Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании бесклеточного экстракта Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании бесклеточного экстракта Escherichia coli"

•4ИНИСГЕРСТВ0 МЕЦШЦИНСКОЛ И ЙЖРОШОДОГИЧЗСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ ПРИ СОВЕТЕ МИНИСТРОВ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЩО-ИССЛЕДОМТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

Хомов Виктор Васильевич

1ССШ0ВАНИЕ ПОВЕДЕНИИ ФЕРМЕНТОВ БИОСИНТЕЗА НУШИНОВЫХ ШСЯОТ И ИХ ПРОТЕСТВЕШЖОВ ПРИ ФРАКЦИОНИРОВАНИИ эЕСКПЕГОЧНОГО ЭКСТРАКТА Eacherichia coli

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискалио ученой степени кандидата биологических наух

Новосибирск 1990

Работа выполнена в Научпо-исследовател:,с:;о:.: копструкторско-технологическом институте биологически акупппж веществ

Научный руководитель - доктор биологических наук С .11, Загребельны

Официальные оппоненты: доктор химических наук Р)МСр1) В&ШЩНВшЯр^

кандидат химических наук Капгинов Владимир Андреевич

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СОАН СССР

Зшцита состоится " ШШЯ/>4№' 1990г. в "_"час. на

заседании специализированного совета К 098.03.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте молекулярной биологии, 633159, Новосибирская область, п. Кольцово.

С диссертацией мо:шо ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского гаститута молекулярной биологии.

Автореферат разослан " 1990г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

ОБШ ШШШЕШк PJVBQTU

Лктуп'п.ностъ темп. tfopuemu биосинтеза нуклеиновых кислот а их предшественников в наетол;:;ее время является незаменимым иистру -ментом для рсизехш.ч научно-исследовательских и прикладных работ в области мол окулярной биологии, генной шсхенерии и медицины.

U связи с этим большое значение имеют исследования и разработки истодов получеши этих ферментов в препаративных масштабах. Изучение поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фпп;;цпо!шровалии клеточного экстракта раз -личными метода:.«? мохет оказаться полезши для построения зффек -тпвпо:; технолопш получения ферментов данного тина. Цель работ». Основной целью работы бшю исследование поведения ферментов биосинтеза нуклеиновых' кислот ОШК-полимерази I, фрашен-та 1Слснова, РНК-полпмсразы, полш!узсчеотщ;фосфорилази), а тшеле (Гю]*.!Снтоп биосинтеза нпедаествек'ников нуклеиновых кислот (нуклео -тидилкина:), ацетокпиазн, нуклеоз;да;езокс;ти<5озилтрансфораз) при фпа!аинлг.1ропа;пш клеточного экстракта В. coil . На осново этих исслпдованлг предстояло выбрать наиболее рациональные методы а оп тимальине условия фракционирования упомянутых ферментов к разработать :>ф[(:к;>;г.нуо и перспектив;^: для : котаОированпн совмещенную техилт.н'ии их очисти: hj одно,'! и то;'*, г.е порции биомассы. Научная новизна и практическая цешпетв работы. Для препаративного получения дезокси- и рибонуклеозидтрифосфатов впервые показана возможность использования цельного либо частично счищенного кло -точного экстракта Е.соК с ацотокин^ноИ системой регенерации ATI». Препаративное применение комплексных ферментных : ро пара-о в .'Колется !юв:с.1 направленном в технологии их получения.

впервые ¡¡сказана возможность использования цельного ^ибо час -

тично очищенного экстракта E.coli. для получения рибонуклеозид -трифосфатов непосредственно из РНК.

Впервые показана возможность выделения в препаративных масш -табах гомогенных препаратов ферментов, биосинтеза нуклеиновые кислот (ДНК-полимеразы I, фрагмента Кленова, полного фермента РПК-по-лимеразы, минимального фермента РНК-полимеразы, полинуклеотидфос-форклазы),а также суммарного препарата нуклеотидилкиназ-с ацето -киназой,пригодного для синтеза полного набора как дезокси- так и рибонуклеозидтрифосфатов, и суммарного препарата нуклеозидцезок -сирибозилтраисфераз) из одного и того ко образца биомассы E.colc. в рамках•совмещенной технологической схемы.

На основе полученных данных разработаны технологические доку -менты, технологические разработки внедрены в Опытное производство научно-исследовательского конструкторско-технологического инсти -тута биологически активных веществ, часть из них внедрена на опытно-промышленном заводе ферментных препаратов НПО "Фермент" г.Вильнюс Литовской ССР, организовано серийное производство перечисленных ферментов.

Публикации и апробация результатов. Основное содержание дассер -тацик изложено в двух статьях, опубликованных в открытой печати и трех авторских свидетельствах. Результаты исследований были доложены на ежегодных научных конференциях научно-исследовательского копструкторско-технологического института 'биологически активных веществ (г. Новосибирск 1977,1970,1304,1906), на 4-ой Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов (г.Рига, 1982).

Структура диссертации. Диссертация содержит 114 страниц маши -полисного текста и состоит из введения ( 3 стр.), литературного обзора ( 39стр.), методической части ( 4 стр.), 3 глав с изложением полученных результатов ( 57 стр.), вывод ( I стр.).

-2-

Библиография включает в себя 123 литературных источника, из них 6 на русском языке. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 16 таблицами.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ÏDC ОБСЯЛШШ

I. Начальные этапы фракционирования ферментов блосинтоза нуклеиновых кислот и их предшественников

I.I. Фракционирование полиэтиленкмином

Kaie правило, описанные методы выделения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников включали в качестве первого этапа фракционирования клеточного экстракта стадию удаления нуклеиновых кислот. Удал с iuî о нуклеиновых кислот из клеточного экстракта проводят либо автолизом (Роуз, 1954), либо с применением для этих целей протамиисульфата (Д'ковин, 1969), стрептомнцинсуль-фата (Ричардсон, 1367, Корпберг, 1977), ИЭГ-догсстрана (Бабино, i960). Перечисленные методы удаления нуклеиновых кислот из клеточных экстрактов имеют ряд недостатков (Атклщсон, 1973). Наибчлео существенным недостатком процедур удаления нуклеиновых кислот является то, что они lie могут быть использованы для эффективного фракционирования изучаемых ферментов.

Перспективным методом фракционирования ферментов биосинтеза нузелоиношх кислот и их предшественников машет слукить метод удаления нуклеиновых кислот пз экстрактов с использованием полиэтнлен-имина (Лткинсон, 1973). Полиэтилошыии, как ноликатион, осаждает из клеточного экстракта полианионы, вклмчая нуклеиновый кислоти и, '¡то особенно ваяно, ферменты, имеющие к нш сродство. Адсорбция ферментов На полиэтиленимшювом осадке в значительной степени за -висит от содержания нуклеиновых кислот в экстракта, концентрации нолиэтиленимина и концентрации соли в экстракте.

В процессе фракционирования клеточ:;:-.;-.- экстракта полиэтилен -имином мы исследовали распределение .ЛШС-полкмеразы I, фрагмента Кленова, РНК-полимеразы, ППФ-азы, нуклеотидклкиназ с ацетокиназоП и нуклеозидцезоксирибозилтрансфераз между полиэтилеииминовим осадком и супернатантом в зависимости от концентрации полнэтиленимпна в клеточном экстракте (рис.1). Видно, что нуклеотиднлкиназц с ацетокиназой и нуклеозиддезоксирибозютрапсфепазы, как ферменты, не имеющие сродства к нуклеиновым кпелоткм, не осаждаются полизти-ленимином. ДНК-полимераза I и фрашент Кленова вначале осаждаются, затем, при дальнейшем повышении концентрации полизтиленимина в глоточном экстракте вше 0,25$ вновь переходят в раствор. И1К-по-лпмераза и 1Ш'1>-аза переходят в осадок при концентрации нолпэти -леннмпна 0,4,":! и 0,5^ соответственно. Таким образом, добавление к клеточному экстракту полизтиленимина до концентрации 0,5« позволяет надежно отделить Р11К-лолимеразу и ПНТ'-азу, нереход-т.^х в этих условиях в осадок,-от группы ферментов ЛДК-полимеразп I, фрашеи-та Кленова, нуклеотидалшшаз с ацетокипазой и нуклеозиддозиксири-бозплтраксфераз, остающихся з супернатанте.

1.2. Фракционирование, сульфатом аммония

Сульфат аммония широко используется как эффективный и мягкий рэа1'снт для фракционирования ферментов. Представляло интерес изу -чить поведение ЛШ-нолзслёразы I, фрагмента Кленова, пуклеотидилки-наз с ацетокиназой и нуклеоэадцезоксирибозилтрансфераз при фракционировании лолиэтиле1шшн1ОЁ0К>"супернатанта. Из экспериментальных данных,приведенных в таблице I,видно, что перечисленные ферменты орождаются из полиэтилениминового суиернатанта в достаточно узких областях концентрации сульфата аммония. Находящиеся в полиэтилен -шиповом супернатанте ферменты можно разделить на две группы: на -

Нузслеотидллкиказа с ацетоютназой

ДГК-полшораза I

Фрагмент Клспова

PIIK-иалшсразз

ПОЛИ! Г/КЛ С О Т H Д : О С: Jo -

рила а

0,2 U.4 и,6 0,8 1.0 £ в экстракте

vpaKUüonüponaiiiio «ермонтоп лализтл.:сщг.шном

-5-

агаенне супернатанта сульфатом а-.;;.; и п.:,: ;. .;:и-српало 40-Сй^ приво -дат к одамдешш ДШС-::олпмеразц I, пуг.леит:;далкпназ с ацстокпиазо:! и пушюозлдцоаохсснрибоиилтрансфораз; фрл1:.:еит Клоиова в этих условиях остается в супериатаитс и макет бить переведен в осадо;: даль-нсГшш.: поведением концентрации сульфата а'/;.<.ош'.я до 85$.

Таблица I

Оразсцпошфовалг.с полиэтилеиимипового супернатанта

ОуЛЬфСТОМ ЕММОКИЯ

¿Степень насинен;:;! полизтплекимшювого Наименование фермента {супернатанта судг-Олто;.: слиокия, $

:•• ¡с-; е отид;уизыаз ц с

..:дсток:;назо;; 55 - 6!3

¡¡лглсозпдцезэкскриОозпл-

тронсфераз:: 35 - 65

Л^тполимсраза I 50 - С5

С.агмонт Нлгнэва 75 - 35

1'а)сг.,м образе:.:, начальные этапу фракционирования плеточного эк-страгста псл;;от;^:с.л;:м;:;;см с последу;::^:.;.: фракционированием полиэти-'сулер;1а'та;;та сулыТатс:.: ац.\:эги:я приводят к получен;:» '-рох фракций (рлс:2>;

- фракция I, содс'рлаСй ^райхпт Клепова;

- фракц;*л 2, содоглг..^:дл''^\-пол;1.'.',эразу I, иувлеотадвлккиаэу с ацо-

701и:1азо]1'а"«3:1*-,:соз;идсзо2:сир;:<Зоз;1лтра11сфзрази; -- франция 3, содер:эд:1я :г«&-полкмёраэу к ШФ-азу.

2. Заключительные этапа фракционирования ферментов биосиптоза

иуклеинових ш:слот и 1.x лродасстланннков >'..[. '¿раициенпрэванпз ферментов биосинтеза нуклеиновнх кислот

Вззкз:.-аюоть дальнейшего ^акционирования и очистки ферментов

IC^L'G'ÛCu ЭКСТРАКТ В.coli ЖЕ-600

Оракцлоплроганке полиэтнлсннмкнс:.:

СУПГРНАТАКГ

{ДПС-полнмораза I,rapan,icht Кленоиа, иу клеотщцишшазн с ацотоюшазой.нуклеознд-де з о кс и оибоз илт ран сфэраз н)

уракционироганис сульфатом агония

ОСАДЖ

( РНК-полкмераза, П1;у-ага)

Фракция 3

СТлРНАТАНТ (фраитсит Клснова)

фракция I

осадок.

(ДПК-полимсраза I ,иукле07вд'нлюшаз!: с ацстокпназоЛ.цуклеозиддезоксцп;;-бсзг-лтрапсферазн )

|фратсцпл Й|

Рис.2. Схема начальник зтопои Фракцноннроваш'л фор-лент оь 6поск»тозп нундеиношх кисло-.* :i?: продгсо?гсиш:::ог.

биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников исследовал:! на различных хроматографических сорбентах, источая традиционные анизноойменные адсорбенты, афишные сорбенты (поли-Л-сефарозу, JUL-C-целлшозу, ДЩК-агарозу, гепарин-ссфарозу) и окрашенные сорбенты (голубую сефарозу, голубой декстран-софарозу).

Выбор фосфоцсллюлозы определялся тем, что фосфоцеллшоза сочл-тает в себе свойства к ионообмешшка и аффинного сорбента, обда -да:ощего специфическим сродством к ферментам субстратами которых служат фосфорные эфнрц. Как.показали исследования, ферменты био -синтеза нуклеиновых кислот, являясь ферментами такого типа аффективно очищаются на фосфоцеллюлозе. Фосфоцеляюлоза P-II фирмы " Whatcnn " ио:кет быть успешно заменена отечественным аналогом производства ШИХТИ (г.Ташкент).

Выбор ДНК-агарозы определялся простотой ее приготовления, суть которого заключается в механическом заплавлении денатурированной ЛПК-тимуса в 4,£-ную агарозу с последующим гранулированием геля.

Простим способом макет быть приготовлена и голубая декстран-се-фароза.

£що одним достоинством вышеназванных сорбентов является то,что на данных сорбентах происходит надежное разделение ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот от ферментов биосинтеза.их предшественников.

2.1.I. Очистка Фрагмента Кленова

Наличие значитсльных "количеств фраплента Кленова в клеточных экстрактах E.'coli. объясняется, очевидно, протсолизом нативной ДНК-полимеразы I эндогешшчп протеиназамл. Дальнейшую счистку фрагмента Кленова {фракция I) проводили последовательны-Ш хроматогра-фиями на фосфоцеллюлозе P-II и голубо!; декстран-агарозе. Степень очистки и выход фермента приведены в таблице 2. Фермент, получа -

емыЛ по предложенной методике, свободен от примесей эвдонуклеаз л

-8-

следов ДНК-полиме-разы I.

2.2. Очистка ДКК-полимеразы I

Дальнейшую очистку дНК-полимеразы I, содержащуюся во фракции 2, проводили хроматографией на фосфоцоллюдозе P-II, На фюсфоцеллюло-зе P-1I происходит отделение ДКК-полп;леразц от нуклеотидилкиназ с ацотокиназой и ну1<У1еоз:ш13зокскри0оз:ш'рансфсраз, которые,не сор-бируясь на фосфоцеллюлозе, элюируются в свободном объеме колоша:. ЛШ-полимеразу I элгаировачи с фосфоцеллгалозц P-II градиентом фосфата калия и дальнейшую очистку фермента проводили последовательными хроматографиямп на ДНК-агарозе и голубой декстран-софарозе. Ферментный препарат, полученный по предложенной схеме, свободен от эвдонуклеаз. Ферментный препарат ДНК-полимеразы I, полученный со стадии хроматографии на ДЖ-агарозс, содержит следы опдоиу:-леазы в примесном соотношении Ш£-пол;:мораза/эндонуклеаза равном 10000 : 1,.что позволяет успешно применять такой ферментный препарат в решщиях ник-трансляции без добавления экзогенной ДНК-азы.

2.1.3. Очистка РНК-полшоразц и ПНФ-азы

Kaie видно из рисунка 3, при концентрации полиэтяленкмина в клеточном экстракте 0,5%авместе, с РНК-полпморазой и ПНФ-азой в осадок переходит около 30^ белков клеточного экстракта. Оптимальные условия элюции PiE-полинерази и 1Ш'Т>-азы определяли суспендн -рованием полизтилепшииотзого осащса в растворах со ступенчатым увеличением концентрации хлористого натрия (рис.4 ). Суспендиро -вание осадка в 0,5£-hom растворе хлористого натрия позволяет отделить около 50% сорбировапшпс па осадке "балластных" белков, РШС-

у

гюлимерапа и ГПКназа в oti..c услов:шх остаются о осадке. Эффектнв-пая элюции этих ферментов достигается I М раствором хлористого натрия.

юр

0,0

I 6,0 л

Е

л 4,0 н о о

й 2,0

Й

03

\\

\

\

о,:

i —i - i-t- i —

12

0,4

0,6 0,8 1,0

" полпэтпленимина в экстракте

100

СЗ

а,

с i

Р-| Еч

О О М ю

80

60

40

1 20

\

\

N.

16

12

072 йл оТб D7B ^Т7о

. % полиэтиленимина в экстракте

Рис.3. Фракционирование РНК-полимеразк и ПНФ-азы полиэтиленимином

—.—--- активность фермента, ед.акт./мл

-i-i— концентрация белка,мг/мл

-Ю-

активность ПН^азы

ы

а> м

\ » Ь»

I \

i V »

1 \ • »-

\ \

I-

\

\

\

to |U сг>

концентрация белка

активность РНК-полимеразы

§

я и

о я

•а

о

Ы M

03 M Cl

о а °

о го

о

т

О СП

О СЭ

I \

I V I \

\ \

V-to*

\

со

-м|

а

\

м rf». о

концентрация белка

Наиболее эффективной процедурой разделения РНК-полимеразы и ПНФ-азы и дальне1саей очистки РНК-полимеразы является хроматография на ДНК-агарозе. РНК-полимераза сорбируется на ДНК-агарозе, как на аффинном сорбенте, в то время как ПНФ-аза элюируется в свободном объеме колонки. Дальнейшая хроматография ПНу-азы на ДЕАЕ-ссфадексе Л-50 позволяет получать практически гомогенный препарат фермента.

Элгащпо РНК-полимеразы с ДНК-агарозы проводили I М раствором хлористого натрия. Проведение ступенчато!-! олощш РНК-гголшеразы дозволило существенно упростить процедуру хроматографии, существенно сократить время ее проведения в сравнении с описанной (Нмсслеин, 1969) градиентной злюцией. Дальнейшую очистку РНК-полимеразы проводили гель-хроматографией па бпо-гсле А 1,5м. Использование биогеля А 1,5м, имеющего более низкий предел исключения, позволяю существенно повысить коэффициент разрешения ¡л езду РНК-пслимеразои и более низкомолекулярным:: белками в сравнении с описанной (Бургесс, 1975) гель-хроматографией на био-геле л 5м.

По данным электрофореза э ПЛАГ содержание сигма субьедшшцы в препарате РНК-полимеразы, получемюп списанным способом, составляло 60-707° от содержания ее в полном (холо) ферменте определяемого формулой . Для детального пзучеш:я процессов транскрипции

необходимы лрепараты РНК-полимеразы, содержание I моль сипла субь-единицы на один моль минимального (кор) фермента. С другой стороны, а ряде а~л;аеа, напрдмрр» для изучения структуры различных РНК большое значение п^гобратг.'ст'-адигод^'гдеотад, одним из способов получения которых является-'Тойпйкрппцил однонптевых фрагментов ДНК в системе минимального фермента* ?НК-пол;:меразн. Наиболее перспективной процедурой разделения этих двух 'форм фермента является хрематогра -фпя на фосфоцеллюлозе Р-Н в 50/^-нсм глицерине в режиме ступенчатой элации. На рисунке 5 представлена электрофореграмма ферментов биэ -синтеза нуглеиновнх кислот, полученной но предложенным схемам.

Fnc.5. Донслтогра".".:к элеглгрофорстпческих голсЛ ,содорл:.а:ц!:х:

A - полный фермент РНК-пол;плсразы; Б - м;:1П".1альш;:; ¡Тор.мспт РЖ-полл,меразп

2.2. фракционирование ферментов биосинтеза предшественников

нуклеиновых кислот 2.2.1. Очистка нуклеотидилкиназ с ацетокиназой

Практически во всех клетках синтез дезокси- и рибопуклеозидтри-фосфатов происходит по схеме:

ч dL) ЫЫР - - (d)LIDP -- (о)ЫТР

л.

ATP ЛОР ЛТР АЬР

'уосфорилирование происходит с участием нуклеотидилкиназ (нуклео -зидмоно- и нуклеозиддифосфаткиназ) и использованием в качестве донора фосфатных групп концевой фосфатной группы АТР. Расход АТР в клетках восполняется обычно за счет ненуклеотидных доноров фосфата с участием различных фосфотрансфераз. В клетках E.colt ату роль моает выполнять ацетокиназа по схеме:

АДР + СН3С. у0 ^ О 3 0 - Р - ОН -~ ATP + СН3С ?

Л4 он

Известно, что для получения (<i) NTP нет необходимости использования высокоочищенных препаратов упомянутых выше ферментов. Возможность синтеза полного набора {<х) WTP с использованием частично очищенных экстрактов E.colu была показана несколькими авторами (Копберг, 1958, Канеллакис, I960). Их частично очищенные препараты содержали весь набор нуклеотидилкиназ, но не всегда содержали ацстокиназу, хотя известно, что этот фермент имеется в клерках E.coli в больших количествах. В связи с этим зачастую ацетокиназу приходилось очищать отдельно. Исходя из этого возникла необходи -мость проследить поведение нуклеотидилкиназ, а таюке ацетокиназы при (фракционировании клеточного экстракта Е.соИ . Это показало 6а на какой .стадии фракционирования можно будет все еще обходиться

эндогенной системой регенерации АТР.

Как ухе упоминалось, эксперименты по фракционированию клеточного экстракта полиэтиленимином показали, что нуклеотидилкиназы с ацетокиназой остаются в супернатанте при 0,5£-ной концентрации полиэткленимина в экстракте шесте с ДШ-поллмеразой, фрагментом Кленова и нуклеозидцезоксирибозилтрансферазами и далее оса^сдаются из полиэтилениминового супернатанта сульфатом аммония при 65$. Нуклеотидилкиназы и ацетокиназа отделяются от ДНК-полимеразы I на стадии хроматографии на фосфоцеллшозе P-II в виде несорбируемого белкового материала, который может быть использован ¡сак суммарный препарат нуклеотидшишназ и ацетокииазы, пригодной для синтеза полного набора как рибо-, foc и дезоксириботрифосфатов. Предложенный метод получения такого ферментного препарата позволяет существенно упростить процедуру получения трифосфатов, причем выход ферментного препарата по предложенному способу возрастает в 2,3, а степень очистки в 10 раз в сравнении с методом Канеллакиса.

2.2.2. Очистка нуклеозидцезоксирибозилтрансфераз

Нуклеозиддезоксирибозилтрансферазн - ферменты осуществляющие трапсрибозилирование нуклеозидов:

- П2('1)В -- IIjidîR * Ы2

где , К - основания (d)R - остаток 2-дезоксирибозы. В это!; решсцик свободное основание является акцептором, а нуклеозид - донором рибозы или дезоксирибозы.

Фракционирование нуклеозщщезоксирибозилтрансфераз полиэтилен -имином показало, что они остаются в супернатанте при концентрации полиэтилешкина в экстракте клеток 0,5,1b и осаждаются из поли -этиленимппового супернатанта при 65,rî сульфата аммония. Так хе, как и нуклеотидилкиназы, эта группа ферментов не сорбируется па (Тосфо-

целлюлозе Р-П и выходят в свободном объеме колошей с фосфоцеллю-лозой Р-11. Элюат с фосфоцеллюлозы может бить использован в качество ферментного препарата нуклеозиддезоксирибозилтрансфераз. Выход ферментного препарата увеличивается в 3 раза, а степень очистки возрастает в 10 раз в сравнении с известными методами (Вильяме, ГХ.2).

3. Способ получения рибонуклеозидтрпфосфатов непосредственно из РНК

Традиционно рибонуы1оозпдтрпфосфаты получают ферментативным фосфорилированием соответствующих рибонуклеозидмонофосфатов, ко -горне, в свою очередь, получают ферментативным гидролизом РНК эн-донуклоазой из Зсг. тгеевсопз и фосфодиэстеразой и'з змеи-

ного яда. Продуктц гидролиза разделяют хооматографпчески и используют их в известных нагл системах фосфорилировашш.

Суммарный препарат нуклеотидилглназ, полученный вышеописанным способом, позволяет осуществить сопряжение реакции расщепления РНК и фосфорилировашш продуктов расщепления до соответствующих ну1:леозидтрифосфатов. Как следует из кинетической кривой (рис. 6) за 4 часа в экспериментально найденных условиях происходит прак -тпчески полны;! гидролиз РНК. Степень фосфорилировашш продуктов расщепления взятой из любой точки кинетической кривой гидролиза' была примерно одинакова и составляла 30-96$. Сопряжение реакции гидролиза РЖ с последующим фосфорилированием продуктов гидролиза происходит, очевидно, с участием в качестве расщепляющего фермента ПН'Ь-ази, следы которого присутствуют в препарате нуКлеа-"идил -киназ:

РНК----- щи, -~

Одним из доказательств такого предположения макет служить тот факт, что реакция расщепления РНК проходила только в присутствии

100

!

1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 время,час

Рис. 6. Кинетика гидролиза РНК

неорганического фосфата- одно из условии фосфотолиза РНК ГПК-а:юй.

Полученные тагам образом 1гу1У1еоз1у;тр;;фосфати разделяли хрогл -тографически (рис.7) и выделяли известиям способом. Спектральные характеристики полученных нуклеозвдтрлфосфатов соответствовали литературным, нуклеозидтрифосфаты использовались в качестве суб -стратов в системе РНК-полимеразы.

6 таблице 2 суммированы результаты наделения вшисперечистенныл •¡срментов.

Таблица 2

Очистка ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников

! 1аимо! 1 овапис формснта Суммарная активность, од.акт. Удельная активность, ед.акт./мг Выход, %

;И1К-полкмераза I 43000 10000 39

«¿раплепт Ил снова 2000 10000 20

¡■ПК-иоли.'лораза 34000 4000 33

22000 54 23

Нуглеотидилкинази 5300 3,7 С5

Нуклерзиддезоксирибо-

эилтрансфоразы 2800 1,9 50

В окончательном варианте совмещенная техпол"гаческаи схема получения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их нродаест -воннкков представлена на рисунке Б. На рг.сунг.е 0 представлена злок-трофорегремма ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот.

Реализация совлеченной технологической схемы получения фдрмен -тос биосинтеза нуклеиновых кислот и их иродооствошшков позволяет подучить экономический эффект в су».мо 54,2 тис.рублей в год.

GTP

л260

0,6 0,5 0,4

0,3 0,2

"0 20 30 номера (ТракцпЛ

•10

0,5

0,4

0,3 s

С*

ht

0.2!) г.

О, I О

30 60

Р;:с. 7. Хроматограф::! продуктов реак?;:::: гидролиза РНК ;

co:ip.>c:;eii!ii;>: с ncíi реакции (¡осфорплирозаппл продуктов пиролиза

кц; : о н : : г о г*а : ; : ; е .толп-отплзкпмппс- :

сг;аг-оза ^т-л-агарэза

j'•¿••■-■¡еозн^сзэкс:; ! Нуклестилг^киназу с

! s'aSos ¡ir.? rancie гл.-. ai 'ацегскпказой ¡

с У к Е ? К А 7 а • п К. А Л 0 К

■па-; г.герага !,■ ípa:*. Клекота FiLv-лол п:.:ераза,

нук.1 "Í ЛЗЫ с а: фосфарп т^ rj о

пух.: ! о с ? ; Т--л-} ок с;* г t. ^/v1 о J li? 'о л h с г-'л 31 '

; Окгтракцпя IJ IIa i

i -, г : \ кц ; ; с и ; : p о в л : : J сульфатом ,„чл-агарога

г" ¡a'.:.!0:í:T_'i

сут:?г::ата;гг ~о"с а до к Био-гель а 1,5

I i 1

1

Сефлдекс С-100 Се^одзкс С-100 £осФоцэллшоза р-н ДНАЗ-се'-адэкс

А-50

i i .'о;т, P-II СосХоце.гт-хюза P-II ________i

i РНХ-полпмараза Пол:::Г"с:ео?:ц

ГОЛУБО!: двмтоан- ' ' ' фзс.рЬллса

Толкый ¡'.".Ьптаалькып !

» . ». í ...... y ■ .

I .¡parr.te;;? ; ^л-полл^гераза I ¡¡уермен?' ,<рер:.:з1к

. • 2л>:аг

Р;:с< 6 Схема наделения ферментов биосинтеза нуклеиновых кисло- у ¡-г . „

" '4 BGHHiíKOB

птзо

й&ОЭ -

I )

тегО

Рис. 9. Электрофореграмма фсрглептов бноспнтсза нуклеиновых кислот:

1 - клеточный экстракт ;

2 - фрашент Клснова ;

3 - ДНК-полИтсраза I ;

4 - РШ{-лолшераза, полный фермент

выводи

На основании различия в поведении ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании клеточного экстракта E.coli. ¡.ШЕ-600.

I. Разработана совмещенная технология одновременного получения ряда ферментов (ДНК-полимераза I, фрагмент Кленова, ДИК-зависимая РШ(-полиглераза полный фермент, ДНК-зависимая РНК-полшераза минимальный фермент, полинуклеотидфосфорплапа, сунпартпЛ препарат ну-клеотидошсиназ с ацетошшазой, суммарный препарат нуклеозидцезок-сирибозилтрапсфераз) из одного образца биомассы. ■ 2. Разработан способ получения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с использованием суммарного ферментного препарата нуклеотидшпш -наз и ацетош-шаз.

3. Разработан способ получения нуклеозвдтрифосфатов непосред -сгвешю из РНК с использованием частично очищенного экстракта E.coIL ¡,IRK-G00.

4. Разработаны технологические процессы получения ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников внедрены в Опытное производство научно-исследовательского конструкторско-тсхно -логического института биологически активных веществ,- часть из них (ДНК-нолшсраза I, фрагмент Кленова) внедрены иа опытно-промышленном заводе ферментных препаратов НПО "Фермент" г, Вилыюс Литовс -кок ССР, организовано серийное производство фезрмештов.

5. Внедрена технология получения дозоксирибонуклеозид-5'-трн -фосфатов в Опытном производстве научно-исследовательского коист -рукторско-технологаческого института биологически активных веще -ств.

Материалы диссертации опубликована в следующих работах:

1. Хомов В.В., Загребелышй С.Н., Токарев К.А., Легостаева Г.А. Распределение ферментов биосинтеза нуклеиновых кислот и их предшественников при фракционировании клеточного экстракта Е.соК '«IRE—600.- Прикладная биохимия и микробиология, 1937, т.23, вып.2, с.179-184.

2. Хомов В.В..Загребелышй С.Н., Легостаева Г.А., Орешкова С.Ф. Поведение большого фрагмента ДНК-полиглеразы I (фрагмента Кле-нова) при фракционировании клеточного экстракта E.coli, . -Прикладная биохимия и микробиология, 1937, т.23, вып.4, с.530-535.

3i Загребелышй С.Н., Корхов В.А., Хомов В.В., Стариковская А.Ф. Способ получения рибонуклеозидтрифосфатов.- Авторское свиде -тельство Je 6914G2. Опубл. 15.01.79. Ы1 S3Ö

4. Загребелышй С.Н., Кор:;ов В.А., Хомов В.В., Стариковская А.Ф. Способ получения пуршювых дезоксириботрифосфатов,- Авторское свидетельство СССР 1Ъ 660976. Опубл. 05.05.79. Ш №17

5. Кравченко В.В., Петренко JI.A., Дегтярев С.Х., Хомов В.В.,Рив-кин М.И. Штамм-продуцент фрашента Клеиова и способ получения фраплента Кленова.- Положительное решение государственной научно-технической экспертизы изобретет:;} па заявку JM3297I8/30

- -13(169875) от 17.Ц.37г.

6. Хомов В.В., Токарев К.А. Совмещенная технология выделения ферментов обмена нуклеиновых кислот // Методы получеши и анализа биохимических препаратов: Тез.дом. 4-oü Всесоюз.копф.(г.Рига февраль 1982г.) Рига, 1982.- Ч.1.- С.С.?.

7. Хомов В.З., Синичкина С.А., Михайлова В.К., Зернов ¡0.11. Использование производных целлюлозы для очистки ферментов обмена нуклеиновых кислот // Проблемы использования целлюлозы и ее производных в медицинской и микробиологической промышленности:Тез.

Подписано к печати УН 08650

Со'(.уят Су.маги 00 у. ЬЛ /10 , оОъс-м ги:ч.листои I

Уч - Д. л Л закал 57' тираж 100 пкзомплнроп

1'оти:;р;'.нт гН'.'И "Л' , С'<.'!ПО 1'пл 1,:'.0"0, Ноиосиг'мре.коН о(1."..