Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура, организация и регуляция генов биосинтеза рибофлавина у Bacillus amyloliguefaciens и bacillus subtilis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структура, организация и регуляция генов биосинтеза рибофлавина у Bacillus amyloliguefaciens и bacillus subtilis"

Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

СТРУКТУРА, ОРГАНИЗАЦИЯ И РЕГУЛЯЦИЯ ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА РИБОФЛАВИНА У BACILLUS AMYLOLIOUEFAC1ENS И BACILLUS SUBTILIS

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

ГУСАРОВ ИВАН ИГОРЕВИЧ

Москва 1997

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научные руководители:

доктор биологических наук Д. А. Перумов

кандидат биологических наук Ю.А.В. Йомантас

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, проф. А.И. Степанов доктор биологических наук, проф. A.C. Миронов

Ведущая организация - Институт биоорганической химии им. Ю.А. Овчинникова и М.М. Шемякина РАН

Защита состоится "10" июня 1997 г. в 14 час. 00 мин, на заседании диссертационного совета Д 098.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генеггикк и селекции промышленных микроорганизмов по адресу : 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ГосНИИ генетика.

Автореферат разослан

1997г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность темы. Рибофлавин (витамин В2) функционирует в клетках в коферментных формах, представляющих собой его фосфорные зфиры: флавинмононуклеотид (ФМН) и флавинадениндинуклеотид (ФАД). Эти вещества являются обязательными участниками многих окислительно-восстановительных реакций. В отличие от растений и большинства микроорганизмов, рибофлавин, в животных клетках не синтезируется: Этим и объясняется широкое применение флавинов в пищевой промышленности и в медицине. Учитывая важность перечисленных выше соединений, были разработаны промышленные технологии получения рибофлавина с использованием микроорганизмов. Основными микроорганизмами, используемыми для биосинтеза рибофлавина, являются: актиномицеты Ashbya gossypii и E.ashbyii, некоторые дрожжи Saccharomyces ■ cereviúae и Pichia guilliermondii, и Bacillus sub lilis.

В генетическом и биохимическом отношении биосинтез рибофлавина лучше всего изучен у B.subiilis (Миронов В. и соавт. 1990, Perkins, J. 1993). Рибофлавиновый оперон B.subtilis представляет собой группу из пяти неперекрывающихся структурных генов, расположенных на 209° генетической карты, транскрибируемых и регулируемых совместно. Экспрессия оперона негативно регулируется продуктом гена ribC, расположенным на 147° генетической карты, кодирующим' предположительно апорепрессор. Эффекторами регуляции являются рибофлавин, ФМН и ФАД. В регуляции транскрипции участвует операторная область, которая находится между промотором и первым структурным геном оперона. Однако, механизм регуляции транскрипции оперона пока не известен.

B.amyloliquefaciens считается близким родственником B.subtilis. Известно, что штаммы B.amyloliquefaáens являются хорошими продуцентами пуринов. Следовательно, использование данной бактерии может быть перспективно в целях создания штаммов продуцентов рибофлавина. К началу работы практически ничего не было известно о биосинтезе рибофлавина у B.amyloliquefaciens, кроме того что гены биосинтеза также тесно сцеплены на хромосоме, как и у B.subtilis, что позволяет предположить существование оперона (Joman tas,-J.-1991).

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение биосинтеза рибофлавина у бацилл. Для осуществления поставленной цели были решены следующие задачи:

1. Клонирование генов биосинтеза рибофлавина B.amyloliquefaciens и определение их нуклеотидной последовательности; х

2. Изучение экспрессии данных генов в клетках B.subtilis.

3. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена ribC B.subtilis.

4. Определение ферментативной активности продукта гена г ib С.

Научная новизна и практическая значимость. Клонированы гены

биосинтеза рибофлавина B.amyloIiquefaciens, а также ген г ib С B.subiilis. Определена нуклеотидная последовательность данных генов. Обнаружено, что структура и организация генов биосинтеза рибофлавина у B.amyloliquefaciens и B.subiilis практически полностью совпадает. Установлено, что рибофлавиновый оперон- В.amyloliquefaciens узнается регуляторной системой B.súbtilis. Обнаружены две операторные мутации В.amyloliquefaciens, приводящие к конститутивному синтезу рибофлавина, расположенные в той же консервативной области, что и рггуляторные мутации B.subtüis. В результате изучения экспрессии генов рибофлавинового оперона В.amyloliquefaciens в различных штаммах B.subtilis, установлено, что продукт гена ribC способен регулировать экспрессию биосинтетических генов обоих оперонов. После определения нуклеотидной последовательности гена г ib С, оказалось, что белок кодируемый данным геном имеет значительную гомологию с рибофлавин-киназной/ФАД-синтазной Corynebacteñum ammoniagenes и E.coli. Показано, что продукт гена 'ribC действительно обладает рибофлавин-киназной/ФАД-синтазной активностью.

Структура работы. Диссертация изложена на J03 стр машинописного текста, включая 15 рисунков и 7 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей условия проведения экспериментов, полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка использованной литературы (106 наименований).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на семинарах отдела биотехнологии ГосНИИгенегика, Москва, 1996,1997.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий, плазмиды и фат. Все использованные в работе штаммы B.subtilis, В.amyloliquefaciens и E.coli получены из центрального музея. ГНИИгенетики: ДНК плазмид'pUCl8 и pTZ19RJLl,- а также ' бактериофагов М13тр18 и М!3тр}9 являются коммерческим препаратами фирмы "Fermentas" (Литва). Плазмиды pACYC184, pLP102 и рСВ20 получены от Йомантаса Ю.В.

Трансформация бактерий и выделение ДНК. Трансформацию клеток B.subiilisпроводили по стандартной методике (Spizizen J., et ai., 1958), компетентные клетки E.coli готовили по методу (Mendel М., Higa А., 1970). Хромосомную ДНК выделяли по методу (Saito Н., Miura К., 1963), плазмидную по методу (Biraboim and Doly, 1978). Однонитевую фаговую ДНК вьщеляли по методике, описанной (Sanger et al., 1977).

Ферменты нуклеотидного обмена. Реакции рестрикции и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва), в условиях рекомендуемых изготовителем.

Определение нуклеотвдных последовательностей,. Определение нуклеотидной последовательности производили по методу (Sanger, 1977).

Определение рибофлавинсинтазной активности. Активность рибофлавинсинтазы определяли по стандартной методике (Бреслер и соавт., 1972).

Определение рибофлавин-киназной и ФАД-сннтазнон активности. Активность рибофлавин-киназы и ФАД-синтазы определяли по методу (Hagihara Т., et al., 1995). Концентрацию белка в экстрактах определяли по Бредфорду (Bradford М., 1976). Разделение флавинов из реакционной смеси проводили обращенно-фазовой ВЭЖХ (Light D..R., et al., 1980). Концентрацию флавинов определяли с помощью флюориметрического ■детектора (420-AC-Waters, США).

Получение мутаций. , Мутагенез in vivo нитрозонитрогуанидином осуществляли согласно процедуре, списанной (Kil Y., et al., 1992).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование генов биосинтеза рибофлавина B.amyloliquefaciens. Для клонирования генов биосинтеза рибофлавина смесь Hind III фрагментов хромосомной ДНК B.amyloliquefaciens А50 и плазмиды pACYC184 обрабатывали полинуклеотидлигазой и использовали для трансформации клеток Exoli BSV821 (ribA::Tn 5). Отбирали устойчивые к хлорамфениколу трансформанты, способные расти на среде без рибофлавина. Из одного из полученных клоноз была выделена плазмида рХ4, содержащая,клонированный Hind III фрагмент размером 5,5, т.п.н. Далее этот фрагмент был переклонирован в B.siibiílis на векторе рСВ20. Полученная в результате плазмида рВХ2 (рис. 1) комплементировала мутации во всех генах 'рибофлавинового оперона B.subtilis (ribBJIO, TibG850, ribA629, ribH16), кроме мутации в ribTD гене (ribD107). Из чего

следует, что на клонированном фрагменте отсутствует ген В.атуЬИдие/ааепг, эквивалентный максимально-удаленному от основного промотора гену НЬТБ В.$иЬп1к.

ллныпа.

- Рис.1 Рестрикдионно генетическая карта плазмвди рВХ2 и схема организации, клонированного на ней, рибофлавинового оперона B.amyloliquefaciens А50. Жирной линией отмечен секвенированный фрагмент.

2. Определение и анализ нуклготидгзой последовател^нсетл фрагмента ДНК, содержащего rib гены. Для определения™ нуклеотидной последовательности Hindlll фрагмент хромосомной ДНК B.amyloliquefaciens А50, клонированный на плазмиде рХ4 расщепляли

различными эндонуклеазами и- полученные фрагменты субклойировали в составе векторов М13тл/>18, М13т/)19 или плазмиды РТ2191иЫ. С помощью универсальных прямого- и обратного праймеров частично определили ■ нуклеотидную последовательность субклонированных фрагментов. Далее были синтезированы 13 олигонуклеотидов, комплементарных участкам ДНК, граничащим с непрочитанными областями. Используя их в качестве праймеров, получили непрерывную последовательность длиной 4286 н.п.. В результате мы секвенировали часть клонированного фрагмента, кодирующего гены рибофлавинового оперона. Нуклеотидная последовательность зарегистрирована в банке данных (ЕМВЬ, АЫ Х95955).

Таблица1. Процент гомологии аминокислотных последовательностей ферментов, участвующих в биосинтезе рибофлавина

гомология с B.amyloliquefaciens

Микроорганизм ribG ribB ribA ribH

ген % ген % ген % ген %

В. sub tills ribG 82.7 ribB 89.3 ribA 93.9 ribH 96.7

E.coli ribD 53.3 ribC 51.6 ribB 56.6 "ribH 65 '

ribA 66.6

A.pleuropneumoniae ribG 51.9 ribB 69.3 ribA 68.5 ribH 80.5

Photobaclerium - ribB 56.8 - ribH 64.9

leiognathi

Haemophilus ribD 55.1 risA 53.4 ribB 56.7 -

influenzae

В результате компьютерного анализа секвенированного фрагмента было обнаружено пять открытых рамок трансляции (ОРТ). Последовательность пятой ОРТ определена не полностью. Аминокислотные последовательности этих ОРТ оказались очень близки к последовательностям соответствующих ферментов, кодируемых генами рибофлавинового оперона ВлиЫИЬ^табл. 1): Порядок расположения генов в оперонах В.шЫИи и В.ату1оИдиг/аскпл полностью совпадает, поэтому в дальнейшем для обозначения генов рибофлавинового оперона В.ату!оПдие/ас1еп$ мы будем использовать названия, принятые для

B.subtilis - ribGBAHTD. Единственное отличие в организации оперонов состоит в том, что если у B.subtilis нет перекрывающихся генов, то в случае B.amyloliquefaciens A5Ü наблюдается перекрывание генов ribG и ñbB. Остается не ясным, является ли перекрывание генов функциональным, или же это результат случайной мутации.

Сравнение с другими флавиногенными организмами, для которых известны аминокислотные последовательности 4 соответствующих ферментов показало, что и здесь степень гомологии велика и колеблется б интервале от 50 до 80% (табл. 1).

Гомология нуклеотшшых последовательностей соответствующих фрагментов ДКК B.subtilis и B.amyloliquefaciens составляет 80%, причем высокая степень гомология наблюдается и для некодирующих областей (рнс.2). Так, например, области, предшествующие первому структурному Г'-HV, ДЛИНОЙ ОКОЛО 350 НУНДеОТИДОВ, В ЪтлОКл угшгг'ПЙИТОЙЯЕ-.; Л'ТТЯ ' рибофлавикоБОго оперена B.subtiiis определено положение основного промотора и точка начала транскрипции, находящаяся .на расстоянии 254 н.п< от сгарт-кодона первого гена оперона, ribG (Миронов Б. и соавт. 1990). В 5'-области B.amyloliquefaciens, на расстоянии 305 нуклеогидов от сгарт-кодона ribG гена, была найдена почти полностью совпадающая с "каноническим" промотором последовательность: (TTGCGT-17 п.н.-ТАТААТ). Исходя из рис.2 видно, что промоторы и, вероятно, точки напала транскрипции совпадают у обоих микроорганизмов. Кроме того, в этой области B.amyloliquefaciens и B.subtiiis содержат почти одинаковые инвертированные повторы, а также структуру, напоминающую р-независимый терминатор транскрипции (рис. 2).

Кроме основного промотора у B.subtilis предполагают наличие двух дополнительных. Первый внутренний промотор (TTGAAG-Í7 п.н,-ТАСТАТ), расположенный на расстоянии 303 п.н. от старт-кодона гена ribA (Чикиндас М. и соавт. 1988), контролирует синтез транскрипта длиной 2600 нуклеотидов, регуляция образования " которого координирована с регуляцией транскрипции с основного промотора. Его эквивалентом у B.amyloliquefaciens мохно считать последовательность (TCGAGA-I7 п.о.-ТАТТАС), которая также находятся ка расстоянии 3CZ н.п. от сгарт-кодона гена : ribA. Положение второго вчухр^-'чгге промотора B.subtilis точно не определено, ú nbH --ribTD' мезтеьнеч области имеется несколько промотор-подобкых структур (например [TTGAAT-18 п.н.-ТААААА]), о дня то которых может контролировать синтез" транскрипта длиной порядил. 550 п.к. (Mironcv, V. et al. 1994).

-35 -10 +1

В.am TAGGTGCAAATTCATTCCGCCTCCCGTAAAGGAT-GTTATAATAGCGGAT^GGACAAAA7\AATA 15 * + ** * ********* ******* * ******* * *********** ****

B.su TMGTTTAT-TTCATTTCGIACTTTAAAAAGGATCGCTaTAATAACCAATARSCaCaaATGAATA 15 B.am TTGATTGTATCCTTCGGGGCTGGGTGAAAATCCCGACCGGCGGTAATAAGSCGCTCCTGCGCTTT 80

B.su AAGATTGTATCCTTCGGGGCAGGGTGGAAATCCCGACCGGCGGTAGTAAAGCACATTTGC—TTT 78 AAA T A AA

t

B.am ACAGCCCGTGACCCGTATGCATCTGTATACGGTGGATTCAGTGAAAAGCTGAAGCCGACAGTGAA 145 * ************** ***** * * ************* ** ******************

B.su AGAGCCCGTGACCCGTGTGCATAAGCACGCGGTGGATTCAGTTTAA-GCTGAAGCCGACAGTGAA 142 T T А Г A

t

B.am AGTCTGGATGGGAGAAGGATGA-GAGAAGCTATGCAAAAAATAATCATACrGrWAGTCTTATTT 209 ' ********************** *** *********** * * * * ** ***** ******

B.su AGTCTGSATGGGAGAAGGAT£\TGAGCCGCTATGCAAAATGTT-TAAAAATGCATAGTGTTATTT 206 ■ A

<============ ter —===—===>

B.am CCTATGGATTAAAACTGGTAAAGCCCCGAATGTGTAA-ACATTCGGGGCTT'iTr-GACGCCAAAT 272

B.su CCTATTGCGTAAAATACCTAAAGCCCCGAATTTTTTATAAATTCGGGGCTTTTTTGACGGTAAAT 271 ■> <========== ter —=====>

RBS

B.am TGCGTGGAAGAAGGGAGGGATAACGATG 300

* **** ******** * ***

. B.su AACAA—AAGAGGGGASGGAAACAAATG 297

Рис.2 Сравнение 5' нетранслируемых областей перед первым структурным геном ribG B.subtilis и B.amyloHquefaciens. Звездочками указаны совпадающие нуклеотиды. Заглавными буквами отмечены операторные мутации B.subtilis, строчными - B.amyloliquefaciens. Предполагаемые промоторные области, точка начала транскрипции и сайт связывания с рибосомами подчеркнуты. Двойной линией обозначен инвертированный повтор.- '

Существует ли регуляция транскрипции с данного промотора не известно. Межгенные области перед гй?ГО геном сильно консервативны у ВлиЬиШ и В. ату!оНдие/аает (99 из 116 п.н. идентичны). Это позволяет предположить, наличие у В.ату!оИдие/ааеги также и второго внутреннего промотора.

Анализ частот встречаемости кодонов в - мРНК, кодируемой структурными частями генов рибофлавинового оперона позволяет сделать заключение о близкородственном происхождении В.$иЬШи и В. ату1оИдие/ааепз.

3. Экспрессия и регуляция рибофлавинового оперона В.ату1о1щие/ас1еги в клепках ВлиЬШк. Для изучения экспрессии и регуляции рибофлавинового оперона В.ату1оИдш/аскт в клетках В.$иЬйШ была использована упомянутая выше плазмида рВХ2 (рис.1). Эту шюзмиду вводили в разлившие штаммы В.тЬпНз и и?мррятги активность рибофлавинсинтазы и накопление рибофлавина (табл 2).

Как уже говорилось, активность генов рибофлавинового оперона у В.5иЬи1й регулируется продуктом гена пЬС. В штамме с диким типом этого гена (ВлиЬИШ БВ25) активность рибофлавинсинтазы была очень низкой. . Введение в этот штамм НЬС мутации приводило к восьмидесятикратному увеличению активности фермента и появлению рибофлавина в культуральной жидкости (табл. 2). Аналогичный эффект наблюдается для штамма с плазмидой рВХ2, содержащей гены рибофлавинового оперона В.атуЬИдие/аыети. В этом случае введение пЬС мутации также увеличивало активность фермента примерно в 100 раз (табл. 2). Таким образом, эти эксперименты показывают, что регуляторная область рибофлавинового оперона В.атуШщие/аае!я "узнается" регуляторной системой В.5иЬйШ .

К началу этой работы ничего не было известно о регуляции биосинтеза рибофлавина у В.ату!иИаие/аает. Штаммы В.атуЬИдие/аагм дикого тмП'л не накапливают рибофлавин в культуральной жидкости. Нам удалось получить мутацию (тгЬО]), приводящую к накоплению рибофлавина и значительному увеличению (более чем в 10 раз) активности рибофлавинсинтазы (табл.2). Анализ нуклеотидной последовательности операторной области рибофлавинового оперона у муталтного штамма показал, что пЬ01 мутация (замена Т на С в положении -5-87) совпадает с одной из пЪО мутаций В.зиЬОТи (рис. 2).

Была получена также вторая регуляторная мутация ггЬ02 на плазмиде рВХ21. Эта мутация (замена С на Т в положении 149) не совпадает ни с

одной из известных мутаций В.зиЫИЬ. Введение плазмиды рВХ21 в штамм В.$иЬй1Ь ВР850 приводит к накоплению рибофлавина и повышению активности рибофлавинсинтазы (табл. 2). Эти данные еще раз доказывают существование перекрестной регуляции.

Таблица 2. Удельная активность рибофлавин синтазы и способность к накоплению рибофлавина в различных штаммах В.зиЫПЬ и В.ату1оИдие/аает.

Штаммы , Генотип Наличие плазмиды Рибофлавин синтазная активность нмоль/мг мин Накопление рибофлавина мкг/ мл

\.B.subtilis SB25 прототроф - 0.008 -

2. -//- RK399he ribCJ - 0.66 32

3.-//-ВР850 ribG850 - - -

4. -//- ВР850 TibG850 pBX2 0.024 -

5. -//- BPS50 ribG850 pBX21 1.6 65

6. -//- ВР851 ribG850 ribCl рВХ2 2.39 143

7. -//- RK222he ribC862 - 0.62 31

8. -//- RK222he ribC862 PRC801 0.02 1.5

9.B.amyloliq. A50 10.-//-AE451 прототроф ribOl - 0.03 0.43 15

4. Клонирование ribC гена Bsubtilis. Несомненно, что продукт гена ribC играет важную роль в регуляции биосинтеза рибофлавина. Поэтому мы решили клонировать и секвенировать данный ген.

Для клонирования гена ribC мы использовали метод основанный на действии 7,8-димеггил-10-(0-метилацетоксим)-изоаллоксазина. Это аналог рибофлавина, содержащий вместо рибитила радикал -CH2-CH=N-0-CH3. Мутанты по гену ribC более чувствительны к действию этого соединения, чем клетки дикого типа. Так подавление роста клеток дикого типа происходит при концентрации аналога 15 мкг/мл, в то время как для мутантов по ribC эта величина составляет 1.53.5 мкг/мл. Устойчивость к аналогу передается при трансформации ribC-мутантов с помощью ДНК из клеток дикого типа (Кренева P.A. и соавт. 1994).

Хромосомную ДНК из штамма B.subtilis SB25 частично расщепляли эндонуклеазой EcoRl, смешивали с ЕсоШ фрагментом плазмиды рСВ20 и обрабатывали полинуклеотидлигазой. Полученную смесь использовали для трансформации штамма B.subiilis RK222he {hisH ribC862 recE4), содержащего мутацию ribC862. Трансформанты отбирали на среде, содержащей эритромицин (10 мкг/мл) - и 7,8-димгтил-10-(0-метилацетоксим)-изоаллоксазин (3.5 мкг/мл). Из одного из полученных трансформантов была выделена плазмида pRK6. При введении этой плазмиды в штаммы реципиенты, содержащие различные мутации по гену ribC, выяснилось, чгто наряду с приобретением устойчивости к аналогу у трансформантов исчезает способность продуцировать рибофлавин. Так, в случае штамма B.subtilis RK222he накопление рибофлавина упало с 31 мкг/мл, до величины менее 0,5 мкг/мл. В случае же штамма B.subiilis RK5h (hisH rib0335 recE4), который несет конститутивную мутацию rib0335 в регуляторной зоне рииифлааияиаиго оперена, накопление рпбсфл2зм.ч2 осталось на прежнем уровне. Таким образом можно предположить, что клонированный фрагмент содержит дикий ген пЪС.

Мутации ribC картированы в области 147° генетической карты B.subtilis в промежутке между ts- мутациями dnaF133 в гене polC (ДНК-полимераза III) и dapG27 в гене dapG (аспартохиназа I) (Kreneva R.A. et. al. 1990). • - • ■ ' '

Рестрикционный анализ показал, что длина клонированного фрагмента в плазмвде pRK6 составляет около 15 т.п.н. (рис. 3) Следовательно, этот фрагмент наряду с геном ribC может включать гены polC или dapG. Для генетического картирования, ДНК плазмиды pRK6 расщепляли эндонуклеазой EcoRI и полученные фрагменты использовали для трансформации штаммов несущих ts- мутации dapG27 (B.subtilis 12X21) n dnaF133 (В.subtil h BD54F ). В обоих случаях наблюдалось появление термоустойчивых траисформантов. В том случае, когда для трансформации использовалась нгтивная плазмида ;; гесЕ4 производные выше указанных штаммоа (B.subiilis RK2127 и ■B.subtilis RK54F ) термоустойчивые трансформанть! появлялись только в случае пггаыма с мутацией dapG27. Таким образом, плазмида pRKC содср:а.*т целые гены ribC, dapG и фрагмент гена рс'С. Сяадоаатедыю, кловкрозанкьш в составе плазмиды pRK6 фрагмент, соответствует области 147е генетипсской' ;.арты хромосомы B.subtilis.

Для локализации гена ribC мы последовательно делегировала различные участки клонированного на гашшщсрИКб фрагмента (рис. 3).

Каждую из полученных плазмид испытывали на способность передавать устойчивость к 7,8-диметнл-Ю-(0-метилацетоксим)-изоаллоксазину, при трансформации мутантных по гену пЬС штаммов и способность к репрессии конститутивного синтеза рибофлавина. О последнем можно было : судить по ■ исчезновению накопления рибофлавина при трансформации данными плазмидами штамма В^иЫИЬ КК222Ье. В результате была получена плазм ид а рНС801, несущая фрагмент размером около 4.5 т.п.н., а также плазмнда рБЗб, с фрагментом 1.4 т.п.н., способная реплицироватся только в Е.соН (рис. 3).

EccFU EcsFJ Ndel . Ndsl Eglll ' Stpl Uriel Ndel BglHEcoR! EcoRl EcoRl

J EcoRl рестрикция Pf^5

J якгироайкиг

r-.-.-.-■-,----—i pRC2

EcoRl Ndsl Ndsl Eglll Stpl Ndsl Hdel BqIII EcaRI

J Ndel рестрикция

[ лигароааккг

---:-.-.--—.—. pRC4D2

EcoRl Ndel Sipl Bg!!l Ndel .Ndel Bglll EcoRl

| Bg!!l рестрикция

fiitC } яигнровекие

-----—■ pRC801

EcoRl Ndel Sipl Bglll EcoRl

j Sjf.i ргалришкя | пигирсьбнмв

--1 pSSB

EcoRl Ndel Stpl

1Й>

Рис. 3. Схема делеционного анализа клонированного фрагмента хромосомы Bac.subtilis SB25, содержащего ribC ген. Плазмиды pRC2, pRC402, pRCSOl сделаны нг основе вектора рСВ20, плазмида pSS6 - на основе pUClS. *На рисунке указан только один сайт для узнзвания Sspl эндонуклеазы.

Плазмнда pSS6,'обработанная-энионукяегзой EcoRl, трансформирует

штаммы содержащие мутации ribCi (.B.subtilis RK6i) и ribC862 (В. sub tills RK222) к устойчивости jk действию аналога. Следовательно, можно j TEcn"-сдать что pSS6 содержот, по крайней мере, часть гена ribC.

5. Определение и анализ нуклеотиднон последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген пЬС. Мы определили нуклеотидую последовательность части клонированного, фрагмента, кодирующую ген пЬС. Стратегия секвенирования приведена на рис. 4. Фрагменты ДНК плазмиды рББб, ограниченные сайтами рестрикции Ше\ - 5^1 и Ыйе\ -Есо12\, бьши субклонированы в составе плазмиды р11С18. С помощью универсальных прямого и обратного праймеров частично определили нуклеотидную последовательность субклонированных фрагментов. Далее были синтезированы 7 олигонуклеотидов, комплементарных участкам ДНК, граничащим с непрочитанными областями. Используя их в качестве праймеров, определили нуклеотидную последовательность фрагмента плазмиды рЯС801, длиной 1387.. н.п. Последовательность зарегистрирована в банке данных (ЕМВЬ Х95312).

ribC

Nde\ ЕсоШ Ahr А 41 Ssp\ Ssp\

ш* «в а»( *т

R3 Н7 RS R1 R2 R4 R5

0.1 kb

Рис. 4 Стратегия секвенирования. Стрелкой обозначено расположение и направление транскрипции гена ribC. Указаны сайты узнавания для редкощепящих ресгриктаз. Стрелками внизу показаны синтетические олигонуклеотиды использованные для секвенирования.

В результате компьютерного анализа секвенированного фрагмента было обнаружено две открытых рамки трансляции (ОРТ). Сравнение аминокислотной .последовательности ОРТ2 с известными последовательностями (SWISS PROT) показало высокую степень гомойогии с бифунккциональным ферментом рибофлавин киназой/ФАД-

синтазой из Corynebacterium ammoniagenes и E.coli (рис. 5). Обнаружена также высокая степень гомологии'с продуктами неидентифицированных генов Pseudomonas fluorescens [Р22990], Haemophilus influenzae [P44957] и Mycoplasma genetalium [Р47391]. На основании этой гомологии мы сделали

вывод, что ОРТ2 соответствует гену ribC.

*■ *** + **

Ca 0 ---vdlwygtaavpkdldnsaVTIGvFDGVHrGHqkLInAtvEkArsvgakaiMVtFdPh

Bs 1 vktihlthphhlikeeqaksvMÄLGyFDGVHlGHqkVIgTakQiAeekgltlaVMtFhPh

Sc 0 —mkllrgihnlsqapqegcyLTIGnFDGVHrGHraLLqGlqEeGrkrnlpvmVMlFePq *

' Ca 58 PvsVflprRaPlg-iTtLaeRfalaesfGidgVlvldFtrelSGtSPekYVeflLedtLh Bs 61 PshVlgrdKePkdliTpX.edKinqieqlGtevLyvVkFnevfASlSPkqFIdqyIi-gLn

■EC 59 PleLfatdKaParl-TrLreKlrylaecGvdyVlcVrFdrrfAAlTÄqnFVsdlLvkhLr * - . + *

Ca 117 ashwvGaNFTfGenaaGtadslrqicqsrlTvdvIdlLddEgvriSSTtVRefLsegDV Bs 120 vqhavaGfDFTyGkygkGtmktmpddldgkaGctmVekLteQdkkiSSSylRtaLqngDV

EC 118 vkflavGdDFPlAlwkAiscyyrklawntaSispVrkLfaEvacaSAArLRqaLaddNL *** * * * *■ * * * *

Ca 177 arAnwaLGrhFyVtGpWrgagrgGKeLGFPTÄNqyfhdtvalPadSVYRgvltiLptea Bs 130 elAnvlLGqpYfIkGiVIhndkr-GRtIGFPTANvglnnsyivPptGVYAvka-eV-nge

SC 178 alAeslLGhpFalsGrVVngdel-GRtlGFPTANvpprrq-vsPvkGVYAvevlgL-gek *

Ca 237 pvsGnMepeVAyaAAisvgtnptfgdEQrsVEsfVlDrdadLYGhcVkVefvdhVRameK Bs 237 vvnG-V-cnlGykPTfy-ekrp----EQpsIEvnLfDfnqeVYGaalklewykrIRserK

EC 235 plpG-V-anIGtrPTva-gir-----QQ—LEvhLlDvamdLYGrhlqVvlrkklRneqR

* * * *

Ca 297 FdSVeQLleiÄSaKDvqkTrtllAqdvqAhkmapetyflqaes

Bs 290 FnGIkELteqleKDkqeAiryfSnlrk---------------

EC 285 FaSLdELkaqlaRDeltAreffGltkpA--------------

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей: Ca - ФАД-синтаза Ccrynebacierium ammoniagenes, Bs - продукт гена rib С Bacillus sublilis, Ее - продукт гена НеX E.coli. Совпадающие и похожие аминокислоты обозначень! заглавными буквами. Звездочками отмечены аминокислоты совпадающие во всех шести последовательностях (см. объяснения в тексте).

Так как ген ribC экспрессируется в составе плазмиды pRC801 при плазмидной Трансформации, то в ее составе вероятнее всего есть его собственный промотор. На расстоянии 204 нуклеотида от старт-кодона ОРТ2 бьша обнаружена последовательность {TTGCCG -17- ТАСАТТ], которая может является промотором данного гена. На расстоянии семи. нуклеотидов от стартового кодона (GTG) находится последовательность, характерная для участка связывания рибосомы бацилл (AGAAAAAAGGTGA). Интересно, что расстояние между ОРТ1 и ОРТ2 составляет 18 п.н. Это указывает на то, что данный ген может входить в состав какого-то оперона, как один из внутренних генов, тем более, что никакой структуры напоминающей р-независимый терминатор на З'-конце гена ribC обнаружено не было. При поиске по банку белковых последовательностей (SWISS PROT) мы не , смогли найти никакой гомологии ОРТ! с и?вмггными последовательностями.

Для того чтобы подтвердить, что ОРТ2 соответствует гену ribC, мы нарушили ее путем введения мутации, приводящей к сбою рамки. Для этого ДНК плазмиды pRC801 расщепили эндонуклеазой Alw<\4\ (Рис. 4), обработали ДНК-полимеразой и лигазой. Эта операция привела к встраиванию четырех дополнительных нуклеотидов в структурную часть гена ribC. Полученная таким образом плазмида потеряла способность обеспечивать устойчивость к аналогу и комплементировать rib С мутации. К "аналогичному" эффекту привело встраивание гена устойчивости ' к канамицину в сайт Есо12\ (Рис. 4) плазмиды pRC801.

Интересно отметить, что нам не удалось клонировать нативный ген ribC в клетках E.coli. Тогда как указанные выше плазмиды, с нарушенным геном ribC, способны реплицироваться в E.coli. Следовательно экспрессия гена rib С легальна для E.coli.

6. Определение активности белка, кодируемого геном ribC. Для того чтобы выяснить обладает ли продукт гена ribC рибофлавин-киназной и ФАД-синтазной активностями мы измерили эти активности экстракте из клеток штамма B.subtilis RK222he, содержащих плазмиду pRC801. Как контроль использовали тот же штамм не содержащий плазмиду. На рис. 6 представлена хроматограмма разделения продуктов реакции. Если учесть, что в условиях нашего эксперимента (рН=6.0) молярная флюоресценция ФАД в 7 раз ниже, чем ФМН (Udenfriend, S. 1962), то окажется, что ФАД является основным продуктом реакции. Скорость накопления этого продукта для штамма с плазмидой pRC801 примерно в 5 раз выше, чем для реципиента (Рис. 7). Таким образом ген rib С действительно кодирует

рибофлавин киназу/ФАД-синтазу.

Рис. 6. Xроматограмма разделения флавинов при определении рибофлазин-киназной к ФАД-синтазной азсгивностк з штамме B.subülh RK222he с пяазмидой pRCSOL А - кулевая минута, В - двадцатая, цифрами обозначены 1 - ФАД, 2 - ФМН, 3 - рибофлавин.

В 1979 году з работе Керни и соавт. был описан фермент осуществляющий аналогичную продукту гена пЪС реакцию: последовательный синтез ФМН и ФАД из рибофлавина. Было высказано предположение, что молекула фермента, имеет два различных активных центра, один из которых связьшйег рибофлавин, а другой ФМН. Недавно было показано, тго а coli рнбофпавин-хиназа/ФАД аштаза кодируется ггком ИеХ и С-кокцезазх часть молекулы контролирует киназную акткзность, а N-концеваяФАД-синтезкрух>щуга (Bacher, А. ei а! 1996). 'Учитывал значительную гомологию между аминокислотными

последовательностями ферментов из различных микроорганизмов, а так же наличие двух очень консервативных областей (рис. 5) можно предположить, что и структурная организация этих ферментов одинакова. Однако, за исключением ВлиЬиШ, в настоящее время нет никаких данных об участии ФМН-ФАД синтаз в регуляции биосинтеза рибофлавина, нм (ФАД)/мг»мин ,

Рис. 7. Кинетика образования ФАД в штамме B.subtilis RK222he с плазмидойрКС801 (1) и без плазмиды (2). . ..

Мы пытались нарушить хромосомный ген ribC B.subtilis при помощи интеграции в него гена устойчивости к канакицину. Для этого мы использовали плазмиду pRC801 со встроенным в Есо12\ сайт геном устойчивости к канамицину (рис. 4). Этой плазмвдой мы трансформировали штамм B.subtilis SB25 и не обнаружили канамицин-устойчивых трансформантов. Возможно,, что синтез ФМН и ФАД у B.subtilis осуществляется только продуктом гена ribC и нарушение этого гена летально для клетки.

Введение плазмиды pRC801 в штаммы с rib С мутациями приводит к падению активности рибофлавинсинтазы до уровня дикого типа (Таблица 2). Следовательно, клонированный ген обладает также регуляторной активностью. Наличие у регуляторного белка еще и ферментативной активности' описано для репрессора' биотинового оперона B.subtilis (продукт гена ЫтА), который также является биотин-белок лигазой (Bower, S. et.al. 1995). Не смотря на то, что участие продукта гена rib С в регуляции активности рибофлавинового оперона не вызывает сомнений, имеющиеся

в настоящее время данные не позволяют утверждать, что этот белок непосредственно взаимодействует с регуляторными участками ДНК или РНК.

7. Механизм регуляции рнбофлавиновых генов. Имеющиеся на данный момент данные "позволяют утверждать, что регуляция рибофлавинового оперона осуществляется на уровне транскрипции (Миронов В. и соавт 1994, Perkins, J. 1993). Существует два основных типа регуляции экспрессии бактериальных оперонов: репрессия, то есть регуляция на уровне инициации транскрипции и атгенуация - регуляция на уровне терминации транскрипции.

Мы установили, что регуляторные области рибофлавинового оперона B.subtilis и B.amyloliquefackns очень похожи. В регуляторной области B.amyloliquefaciens можно найти практически все вторичные структуры, которые есть у B.subtilis. Также ее можно сложить в виде "клеверного листа", как это было предложено для B.subtilis (Kil, Y et al. 1992). Для B.subtilis идентифицировано 13 различных точечных мутаций, которые приводят к полной или частичной дерепрессии рибофлавинового оперона (Kil, Y et al. 1992). Эти мутации расположены в интервале +37 - +159 н.п., относительно точки начала транскрипции. Мы определили положение двух мутаций у B.amyloliquefaciens (рис. 2), приводящих к такому же фенотипу. Одна из этих мутаций совпала с известной мутацией у B.subtilis. Как видно из рис.2, все 14 нуклеотидов, соответствующих положению мутаций, идентичны у B.subtilis и B.amyloliquefaciens. Следовательно, учитывая данные по перекрестной регуляции, можно предположить, что механизмы регуляции экспрессии рнбофлавиновых оперонов B.subtilis и B.amyloliquefaciens одинаковые. Однако, несмотря на большое количество данных мы не знаем каким образом осуществляется регуляция.

С одной стороны, данный механизм не похож на репрессию. Она предполагает связывание активного регуляторного белка с операторной последовательностью ДНК. В регуляторной области мы не смогли найти последовательности подобной известным операторным последовательностям. Кроме того, все регуляторные мутации обнаруженные у. B.subtilis ' и B.amyloliquefaciens распределяются на необычно большую, для операторной последовательности, область (более 120 н.п.). Мы не смогли также найти "helix-tum-helix" мотива в аминокислотной последовательности белка ribC.

С другой стороны,' в регуляторных областях обоих оперонов

обнаружена структура похожая на р-независимый терминатор транскрипции (рис. 2), расположенный прямо перед началом первого структурного гена ribG. Наличие такого элемента предполагает регуляцию по принципу аттенуации транскрипции. Однако, несмотря на большое количество идентифицированных мутаций у В. subtilis и B.amylolique/aciens небь'шо найдено ни одной мутации в терминаторе. Кроме того нам не удалось найти альтернативных шпилечных структур, необходимых для осуществления данного типа регуляции.

Существующие данные о преждевременной терминации транскрипции мРНК, характерной для данного механизма, также достаточно противоречивы. Миронов и соавт. в своей работе не смогли увидеть короткого РНК транскрипта, который бы появлялся вместо основного транскрипта длиной 4.3 т.н.п. в условиях репрессии экзогенным рибофлавином в ауксотрофном цп-аммс ribDlG? (Miipcncs Е. к соавт 1994). Тогда как Сорокин с соавт., напротив, обнаружили транскрипт, длиной около 160 п.н., ftp и выращивании прототрофного штамма на минимальной среде (Azevedo, Y. et.al. 1993). Несмотря на это, авторы не могут утверждать, что этот короткий РНК транскрипт не является результатом процессинга мРНК всего оперона.

О регуляции биосинтеза рибофлавина у других микроорганизмов , известно гораздо меньше. Мы провели сравнение регуляторной области рибофлавинового оперона бацилл со всеми известными последовательностями из банка генов (EMBL). В результате мы обнаружили гомологию с пятью последовательностями [U27202, Z46864, L47648, Х66720, S37783, U32760; L42023] (рис. 8). Эти последовательности обнаружены: у Actinobacillus pleuropneumoniae перед генами рибофлавинового оперона; у Escherichia coli и Haemophilus influenzae перед геном, кодирующим 3,4-дигидрокси-2-бутанон 4-фосфат синтазу; у Brucella aborius - перед геном, гомологичным ribH В.subtilis. Кроме того, гомология была найдена перед геном B.sublilis, кодирующим белок гомологичный NADH дегидрогеназе.

Оказалось, что в гомологичной области есть три консервативные участка, обозначенные нами rib boxl, rib Ьох2 и rib ЬохЗ, размером 35, 12 и 49 нуклеотидов соответственно (рис. 8). Расстояния между этими участками сильно • варьируют, а ' вслед за- -ними у B.sublilis, B.amyloliquefaciens, А.pleuropneumoniae и Н.influenzae находятся последовательности похожие на р-независимый терминатор транскрипции. Интересно, что все 15 мутаций, идентифицированные у

-rib boxl---—rib box2—

***■* ***. **** *** + * ***. *** ** ** **" *

bs cctTCgGGGCaGGGtGgAAaTCCCgAcCGGcGGTa—19—gAGcCCgtGAcC-20-bam cctTCgGGGCtGGGtGaAAaTCCCgAcCGGcGGTa—21—-cAGeCCgtGAcC-20-ap tctTCaGGGCaGGGtGaAAtTCCCgAtCGGcGGTa—0—aAGtCCgcGAgC-20-ec ttcTCaGGGCgGGGcGaAAtTCCCcAcCGGcGGTa--15—aAG-CCgcGAgC-27-

hi ttcTCaGGGCaGGGtGaAAtTCCCtAcCGGtGGTa---:0—aAGcCCacGAgC-72-

ba ttcTCgGGGCgGGGtGaAAcTCCCcAcCGGcGGTa—15—aAGcCCgcGAgC-42-bsx tctTCgGGGCaGGGtGaAAtTCCCtAcCGGcGGTg—16—aAGcCCgcGAgC-13-aaa t a aa t t

YYYTCUGGGCuGGGYGUAAnTbCCnAYCGGYGGTO uAGYCCUYGAnC

-rib ЬохЗ-

** * *** * * ***** ** * **** ***** ***

bs gGAttcaGT-ttAagCtgaagCCGACaGTgAaAGTCtGGATGggAGAag-135-ATG bara gGAttcaGTG=aAagCtgaagCCGACaGTgAaAGTCtGGATGggAGAag-135-ATG

ap gGAaccgGTGa'gAttCcggtaCCGACaGJ-AtAGTCtGGATGgaAGAag---0-ATG

ec aGAtccgG?GtaAttCcggggCCGACgGTtAgAGTCcGGATGggAGAga-109-ATG hi. aGAtttgGTGaaAttCcaaagCCGACaGT-AaAGTCtGGATGaaAGAga—94-ATG ba __ aGAtccgGTGagAtgCcggagCCGACgGTtAaAGTCcGGATGgaAGAga--S2-ATG bsx gGAttcgGTGagAttCcggagCCGACaGT-AcAGTCtGGATGggAGAag-159-GTG s a t a ■ t a

- UGAyYYVGTGnuAnnCYWuUCCGACVGTijAnAGTCYGGATGWAGAUV

Рис. 8 Сравнение регуляторных областей: рибофлавиновых оперонов B.subti'tis (bs), B.amyloliquefaciens (bam) и A.pleuropneumoniae (ар); генов ribB,tкодирующих" 3,4-дигидрокси-2-бутанон 4-фосфатсинтазу E.coli (ее) и Н. influenzae (hi); гена Brucella abortus (ba), кодирующего белок гомологичный люмазинсинтазе (Р-субъединица); гена B.subiilis (bsx), кодирующего* белок гомологичный NADH дегидрогеназе. Звездочками вверху обозначены чуклеотиды совпадающие во всех вариантах. Цифры показывают расстояния между rib boxl, rib Ьох2 и rib ЬохЗ. Внизу приведена консенсусная последовательность, где T,C,G,A -соответствуют нуклеотидам, Y - тгрймндан во всех вариантах, у - пиримидин.в большинстве вариантов, Uпурин во всех' вариантах, и - пурин в большинстве вариантов.' Строчными буквами над консенсусной последовательностью указаны операторные мутации Bsubtilis и B.amyloliquefaciens.

B.subiilis и B.amyloliquefaciens, попадают в эти консервативные области. Причем 11 из 14 нукпеотидов, мугированых у B.subiilis и B.amyloliquefaciens, идентичны у всех микроорганизмов (рис. 8). rib boxl и rib Ьох2 можно представить в виде той же структуры "клеверного листа", предложенной Килем и соавт. -Три из четырех шпилек консервативны в этой структуре.

Нам удалось получить делецию в 110 п.н. в регуляторной области рибофлавинового оперона B.subtilis. Эта деления (от +76 до +186 относительно точки начала транскрипции) захватывает полностью rib Ьох2 и rib ЬохЗ. Самое интересное, что синтез рибофлавина в штамме, содержащем данную делецию, лишь частично-конститутивный. Следовательно, не исключено, что каждая последовательность (rib boxl, rib Ьох2 и rib ЬохЗ) ответственна за свой механизм регуляции,"

Найденные последовательности говорят п том. что механизмы регуляции биосинтеза рибофлавина могут быть похожи у этих микроорганизмов.

Для того, чтобы определить механизм регуляции рибофлавиновых генов B.subtilis, на следующем этапе работы мы собираемся выделить белок RibC и выяснить взаимодействует ли он непосредственно с ДНК или РНК.

ВЫВОДЫ.

1. Клонирован рибофлавиновый оперон B.amyloliquefaciens. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента хромосомы Bacillus amyloliquefaciens длиной 4286 нуклеотидов показал, что все 5 структурных генов контролирующих биосинтез рибофлавина образуют одну группу сцепления, структура которой очень близка к структуре рибофлавинового оперона B.subtilis.

2. Установлено, что рибофлавиновый оперон В.amyloliquefaciens узнается регуляторной системой B.subiilis. Важную роль в регуляции экспрессии рибофлавиновых генов играет продукт гена ribC.

3. Клонирован. ген ribC, .B.subtilis. \ Определена его яуклеотадная последовательность. Установлено, что ген ribC имеет значительную гомологию с бифунккциональным ферментом рибофлавин киназой/ФАД-синтазой из Corynebaclerium ammoniagenes и E.coli.

4. Показано, что продукт гена пЬС действительно обладает рибофлавин-киназной/ФАД-синтазной активностью и способен регулировать экспрессию рибофлавиновых генов.

5. Показано, что в регуляторных областях рибофлавиновых генов нескольких микроорганизмов существует консервативная последовательность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. И.И. Гусаров, P.A. Кренева, Д.А. Подчерняев, Ю.В. Йомантас, Абалакина Ё.Г., Стойнова Н.В., Перумов Д.А., Козлов Ю.И. // Гены биосинтеза рибофлавина у Bacillus amyloliquefaciens: первичная структура, организация и регуляция активности. Молекулярная биология. 1997. Т. N3.' С

2. Кренева P.A., Гусаров И.И., Козлов Ю.И., Перумов Д.А. // Феноти'пичёское 'проявление делецйи в 110 нуклеотйдов в регуляторной зоне рнбофлавинового оперока Bacillussubtilis. Генетика. 1997. ТЗЗ. N4. С

3. Стойнова Н.В., Абалакина Е.Г., Чень Сюнь, Люи Хун, ПерумоЕ Д.А., Кренева P.A., Гусаров И.И., Подчерняев Д.А., Йомантас Ю.В., Козлов Ю.И., // Конструирование рекомбинантных штаммов -продуцентов рибофлавина. I. Клонирование и экспрессия рнбофлавинового оперона Bacillus amyloliquefaciens в клетках Bacillus subtilis. Биотехнология, 1996, N1 Г, стр. З-б.

4. Стойнова Н.В., Абалакина Е.Г., Чень Сюнь, Люи Хун, Перумов Д.А., Кренева P.A., Гусаров И.И., Подчерняев Д.А., Йомантас Ю.В., Козлов Ю.И. // Конструирование рекомбинантиых штаммов -продуцентов рибофлавина. II. Разработка методов интеграции чужеродных генов в хромосому Bacillus subtilis на л: одел и рнбофлавинового оперона Bacillus amyloliquefaciens. Биотехнология, 1996, N11, стр. 7-10.

Подписано к печати 'З " 0 ^_199 '/"г.

Стлгчатано на роталринтерс формат бумаги 30 х 42 /4

в ЗАО "Р11ЯД" ' осьем П.Л. ^ ■ ' .'

• /У Т1'Р-/ (29

ззк,

г. Москва ул. Усиевича до)! 8 А

тел: ! ¿2-17-71-