Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика R. плазмилы рВS221 группы несовместимости Р-1, обнаруженной в штамме Pseudomonas deitrificans

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика R. плазмилы рВS221 группы несовместимости Р-1, обнаруженной в штамме Pseudomonas deitrificans"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКТТИИ ПРОКМ1ШЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ (ВНИИгенетика)

ПАРФЕНОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА R ПЛАЗМИДЫ pBS221 ГРУППЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ Р- 1, ОБНАРУЖЕННОЙ В ШТАММЕ PSEUDOMONAS DENITRIFICANS

03.00.15 - генетика

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук А. М. Воронин [кандидат биологических наук Л. А. Аниеимова

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

/

На правах рукописи

УДК 579. 252. 55: 615. 33

Москва-1Э92

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов Российской АЕ

Научные руководители:

профессор, доктор биологических наук А. М. Воронин кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Л А. Анисимова

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук Ю. 0. Сазыкин профессор, доктор биологических наук 8.Н КРЫПС&

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Е Ф. Гамалеи АМН

Защита состоится "/" З^с?- 1992 г. в час._мин. на

заседании Специализированного швета при ВНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу:

С диссертацией можно ознакомиться в библитотеке ВНИИгенетики

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного Совета канд. биол. наук

К И. Щербакова

- 3 -

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Устойчивость к антибиотикам бактерий достаточно часто контролируется плазмидами резистентности. Немаловажное значение в .распространении устойчивости к антибиотикам имеют плазмиды группы несовместимости Р в системе классификации плазмид энтеробактерий или Р-1 в системе классификации плазмид бактерий рода Pseudomonas, характеризующиеся широким кругом бактерий хозяев, который включает многие виды грамотрицательных бактерий. В то же время показана гетерогенность плазмид этой группы. Их подразделяют на три подгруппы«;,^ Больной интерес представляет исследование генетических систем репликации, несовместимости, поддержания и конъюгационного переноса этих плазмид, обеспечивающих космополитизм их существования.

Изучение плазмид группы несовместимости Р приобрело особую актуальность в связи с тем, что на основе их репликонов сконструирован ряд bhr (broad host ränge) векторов, используемых в генно -инженерных работах для получения важных биотехнологических продуктов.

Интенсивное применение тетрациклинов в химиотерапии инфекционных заболеваний, вызываемых представителями разных групп микроорганизмов, привело к широкому распространению резистентных к данному антибиотику бактерий. Очень часто резистентность бактерий к тетра-циклинам контролируется генами, входящими в состав плазмидного генома. Однако, структурно-функциональная организация детерминантов и механизмы резистентности к тетрациклинам мало изучены. Всестороннее, широкое изучение этих вопросов необходимо как для современной эпидемиологии, так и для понимания эволюции генов резистентности, а также для разработки новых подходов к созданию антибактериальных препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структурно-функциональной организации плазмиды с широким кругом бактерий-хозяев группы несовместимости Р-1 - pBS221, детерминирующей резистентность к тетрациклинам, обнаруженной в штамме бактерии. идентифицированной как Pseudomonas

denitrif ican:?.

В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задач;':

1. Построить физическую карту плазмиды pBS221.

2. Изучить гомологию плазмиды pBS221 с известными плазмидами

- 4 -

IncP группы, относящихся к подгруппам/и^.

3. Клонировать области плазмиды pBS221, участвующее в репликации и мобилизации этой плазмиды.

4. Исследовать гомологию tet детерминанта плазмиды pBS221 с tet детерминантами известных классов.

5. Клонировать tet детерминант плазмиды pBS221. Изучить экспрессию tet детерминанта в клетках Е. coli, P. aeruginosa, P. putida и В. subtilis.

б.Исследовать распространение tet детерминанта среди различных групп микроорганизмов.

Научная новизна В настоящей работе впервые представлена физическая карта плазмиды pBS221, изолированной в лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН из штамма P. denitrif icans, детерминирующей индуци-бельную устойчивость к тетрациклином и относящуюся к группе несовместимости Р-1. Обнаружена гомология плазмиды pBS221 с плазмидами RP4 (IncFlt) и R751 (Inc^o).

Клонированы и изучены гкизненно-важные области, участвующие в репликации и мобилизации плазмиды pBS221. Показано, что oriV и trfA области этой плазмиды кодируют синтез двух белков, с молекулярными ¡.ассами 43 кД и 32 кД, по-видимому, необходимых для инициации репликации.

Локализован сайт инициации переноса (oriT) плазмиды pBS221, а таетз гены, участвующие в образовании релаксационного комплекса. Эта область контролирует образование двух полипептидов с молекулярными массами 12 кД и 35 кД, участвующих в мобилизации этой плазмиды.

Установлено, что клонированный tet детерминант плазмиды p8S221 принадлежи к новому классу tet детершнантов, обозначенному- нами tetG*. Новый детерминант экспрессируется как в аэробных, так и в анаэробных условия)-:, кодирует образование двух полипептидов с молекулярными кассами 36 кД и 24 кД.

Впервые было показано, что t'etG* детерминант контролирует высокую степень устойчщюсти к тетрациклинам в клетках Enterobacter spp.

* Исследуемый детерминант обозначен нала! раньше, чем были опубликованы данные Levy S. В. tet детерминант - генетический детерминант устойчивости к тетращшшнам.

Положительные опыты по гибридизации позволяют предположить, что tetG* детерминант широко распространен среди штаммов Serratia rarcescens.

Научно-практическая значимость. Плазмида pBS221 и полученные рекомбинантные плазмиды, содержаще области pBS221, участвующие в репликации, могут быть использованы в работах по детальному исследованию систем репликации и стабильного наследования bhr плазмид в клетках различных видов бактерий. Клонированный tetG* детерминант может быть использован в качестве зонда в эпидемиологических исследованиях при скрининговом анализе устойчивости .к антибиотикам клинических штаммов бактерий и в работах по изучению механизмов устойчивости к тетрациклинам. Эти данные могут быть полезны при разработке новых или модификации существующих лекарственных препаратов, эффективных в отношении штаммов бактерий, содержащих R плаз-мидь1.

Апробация. Основные результаты диссертационной работы доложены на XI и XII рабочих совещаниях по программе "Плазмида" (Пущино, 1985, Нальчик, 1990), на V Всесоюзной'конференции "Методы получения и анализа биохимических препаратов" (Юрмала, 1987), на Всесоюзном семинаре, посвященном 90-летию со дня рождения Э.В.Ермольевой (Москва, 1988), на 11 Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клинической микробиологии в неинфекционной клинике" (Барнаул, 1988), на 1 Межреспубликанской школе-конференции молодых ученых "Физиология, биохимия и генетика микроорганизмов - фундаментальная основа биотехнологии микроорганизмов" (Алушта, 1990), на III Международном симпозиуме по биологии и биотехнологии псевдомонад "Pseudomonas 1991" (Триест, Италия, 1991), на Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы химиотерапии бактериальных инфекций" (Москва, 1991).

Публикации. По теме работы опубликовано_ 3 статьи, б тезисов.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов, изложение зкспериментальных.^зезультатов, обсуждения результатов и выводов. Работа содержит^траниц машинописного текста, 1.1 таблиц и 14 рисунков. Список цитируемой литературы включает 176 наименований, в том числе 154 - зарубежных авторов.

- 6 -

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды. Использованные в работе лабораторные штаммы и плазмиды бактерий приведены в табл. 1 и 2. Клинические штаммы энтеробактерий, стафилококков и почвенные штаммы Erwinia sp. получены из Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии ГК СЭН РСФСР.

Для определения размеров R-плазмид использовали плазмиды известных размеров: RSF1010 (8.3 т. п. н.), R6K (36 т. п. н.), RP4 (59 т. п. н.), R222 (96 т. п. н.) , любезно предоставленные JL И. Глатман (ИЭМ им. Гамалеи, Москва).

В работе использовали рестриктазы, полученные на опытно-технологической установке ИБФМ РАН и рестриктазы фирмы Reanäl (Венгрия).

Среды. Использованные в работе штаммы выращивали на мясо-пеп-тонном бульоне и агаре, L-arape, L-среде, ЫВсреде. В качестве минимальной среды для штаммов Р. aeruginosa использовали среду В (Скрябин, СТаровойтов, 1975), для штаммов Е.coli - среду М-9 (Миллер, 1976).

В работе использовали тетрациклин и метациклин отечественного производства, миноциклин фирмы "Sigma" (США), доксициклин производства предприятий "Polfa" (Польша).

Для исследования экспрессии tet генов в анаэробных условиях штаммы выращивали в среде М-9, обработанной тиогликолатом натрия (конечная концентрация - 0,1%), или в среде М-9, обработанной ри-зорцином и сульфитом натрия.

Конъюгационный перенос плазмид проводили по методу Сагаи и др. (Sagai et al. , 1975).

Наличие в штаммах плазмидной ДНК регистрировали с использованием метода Экхардта (Eckhardt, 1978).

Выделение плазмидной ДНК проводили по метода« йшсен, Олсен (Hansen, Olsen, 1978), Бирнбойм, Доли (Birnboim, Doli, 1979).

Рестрикционный анализ, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля, лигирование ДНК, реакцию нигегрансляции, перенос ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозные фильтры, гибридизацию ДНК-ДНК и колоний проводили согласно Маниатису и др. (1984).

- 7 -

Таблица 1. Использованные в работе штаммы

Штаммы Генотип Источник получения

P. aeruginosa trp-6 his-308 Uv-309 met-316 rif

ML4262 (PAO)

P. aeruginosa npoTOTpo$

P. aeruginosa his-308 trp-6

ML4600 (PAO)

E. coli K-12 K802 F' argH thi-A purD gal net hsd rps rif

E, coli K-12 HB101 F' proA2 leu6 thi-1 galK2 lacYl str hsd20 aral4 recA13 rpsL20 supE44 xyl-5

S. Mitsuhashi

коллекция лаборатории S. Mitsuhashi

A. И. Коротяев

B. R Ксензенко

E.coli K-12 C600 thi-1 thr-1 leu-6 lacYl supE44 tonA21

E. coli K-12 JM109 recAl gyrA95 thi hsdR17 supE44 relAl (lac-proAB) F' traD36 proAB lacJlZ Ml5

R И. Матвиенко В. И. Таняшин

Е. coli K-12 Х925 F' minA minB leu thr thi ara lacY gal malA xyl mtl ton rpsL20 supE

коллекция

E. coli K-12 XI037 galK2 galT22 hsdR lacYl metBl

relA supE44 rif E. coli K-12 YC259 thy thr leu thi lac recA rif

то же

Agrobacterium протограф tumefaciens 8528

rif

Rhisobium tri folium 5C Bacillus subtilis 168

his str rif

tr p

Трансформацию ДНК проводили по методу Дагерта, Эрлиха (Dagert,

Ehrlich, 1979).

Получение мики-клеток, мечение S " -метионином белков, кодируемых плазмидами, электрофорез белков в 12% SDS-полиакриламидном геле осуществляли по Хеймс и Хиггинс (1987).

Таблица 2. Использованные в работе плазмиды

Плазмиды Фенотип Источник получения

RP4 Ар То Km Тга" IncF-1 S.Mitsuiiashi

RP4:: Тп501 Ар Тс Hg Tra+ IncP-1 Т. Е Ивашина

R6 Sm Km Cm Su Hg Тс Tra+IncFII И. В. Домарадский

R388 Тр Su Тга+ IncV A. IL Коротяев

RSF1010 Su Sm Tra- IncQ Л. И. Глатман

R2 Cb Sm Su Uv . Tra+ IncP-9 G. A. Jacoby

pUC19 Ap Tra- Inc ColEllacZ Rep+ коллекция

лаборатории

pRK2013 Km imm Tra+ Inc ColEl Rep+ то же

NPL41:: Tn5 Nah+ Sal- Km TrafIncP-9 то же

R751 Тр Tra+ IncP-1 G. A. Jacoby

PBR322 Te Ap Tra- Inc ColEl Rep+ Я. И. Бурьянов

pBS221 Тс Тга+ коллекция

pUBUO - Km лаборатории

'РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Рестрикционная карта плазмиды pBS221 Плазмиды группы несовместимости Р характеризуются широким кругом бактерий-хозяев, который включает многие виды грамотрицательных бактерий. На основе репликонов плазмид IncP-группы сконструирован ряд bhr (broad host range) векторов, используемых в генноинмзнерных

работах для получения важных биотехнологических продуктов. Поэтому большой интерес представляет изучение генетических систем репликации, несовместимости, поддержания и конъюгативного переноса этих плазмид, обеспечивающих космополитизм их существования.

Ранее в нашей лаборатории из штамма Р. ¿ат(и(ГсйЛ£была изолирована плазмида рВ5221, детерминирующая индуцибельную устойчивость к тетрациклину и относящаяся к группе несовместимости Р-1. На основании рестрикционного и гибридизационного анализа, а такие рестрикци-онного анализа индивидуальных фрагментов построена физическая карта плазмиды рВ5221 (рис.1) для эндонуклеаз ЕсоМ, НтсЛП, ВалШ, II и определен ее размер в 61 тпн. Рестрикционная карта рВБ221 обнаруживает неслучайное распределение сайтов рестрикции эндонуклеаз: два основных кластера сайтов, локализованные в районах с координатами 25-32 и 36-44 тпн, разделены областями, содержащими незначительное число сайтов рестрикции.

Рис. 1. Физическая и генетическая карты плазмиды pBS221.

Клонирование гкизненноважных областей плазмиды pBS221 Для изучения кизненноважных областей плазмиды pBS221 был получен банк генов этой плазмиды в векторе pUC19. Гибридные плазмиды были мобилизованы с помощью плазмиды pRK2013 в штамм P. aeruginosa ML4262. Рекомбинантная плазмида pBS358 мобилизуется и стабильно поддерживается в штамме P. aeruginosa в течение 50 генераций, однако

не передается при мобилизации с помощью плазмиды-помощника в штаммы A. tumefaciens и R. trifolii. Известно, что минирепликон, содержащий только области oriV и trfA*, способен к стабильной репликации и поддержанию в клетках Е. coli, P. aeruginosa и P. putida. Для поддержания минирепликона плазмид в штаммах R. meliloti и A. tumefaciens необходима область размером 3,1 тпн, в состав которой входят korA (trfB korBl korD), incP-l(II), korB.

Очевидно, что полученная в наших опытах рекомбинантная плазми-да содержит только oriV и trfA* области или, по крайней мере, значительную их часть.

Представлялось интересным выяснить, каким образом проявляется несовместимость плазмиды рВ3357 и изменены ли свойства несовместимости по сравнению с исходной плазмидой pBS221. Оказалось, что тестируемая плазмида проявляет строгую несовместимость с плазмидами R751 и RP4. Подобные результаты с однонаправленным проявлением несовместимости элиминации IncP плазмид pRK24 и R751 были получены в экспериментах с плазмидой рСТ7, в которой oriV локус RK2 был введен в высоко копийный вектор другой группы несовместимости.

Анализ экстрактов миниклеток штамма ХЭ25, в которой была трансформирована плазмида pBS357, показал наличие двух белков с молекулярными массами 43 кД и 32 кД, - кодируемых рекомбинантной плазмидой, по-видимому, необходимых для инициации репликации (Рис.2).

43 кД

1 2

Рис.2. Радиоавтограф 355-меченых полипептидов, кодируемых рекомбинантной плазмидой рBS357 (oriV и trfA* области плазмиды PBS221) в миниклетках штамма Е. coli Х925: 1) pUC19, 2) PBS357.

Клонированные oriV и trfA* расположены в районе с координатами

30-38 тпн.

Из банка генов плазмиды pBS221 был выбран клон, содержаний ре-чомбинантную плазмиду pBS359, характеризующуюся наибольшей частотой мобилизации плазмидами RP4-и R751 - 2.10-3 и 3.10-1 соответственно. •Слонированный фрагмент размером 3,6 тпн, несущий oriT,- содержит по здному сайту для рестриктаз Sali, EcoRI, HindШ.

Достаточно высокая частота мобилизации с помощью RP4 исследо-занной плазмиды pBS359 позволяет нам предположить, что данная плаз-веда содержит не только сайт oriT, но и гены, участвующие в образо-зании релаксационного комплекса. Анализ полипептидов, кодируемых тлазмидой pBS359, показал присутствие ^олипептидов с молекулярными кассами 12 кД и 35 кД, возможно участвующих в мобилизации этой I лаз миды.

Изучение гомологии плазмиды pBS221 с плазмидами 1пс1^и IncPg

подгрупп

Используя фрагменты ДНК плазмиды RP4 и R751, содержащие жиз-:екно важные области, контролирующие репликацию и конъюгационный :еренос этих плазмид, была изучена гомология данных плазмид с плаз-мдой рВ5221 (представлено на рис. 3). Как видно из рисунка, наблю-;ается гибридизация со всеми пробами, однако более слабо гибридизу-)тся бонды из плазмиды RP4. Известные плазмиды IncF^ группы .етерминируют устойчивость к хлористой ртути (R906, pJP4) или со-ержат фрагменты ДНК, гомологичные тег оперону и концевому повтору ранспозона Tn501 (R772) или только концевому повтору этого трансозона (R751). Плазмида pBS221 не контролирует устойчивости к ртути и з штаммах Е. coli, ни в штаммах P. aeruginosa, но EcoRI-фрагмент лазмиды-РР4:: Тп501, содержаний гены пег оперона, гибридизуется с А EcoRI-фрагментом pBS221.

На основании полученных нами результатов, таких как строгая есовместимость плазмиды pBS357, содержащей оонированные trfA и riV локусы плазмиды pBS221, с плазмидой R751, более высокая по равнению с RP4 частота мобилизации R751 плазмиды pBS359, содержа-эй oriT локус плазмиды pBS221, можно предположить, что плазмида 3S221'относится к подгруппе IncRg. Косвенно это подтверждает и боге сильная гибридизация фрагментов ДНК плазмиды R751 с ДНК плазми-

ды р&>221 по сравнению с таковыми из Р?Р4. К настоящему временя плазмида рВБ221 является единственной плазмидой тс&юдгруппы, детерминирующей резистентность к тетрациклинам. Однако детерминанты исследуемой плазмиды не гомологичны tetA детерминанту плазми-ды Г?Р4.

ЯК2

я,' *

,?г гг.

Кт

РР5-»«

заи

л

_1_

•еп^рп Тп»1 ¿«7 «»-в

л.

миииа

га ^ Гзо

I '\Yf.TlIlil

Т У ]

¡0

ТЛУ.-УЛ.Ч!

>ВБ221

и* ¡0

ВЕКИ

ЕайЗЗ

Рис.3. Изучение гомологии плазмиды рВ5221 с плазмидами НК2 (1псВ) ¡3751 (1пс5в). Заштрихованными прямоугольниками отмечены об ласти плазмид Н<2 и 13751, использованные в качестве зондов и гомологичные им области плазмиды рВ3221.

Молекулярно-генетический анализ плазмиды рВ3221 дополняет име ющиеся представления о генетической организации "базового" реплико на 1псР плазмид. Как и другие плазмиды группы 1псР, плазмида рВ322 содержит два кластера сайтов, один из которых находится дистальне детерминанта, другой - между участками ДНК плазмиды, гомологич ными 1га1-, Ьга2- и 1гаЗ-областям плазмиды ИР4. Таким образом, н плазмиде рВ3221 эти локусы разделены.

Полагают также, что общим предшественником плазмид ГпсР^подг руппы была плазмида, содержащая транспозон Тп501, интегрированный сайт между 1гГА и опУ локусами. Обнаружение в составе плазмид рВ3221 последовательностей, гомологичных тег-оперону Тп501, подт

¡ерждает принадлежность плазмиды pBS221 к подгруппе IncR^. Клонирование и экспрессия tet детерминанта Ранее было показано, что колонии штамма P. aeruginosa ML4262, содержащие плазмиду pBS221 (Тс Tra+ 1псР-1), не гибридизуются с зрагментами ДНК плазмид, содержащими генетические детерминанты ре-щстентности к тетрациклинам классов А, В, С. Также нами было пока-ано отсутствие гибридизации ДНК плазмиды pBS221 с tet(D), tet(E), et(L), tet(M) генами (табл.3)

'аблица 3. Зонды, использованные в экспериментах по гибридизации ДНК-ДНК и колоний для классификации tet детерминантов

'ен резис- Плазмида Зонд Размер Источник

ентности зонда получения

тпн

etA RP4 Smal 0.75 S. Mitsuhashi

etB R6 Hindi 11 4.8 И. В. Дамарадский

et,C pBR322 BamHI-Bgll 0.7 ' G. A. Jaccby

etD PSL106 Hindi I I-PstI 2.5 S. B. Levy

stE PSL1502 BamHI-Clal 2. 4 S. B. Levy

gtL pWV158 EcoRI-PstI 2. 4 V. Burdett

3tM PJ13 KpnI-Hindlll 4. 8 V. Burdett

Из банка генов плазмиды pBS221 были отобраны 4 клона, способна расти на среде, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина. В двух кло-ах были обнаружены плазмиды, обозначенные pBS353 и pBS354, содер-ащие вектор со вставками 3,6 тпн, в двух других - плазмиды, Зозначенные pBS355 и pBS356 со вставками 3,5 тпн. Клонированные эагмекты ДНК имеют 2 сайта для рестриктазы Haell. íía фрагментах ■Ж, содержащих tet гены плазмид pBS353 и pBS354, помимо 2 сайтов тя рестриктазы Haell, картирован участок узнавания для рестриктазы nal, отсутствующий в клонированных фрагментах плазмид pBS355 и £356 (рис.4).

В табл. 4 представлены результаты исследований устойчивости к ярацгаслинам штаммов, содержащих рекомбинантные плазмиды. Уровень !зистентн0сти к антибиотикам тетрациклинового ряда, детерминируе-

мый исследуемыми плазмидами,• значительно превышает таковой для ро дительской плазмиды рВ5221. Очевидно, такое значительное увеличени уровня резистентности связано с эффектом дозы гена и определяете мультикопийностью использованного вектора риС19.

Рис.4. Схема конструирования плазмид pBS356 (pBS355), pBS360 и _ pBS36v

Tet гены классов А-Е экспрессируются в штаммах 'Е. coli в ана робных условиях, хотя уровень устойчивости значительно ниже. Шгам Е. coli, содержащие плазмиды pBS353 и pBS355, растут на минимальн среде М-9, содержащей 10 мкг/мл тетрациклина в анаэростате; при

мкг/мл тетрациклина роста уже не наблюдается.

С использованием системы мини-клеток были определены полипептиды, контролируемые 1еЪ-оперонами плазмид рВ3353 и рВ3355. ТеЬ детерминант плазмиды рВ3355 контролирует синтез двух полипептидов с мол. массой 27 кД и 36 кД, а ЪеЬ детерминант плазмиды рВ3353 - синтез полипептида с мол. массой 36 кД. Поскольку плазмида рВ3353 контролирует конститутивную устойчивость к тетрациклинам, можно предположить, что белок с мол. массой 27 кД, кодируемый плазмидой рВ5355, является белком репрессором, синтез которого в штамме, содержащем плазмиду рВЗЗБЗ, отсутствует.

Таблица 4. Резистентность к тетрациклинам, детерминируемая плазми-дами, содержащими клонированные tet гены pBS221

Плазмида Размер Индуци- WIK (мкг/мл)*

клонирован, бельность _

Фрагмента,

тпн тетрациклин миноциклин доксициклин

н** и*** н и Н и

PB3353 3.6 175 175 75 75 200 200

рВ3354 3,6. - 175 175 75 75 200 200

PBS355 3,5 + 175 425 75 125 200 320

pBS356 3,5 +- 175 425 75 125 200 320

pBS221 + 125 200 25 50 50 75

* Посевная доза для всех исследованных штаммов Е.coli JM109, содержащих плазмиды, равна 108 кл/мл

** неиндуиированная ы<* индуцированная

Tet детерминанты классов А-Е и, по-видимому, tet гены нового "ласса контролируют активный вывод антибиотика из клетки и имеют

структуру tet-оперона, кодирующего 2 белка: белок-репрессор и белок, определявший резистентность, но различаются по нуклеотиднои последовательности ДНК. По-видимому, »^следуемый tefconepon, отнесенный нами к новому классу G*, более близок по функциональной организации к tet-оперонам классов А-Е, чем класса F.

Клонирование tetG* детерминанта в клетках P. aeruginosa Для изучения экспрессии tetG* детерминанта в клетках P. aeruginosa ДНК плазмид RSF1010 и pBS356, обработанные эндонуклеа-зами Pstl и EcoRI, лигировали лигазой фага Т4. Получении клоны на среде со стрептомицином, что свидетельствует о наличии в клонированном детерминанте собственного промотора, с которого осуществляется транскрипция aphC гена. Последний факт подтверждает полученные ранее результаты опытов по индукции тетрациклином клонированного tetG* оперона в векторе pUCIS (плазмида pBS356) и отсутствие таковой при индукции лактозой. Уровень резистентности к теграциклинам, детерминируемый плазмидой pBS360 в штамме P. aeruginosa ML4262 РАС (МИК 500) выше такового, определяемого плазмидой pBS356 в клетках Е. coli J Ml 09 (МИК 175).

Клонирование tetG* детерминанта в клетках В. subtil is В настоящее время появилось достаточно много данных, свидетельствующих о горизонтальном переносе генетической информации между грамположительными и грамотрицательными микроорганизмами. С целью изучения экспрессии tetG* детерминанта в клетках грамположи-тельных бактерий гены tetG* оперона плазмиды pBS356 переклонированы в вектор pUBllO и трансформированы в В.subtilis. Ни один из полученных клонов, содержащих рекомбинантную ДНК, не рос на среде L с тетрациклином даже в том случае,' когда концентрация тетрациклина была близка к МИК тетрациклина для бесплазмидного штамма В. subtilis 168,

Распространение tet детерминанта нового класса Используя 3,6 тпн Hindi II-EcoRI фрагмент плазмиды pBS355 в качестве зонда, изучено распространение tetG* детерминанта в устойчивых к тетрациклину штаммах грамотрицательных бактерий и среди 50 конъюгативных R плазмид, изолированных из энтеропатогенных штаммов E.coli. Ни один из исследованных штаммов Klebsiella sp., К. oxytoca, К. pneumoniae, Morganella morganii, Proteus vulgaris, P.mirabilis, Shigella flexneri, Hafnie sp., Citrobacter sp. не содержит tet генов данного класса. Три

Таблица 5. Распространение детерминанта нового класса в штаммах -оамотрицагельных бактерий

Штамм • Число Число штаммов,

лсследованных гибридизуюцихся с

iet детерминантом Ж221

Escherichia coli 50 1*

Citrobacter sp. 1 0

Klebsiella sp. 50 0

Klebsiella oxytoca 1 0

Klebsiella pneumoniae 5 0

MorganeIIa morganîi 3 0

Proteus vulgaris 6 0

Droteus rettgeri 2 0

Proteus mirabilis 9 0

Serratia rnarcescens 50 1(10*)

Shigella flexneri 4 0

Hafnia sp. 12 0

r,seudonx;nas aeruginosa 75 1(2*)

плазмиды, выделенные из знтеропатогенных

штаммов Е. col i 50 О

- менее интенсивная гибридизация

■итамма из 75 просеренных штаммов P. aeruginosa, один штамм из 50 исследованных штаммов Е. coli. 11 штаммов из 50 штаммов Serratia rnarcescens гибридизуются с зондом (табл.5).

3 указанных выше 10-ти штаммах1 S. rnarcescens обнаружены конъ-;пгативные R плазмиды, контролируйте резистентность к тетрациклину :: молекулярными массами около 80-90 !Д, в штамме S. rnarcescens, интенсивно гибридизующемся, R-плазмида с молекулярной массой 46 МД. Возможно, более слабая гибридизация 10-ти штаммов S. rnarcescens- свя-;ача с бол?е низким числом копий tet плазмид в этих штаммах, учитывая их большую молекулярную массу.

- IP. -

Представлялось интересным выяснить, распространен ли tetG* детерминант в родах Enterobacter и Erwinia, входящих в ту же подгруппу бактерий семейства Enterobacteriaceae, что и Serratia, основной средой обитания которых является вода и почва. Из 26 штаммо! Enterobacter с пробой, содержащей tetG* детерминант (EcoRKalL1 фрагмент плазмиды pBS355), гибридизуются 13 штаммов, из 34 штаммо! Erwinia положительный ответ установлен для 12 штаммов. Однако следует отметить менее интенсивную гибридизацию для колоний штаммо] Erwinia и Enterobacter по сравнению с контрольным штаммом Е.coli ( плазмидой pBS221.

Открытие различных, но связанных между собой детерминантов резистентности к тетрациклину у грамотрицательных микроорганизмо] указывает на то, что в процессе их эволюции могли происходить Kai дивергенция, так' и конвергенция. Источником tet-гвнов, возможно, были гены, служащие для выполнения каких-то других функций, а н; вывода антибиотика из клетки. Возможно, широкое использование тет-рациклинов привело к тому, что эти гены были привлечены к выполнению новой функции.

Обнаружение tet-детерминанта нового класса в штамма: Р. aeruginosa в составе плазмиды, относящейся к группе несовмести мости Р-1 и имеющей широкий круг хозяев, интересно с точки зрени; распространения детерминантов резистентности. Плазмиды группы IncP 1 могут служить идеальным "переносчиком" для распространения гено резистентности новых типов среди бактерий.

вывода

1. Построена физическая карта плазмиды pBS221.

2. Клонированы области плазмиды pBS221, участвующие в реплика ции и мобилизации этой плазмиды. Установлено, что [тонированные об ласти oriV и trfA* кодируют синтез двух полипептидов с молекулярно массой 43 кД и 32 кД. Область, содержащая oriT, кодирует синтез по липептидов с молекулярной массой 12 кД и 35 kZ,.

3. С использованием метода ДНК-ДНК гибридизации обнаружена го мология плазмиды pBS221 с плазмидами RP4 (Incß.) и R751 (IncF^j ) Участки гомологии расположены в областях, участвующих в, репликации поддержании и конъюгационном переносе плазмид.

4. Клонирован tet детерминант плазмиды' pBS221. Установлено что исследуемый детерминант не гибридизуется с tet детерминантаь

лассов D, Е, M, L и в отличие от tetF детерминанта экспрессируется пк в аэробных, так и в анаэробных условиях, tet детерминант отне-ен к новому классу G*.

5. Клонированный tetG* детерминант кодирует образование двух олипептидов с молекулярной массой 36 кД (белок резистентности) и 7 кД ( белок-репрессор).

6. TetG* Детерминант контролирует устойчивость к тетрациклинам клетках P. aeruginosa, Е. coli, но не экспрессируется в В. subtil is.

7. С использованием метода гибридизации колоний изучено расп-остранение tetG* детерминанта в штаммах бактерий семейства nterobacteriaceae и Pseudomonas aeruginosa. Обнаружено, что все сследованные штаммы Serratia marcescens, 1 штамм Е.coli и 3 штамма .aeruginosa гибридизуются с используемым зондом.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Козлова Е. В. , Парфенова 0. В. , Ерова Т. Е. , Анисимова JL А. , оронин А. М. Плазмиды бактерий рода Pseudomonas с широким кругом актериальных хозяев. Сб.тезисов докладов XI рабочего совещания по рограмме "Плазмида", Пупщно, 1986, с. 24.

2. Анисимова JL А. , Козлова Е. В. , Ерова Т. Е. , Парфенова О. В. , оронин А. М. Генетические пробы для определения резистентности к ятибиотикам и устойчивости к сыворотке крови бактерий родов seudomonas и Salmonella. Сб. тезисов докладов V Всесоюзной конфе-энции "Методы получения и анализа биохимических препаратов", Юрма-ä, 1987, с. 236.

3. Парфенова О. В., Анисимова JL А. Изучение структурно-функцио-альной организаций плазмиды pBS221. Сб.тезисов докладов 11 Всесо-зной конференции "Актуальные вопросы клинической микробиологии в эинфекционной клинике", Барнаул, 1988, с. 232.

4. Парфенова О. В. , Анисимова Л. А. , Воронин А. М. Структура-функциональная организация плазмиды pBS221 группы несовместимос-l Р. Генетика, 1990, т. 26, N 6, с. 981- 988.

5. Парфенова О. В., Анисимова Л. А., Воронин А. М. Клонирование и сспрессия детерминанта резистентности к тетрациклину нового класса штаммах Escherichia coli. Молекулярная генетика, микробиология и фусология, 1990, N. 7, с. 3-7.

6. Ерова Т. Е. , Парфенова О. В., Анисимова JL А. , Воронин А. М. ¡нетические детерминанты резистентности к тетрациклинам плазмид

бактерий рода Pseudomonas. Молекулярная генетика, микробиология вирусология, 1990, N И, с. 29-31.

7. Парфенова 0. В. , Анисимова Л. А. , Воронин А. М. Клонирование экспрессия детерминанта резистентности к тетрациклину нового класс в штаммах E.coli. Сб. тезисов докладов "Бактериальные плазмиды" сс вещания "Плазмида XII", Нальчик, 1990, с. 111.

8. Anisimova L. А. , Parfenova 0. V. , Suzina N. Е. , Dmitriev V. V. Boronin A.M Plasmids of Pseudomonas bacteria determinir res i stant: s to potassium tellurite. Book of abstracts Thir International Symposium on Pseudomonas Biology and Biotechnology Triest, Italy, 1991.

9. Парфенова 0. В. , Анисимова Л. А. , Воронин А. М. Эксперссия te детерминанта плазмиды pBS221 в клетках Escherichia coli Enterobacter species, Pseudomonas aeruginosa и Bacillus subtilis Сб. тезисов докладов Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы хк миотерапии бактериальных инфекций", Москва, 1991, с. 490-491.

18.03.92 г. 31K.5II0P Тир.125 экз. Уч.-изд.л. 1,0 Отпечатано на ротапринте в 0НТИ ПНЦ РАН