Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение конъюгативных свойств плазмиды p19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение конъюгативных свойств плазмиды p19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19"

На правах рукописи

Шиловскнй Игорь Петрович

ИЗУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТИВНЫХ СВОЙСТВ ПЛАЗМИДЫ р19 ИЗ ПОЧВЕННОГО ШТАММА ВцсШм хиЪйШ 19

03.00.15-генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

003460531

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: кандидат биологических наук

Полуэктова Елена Ульриховна

ОФФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор биологических наук

Еланская Ирина Владимировна

кандидат биологических наук Козловский Юрий Евгеньевич

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии

имени Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита диссертации состоится « ^ » °РЛ ^ 2009 года в ¡6 час. мин. на заседании диссертационного совета Д002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: Москва, 119991, ГСП-1, ул. Губкина, 3, факс 8-499-135-12-89, е mail: iogen@vigg.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИОГен РАН

Автореферат разослан «_££_» 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т.А. Синельщикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Bacillus subtilis является наиболее изученным видом среди грам-положительных бактерий и широко применяется как в лабораторной практике в качестве модельного микроорганизма, так и в прикладных исследованиях по биотехнологии. Кроме того, существенным достоинством этой бактерии служит полное отсутствие патогенности. Не геном был секвенирован одним из первых среди микроорганизмов (Kunst et al., 1997); у В.subtilis уже давно разработаны методы, позволяющие осуществлять обмен генетическим материалом за счет трансформации и трансдукции. Однако до сравнительно недавнего времени у нее не был описан такой, распространенный у других бактерий, способ гибридизации, как конъюгация. Такой пробел объясняется, в основном, тем, что у лабораторного штамма B.subtilis 168 отсутствуют крупные конъюгативные плазмиды. В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН была разработана система, позволяющая воспроизводить конъюгативный перенос у различных штаммов B.subtilis (в том числе и у B.subtilis 168) и других бацилл с помощью крупной (размером 97 тпн) плазмиды р19, которую несет природный штамм B.subtilis 19, выделенный проф. М.А. Титок (Белорусский гос. университет) из лесных почв Белоруссии. Конъюгативная плазмида р19 оказалась способной к «самопереносу», переносу мелких неконъюгативных плазмид и к конъюгативному переносу хромосомных генов; это делает ее удобным инструментом для различного рода опытов, связанных с переносом генетического материала у бацилл во многих областях генной инженерии и биотехнологии. Однако строение различных областей этой плазмиды, их «генный набор», и принадлежность ее к какой-либо группе других конъюгативных плазмид бактерий до настоящего времени не изучались.

Целью работы являлось изучение строения областей, ответственных за конъюгативный перенос, у крупной конъюгативной плазмиды р19, и исследование некоторых особенностей конъюгации, происходящей с участием этой плазмиды. В задачи исследования входило:

1. На основе полученных ранее производных плазмиды р19 провести клонирование и секвенирование генов конъюгации.

2. Осуществить в базе данных поиск гомологов генов, расположенных на секвенированных плазмидных фрагментах.

3. Провести функциональный анализ генов, лежащих на секвенированных участках плазмиды р19.

4. Провести сравнительный анализ р!9 и других конъюгативных плазмид.

5. Разработать систему, позволяющую обнаружить явление ретроконьюгации у бацилл и изучить это явление на модели плазмиды р19 у Bacillus subtilis. Научная иовизна. Клонированы и секвенированы четыре фрагмента ДНК плазмиды р 19 (в сумме 30006 пн). На секвенированных фрагментах удалось идентифицировать 35 открытых рамок считывания (ORF). 20 открытых рамок считывания (19340 пн) на основе гомологии можно отнести к (га-району плазмиды р19; для 6 из них конъюгативная функция была доказана экспериментально.

На основе сравнительного анализа предполагаемых белковых продуктов ORF tra-района исследуемой плазмиды с белками имеющейся в настоящий момент базы данных установлено, что р19 является представителем новой, ранее не идентифицированной группы конъюгативных плазмид.

Впервые у бацилл (на примере плазмиды р19) показано явление плазмидного ретропереноса генетического материала.

Практическая ценность. Результаты работы могут быть использованы в биотехнологии, в частности для генетического анализа различных видов бацилл-продуцентов биологически активных веществ, и в различных областях микробиологии при изучении закономерностей горизонтального переноса генов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на международной конференции, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); международной школе-конференции, посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2006); международной молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2007); международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); межлабораторном научном семинаре ИОГен РАН «Генетические основы биотехнологии» (Москва, 2008);международной научной конференции, посвященной 60-летию кафедры генетики биологического факультета БГУ «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2008).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация изложена на 137 страницах, содержит 16 таблиц 20 рисунков и 2 приложения. Список литературы включает 169 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и плазмиды. В работе было использовано 5 различных производных штамма B.subtilis 19 из лабораторной коллекции и штамм E.coli DH5(a) recA (лаб. музей). В работе были использованы плазмиды pUBllO, pMTL21C, рЗ (лаб. музей) pBluescript («Stratagene»), а также плазмиды, полученные в данной работе.

Среды и реактивы. При работе с бактериальными культурами B.subtilis и E.coli в качестве полноденной питательной среды использовали среды LB-бульон и LB-arap ("Fluka" и "Sigma"). В качестве минимальной среды для трансформации B.subtilis использовали среду Спицайзена (Spizizen, 1958). В работе были использованы следующие реактивы: агар-агар, гидролизат казеина, дрожжевой гидролизат («Difco»); аминокислоты и азотистые основания («Fluka»); рестрикционные эндонуклеазы и ДНК-лигаза Т4 фага («Promega»); РНК-аза, лизоцим, агароза, легкоплавкая агароза, антибиотики (хорамфеникол, ампициллин, тетрациклин, канамицин, стрептомицин, спектнномицин) («Sigma»); различные соли («Fluka»); SDS, трис, ЭДТА, IPTG, X-gal, сахароза, глюкоза («Sigma»); изопропиловый и этиловый спирт (отечественного производства).

Получение препаратов ДНК. Плазмидную ДНК из клеток E.coli и B.subtilis выделяли щелочным методом (Birnboim, Doly, 1979). ДНК, используемую для определения нуклеотидной последовательности, получали с помощью набора Wizard plus SV minipreps DNA purification system («Promega»),

Трансформация клеток E.coli проводилась по методу Кушнера (Маниатис и др., 1984). Трансформация компетентных клеток B.subtilis проводилась по модифицированной методике Анагностопуолоса и Спицайзена (Anagnostopoulos, Spizizen, 1961), принятой в лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН (Прозоров, 1988).

Конъюгативные скрещивания бактериальных штаммов проводили в жидкой среде. В качестве контроля на те же среды высевали культуры раздельно выращенных штаммов донора и реципиента; частота возникновения спонтанных мутантов, устойчивых к антибиотикам, была < 10"7 (т.е. ниже детектируемой). Частоту конъюгации определяли как отношение числа клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ) трансконъюгантов к числу КОЕ реципиента.

Электрофорез: выделение фрагментов плазмидной ДНК из геля. Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле в трис-боратном буфере (Маниатис и др., 1984). Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля с помощью "GenElute minus EtBr Spin Column" ("Sigma").

Рестрикцию и лигированне проводили в соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов («Fermentas», «Promega»),

Секвеннрованне ДНК. Определение нуклеотидной последовательности ДНК выполняли по методу Сэнжера (Sangar et al., 1977) с использованием ДНК-секвенатора ABI PRIZM 310 и набора реактивов Big Dye Termination KIT V. 3.0 ("РЕ Applied Biosistems", Foster City CA), согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Сиквенс проводили в центре "ДНК-диагностика" ИОГен РАН. В качестве матриц использовали клонированные и субклонированные в клетках E.coli фрагменты ДНК плазмиды р19; использовали стандартные праймеры, а также праймеры, сконструированные на основе определенной нуклеотидной последовательности. Праймеры синтезированы фирмой «Синтол».

Для анализа нуклеотидной последовательности использовали программы Chromas Pro Version 1.2 и Vector NTI 6. Идентификация ORF проведена с помощью программы GeneMark.hmm Version 2,5 для прокариот с учетом кодирующего потенциала B.subtilis (http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/). Поиск гомологов был проведен на сайте NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov) с помощью программы BlastP. Анализ белковых последовательностей осуществляли с помощью баз данных InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/) и PFAM 21.0 (http://sanger.ac.uk./Software/Pfam). Трансмембранные домены идентифицировали с помощью программы ТМНММ (http://cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/). Анализ нуклеотидных последовательностей был проведен совместно с С.А. Родионовой (Институт проблем передачи информации им. A.A. Харкевича РАН)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН ранее проводились работы по поиску крупных конъюгативных плазмид в природных штаммах B.subtilis. В результате в штамме B.subtilis 19 была обнаружена крупная плазмида р19, которая с высокой частотой мобилизовала мелкую стафилококковую плазмиду pUBllO (Полуэктова и др., 2000; Лотарева и др., 2001). В последующих работах была изучена кинетика и особенности конъюгативного переноса собственно плазмиды р 19 (Полуэктова и др., 2005). Однако гены, отвечающие за контроль процесса конъюгации плазмиды р19, оставались не выявленными. Подобные гены не идентифицированы ни на одной из плазмид B.subtilis. Оставались не изучены и многие особенности собственно процесса конъюгативного переноса р!9. Мы попытались клонировать, секвенировать и проанализировать строение генов плазмиды р19, участвующих в конъюгативном переносе, и проверить, существует ли у B.subtilis явление ретроконъюгации.

1. Клоинрованне фрагментов ДНК плазмиды р19, предположительно несущих гены конъюгации.

Для того, чтобы клонировать конъюгативные гены плазмиды р19, мы использовали коллекцию ее производных с инсерцией гена cat (pl9cai), обуславливающего устойчивость клеток к хлорамфениколу и не способных к конъюгации. Эти производные были получены в предыдущей работе лаборатории при маркировании критической плазмиды р19 плазмидой рЗ, несущей ген cat. Встраивание рЗ в р19 проводилось no £coRI сайгам, которых на р19 около 20, в то время как на рЗ всего один сайг узнавания данной рестриктазы. В ходе маркирования получено 28 CmR Тга" клонов, у которых, по всей видимости, встраивание селективного маркера (гена cat в составе рЗ) произошло в участки р19, существенные для конъюгации (ira-район), и тем самым нарушились функции конъюгативных генов. При этом могла происходить деления части генов исходной р19 (Федорина, 2006) (рис. 1).

Далее мы клонировали фрагменты ДНК, прилегающие к вставке (рЗ), на которых предположительно располагаются конъюгативные гены. Для этого плазмиды pl9cat (из CmR Тга - клонов) рестрицировали по С1а\ сайтам, которых на р19 около 17, в то время как на рЗ сайты узнавания данной рестриктазы отсутствуют. Затем плазмиды лигировали и трансформировали ими клетки E.coli DH5a. В результате мы получили рекомбинантные плазмиды серии рЗ-19, каждая из которых состояла из векторной части (рЗ) и двух клонированных Clal-EcoRl фрагментов плазмиды р19 (рис. 2). Эти два Clal-EcoRl фрагмента, скорее всего, в исходной р19 не прилегали друг к другу. Нам удалось получить в клетках E.coli 18 плазмид серии рЗ-19. Из них 9 плазмид в результате перестроек утратили C/al сайт и в дальнейшей работе они не рассматривались. Для остальных 9 плазмид были построены рестриктные карты и определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДИК, прилегающих к р3, с использованием стандартного праймера pUC/M13F и праймера cat, сконструированного по известной нукпеотидной последовательности гена cat (рис. 3). Это позволило определить, что три плазмиды из девяти идентичны. Для дальнейшей работы была использована одна из них. В итоге для секвенирования клонированных фрагментов ДНК р19 было использовано 7 плазмид серии рЗ-19, которые отличались друг от друга, хотя отдельные фрагменты ДНК различных плазмид могли быть одинаковыми (рис. 4).

А.

firoRI

I

&0RI

I

EcoRl \ I

pl9 .EcoSl -)-

V

EcoRl j

&0RI й»М

P3

Б.

p3'

p3'

EcoR\ рестрикция плазмид p!9 и рЗ (3,9 тпн.)

Лигирование линейной плазмиды рЗ и EcoRl-фрагментов р19

Интермедиат - рекомбинантная плазмида рЗ'

В.

Трансформация компетентных клеток В. subtilis 19 (р19).

Отбор трансформантов по Стк-фенотипу.

Делегируемый фрагмент плазмиды р19

Рисунок 1. Маркирование плазмиды р19 с помощью плазмиды рЗ.

А Получение интермедиата - рекомбинантной плазмиды рЗ'. На плазмиде р 19 находится более 20 £coRI сайтов, на плазмиде рЗ находится всего один £coRI сайт. Б. Получение плазмид pl9cai без делеции ДНК р19. В. Получение плазмид p\9cat с делецией фрагмента ДНК р 19.

Рисунок 2. Клонирование фрагментов ДНК плазмиды р19, прилегающих к вставке рЗ.

Рисунок 3. Праймеры, использованные для секвенирования плазмид рЗ-19.

% I 1*1 Ч % %. t i % s

и и ы Ы ы ы

р19

UJ ы

1-1 1 1 1 1 I I

1=1 ч 5,4 1 «,0 | 0,8 | 4,9 1 Ч

Ы

6,9 1,0 2,0 1,6 4,5

рЗ-19-27

Рисунок 4. Плазмиды серии рЗ-19, использованные для клонирования фрагментов ДНК р19.

Цифрами указаны величины фрагментов в тпн по данным электрофореза в агарозном геле. Одним цветом указаны участки ДНК, принадлежащие непрерывным фрагментам р19. На рисунке представлены только фрагменты ДНК, клонированные на плазмидах рЗ-19, без векторной части рЗ. Фрагмент EcoRl-Clal величиной 1,6 тпн плазмиды p3-19-32 секвенирован не был.

2. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК плазмиды р19.

Для определения нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК р19 мы использовали два подхода. Во-первых, секвенировали плазмиды серии рЗ-19 со стандартных праймеров (pUC/M13F и cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков плазмид рЗ-19 (рис. 3). Во-вторых, проводили субклонирование плазмид серии рЗ-19. Для этого либо клонировали на векторе pBluescriptll KS нужные рестриктные фрагменты ДНК, выделенные из агарозного геля (так были получены плазмиды: р27-50, р27-13, р40Есо5, p40Ecol, рЗ-12, р27-29-В, pl-1, р27ЕС814, р27-29, р27-13-2 р29ЕН, р5), либо рестрицировали плазмиды рЗ-19 ферментами ßg/II, Hindi II, Sali, лигировали их «сами на себя» и трансформировали клетки E.coli DH5a; при этом получали плазмиды, состоявшие из вектора рЗ (или его части) и прилежащих к нему фрагментов ДНК р19 (так были получены плазмиды: p40Sal, p40Bgl, p58Hind2, р2-8, р5-5, р4-1, р2-5, р21ЕН). На рис. 5 показаны субклоны, полученные из плазмиды рЗ-19-40.

Всего было получено 18 плазмидных субклонов, некоторые из них оказались одинаковыми; это подтвердили данные рестриктного анализа и определение нуклеотидной последовательности. Одинаковыми оказались плазмиды p58Hind2 и р27-13-2; р27-29 и р40Есо5 (рис. 6). Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров (pUC/M13F, pUC/M13R, cat), что позволило определить нуклеотидные последовательности концевых участков. Затем на основе полученных нукпеотидных последовательностей создавали специфические праймеры, всего их было сделано 87 (рис. 6).

Рисунок 5. Субклонирование плазмиды рЗ-19-40.

А. Субклонирование плазмиды рЗ-19-40 по Sail сайту рестрикции и получение плазмиды p40Sal. Б. Субклонирование £coRI фрагментов плазмиды рЗ-19-40 на векторе pBlueskriptH KS и получение плазмид p40Ecol и р40Есо5. Буквами Е, С, В и S отмечены сайты узнавания рестриктаз !хоК\, C/al, !Sgl\ I и Sail. Цифрами обозначены размеры фрагментов в тпн.

Рестрикция р408а! 1 рестриктазой ЕсоКI и лигирование плазмиды «самой на себя». Трансформация клеток Е.соП ОН5а.

Рестрикция рЗ-19-40 рестриктазой Sail и лигирование плазмиды «самой на себя». Трансформация клеток E.coli DH5a.

4,9 S В

/

Е Е и

\

Е Г

I 1.0 I

Рестриктная карта рЗ-19-40.

Выделение из агарозного геля ЕсоКI фрагментов плазмиды рЗ-19-40 величиной 4,9 тпн и 1,0 тпн.

Лигирование фрагментов 4,9 тпн и 1,0 тпн плазмиды рЗ-19-40 с векторной плазмидой рЕНиевкпрШ КЗ.

Е. 1.0 Е гл

■ p40Ecol I

Трансформация клеток Е. coli DH5a.

48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 '0 72 74 76 78 79 81 83 85 87

49 51 53 55 57 59 61 63 6 5 6 7 69 71 73 75 77

3 5 7 9 1 ] 13 15 17 19 21 23 25 27 30 32 34

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 29 31 33 35 36 37

38 40 42 44 4(3

ЗУ 41 43 45 47 У

ЕСЕ Е ЕЕ ЕЕ

5 10 54 1.0 0.8 4.9 ][|

BHSH SHB Н

Н

,14-1

p40Sal p4ßEcoI

РЗ-27ЕС894 p40Bgl

р27-13-2

pl-1

р27-50

р27-13

pS-S

р27-29-8

Р27-29

Специфические праймеры

^ ^ ^ ^ ^ Участки, секвенированные с

J помощью стандартных Е с е е с е Е > праймеров M13F, M13R и cat.

1,0 2,0 '■<> 4-5 О-5

н в

Рестриктная карта фрагментов р 19

Субклонированные фрагменты ДНК плазмиды р 19

Рисунок 6. Субфрагменты ДНК плазмид рЗ-19 и праймеры, использованные для определения нуклеотидной последовательности.

Одним цветом отмечены фрагменты ДНК. соответствующие непрерывным участкам ДНК р 19. Буквы обозначают сайты рестрикции: £coRI (Е), С/аI (С), Hindlll (Н), Ä/I (S), ßg/II (В). Е, С, S - сайты указаны все; сайты В и Н указаны только нужные для данного рисунка. Цифрами указан размер фрагментов в тпн. Номерами от 1 до 87 обозначены специфические праймеры.

3. Анализ пуклеотидных последовательностей плазмиды р19.

В результате объединения коротких пуклеотидных последовательностей, полученных в ходе секвенирования плазмид рЗ-19 и их субклонов с использованием стандартных и специфических праймеров, удалось получить четыре непрерывных фрагмеш-а ДНК р 19: 739 пн, 2021 пн, 4518 пн и 22728 пн. Всего это составляет 30006 пн. Каждый участок ДНК был прочитан минимум дважды. Все четыре фрагмента ДНК р19 были депонированы в GenBank: фрагмент 739 пн (acession № FJ434457); фрагмент 2021 пн (acession № FJ434455); фрагмент 4518 пн (acession № EF506609); фрагмент 22728 пн (acession № FJ434456).

На фрагменте величиной 4518 пн обнаружено 5 открытых рамок считывания. Все они транскрибируются в одном направлении. Предполагаемый промотор был обнаружен лишь перед ORF2 (рис. 7А). Поиск гомологии в базе данных показал, что продукт OFR4 имеет сходство с Угг04-подобным белком плазмиды pAW63 Bacillus ihuringiensis. VirD4-подобные белки являются компонентами системы секреции IV типа и необходимыми компонентами коньюгативных аппаратов как грам-положительных, так и грам-отрицательных микроорганизмов. В частности, этот белок соединяет ДНК с конъюгативным каналом. Продукт ORF1 сходен с праймазой-хеликазой плазмиды pLL1212 Lactobacillus delbrueckii. Подобные ферменты могут участвовать в инициации конъюгативкого переноса в составе релаксосомы. Продукт ORF3 на 34% идентичен гипотетическому белку Bacillus sp. В14905 и содержит трансмембранный домен. Продукты остальных двух рамок считывания (ORF2 и ORF5) не имеют гомологов в базе данных, но при анализе их предполагаемых белковых последовательностей были обнаружены трансмембранные домены на N-концевых частях белковых молекул. Возможно, продукты ORF2, 3 и 5 могут принимать участие в конъюгации в качестве поверхностных белков. На основании вышесказанного можно предполагать, что все ORF фрагмента 4518 пн относятся к (га-району р19.

На фрагменте размером 22728 пн обнаружено 25 открытых рамок считывания. Все они транскрибируются в одном направлении и имеют сайты связывания с рибосомами (кроме ORFIO). Предполагаемые промоторы были обнаружены перед ORF11, ORF22, ORF31 и ORF33 (рис. 7Г). Гипотетические белковые продукты 14 рамок считывания из найденных 25 имеют гомологов в текущей базе данных, продуктам шести рамкам считывания на основе обнаруженной гомологии можно приписать определенные функции. Продукт ORFIO имеет значительную гомологию с VirB 11-подобным белком Bacillus pumilus (38%). Субъединицы VirB 11 белка вовлечены в системы секреции двух

типов (II и IV) и являются необходимыми для осуществления конъюгативного процесса,

хотя точная роль этого белка остается неизвестной. Структурный анализ VirBll белка показал наличие АТФ-азного домена, а недавние исследования подтвердили, что субъединицы белка организуются в гексамерные структуры, объединенные с внутренней стороной мембраны, и функционируют как «входные ворота» (Savvides et al., 2003). Продукт ORF12 имеет гипотетические трансмембранные домены (от 5 до 7 по данным разных программ) и, возможно, является функциональным аналогом белка ТсрН плазмиды pCW3 C.perfringens (Teng et al., 2008) и белка VirB6 A.tumefaciens. Эти интегрированные в мембраны клетки белки стабилизируют и объединяют другие белки конъюгативного аппарата. Продукт ORF15 на 47% идентичен У1гВ4-подобному белку плазмиды pFR55 Bacillus thuringiensis. Уи-В4-подобные белки являются компонентами системы секреции IV типа и принимают участие в конъюгативном переносе ДНК. В частности, они входят в состав mpf-комплекса большинства конъюгативных систем и выполняют энергетическую функцию, обеспечивая необходимой энергией процесс переноса ДНК. Продукт ORF17 сходен с пепгидазами и пептидогликан-гидролазами. Эти ферменты разрушают пептидогликан - главный компонент клеточной стенки бактерий. По всей видимости, пептидогликан-гидролазы важны для осуществления конъюгации именно у грам-положительных бактерий, поскольку эти бактерии обладают более толстой клеточной стенкой. Продукт ORF26 на 30% идентичен УИМ-подобному белку Enterococcus faecium DO, являющемуся компонентом системы секреции IV типа и неотъемлемым компонентом любой конъюгативной системы. Однако ORF26 -сравнительно небольшой белок (202 аа), в то время как обычно УИ)4-подобные белки имеют величину 739 - 877 аа. Скорее всего, ORF26 является псевдогеном, и кодируемый ею белок не активен. Продукт ORF32 сходен с ДНК-топоизомеразой III (идентичность 35%), кроме того, анализ ее транслированной последовательности выявил наличие Toprim-домена. Данные ферменты регулируют топологическую структуру ДНК и зачастую встречаются в различных конъюгативных системах. В частности, они выполняют роль релаксаз, участвуя в инициации переноса ДНК. Однако конъютативная функция продукта данной рамки считывания не подтвердилась, поскольку ее инактивация посредством инсерционного мутагенеза не приводила к снижению частоты передачи р19 (см. ниже). Также следует отметить продукт ORF11. Он не имеет близких гомологов в текущей базе данных, но, как и у продукта ORF12, у него присутствуют многочисленные трансмембранные домены (их обнаружено 4).

Мы полагаем, что фрагмент размером 22728 пн может быть разделен на 2 части -(га-район (ORFIO - 21) и район, не относящийся к конъюгации (ORF22 - 34). Наличие между ORF21 и ORF22 предполагаемого промотора подтверждает возможность такого разделения фрагмента 22728 пн на две части (рис. 7Г). Среди рамок считывания, которые

мы отнесли к /га-району, ORFIO, кодирующая VirBl 1-подобный белок, ORF12, кодирующая мембранный белок, ORF15, кодирующая У1гВ4-подобный белок и ORF17, кодирующая лизоцим-подобный белок, имеют непосредственное отношение к конъюгативной функции р19.

На фрагменте размером 2021 пн идентифицированы 3 ORF, транскрибируемые в одном направлении (рис. 7Б). Белковые продукты ORF36 и ORF37 имеют небольшую гомологию с белками конъюгации грам-положительных бактерий. Продукт ORF35 не имеет гомологов в базе данных, однако инактивация данной рамки считывания нарушает конъюгативную функцию р19 (см. ниже). На основании этих фактов можно полагать, что ORF35, 36, 37 относятся к tra-району р19.

На фрагменте величиной 739 пн идентифицированы фрагменты двух рамок считывания, ORF38 и ORF39 (рис. 7В). Их белковые продукты не имеют гомологов в базе данных. У нас нет каких-либо свидетельств того, что эти гены имеют отношение к конъюгации.

Таким образом, к (га-району р19 могут быть отнесены фрагменты 2021 пн, 4518 пн, и часть фрагмента 22728 пн, всего 19340 пн и 20 ORF.

Представляло интерес выявить, существует ли какая-либо система конъюгации, родственная таковой р19. На настоящий момент изучено не так много конъюгативных плазмид грам-положительных микроорганизмов. На основе сходства (га-районов плазмид их можно разделить на 2 группы. Первую группу составляют плазмиды pRE25 и pGOl S.aureus, plP501 E.faecalis, pMRCOl L.Iaclis. Ко второй группе относятся плазмиды pAW63 и рВТ9727 B.thuringiensis, рХ02 B.anthracis и, вероятно, pHTbeta E.faecalis. Исследуемая нами плазмида р19 более сходна с шшмидами второй группы, поскольку некоторые идентифицированные на р19 белковые продукты ORF (га-района имеют гомологов на плазмидах pAW63, рХ02 и pHTbeta.

Однако мы обнаружили в базе данных конъюгативные системы, более близкие р19, чем конъюгативные системы плазмид этой группы. В табл.1 представлены результаты поиска гомологов белков, кодируемых ORF р19, с данными GenBank. 10 микроорганизмов - все они грам-положительные - имеют каждый около 10 белков, гомологичных белкам, соответствующим ORF tra-района р19. Сюда входят белки, соответствующие ORF36 и ORF37 фрагмента ДНК р19 величиной 2021 пн; одной ORF фрагмента 4518 пн (ORF14) и 11 ORF фрагмента 22728 пн. Последние 11 ORF - это 10 ORF из района, который по нашим данным относится к (га-району, и ORF26, соответствующая неполному VirD4-подобному белку. Для некоторых из 10 упомянутых организмов расположение генов, кодирующих гомологичные (га-белки, очень сходно с таковым у р19. Таким образом, вероятно, (га-район р19 (во всяком случае, секвенированная нами часть) принадлежит к

особой системе генов конъюгации, распространенной среди грам-положительных микроорганизмов. Эта система конъюгации встречается у представителей разных родов -Clostridium, Bacillus, Listeria, Exiguobacterium. В некоторых случаях показано, что соответствующие гены расположены на плазмидах (pRF55, pCLL, рСР13, pEspß, pLM80); в остальных случаях нет окончательных данных о том, расположены ли эти гены конъюгации на хромосомах, или при тотальном сиквенсе не были идентифицированы плазмидные репликоны.

А.

-10 signal -35 signal

Б.

ORF37 --

ORF36

+

В.

Рисунок 7. Схема расположения ORF на фрагментах ДНК плазмиды р19 величиной. А. 4518 пн; Б. 2021 пн; В. 739 пн; Г. 22728 пн.

Знаком (+) отмечены рамки считывания, инактивация которых приводит к снижению частоты передачи р 19, знаком (-) отмечены рамки считывания, инактивация которых не приводит к снижению частоты передачи р19. Буквами С и Е обозначены сайты узнавания рестриктаз CíaI и ЕсоК\.

Рис. 7 Г.

Таблица 1. Результаты поиска систем конъюгации, гомологичных системе конъюгации плазмиды р19.

Микроорганизм. Плазмида Количество гипотетических белковых продуктов, гомологичных белковым продуктам ORF tra- района р!9, на фрагментах ДНК р19

2021 пн (ORF35-37) 4518 пн (ORF1-5) 22728 пн (ORFlO-21) 22728 пн (ORF22-34)

В. thuringiensis str. INTA FR7-4 pRF55 1 (ORF37) 1 (ORF4) 9 1 (ORF26)

В. thuringiensis ser. israelensis ATCC 35646 - 0 1 (ORF4) 7 1 (ORF26)

C. botulinum В str. Eklund 1713 pCLL 0 1 (ORF4) 9 1 (ORF26)

C. perfringens В str. ATCC 3626 - 0 1 (ORF4) 9 1 (ORF26)

C. perfringens С str. YGS 1495 - 1 (ORF36) 1 (ORF4) 9 0

C. perfringens D str. YGS 1721 - 1 (ORF36) 1 (ORF4) 9 1 (ORF26)

C. perfringens E str. YGS 1987 - 1 (ORF36) 1 (ORF4) 9 0

C. perfringens str. 13 pCP13 1 (ORF36) 1 (ORF4) 8 0

Exiguobacterium sp. RLF1109 pEspß 0 1 (ORF4) 8 0

L. monocytogenes str. 4b H7858 pLM80 1 (ORF37) 1 (ORF4) 9 1 (ORF26)

B. thuringiensis ser. kurstaki pAW63 1 (ORF37) 0 6 1 (ORF26)

4. Инактивация предполагаемых конъюгативных генов плазмиды р19.

Чтобы подтвердить конъюгативные функции обнаруженных ORF, мы проводили их инактивацию посредством инсерционного мутагенеза. В предполагаемый конъюгативный ген в нативной плазмиде р19 встраивали маркер устойчивости к хлорамфениколу. Для этого клонировали в клетках E.coli расположенные вне концевых областей фрагменты генов на векторных плазмидах pMTL21C или рЗ. Данные плазмиды не реплицируются в клетках B.subtilis, однако несут CmR маркер, экспрессирующийся в клетках этого микроорганизма. Полученными гибридными плазмидами проводили трансформацию клеток штамма B.subtilis 19 (р19), содержащего нативную р19. При этом гибридные плазмиды встраивались в участки тех ORF, фрагменты которых были на них клонированы, посредством гомологичной рекомбинации, тем самым нарушая функциональную целостность соответствующих ORF (рис. 8).

Полученные трансформанты B.subtilis 19 (р19са/) были проверены на способность быть донорами в скрещиваниях. В качестве положительного контроля использовался

штамм-донор B.subtilis 19, несущий плазмиду р19са/4, частота переноса которой достигала 100%. Нами было проверено 9 ORF, идентифицированных в данной работе, а также ORF6 из гер-района плазмцды р19, который был секвенирован в предыдущей работе лаборатории (Федорина, 2006), Как оказалось, инактивация ORF1, 4, 10, 12, 17 и 35 приводит к снижению частоты передачи р19 на 3 - 5 порядков в сравнении с контролем, что указывает на участие данных ORF в конъюгативном переносе плазмцды. Нарушение ORF6, 24, 25 и 32 не влияло на конъюгативные свойства плазмиды, и частота конъюгации не отличалась от контроля (табл. 2). Вероятно, данные ORF не участвуют в процессе конъюгативного переноса р 19.

Нативная р19.

Фрагмент ДНК инактивируемой ORF.

Плазмида pMTL21С или рЗ с клонированным на ней фрагментом ДНК инактивируемой ORF.

Нативная р19.

I ORF I f

1 ОМ" 1

X

Клонирование фрагмента ДНК инактивируемой ORF на векторах pMTL21C или рЗ, имеющих маркер CmR.

Трансформация клеток B.subtilis 19 (р19) и отбор трансформантов по CmR- фенотипу. Встраивание гибридной плазмиды с клонированным на ней фрагментом ORF в нативную плазмиду р19 посредством гомологичной рекомбинации.

pl9catc инактивированной ORF.

CmR

Рисунок 8. Инактивация генов плазмиды р19 с помощью инсерциопного мутагенеза.

Белым цветом обозначена инактивируемая ORF, красным - ее клонированный фрагмент, зеленым - ДНК плазмиды р19, черным - ДНК векторной плазмиды pMTL21C или рЗ.

Эти данные, вместе с данными по гомологии белковых продуктов, подтверждают, что часть секвенированных нами фрагментов ДНК плазмиды pl 9 действительно относятся к /га-району плазмиды.

Таблица 2. Клонированные на pMTL21C и рЗ фрагменты ORF р19, использованные для инактивации генов, и частоты конъюгативной передачи р19 с инактивированными ORF.

В таблице представлены средние данные двух опытов.

ORF р19. Плазмида-источник нужного фрагмента ДНК. Размер клонированного фрагмента (пн) и сайты рестрикции, фланкирующие фрагмент. Предполагаемая функция белка, соответствующего данной ORF. Частота конъюгативной передачи плазмиды pl9::pMTL21C или р19.:рЗ на клетку реципиента.

ORF1 Р5 430 С1а\ Нра\ Праймаза-хеликаза 4,10х10"5

ORF4 рЗ-12 874 ЕсоК\ BglW УИ)4-подобный белок. 1,40x10^

ORF6 рб 236 ficoRI SaulM ДНК-связывающий белок из гер-района. 0,95

ORFIO р4-1 634 EcoRV EcoRl VirB 11-подобный белок. 0,57х 10'3

ORF12 р4-1 955 UindUl Sail Мембранный белок 2,95ХЮ"5

ORF17 p40Sal 496 SpeI EcolU Лизоцим-подобный белок 1Д7ХЮ'5

ORF24 p40Ecol 542 Hindlll EcoKV Белок с неизвестными функциями 1,00

ORF25 р21ЕН 411 BglU Hindlll Белок с неизвестными функциями 0,91

ORF32 р27ЕН6 429 EcoRV EcoRV ДНК-топоизомераза III 0,73

ORF35 рЗ-19-57 785 C/al Hindlll Белок с неизвестными функциями 2,16х10"3

pl9cat4 (положительный контроль) - - - 0,76

5. Изучение явления ретроконъюгации у Bacillus subtilis.

В заключительной части нашей работы мы показали, что плазмида р 19 обладает способностью к ретропереносу мелкой неконъюгативной плазмиды pUBHO. Ретроперенос - это передача генетического материала не только от донора реципиенту, но и в обратном направлении. Ретроконъюгация не была описана у бацилл, поэтому одной из задач нашей работы являлся поиск данного феномена у B.subtilis. Для этого была разработана следующая система. Клетка-донор несет крупную конъюгативную плазмиду pI9cat (CmR) и хромосомный маркер SpcR. Клетка-реципиент несет мелкую плазмиду pUBllO с маркером K.mR и хромосомную мутацию Тся. Происходит перенос pl9cat (обозначен стрелкой 1) в клетку-реципиент, которая теперь несет обе плазмиды и приобретает из-за этого (стрелка 2) свойства донора («вторичный донор»), «Вторичный донор» передает (обозначено стрелкой 3) pUBHO исходному донору, ставшему теперь «вторичным реципиентом»; возникают ретроконъюганты (стрелка 4) (рис. 9). Передача плазмид была подтверждена данными электрофореза. Подсчитана частота ретромобилизации pUBl 10. Она была близка к 1 х 10"3.

pl9catl

Донор, он же «вторичный реципиент»

' Хромосома 1 TcR

Реципиент

2 I

Ретроконьюгант

Трансконъюгант, он же «вторичный донор»

Рисунок 9. Схема осуществления прямого конъюгативного переноса и ретропереноса

ривпо.

(пояснения в тексте).

Таким образом, продемонстрировано, что р19 способна осуществлять ретроперенос наряду с ранее описанными типами конъюгативного переноса (самопереносом, переносом мелких неконъюгативных плазмид и переносом хромосомных генов).

ВЫВОДЫ

1. У конъюгативной плазмиды р19, содержащейся в почвенном штамме B.subtilis 19, исследовано 28 мутантов, которые, за счет инсерционного мутагенеза, утратили способность к конъюгативному переносу. Клонированы и секвенированы участки ДНК р19, примыкающие к инсерциям, у 7 мутантов.

2. Определена нуклеотидная последовательность ДНК четырех фрагментов плазмиды р19, равная в сумме 30006 пн. На ней идентифицировано 35 открытых рамок считывания (ORF). Из них 20 ORF (19340 пн) могут быть отнесены к району плазмиды, обуславливающему конъюгативный перенос (ira-району).

3. Посредством функционального анализа показана причастность 6 ORF к процессу конъюгативного переноса.

4. Для белков - предполагаемых продуктов 18 ORF р19 найдены гомологи в базе данных; среди них - белки-гомологи VirB4, VirBll, VirD4 pTi A.tumefaciens, являющиеся компонентами почти всех известных систем конъюгации.

5. На основании анализа гомологов белков - предполагаемых продуктов ORF /га-района р19 установлено, что р19 является представителем новой группы конъюгативных плазмид. Часть (га-генов этой плазмиды присутствует в геномах ряда грам-положительных микроорганизмов (роды Bacillus, Clostridium, Exiguobacterium, Listeria).

6. Впервые показано у бацилл (на примере плазмиды р19) наличие явления конъюгативного ретропереноса генетического материала.

СПИСОК РАБОТ, ОБПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лотарева О Б., Шиловский И.П., Прозоров А.А. Явление плазмидного ретропереноса при конъюгации у B.subtilis. II Генетика. 2006. Т.42. №12. С. 1735-1738.

2. Полуэктова Е.У., Гагарина ЕЮ., Шиловский И.П., Федорина Е.А., Незаметдинова В.З., Родионова С.А., Прозоров А.А. Клонирование и секвенирование некоторых генов, участвующих в процессе конъюгации, у крупной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. // Генетика. 2008. Т.44. №5. С. 623-630.

3. Шиловский И.П., Федорина Е.А., Рожкова А.В. Идентификация генов конъюгации плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. I/ Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире». Москва. 2006.

4. Шилоеский И.П., Полужтова E.V. Идентификация генов конъюгации плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis. II Материалы международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва. 2006.

5. Шилоеский И.П., Полужтова Е.У. Изучение конъюгативных свойств плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. II Материалы международной молодежной школы-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии». Москва. 2007.

6. Полужтова Е. У., Гагарина ЕЮ., Лотарева О.В.. Яешштдинова В.З., Федорина Е.А., Шилоеский И.П., Прозоров A.A. Различные классы гшазмид, обнаруженные в штаммах Bacillus subtilis из почв некоторых регионов восточно-европейской равнины: свойства, молекулярная характеристика, возможная роль в биоценозах. // Материалы международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера». Москва. 2007.

7. Полужтова Е.У., Гагарина Е.Ю., Пезамстдинова В.З.. Шилоеский H.H., Прозоров A.A. Характеристика tra-pafioiia конъюгативной плазмиды р19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19. // Материалы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». Минск. 2008.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАНЫХ СОКРАЩЕНИЙ mpf-комплекс - (mating-pair formation) белковый комплекс, ответственный за образование межклеточного контакта, формирование копъюгагивного канала и собственно перенос ДНК в клетку реципиента В его состав входят белки, кодируемые гаазмидой. ORF - (open reading frame) открытая рамка считывания; последовательность пуклеотидов ДНК от инициирующего до терминирующего кодона, потенциально может быть транскрибирована и транслирована в полипептидную цепь, аа - (amino acids) количество аминокислотных остатков полипситида.

Подписано в печать:

15.01.2009

Заказ № 1429 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шиловский, Игорь Петрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Бактериальная конъюгация.

1.1.1. Основные закономерности конъюгации на примере F-фактора Е. coli.

1.1.1.1. Общая характеристика конъюгации.

1.1.1.2. Этапы конъюгации.

1.1.1.3. Гены и белки конъюгации.

1.1.1.4. Регуляция процесса конъюгации.

1.1.2. Сходство элементов конъюгативного аппарата с компонентами системы секреции IV типа (T4SS).

1.1.3. Конъюгативная мобилизация RCR плазмид.

1.1.4. Ретроконъюгация у бактерий.

1.1.5. Конъюгативные транспозоны.

1.1.6. Особенности конъюгации грам-положительных микроорганизмов.

1.1.7. Конъюгация у бацилл.

1.1.7.1. Группа В. cereus.

1.1.7.2. Группа В. subtilis.

1.2. Плазмиды бацилл.

1.2.1. Общая характеристика плазмид бацилл.

1.2.2. Строение крупных плазмид бацилл и свойства, определяемые их генами.

1.2.3. Механизмы репликации крупных плазмид бацилл.

1.2.4. Характеристика отдельных крупных конъюгативных плазмид бацилл.

1.2.4.1. Я subtilis.

1.2.4.1.1. pLS20.

1.2.4.1.2. р1387-3 и другие плазмиды из московской коллекции.

1.2.4.1.3. pBS72, р19 и другие плазмиды из белорусской коллекции.

1.2.4.2. В. thuringiensis.

1.2.4.2.1. рХО 16.

1.2.4.2.2.pAW6 3.

1.2.4.2.3. рВМВ67.

1.2.4.3. В. anthracis.

1.2.4.3.1. pXOl.

1.2.4.3.2. рХ02.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Клонирование фрагментов ДНК плазмиды р 19, предположительно несущих гены конъюгации.

3.2. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК плазмиды р19.

3.3. Анализ нуклеотидных последовательностей плазмиды р19.

3.4. Инактивация предполагаемых конъюгативных генов плазмиды р19.

3.5. Изучение явления ретроконъюгации у Bacillus subtilis.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение конъюгативных свойств плазмиды p19 из почвенного штамма Bacillus subtilis 19"

Bacillus subtilis является наиболее изученным видом среди грам-положительных бактерий и широко применяется как в лабораторной практике в качестве модельного микроорганизма, так и в прикладных исследованиях по биотехнологии. Кроме того, существенным достоинством этой бактерии служит полное отсутствие патогенности. Ее геном был секвенирован одним из первых (Kunst et al., 1997); у В. subtilis уже давно разработаны методы, позволяющие осуществлять обмен генетическим материалом за счет трансформации и трансдукции. Однако до сравнительно недавнего времени у нее не был описан такой, распространенный у других бактерий, способ гибридизации, как конъюгация. Такой пробел объясняется, в основном, тем, что у лабораторного штамма В. subtilis 168 отсутствуют крупные конъюгативные плазмиды. В лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН была разработана система, позволяющая воспроизводить конъюгативный перенос у различных штаммов В. subtilis (в том числе и у В. subtilis 168) и других бацилл с помощью крупной (размером 97 тпн) плазмиды р19, которую несет природный штамм В. subtilis 19, выделенный проф. М.А. Титок (Белорусский гос. университет) из лесных почв Белоруссии. Конъюгативная плазмида р19 оказалась способной к «самопереносу», переносу мелких неконъюгативных плазмид и к конъюгативному переносу хромосомных генов; это делает ее удобным инструментом для различного рода опытов, связанных с переносом генетического материала у бацилл во многих областях генной инженерии и биотехнологии. Однако строение различных областей этой плазмиды, их «генный набор», и принадлежность ее к какой-либо группе других конъюгативных плазмид бактерий до настоящего времени не изучались.

Целыо работы являлось изучение строения областей, ответственных за конъюгативный перенос, у крупной конъюгативной плазмиды р19, и исследование некоторых особенностей конъюгации, происходящей с участием этой плазмиды.

В задачи исследования входило:

1. На основе полученных ранее производных плазмиды р19 провести клонирование и секвенирование генов конъюгации.

2. Осуществить в базе данных поиск гомологов генов, расположенных на секвенированных плазмидных фрагментах.

3. Провести функциональный анализ генов, лежащих на секвенированных участках плазмиды р 19.

4. Провести сравнительный анализ р19 и других конъюгативных плазмид.

5. Разработать систему, позволяющую обнаружить явление ретроконъюгации у бацилл и изучить это явление на модели плазмиды р19 у Bacillus subtilis. Работа была выполнена в группе генетики плазмид лаборатории генетики микроорганизмов ИОГен РАН им. Н.И.Вавилова.