Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности экспрессии гена 26 базальной пластинки бактериофага Т4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспрессии гена 26 базальной пластинки бактериофага Т4"

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи

ВАЙШКУНАЙТЕ РИТА ИОНО

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА 26 БАЗАЛЬНОЙ ПЛАСТИНКИ БАКТЕРИОФАГА Т4

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ВИЛЬНЮС -1992

Работа . выполнена в Лаборатории генной инженерш Института биохимии.

Научные руководитель

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Р.Г. НИВИНСКАС

Официальные оппоненты - член-корреспондент Литовской АН,

доктор биологических наук, профессор A.A. ЯНУЛАИТИС

- кандидат биологических наук, стардий научный сотрудник :э.А. РАЧКУС

Ведущая организация

- Кафедра биохимии Естественного факультета Вильнюсского Университета

Защита диссертации состоится июня 1992 г. в //{часов на заседании специализированного совета К 011.05.01 в институте биохимии, 2600 Вильнюс, ул. Ыокслшинку, 12. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии.

Автореферат разослан мая 1992 г.

Ученый секретарь специализированного -совета, кандидат биологических наук

f. &оо

В.Ф. Зовите-Браженене

В.BE ТВНЙЕ

/•дуальность шт. Проблема регуляции экспрессии генов является одной из основных в молекулярной биологии. Именно рэгуляторная взаимосвязь трарпкртпш и трансляции определяет конечный уровэ! j синтезируемых продуктов генов бактериофага Т4 в зарааентш клетках 4 Исследования регуляции тран^фипцнн генома фага Т4 показывают, что в строго определенной временной последовательности синтезируются i^ra .основные классы mFHK (ранние, средние и поздние). Долгое время считалось, что транг-рипция ранних генов происходит с 1-цэпи ДИК против часовой стрелки, а транскрипция поздних генов - с r-цепи ДНК по часовой стрелке на генетической ларта фага Г4 (Guba et al., 1971; Wood, Revel, 1976; O'Farell et Л., 1980). Однако, в последнее время выяснилось, что направление транскрипции не nose? быть критерием &«я классификации генов на ранние и поздние: появляется все больше доказательств того, что поздние гены такне могут транскрибироваться с 1-цепи ДНК (Kacrtonald et al., 1984; McPlieeters et al., 1986; Barth et al., 198ь и др.).

' Так, в группе - эздних генов базальной пластинки гены 26 а 25, в отличие от генов 51, 27, 28, 29, транскрибируются против часовой стрелки на генетической карте фага (Клауса, Нивинскас, 1988). Следоьательно, в участке мевду генами 26 и 51 происходит иницаац. i транскрипции в противоположных направлениях, что п об,уел вило интерес к структуре регуляторной области гена 26.

'Особый интерес представляет регуляция экспрессии .генов, кодирующих по два полипептида с различной мол. массой, когда меньший полипептид фактически представляет собой С-концэвув часть большего полипептида. У бактериофага Т4 такими являются ~ен 17 (Moslg, Eiserling, 1988), ген 49 (Barth et al., 1988) и ген 69 (ИасйопаШ, Moslg, 1984). С эдует отметить, что продукт гена 26 первоначально был вдентифйцирован в структуре центральной части базальной пластинки как белок с юл. массой 40-41 кДа (Kozloir, 1981; Koalott, Lute, 1984). В то же время, при экспрессии гена 26 в составе рекомбинантной плазмида его продукт идентифицирован как белок с мол. массой 24 кДа (1Слауса, Нивинскас, 1990). Представляется возможным, что обнаруженные различия в мол. массе продукта гена 26 могут быть обусловлены наличием двух продуктов этого гена.

- г -

Вышеизложенное предопределило выбор участка ДНК с геном 26 бактериофага Т4 в качестве объекта исследований. Актуальность выбранного направления наших исследований обусловлена тем, что информация об особенностях экспрессии гена 26 фага Т4 будет способствовать дальнейшим исследованиям регуляции экспрессии генов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работа явиюсь изучение особенностей экспрессии гена 28 бактериофаге Т4, а такко определение структурной организации генома в облает в?"-'.- гена. Задачи исследования:

1) доказать, что ген 26 фага Т4 кодирует два полшептсда с различными мол. массами;

2) определить первичные структура генов 26 и 51 фага Т4;

3) определить локализацию амбер-мутаций ®й105, ап1Ю114 ь олМ131 в нуклеотвдной последовательности гена 26;

4) определить кодон, тгациирукщий синтез второго продукта гона 26 фага Т4;

5) показать зависимость эффективности инициации синтеза второго продукта гена 26 от вторичной структуры РНК в участке связывания рибосом.

Научная новизна работы. В результате клонирования к экспрессии гена 26 в дауплазмвдной система впервые получены доказательства того, что продуктами гона 26 являются два полипеятида с мол. массами 24 и 8-9 кДа, причем полшзептяд 8-9 кДа кодируется концевой часть» одной и той ке открытой рамки считывания.

Определена первичная структура гэна 26 фага Т4, состоящая из €24 иуклеотидов. Определена локализация амбер-мутаций сий105, атШ114 и аяИ131 в нуклооткдкой последовательности гена 26. Установленная и опубликованная последовательность гона 26 (Шл1лг!каа ег а1., 1990) была полностью подтверздеЕа в работе вгоКЦ ее аК (1991).

Определена первичная структура гене 51 фага 14. Нами установленная нуклеотидаая последовательность в значительной степени совпадает с последовательность» гена 51, опубликованной ¡ЗсагШо ег а1. (1989), тем не менее в грех ее участках наблюдаются различия, приводящие к не соответствия!,I пяти аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности продукта отого гена.

Впервые показано, что АТО-кодои, 114-ый триплет гэна 26, является иницщфугзщм кодовом для синтезе второго продукта гена 26. Установленное нами использование Аии-триплета в качестве инициирующего 'кодояа является уникальным случаем для бактериофага Т4. Показано, что эффективность инициации синтеза второго 21родунтг гека 26 зависит от вторичной структур! РНК в участке связывания рибосом.

Практическое значение работы. Настоящая работа является часть» фундаментальных исследований регуляции экспрессии генов бактериофага Т4. В то же время некоторые эе результаты могут найти и практическое применение, в частности, при создании наиболее эффективной системы внеклеточного синтеза белка.

Работа выполнена в рамках научно-технической программа 0.74.05 '(Физико-химическая биология) по теме Института биохимии "Изучить механизмы активации и направленной экспрессии генома" (й Госрегистрации 01 87 0049912).

Нуклеотвдные последовательности генов 26 и 51 фага Т4, представленные в работе, зарегистрированы в банке данных Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии (ЕНВЬ, Гойдельберг. ФЕГ) под номерами Х1Т685 и Х55132, соответственно, и могут быть использованы з научных лабораториях, ведущих работа по генной инженерии и молекулярной биологии.

Материал диссертационной работы ^пользуется' при чтении лекций по молекулярной генетике для студентов V курса Химического факультета Вильнюсского университета.

Апробация работы. Материалы диссертации докладавались на научных конференциях Общества генетиков и селекционеров Литвы (Вильнюс, 1988, 1989); на Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1939); на Эвергринсксй международной конференции по бактериофагу Т4 (Олимпия, США, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи и ■"взисы 5 'докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит кз введения, обзсп.з литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и ах обсуждения, выводов. Диссертация и&ложэна не страницах машинописного текста, включая список литературы ш/2/наименований. 6 таблиц и 31 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования - геи 26 бакт^тяофага Т4.

Штериалы. Штамм Б. coli НВ101 служил в качестве реципиента при конструировании рекомбинантных плазыяд. ©тема В. colt JHIOI был использован при работе с, фаговыми векторами Ш атгр10 н Ш3кр11, о плазмиадыми векторами pTZ18R и pTZ19Е, а также для подготовки фага-помощника Ы13К07; все - фирмы "Pharmacia". Штаммы В. coli HKS174 {recÄ 1, IiaOR) с плазмидой рТ7-5 и Е. coli К38 (EfrCk) с плазмидой pGPl-z получены от s. Tabor (Ыедпданс-кая школа Гарвардского университета, США). Амбер-мутанты craS52, otiNG91 и сиN67 по" гену 26, craS105, csnNGIU и шН131 по гену 26, CCTS29 и ш®С462 по гену 51, mN120, amNG35 и amS92 по гену 27 фага 14 получены от W.B. Wood (Колорадский университэт, ША).

Фаговые векторы HI Зглр1 о и ш I Зяр11 были использованы для клонирования и секвенирования ДНК фага Т4. Плазмпда рТ7-5 была использована для клонирования и .экспрессии генов фага Т4 в двуплазмшщой системе РНК-полшеразы фага Т7, а плазмидц pTZ18R п pTZ19R - для клонирования, секвенирования и олигонуклеотид-направленного мутагенеза In vitro ДНК фага Т4. Олигодезокси-рибонуклеотидные прайморы были синтезированы в Институте Биотехнологии "Ферментас".

Методы. Выделение плазмидной ДНК репликативной и одноце-почечной ДНК фага Ы13, одноцепочечной ДНК плазмид серии pTZ, гидролиз ДНК рвстриктазамн, достраивание укороченных З1-концов двухцепоч'ечной ДНК, отщепление нуклеотидов с концов двухцеьо-чечной ДНК с помощью ну леезы BaI31, дефосфорилирсзание ДНК, лигировшшо фрагментов ДНК, олигонуклеотнд-направленный мутагенез in vitro, трансформацию и отбор трансформантов, а также электрофорез ДНК в агарозном геле и в денатурирующем полиакрил-амидном гел© главным образом проводили по методикам, описанным в работах Hanlatis et.al. (1982) и Sambrook. et al. (1989).

Фрагг нты ДНК фага Т4 в составе рекомбинс-лтных плазмид генетически идентифицировали методом "спасения маркера" (Mattson et al., 1977), используя амбер-мутанты фага Т4. Экспрессию фаговых генов в двуплазмидной системе РНК-полшеразы фага Т7 проводили по методике Tabor (1990). Электрофорез белков проводили в градиентном ПААГ (10-17,5$ акриламида, 5-20Ж сахарозы) в присутствии 0,1% SDS. Нуклеотидную последовательность ДНК

определяли дадезохссищпшотидаш ывтодом Sanger et al. (19Т7).

РЕЗУЛЬТАТЫ Iî ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выявление двух продуктов экспрессии гена 26 фага Т4

О целью изучения экспрессии гена 26 на первое этапе пата работа било проведено _ клонировать ЕсойУ-В^Ш-фрашента ДНК фага Т4 длиной в 1,9 т.п.н. с генами 51, 26 и 25 з векторную илазмиду рТ7-5, содэркащую промотор фЮ фага Т7. Сконструированная рэкомбинантная плазмида pRR5-3 (piïc. 1 ) была введена в клетки Е. coll КЗЗ (HfrCk), содержащие плаз?,ищу pGP1 -2 с геном Ш£-полимеразы фага Т7 (Tabor, Richardson, 1985). Созданная таким образом двуплазшдная система (РНК-полкмераза Фага Т7/промотор фага 17) позволила индуцировать транскрипцию с промотора фага Т7 рвкомбинантннх шртивд в условиях подавленной транскрипции генов клетки--хозяина, т.е. анализировать белки, кодируете только.генами рэкомбинантиых плазмкд.

В результате анализа фаговых белков в система FIIK-полимеразы фага 17 было показано, что с SccRV-iJgZ П-фрогмзнта индуцируется синтез трех полипептидов (рис. 2), и определено, что полипептид с мол. массой 15 кДа является продуктом гена 25, а Оэлок с мол. массой 24 кДа является продуктом гена 26. Чтобы установить, продуктом какого-же гена является белок с мол. массой 8-9 кДа, необходимо было субклонировать этот фрагмент. Для этого был проведен рестриктазннй' анализ ЕсоШ-BglII-фрагмента ДНК фага . Т4 (рис. 1), который явился основой тгрп дальнейшем конструировашп! рекомбинантных плазмид серии'рГО. В результате проведенного субклонирования была получена плазмида р1Ш5-311 (рис. 1), содержащая 4зи11-Я(шШ1-фрагмент ДШ£ с геном 2S фага Т4 длиной 0,78 т.п.н., и показано, что с этой плазкида индуцируется синтез двух полипептидов с мол. массами 24 и 8-9 кДа (рис. 2). Для кодирования этих двух бежав необходимы две открытые рамки считывания протяженностью более 600 и 200 нуклеотидов соответственно. Так как они не могут поместиться во фрагменте фаговой ДНК длиной 0,78 т.п.н. без, по крайней мере, частичного их перекрывания, потребовался дальнейший анализ.

Так, в результате действия рестриктазы Азии и нуклеазы Ш131 на плазмиду pRR5-3 были получены делеционные производные,

- б -

05* кЬ

}1!с. 1. Схема конструирования рекомбинантных плазмид рНН5-3 = р.ГО5-31, рШ15-311 и рНК5-32. Сверху изображена векторная плаз.'.гид:) рТ7-5 к плазмида рКЬТ05, содержащая БиИ-фрагмент ДНК о гелзди 25, 26, 51, 27, 28 и 29 фага Т4. внизу изоСоазкена эйстржгазная карта гсоКУ-й^ги-фрашзнта ДНК фага Т4.

Рис. 2. Электрофоретическое разделение продуктов экспрессии генов фага Т4 в двуплазмидной системе, содержащей пдазмкду иСИ-г я плаз-мида: рГО5-3 (2). вРЛЪ-31 ч рЛЛ5-311 (4); стандарты молэкуляр-ной массы в кДа (1).

содержащие различной длины делении в районе генов 51 и 25 фага Т'4. При изучении экспрессии генов фага 74 в двуплазмидной системе установлено, что фрагмент фаговой ДНК длиной около 0,66 т.п.н.„ начинающийся между участке?,и действия рестриктаз Лзг/11 и гтьа! и заканчивающийся перед участком действия рестриктазы Я£л<НП, кодирует белок с мол. массой 24 кДа - продукт гена 26, а концевая часть этого фрагмента ДНК кодирует белок с мол. массой 8-Э кДа. Для ответа на вопрос, существует ли другая открытая рамка считывания для кодирования белка с мол. массой 8-9 кДа или же это концевая часть той яе самой рамки считывания, кодирующей белок с мол. массой 24 кДа, было предпринято слияние генов 26 и 25 с помощью небольших дедецкй в участке действия рестриктазы #(шИ11„ С этой целы» была сконструирована плазмида рЖ5-32 (рис. 1), получены-ее деле-цнонные производные, и проведен анализ фаговых белков в двуплазмидной системе. В результате анализа было показано, что продуктами гена 26 являются два полшепткда с мол. массами 24 кДа (ер2б) и 8-9 кДа (gp2б*), причем полипептид 8-9 кДа экспрессируется с концевой части этого гена и, по-еядимсму, кодируется той зхе самой открытой рамкой считывания гена 26. Для подтверждения этого предположения возникла необходимость определить нуклеотидну» последовательность гена 26.

2. Определение и анализ первичных структур генов 26 и 51 фага Т4

В результате секвенирования ЕооШ-Н I гиНП-фрагмента ДНК длиной е 1474 п.н., содержащего гены 26 и 51 фага Т4 (рис. 3), было выявлено, что кодирующая белок последовательность гена 26 состоит кз 624 нуклеотидов и кодирует полипептид, состоящий из 208 аминокислотных остатков с мол. массой 23880 Да (р! =6,06).

1 2 а 4

кОа 30.0— «за

21.5- «я»

12.5- «2» С£>'

д_5_ ___ -та» СЗ* й=а>

£c«RV íi****

GATATCCBBGGCBTTGCflACATftCTCflTTflTTGTTTATCCTTCTCAflTCflGTTrTflATACSAATCCBCBCT

GENE 27 ED

CGGCAGGAATCArrTTCATTATTBAATTTAAQCTATAATTACTTTTTACEABTETETGATTAATTTGATAA

Accl

^AAOTAAATeTCTCATCTGGSTTAACTAATAoCTTAAACACGTCTACTATATCASTGTATTTTTTAA TGTA I---A42— >

CTTATTACAGCATGACATBTGTAGAGTTAAATTAATAGBATTCATTGCATCGAGAATTTTTTCTftATGTTT

CTATCTCGATGGCGTCAACTAGfTCTATTTBflCTGGACTCBCTAATTTCCTTCCAATCATACCATATTTCA —A23—>

TCTACTTGaACAGftATQAATATTTTCAGTAATCATCTTTGCTTTATTTTCATflAftACTCftGAftGGAAACTT

I---Д20—>

TAATTTAATTTTAACATTAGC7ACATCAAAAACAGGTTCCTTTAATTCTTTTTGATATATTTCAAATGGAA

CTGTCTTTTCTTTTTTACflTTTTGGftCATATAAATBTGACCSQTACTTTAGTTTTACCTATTGACCCTACA

AATACCTGCAAAAATATAAATGGTTGCCAAGTCTTCGGATAGTCTCCAAAATAATCATCAATTAAATCABT

Asull

AATTATTTCTTTTTGTTCTTGTBSTSACCGATGTTCTATATCGTTTCGAflCTAACAAAAAATCTCBATAAT

CTTCTACCGTAAATGGTTTAAAACGATGflACACCflTCTEGTAATTTACAACGflATAATGTTTGCCATABAT

GENE SI

PL26a-> PL26b-> вп GENE 26 . P, 26c- ■>

GCTCCTTTTATTqrATT|rATAflATA|rpATAAAfAftAB¿AG ipTAAAT ATS frAi GAA TAp AAA TTT 18

50 < -P, 51 L i Ket iyr elu Tyr Lys Pha 6

GAT GTG ABA GTT GuT TCT AAA ATA АТС AAT TGT CSC GCA TTC ACQ CTT AAA ВЙА TZ

Asp Val Xb a 3 Arg Val Gly Ser Lys He He Asn Cys Arg Ala Phe Thr Leu Lys eiu 24

TAT СТА GAA CTT ATT ACT GCC AAA AAT AAT BGT TCC GTA 6AA GTA ATT GTT AAA S26

Туг Leu 61u Leu lie Thr Ala Lys fisn Asn Bly Ser Val Slu Val He Val Lys 42

AAB СТА АТС AAA GAC TEC ACA A AT GCA ABA BAT TTA AAC cec CAA GAñ TCA GAA ISO

LyB Leu lit! Lys Asp Cys Thr Asn Ala Lys Asp Leu Asn ñrg El Г! Blu Ssr Glu 60

iS105 <-- -Д20- i

СТА 7TB TTS ATT CAT TTA TGG GCA CAT TCT CTC SET BAA GTT ААТ CAC BAA AAC 234

Leu Leu Leu lie His Leu Trp Ala His Ser Leu Gly Glu V a 1 Asn Hi D Glu Asn 78

afliNGl 14 Apa LI L

ТСС TGS AAG TEC ACC TGT GGA ACT GAA ATA CCfl ACC СйГГ йТА "АйТ" CjTA TTA CAT 2S8

Ser Tf-p Lys Cys Thr Cys Gly Thr Glu lie Pro Thr Hla lie Asn Lou Leu His 9 6

<- —Л25---1 a* ,N131 . Лее! SO gp26 t

АСА САЙ ATA EAT BCA CCA GAA SAC CTC TGG TAT АСА СТА GST ВАС ATT AAA AT.T 342

Thr Gin lie Asp Ala Pro Glu Asp ■Leu Trp Tyr Thr Leu Gly Asp ile Lys Ile 114

AAA TTC CGA TAC CCT AAA ATT TTT GAT GAT AAA AAT ATA БСС CAC ATG ATA STfi 396

Lys Phe Arg Туг Pro Ly.-. lie Phss Asp ftsp Lys Asn Ile Ala His Met He Val 132

<- —Л42---1

TCA TGT ATA GAA ACG ATT CAT GCT AAC BGG GAA AG С ATT CCA BTT GAA БАС TTA 450

Ser Cys lis Glu Thr lie His Ala Asn Ely Glu Ser Sle Pro Val Glu Asp Leu 150

ЙАТ GAA fiflG GAA CTfl GAA SAT TTA TAT TCT АТС АТС ACfl, GAS TCA GAT ATT GTA 504

Asn Glu Lys GJu Leu Glu Asp Leu Туг Ser He lie Thr Glu Ser Asp Ile Val 168

GCT А ГА AAA GAT ATS CTT TTA AflG CCT ACC GTT TAT TTG GCT GTT CCA ATT AAB 55B

Ala ¡le Lys Asp Met Leu Leu Lys Pro Thr Val Туг Leu Ala Val Pro IlE Lys 186

TGT CCA GAGTH-ST GGA AAA ACC CAT GCT CAC GTA ATA ABA GGC CTC AAA GAG TTC 612

Cys Pro Glu~Cys Gly Lys Thr His Ala His Val Ile Arg Gly Leu Lys g'iu Phe 201

SD BENE 25 Hindi 11

TTT GAB TTA СТА TAA1GÜCAAATATTAATAAGCTT 624

Phe Glu Leu Leu *** 208

Рис. 3. Нуклеотидная последовательность EcoRV-fftndIII-фрагмента ДНК длиной в 1474 п.н., содержащего гены 51 и 26 фага Т4.

Спптоз этого полипептдца инициируется на AUG-кодоно, на расстоянии шести нуклеотидов от которого обнаруживается регулятор-ннй сигнал трансляции - последовательность Шайна-Далгарно AAGGAG, а перед ней - гчздвий промотор гена 26, PL25a, содэраа-щий последовательности ТАТАААТА. Зтот промотор перекрывается с поздним промотором гена 51, Pj51, в случае которого синтез'МЕНК инициируется с комплементарной нити ДНК по направлению часовой стрелки на генетической карте фага Т4. Наряду с промотором Pj25a находятся еще несколько промоторов гена 26 (рис. 3). Так, в мекгенном участке, непосредственно за вышеупомянутым промотором Pj26a, локализован второй промотор гена 26, РЬ26Ь, содерза-щий не совсем типичную для поздних промоторов последовательность GATAAATA. В начале кодирующей последовательности гена 26 обнаружен ецэ один поздний промотор, Pj26c, содержащий последовательность TATGAATA. Следует таете отметить, что. в гене' 26 обнаруживается промоторная последовательность ТАТАААТС, однако, соответствующих транскриптов in vivo не обнаружено (Gruidl et al., 1991 В нуююотидной последовательности гена 26 обнаружены три потенциальных амбер-участка (TGG), причем локализация конкретных гчбер-мутамй в этих участках основана на последовательности их. расположения, установленной наш в опытах по спасении маркера с использованием делеционных производных плазмид.

• Наряду с этим была определена и- первичная структура гена 51 (рис. 3). Установлено, что кодирующая белок последовательность гена 51 содержит 747 нуклеотидов и кодирует полипептид из 249 аминокислотных остатков с мол. массой 29387 Да (р! = 6,34).

Тот факт, что в установленной нуклеотидной последовательности гена 26 не удалось обнаружить отдельную рамку считывания для кодирования полипептида с мол. массой 8-9 кДа, подтвердил наше предположение, что с*лтез второго полипептида гена 26 инициируется одним иь кодонов одной и той же открытой рамки считывания этого гена.

Однако, на .основе проведенного анализа предсказание внутригенного инициирующего кодона явилось затруднительным из-за отсутствия ярко выраженного участка связывания рибосом. С учетом этого было решено экспериментально локализовать внутри-генный участок, необходимый для инициации синтеза второго продукта гена 26, с последующим определением инициирующего кодона в этом участке.

3. Определение внутригенного участка, ответственного за

инициацию синтеза второго продукта гена 26 С целью выявления участка нуклеотидной последовательности, необходимого для инициации синтеза второго полипептида, были изучены продукты экспрессии гена 26 с плазмид, содержащих различной длины последовательности концевой части этого гена. При этом мы использовали некоторые из ранее полученных делецконных производных плазмиды рЮ5-3 (рГШ5-ЗД20, рШ15-ЗЛ25 и рКН5-ЗЛ42), содержащих различной длины делении в районе -генов 51 и 26 (рис. 4). При секвенировании этих производных были уточнены границы делений в нуклеотидных последовательностях упомянутых генов (рис. 3). Кроме того, были сконструированы производные плазмиды рМ15~311 (рКК5-311 -1, рйН5-311-2 и рИН5-31I-3), содержащие различной длины фрагменты концевой части гена 26 (рис. 4).

к о о ш

и

о <

СЕМЕ 51

ьз=

115.8

га л X

V

га о

а. о <<

СЕМЕ 26

•о с

О)

иЗ

|семе 25

115.4

и 5.0

114.6

рИИВ-З

114.2 кЬ

ьс

ы=

Ы=

-589 Ьр — - 774 Ьр--1028 Ьр-

з>—и

рРШ5-311 & рНН5-ЗТМ & рЙЯ5-311-2 рЯВБ-ЗП-З

рртЕ-здгс

рЙЙ5-ЗД2£ рНЯВ-ЗД«

Рис. 4. Схематические карты делений плазмид рИН5-ЗА20, рИН5-ЗД25 и р1Ш5-ЗД42, -а тага® производных плазмиды р1Ш5-311.

В результате экспрессии генов плазмиды рйН5-3 и ее деле-ционных производных в системе РНК-полимеразы фага Т7 (рис. 5) показано, что в случае плазмиды рВД5-3, содержащей гены 26 и 25 в благоприятной для. их экспрессии ориентации, наблюдается синтез двух полипептидов гона 26, а также полипептида'гена 25 с

. п 12 34 5 6789 10 кРа

30.0- _

21.5- с-»

12.5- С"} <ГЗ 6.5- ^^ «юя» «¿я» с ' £

Рис. 5. Электрофоретическое разделение продуктов экспрессии гена 26 фага Т4 в двуплазмидной системе, содержащей плазмиду рОР1-2 и плазмидн: рНИ5-3 (2), рИ15-ЗЛ20 (3), рШ5-ЗА25 (4), рНЙ5-ЗД42 (5), рШг5-311 (6), рГО5Ч311-1 (7), рНН5-311-2 (8), рПП5-311-3 (9), рТ7-5 (10); стандарта мол. массы в кДа (I).

мол. массой 15 кДа. В случае плазмид рИЛ5-ЗД20 и рШ5-ЗЛ25 с делениями, охватыващими соответственно 227 и 300 п.н. последовательность гена 26, наряду с продуктами гена 25 наблюдается синтез только полипептида 8-9 кДа гена 26. С шаг?,иди рШ15-ЗД42 с делэцией, охватывающей 414 п.н. последовательности гена 26, индуцируется только белок в 15 кДа - продукт гена 25.

Таким образом, результаты изучения цродуктоз экспрессии генов с дэлеционных производных плазмэды рГО5-3 указывают на то, что инициация синтеза 'второго полипептида гена 26 происходит з участке меаду 300 и 414 нуклеотидами гена 26. Упомянутый участок гена 26 был несколько сужен в результате анализа экспрессии гона 26 с производных илазмиды рНН5-311. При этом показано, что в случае плазмиды' рЕН5-311, содержащей Asu.II-Я£п£21П"фр'агмбнт ДНК с полной нуклеотидной последовательностью гена 26, наблюдается синтез двух полипептидов, а' в случае плазмид рНН5-311 -1, рКй5-311-2 и рЕИ5-311-3 с неполны?® последовательностями этого гена наблюдается синтез полипептида 8-9 кДа (рис. 5), Индуцирование синтеза полипептида 8-9 кДа даже в случае плазмиды рШ5-311~3, содержащей- лишь AccI-HtndJ.II-фрагмент Фаговой ДНК, указывает на то, что инициация синтеза второго пслипептида гена 26 происходит мевду участком действия рестркктазы асс1 и границей делеции в плазмиде рРЛ5-зд42, т.е. во внутригенном участке от 320 до 414 нуклеотида кодирующей после довательЕости гена 26. Дальнейшей нашей задачей явилось определение инициирующего кодона, локализованного в этом участке.

4. Опрэделение кодона» ишщшгрувдэго синтез второго

продукта гена 25 фага Т4 Известно, что ишциирунцим крдоноы трансляции большинства Е. coll мРНК является кодон AUG (91»), а рош GUG (ЗЯ) п ШС-(12) (Gren, 1984; Stormo, 1936). Вышеупомянутый участок гена 26 содержит только один AUG-кодон (в позиции 888-ой нуклэотцд гена 2S) Е mi одного из двух других возможных инициирующих кодонов, т.е. GUG или UUG. Возможность. использования этого AUG-кодона т проверили с помощь» олигонуклеотвд-нацравлэнного мутагенеза in vitro, заменив AUG-кодон на ACG-кодон. Анализ синтеза белков в двуплазмидной системе показал, что в случае такой вамэш (плазмида pHR5-3l1M1) уровень синтеза полипептида 8-9 иДа гена 26 не изменяется по сравнению с синтезом атого бежа в случае контрольной плазмида рШ15-311 (рис. 6), и, следовательно, AUG в положении ЗЗЗ-ой нуклеотид не является иншщрувдим кодовом для синтеза второго полипептида гена 26. Такой результат- но являэтся столь неожиданным, так как в ;,этом случвз последовательность Шайна-Далгарно была бы представлена всего лииь двумя нуклэотидами (AG).

5 6 7

Рис.6. Электрофоретическое разделение продуктов экспрессии гена 26 фага Т4 в двуплазмидной системе, содержащей плазмиду рОР1-2 и плазмида: рНН5-311 (2), рДНБ-ЗИШ (3), рНЙ5-311К2 (4), рйн5-ЗПКЗ (5), рНН5-311М5 (6), рТТ-5 \Т); стандарты молекулярной массы в кДа (1).

Следует отметить, что в настоящее время известны два примера использования АШ-триплета в качестве инициирующего кодона (Басегсюг ег а1., 1932; РоХагй ег а!., 1991). В вышеупомянутом участке нуклеотидной последовательности находятся четы-

1 '2 3 4

kDa

30.0-

«ыед» . «ада,.

2Л I" ........

L&- ■

12.5- ~ -

6.5- —

ре АШ-триплета, но только пород одним из них, в тологении 340-03 нуклеотнд, в участке связывания рибосом обнаруживает-"хорошая" SD-после до*" дельность - AGGUGA. О помощью олиго-нуклеотид-направленного мутагенеза упомянутый АЩЬкодон был заменен ЦШ-кодоном. Анализ продуктов экспрессии гена 26 с полученной плазмиды pRR5-311Н2 показал, что в случае замены AUU (Ile) -> UOU (Phe) в положении 340-ой нуклеотид, наблюдается очень сильное снижение синтеза полипептида с мол. массой 8-9 кДа, тогда как уровень синтеза полипептида в 24 кДа не изменяется (рис. б). С целью подтверадения того, что этот кодон является инициирущим кодоном второго полипептида гена 26, мы на: ¡пиля нуклеотидную последовательность в участке связывания рибосом, т.е. SD-последовательность AGGITGA перед AUU-кодоном была измазана на последовательность ÀCGUAA. При анализе сштева белков с полученной плазмиды pRR5-311H3 (рис. 6) было показано, что синтез полипептида 8-9 кДа гена 26 полностью отсутствует. Эти данные убедительно указывают на то, что синтез второго продукта гена 26 инициируется именно с этого AUU-кодона, т.е. с 114-ого триплета гена 26. На основе нуклеотидной последовательности установлено, что вторым продуктом гена 26 является полипептид, состоящий из 95 аминокислотных, остатков (принимая Met за первую аминокислоту) с мол. массой 10873 Да (pi = 5,90).

• В случав зь*аены AUU -> ОТО в положении 340-ой нуклеотид (рис. 6) наблюдаемый хотя и небольшой, но все аэ ощутимый синтез полипептида 8-Q кДа, видало, указывает на то, что трансляция в некоторой степени может инициироваться и с UOU-трип-лета, или » она инициируется с AUU-триплета в положении 334-ый нуклеотид. Для проверки такой возможности мы изменили AUU (Не) -> AAA (Lys) в положении 334-ый нуклеотид. Анализ синтеза белков в двуплазмидной системе показал, что в случае такой замены, уровень синтеза полипептида в 8-9 кДа не изменяется. Наблюдаемый ощутимый уровень синтезч полипептида 8-9 кДа указывает на инициацию трансляции с UUU-кодона. В связи с этим следует подчеркнуть, что нами не„обнаружено литературных данных об использовании UUU-триплета в качестве инициирующего кодона. Довольно эффективная инициация синтеза второго продукта гена 26 с AUU-кодона, как и возможность инициации синтеза этого продукта даже с UUU-триплета, позволяет предположить наличие особенной структуры РНК в участке связывания рибосом.

- к -

Следует отметить, что в начале кодирущэЁ последовательности гена 26 обнаруженный поздний промотор Р^26с (риг 3) индуцирует транскрипты, б'-конец которых соответствует 17-сму нуклеотиду кодирущей последовательности гена 26 (Сги1й1 з* а1., 1991). Очевидно, что тренскрипта, индуцированные с ©того промотора, могут быть использованы только для синтеза второго продукта гена 26. Нельзя исключить возможность „ что такой длинный участок РНК перед инициирующим кодовом второго продукта гена 26 необходим для формирования вторичной структуры, способствующей эффективной инициации трансляции с А1Ш-кодона.

Анализ нуклеотидной последовательности в участке связывания рибосом указывает на формирование шпилькообразной структуры, которая укладывается двуыя возможными путями, причем в обоих случаях ЗБ-последовательяость находится в ое стебло, а инициирующий кодек АШ локализован за шпилькой (рис 7). С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза были изменены два нуклеотнда АС -> Ш (в положении 303-304-ый нуклэотид),

С

и и С-С С-С А-и. С Аи А А А .С С-СА А-и, СЧГ С-С

и -> А-и С-С. 0-СА и-А г,А-11

8Б

26*

А-11

АСАААи-ААААШААА 291 345

О С А С А и С-С А-и 0-0 в -> СЧ}

И -> А-и. С $

С-СГ .и-А АС-С А-и .и-А

аас-о

А-и БВ 26* С-САСАШААААТОААА 290 345

Ш = -10.9 кса1/то!

Дй = -11.1 Кса1/то1

Рис. 7. Потенциальные вторичные структуры мРНК гена 26. Цифры под крайними основаниями указывают позиции нуклеотидов в последовательности гена 26 на рис. 3. Подчеркнут АШ/-кодон, инициирующий синтез второго продукта гена 26; БО-последоватеЛьность представлена выделительным шрифтом. Стрелками указаны основания, измененные с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза; АО - вычисленное значение свободной энергии.

которые участвуют в формировании вторичной структуры. Наблюдаемое при этом снижение уровня сштезз второго полипептида гена

25 (рис. 6, плазмида р?Л5-311М5) указывает на то, что вторичная структура РНК играет важную роль в контроле эффективности инициации трансляции в данном участке связывания рибосом.

Таким образом, ген 26 пополняет группу генов бактериофага 14, кодирующих по два полипептида. Предполагается, что в качестве инициирующего кодона для синтеза меньшего полипептида в случае генов 17 л 69 используется АШ-тршьиет, а в случае гена 49 - ЯШЬтриплэт. В то хе время использование АШ-триплета в качестве инициирующего 'кодона для синтеза второго продукта гена 26, видимо, является уникальным случаем среди генов бактериофага Т4.

ВЫВОДЫ

1. 3 результате клонирования и экспрессии гена в двуплазмидеой системе показано, что ген 26 фага Т4 кодирует два полипептида с мол. массами 24 и 8-9 кДа, причем полипептид 8-9 кДа кодируется концевой частью этого гена.

2. Первичную структуру -генэ 26 фага Т4 составляет последовательность 624 нуклеотидов, кодирующая полипептид с мол. массо® 33880 Да (р1 = 6,06). Дня гена 51 - это последовательность 747 нуклеотидов, кодирующая бэлок с мол. массой 29387 Да (р! - 5,34). 3 нуклеотидной последовательности гена 26 определена локализация ембер-ыутаций оя3105, аг.Ш114 и аяМ131.

3. Два полипептида гена 26 кодируются одной и той аэ открытой раккой считывания. Для синтеза второго продукта используется необычный инициирующий кодов Аии, 114-ый триплет гена 26. Меньший полипептяд состой? из 95 аминокислотных остатков с мол. массой 10873 Да (р1 = 5,90).

4. Эффективность инициации синтеза второго продукта гена

26 зависит от вторичной структуры РЕК в участке связывания рибосом.

Список работ, опубликованных по теш диссертаций:

1. Вайшкунайте Р., Витенене И., Швиникас Р. Рестрикциои-, вый анализ ?7Ш-фрагыента ДНК с генами базальной пластинки фага Т4 // Проблемы экологического мониторинга и генетические аспекта орнитофауны и других организмов: Тез. конф. - Вильнюс, 1988. - С. 161.

2. ВаЯшкунайте Р., Нивинскас Р^Цва продукта экспрюссии гена 26 базальной пластинки бактериофага Т4 // Состояние и перспективы развития генетики и селекции в Литве: Тез. ков®. -Вильнюс, 1989. - С. 4. .

3. Valstomalte R.J., Nlvlnskaa R.H. Cloning and expresslor or bacteriophage T4 baseplate genes 25 and 26 // Molecular Organization or Biological Structures / Abstracts or International Symposium. - Moscow, 1989. - Boolc'l. - P. 86.

4. ВаЯшкунайте P.И., Нивинскас Р.Г. Гон 26 базальной пластинки бактериофага Т4. I. Два продукта"экспрессии клонированного гена // Молекулярная биология. - 1990. - Т. 24. J2 2. -С. 379-390.

Б.-NiYlnskas R., Raudonilciene A., Valfikumite R. .Bacteriophage Т4 gene 2£ // Huclelc Acids Res. - '990. - V. 18. 7* -P. 1913. ■

.6. Вайшкунайте P., Нивинскас P. Наличие двух продуктов экспрессии клонированного гена 26 бактериофага Т4 // Молекулярные механизмы генетических процессов / VII Всесоюзный симпозиум: Тез. докл. - Москва, 1990. с. 201.

7. Нивинскас Р.Г., Раудоникене А.А., Вайшкунайте Р.И. Нуклеотидная последовательность гена 26 базальной пластинка бактериофага Т4 // Биоорганическая химия. - 1991. - Т. 17. & 2 - С. 273-276.

" 8. Nlvlnskas R., Vaiskuiialte R., Dagyte R., Klausa V. Cloning, Bequence and overexpresslon or bacteriophage T4 baseplate genes 51, 26 and 25 // Abstracts or Evergreen International Bacteriophage T4 Meeting. - Olympia, Ш, Augnt 1-6, 1991. - P. 49.

9. Nlvlnskaa R., Valikunaite R., Raudonilciene A. An internal AW codon initiates a smaller peptide encoded by bacteriophage T4 baseplate gene 26 // Mol. Gen. Genet. - 1992. - V. 232. HZ. - P. 257-261. fi^-Jut^e

ЛИТОВСКАЯ РЕСПУБЛИКА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ВАЙШКУНАЙТЕ РИТА ИОНО

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА 26 БАЗАЛЬНСЙ ПЛАСТИНКИ БАКТЕРИОФАГА Т4 БУМАГА ТИПОГРАФСКАЯ 60x84 1/16. ТИРАЖ 100. ЭКЗ. ЗАКАЗ 335 УСЛ.ПЕЧ.Л.1.00. ОТПЕЧАТАЮ РОТАПРИНТОМ В ИНСТИТУТЕ ИНФОРМАЦИИ ЛИТВЫ.20О0.ВИЛЬНЮС.ТОТОРЮ 27. "