Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ первичной структуры гена ribR Bacillis subtilis и основные характеристики соответствующего полипептида

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соловьева, Ирина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1. Биосинтез рибофлавина.

1.2 Аналоги рибофлавина и их регуляторная активность.

2. Генетика, первичная структура и организация структурных генов биосинтеза рибофлавина B.subtilis.

3. Биосинтез флавокоферментов (флавинмононуклеотида и ф лавина дениндинуклеотида).

3.1 Химические свойства флавинов.

3.2 Синтез ФМН и ФАД в клетке.

3.3 Особенности превращения рибофлавина у B.subtilis.

4. Регуляция флавиногенеза у Bacillus subtilis.

4.1 Структура регуляторной области рибофлавинового оперона B.subtilis.

4.2 Особенности гена ribC.

4.3 Группа rib R мутаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Клонирование гена ribR и изучение его функций.

2. Рестрикционное картирование вставки, несущей ribR ген.

3. Определение и анализ нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, содержащего ген пЬЯ.

4. Идентичен ли клонированный фрагмент соответствующему фрагменту хромосомы?.

5. Субклонирование и биохимическая идентификация продукта гена г1ЬЯ.

6. Изучение свойств флавокиназы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ВЫВОДЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Соловьева, Ирина Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Показано, что у Bacillus subtulis наряду с бифункциональной рибофлавин киназой/ ФАД синтазой имеется монофункциональная флавокиназа, синтезирующая ФМН из рибофлавина и АТФ.

2. Анализ нуклеотидной последовательности клонированного фрагмента хромосомы показал, что размер соответствующего гена составляет 690 н.п. или 230 аминокислотных остатков. Идентифицированный ген получил название ribR.

3. Компьютерный анализ кодируемого геном пептида показал высокую степень гомологии белка RibR как монофункциональным рибофлавин-киназам, так и киназной части бифункциональных рибофлавин киназ/ ФАД синтаз из различных микроорганизмов.

4. Субклонировав и экспрессировав ген ribR в клетках E.coli, удалось показать в реакциях in vitro, что он действительно обладает рибофлавин-киназной активностью.

5. Фермент специфичен в отношении АТФ как источника фосфата, является Mg- зависимым и активен только на восстановленной форме рибофлавина, как и бифункциональный фермент Bacillus subtilis. Активной формой флавокиназы является мономер.

6. Были определены Km для субстратов монофункциональной рибофлавин-киназы (КМРФ= 0,180 мкМ, и КМАТФ= 112мкМ).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соловьева, Ирина Михайловна, Санкт-Петербург

1. Аваков, А.С, Болотин, А.П., Колибаба, Л.Г., Сорокин, A.B., Шемякина, Т.М., Паберит, М., Райк, X., Аавиксаар, А. (1990) Клонирование и экспрессия в Bacillus subtilis гена нейтральной протеазы Bacillus brevis, Молекулярная биология, 24, стр. 1001- 1009.

2. Бреслер С.Е., Черепенко Е.И., Черник Т.П., Калинин В.Л., Перумов Д.А. (1970.а) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Генетическое картирование оперона, Генетика, 6, 116-124.

3. Бреслер С.Е., Черепенко Е.И., Перумов Д.А. (1970.6) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. II Биохимические исследования регуляторных мутантов, Генетика, 6, 126-135.

4. Бреслер С.Е., Черепенко Е.И., Перумов Д.А. (1971) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. III. Продуктивность и свойства мутантов со сложным регуляторным генотипом, Генетика, 7, 117-123.

5. Бреслер С.Е., Глазунов Е.А., Перумов Д.А. (1972) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. IV Регуляция синтеза рибофлавин синтазы. Исследование транспорта рибофлавина через мембрану, Генетика, 8, 109-118.

6. Бреслер С.Е., Глазунов Е.А., Черник Т.П., Шевченко Т.Н., Перумов Д.А. (1973) Оперон биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Флавинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид, как эффекторы рибофлавинового оперона, Генетика, 3, 84-91.

7. Бреслер С.Е., Глазунов Е.А., Перумов Д.А., Черник Т.П. (1977) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. XII Генетические и биохимические исследования мутантов промежуточных стадий биосинтеза, Генетика, 13, 2007-2016.

8. Бреслер С.Е., Горинчук Г.Ф., Черник Т.П., Перумов Д.А. (1978) Оперон биосинтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. XV Исследование мутантов по начальным стадиям биосинтеза. Происхождение боковой рибитильной цепи, Генетика, 14, 2082-2090.

9. Бреслер С.Е., Перумов Д.А. (1979) Рибофлавиновый оперон Bacillus subtilis. Регуляция синтеза ГТФ циклогидролазы в штаммах с различным генотипом, Генетика, 15, 967-971.

10. Бреслер С.Е., Перумов Д.А., Скворцова А.П., Черник Т.П., Шевченко Т.Н. (1975) Изучение рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. VIII Генетическое картирование ribC маркеров по отношению к кластеру структурных генов, Генетика, 11, 95-100.

11. З.Гусаров И.И., (1997) Структура, организация и регуляция генов биосинтеза рибофлавина у В. amyloliquefaciens и В. subtilis. Автореферат дисс.к.б.н. ГосНИИ генетика, Москва.

12. Гусаров, И.И., Кренева P.A., Йомантас, Ю. А., Колибаба, Л.Г., Полануэр, Б.М., Козлов, Ю.И., Перумов, Д.А (1997) Первичная структура и функцианальная активность ribC- гена Bacillus subtilis. Молекулярная биология, 31,825- 830.

13. Кренева P.A., Перумов Д.А., (1994) Биосинтез рибофлавина у Bacillus subtilis: исследование антивитаминной активности аналогов с модифицированным рибитблом, Биотехнология, 3, 6-10.

14. Кренева P.A., Перумов Д. А. (1996) Генетическое картирование дополнительного регуляторного локуса рибофлавинового оперона Bacillus subtilis, Генетика, 10, 1-8.

15. Кренева P.A., Перумов Д.А. (1994) Генетическое картирование структурных и регуляторных мутаций в области 147° генетической карты Bacillus subtilis, Биотехнология., 7, 12-14.

16. Кренева P.A., Гусаров, И.И., Козлов, Ю.И., Перумов, Д.А., (1997) Фенотипическое проявление делеции в 110 нуклеотидов в регуляторной зоне рибофлавинового оперона Bacillus subtilis. Генетика, 33,№4.

17. Кулаев И.С. (1975) Биохимия высокомолекулярных полифосфатов.МГУ.

18. Миронов В.Н., Чикиндас М.Л., Краев A.C., Степанов А.И., Скрябин К.Г. (1990) Оперонная организация генов биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis, ДАН, 312, 237-240.

19. Миронов В.Н., Перумов Д.А., Краев A.C., Степанов А.И., Скрябин К.Г. (1990) Необычная структура регуляторной зоны оперона биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis, Мол.Биология, 24, 256-261.

20. Морозов Г.И., Рабинович П.М., Бандрин С.В., Степанов А.И. (1984) Организация рибофлавинового оперона Bacillus subtilis, Мол. Генетика Микробиол. и Вирусол., 7, 42-46.

21. Морозов Г.И., Рабинович П.М., Емельянов В.В., Степанов А.И. (1985) Оперон биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis содержит дополнительные промоторы, Мол. Генетика Микробиол. и Вирусол., 12, 14-19.

22. Перумов Д.А. Генетический контроль биосинтеза рибофлавина и его регуляция у Bacillus subtilis (1980) Дисс.д.б.н,- М.,ВНИИгенетики.

23. Рабинович П.М., Бебуров М.Ю., Линевич З.К., Степанов А.И. (1978) Амплификация рибофлавинового оперона Bacillus subtilis в клетках Escherichia coli., Генетика, 14, 1696-1705.

24. Тульчинская Л. С. , Жилина Т. А., Степанов А. И., Березовский В. М. (1975) Исследование в ряду алло- и изоаллоксазина. X. 8-Ы-замещенные аналоги рибофлавина. Журнал общей химии, т.45, с.928-932.

25. Чикиндас М.Л:, Миронов В.Н., Лукьянов В В., Борецкий Ю.Р., Арутюнова Л.С., Рабинович П.М., Степанов А.И. (1987) Установлениеграниц рибофлавинового оперона Bacillus subtilis, Мол. Генетика Микробиол. и Вирусол., 4, 22-26.

26. Чикиндас M.JL, Морозов Г.И., Миронов В.Н., Лукьянов В.В., Емельянов В.В., Степанов А.И. (1988) Регуляторные области оперона биосинтеза рибофлавина Bacillus subtilis, ДАН. 298, 997-1000.

27. Шевченко Т.Н. (1975) Исследование роли ФМН и ФАД в регуляции синтеза рибофлавина у Bacillus subtilis. Автореферат дисс.к.б.н., Киев.

28. Altschul, S. F., Gish, W„ Miller, W„ Myers, E. W. And Lipman, D.J. (1990) Basic local alignment search tool, J.Mol. Biol., 215, 403- 410.

29. Anagnostopoulos C., Spizizen J. (1961) Requirements for transformation in Bacillus subtilis, J.Bacteriol., 81, 741-746.

30. Azevedo V., Sorokin A., Ehrlich S.D., Serror P. (1993) The transcriptional organization of the Bacillus subtilis 168 chromosome region between the spoVAF and serA genetic loci, Molecular Microbiol., 10, 397-405.

31. Bacher A., Biosythesis of flavins, (1991) p. 215-259, In F. Muller (ed), Cemystry and biochemistryof flavins, vol.1, Chemical Rubber Co., Boca Raton, Fla.

32. Bacher A., Baur R., Eggers U., Harders H., Otto M.K., Schnepple H. (1980.a) Riboflavin synthases of Bacillus subtilis: purification and properties, J.Biol.Chem., 255, 632-637.

33. Bacher A., Eberhardt S., Richter G., Neidhardt F.C. (ed) (1996) Esherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology, Washington, ASM Press., USA, 657-664.

34. Bacher A., LeVan Q., Keller P.J., Floss H.G. (1985) Biosynthesis of riboflavin, incorporation of multiply 13C-labeled precursors into the xylene ring, J.Am.Chem.Soc., 107,6380-6385.

35. Bacher A., Ludwig H.C., Schnepple H., Ben-Shaul Y. (1986.a) Heavy " riboflavin synthase from Bacillus subtilis. Quaternary structure and reaggregation, J.Mol.Biol., 187, 75-86.

36. Bacher A., Mailander B., Baur R., Eggers U., Harders H., Schnepple H. (1976) Studies on the biosynthesis of riboflavin, p. 285-290, In Pfleiderer (ed.), Chemistry and biology of pteridines, Walter de Gruyter, Berlin.

37. Bacher A., Neuberger G., Volk R. (1986.b) Enzymatic synthesis of 6,7-dimethil-8-ribitillumazine, p. 227-230, In Cooper B.A., Witehead V.M. (ed.), Chemistry and biology of pteridines, Walter de Gruyter, Berlin.

38. Bacher A., Schnepple H., Mailander B., Otto M.K., Ben-Shaul Y. (1980.b) Structure and function of the ribiflavin synthase complex of B.subtilis, p. 579586, In Yagi K., Yamano T. (ed.), Flavins and flavoproteins, Japan Scientific Societies Press, Tokyo.

39. Birnboim H.C., Doly J. (1979) A rapide alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA, Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523.

40. Bouvet P., Belasco J.D. (1992) Control of the RNase E-mediated RNA degradation by 5'-terminal base pairing in E.coli., Nature, 360,488-491.

41. Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitayion of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem., 72, 248-254.

42. Brey R.N., Banner C.D.B., Wolf J.B. (1986) Cloning of multiply genes involved with cobalamin (vitamin Bj2) biosynthesis in Bacillus megaterium.,

43. J.Bacteriol., 167, 623-630.

44. Brown G.M., Yim J., Susuki Y., Heine M.C., Foor F. (1975) The enzymatic synthesis of pterins in Esherichia coli, p. 219-245, In Pfleiderer (ed.), Chemistry and biology of pteridines, Walter de Gruyter, Berlin.

45. Burgstaller P., Famulok M., (1994). Isolation of RNA aptamers for biological cofactors in vitro selection., Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 33, 10, 1084-1087.

46. Burrows R.B., Brown G.M., Presence in Esherichia coli of a deaminase and a reductase involved in biosynthesis of riboflavin (1978) J.Bacteriol., 136, 657667.

47. Chen N.-Y., Hu F.-M., Paulus H., Nucleotide sequense of the overlapping genes for the subunit of Bacillus subtilis aspartokinase II and their control regions, J.Biol.Chem., 1987262, 8787-8798,.

48. Debarbouille M., Arnaud M., Fouet A., Klier A., Rapoport G. (1990) The sacT gene regulating the sacPA operon in Bacillus subtilis shares strong homology with transcriptional antiterminators, J.Bacteriol., 172, 3966-3973.

49. Devine, K. M. (1995) The Bacillus subtilis genome project: aims and progress, Trends in Biotechnology, v. 13, 6, p.210- 216.

50. Ebbole J.D., Zalkin H. (1987) Cloning and characterization of 12-gene cluster from B. subtilis encoding nine enzymes for de novo purine nucleotide synthesys, J.Biol.Chem., 262, 8274-8287.

51. Fall H.H., Petering H.G. (1956) Metabolite inhibitors. I. 6,7-Dimethyl-9-formylmethylisoalloxazine, 6,7-dimethyl-9-(25'0-hydroxyethyl)-isoalloxazine and derivatives, J Amer Chem Soc., 75, 377-380.

52. Foor F., Brown G.M. (1975) Purification and properties of guanosine triphosphat cyclohydrolase II from Esherichia coli, J.Biol.Chem., 250, 35453551.

53. Googwin T.W., Horton A.A. (1961) Biosynthesys of riboflavin in cell-free systems, Nature (London), 191, 772-774.

54. Hagihara T., Fujio T., Aisaka K. (1995) Cloning of FAD synthetase gene from Corynebacterium ammoniagenes and its application to FAD and FMN production., Appl.Microbiol.Biotechnol., 42, 724-729.

55. Harzer G., Rokos H., Otto M.K., Bacher A., Ghisha S. (1978) Biosynthesis of riboflavin. 6,7-Dimethil-8-ribitillumazine 5'-phosphate is not a substrate for riboflavin sunthase., Biochim.Biophys.Acta, 540, 48-54.

56. Kearney E.B., Goldenberg J., Lipsick J., Perl M. (1979) Flavokinase and FAD synthetase from Bacillus subtilis specific for reduced flavins, J.Biol.Chem., 254, 9551-9557.

57. Kil Y.V., Mironov V.N., Goryshin I.Y.,Kreneva R.A., Perumov D.A. (1992) Riboflavin operon in Bacillus subtilis: unusual symmetric arrangement of the regulatory region., Mol Gen Genet., 233, 483-486.

58. Kis K., Bacher A. (1995) Substrat channeling in the lumasine sythase/riboflavin synthase complex of Bacillus subtilis, J.Biol.Chem., 270, 16788-16795.

59. Kreneva R.A., Perumov D.A. (1990) Genetic mapping of regulatory mutations of Bacillus subtilis riboflavin operon, Mol. Gen.Genet., 222, 467-469.

60. Kunst, F., Ogasawara, N., et al (150 authers) (1997) The Complete Genome Sequence of the Gram -positive bacterium B.subtilis, Nature, vol.390, 20.

61. Lee, C. Y., O'Kane, D., Meighen, E.A. (1994) Riboflavin Synthesis Genes are Linked with lux Operon of Photobacterium phosphoreum, Journel of Bacteriology, Apr., 2100-2104.

62. LeVan Q., Keller P.J., Brown D.H., Floss H.G., Bacher A. (1985) Biosynthesis of riboflavin in Bacillus subtilis: origin of the four-carbon moiety, J.Bacteriol., 162, 1280-1284.

63. Light D.R., Walsh C., Marietta M.A. (1980) Analitical and preparative high preformance liquid chromatography separation of flavin and flavin analog coenzimes., Analitical Biochem., 109, 87-93.

64. Ludwig H.C., Lottspeich F., Henschen A., Ladenstein R., Bacher A. (1987) Heavy riboflavin synthase from Bacillus subtilis: primary structure of the a subunit, J.Biol.Chem., 262, 1016-1021.

65. Lu Y., Switzer R.L. (1996) Evidence that the Bacillus subtilis pyrimidine regulatory protein PyrR acts by binding to pyr mRNA at three sites in vivo, J.Bacteriol., 178, 5806-5809.

66. Mack M., van Loon A.P.G.M., Hohman H.P. (1998) Regulation of riboflavin biosynthesis in Bacillus subtilis is affected by the activity of the flavokinase/flavin adenine dinucleotide synthetase encoded by ribC, Journal Bacteriology, v. 180, p.950-955.

67. Mackey C.J., Warburg R.J., Halvorson H.O., Zahler S.A. (1984) Genetic and physical analysis of the ilvBC-leu region in Bacillus subtilis, Gene, 32, 49-56.

68. D.J.Manstein and E.F.Pai (1986) Purification and Characterization of FAD Synthetase from Brevibacterium ammoniagenes, J.Biol.Chem, vol.261, №34, 16169-16173.

69. Maley G.F., Guarino D.U., Maley F. (1983) Complete amino acid sequence of an allosteric enzyme, T2 bacteriophage deoxycytidilate deaminase, J.Biol.Chem., 258, 8290-8297.

70. Mandel M., Higa A. (1970), Calcium dependent bacteriophage DNA infection, J. Mol. Biol., 53, 154-162.

71. Merino E., Babitzke P., Yanofsky C. (1995) Trp RNA-binding attenuation protein (TRAP)-trp leder RNA interaction mediate translation as well as transcriptional regulation of the Bacillus subtilis trp operon, J.Bacteriol., 177, 6362-6370.

72. Mironov V.N., Kraev A.S., Chikindas M.L., Chernov B.K., Stepanov A.I., Skryabin K.G. (1994) Functional organization of the riboflavin biosynthesis operon from Bacillus subtilis SHgw, Mol. Gen. Genet., 242, 201-208.

73. Nakagawa S., Igarashi A., Ohta T., Hagihara T., Fujio T., Aisaka K. (1995) Nucleotide sequence of the FAD synthetase gene from Corynebacterium ammoniagenes and its expression in Escherichia coli., 4, 694-702.

74. Neuberger G., Bacher A. (1986) Biosynthesis of riboflavin. Enzymatic formation of 6,7-dimethil-8-ribitillumazine by heavy riboflavin synthase from Bacillus subtilis, Biochem.Biophys.Res.Commun., 139, 1111-1116.

75. M.Oka and D.B.McCormick (1987) Complete Purification and General Characterization of FAD Synthetase from Rat Liver, J. Biol. Chem., Vol.262, №15, pp.7418-7422.

76. Pearson, W. R. & Lipman, D. J., (1988), Improved tools for biological sequence comparison, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 24444- 2448.

77. Perkins J.B., Pero J.G., Sloma A. (1991) Riboflavin overproducing strains of bacteria., European patient application 0405370.

78. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463-5467.

79. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel B., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 239, 487.

80. Saito H., Miura K.I. (1963) Preparation of the transforming deoxyribonucleic acid by phenol treatment, Biochim. Biophys. Acta., 42, 619-629.

81. Schoepfer, R (1993) The pRSET family of T7 promoter expression vectors for Esherichia coli, Gene 124, pp.83- 85.

82. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., Dubendorf, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymology, 185, pp. 60-89.

83. Schecker A. W, Kornberg A. (1970) Reversible enzymatic synthesis of flavmadeninnucleotide, J.Biol. Chem., ,v. 182, p. 795-801.

84. Song B.H., Neuhard. (1989) Chromosomal location, cloning and nucleotide sequence of the Bacillus subtilis cdd gene encoding cytidine/deoxycytidine deaminase, Mol.Gen.Genet., 216, 462-468.

85. Sorokin A., Azevedo V., Zumstein E., Galleron N., Ehrlich S.D., and Serror P., (1996) Sequence analysis of the Bacillus subtilis chromosome region between the serA and kdg loci cloned in a yeast artificial chromosome., Microbiology., 142, 2005-2016.

86. Sorokin A., Zumstein E., Azevedo V., Ehrlich S.D., Serror P. (1993) The organization of the Bacillus subtilis 168 chromosome region between the spoVAF and serA genetic loci, based on sequence data., Molecular Microbiol., 10, 385-395.

87. Sun, Y- J, Rose, J., Wang, B- C., Hsiao, C- D. The structure of Glutamine-binding protein Complexed with Clutamine at 1.94 A Resolution: Comparisons with other Amino Acid Binding Proteins (1998) J.Mol.Biol. 278, 219- 229.

88. Turner R.J., Lu Y., Switzer R.L. (1994) Regulation of the Bacillus subtilis pyrimidin biosynthetic (pyr) gene cluster by an autogenous transcriptional attenuation mechanism, J.Bacteriol., 176, 3708-3722.

89. Weng M., Nagy P.L., Zalkin H. (1995) Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 92, 7455-7459.

90. Udenfriend S. (1962) Fluorescence assay in biology and medicine., N.Y., Acad.Press., 236-245.

91. Zalkin H., Ebbole J.D. (1988) Organisation and regulation of genes encoding biosynthetic enzymes in Bacillus subtilis, J.Biol.Chem., 263, 1595-1598.

92. Zanker, H., von Lintig, J., Schroder, J. (1991) Opine Transport genes in Octopine (occ) and Nopaline (noc) Catabolic Regions in Ti Plasmids of Agrobacterium tumefaciens Journal of Bacteriology, Feb., 841- 849.