр. биология .-1988.-Т.22., вып.2.-С. 485-492.

с. Еолчкова В.А., Горн В.В. Хомов В.В. Фрагмент Кленова ДНК- по-лимераэы 1 из E.coli // Бкоорган.химия .-1989.-Т.15,N 1.-С.

73-59,

6. Потапова И.А., Хсмов В.В. и др. Езаимодействие dNTP-связывающих участков ДНК-полимеразы «-человека и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli нуклеотвдами, пирофосфатом и их аналогами // Молекуляр. биология .-1990.-Т.24.,вып.1 .-С. 104-116.

7. Невияский А., Хомов В.Е. и др. Влияние некомлементарных матрице оснований на эффективность взаимодействия праймеров с фрагментом Кленова ДНК-полимеразы 1 из E.coli '/ Молекуляр. биология .-1990.-Т.24.,вып.1 .-С. 96-103.

8. Петренко В.А., Хомов В.В. и др. Исследование механизмов мутагенеза, направленного фосфодиэфкрными аналогами олигонуклеоти-дов.Роль репарации в закреплении мутаций // Молекуляр. биология -1990.-Т.24.,вып.2 .-С. 460-466..

9. Халабуда О.В., Невинский Г.А., Хомов В.В. Зависимость 3'-5'-экзонуклеазной активности фрагмента Кленова ДНК-полиме-раэы I E.coli от длины и структуры расщепляемого олигонуклео-тида //Молекуляр.биология -1990.-Т.24.,вып.5 .-С.1219-1229.

10.Potapova I.A., Nevinsky Q.A., Khomov V.V. NaF and mononucleotides as inhibitors of 3'-5'exonuclease activity and stimula______toES-of- polymerase activity of E.coli DMA polymerase I Klenow

fragment // FEBS .-1990._V.277.-N.1.2 .-P.109-111

11.Potapova I.A., Nevinsky G.A., Khomov V.V. Interaction of dNTP, pyrophosphate and their analog's with the dNTP-binding sites of E.coli DNA polymerase I Klenow fragment and human DNA polymerase a /7 FEES .-193Q._V.277.-N.1,2 .-P.194-196

12.Mitina P..L., Mustaev E. F., Khomov V.V. Highly selective affinity labeling- of the primer-binding1 site of E.coli DNA polymerasel // FEBS .-1990._V.2?7.-N.1,2 .-P.181-183

13-Xomob B.B. Невинский Г.А,, Лаврик О.И. Аффинная модификация ДНК-полимеры I не E.coli' и ее фрагмента Кленовз имидазолидалш нуклеотидов // Молекуляр. биология -1991.-Т.25.,вып.2 .-С.358-367

14.Масычева В.И., Хомов В.В., Сигов A.A. Иммуностимулирующие свойства биологически' активных веществ эмбриональной ткани птиц семейства куриных // Доклады академ.нзук Рос.Федерации .-1995.-Т.344,Ml.-С. 140-142.'

15.Хомов В.В., Сизов A.A. ДНК-полимераза из термофильной бактерии Bac.stearothermophylas // Биотехнология .-1995.-М.12.-С.8-11.

16.Хомов В.В., Масычева В.И., Барановская Г.А. Влияние препарата на основе эмбриональной ткани кур на иммунную систему // Ветеринария .-1995.-N11.-С.46-47

17. Хомов В.В. , Пустошилова Н.Ы. Технологические основы получения ферментных препаратов // НЙКТИ БАВ Сб. науч.трудов сотрудников -Бердск.-1996.-С.111-116 ■

18. Хомов В.В., Сизов А.А.,Разворотнев В.А. Изучение иммунности-мулирующих свойств экстрактов эмбриональных тканей птиц ран-негосрока развития // НИКТИ БАВ Сб. науч. трудов сотрудников -Бердск.-1996.-С.104-110.

19. Хомов В.В., Сизов А.А..Репин В.Е. Термофильная ДНК-полимераза из Bac.stearothermophylus // НЙКТИ БАВ Сб. науч. трудов сотрудников -Бердск.-1996.-С.117-123. '

2Ü-. Хомов В.В., Сизов А.А. .Масычева В.И. Технология получения ри-бонуклеоэиддифосфатов с использованием биореактора проточного типа о неподвижной фазой //НИКТИ БАВ Сб. науч. трудов сотрудников -Бердск.-1996.-С.123-128,

21. Хомов В.В., Сизов A.A..Барановская Г.А. Иммуностимулирующие и адалтогенные свойства препарата "Фагост.им" //НИКТИ БАВ Сб. науч. трудов сотрудников -Бердск;-1996.-С. 185-189..'

22. Хомов В.В., Денисова Л.Я., Загребельный С.Н. Изучение влияния 8-экзотоксина Bac.thuringiensis // YIII Всесоюз. симп.- Компоненты нуклеиновых кислот Рига.-1989. -С.69

23. Хомов В.В..Синичкина С.А.., Михайлова В.К. Использование производных целлюлозы для очистки ферментов обмена нуклеиновых кислот // Всесоюз. конф. Проблема использования целлюлозы и

ее производных Москва.-1989.-С.55.

24. Меламед Н.В., Хомов В.В. Рекомбинантная РНК-полимераза фага Т7 // Геном человека -90 : 1-я Всесоюз.конф. -Москва.-1990 .-С.90.

25. Сизов A.A.. Хомов В.В., Репин В.Е. Bac.stearothermophylus -777-продуцент термофильных ферментов для молекулярной биологии // Геном человека -90 : 1-я Всесоюз.конф. -Москва.-1990 .-С.94.

26. Хомов В.В., Репин В.Е..Андреева И.С. Bac.stearothermophylus -777-продуцент термофильных ферментов для генной инженерии // Всесоз. науч.-практич. конф. Ферменты - народному хозяйству -Черновцы .- 1990 .- С. 145.

27. Хомов В.В., Андреева И.С., Репин В.Е. Выделение и изучение свойств термофильных ДНК-полимеразы. щелочной фосфатазы и рестриктазы из Bac.stearothermophylus-777 // Всесоюз. конф. Методы получения, анализа и применения ферментов - .-Юрмала .-1990.-С.26

28. Хомов В.В., Сизов A.A., Загребельный С.H. Применение утра-фильтрационных установок с трубчатыми мембранами для очистки белков на примере очистки препарата рибонуклеазы аморфной // Всесоюз. конф. Мембранные процессы'в биотехнологиии, медицине и- пищевой промышленности .-Москва.-1991.-С.60.

29. Хомов В.В., Масычева В.И., Сизов A.A. Исследование комплекса фермёнтов нуклеазного действия и технология получения противовирусных препаратов на их основе // Международ, конф. Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и

• с/х г -Степногорск ,-1995.-4.1.-С. 185. '

30. Хомов В.В., Масычева В.И., Сизо? A.A. Новая технология получения рибонуклезаы аморфной с применением волоконной технологии // Меддународ. конф. Перспективы развития производства

биопрепаратов для медицины и с/у. - -Степногорск .-1995!-4.1,-С.133.

31. Хомов В.Е., Масычева В.Й., Сиэов A.A. Новая технология получения рибо- и деэоксирибонуклеозидмонофосфатов на основе биореактора и иммобилизованным ферментом //Междунзрод,. конф. Перспективы развития производства биопрепаратов' для медицины и с/к -Степногорск .-1995.-4.1.-С. 60.

32. Хомов В.В.. Масычева В.И., Сизов A.A. ' Влияние биологически активных веществ эмбриональных тканей птиц на иммунную систему животных // Международ, кокф. Перспективы развития проиг-водства биопрепаратов для медицины и с/х -Степногорск .-1995.-4.1.-С. 25.

33. Хомов В.В., Масычеиа В.И., Сизов A.A. Экспериментальная терапия вирусных инфекций плотоядных с применением ферментных препаратов // 7 Межгосударств.межвуговск. научн.-практич. конф. Новые фармакологические средства в ветеринарии .— СПб.-1995.-С.84.

34. Хомов В.В., Масычева В.И., Сиэов A.A. Влияние биологически активных веществ эмбриональных' тканей птиц кз иммунную, систему животных // 7 Межгосударсгв. межвузовск. научн.-np&KTir-i. конф. Новые фармакологические средства в ветеринарии .--СПб.-1995.-С.47.

35. А.с.СССР М 498315 Опубл в Б.И. ,1976, N 1.

"Способ получения иммобилизованной полинукдеотидфосфорилазы" Кумарев В.П., Райт А.С.,Хомов В.Е.

36. A.c. СССР N 660976 ,Опубл в Б.И. ,1979, N 17.

"Способ получения пуриновых дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфа-тов" Загребельный С.Н., Коржов В.А.,Хомов В.В.

37. A.c. СССР N 691462 ..Опубл в Б.И. ,1979, N 38. "Способ получения рибонуклеозид-5'-трифосфатов" Загребелъный С.Н., Кор-жов В.А. Хомов В.В.

38. A.c. СССР N 1567627 МКИ С 12N15/00, С 07 Н £1/04 Опубл. 30.05.90 г."Способ получения двуспиралъных полидезоксирибо-нуклеотидных комплексов" Хомов В.В., Загребелъный С.Н.. Сизов A.A. и др.

39. A.C. СССР И 1724689 Опубл. В Б.И. 08.12.91г.

" Способ получения эндонукпеагы рестрикции узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотщов 5-TG-ATCA-3'" Хомов В.В., Андреева И.С., Репин В.Е.

40. Патент Рос.Федерации N1602055 от 17.03.93 г.

"Штамм Е.соП 3825-продуцент фрагмента Кленова и способ получения фрагмента Кленова" Кравченко В.В.. Петренко Л.А.,Хомое В.Е.

41. Решение о выдаче патента от 11.09.96 г.Заявка N 94025752'14 0325302)

"Способ получения рибонуклеагы панкреатической" ХомоВ'В.В., Загребельный С.Н.,Сизов A.A., Масычева В.В.

42. Решение о Еыдаче патента от 19.06.95 г.Заявка N 94-014602/13

" Рекомбинантная ДНК-фага МБ ро!Т7,содержащая ген РНК-полше-разы фага 17 и штамма MB pd Г7-продуцент РНК-полимерааы фага 17" Ильичев A.A., Меламед Н.В., Хсмов В.В.

43. Хомов в.В., Сизов A.A., Масычева Б.И. Получение рибонуклео-зад - 5 - дифосфатов фосфоролизом природных РНК с использованием проточного биореактора о иммобилизованной ПНФ-азой // Биотехнология.- 1997 Ji I.- С.15-19

(013937)

гнц ВБ "Вектор" а.13 т.70 1997г.

Информация о работе

Хомов, Виктор Васильевич
кандидата биологических наук
Бердск, 1997
ВАК 03.00.23

Автореферат

Комплексные технологии фракционирования клеточных экстрактов и получение на их основе ферментов обмена нуклеиновых кислот, полинуклеотидов и их предшественников - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы