Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биосинтеза рибофлавина у дрожжей (химизм, ферменты, регуляция)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование биосинтеза рибофлавина у дрожжей (химизм, ферменты, регуляция)"



ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УССР ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. В. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

ЛОГВИНЕНКО

Елена Моисеевна

УДК [577.164.124-577.1521:582.282.23

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОСИНТЕЗА РИБОФЛАВИНА У ДРОЖЖЕЙ (ХИМИЗМ, ФЕРМЕНТЫ, РЕГУЛЯЦИЯ)

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

и/

Киев — 1989

Работа выполнена в ордена Трудового Красного Знамени Институте биохимии им. А. В. Палладина АН УССР.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук БЫХОВСКИЙ В. Я-, доктор биологических наук, профессор КУДИНОВ С. А., доктор биологических наук МАЛЮТА С. С.

Ведущее учреждение — Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Защита состоится «_____»_19 г. в_ часов

на заседании специализированного совета Д 016.07.01 при Институте биохимии им. А. В. Палладина АН УССР (252030, Киев-30, ул. Леонтовича, 9).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии им. А. В. Палладина АН УССР.

Автореферат разослан «_»_19 г.

Ученый секретарь специализированного совета

О. В. КИРСЕНКО

общая характеристика работы

Актуальность проблемы, йлавинмононуклеотид (raí ) и флавин-адениндинуклеотид (fad ) входят в состав флавопротеинов, катализирующих многочисленные окислительно-восстановительные реакции клеток. Они образуются нз рибофлавина (витамина &>), биосинтез которого осуществляют микроорганизмы н растения.

Структура рибофлавина (РФ), который представляет собой 7,8-диметил-10-(1'-D-рибмтил)нзоаллоксазнн, установлена более 50-тя лет назад, однако исследование путей его образования в связи со сложностью строения молекула растянулось на долгие годы и. продолжается до сих пор. К началу настоящей работы (1970 г.) при помощи гуанинзависимых мутантов дрожжей ( Шавловский и соавт.» 1969 ) и бактерий ( Bacher0 Mailänder „ 1969 ) было установлено, что РФ образуется из гуанилового соединения. Из культур флавиногеяшх микроорганизмов вццелен непосредственный предшественник витамина Bg 6,7-диметил-8-рибитиллюмазин (ДМРЛМ Masude « 1957; маley,Plaut, 1959 ) и показано его превращение в РФ под влиянием РФ-синтазы (Flaut, 1963). В культуральноЯ жидкости РФ-зависимых мутантов sao-charomycea cerevlslae Бахер и соавт. (oltmanne et al. » 1969; Bacher, Llngena , 1970, I97X ) обнаружили пиримидиновые продукты фла-виногенеза, что позволило им создать гипотетическую схему биосинтеза PS у дрожжей: гуаниловое соединение —■» 2,5,6-триамино-4-ок-сипиримидин — 2,5-диамино-4-окси-6-рибитиламинопиримидин —2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидин —=» ДМРЛ —»- РФ.

Оставались невыясненными следующие вопросы: какое гуаниловое соединение (основание, цуклеозид или нуялеотид) используется для флавиногензза; являются ли пиримидины, накапливающиеся в культурах РФ-зависимых мутантов, истинны»« предшественниками РФ или продуктами их распада; каково происхождение рибитияьной цепи фяавинов; как образуется птФридикоаыЙ предшественник' витамина Bj.

До середины 70-х годов были изучены свойства только одного фермента биосинтеза витамина Bg - РФ-синтазы (КЭ 2.5.л.9)( Flaut , 1963; Harvey,Flaut , 1966 \ Были начаты работы по изучение механизмов регуляции флавиногенеза у бактерий Bacillus aubtilie ( Врес-лер и соавт., 1969 ). Отсутствовали сведения о механизмах регуляции этого процесса у эукариотическиж микроорганизмов,,

Цель и задачи исследования. Работа посещена изучению пути биосинтеза РФ и механизмов регуляция этого процесса у дрошей. Основным объектом исследования служили дрожжи pic hi a aullliercieadíi АТСС 9058, синтезирующие при росте а желеэодефицитных средах повы-

шенные количества витамина Bg.

В число основных задач работы входило:

- изучение природы продуктов флавиногенеза, накапливавшихся в культурах РФ-зависимых мутантов P. guilliermondilj

~ исследование химизма биосинтеза РФ у дрожжей в опытах In vitro и свойств ферментов! катализирующих этот процесс у p. guilliermondil;

- изучение механизмов регуляции активности и образования ферментов биосинтеза витамина Bg У ряда видов дрожжей - активных и слабых продуцентов этого витамина.

Научная новизна работы. Впервые систематически исследованы реакции биосинтеза Pi у дрожжей в опытах in vitro. Установлена природа гуанилового предшественника РФ, происхождение рибитильной цепи флавинов, более детально охарактеризованы пиримидиновые интер-меДиаты флавиногенеза у дрожжей, установлена роль рибозо-5-фосфата как углеводного предшественника витамина Bj> у дрожжей и бактерий. Подученные нами данные позволили существенна дополнить предложенную ранее схему биосинтеза РФ у дрожжей.

Из клеток P.guilliermondil впервые ввделены и охарактеризованы ферменты, участвующие в биосинтезе РФ у дрожжей: gtp -цикло-гидролаза, редуктаза, дезаминаза, синтеза алифатического предшественника РФ (АПР-скнтаза) и ДМРЛ-синтаза. Идентифицированы структурные гены, кодирующие их синтез.

Изучены механизмы регуляции флавиногенеза у дрожуей как представителей эукариотических микроорганизмов. Обнаружен общий для флазмногенных и нефлавиногенных видов механизм ретроингибирования фермента первого этапа gtp-циклогидролазы конечным продуктом флавиногенеза FAD ..Показано, что у ряда видов дрожжей (p.guilliermondil, Torulopsis cacdida и некоторых других), осуществляющих сверхсинтез витамина Е^ в условиях дефицита железа, ионы этого металла в качестве корепрессора участвуют в координированной регуля-цкн образования почти всех ферментов биосинтеза РФ. Выяснена основная причина сверхсинтеза витаиииа Bj> у этих организмов.

Практическая ценность работы. Результаты настояцей работы имеют важное значение для разработки рациональных методов селекции дрожжей - продуцентов витамина Bg, его предшественников и производных, Они з<же несши применение для селекции мутантов р.guilliermondil о нарушенной регуляцией флавиногенеза, способных синтезировав значительные количества витамина Bg в чреде с высоким содержанием ионов железа (Шавловский и соавт., 1985).

Разработанные нами методы селекции РФ-эависимых мутантов и определения активности ферментов флавиногенеза использовались рядом исследователей (Шавловский и соавт.,, 1978-1980, 1982, 1985, 1988; Сибирный и coaэт., 1978; Еандрин и соавт., 1975;Bacher et al., 1984-1986). Pfl-зависимый мутантt способный расти при низких концентрациях РФ, использовался для исследования закономерностей транспорта PS у этого организма ( Сибирный и соавт., 1977-1979; 1985).

РФ-зависимые мутанты P.guilliermondil могут найти применение для клонирования структурных генов биосинтеза витамина Bg эу-кариотических микроорганизмов.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались или были представлены на международных, всесоюзных и республиканских съездах, симпозиумах и конференциях.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 63 работы.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,обзора литературы (3 главы), экспериментальной части (4 главы)„ заключения и выводов. Работа изложена на 220 страницах машинописного текста, содержит 73 рисунка, 59 таблиц, 507 литературных источников, в том числе 372 иностранных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовали: дрожжи, осуществляющие сверхсинтез Ра при лимитировании роста ионами железа (штаммы Pichls guilliereoa-dii АТСС 9058, ВКМ У-1256, ВКМ У-1257, Torulopsis candida ВКМ 18, Debaryomycea kloeckeri гаавв Fabryii ВКМ У-102, Schwan-niomycea occldentalis 1758), обозначенные как флавиногенныв организмы; дрожжи, обладающие низкой флавиногенной активность»(штамм Fichia guilllermondil 1453, piehla ohmeri ВКМ У-1252, Candida ufcilis ВКЫ 106, Candida pulcherriaa ВКМ 95, Seccharojnyces oere-viaiae S283 С), обозначенные как нефлавиногенные организмы; РФ-зависимые мутанты P.^jiilliermondlljT.candida» Р.ohmeri , селекционированные в настоящей работе - штаммы серии К '„ а также полученные из генетической линии P.guilliermondil - штаммы серии RO (rib", hla") и RA (rib",ade" ) (Шавловский и соавт., 1979) ¡ цугам р. gull-llermondli. 36-121 с поврежденным транспортом конов железа, синтезирующий значительные количества РФ в среде о высоким содержанием этого металла (Шавловский, Кшеминская0 2970 , к jsi-37 с повдаеи-ной чувствительностью к ряду антибиотиков (Сибирный м соаат.Д977/; мутант S.cerevi3lae 750 с блокированной РФ-синтазой (Oltaanna et al., 1969); бактерии Escherichia coli 802 ( met gal",

ви2 ) из коллекции У.Б.Вуда.

Дрогши выращивали в кодифицированной среде Беркгольдера (Дог-ВИИ8НК0 и соавт., 1977), содержащей низкие (0,005 мг/л) или высокие (0,2 мг/л) концентрации ионов железа. Очистку сред от металлов проводили при помощи 8-оксихинолина (Waring,Werkman , 1943 ). Дрожжи культивировали в колбах на качалке или в 20-литровых сосудах с барботажем при 29°С.

РФ-зависимые мутанты дрожжей получали, используя в качестве мутагена Уф-лучи или N-метил- н' -нитро-н-нитрозогуанидин. Природу диаминопирлмидинов, накапливающихся в культурах РФ ауксотрофов, а ?аив образующихся в ферментативных реакциях, изучали после превращения в люминесцентные пигменты - птеридины - путем конденсации с диацетилом ( oitmanns et.al. , 1969). Птеридины очищали при помощи хроматографии на ионообменных смолах, сефадексах, целлюлозе, бумаге ватман 3 мм. Идентификацию этих веществ проводили по спектрам поглощения, хромагографической подвижности на бумаге в различных системах, содержанию фосфора, а также энзиматически.

Клетки дрожжей разрушали при помощи стеклянных бус. Пермеаби-лизацию дрожжей проводили диметилсульфоксидом (Adams , 1972 ) или дигитонином (Логвиненко и соавт., 1977 > Активность РФ-синтаэы определяли по модифицированному методу Пляута (Шавловский и соавт., 1975); активность остальных ферментов биосинтеза РФ - методами, разработанными в настоящей работе.

Скорость синтеза нуклеиновых кислот и белков измеряли по включению [2 ^с] гуанина и ^^С-лейцина соответственно в кислотонерас-творицую фракцию дрожжей.

Концентрацию флевинов и птеридинов определяли флуориметрически или спектрофотоыетрически. Экстракцию флавинов из клеток и определение FAD проводили по Яги (sfagi , 1963 1 Концентрацию белка определяли по Лоури и соавт. (I,cwry et al. , 1951 )или спектрофотомет-рически при 280 им, фосфора - по Вейл-Ыалерби и Грину («ell-ltaler-Ъч, Grooa , 1951) , рибозы — орциновым методом (аХЬаия!(ишЬгеit , 1947). Молекулярную массу ферментов определяли методом гель-фильтрации (Детерман, 1970). Диск-электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Дэвиса( Davis , 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

I. Садркляя к биохимическая классификация РФ-зависимых мутанТОВ P.eullUexacndil,

Рй-запясиыш »<угаяты дрояжей впервые были'выделены у s.cere-vi#i4« t обладаюцкх слабой флавиногокной активностью(оПааш1з,

Lingens , 1969 ). Попытки подучить такие мутанты у дрожжей p.guil-liermondii , способных к сверхсмнтезу РФ, вначале оказались безуспешными ( Oltnanna at.al» , 1968). Нами показано» что для селекции РФ-зависимьк мутантов этого вида дрожжей необходимо использовать среды с высоким содержанием витамина Bg (150-200 мкг/мл). Из рдца штаммов P.guilliermondii » таких как АТСС 9058, ВКМ 1256, ВКМ 1257, Ф5-121, при помощи УФ-лучей и нитрозогуанидина селекционировано 56 ауксотрофных по РФ мутантов. Получены тагскз РФ-зависимые мутанты т.candida (6 штаммов) и p.ohmeri С? штаммов). Частота воздакнове-ния РФ-зависимых мутантов у исследованных дрожжей колебалась в пределах 0,02-0,05

При изучении ростовых потребностей мутантов оказалось, что они отличаются не только у штаммов, принадлежащих к различным видам дрожжей, но и у мутантов одного вида. Так, среди мутантов ?„guil-liermondii АТСС 9058 обнаружены штаммы, накапливающие максимальную биомассу в присутствии 200 ( R7.R9 ), 70 ( r^5) и 20 (н120 ) мкг витамина Bg в I мл. Потребности мутантов p.guilliarmondii в ростовом факторе можно существенно понизить путем последовательного пересева клеток в среды с постепенно понижающимися концентрациями витамина Bg (100, 50, 25 и Ю мкг в I мл) или путем повторного мутагенеза клеток и отбора мутантов, растущих в присутствии 5 мкг РФ в I мл. Последним способом получены мутанты, накапливающие максимальную биомассу при наличии в среде 2 мкг РФ в I мл.

Оптимальная концентрация витамина Bg для роста мутанта т.candida R7 составляет 150 мкг/мл, а мутанта Р.ohmeri Н32 - 5 мкг/ил.

С целью биохимической классификации РФ-зависимых мутантов р. guilliermondii изучали природу специфических продуктов, накапливающихся в их культурах при инкубации железодефицитных клеток в среде без витамина Bg, а также способность дрожжей расти в среде без РФ с ДМРЛ или диаретилом. На основании данных о природе пиримиди-нов и птеридинов, обнаруженных в клетках и культуральной жидкости, и ростового теста мутанты были разделены на пять биохимических групп (табл. I). Мутанты первой группы ие синтезируют пиримидиновых и' птеридиновых предшественников РФ, что свидетельствует о нарушении у них первого этапа флавинсгенеза - раскрытия пуринового кольца ь положении 8. Мутанты второй группы накапливают в клетках и среде 2,5,б-триамино-4-оксипиримидин или его рибозильное производное. После конденсации с диацетилом это вещество превращается в 6,7-диме-тилптерин, обладающий голубой флуоресценцией. В культуральной жидкости мутантов третьей группы обнаружен 2,5-диамино-4-окси-6-рибк-

тиламинопиримидин, который после взаимодействия с диацетилом превращается в 6,7-диметил-8-рибитилптерин, обладающий зелено-голубой флуоресценцией. У мутантов третьей группы блокирована реакция деза-минирования пиримидиневого предшественника РФ во 2-ом положении.Мутанты четвертой группы накапливают в среде 2,4-диокси-5-амино-6-ри-битиламинопиримидин, превращающийся в присутствии диацетила во флуоресцирующий зеленым цветом ДМРЛ. У них поврежден синтез этого пте-ридина. Цутанты пятой группы воделяют в среду ДМРЛ. Очень большие количества птеридина (до 160 мкг/мл) накапливаются в культуральной жидкости мутантов этой группы, вцделенных из штамма Ф5-121. Как показали исследования, у мутантов пятой группы блокирована РФ-синта-за. '

Таблица I. Биохимическая классификация РФ-зависимых мутантов Р»ви1111егтош111

Биохими- Количе- Рост в среде Идентифициро- Продукт, син-

ческая группа ство мутантов с диацетилом дел ванное вещество тезируемый мутантом

I 24 - + Отсутствует Отсутствует

П II - 6,7-Диметил-птерин 2,5,6-Триамино-4-оксипиримидин

Ш 7 — + 6,7-Диметил- 8-риоитилпте- рин 2,5-Диамино-4-ок си-6-рибитилами-нопиримидин

1У 8 + + ДМРЛ 2,4-Диокси-5-ами но-6-рибитилами-нопиримидин

У 7 - - ДМРЛ ДМРЛ

Сравнивая свойства РФ-зависимых мутантов p.guilliermondii и a.oereviaiae , следует отметить, что по природе аккумулируемых продуктов они идентичны. Однако мутанты F.guilllermondil в усло-' виях дефицита ионов железа синтезируют в 10-100 раз больые предшественников, чем мутанты S.cerevisiae.

При помощи разработанных нами методов получена большая коллекция РФ-зависимых мутантов генетической линии bgullliermondii и проведен их биохимический и генетический анализ (ДОавловский и со-авт., 2979 \ Показано, что мутантам первой, второй, третьей и пятой биохимических групп соответствует по одному классу комплементации - . riV» , rit2,rib5 в rib?; мутанты четвертой биохимической группы ¿шздеяаны ни три класса - ritxt, rib? и rib6.

2. Изучение химизма биосинтеза РФ и овойств ферментов, катализирующих этот процесс у дрожжей.

2.1. OTP -циклогидролаза - фермент первого этапа флавиноге-неза. Фур и Браун ( loor, Brown , 1975) вцделили из клеток в.coli новый фермент иг? -циклогидролазу П, превращающую GTP в 2,5-диа-мино-4-окси-6-рибозиламинопиримидин-5'-фосфаТ, формиат и пирофос-фат. Они предположили,- что этот фермент участвует во флавиногенезе, однако не представили доказательств в пользу данной гипотезы. OTP -циклогидролаза, осуществляющая аналогичную реакцию, обнаружена нами у дрожжей P.guilliermondii иT.candida . Разработан флуоримет-рический метод определения активности этого фермента в экстрактах и клетках дрожжей с нарушенной проницаемостью, в основе которого лежит неферментативное, превращёние пиримидинового продукта реакции в присутствии диацетила в 6,7-дикетилптерин. GTP -циклогадролазная активность обнаружена у РФ-зависимых мутантов p.guilliermondii и T.candida различных биохимических групп; она отсутствовала только у мутантов первой биохимической группы. Таким образом, было доказано, что GTP -циклогидролаза катализирует первую реакцию флавино-генеза и, следовательно, GTP является пуриновым предшественником РФ (рис. I). У P.guilliermondii этот фермент кодируется геном RIB1.

Уже первые попытки очистки OTP -циклогидролазы P.guilliermondii показали, что она очень лабильна. Из испытанных возможных стал

билизаторов, таких как ЭДТА, дитиотрейтол, кофактор Mg + , субстрат, глицерин, только ионы llg2+ совместно с дитиотрейтолом несколько стабилизируют фермент. GTP -циклогидролазу вцделяли из железо-дефицитных клеток P.guilliermondii АТСС 9058 путем обработки экстрактов стрептомицин сульфатом, фракционирования белков сульфатом аммония при 25-45 % насицения, гель-фильтрами через сефадекс G -200 и хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. При помощи данной процедуры GTP-циклогидролаза была очищена в 190 раз (удельная активность 0,05 Е/мг белка). Выход фермента колебался 8 пределах 4-17 sí-

При хроматографии препаратов GTP-циклогидролаэы, полученных фракционированием белков сульфатом аммония и гель-фильтрацией, на OTP -сефарозе практически весь белон связывался с сорбентом, во-ви-димому, за счет гидрофобного взаимодействия. Для элюции фермента использовали буферные растворы, содержащие I Ш и 2 мЫ GTP . В первом случае достигалась 10-ти кратная очистка, однако злюция GTP -циклогидролазы была неполной и наблюдалось сильное разбавление фермента. При повшении концентрации субстрата в элюирующем растворе до 2 мМ выход фермента составлял примерно 80 при этом происходи-

№1,0Н,С

ОН ОН

О" ОМ

мнг -я/а з мн3

СЯ2 N ¿н

(н-с-ои)5 (н_,

© СН2°СР) ©

сн2

(Н-С-ОШз СН2ОН

СН20Н

Ри5аъв-$(Р) | т&Ь

Й185

Сч-с-он)5 сн2ои

ОУ (м-с-ои)з

СН20Н

оэ

Рис.1. СХЕМА БИОСИНТЕЗА РИБОФЛАВИНА У ДРОИЕЙ Р1СНИ сшьиенмсшш I - бТР ;П - 2,5-диамино-^-окси-б-рибозиламянопиримидин-5'-фосфат ; Ш -2,5-диамино-4-окси-б-рибитиламинопиримидин-5'-фосфат ; 1У - 2,4-диокси-5-амино-б-рибитиламинопиримидин-5'-фосфат ; У - 2,^-диокси-5-аш1но-6-рибитиланинопиримидин ; 1У - ДМРЛ ; УП- Р§ ; УШ - АПР.

яа злюция балластных белков (около 30 £), что значительно снижало эффективность очистки.

Для изучения свойств GTP -циклогидролазы P.Euillieroondii АТСС 9053 использовали препараты фермента, очищенные путем фракционирования белков сульфатом аммония и гель-фильтрации; в некоторых опытах препараты фермента дополнительно очищали хроматографией на ДОАЭ-целлюлозе. Показано, что GTP -циклогидролаза обладает строгой специфичностью к ОТр и не использует в качестве субстрата gmpc GDP, А hp о ADPjATP, ИР и ХТР . Для проявления активности фермента необходимы ионы Mg2+ и Мп2* . В эквимолярной концентрации ионы магния в два раза более эффективны, чем ионы марганца. В отсутствие этих катионов ферментативная активность составляет около 8 % от максимальной. Кривая зависимости удельной активности GTP -циклогид-ролазы от концентрации Mg2+ имеет негипербодический вид; величина [ыф|5 равна 2,0*10~^М. Активирующее действие на фермент оказывает дитиотрейтол. В присутствии I•раствора этого восстановителя активность фермента повьшается почти в два раза. Ингибиторами фермента являются продукт GTP -циклогидролазной реакции пирофосфат (00 5 - 5,8-Ю М), а также ортофосфат ([i] 0 5 ® 4,5»I0"3M)S хе-латирующие соединения, ионы тяжелых металлов. Ьермент проявляет максимальную активность при pH 8,0-8,3 и температуре 42°С.

Удельная активность фермента зависит от концентрации ферментного препарата. По мере уменьшения его содержания от 0,02 до 0,002 мг белка в I мл она понижается в 2-3 раза. Кривая зависимости скорости GTP-циклогидролазной реакции от концентрации gtp в присутствии высоких концентраций ферментного препарата (0,1-0,2 мг белка в I мл) имеет негиперболический вид и характеризуется положительной кооперативностью в зоне высоких концентраций субстрата; величина [s] о 5 * 2,0'Ю"°М. При низком содержании белка (0,01 мг в I мл) кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата имеет вид гиперболы; Кш- 4,0»j0~^M.

Конечный продукт флавиногенеза fad (но не РФ и гвд ) угнетает gtp -циклогидролаэу. Ингибирующее действие' оказывают также другие нуклеотиды, содержащие остаток аденилойой кислоты. Эти-данные свидетельствуют о том, что активной частью в структуре эффектора является 5'-аир , а не изоаллоксазиновое кольцо флавинов.

Изучено влияние amp на удельную активность gtp -циклегидрола-зы в зависимости от концентрации субстрата и белка. Как видно из рис. 2, в присутствии I-lO"3 М АМР и 0,2 мг белка в I мл происходит значительное снижение активности фермента. Сродство фермента

к субстрату понижается примерно в 6 раз (величина [э ] ц 5 - 1,3« 10 М). Степень ингибирования фермента эффектором зависит от концентрации субстрата и почти полностью устраняется в присутствии его высоких концентраций. По мере уменьшения концентрации белка в реакционной смеси от 0,2 до 0,02 мг/мл чувствительность (УТР-циклогидролазы к А11Р резко снижается. В присутствии 0,01 мг белка в I мл эффектор не влияет на активность фермента при всех испытанных концентрациях субстрата (рис. 2). В этих условиях происходит полная десенсибилизация й№ -циклогидролазы без значительного снижения удельной активности.

О 0,2 ty. 0,fc а8 W

2.0

[СТР], И«1(Г*

Рис. 2. Влияние auf на кривые зависимости удельной активности отр -циклогидролазы от концентрации субстрата.

I - 0,2 мг белка в I мл; 2 - то же и I-I0"3 М АИР; 3 - 0,01 мг балка в I мл; 4 - то же и 1-Ю"3 М АИР.

Приведенные данные свидетельствуют об аллостерической природе gtp -циклогидролазы p.gutlJ.iermondil , а также о большой лабильности ее структуры.

Изменение регуляторных свойств в зависимости от концентрами белка является характерной особенностью диссоциирующих аллостери-чесхих ферментов ( Курганов, 1978). Методом гель-фильтрации определяли молекулярную массу gtf -циклогидролазы при' внесении в колонку с евфадехеон О -150 0,8 и 0,02 мг белка. В первом варианте фермент

элюировался из колонки в виде одного пика и имел молекулярную массу 170 кДа. При использовании 0,02 мг белка в ряде опытов обнаружено два пика ферментативной активности, соответствующих белкам с молекулярной массой 170 и 18,5 цЦа. Возможно, gtp -циклогидролаза P.guiUiermondii является олигомерным ферментом, способным при очень низких концентрациях белка диссоциировать на 8-Ю субъединиц. Дальнейшее исследование данного вопроса предполагает работу с гомогенными препаратами gtp -циклогидролазы.

Молекулярная масса OTP -циклогидролазы t.candida и D.kloeo-keri соответствует 190 цЦа и 180 кДа. Подобно ферменту P.guiUiermondii, GTP -циклогидролаза этих видов дрожжей угнетается FAD и АЫР.

Ретроингибирование gtp -циклогидролазы выявлено также в опытах in vivo у Рй-зависимых мутантов дрожжей. В процессе инкубации клеток мутанта P.guiUiermondii r128-13 с поврежденной второй реакцией флавиногенеза, обладающего низкой потребность» в витамине Bg, в течение 4 ч в среде без PS скорость образования 2,5-диаминэ-4-oкcи-б-pибoзилaминoпиpимидин-5,-фосфата повышалась с 0,005 мкмоль/г сухого веса клеток в ч до 0,15 мкмоль/г сухого веса клеток в ч, то есть возрастала в 30 раз. Блокирование белкового синтеза циклогексимидом не влияет на стимуляцию образования предшественника, что свидетельствует об участии механизма ретроингибирова-ния, а не репрессии в регуляции активности gtp -циклогидролазы.. Ретроингибирование флавиногенеза обнаружено у Pi-зависимых мутантов S.cerevisiae и p.ohmeri • Таким образом, этот механизм регуляции распространен как у .флавиногенных, так и нефлавиногенных видов дрожжей.

2.2. Изучение второй реакции биосинтеза РФ. катализируемой 2.5-диамино-4-окси-6-рибозиламинопиримидин-5'-Досфатредуктазой. G целью исследования второй реакции флавиногенеза у дрожжей изучали природу продуктов, образующихся из gtp в экстрактах мутантов p.guiUiermondii генотипа riba и г1ьз , у которых повреждена соответственно вторая и третья реакция данного лроцесса. Диализоган-ные экстракты железодефицитных клеток мутантов инкубировали с gtp или с gtp и nadph . Показано, что при инкубации экстрактов мутантов R6 (riÜ2 ),RA46 (rib2 ),R39 (rib3 ) И hg80 (пьз ) С gtp образуется только продукт gtp -циклогидролазной реакции 2,5-диа-мино-4~окси-б-рибозиламинопиримидин-5'-фосфат (табл. 2). ß присут- -ствии gtp и nadph у мутантов rib3 синтезируются два новых вещества, идентифицированных.как 2,5-диамино-4-окси-б-рибитиламинопй-

Таблица 2. Образование предшественников РФ и их производных из ОТР под влиянием диализованных экстрактов желеэодефицит-ных клеток Р.виИНегтошИ! АТСС 9058 разного генотипа

Штамм Наличие НАОРН Продукты превращения (УТР Концентрация, мш

АТСС 9058 + 2,5-Диамино-4-окси-6-шбозил-аминопиримидин-б*-фосфат 2,5-Диамино-4-окси-б-рибозил-аминопиримидин-5'-фосфат 2,4-Диокси-5-амино-б-рибитил-аминопиримидин-5'-фосфат 2,4-Дио ксит5-амино-б-рибитйл-аминопиримидин 2,5гДиамино-4-окси-6-рибитил-аминопиримидин 9,84 0,18 5,30 3,95 0,06

Б6(г1Ъ2) 2,5-Диамино-4-окси-6-рибозил-аминопиримидин-5•-фосфат. 2,5-Диамино-4-окси-б-рибозйл-аминопиримидин-5'-фосфат 6,20 5,90

Нй80(г1Ь5) + 2,5-Диамино-4-окси-б-рибозил-аминопиримидин-5'-фосфат 2,5-Диамино-4-окси-6-рибозил-аминопиримидин-5' -фосфат 2,5-Д»а«ино-4-окси-6-рибитил-аминопиримидин-5* -фосфат 2,5-Дцамино-4-окси-б-рибитил-аминопирймидин 5,96 0,99 3,75 0,50

римцдин-5'-фосфат и 2,5-диамино-4-окси-6-рибитиламинопиримидин. В таких условиях у мутанта лово 63 % пирямидинового продукта отр -циклогидролазной реакции превращается в 2,5-дйамино-4-окси-6-риби-тиламинопиримидин-5*-фосфат и только 8 # - в его дефосфорилированную форму (табл. 2). Эти вещества не образуются в экстрактах мутантов г1Ь2 , Полученные данные свидетельствуют о том, что на втором этапе флавиногенеза у дрожжей происходит восстановление рибозиль-ной цепи продукта (¡тр-циклогидролазной реакции в рибитильную цепь с образованием 2,5-диамино-4-окси-6-рибитиламинопиримидин-5'-фосфа-та (рис. I). Фермент, катализирующий эту реакцию, 2,5-диамино-4-ок-сн-6-рибогидаминопиримидин-5»-фосфатредуктаза у р.^1111егтопаи кодируется геном нхвг.

Нами впервые разработан метод определения активности редукта-зы, участвующей во флазшогенезе, в основе которого лежит превраще-

ние продукта реакции в присутствии диацетила во флуоресцирующий зелено-голубым цветом б,7-диметил-8-рибитилптеринфосфат. Определена редуктазная активность в экстрактах рада видов дрожжей ( см. табл. 5), а также мицелиальных грибов Eremothecium aahbyii, ueuro-spora сгавза и Aaperglllus aidulaas . По-видимому» 2,5-диа-мино-4-окси-б-рибозиламинопиримидин-5,-фосфатредуктаза участвует на втором этапе флавиногенеза у всех эукариотических микроорганизмов.

2,5-Диамино-4-окси-б-рибозиламинопиримидин-5,-фосфатредуктазу выделяли из железодефицитных клеток P.guilliermondii АТСС 9058 при помощи двух процедур. Первая из них включала фракционирование белков сульфатом аммония при 45-75 % насыщения, гель-фильтрацию через сефадекс G-200 и хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. На всех этапах очистки происходила значительная инактивация редуктазы. Несмотря на удаление значительного количества балластных белков, удельная активность возрастала не более, чем в"5 раз; выход фермента составлял 3-5

Вторая, более быстрая процедура очистки редуктазы состояла из фракционирования белков ( NH^ so^npn 45-75 % насыщения и хроматографии на голубой сефарозе CL-6B . В то время как балластные белки элюируются при промывке колонки, исследуемый фермент прочно связывается с сорбентом. Специфическое элюирование 5 мМ растворои nadph позволяет очистить'редуктазу в 20 раз (удельная активность 0,2 Е/мг белка). Выход фермента составлял 5 При диск-электрофорезе в полиакриламидном геле препаратов редуктазы обнаружено 3 основных и 7 минорных белковых фракций.

Для исследования свойств редуктазы p.guilliermondii АТСС 9058 использовали препараты фермента, очищенные при помощи первой процедуры. Фермент презращает 2,5-диамино-4-окси-б-рибозиламинопирими-дин-5'-фосфат в 2,5 диамино-4-окси-б-рибитиламинопиримидин-5»-фосфат (рис. I). Дефосфорилирование субстрата щелочной фосфатазой приводит к полной потере ферментативной активности. Кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата имеет гиперболический вид; Кш= 5-Ю"5 М. Редуктаза проявляет-активность в присутствии nad РН и hash . Сродство фермента к NADPH ( Кш» 4,7.10" II) примерно на порддок выше, чем KHADH ( Кщ» 5,5-10 М). Среди ка- : тлонов не выявлено активаторов фермента. Редуктаза проявляет максимальную активность в 2-Ю"^ М три с- НС1 буфере или 2-10" Ы фосфатном буфере при рН 7,2. Повышение ионной силы буферного раствора до Ы0~* М приводит к снижению активности на 30-40 Температурный оптимум действия фермента находится при 37°С; при увеличении темпе-

ратуры выше 40°С активность резко снижается. Молекулярная масса редуктазы составляет 140 кДа. Удельная активность фермента не изменяется при варьировании концентрации белка в пределах 0,002-0,2 мг в I мл реакционной смеси. Фермент очень лабилен при 4°С и полностью инактивируется в замороженном состоянии при -15°С. РФ, fuu и fad в концентрации М не влияют на его активность.

2.3. Изучение третьей реакции биосинтеза РФ. катализируемой 2,5-диамино-4-окси-б-рибитиламинописимидин-5'-фосфатдезаминазой. В результате биохимического анализа РФ-зависимых мутантов дрожжей выяснено, что на третьем этапе флавиногенеза у этих организмов происходит гидролитическое дезаминирование 2,5-диамино-4-окси-б-риби-тиламинопиримидина ьо 2-ом положении. С целью более детального исследования этой реакции изучали продукты, образующиеся из gtp в присутствии NADFH под влиянием диализованных экстрактов железоде-фицитных клеток прототрофного штамма P.gullliermondii АТСС 9050. Показано (табл. 2), что в таких условиях продукт стр-циклогидро-казной реакции превращается преимущественно в 2,4-диокси-5-амино-б-рибитиламинопиримидин-5*-фосфат. В значительном количестве накапливался также 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидин. Указанные выше пиримидины не синтезируются в экстрактах мутантов p.gullliermondii RG80 и Н39 генотипа ribj . Из представленных данных можно заключить, что на третьем этапе флавиногенеза происходит дезаминирование продукта редуктазной реакции с образованием 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидин-5'-фосфата (рис. I). Фермент, катализирующий эту реакцию, 2,5-диамино-4~окси-6-рибитиламинопирими-дин-5*-фосфатдезаминаза у p.guilliermondii кодируется геном RIB3-

Разработан метод определения активности дезаминазы, участвующей во флавиногенезе дрожжей, основанный на превращении продукта реакции в присутствии диацетила во флуоресцирующий зеленим цветом ДМРЛ-фосфат и отделения его от других флуоресцирующих пигментов путем хроматографии на бумаге. При помощи этого метода определена дьзаминазная активность в экстрактах ряда видов дрожжей (см. табл. 5).

Препараты дезаминазы получали путем обработки экстрактов же-лезодефкцитных клеток P.guillierBondll АТСС 9053 стрептомицин сульфатом, осаждения белков сульфатом аммония при 45-75 £ насыщения и голь-фильтрации через сефадекс G-150 . После гель-фильтрации удельная активность фермента повышалась в 3-5 раз и достигала 0,005 белка. Молекулярная масса дезамнназы" составляет 190 «Да; КА я 0,3>l0 М; РФ, ?1£К и FXD в концентрации МО"4 М не влияют

на активность фермента.

2.4. Биосинтез ДМРЛ. АПР-синтаза и ДМРЛ-синтаза. Длительное время дискутировался вопрос о происхождении четырех атомов углерода, необходимых для превращения пиримидинового интермедиата флави-ногенеза в ДМРЛ. На основании экспериментов, проведенных in vivo , предполагалось, что донором четырехуглеродного фрагмента являются дикетоны, интермедиат пентозофосфатного цикла, гексоза, триоза.ри-битильный остаток молекулы 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопири-мидина ( см. обзор Шавловский, Логвиненко, 1985).

Мы создали бесклеточную систему, осуществляющую синтез ДМРЛ б диализованных экстрактах железодефицитных клеток мутанта p.guil-liermondii RGi23 (rib7) с блокированной Р$-синтазой. Пиримидино-вый субстрат 2,4-диокси-5-амино-б-рибитиламинопиримидин получали из OTP при помощи ферментов первого-третьего этапов флагвиногене-за, выделенных из клеток P.gullliermondii • В качестве возможного донора четырех атомов углерода испытывали ряд метаболитов углеводного обмена. Как видно из данных, представленных в табл. 3, при инкубации экстрактов железодефицитных клеток мутанта rlb7 с пирими-диновым субстратом и рибозо-5-фосфатом интенсивно образуется ДМРЛ.

Таблица 3. Влияние ряда метаболитов углеводного обмена на образование ДМРЛ в экстрактах железодефицитных клеток P.guillier-mondii АТСС 9058 и мутанта RG123(rib7)

Соединение, добавленное в реакционную смесь Мутант Дикий штамм

ДОЛ, мкМ ДОЛ +Р0, мкМ

Еез добавок 0 0

Рибозо-5-фосфат 19,0 22,0

Глюкозо-6-фосфат 2,0 2,0

5руктозо-б-фосфат 3,0 3,0

Рибоза 0,2 0,2

Рибитол 0 0

Глюкоза . 0,2 0,2

Йруктоза 0,2 0,2

Пируват+тиаминпирофосфат 0 0

В аналогичных опытах с экстрактами прототрофного штамма р. сиц_ Пегшопаи синтезировался также в небольших количествах РФ. Замена рибозо-5-фосфата на глюкозо-б-фосфат и фруктозо-6-фосфат приводит к слабому синтезу яюмазина; рибоза, рибитол, фруктоза, глюкоза

и пируват совместно с тиаминпирофосфатом были не активными. При инкубации с пиримидиновым субстратом и рибозо-5-фосфатом экстрактов мутантов P.guilliermondil RG20 (rib5). HG64 (rib6) и RG118 (г1Ь6)четвертой биохимической группы ДМРЛ не образуется. Из этих данных следовало, что для образования ДМРЛ, кроме пиримидинового субстрата, необходим донор четырех атомов углерода, которым может быть рибозо-5-фосфат или его метаболит.

Используя бесклеточную систему P.guilliermondil АТСС 905(3, Нильсен и соавт. (Nielsen at al. , 1934) подтвердили полученные нами данные, а также показали, что все атомы углерода пентозо-5-фос-фата, кроме С-4, включаются в молекулу РФ.

•Исследуя биосинтез ДМРЛ в экстрактах E.coli . Холлендер и соавт. (Hollander et al. , 1930) заключили, что этот процесс протекает в присутствии 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидина Или'его'фосфорного эфира в отсутствие других углеродсодержащих веществ. Однако нами показано, что для эффективного образования этого птеридина в экстрактах E.coli, кроме пиримидинового субстрата , также требуется рибозо-5-фосфат. По-видимому, биосинтзз ДМРЛ у E.coli протекает так же, как у дрожжей.

Проведена биохимическая и генетическая идентификация ферментов, участвующих в биосинтезе ДМРЛ у Кgullliermondii АТСС 9058. Из железодефицитных клеток путем фракционирования белков сульфатом аммония и гель-фильтрации через сефадекс G-150 выделена два белка - PI и Р2, осуществляющих синтез люмазина из 2,4-диокси-5-ами-но-э-рибитиламинопиримидина и рибозо-5-фосфата. Прибавление препаратов белка PI к экстрактам мутантов p.guilliermondil rib5 , а белка Р2 к экстрактам мутантов rlb6 восстанавливает у них способность к образованию ДМРЛ. Белки PI и Р2 лишь частично восстанавливают синтез люмазина в экстрактах мутанта P.guilliermondil ra65 (ribi) четвертой -биохимической группы. Из этих данных вытекает, что у P.guilliermondil синтез белка PI кодируется геном НГВ5 , а белка Р2 - геномHIB6 . Роль гена RIB4 в биосинтезе РФ не выяснена.

С целью изучения биохимических функций белков PI и Р2 экстракты железодефицитных клеток мутантов p.guilliermondil RG152(rib5), RG122 (rib5),RG64 (rib6) и RG118 (rib6) сначала проинкубировали ' с рибоэо-5-фосфатом, а затем определяли, в экстрактах каких мутантов происходит синтез люмазина из 2,4-диокси-5-амшо-6-рибитилами-кошриладина и продукта превращения рибозо-5-фоефата. Показано (табл. А), что синтез ДМРЛ протекает лишь при инкубации экстрактов

Таблица 4. Влияние продукта превращения рибозо-5-фосфата на синтез ДМРЛ в экстрактах мутантов P.guilliermondii rib5 и rib6

Штамм

ЭДутантный белок

Преинкубация рйбозо-5-фос-фата с экстрактами мутантов:

Концентрация ДОЛ, мкМ

HG122(rib5) RG64- (rib6) RG122, RG64

RG122(rib5) RG64 (г!Ьб)

PI Р2

PI Р2

Без преинкубации То же То же Преинкубация с: RG64 (rib6) RG122(rib5)

0.1 0,1

5,5

0,1

3,9

мутантов rib6 (активный белок PI) с пиримидиновьгм субстратом и продуктом превращения рибозо-5-фосфата под влиянием экстрактов мутантов rib5 (активный белок Р2). Реакция не осуществляется в экстрактах мутантов rib5 в присутствии пиримидинового субстрата и рибозо-5-фосфата, который предварительно инкубировали с экстрактами мутантов rib6 . Следовательно, белок Р2, продукт гена HIB6 , катализирует превращение рибозо-5-фосфата или другого пентозофосфата, тесно связанного с его метаболизмом, в непосредственный предшественник ДМРЛ (рис. I). Этот фермент условно обозначен синтазой алифатического предшественника РФ (АПР-синтаза). Белок PI, продукт гена RIB5 , является собственно ДМРЛ-синтазой, осуществляющей образование ДМРЛ из пиримидинового субстрата и продукта превращения ри-бозо-5-фосфата (рис. I).

Нами впервые разработаны флуориметрические методы определения АПР-сиитазы и ДМРЛ-синтазы. Определение активности АПР-скнтазы основано на превращении продукта реакции в присутствии 2,4-диокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидина в ДМРЛ под действием люмазинсинтазы.

Изучены некоторые свойства ферментов, участвующих в образовании ДМРЛ у P.guilliermondii АТСС 9058. Показано, что под действием АПР-синтазы из рибозо-5-фосфата образуется продукт, связывающийся с ДЭАЭ-целлюлозой, что предполагает наличие в нем фосфатной группы. АПР-синтаза активна в присутствии ионов lig2* ; молекулярная масса - 26 кДа. Фермент стабильный при 4°С и в замороженном состоянии при -15°С. РФ, FUS, F AD, ДМРЛ в концентрации 1-Ю"4 M, а тагосе адениловые цуклеотиды в концентрации 1-Ю"3 M не влияют на его активность .

ДМРЛ-синтаэа взаимодействует с двумя субстратами. Пирикидино-вым субстратом является 2,4-диокси-5-а).ино-0-риблтилзминопипиу;у^чн,

а не его фосфорный эфир - продукт третьей реакции флавиногенеэа. Второй субстрат, образующийся из рибозо-5-фосфата, по-видимому,содержит фосфатную группу, так как обработка AIP щелочной фосфатазой приводит к утрате ферментативной активности. Фермент обладает высоким сродством к пиримидиновому субстрату (i^ « I,2-l0-d М) и АПР (Кщ ■ 0,7'10"^ М). ДМРЛ-синтаза не требует для проявления активности кофакторов; молекулярная масса - 120 кДа; фермент характеризуется большой лабильностью при 4°С и полностью инактивируется в замороженном состоянии при -15°С. РФ, но не FAD , угнетает ДМРЛ-синтазу, по-видимому, по типу конкурентного мигрирования; [iJq t.-2-10"^ М. Активность фермента угнетается АТР, но не AMP.

2.5. Исследование некоторых свойств РФ-синтазы P.guilliermondii и Т.candida . Изучены некоторые свойства РФ-синтазы диали-эованных экстрактов P.guilliermondii, Т.candida и некоторых других видов дрожжей. Показано, что кривые зависимости скорости реакции от концентрации ДМРЛ для фермента p.guilliermondii и Т.candi-da имеют вид гиперболы; Кш равна соответственно 1,3-IGT0 М и 3,5-10"^ М. Оптимум действия РФ-синтазы этих организмов находится при pH 7,0-7,5 и температуре 37-40°С. Фермент T.candida быстрее инактивируется при повышении температуры вше 40°С, чем фермент p.guilliermondii . РФ-синтаза этих видов дрожжей отличается также по чувствительности к 6-метил-7-окси-8-рибитиллюмазину, который в концентрации 1-Ю"4 М на 95 # угнетает активность фермента T.candida, но не p.guilliermondii.

РФ, FMN и FAD в концентрации 1-Ю-4 М не влияют на РФ-син-тазу P.guilliermondii, T.candida,C.utllis и p.ohmeri • На основании того факта, что РФ ингибирует РФ-синтазу S.cerevisiae , но не* A.gossypii (Harvey, Plaut , 1966 X возникло предположение^De-main , 1972), что у нефлавиногенных дрожжей РФ может регулировать собственный синтез. Из наших данных вытекает, что ингибирование продуктом реакции не является общим свойством РФ-синтазы нефлавиногенных дрожжей.

Нами разработан эффективный метод определения РФ-синтаэи в пермеабилизованных при.помощи дигитонина клетках дрожжей. Этот агент вызывает вскрытие клеток P.guilliermondii ■ не при 0°С, как описано в оригинальном методе ( Volland et al. > 1975 \ а при 30°С. Поскольку дигитонин не угнетает РФ-синтазу дрожжей, пермеаби-лизованные клетки можно сразу без промывания использовать для исследования ферментативной активности, что значительно упрощает процедуру анализов.

3. Изучение регуляции образования ферментов биосинтеза РФ у дрожжей.

3.1. Роль ионов железа в регуляции образования ферментов фла-виногенеза у дрожжей - сверхсинтетиков РФ. Со времени обнаружения сверхсинтеза РФ у P.euilliermondii и Т.candida (Tanner et al. , 1945), а затем и у других видов дрокжей, культивируемых в железо-дефицитных средах, рад авторов безуспешно пытались объяснить это явление (см. обзор Шавловский, Логвиненко, 1983).

Мы изучили активность ферментов биосинтеза витамина &> у ряда видов флавиногенных и нефлавиногенных дрожжей, выращенных в средах с высоким (0,2 иг/я) и низким (0,005 мг/л) содержанием ионов железа. Показано (табл. 5), что в железодефицитных клетках

Таблица 5. Влияние концентрации ионов железа в среде на образование РФ и активность ферментов этого процесса у дрожжей

Вид и штамм •Концент- РФ. мг/г клеток Активность,Е/мг белка-10"^

дрожжей 'рация ¡ионов ркелеза !в среде * |мг/л GTP-цикло-гидролаза Ре- дук- таза Деза-мина-за АПР-син-таза дарл- син-таза РФ^ синтеза

P.guilliermon-dii АТСС 9058 g.005 xí:f ] т т TIS

T.candida 0,005 0,2 loo:l 4á 188,0 115,0 130,4 23,1 78,8 1,1 163,3 ш,5 20,9 3,3

D.kloeckeri 0,005 0,2 2 fci II.4 0,2 178,0 84,0 315,4 44,1 73,0 1,7 319,0 19,1

S.occidentalia 0.005 0,2 I 84,3 54,3 74,0 1,7 236,2 22)9 34,2 4,5

P.guillieriLon-dii 1453 0,005 0*2 olí 0,5 0|б 60,8 65) 8 69,4 2,5 1,8 12,9 12,5 0,8 1,6

C.utllis 0,005 0,2 0,1 0,1 26,0 25,0 8,2 15,2 2,1 2l3 2,6 7,0

C.pulcherrima 0,005 0,2 1,1 0.1 2,0 6,3

F.ohmerl 0,005 0,2 0,8 0,1 » 2,7 2|0

( (

P.guilliermondii АТСС 9058, Т.candida, D.kloeckeri и S.oociden-talis , осуществляющих сверхсинтеэ РФ, активность GTP -циклогид-ролазы возрастает в 30-50 раз, дезаминазы - в 3-7 раз, АПР-синта-зы - в 30-70 раз, ДМРЛ-синтазы - в 12-16 раз и РФ-синтаэы - в 8-34 раза по сравнению с уровнем активности соответствующих ферментов в богатых железом клетках. Редуктазная активность слабо повышается (в 1,5-2 раза) в железодефицитных клетках т.candida и D.kloeckeri , но не в клетках F.guilliermondil (табл. 5). Не обнаружено различий в активности соответствующих ферментов биосинтеза РФ у железодефицитных и богатых железом клетках нефлавиноген-ных дрожжей P.ohmerl, C.utilis И штамма P.guilliermondii 1453 (табл. 5).

Более детально изучено влияние ионов железа на регуляцию активности GTP -циклогидролазы и РФ-синтаэы у P.guilliermondii и T.candida . Показано, что максимальная GTP -циклогидролазная и флавиногенная активность наблюдается в клетках P.guilliermondii АТСС 9053, выращенных в средах, содержащих 0,005-0,01 мг ионов железа в I л. Увеличение концентрации ионов этого металла до 0,02 мг/л вызывает одновременно резкое снижение GTP -циклогидролазной активности и накопления витамина Bg в среде (рис. 3). Б процессе роста p.guilliermondii в среде с высоким содержанием ионов железа активность GTP -циклогидролазы понижается, а РФ-синтазы повышается примерно в два раза в клетках из стационарной фазы. При выращивании в железодефицитной среде, наоборот, происходит резкое увеличение GTP -циклогидролазной (рис. 4) и РФ-синтазной активности при торможении роста клеток в ранней стационарной фазе в период активного образования витамина Bg. Прибавление ингибитора белкового синтеза циклогексимида или ионов двухвалентного железа к молодым железодефицитным клеткам, обладающим еще низкой удельной активностью этих ферментов, приостанавливает повышение их активности при дальнейшем культивировании дрожжей (рис. 4). Аналогичные данные получены при исследовании влияния циклогексимида и ионов железа на возрастание активности дезаминазы и АПР-синтазы в процессе роста T.candida и P.guilliermondii в железодефицитной среде. Полученные данные свидетельствуют о том, что yF.guilller-mondii, T.candida и,очевидно, у других видов дрожжей, осуществляющих сверхсинтеэ РФ при дефиците железа, этот металл участвует в координированной регуляции образования почти всех (за исключением редуктазы) ферментов биосинтеза витамина Б^. Дерепрессия ряда фер-

JC

Концентраций Fe, мг/л

Рис.3. Зависимость йТР-циклогидролазной активности (^.накопления РФ в среде (2) и биомассы (3) клеток р.киШ.1ег- ' иоп<111 АТСС 9058 от концентраций ионов железа в среде.

^ 20 Г»

е

SJ 16

1ГГ 12 <

§ 8 о

а «*

гх

ё и

ш

zt

d. 0 у—

CS

500 i

. kz 300 *

200 К §

3

100

е-

16 2<<

60

5i

JE

L ни 1 0

32 a0 aft Время, ч

Рис.4. Изменение GTP-циклогидролазной активности (I),скорости флавиногенеза (2) и биомассы (3) клеток P.guilliermondii АТСС 9058 при вырагцивании в среде, содержащей 0,005 мг ионов железа в I л. 4 -циклогексимид, 20 мг/л ; 5 - fe2+ 0.2 мг/л.

Ь

ментов данного пути в железодефицитных клетках является основной причиной сверхсинтеза РФ у этих организмов.

Стимуляцию флавиногенеза у дрожжей можно вызвать путем инкубации клеток, предварительно выращенных на полноценной среде, с хедатирующим соединением оС,и'-дипиридилом, обладающим высоким сродством к ионам двухвалентного железа. Б таких условиях выявлена положительная корреляция между возрастанием скорости флавиноге-неза и удельной активности GTP-циклогидролазы у P.guilliermondii и РФ-синтазы у т.candida (рис. 5). Циклогексимид предотвращает действие этого хелатора (рис. 6). По-видимому, в регуляции флави-ногенеза у дрожжей железо участвует в .ионной форме (предположительно в виде Fe ).

С целью исследования вопроса, на каком уровне - трансляции или транскрипции - ионы железа участвует в регуляции образования ферментов биосинтеза РФ, изучали влияние ингибитора транскрипции актиномицина D на дерепрессию РФ-синтазы, синтез нуклеиновых кислот и белков у селекционированного нами мутанта т.candida mst2 , чувствительного к низким концентрациям антибиотика. Дефицит ионов железа создавали путем инкубации клеток с rf,*' -дипиридилом. Показано, что актиномицин D в сравнительно низкой концентрации (20 мкг/мл) подавляет включение [2-C^J гуанина в нуклеиновые кислоты на 70 % и не оказывает существенного влияния на включение ^С-лейцина в белки. При инкубации штамма mst2 с -дипиридилом

активность РФ-синтазы возрастала в 3 раза; актиномицин D сильно угнетал этот процесс (табл. б). Актиномицин D блокирует также

Таблица 6. Влияние актиномицина D на дерепрессию РФ-синтазы в клетках мутанта Т.candida MST2

Соединение, прибавленное в инкубационную среду

Активность РФ-синтазы, Е/иг клеток-Ю-0'

Без добавок 2,9

о^'-Дипиридил, 60 мкг/мл 9,0

То же и актиномицин, 20 мкг/мл 4,6

То же и актиномицин, 100 мкг/мл 4,3

дерепрессию OTP -циклогидролазы у мутанта P.guilliermondii Ш1-37, чувствительного к низким концентрациям антибиотика. На основании

с о о 4

s:

о 3 ю

2

4

Время ншбацш.ч

Рис. 5. Зайисимость РФ-синтазной активности (I), скорости флави-ногенеза (2) и биомассы (3) клеток т.еапйЫа от времени инкубации с -дипиридилом.

Концентрация «*,«<' -дипиридила 50 мг/л.

Рис. 6.

as 1,0 3fi 9.0

концеитрацкя докаогекшша. нгг/ма

Влияние различных концентрата циклогексимида на РФ-син-тазную активность (I) и скорость флавиногенеза (2) клеток Т.candida при инкубации с «c,«t' -дипиридилом.

Концентрация -дипиридила 60 мг/л; биомасса пе-

ред инкубацией I мг/мл; время инкубации В ч.

этих данных сформулирована гипотеза, согласно которой ионы железа в качестве корепрессора участвуют в регуляции образования ферментов биосинтеза РФ на уровне транскрипции.

3.2. Исследование влияния флавинов на образование РФ-синтаэы.

Клетки и протопласты P.euilliermondii и c.utilis инкубировали с РФ (200 мкг/мл) и без него. В присутствии высоких концентраций витамина Bg общее содержание флавинов в клетках этих видов повидалось соответственно на 20 и 30 а в протопластах -на 92 и 57 Увеличение внутриклеточной концентрации флавинов не оказывало влияния на РФ-синтазную активность интактных клеток и протопластов этих организмов.

При инкубации РФ-зависимых мутантов p.guilliermondll r7a и Е9АЬ T.candida R7 и p.ohmerl R32 в среде без витамина происходит понижение общего содержания флавинов в 4-6 раз, что однако не отражается на РФ-синтазной активности клеток. У P.guUlier-nondii флавины не участвуют в регуляции образования GTP-цикло-гидролаэы (Колтун, 1980), РФ-киназы (Шавловский и соавт., 1975) и ATP; FMN -аденилилтрансферазы (Шавловский, Федорович, 1977). По-видимому, у исследованных нами видов флавиногенных и нефлавиноген-ных дрожжей синтез ферментов флавиногенеза не регулируется механизмом отрицательной обратной связи с участием флавинов.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящая работа является первым систематическим исследованием химизма биосинтеза РФ у дрожжей в опытах in vitro . Важной вехой в познании путей образования витамина Bg У микроорганизмов явилось обнаружение у E.coli ( Foor, Brown , 1975) и нами у р. guillieraondii и T.candida нового фермента GTP -циклогидрола-зы, катализирующего первую реакцию флавиногенеза, и установление роли GTF как пуринового предшественника РФ. Получение очищенных препаратов GTF-циклогидролазы из клеток этих организмов позволило осуществить ферментативный синтез пиримидиновых предшественников РФ из GTP , более подробно изучить их природу, а затем использовать в качестве субстратов для исследования свойств рада ферментов флавиногенеза. При этом было показано, что биосинтез РФ у про-кариотических ( Burrowe„ Brown « 1978) и эукариотических микроорганизмов отличается очередностью протекания реакций дезаминиро-вания и восстановления рибозильной группы пиримидиновых интерме-диатов.

Важным результатом настоящей работы является установление роли рибозо-5-фосфата как углеводного предшественника витамина Bg у дрожжей и в.coli . Под влиянием специфического фермента АПР-синтазы, выделенного до сих пор только из клеток P.guilliermon-dii , рибозо-5-фосфат или, возможно, другой тесно связанный с его метаболизмом пентозо-5-фосфат (ксилулозо-5-фосфат, рибулозо-5-фосфат) превращается в непосредственный донор четырех атомов углерода, необходимых для синтеза ДМРЛ из пиримидинового предшественника. Субстратная специфичность этого фермента и продукты реакции пока не изучены. ДМРЛ-синтаза дрожжей, а также B.subtilis (Neubörger, Bacher , 1986) использует в качестве субстрата 2,4-ди-окси-5-амино-б-рибитиламинопиримидин, а не его монофосфорный эфир, образующийся на третьем этапе флавиногенеэа. Это ставит вопрос об участии во флавиногенезе фосфатазы, гидролизующей продукт третьей реакции данного процесса. Предстоит выяснить, является ли она специфичной.

В настоящее время исследование химизма биосинтеза РФ у Дрожжей (рис. I) и бактерий близится к завершению. Сложный гетероцикл витамина Bg образуется из продуктов пуринового и углеводного обменов. Этот процесс катализирует не менее шести специфических ферментов, свойства которых (за исключением РФ-синтазы} еще слабо изучены.

Успехи, достигнутые в энзимологии флавиногенеэа, открыли широкие возможности для исследования механизмов регуляции этого процесса у различных видов микроорганизмов. До сих пор такие работы проводились лишь с p.guilliermondii „ некоторыми другими видами дрожжей и B.subtilis , слабо синтезирующих РФ на полноценных средах. У этих организмов флавиногенез регулируется по принципу отрицательной обратной связи. У рада видов дрожжей ( p.guilliermondii, T.candida и некоторых других) обнаружено ретроингибирование GTP-циклогидролазы, а у метилотрофных дрожжей Hansanula polymorphs выявлена репрессия и инактивация трех заключительных ферментов флавиногенеэа ( Brooke et al. , 1986), в которых участвует fad . У B.subtilis функционирует механизм репрессии всех ферментов этого процесса продуктом универсального регуляторного гена с участием РФ, FMN и FAD (Перумов, I93C). Представляет интерес исследование механизмов регуляции флавиногенеэа у других видов микроорганизмов, особенно у E.ashbyii и A.gossypü , у которых селекционированы наиболее активные продуценты витамина Б^.

У микроорганизмов ионы железа являются не только кофакторами каталитических: систем, но выполняет также регуляторные функции в биосинтезе ряда белков и ферментов (см. обзор Шавловский, Лог-виненко, 1988). Нами впервые установлено, чТо ионы этого металла участвуют в координированной репрессии образования почти всех ферментов биосинтеза РФ у P.guilliermondii, T.candida и других видов дрожжей, осуществляющих сверхсинтез витамина Bg в условиях дефицита ионов железа. Исследование генетического контроля образования ферментов данного процесса у p.guilliermondii позволило выявить сложную регуляторную систему, состоящую не менее чем из двух генов позитивного типа действия (rib83.rib84), н также двух генов негативного типа действия ( rib80, rib81 ), продукты которых проявляют активность в присутствии ионов железа (Шавловский и соавт., 1985, 1937, 1988). Рад регуляторных генов флавино-генеза контролирует также транспорт ионов железа в дрожжевые клетки (Шавловский, Федорович, 1985, 1987). Исследование функций продуктов регуляторных генов флавиногенеза и транспорта ионов железа, характера их взаимодействия между собой и с ДНК является удобной моделью для выяснения того, как эукариотическая клетка контролирует образование кофакторов дыхательной цепи, а также других структур, связанных с окислительно-восстановительной активностью.

ВЫВОДЫ

1. Проведена биохимическая классификация селекционированных РФ-зависимых мутантов флавиногенных дрожжей P.guilliermondii .Мутанты разделены на пять биохимических групп. Мутанты первой группы не синтезируют специфических интермедиатов флавиногенеза. Мутанты последующих групп накапливают в среде соответственно 2,5,6-триамино-4-оксипиримидин, 2,5-диамико-4-окси-о-рибитиламинопири-мидин, 2,4-дйокси-5-амино-6-рибитиламинопиримидин и ДМРЛ.

2. У P.guilliermondii впервые обнаружено и охарактеризовано пять специфических ферментов флавиногенеза: ОТР-циклогидрола-эа, 2,5-диамино-4-окси-6-рибозиламинопиримидин-5'-фосфатредукта-за, 2,5-диамино-4-окси-6-рибитиламинопиримидин-5'-фосфатдезамина-за, ДМРЛ-синтаза и АПР-синтаза, которые кодируются соответственно генами RIB1, RIB2, RIB3, RIB5 и RIB6 . Разработаны флуориметри-ческие методы определения активности этих ферментов.

3. Первую реакцию флавиногенеза осуществляет OTP -циклогидро-лаза, превращающая OTP в 2,5-диамино-4-окси-6-рибозиламинопирими-

Ai

дин-5*-фосфат и пирофосфат. Проведена частичная очистка фермента p.guilliermondii и изучены его основные свойства (субстратная специфичность, влияние активаторов и ингибиторов, оптимума pH и температуры, молекулярная масса, стабильность, зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, эффектора и белка).

4. Вторую реакцию флавиногенеэа у дрожжей и мицелиальных грибов катализирует NADPH -зависимая 2,5-диамино-4-окси-6-рибо-зиламинопиримидин-б'-фосфатредуктаза, которая восстанавливает пи-римидиновый продукт GTP-циклогидролазной реакции в 2,5-диамино-4-окси-б-рибитиламинопиримидин-5'-фосфат. Проведена частичная очистка фермента p.guilliermondii и изучены его основные свойства (влияние активаторов, катионов, оптимумы pH и температуры, молекулярная масса, стабильность, кш для субстрата и коферментов).

5. Третью реакцию флавиногенеза у дрожжей осуществляет 2,5-диамино-4-окси-б-рибитиламинопиримидин-5'-фосфатдезаминаза, превращающая продукт редуктазной реакции в 2,4-диокси-5-амино-б-риби-тиламинопиримидин-5*-фосфат. Определены кщ и молекулярная масса фермента Р. guilliernondil.

5. Впервые показано, что рибозо-5-фосфат является предшественником РФ у дрожжей и в.coli . Под действием АПР-синтазы он превращается в фосфорйлированный продукт АПР - непосредственный донор четырех атомов углерода для образования ДМРЛ. Активность АПР-синтазы зависит от ионов Mg2"*" . Охарактеризованы молекулярная масса и стабильность фермента P.guilliermondii.

7. ДМРЛ-синтаза осуществляет синтез ДМРЛ из 2,4-диокси-5-амино-б-рибитиламинопиримидина и АПР. Охарактеризованы значения

Кщ для субстратов и молекулярная масса фермента P.guilllereon-dii.

8. Изучены некоторые свойства РФ-синтазы P.guilliermondii

и Т.candida . Выявлены как общие черты (характер зависимости скорости реакции от концентрации субстрата), так и различия (чувствительность к повышенной температуре, ингибитору б-метил-7-окси-8-рибитиллюмазину) в свойствах фермента у этих организмов.

9. Конечный продукт флавиногенеэа FAD , а также нуклеотиды, содержащие остаток адениловой кислоты, угнетают ОТр-циклогидро-лазу P.guilliermondii, T.candida и D.kloeckerl • Регуляторные свойства OTP -циклогидролазы полностью утрачиваются при низких концентрациях ферментного препарата, что свидетельствует об алло-стерической природе этого фермента и лабильности его структуры.

Ретроиш'ибирование флавиногенеза обнаружено в опытах in vivo у РФ-зависимых мутантов P.guilliermondii, p.ohmeri и S.cerevisiae.

10. У флавиногенных ( Р; guilliermondii, T.candida ) и Не-флавиногенных ( Р. ohmer i, c.utilia ) дрожжей флавины не участвуют в регуляции образования РФ-синтазы.

11. Установлено, ЧТО у P.guilliermondii, T.candida, D.kloe-ckeri и s.occidentails железо участвует в координированной репрессии образования всех (кроме редуктазы) ферментов биосинтеза РФ. Основной причиной сверхсинтеза РФ у этих организмов при лимитировании их роста ионами железа является дерепрессия ряда ферментов данного пути.

12. В процессе инкубации клеток.P.guilliermondii и T.candida с <Я,<а/ -дипиридилом, обладающим высоким сродством к ионам двухвалентного железа, происходит дерепрессия ОТР-циклогидрола-зы и РФ-синтазы, которую блокирует актиномицин D . Сформулирована гипотеза об участии в регуляции биосинтеза ферментов флавиногенеза у дрожжей репрессора, содержащего в качестве корепрессора ионы железа.

Список основных работ по теме диссертации:

1. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М., Трач В.М. Изменение активности рибофлавинсинтетазы при различных уровнях флавиногенеза у некоторых видов дрожжей Candida // Докл. АН СССР.- 1972.- 203, Jí I.- С. 241-244.

2. Логвйненко Е.М., Шавловский Г.М., Колтун Л.В. Получение и некоторые свойства рибофлавинзависимых мутантов дрожжей Pichia guilliermondii wickorham // Микробиология.- 1972.- 41, в. 6.-С. II03-II04.

3. Исследование роли флавинов в регуляции синтеза рибофлавинсинтетазы у дрожжей Pichia guilliermondii и Candida utilis /Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский, В.М.Трач, В. А.Сибирный // Микробиология.- 1973.- 42, в. 6,- С. I003-I0I3.

4. Природа предшественников рибофлавина у дрожжей Pichia guilliar-Bondii /Е.М.Логвйненко, Г.М.Шавловский, Л.В.Колтун, Г.П.Кше-минская // Микробиология.- 1975.- 44, в. I.- С. 48-54.

5. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М., Колтун Л.В. 0 механизме ре-троингибирования в регуляции флавиногенеза у дрожжей рода pichia //Микробиология.- 1975.- 44, в. I,- С. I7I-I73.

6* Die regulation der Synthase Riboflavinsynthetase durch Siaen in flavinogenen Hefen / G.M.Shavlovsky, K.K.LOgvinenkCB У.М. Trech, E.Z.Senjuta // Biochem. Physiol. Pflanzen. -1975« -16?, N 5. - S.379-38?.

7. Биосинтез флавинов и его регуляция у дрожжей Pichia guillier-mondli /Г.М.Шавловский, Е.М.Логвиненко, Л.П.Струговщикоэа, В.Е.Кащенко // У|ф. tfioxiu. журн.- 1975.- 47, * 5.- С. 649660.

8. Участие флавинов и железа в регуляции скорости первой реакции флавиногенеза у дрожжей pichia guilliermondii / Г.Ы.Шавловский, Е.М.Логвиненко, Д.Шлее, Л.В.Колтун // Докл. АН СССР.-1976.- 226, » I.- С. 217-220.

9. Об участии механизмов ретроингибирования и репрессии в регуляции флавиногенеза у дрожжей,/ Г.Ы.Шавловский, Е.М.Логвиненко, В.М.Трач, Л.В.Колтун // Сб. Витамины.- Киев: Наукова думка, 1976.- 9.- С. 99-104.

10. Regulation of 6-hydroxy-2,4,5-triaminopyrlmldine synthesis by riboflavin and iron in riboflavin-deflcient mutants of pichia guilliermondii / G.U.Shavlovaky, E.M.Logyinenko, D.Schlae,

L.V.Koltun // Biochim. et biophys. acta. - 197&» -428, H 2. -P. 611-618.

11. Обнаружение фермента первого этапа флавиногенеза ГТФ-циклогидролазы у дрожжей pichia guilliermondii / Г.Ы.Шавловский, Е.М. Логвиненко, В.Е.Кащенко и др. // Дохл. АН СССР.- 1976.- 230,

№ 6.- С. I485-1487.

12. Регуляция железом синтеза ГГФ-циклогидролазы,, участвующей во флавиногенезе дрожжей / Г.Ы.Шавловский, В.Б.Кащенко, Л.В.Колтун и др. // Микробиология.- 1977.- 46, в. 3.- С. 578-580.

13. Изучение активности некоторых ферментов флавиногенеза у дрожжей in situ / Е.М.Логвиненко, В.М.Трач, В.Е.Кащенко и др. // Биохимия.- 1977.- 42, * 9.- С. 1649-1654.

14. Origin of the ribityl chain of riboflavin from the ribose moiety of guanosine triphosphate in Pichia guilliermondii yeast / J.Uiersch, E.M.Logvinenko, A.S.Zakalsky et al. // Biochim. et biophys. acta. -1976.- 5^3. H 1. -P. 305-312.

15. Логвиненко Е.М., Шавловский Г.М., Закальский A.E. 0 продукте второго этапа биосинтеза рибофлавина у дрожжей pichia guilliermondii // Микробиология.- 1979.- 48, в. 4.- С. 755-758.

16. First reaction of riboflavin biosynthesis catalysis by a guano-

eine triphoaphate cyclohydrolase from yeast / G.M.Shavlov-8ky„ E.M.Lcgvinenko, R.Benndorf.et al. // Arch. Ulcrobiol.-1980. -124-е м 2-3. -P. 255-259«

17. Обнаружение фосфорилированных пиримидиновых предшественников рибофлавина у дрожжей / Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский, Л. Е. Закальский, Э.З.Сенюта // Биохимия.- 1980.- 45, К 7.- С.1284-X29I.

18. Влияние железа, актиномицина В и циклогексимида на синтез ГТФ-циклогидролазы у флавиногенных дрожжей / Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский, А.Е.Закальский, И.В.Заходыло // Биохимия.-1982.- 47, * I,- С. 28-33.

19. Об активности фермента второго этапа флавиногенеза 2,5-диами-но-6-окси-4-рибозиламинопиримидин-5'-фосфатредуктаэы у дрожжей Pichia guilliermondii / Г.М.Шавловский, Е.М.Логвиненко, А.А.Сибирный и др. // Микробиология.- 1981.- 50, в. 6.-

С. I008-I0II.

20. Биосинтез 6,7-диметил-8-рибитиллюмазина в экстрактах дрожжей Pichia guilliermondii / Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский,

А.Е.Закальский, И.В.Заходыло // Биохимия.- 1982.- 47, » 6.-С. 931-936.

21. Der Sinfluss von Transcriptioninhibitoren auf die Derepression der Riboflavinaynthase in der Hefe Torulopsis Candida / V.II. Trach, E.M.Logvinenko, D.Schlee und and. // Blochen. Fhysiol. Pflanzen. - 1982. -177, N 3. - S. 585-592.

22. Шавловский Г.М., Логвиненко E.M., Закальский A.E. Очистка и некоторые свойства ГТФ-циклогидролазы дрожжей Pichia guilliermondii U Биохимия.- 1983.- 48, » 5.- С. 837-843.

23. Логвиненко Е.М., Шавловский Г.М., Царенко Н.Ю. Участие железа в регуляции образования 6,7-диметил-8-рибитиллюмазинсинтазы

у флавиногенных дрожжей // Биохимия.г 1984.- 49, №.1.- С. 4350.

24. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. ГТФ-циклогидролазы микроорганизмов и их роль в обмене веществ // У1ф. биохим. журн.-1984.- 56, * 5.- С. 689-698.

25. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Биогенез, флавинов у дрожжей // Укр. биохим. журя.- 1985.- 57, * 4.- С. 98-112.

26. Логвиненко Е.М., Шавловский Г.М., Царенко Н.Ю. Белки 6,7-диме-тил-8-рибитиллюмазинсинтазной системы дрожжей Pichia guilliermondii и регуляция их биосинтеза // Биохимия.- 1905,- 50, * 5,- С. 744-748. . .

27. Логвиненко Е.М., [Павловский Г.М., Конторовская Н.Ю. О природе пиримидинового субстрата 6,7-диметил-8-рибитиллюмазинсин-тазы, участвующей в о'иосинтезе рибофлавина у дрожжей // Укр. биохим. журн.- 1987.- 59, » I.- С. 80-82.

28. Логвиненко Е.М., ¡Павловский Г.М., Конторовская Н.Ю. О биохимических функциях продуктов генов RIB5 и RIB6 , участвующих

в биосинтезе рибофлавина у дрожжей Pichia guilliermondil // Генетика.- 1987.- 23, # 9.- С. I699-I70I.

29. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Роль железа в регуляции синтеза белков у микроорганизмов // Успехи микробиологии.- 1988.22.- С. 108-133.

30. Участие железа в регуляции синтеза фермента третьего этапа флавиногенеза 2,б-диамино-^-окси-б-рибитилаигаопиримидин-б* -фосфатдезаминаэы у дрожжей / Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский, Н.Ю.Конторовская, А.Е.Закальский // Микробиология.- 1988.57, в. 2.- С. I8I-I85.

31. Шавловский Г.М., Логвиненко Е.М. Сверхсинтез флавинов у микроорганизмов и его молекулярные механизмы // Прикл. биохим. и микробиол.- 1988,- 24, » 4.- С. 435-447.

32. О регуляции активности и синтеза ферментов, участвующих в образовании предшественника рибофлавина 6,7-диметил-8-рибитил-люмазина у дрожжей / Е.М.Логвиненко, Г.М.Шавловский, А.Е.За-кальский, В.А.Самарский // Укр. биохим. журн.- 1989.- 61, J? I.-С. 28-31.

Материалы диссертации опубликованы также в трудах следующих конференций, симпозиумов и съездов: конференции Европейских биохимических обществ (Варна, Болгария, 1971; Дрезден, ГДР, 1978); Международных симпозиумах по метаболизму дрожжей (Отаниеми, Финляндия, 1973; Монпелье, Франция, 1978 и 1984); симпозиуме "Регуляция микробного метаболизма факторами внешней среды" (Цущино,1983); УШ объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (Рига, 1985); Всесоюзных биохимических съездах (Рига, 1974; Ленинград, 1979; Киев, 1986); съездах Всесоюзного микробиологического общества (Ереван, 1975; Рига, 1980; Алма-Ата, 1985); Украинского биохимического общества (Днепропетровск, 1982; Ивано-Франковск, 1987); Украинского микробиологического общества (Киев, 1975; Днепропетровск, 1980; Донецк, 1984; Черновцы, 1989); Всесоюзных конференциях "Вторичные метаболиты" (Пущино, 1985), "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989), "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988).

Подписано к печати 6.07.69. ЕГ Ю4^.Формат 60хС4Л6.

Печать офсетная. Бумага офсетная.Усл.печ.л. 1,86./сл.кр.-отт.С, Уч,-изд.л.1,82.Тирая 100 г>кз. Гесплатнэ. За::. 2£7С. Областная книжная типография, 290000,Львов,ул. Стланика, хж.'.