Организация плазмидных репликонов групп несовместимости P-7 и P-9

Соколов, Сергей Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Организация плазмидных репликонов групп несовместимости P-7 и P-9
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Организация плазмидных репликонов групп несовместимости P-7 и P-9"

00460961а

На правах рукописи

СОКОЛОВ СЕРГЕЙ ЛЬВОВИЧ

ОРГАНИЗАЦИЯ ПЛАЗМИДНЫХ РЕПЛИКОНОВ ГРУПП НЕСОВМЕСТИМОСТИ Р-7 И Р-9

03.02.07 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 О СЕН 2010

МОСКВА-2010

004609618

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Учреждения РАН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Научный руководитель:

член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор

Учреждение РАН Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, професор. ФГУП «ГосНИИ генетика»

кандидат биологических наук, Учреждение РАН Институт общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН

Ведущая организация:

Воронин Александр Михайлович

Яненко Александр Степанови

Полуэктова Елена Ульриховн

Учреждение РАН Инсти> молекулярной генетики РА

Защита диссертации состоится « октября 2010 года в ^^ часов \ заседании диссертационного совета Д217.013.01 при Федерально государственном унитарном предприятии ГосНИИгенетики и селеквд промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИГенетика) по адресу: 1175^ Россия, Москва 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственнь научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленнь микроорганизмов».

Автореферат разослан « & » сентября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

Т.Л. Воюшина

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Изучение геномов микроорганизмов, в частности псевдомонад, касается не только хромосомной ДНК наиболее типичных видовых представителей, но также и разностороннего исследования мобильных генетических элементов, встречающихся у данных бактерий. Плазмиды - наиболее типичные представители мобильных генетических элементов, поскольку они реплицируются отдельно от хромосомы хозяина и встречаются у довольно широкого круга микроорганизмов, занимающих различные экологические ниши (Turner et al., 2002). Многие плазмиды несут важные для клеток-хозяев детерминанты, такие как способность утилизировать устойчивые органические соединения, резистентность к антибиотикам или иным токсичным веществам, факторы патогенности и т.д. (Тор et al., 2000). Но при этом некоторые гены, обнаруженные на хромосомах бактерий, могут также находиться и в составе плазмид, следовательно, генетические характеристики плазмид не являются неизменными и исключительными. Кроме того, генетические характеристики плазмид обычно не связаны с нормальными условиями окружающей среды, но чаще -с теми изменениями в окружающей среде, с которыми микроорганизмы могут столкнуться. Катаболические гены, ассоциированные с плазмидами, обычно существуют в самодостаточном виде, например, в виде единого оперона, или в составе транспозона, что дает им возможность экспрессироваться в широком круге бактериальных хозяев.

Плазмиды, по определению - автономные структуры, содержащие собственные системы репликации и стабильного поддержания, делающие их в известной степени независимыми от бактериального хозяина. Для каждой плазмиды характерен свой круг хозяев, в котором выполняются эти условия. Однако бывают ситуации, когда круг хозяев, в который возможен перенос плазмиды, и ее реальный круг хозяев, в котором функционируют системы репликации и поддержания плазмиды, не совпадают. Тогда плазмида, попадая в бактериальную клетку, в которой невозможна ее автономная репликация, способна сохранить свое существование, только интегрировавшись в хозяйскую хромосому, действуя, таким образом, как природный суицидный вектор. Анализ имеющихся на сегодняшний день бактериальных хромосомных последовательностей ДНК показывает, что интеграция и эксцизия плазмид из бактериальной хромосомы - довольно частое событие (Chiu and Thomas, 2004).

Детальный генетический анализ как вновь выделенных, так и уже описанных плазмид предоставит ценные сведения о роли плазмид в адаптации бактерий, о микроэволюции плазмид и их мозаичном строении, о значении рекомбинации,

коинтеграции и инсерции мобильных элементов (интегроны, транспозоны и IS-элементы) в генетическом разнообразии плазмид и их хозяев.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы являлось изучение организации плазмидных репликонов групп несовместимости Р-7 и Р-9 на примере плазмид биодеградации ПАУ и R-плазмид бактерий рода Pseudomonas.

В соответствии с целью, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать минирепликоны плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости и изучить их структурную организацию;

2. Провести филогенетические исследования структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (oriV, гер- и раг-генов);

3. Исследовать влияние плазмидных транспозонов и IS-элементов на стабильность плазмид и функционирование генов деградации ПАУ;

4. Изучить встречаемость и распространение 1псР-7 и 1псР-9 плазмид в загрязненной и незагрязненной ксенобиотиками почве.

Научная новизна

В ходе работы впервые получены минимальные репликоны плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-95, проведен филогенетический анализ структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (oriV, гер- и /иг-генов), показана необходимость участия раг-генов в процессах репликации и поддержания 1псР-95 плазмид в клетках Е. coli. Получена информация о «структурном скелете» плазмид биодеградации группы несовместимости Р-9, определены вариабельные участки у плазмид различных подгрупп 1псР-9.

На примере плазмиды NPL-1 и ее производных продемонстрировано влияние совместной экспрессии катаболических и транспозонных генов на структурную стабильность плазмид. Показано, что инверсия 4.2 т.п.н. фрагмента у плазмиды NPL-1 приводит к изменению характера экспрессии катаболических генов с индуцибельного на конститутивный.

Впервые в ходе экзогенной изоляции плазмид при двухродительском скрещивании из образцов почв, загрязненных устойчивыми органическими соединениями, наряду с плазмидами биодеградации были выделены и плазмиды устойчивости к антибиотикам, получившие распространение в почве благодаря неспецифическому загрязнению.

Практическая значимость работы

Полученные данные по структурно-функциональной организации плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-9, их распространения, круга хозяев, а также роли в адаптации микроорганизмов к изменяющимся условиям внешней среды могут быть использованы в работах по созданию плазмидных векторов и штаммов микроорганизмов с заранее заданными свойствами, а также для разработки систем мониторинга бактериальных штаммов-деструкторов в ходе процесса биоремедиации загрязненных территорий.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: EERO Workshop "Enzymatic and Genetic Aspects of Environmental Biotechnology", Пущино, 1995; IT Открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, 1997; International Symposium on Plasmid Biology, Merida, Mexico, 1998; Pseudomonas Congress, Brussels, Belgium, 2001; 3d symposium on "Mobile genetic elements' contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001; 12th International Biodeterioration&Biodegradation Symposium Prague, Czech Republic, 2002; III Пущинская школа-семинар по экологии «Экология 2004: Эстафета поколений», Пущино; "Plasmid Biology 2004" Conference, Corfu, Greece; 13th International Biodegradation&Biodeterioration Symposium, Madrid, Spain, 2005; International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006, Leipzig, Germany; 4th European Bioremediation Conference, Crete, Greece, 2008.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 40 работ, из них 9 статей и 31 материал конференции.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах машинописного текста, включает 6 таблиц и 29 рисунков. Библиография включает 185 наименований, из них 15 отечественных и 170 зарубежных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Биодеградация нафталина, детерминируемая плазмидами бактерий рода Pseudomonas, к настоящему времени исследована на примере нескольких плазмид

(Cerniglia, 1992). Как правило, гены биодеградации нафталина организованы в два оперона. Верхний nahl-оперон контролирует окисление нафталина до салицилата; нижний nah2-оперон включает в себя гены, ответственные за окисление салицилата до катехола с последующим расщеплением последнего по мета-пути до субстратов цикла Кребса (Yen and Serdar, 1988). Регуляция экспрессии /гаА-оперонов детально изучена на примере плазмиды NAH7: продукт гена nahR, расположенного между оперонами, является позитивным регулятором, индуктором экспрессии служит салицилат (Yen and Gunsalus, 1985). Ранее сотрудниками лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН был описан штамм Pseudomonas pulida BS202, содержащий плазмиду NPL-1 размером около 100 т.п.н. группы несовместимости Р-9, которая контролирует деградацию нафталина до салицилата. Дальнейшее окисление салицилата происходит через орто-пугъ расщепления катехола и контролируется хромосомными генами (Кошелева и др., 1986). NPL-1 содержит функциональный nah!-оперон и молчащие гены мета-пути окисления катехола Синтез первого фермента окисления нафталина, нафталин диоксигеназы NahA, у штамма BS202 является строго индуцибельным, как и в случае плазмиды NAH7 индуктором является салицилат.

Плазмида NPL-41 представляет собой спонтанный мутант плазмиды NPL-1 с конститутивным синтезом нафталин диоксигеназы. Опыты по элиминации плазмиды NPL-1 показали наличие функционального гена салицилат гидроксилазы в составе бактериальной хромосомы штамма BS202. Бесплазмидный Sal+ вариант получил обозначение BS203. Для штамма BS202 (NPL-1) с помощью элиминации, транспозонного мутагенеза и конъюгационного переноса получен ряд производных, как бесплазмидных, так и содержащих плазмиды, контролирующих Nah+Sal~, Nah+Sal+ и Nah~Sal+ фенотипы. Производные штамма BS202 (NPL-1) характеризуются также различными типами экспрессии лай-генов и отличаются по стабильности поддержания плазмид на разных ростовых субстратах.

В ходе дальнейшего исследования плазмиды NPL-1 она была помечена транспозоном Тп/ (Кошелева и др., 1986). Инсерция Тп/ привела к исчезновению Nah+ признака, но создала возможность отбора трансконъюгантов плазмиды NPL-1 ::Тп1 в Sal- штаммах по признаку устойчивости к ампициллину. Один из полученных штаммов был обозначен BS814 (NPL-1::Tnl). В результате длительного хранения BS814 (NPL-l::7>i/) в неселективных условиях с частотой КГМ(Г8 происходило образование клонов с фенотипами Nah^Sal+ и Nah"Sal+. Эти штаммы содержали плазмиды, которые получили обозначения pBS108 и pBS106 соответственно. Примечательно, что при восстановлении Sal+ фенотипа одновременно, по крайней мере в случае pBS106, включаются молчащие плазмидные гены мета-пути окисления катехола.

В данной работе изучались особенности генетической организации плазмид NPL-1, NPL-41 и pBS106.

Стабильность плазмид NPL-1 и NPL-41 в штаммах Р. putida при длительном культивировании

Проведенные ранее эксперименты по изучению стабильности плазмид NPL-1 и NPL-41 (Воронин и др., 1985) показали, что при культивировании BS202 на глюкозе плазмида NPL-1 достаточно стабильно поддерживается в клетках хозяйского штамма. Однако при выращивании на среде с салицилатом в качестве единственного источника углерода стабильность поддержания NPL-1 значительно уменьшается. Через 65 генераций менее 1.5% клеток от числа общей популяции имели Nah+ фенотип. Кроме того, некоторые Nah" штаммы содержали делеционный вариант плазмиды размером около 40 т.п.н.

Иная картина наблюдалась при изучении стабильности плазмиды NPL-41. При культивировании штамма с плазмидой NPL-41 и на глюкозе, и на салицилате менее чем через 100 генераций доля клеток, содержащих NPL-41, снижалась до 1%. Так же, как и в случае NPL-1, некоторое число Nah" клеток содержало 40 т.п.н. делеционный вариант NPL-41.

Рестрикционный и гибридизационный анализ NPL-1 и ее производных

Анализ плазмид NPL-1 и NPL-41 с помощью эндонуклеаз рестрикции EcoRI, ШпйШ и ВатШ показал их значительное сходство, за исключением области размером 4.2 т.п.н., примыкающей к регуляторной области nahl-оперона и, скорее всего, эту область затрагивающую. У NPL-41 наблюдается инверсия 4.2 т.п.н. фрагмента ДНК, что сопряжено с отмеченными изменениями свойств данной плазмиды (Кошелева и др., 1986). Рестрикционная картина распределения ЕсоШ фрагментов плазмид NPL-1 и NPL-4I очень схожа с таковыми у ряда плазмид биодеградации нафталина, в частности, pDTGl (Stuart-Keil et al., 1998), pBS216 и pSNll (Соколов и др., 2005).

Гибридизационный анализ с мечеными 32Р пробами генов nah А, nahH, nahR и nahG плазмиды NAH7 показал, что у плазмид NPL-1 и NPL-41 гены ла/г/-оперона практически полностью локализованы в составе 16.5 т.п.н. ßcoRI-фрагмента. В то же время в составе 19.5 т.п.н. фрагмента находятся нефункциональные гены nahG и мета-аут расщепления катехола. В случае nahR-зонда гибридизационный сигнал отсутствовал у обеих плазмид. Для pBS106 наблюдалась иная картина: отсутствовала гибридизация с nahA-зондом, тогда как nahH, nahR и nahG-зонды давали четкий гибридизационный сигнал с верхним ЕсоRI-фрагме[itoм плазмиды. Результаты гибридизации подтверждались полимеразной цепной реакцией с набором олигонуклеотидных праймеров к тем же генам. Во всех случаях, когда наблюдалась

гибридизация с меченым зондом, были получены ампликоны соответствующих плазмидных генов (Кошелева и др., 2003).

Клонирование /шй-областей и прилегающих к ним участков плазмид NPL-1 и pBS106

Гибридизация ДНК плазмиды NPL-1, обработанной №'ndIII, с зондами, описанными выше, показала, что гены nahI и нефункционального лай2-оперонов расположены в близких по размеру (около 8 т.п.н.) фрагментах ДНК. Эти фрагменты были обработаны £coRI и лигированы с вектором pBluescript II KS+ по тем же сайтам. Отбор рекомбинантных плазмид проводили с помощью гибридизации клонов с соответствующими зондами. Сопоставление размеров клонированных фрагментов, а также частичное определение их нуклеотидной последовательности при помощи универсальных праймеров М13 позволило построить карту и ¿¡/¡-области плазмиды NPL-1 (Рис. 1). Как видно из рисунка, инсерция транспозона нарушает регуляторную область иай-оперонов и ген nahG. Ген nahR отсутствует в составе плазмиды NPL-1, но находится на хромосоме, поскольку у штамма Р. putida BS202 сохраняется индуцибельный характер синтеза нафталин диоксигеназы.

EcoBI ЕсоЪ1 НмШ

ÄroRI Eco RI

\ ЕсоШ Hin din «мп

БатШ \ \ ВатЖ Х1 Г ВатШ 1 .

л ahí - оперон

i- в с г D •>

I- в с г D ■

инверсия

tnpl

наЛ2 - оперон

-Т-Т-Т-Т-Т--1—, NPL-1

—г п—I---1---1---1---1 »

Rj G ¡ Н ¡ I ¡ К ¡ L ¡ J j КЬ

,—,--,—NPL-41

h)g¡H¡ i ¡ n ¡ l ¡ j ¡ к)-

—1- i.__1. _ _ l.__V__1__

Nah-про мотор

□

Функциональные гены

j NahR-незввнснмый громотор

}_ _¡ Молчащие гены

Рис. 1. Карта /шА-областей плазмид №Ь-41 и рВ8106. Расположение сайтов

рестрикции не масштабировано и привязано к их локализации в генах.

-—ТпрА рВ8106

ркиим, Рхеи4отолв* »р. (САС800Й4) рЯА2, Ркм</отояшх »¡сшНяепе* (УР_025335) рКЬН443, ХаШквшвяв1 салреМгк (САВ65711) ,, рХЛС64, Хвягкотоялз шхвпор*4а ^Р_644795) I- рХСУ|9, \anihomonas сштра/ги (УР_361509)

-ТвЗ ЕхЬепскш соН (гР_00734188)

—-■-ТпЗ РгшлкЫ (р. (ЕАМ83348)

-- ТпЗ Б1гер1отусе1 илртапелм (СА159998)

--—Т&4556 Ягтертшусп/глЛвг (Р20189)

1г--- ¡Инм/осессы гиЬег (ААЬ25727)

- рЯЕС\,КШососсы егрЬгорЫЬ (УР_34513Ь) -рАМ373, Етегососсиг/»есш!й (КР_072001)

-ТвЗ В*сШииЬыпяцияя$ (ЕА057255)

Тв801 Ритёотвнмз леп^шв!а (ААС77429) ???1Ъ\,$а1теяе1и еШетка (САС25429) ТпЗ КиЬйеНаряечмоя1ае (ААЯ91460) Тв1 ЕккчпсМт соН [АА049563)

- ТпЗ Саяисисчи хмНегта/а (ЕА183206)

.ТпрР^РЫ

22| рСТ14, Рьеш/иявявш «р. (АВА2597Ц) 50 ТпрЯ2 ?ЬО<>-\,Р%е»ёотоя»1 *р. (ААР44227) Нин! 49, РаыЫотопаг легицЫыв (СА146988) | рК^\,Р^и4лтояаз ршШ (ААХЗШ7)

1491--ТпрК! рХАСЗЗ, ХшяНютояи лхвнороИв (ААМЗУ233)

'П- 1псР-!рРВ8, Г*еы4»тояаш «р. (СА110739)

I-рТГ5! АсИШоЬвсШм/егнюхНни (ААСК0185)

'— рРСН 1, Неи4о*опиршЫа (САА70597)

100 ТпрК1 РХАС64,*,«лгАвви»»м»*гм«»/»вА"1 (ААМ39307) - рКЬС102, Р\еиёом»яч игих 'икпл (ААР22617)

т,

ТпрЯ1 рХСУМЗ,Хая1котоял1 сатрсиш (СЛЛ9Ч15)

,-ТпрЯрВБЮб

г- р(*А2, Рхы4ит»на* а!саНцепп (ААС33273) [34|

93 — Рхеы^ототв! »р. (САС80087)

| рКОШЗ, ХшчЬитаял! сатрлггп <С'АВ65714) ч2 ТярЫ рйТС!, Риыёотона* ршЫ* (АА064282) 1 ТпрЫ р\0*-1, РкмАмммм $р. (ААР441У4) , ТпрВД рХАС64, Хая1котоят тх*ппр<>4п (ААМЗЧЗ17)

___1001 рХСЛ'П, Хая1Аотпяаг сттрШп» (УР_ЗМ512)

ТпрШ рХАСЗЗ, ХаШкотпяа* ахоян/нчНг (ААМ39242)

- ТпрШрОТС^ЛгиА/лммшригМв (АА064264)

Рис. 2. Дендрограммы, иллюстрирующие эволюционные взаимоотношения транспозаз и резолваз плазмид №Ь-1 и рВБЮб.

Гены nahG и nahR плазмиды pBS106 были клонированы в векторе pBluescript II KS+ (Соколов и др., 1998). Определение нуклеотидной последовательности клонированных областей позволило установить, что в непосредственной близости от гена nahR тоже располагается транспозон II класса (Рис. 1). Сравнение нуклеотидных последовательностей генов резолваз tnpR, примыкающих к га/г2-оперонам у плазмид pBS106 и NPL-1, показало, что оба транспозона не идентичны, но принадлежат к одному семейству транспозонов TnJ (Рис. 2).

Влияние транспозонов на экспрессию катаболических генов и структурную стабильность плазмид

Наличие транспозонов и IS-элементов в составе плазмид биодеградации не является редкостью. Установлено присутствие, по крайней мере, трех транспозонов класса II в составе TOL-плазмиды pWWO (Greated et al., 2002). Плазмида pWWO принадлежит к группе несовместимости Р-9; ее базовый репликон и репликон NPL-1 если не идентичны, то очень близки (Krasowiak et al., 2002). Было показано, что архетипическая плазмида NAH7 также содержит дефектный транспозон класса II, который может быть искусственно восстановлен (Tsuda and lino, 1990). Транспозоны наряду с плазмидами играют важную роль в горизонтальном переносе генов биодеградации внутри и между бактериальными популяциями.

Полученные в ходе настоящей работы данные свидетельствуют о том, что транспозоны и IS-элементы существенно влияют на генетический контроль процессов биодеградации нафталина. На примере NPL-1 показана возможная роль плазмидных перестроек, индуцированных транспозонами, в экспрессии катаболических оперонов. Инсерция транспозона в начало nah2-оперона приводит к утрате плазмидой регуляторного гена nahR и выключению гена nahG и остальных генов nah2-оперона, то есть генов, отвечающих зал/е/иа-путь расщепления катехола (Рис. 1). Известно, что xyl- и nah- гены могут контролировать также деградацию замещенных (метилированных и галогенированных) производных бензола и нафталина благодаря широкой субстратной специфичности кодируемых ферментов. Однако при расщеплении галогенированных катехолов по мета-пути в клетке накапливаются токсичные интермедиаты, приводящие в конце концов к гибели клетки (Reineke et al., 1982). При функционировании в клетке opmo-пути, токсичных интермедиатов не образуется. Отсюда можно сделать предположение о том, что переключение метаболического пути у штамма BS202 (NPL-1) однажды произошло именно по этой причине. При отсутствии селективного давления, направленного на инактивацию генов мета-пут, может наблюдаться очередное рекомбинационное событие, при котором в составе плазмиды полностью восстанавливаются гены nahR и nahG, происходит делеция tnpA и tnpR и идет переключение метаболизма на мета-пугь

расщепления катехола, что продемонстрировано на примере производных NPL-1 -pBS106 и pBS108. У плазмиды pBS106, кроме того, происходит делеция всего nahl-оперона. Сходный тип блокирования метаболических путей описан для штаммов Р. stutzeri 0X1 и Ml, утилизирующих метилированные бензолы (Bolognese et al., 1999).

Инверсия фрагмента ДНК у плазмиды NPL-41 приводит к изменению индуцибельной экспрессии лай-генов на конститутивную. Показано, что такое изменение характера экспрессии напрямую связано с возникновением у псевдомонад способности к деградации помимо нафталина более высокомолекулярных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), в частности фенантрена (Кошелева и др., 2000). Наиболее вероятным механизмом такого изменения экспрессии является формирование в ходе инверсии 4.2 т.п.н. фрагмента ДНК NahR-независимого конститутивного промотора у лай/-оперона. Это приводит к увеличению в клетке начальной концентрации нафталин диоксигеназы, ключевого фермента деградации ПАУ, и, соответственно, расширению спектра утилизируемых высокомолекулярных ПАУ и повышению адаптивных возможностей псевдомонад в условиях загрязнения окружающей среды этими соединениями. •

Анализ клонированных фрагментов ДНК плазмиды NPL-1 показал отсутствие в их составе каких-либо сигналов терминации транскрипции. У pBS106 транспозонные и /мЛ-гены кодируются разными цепями ДНК, а в случае NPL-1 - одной, и, скорее всего nahl-гены и гены транспозона у NPL-1 считываются как единый транскрипт (Рис. 1). Это подтверждается данными по стабильности плазмид NPL-1 и NPL-41 при росте на разных субстратах. Конститутивная экспрессия nah-генов у NPL-41 обеспечивает также постоянную экспрессию транспозазы, поэтому NPL-41 проявляет нестабильность при культивировании хозяйского штамма, как на богатой среде, так и на среде с индуктором nah-генов, салицилатом. Нестабильность NPL-1 напрямую связана с индукцией экспрессии na/i-генов, то есть проявляется только в присутствии в ростовой среде салицилата. Такое сопряжение экспрессии катаболических и транспозонных генов может обеспечивать быстрое распространение катаболических генов в микробных популяциях за счет увеличения частоты рекомбинационных событий как ответ на присутствие ПАУ в окружающей среде.

Рестрикционный анализ элементов базового репликона 1псР-9 плазмид

В 1991 году М.А Титок с соавторами клонировали минирепликон размером 8.5 т.п.н. из 1псР-9 плазмиды резистентности к стрептомицину рМЗ (Titok et al., 1991). На основании нуклеотидной последовательности репликона плазмиды рМЗ нами был разработан ряд олигонуклеотидных праймеров, специфичных для kor, par и гер-областей (Krasowiak et al., 2002).

Рестрикционный анализ амплифицированных ПЦР-фрагментов различных IncP-9 плазмид позволил их классифицировать по четырем подгруппам. Плазмиды устойчивости рМЗ и pMG18 принадлежат к a-подгруппе; плазмиды биодеградации капролактама pBS265, pBS267 и pBS268 - к у-подгруппе. Большинство проверенных плазмид биодеградации нафталина и TOL-плазмида pWWO изначально были отнесены к ß-подгруппе IncP-9, однако в ходе их дальнейшего изучения была выделена четвертая, 5-подгруппа, в которую входят, например, pBS216, pSNll и pOV17 (Рис. 3) Классический представитель IncP-9 группы, плазмида R2, может быть отнесена к отдельной подгруппе IncP-9s.

Рис. 3. Амплифицированные mpfAlFa-korA2Ra (дорожки 2-13) и когАЗРя-repSRc (дорожки 15-26) ДНК-фрагменты плазмид IncP -9а, IncP-9ß, IncP-9y и R2, обработанные Нае III (дорожки 2-5, 15-18), Нра\1 (дорожки 69, 19-22) и Rsal (дорожки 10-13, 23-26). Дорожки 1, 14, 27 - маркер GeneRuler 50 bp (Fermentas).

Клонирование минирепликонов IncP-7 и IncP-9 плазмид деградации нафталина

Ведущую роль в переносе биодеградативных генов внутри и между микробными популяциями играют плазмиды наряду с другими мобильными генетическими элементами. Не составляют исключения и плазмиды биодеградации нафталина бактерий рода Pseudomonas. Известно, что они относятся в большинстве случаев к группам несовместимости IncP-7 и IncP-9 (Кочетков и др., 1997). Поэтому объектами исследования в данной работе были выбраны плазмиды биодеградации нафталина pBS213 (IncP7) и pOV17 (IncP-98).

Минирепликоны плазмид pBS213 и pOV17 были получены лигированием 5аиЗА-фрагментов гшазмидной ДНК размером 5-8 т.п.н. с тетрациклиновой кассетой размером 1.4 т.п.н. из плазмиды p34S-Tc. (Dennis and Zylstra, 1998), обработанной Ват HI. Лигазной смесью трансформировали клетки бесплазмидных штаммов Р.

putida BS394 или Р. putida КТ2442. Для дальнейшей работы были отобраны два клона, содержащие минирепликоны pBS213mini и pOV17mini (Рис. 4).

SemHI

Л™\ Aval

Smal Sinal

Рис. 4. Физические карты плазмид pOV17mini и pBS213mini..

При сравнении рестрикционной карты pOV17mini с рестрикционной картой гшазмиды биодеградации нафталина pDTGl, которая также принадлежит к группе несовместимости IncP-98 (Dennis and Zylstra, 2004), было установлено, что в состав минирепликона pOV17mim входят наряду с ori-rep областью еще 5 открытых рамок считывания с неизвестными пока функциями и ген ruvBl (Рис. 5).

pOV17min¡

6100 bp

Рис. 5. Карта организации pOV17mini.

Структура минирепликона pOV17min¡ проверялась определением частичной нуклеотидной последовательности с использованием специфичных праймеров. Несмотря на отсутствие par- и kor- областей в составе минирепликона, наличие этих ОРС и ruvBl обеспечивает репликацию и поддержание минирепликона в клетках Р putida.

Рольрдг-генов в функционировании репликонов 1псР-7 и 1псР-9 в клетках Е. coli

Предположение о том, что для стабильного поддержания и репликации 1псР-9 репликона в клетках Е. coli требуется наличие функциональных par-генов, в дальнейшем нашло свое подтверждение в работе Севастьянович с соавторами (Sevastsyanovich et al., 2005). Ими, во-первых, было показано, что активность гер-промотора в клетках Р. pulida приблизительно в 30 раз сильнее, чем в Е. coli. Таким образом, в клетках Е. coli недостаточно Rep-белка для активации oriV, поскольку у IncP-9 плазмид DnaA связывается со своим участком узнавания только в присуствии Rep. Однако при наличии в клетках Е. coli действующего гена par В, репликон IncP-9 оказывался полностью функциональным при том, что нуклеотидная последовательность /-ер-промотора не претерпевала изменений. Предположительно, РагВ не связывается с orí У либо с rep- промотором, но влияет на активацию ориджина опосредованно, связываясь со своим сайтом, расположенным в районе раг-промотора. Две 16 п.н. палиндромные последовательности (5'-TTCTCGCATGCGG/AGAA-3'), обнаруженные там, сходны с консенсусом сайта узнавания РагВ. Связывание РагВ с этим участком вполне способно изменить конформацию суперскрученной штазмидной ДНК таким образом, что промоторный участок rep становится более доступным для РНК-полимеразного комплекса Е. coli. Впрочем, нельзя исключить и возможность того, что РагВ активирует экспрессию rep напрямую, подобно своему аналогу, VirB плазмиды вирулентности Shigella flexneri, хотя доказательств этому пока не найдено. Тем не менее, не подлежит сомнению тот факт, что на примере IncP-9 плазмид впервые показана зависимость процесса репликации от наличия функционирующих par-генов.

Минирепликон 1псР-7 плазмиды pBS213 был получен тем же способом, что и минирепликон плазмиды pOV17. Размер клонированного участка плазмидной ДНК составил около 5.4 т.п.н. (Рис. 4). Так же, как и pOV17mini, данный минирепликон мог существовать только в клетках Р. pulida, но не в клетках Е. coli. При помощи ПЦР-анализа было установлено, что в pBS213mini отсутствуют функционирующие par-гены, в состав данного минирепликона входит лишь частичная последовательность гена parW, при этом oriV-rep участок присутствует полностью. Шинтани с соавторами (Shintani et al., 2006) изучали возможность поддержания в клетках Е. coli 2.9 т.п.н. фрагмента 1псР-7 плазмиды pCARl, содержащего oriV-rep участок, но не par-гены, в условиях, когда дополнительная копия герА эффективно экспрессируется под lac промотором. Однако, в отличие от минирепликонов плазмид IncP-9 группы, увеличение количества RepA в клетках Е. coli не приводило к репликации минимального репликона pCARl. Тем не менее, проведенных исследований недостаточно для того, чтобы утверждать, что для репликации и поддержания плазмид 1псР-7 группы в клетках Е. coli, по аналогии с IncP-9

плазмидами, требуются функционирующие par-гены.

Структура ог/Кплазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости

ir-a

agcttttcag ttttaaaagc cttttaattg тттттстстт gttgttctct 50 ir-a'

tgtttttaga aggctggagc ccttgtgcca cggggcctcc agaggactat 10 0

cgactacaaa ttacggcatt gcgactacag attccggctt tgcgactatg 150 dr1 dr2 dr3

gattacggct gatgcgacta cagattccgg ctgtgacgac tacagattcc 20 0

ggccgttatc cacaggccag atgaaggccc tgggctgcgt ctaacgacta 250

cagattccgg ctgttgggtt gtgcacatag cacgattttg agtttttatg 30 0

dr6

gctcgatttc aagccatttt gtgctttgaa tttgccagac tggcctttgc 350

ctacggcaaa aactctgtaa ctccttgttt ttaaaggata tttatgttta 4 00

ttcgccgttt ctttgacgtt tctcgatgtt ttgccccaat cctgcgtgga 4 50

atcgccaata aatagtcttt cctgtcctca cctgagccta tcgactacag 500 ir-b dr7

attacggctg cgatagcagc catttgctcg atacgactac agattacggc 550

dr8

tatgcctgga cggcctttgc ccgtagcagt gccaccaaat tctttgctat 600 cgactacaga ttacggctgc ggatcgaagg tgccgcggac catcgactac g50

dr9 dr10

agattacggc tgttgtacgg ggtggacgga agcctatcga ctacaaatta 700

cggctgctat ctatcgacta cagattcatg cgatgccgag ccaagtgaac 750

dr12

aggcggtgat ctgcggggcc cgtggttact ggggtcgaga gattaaaaaa 80 0

ttcctgggta tcgactacag gggaaactct ctgtagggtt tcgttactaa 8 50 Рис. 6. Нуклеотидная последовательность or/K плазмид IncP-7 группы.

Методами ПЦР с последующим клонированием и секвенированием были определены нуклеотидные последовательности rep- и oriV-областей плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости. Для' IncP-7 плазмид характерна классическая итеронная

организация ориджина репликации, в которую входят 12 прямых (ОИ.) и 4 инвертированных повтора (Ш) длиной 19 и 12 нуклеотидов соответственно (Рис. 6).

ori Р-9а ori P-9ß ori P-&Y ori Р-98 Consensus

'gIttcacg---САТАСССЦ

.GICAAACG - ATCAGGGGA ICTffcATGAGTTGGAGTGGTgl

|tagt®

Iataa® IataaI 1атта|§

cacgactggccgccgccggcaggcgactttgagtacctaacagccaaggcaaacg agcaggggttaggagatcataagaa

ori P-9a ori P-9ß ori P-9y oriP-95 Consensus

oriP-9a ori P-9ß ori P-9y ori P-95 Consensus

ori P-9a ori P-9ß ori P-9y ori P-96 Consensus

ori P-9a ori P-9ß ori P-9y ori P-98 Consensus

Рис. 7. Множественное выравнивание нуклеотидной последовательности oriV области различных подгрупп IncP-9 плазмид.

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей ориджинов репликации плазмид a, ß, у и 5-подгрупп IncP-9 группы продемонстрировало их высокую гомологию между собой, хотя у плазмид 1псР-98 обнаруживается делеция в 26 пар оснований, затрагивающая один прямой и один инвертированный повтор. Организация oriV IncP-9 плазмид (Рис. 7) не носит ярко выраженного итеронного характера, тем не менее, для oriV IncP-9 характерно наличие всех структурных элементов ориджина (прямые и инвертированные повторы, АТ-богатый участок и сайт связывания DNA-A Box).

Филогенетический анализ RepA-белков IncP-7 и IncP-9 плазмид

На основании сравнения выведенной аминокислотной последовательности ЯерА-белков IncP-7 и IncP-9 плазмид с известными плазмидными и хромосомными RepA-белками были построены диаграммы, иллюстрирующие их филогенетические отношения (Рис.8 и 9).

83 90 100 110 120 130 140 150 164

CGAT^GGTAGCTCAT^pG^^C^CGTTATCTCTCAA|iTCCTGTGpGATAT^^PTC^CATA^pAGpTSGGGGTAAC^^pTGAAG

ggac||acttaccgag|^

CGGC||ACTTGCCGAC||^ CTA^PcA^gACCTCCGA^^«TGATC

CCAG^agatagaggc^^TJ^APTTACGGGGCTTCC^GGGCATT^CCTAG^^PAGP-ACA^PAG§GPACCTCAGT^^PCCTAG

CGACGAGTTGCCGACCCTTGTAATTCGCGGCTTCCAGGGCATTACCTCGCTCACA ATATGAGCGAACCTCAGATCATGATC

IR-A

165 170 180 190 200 210 220 230 246

ggg||gg------ia^^htagggi- - GACCTAACC - tag ct catg gataa^^^^^g^ga^^^^^tagat t g^bg

eAT^GCGACCAic^^eCGATciATGACCTACCCCTAGCTCATCATCTG^^^^pG^ - ^^^^ШССС - - T А^Нт САТШАСССАССА!^ - ^^^^^AG - - ТА^^ШТ

CATGAGCGACCATCGCTCACTATGTATGACCTACCCCTAGCTCAT АТС GTGAGCTAGGT TAGCTСACAG TATGAGCT

IR"A' DR1 ,R"B DR2 DR3

247 260 270 280 290 300 310 328

^^GGT^G ^T^ApGGATG А^^^Т^СССССТ^С^ТСС G^-GCAAGCCTGCA^CC ^CG^ATT^ ■ 1 '*

AC CCCCCCCA ATGAGCTACCCCTCGTTCATGC G.TGAGCGATATCGCACAA TTTTGGGAGATAACGTGCAA.GGA -' ' DR4 1 IR"B AT-rich

329 340 350 360 370 380 ,390 400 410

^GG^ApC CC^CTG^^TGCCTf j <3CCGG^G

TGCGCTACCCATCGCTCATCAGATGAGCTAGGGTATG CATGTCC ATGATCGATATCTAC CAAATTTGCACGATATCG

— RepAP-7

- pECB2, Pseudomonas »Icaligenes (CAA7178S)

-pPMA4326C, Pseudomonas syringae (AAT35203)

-pEA29, Erwinia amytovora (AAG31039)

-pi IT A426, CeohacU/us kaustophiius (BAD74245)

-pBM19, Bacillus meihanolicu* (NP_957662)

— pCMl, Chromohalobarter murismorfui (CAA60049)

- pROlöOO, Pseudomonasßuorescens (AAA98313) -PsycMrobacier cryokaloientis KS (ZP_00655047)

-Acinetoboaer tp. (AAW66499)

- pAB02, Acinetobacler baumunmi (AAROOS17)

- pVS43, Vibriosalmomcide (YP_2094>10)

-pHS129, Haemophilus somnus (AAU25832)

-pKMAI 467, A ctinobaciUus porcüonsiUarum (CAH25 838)

-p250, A vibactcrium pa rag all in arum (AAQ73621)

-рАВб, Neisseria meningitidis (AAD31794)

I00r pJR2, Pasieurellamutu>cUa (NPJ48I74) I pMVSCSI, MannkeMa vorigen* (CAC85833)

- pIGWZ12, Escherichia coii (ABC54843)

- pYC, Yersiniapestis (KP.053154)

- pSClOI, Escherichia coli (AAB59157)

Рис. 8. Филогенетическая диаграмма RepA IncP-7. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы Тгеесоп.

Рестрикционный анализ плазмид биодеградации ПАУ, относящихся к Р-7 группе несовместимости показал, что они обладают значительным структурным разнообразием по сравнению с 1псР-9 плазмидами (Измалкова et al., 2005), но, в отличие от последних, они не могут быть подразделены на подгруппы, в зависимости от организации их базового репликона, так как структура ori-rep участка IncP-7 плазмид отличается высокой консервативностью.

Как видно из филогенетического анализа аминокислотных последовательностей (Рис. 8), Rep-белок плазмид IncP-7 родственен многим плазмидным Rep-белкам псевдомонад, включая таковые у рЕСВ2 и pR01600. К этой же группе Rep-белков можно отнести Rep pSCIOl из Е. coli и Pir-белок R6K.

— pRRRI, ßorJriHla breaihifcptica (NP_976304)

— pQYY,Sphlagamaitas xeaophaga <AAW24018| ~ CluconobacUt axyians 62IH (YPJ90452)

- flKl-\,Glucaitücetob*cler europacus (CAAI 1421)

— ХаШкотмш сомрейт 85-1Я iYPJ36T5I3)

- рАМЮ.6, Pseudomonas flao'tsceiu (AAG23805) pSRD142, Sdtnomuaas ruminaatiam (ABA28219)

- pBMBfl, Bacillus Umringleitsis (AAV70919)

_IOOj

Bacillus crrtus L33L (YP_245944)

- füMYl. Bacillus mycoiJes (САВШ26)

-pIlOTL, Hlslophilus «w* (AAN52085)

- PHS649, Haemophilus tamnas (AAP44497)

--Incll pSERB2, Escherichia coli (ABB76657)

Рис. 9. Филогенетическая диаграмма RepA IncP-9. Относительные дистанции и конечный график построены при помощи программы Тгеесоп.

Следует отметить, что разнообразие Rep данной группы, включающей в себя в основном Rep-белки плазмид с узким кругом хозяев, значительно больше, чем собственно разнообразие хозяев какой-либо отдельно взятой плазмиды из этой группы. То есть, различные представители Rep данной группы адаптированы к существованию в небольшом количестве бактериальных хозяев.

Интересно, что Rep-белки IncP-9 плазмид попадают в одну филогенетическую группу с Яер-белком плазмиды pBBRl из Bordetella bronchiseptica, которая реплицируется по типу «катящегося кольца» (Рис. 9). И Rep IncP-9 (20 кДа), и Rep pBBRl (24 кДа) размерами немного меньше, чем другие известные плазмидные Rep-белки (30-40 кДа). Можно предположить, что Rep у плазмид IncP-9 группы произошел от Rep с функцией репликации по типу «катящегося кольца», который впоследствии потерял свою никирующую активность и включился в репликативный комплекс тета-типа.

После детального анализа нуклеотидных последовательностей ori-rep областей IncP-9 плазмид была построена диаграмма, иллюстрирующая генетические дистанции между IncP-9 плазмидами, принадлежащими к различным подгруппам (Рис. 10).

Рис. 10. Классификация IncP-9 плазмид по подгруппам на основании их ori-rep нуклеотидных последовательностей.

Организация «структурного скелета» 1псР-9 плазмид

Чтобы определить структурно-функциональные различия в организации различных плазмид Р-9 группы несовместимости, проводился сравнительный анализ известных к настоящему времени нуклеотидных последовательностей плазмид pWWO, pDTGl и NAH7. Тем самым была получена информация о 1) структурном «скелете» IncP-9 плазмид; 2) возможных уникальных участках каждой плазмиды; 3) гомологии и идентичности плазмидных генов и, 4) инсерциях соответствующих генов биодеградации. Структурный «скелет» IncP-9 плазмид занимает приблизительно 35 т.п.н. (37.4, 35.0 и 34.1 т.п.н. для pWWO, pDTGl и NAH7 соответственно) и включает в себя гены, ответственные за репликацию (oriV-rep), поддержание (par и res), конъюгативный перенос (tra-mpj), а также 10 т.п.н. вариабельный участок (Рис. 12). Участки rep/par и tra/mpf очень сходны у всех трех плазмид и показывают значительную гомологию как у ОРС, так и соотвествующих им белковых продуктов (70-98% идентичности для rep/par и 60-99% для tra/mpf). Различия касаются лишь наличия уникальной ОРС у pDTGl (orf25) и слабого сходства (32% идентичности) РагС белков pDTGl и NAH7 по отношению к ParC pWWO. Кластеры tra и mpf состоят из 6 и 16 ОРС соответственно. У pDTGl и NAH7 в этих областях дополнительно имеются по две гомологичных ОРС (orf692/orfl7 и orß08/orfl2), которые отсутствуют у pWWO. Участок между кластерами rep/par и tra/mpf является вариабельным, в нем встречаются ОРС с предсказанными функциями (например, ДНК-полимераза V, SSB-белок, регулятор транскрипции и т.д.), а также гены

биодеградации толуола и нафталина у рХУМО и р0Т01 соответственно. Если вычесть все специфические ОРС, то останется консервативный для всех трех плазмид 10.310.7 т.п.н. участок с уровнем идентичности предсказанных белковых продуктов от 32 до 98%. Такая консервативность в структурном «скелете» 1псР-9 плазмид несомненно важна для процессов рекомбинации между различными представителями плазмид данного семейства.

j 12 13 14 20 21 22 23 24 26 2729 30 31

Tol (Тп 4653. 71 kb)

pWWO

116.5 kb

NAH7

81.7 kb

< m < о

Nah (Tn 4655, 39 kb)

Рис. 11. Схематическое выравнивание плазмид pWWO, pDTGl и NAH7. Серые области соединяют гомологичные ОРС. Белые фигурные стрелки обозначают уникальные ОРС.

Для анализа потенциальных участков встраивания в 1псР-9 плазмиды генов биодеградации или резистентности проводилась ПЦР с праймерами, специфичными к участкам orß9A/607-orfl75/613 (pWWO/pDTGl) и ruvB-ruvA. У IncP-9ß плазмиды pWWO orfl9A и orfl75 фланкируют Тх\4б53, содержащий гены биодеградации толуола; эти рамки считывания эквиваленты ог/607 и orf613 плазмиды pDTGl. Гены биодеградации нафталина у IncP-9S плазмиды pDTGl находятся между ruvB и ruvA

(Рис. 12).

pWWO

1153 bp

Рис. 12. Схема локализации генов

биодеградации у pWWO и pDTGl.

mvB-F(2) - ruvA-R(2) 39A/607F- 175/613R

pDTGl

ПЦР-анализ ruvB-ruvA локуса IncP-9 плазмид показал, что этот участок остается интактным у всех подгрупп, кроме плазмид 8-подгруппы. В то же время, orß9A/607-orß75/6l3 локус нарушен инсерциями у pWWO, pBSl 191 (ß-подфуппа), рМЗ (а) и R2 (s). Большинство плазмид биодеградации нафталина, принадлежащих к IncP-9ß, сохраняют orß9A/607-orfl75/613 локус интактным и очень похожим на соответствующий локус плазмиды pWWO, как если бы он потерял Тп4653 (около 1.8 т.п.н.). Это указывает на то, что IncP-9ß плазмиды деградации нафталина могут быть структурно очень близки pWWO, и могут нести гены биодеградации как в том же локусе, что и pWWO (например, pBSl 191), так и в других участках структурного «скелета» IncP-9, но никогда в ruvB-ruvA локусе, как это бывает у IncP-9 плазмид 8-подгруппы. Это подтверждает и пример плазмиды NAH7, у которой деградативные гены расположены в третьем участке, между tra и mpf генами.

Экзогенная изоляция плазмид из почвенных образцов

Почва обладает огромным биодеградационным потенциалом за счет почвенных микроорганизмов, в том числе содержащих плазмиды деградации. Однако большая часть почвенных бактерий не поддается культивированию, что не позволяет полностью изучить и биодеградативные плазмиды, содержащиеся в некультивируемых микроорганизмах. Поэтому для изучения конъюгативных почвенных плазмид был использован такой подход, как экзогенная изоляция плазмид (Smalla et al., 2000). В качестве реципиентов для экзогенной изоляции из почвенных образцов Нижегородской области, загрязненных тормозной жидкостью ДОТ-4, использовались g^-меченые штаммы Р. putida КТ2442 и Pseudomonas sp. В13.

Несмотря на то, что ПЦР тотальной почвенной ДНК со специфичными к 1псР9 гер-области праймерами с последующей гибридизацией продуктов амплификации не позволили выявить присутствие IncP-9 плазмид в почве, методом экзогенной изоляции плазмид были получены трансконъюганты, содержащие плазмиды этой группы.

Из образцов почвы на селективной среде с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии были отобраны 12 трансконъюгантов КТ2442. Из всех трансконъюгантов была выделена плазмидная ДНК, ее рестрикционный анализ показал, что в трансконъюгантах содержатся плазмиды размером около 100 т.п.н., сходные с архетипической плазмидой биодеградации нафталина pDTGl и между собой по рестрикционному ScoRI-профилю (Рис. 13). ПЦР-анализ экзогенно изолированных плазмид с праймерами, специфичными для 1псР-9 репликона, позволил отнести их к IncP-9S подгруппе. Достаточно большое сходство этих плазмид оставляет открытым вопрос, переносились ли они в

реципиентный штамм независимо, или же являются различными вариантами одной

«предковой» плазмиды.

1 3 5 7 9 1 1

Рис. 13. FIGE пульс-форез плазмидной ДНК, обработанной ЕсоШ. Дорожки: 1, 13 - 2.5 т.п.н. ДНК маркер (Bio-Rad); 2-9 - экзогенно выделенные плазмиды деградации нафталина; 10-13 -плазмиды деградации нафталина из микроорганизмов, выделенных прямым высевом из образцов почвы.

V" IncP-95

IncP-9ß

Аналогичным образом были получены трансконъюганты КТ2442, содержащие плазмиды деградации нафталина, для модельных почвенных микрокосмов (Рис. 14).

Рис. 14. FIGE-электрофорез плазмидной ДНК, обработанной £coRI и блот-гибридизация с DIG-мечеными naliAc и naliG зондами. М - 2.5 т.п.н. ДНК маркер (BioRad).

Известно, что среди плазмид устойчивости к антибиотикам встречаются плазмиды Р-9 группы несовместимости, как например типическая 1псР-9 плазмида R2. Поэтому для исследования распространения в почве 1псР-9 плазмид с различными

детерминантами, с теми же почвенными образцами и реципиентами проводилась экзогенная изоляция плазмид устойчивости к антибиотикам.

Рис. 15. FIGE плазмидной ДНК, обработанной EcoRl. Дорожки:1, 11 - 2.5 kb ДНК маркер; 2-9 -экзогенно выделенные плазмиды устойчивости; 10 - плаз м и да R2.

Трансконъюганты, содержащие lncP-9 плазмиды устойчивости к тетрациклину и стрептомицину были получены только с реципиентом КТ2442. Плазмиды резистентности IncP-9 переносились в КТ2442 из почвенных образцов, загрязненных тормозной жидкостью, с достаточно высокой частотой (порядка 10"4).

Рестрикционный анализ плазмидной ДНК продемонстрировал большее различие между собой плазмид резистентности по сравнению с плазмидами биодеградации нафталина (Рис. 15). Для всех экзогенно выделенных плазмид устойчивости были получены ori-rep ПЦР-фрагменты 1псР-9 репликона. Для дальнейшей их классификации, амплифицированные par- и ког-гер фрагменты обрабатывались эндонуклеазой НаеIII. При сравнении рестрикционных профилей амплифицированных фрагментов было установлено, что они идентичны

Рис. 16. Электрофореграмма рестрикции Нае III

ампликонов раг- (2-16) и ког-гер (18-32) областей 1псР-9 плазмид. Дорожки: I, 17, 33 -50 Ьр ДНК маркер; 2, 18 - И2; 3-14, 19-30 - экзогенно выделенные плазмиды

устойчивости к тетрациклину и стрептомицину; 15-16, 31-32 - плазмиды деградации нафталина 1псР-9р.

Интересен тот факт, что до сих пор плазмида R2 занимала обособленное положение в классификации плазмид Р9 группы устойчивости, не имея иных аналогов (Рис. 10). В ходе данной работы методом экзогенной изоляции выделены, по меньшей мере, 12 плазмид резистентности к стрептомицину и тетрациклину, организация базового репликона которых идентична R2.

Распространение плазмид деградации и резистентности в почвенных образцах

В ходе данной работы из образцов почв, загрязненных устойчивыми органическими соединениями, такими, как дизельное топливо, нефтепродукты, тормозная жидкость и др., с частотой 10~5-10"7 были получены трансконъюганты, содержащие плазмиды биодеградации ПАУ Р-95 группы несовместимости, сходные по своей организации с плазмидами pDTG-1 и pBS216. Гены катаболизма ПАУ, в частности nahA, являются в некотором смысле индикаторными, поскольку их присутствие в почве увеличивается в ответ на загрязнение, даже в том случае, когда загрязнитель содержит малое количество ПАУ, или даже не содержит ПАУ совсем (Tuomi et al., 2004). Поэтому экзогенная изоляция плазмид биодеградации ПАУ из образцов почвы, загрязненной тормозной жидкостью, выглядит совершенно естественной. Любопытно, что при экзогенной изоляции абсолютное большинство выделенных плазмид составили плазмиды 8-подгруппы 1псР-9; это позволяет предположить, что они лидируют по скорости распространения в микробных популяциях.

Однако из тех же образцов загрязненной почвы с частотой Ю^-Ю"6 были экзогенно изолированы плазмиды, несущие детерминанты устойчивости к антибиотикам, в частности, к тетрациклину и стрептомицину. Химический состав тормозной жидкости является коммерческой тайной, однако известно, что она содержит борсодержащие полиэфиры, которые могут нарушать структуру мембраны клетки. Можно было предположить, что экспрессия гена tetA позволяет бактериальной клетке адаптироваться к высокой концентрации загрязнителя путем эффективной работы мембранного насоса, выводящего токсичные соединения из клетки. Тем не менее, сравнение ростовых параметров бесплазмидного штамма Р. putida КТ2442 и штамма КТ2442 с плазмидой устойчивости, на среде, содержащей тормозную жидкость (2-10 г/л), не выявило никаких различий между кривыми роста этих штаммов. Второе предположение об увеличении количества плазмид устойчивости в микрофлоре почв, загрязненных устойчивыми органическими соединениями, состоит в том, что в почве может увеличиваться пул актиномицетов, деградирующих загрязнитель, но при этом продуцирующих природные антибиотики. В таком случае, увеличение присутствия плазмид устойчивости в почвенной

микрофлоре является вторичным ответом на увеличение природной популяции актиномицетов. Тем не менее, впервые продемонстрировано, что неспецифическое загрязнение почвы химическими соединениями, не относящимися к антибиотикам, способно приводить к увеличению пула плазмид резистентности в микробных популяциях. Следует отметить, что гены биодеградации и резистентности с точки зрения их совместимости - в некотором роде антагонисты, поскольку до сих пор не обнаружено ни одной природной плазмиды, комбинирующей в себе эти свойства. Не исключено, что, по крайней мере, в отношении 1псР-9 плазмид это обусловлено тем, что вариабельная область плазмиды способна содержать только один транспозон, сохраняя при этом структурную стабильность плазмиды. Таким образом, риск загрязнения окружающей среды устойчивыми соединениями заключается еще и в сопутствующем распространении детерминант устойчивости к антибиотикам в микробных популяциях.

Тот факт, что плазмиды деградации не включают в свою структуру гены резистентности, является дополнительным аргументом в пользу безопасного применения в технологиях биоремедиации микробных штаммов, содержащих природные плазмиды биодеградации.

ВЫВОДЫ

1. Изучены генетические структуры базовых репликонов плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-9. Плазмиды группы несовместимости Р-9 делятся, по крайней мере, на пять подгрупп на основе структурной организации их базовых репликонов. Исследованные репликоны 1псР-7 плазмид обладают высококонсервативной организацией и не подразделяются на подгруппы.

2. Показано, что RepA белок 1псР-9 плазмид мог произойти от RepA белка плазмид, реплицирующихся по типу «катящегося кольца», который включился в репликативный комплекс тета-типа, утеряв при этом свою никирующую функцию.

3. На примере минирепликона плазмиды pOV17 впервые показано, что для репликации и стабильного поддержания [псР-9 репликона в клетках Е. coli требуется наличие функционирующих 1псР-9 раг-генов.

4. Катаболические и транспозонные гены могут находиться под общей регуляцией, как показано для 1псР-9 плазмиды NPL-1 и ее производных. Совместная экспрессия катаболических и транспозонных генов повышает структурную нестабильность плазмид, что может увеличивать распространение катаболических генов в микробных популяциях.

5. Увеличение популяции 1псР-9 плазмид резистентности к антибиотикам может вызываться не только присутствием антибиотиков в окружающей среде, но и

загрязнением почвы токсическими органическими соединениями.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

1. Sevastsyanovich Y.R., Krasowiak R., Bingle L.E.H., Haines A.S., Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Leuchuk AA., Titok M.A., Sraalla K., Thomas C.M.. Diversity of IncP-9 plasmids ofPseudomonas //Microbiology, 2008. V. 154. P. 2929-2941.

2. Izmalkova T.Yu., Mavrodi D.V., Sokolov S.L., Kosheleva I.A., Smalla K., Thomas C.M. and Boronin A.M. Molecular classification of IncP-9 naphthalene degradation plasmids// Plasmid, 2006. V. 56:1, P. 1-10.

3. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Микробиология, 2005. Т.74. №3, С. 342-348.

4. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Воронин A.M. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonasfluorescens // Микробиология, 2005. Т.74, jVU, С. 70-78.

5. Соколов С.Л., Кошелева И.А., Филонов А.Е., Воронин A.M.. Влияние транспозонов на экспрессию генов биодеградации нафталина у штамма Pseudomonas putida BS202 (NPL-1) и его производных // Микробиология, 2005 Т.74, № 1,С. 79-86.

6. Кошелева И.А., Измалкова Т.Ю., Соколов С.Л., Сазонова О.И., Воронин A.M. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полициклических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas putida II Генетика. 2003. Т.39, № 9. С.1185-1192.

7. Krasowiak R., Smalla К., Sokolov S., Kosheleva I., Titok M., Thomas C.M. PCR primers for detection and characterisation of IncP-9 plasmids // FEMS Microbiology Ecology. 2002. V.42. P. 217-225.

8. Кошелева И.А., Балашова H.B., Измалкова Т.Ю., Филонов А.Е., Соколов С.Л., Слепенькин А.В., Воронин A.M. Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина // Микробиология, 2000. Т.69, №6. С.783-789.

9. Соколов С.Л., Кошелева И.А., Мавроди О.В., Мавроди Д.В., Воронин A.M.. Структурная организация и экспрессия гена салицилат гидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS814 (pBS106) // Генетика, 1998, Т.34, №2, С.206-212.

Подписано в печать:

07.09.2010

Заказ № 4067 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколов, Сергей Львович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие свойства бактериальных плазмид.

1.1.1. Репликация.

1.1.2. Конъюгация.

1.1.3. Мобилизация.

1.1.4. Интеграция и стабильность поддержания.

1.1.5. Несовместимость плазмид.

1.2. Классификация плазмид по группам несовместимости.

1.3. Плазмиды бактерий рода Pseudomonas.

1.4. Репликация и поддержание плазмид Pseudomonas.

1.5. Плазмиды биодеградации Pseudomonas.

1.6. Плазмиды деградации нафталина и толуола.

1.7. Биохимические пути и генетический контроль биодеградации нафталина.

1.8. Биохимические пути и генетический контроль биодеградации толуола.

1.9. Катаболические транспозоны псевдомонад.

1.10. Роль мобильных генетических элементов в адаптации микроорганизмов к ксенобиотикам.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Питательные среды и условия роста.

2.3. Выделение бактериальных штаммов из почвенных образцов.

2.4. Выделение ДНК из почвы.

2.5. Выделение тотальной ДНК бактерий.

2.6. Выделение плазмидной ДНК.

2.7. Конъюгационный перенос плазмид.

2.8. Полимеразная цепная реакция.

2.9. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.;.

2.10. Электрофорез в агарозном геле.

2.11. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.12 Мечение ДНК методом рассеянной затравки.

2.13. ДНК-ДНК гибридизация.

2.14. Лигирование ДНК.

2.15. Приготовление компетентных клеток E.coli.

2.16 Трансформация клеток Е.coli плазмидной ДНК.

2.17. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Стабильность плазмид NPL-1 hNPL-41 в штаммах P. putida при длительном культивировании.

3.2. Рестрикционный и гибридизационный анализ NPL-1 и ее производных

3.3. Клонирование иа/г-областей и>прилегающих к ним участков плазмид NPL-1 и pBS106.

3.4. Рестрикционный анализ элементов базового репликона 1псР-9 плазмид

3.5. Клонирование минирепликонов 1псР-7 и 1псР-9 плазмид деградации нафталина.

3.6. Физическое картирование минирепликонов pBS213mini и pOV17mini.

3.7. Структура oriVплазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости.

3.8. Филогенетический анализ RepA-белков 1псР-7 и 1псР-9 плазмид.

3.9. Экзогенная изоляция плазмид из почвенных образцов.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Влияние транспозонов на экспрессию катаболических генов и структурную стабильность плазмид.

4.2. Анализ G+C-состава базовых репликонов плазмид бактерий рода

Pseudomonas.

4.3. Филогения Яер-белков 1псР-7 и 1псР-9.

4.4. Роль par-генов в функционировании репликонов 1псР-7 и 1псР-9 в клетках Е. coli.

4.5. Организация «структурного скелета» 1псР-9 плазмид.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Организация плазмидных репликонов групп несовместимости P-7 и P-9"

Актуальность проблемы

Изучение геномов микроорганизмов, в частности псевдомонад, касается не только хромосомной ДНК наиболее типичных видовых представителей, но также и разностороннего исследования мобильных генетических элементов, встречающихся у данных бактерий. Плазмиды -наиболее типичные представители мобильных генетических элементов, поскольку они реплицируются отдельно от хромосомы хозяина и встречаются у довольно широкого круга микроорганизмов, занимающих различные экологические ниши [160]. Многие плазмиды несут важные для клеток-хозяев детерминанты, такие как способность утилизировать устойчивые органические соединения, резистентность к антибиотикам или иным токсичным веществам, факторы патогенности и т.д. [151]. Но при этом некоторые гены, обнаруженные на хромосомах бактерий, могут также находиться и в составе плазмид, следовательно, генетические характеристики плазмид не являются неизменными и исключительными. Кроме того, генетические характеристики плазмид обычно не связаны с нормальными условиями окружающей среды, но чаще — с теми изменениями в окружающей среде, с которыми микроорганизмы могут столкнуться. Катаболические гены, ассоциированные с плазмидами, обычно существуют в самодостаточном виде, например, в виде единого оперона, или в составе транспозона, что дает им возможность экспрессироваться в широком круге бактериальных хозяев.

Плазмиды, по определению - автономные структуры, содержащие собственные системы репликации и стабильного поддержания, делающие их в известной степени независимыми от бактериального хозяина. Для каждой плазмиды характерен свой круг хозяев, в котором выполняются эти условия. Однако бывают ситуации, когда круг хозяев, в который возможен перенос плазмиды, и ее реальный круг хозяев, в котором функционируют системы репликации и поддержания плазмиды,, не совпадают. Тогда плазмида, попадая в бактериальную клетку, в которой/ невозможна ее автономная репликация, способна, сохранить свое существование, только? интегрировавшись в хозяйскую; хромосому, действуя, таким образом; как природный суицидный; вектор; Анализ имеющихся на сегодняшний; день бактериальных хромосомных последовательностей: ДНК показывает, что интеграция и эксцизия плазмид из бактериальной хромосомы - довольно частое событие [37]!

Детальный генетический анализ как вновь выделенных, так и уже описанных плазмид предоставит ценные сведения о; роли плазмид в адаптации бактерий,' о микроэволюции плазмид и их мозаичном строении; о значении рекомбинации; коинтеграции и; инсерции мобильных элементов (интегроны, транспозоны и IS-элементы) в генетическом разнообразии плазмид и их хозяев.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы являлось изучение организации; плазмидных репликонов групп несовместимости Р-7 и Р-9 на примере плазмид биодеградации ПАУ и R-плазмидбактерий родаPseudomonas.

В соответствии с целью, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать минирепликоны плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости и изучить их структурную организацию;

2. Провести филогенетические исследования структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (oriV, rep- и par-генов);

3. Исследовать влияние плазмидных транспозонов и IS-элементов на стабильность плазмид и функционирование деградативных генов.

Научная новизна

В ходе работы впервые получены минимальные репликоны плазмид групп несовместимости Р-7 и Р-98, проведен филогенетический анализ структурных элементов базовых репликонов плазмид Р-7 и Р-9 групп несовместимости (oriV, rep- и par-генов), показана необходимость участия par-генов в процессах репликации и поддержания 1псР-95 плазмид в клетках Е. coli. Получена информация о «структурном скелете» плазмид биодеградации группы несовместимости Р-9, определены вариабельные участки у плазмид различных подгрупп 1псР-9.

Практическая значимость работы

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: EERO Workshop "Enzymatic and Genetic Aspects of Environmental Biotechnology", Пущино, 1995; II Открытая городская научная конференция молодых ученых города Пущино, 1997; International Symposium on Plasmid Biology, Merida, Mexico, 1998; Pseudomonas Congress, Brussels, Belgium, 2001; 3d symposium on "Mobile genetic elements" contribution to bacterial adaptability and diversity" (MECBAD), Berlin, Germany, 2001; 12th International Biodeterioration&Biodegradation Symposium (Biosorption and Bioremediation III) Prague, Czech Republic, 2002; III Пущинская школа-семинар по экологии «Экология 2004: Эстафета поколений», Пущино; "Plasmid Biology 2004" Conference, Corfu, Greece; 13th International Biodegradation&Biodeterioration Symposium, Madrid, Spain, 2005; International Conference on Environmental Biotechnology ISEB ESEB JSEB 2006, Leipzig, Germany; 4th European Bioremediation Conference, Crete, Greece, 2008.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 40 работ, из них 9 статей и 31 материал конференций. Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Соколов, Сергей Львович

ВЫВОДЫ

2. Показано, что RepA белок IncP-9 плазмид мог произойти от RepA белка плазмид, реплицирующихся по типу «катящегося кольца», который включился в репликативный комплекс тета-типа, утеряв при этом свою никирующую функцию.

3. На примере минирепликона плазмиды pOV17 впервые показано, что для репликации и стабильного поддержания IncP-9 репликона в клетках Е. coli требуется наличие функционирующих IncP-9 раг-генов.

4. Катаболические и транспозонные гены могут находиться под общей регуляцией, как показано для IncP-9 плазмиды NPL-1 и ее производных. Совместная экспрессия катаболических и транспозонных генов повышает структурную нестабильность плазмид, что может увеличивать распространение катаболических генов в микробных популяциях.

5. Увеличение популяции IncP-9 плазмид резистентности к антибиотикам может вызываться не только присутствием антибиотиков в окружающей среде, но и загрязнением почвы токсическими органическими соединениями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколов, Сергей Львович, Москва

1. A.M. Воронин, А.Н. Борисоглебская, И.И. Старовойтов / Мутанты плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина // Докл. АН СССР. 1977. - 235: 2. - С. 494-503.

2. A.M. Воронин, А.Е. Филонов, В.В, Балакшина, А.Н. Кулакова / Стабильность плазмид биодеградации нафталина NPL-1 и NPL-41 в популяциях Pseudomonas putida в условиях непрерывного культивирования//Микробиология. 1985. - 54: 4. - С. 610-615.

3. Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова, С.Л. Соколов, И.А. Кошелева, A.M. Воронин / Плазмиды биодеградации нафталина и салицилата Р-7 группы несовместимости в штаммах флуоресцирующих псевдомонад // Микробиология. 2005. - 74: 3. - С. 342-348.

4. Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова, С.Л. Соколов, И.А. Кошелева, A.M. Воронин / Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens // Микробиология. 2005. - 74: 1. - С. 70-78.

5. В.В. Кочетков, В.В. Балакшина, Е.А. Мордухова, A.M. Воронин / Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas // Микробиология. 1997. - 66: 2. - С. 211-216

6. В.В. Кочетков, Воронин, A.M. / Сравнительное изучение плазмид, контролирующих биодеградацию нафталина культурой Pseudomonas // Микробиология. 1984. - 53: - С. 639-644

7. И.А. Кошелева, Н.В. Балашова, Т.Ю. Измалкова, А.Е. Филонов, С.Л. Соколов, А.В. Слепенькин, A.M. Воронин / Деградация фенантрена мутантными штаммами-деструкторами нафталина // Микробиология. -2000. 69: 6. - С. 783-789

8. И.А. Кошелева, C.JI. Соколов, Н.В. Балашова, А.Е. Филонов, Е.И. Мелешко, P.P. Гаязов, A.M. Воронин / Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом Pseudomonas sp. 8909N // Генетика. -1997.-33:6.-С. 762-768

9. И.А. Кошелева, Т.В. Цой, А.Н. Кулакова, A.M. Воронин / СравнительныйIанализ организации плазмиды NPL-1, контролирующей окисление нафталина клетками Pseudomonas putida и ее производных // Генетика. -1986.-22: 10.-С. 2389-2397.

10. А.Н. Кулакова, A.M. Воронин / Мутанты плазмид биодеградации нафталина, детерминирующие окисление катехола по мета-пути // Микробиология. 1989. - 58: 2. - С. 298-304

11. Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук / Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - 480 с.

12. В.Н. Рыбчин / Основы генетической инженерии 2-е изд. - СПб: Издательство СПбГТУ, 1999. - 522 с.

13. C.JI. Соколов, И.А. Кошелева, О.В. Мавроди, Д.В. Мавроди, A.M. Воронин / Структурная организация и экспрессия гена салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS814 (pBS106) // Генетика. 1998. - 34: 2. - С. 206-212.

14. C.JI. Соколов, И.А. Кошелева, А.Е. Филонов, A.M. Воронин / Влияние транспозонов на экспрессию генов биодеградации нафталина у штамма Pseudomonas putida BS202 (NPL-1) и его производных // Микробиология. -2005.-74: 1.-С. 79-86.

15. К.Е. Abremski, R.H. Hoess / Evidence for a second conserved arginine residue in the integrase family of recombination proteins // Protein Eng. 1992. - 5:1. -C. 87-91.

16. H. Allmeier, В. Cresnar, М. Greek, R. Schmitt / Complete nucleotide sequence of Tnl721: gene organization and a novel gene product with features of a chemotaxis protein // Gene. 1992. - 111: 1. - С. 11-20.

17. U. Altenschmidt, C. Eckerskorn, G. Fuchs / Evidence that enzymes of a novel aerobic 2-amino-benzoate metabolism in denitrifying Pseudomonas are coded on a small plasmid // Eur J Biochem. 1990. - 194: 2. - C. 647-653.

18. T. Aoki, S. Egusa, Y. Ogata, T. Watanabe / Detection of resistance factors in fish pathogen Aeromonas liquefaciens // J Gen Microbiol. 1971. - 65: 3. - C. 343-349.

19. S.J. Assinder, P.A. Williams / The TOL plasmids: determinants of the catabolism of toluene and the xylenes // Adv Microb Physiol. 1990. - 31: - C. 1-69.

20. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, K. Struhl / Short protocols in molecular biology Wiley New York, 1999.

21. M.I. Bahl, L.H. Hansen, S.J. Sorensen / Impact of conjugal transfer on the stability of IncP-1 plasmid pKJK5 in bacterial populations // FEMS Microbiol Lett. 2007. - 266: 2. - C. 250-256.

22. M.J. Bale, J.C. Fry, M.J. Day / Plasmid transfer between strains of Pseudomonas aeruginosa on membrane filters attached to river stones // J Gen Microbiol. 1987. - 133: 11. - C. 3099-3107.

23. S. Beil, K.N. Timmis, D.H. Pieper / Genetic and biochemical analyses of the tec operon suggest a route for evolution of chlorobenzene degradation genes // J Bacteriol. 1999. - 181: 1. - C. 341-346.

24. C.L. Bender, D.K. Malvick, R.E. Mitchell / Plasmid-mediated production of the phytotoxin coronatine in Pseudomonas syringae pv. tomato // J Bacteriol. -1989.- 171:2.-C. 807-812.

25. D.E. Berg, Howe, M.M. / Mobile DNA Washington: American Society for Microbiology, 1989.

26. F. Bolognese, C. di Lecce, E. Galli, P. Barbieri / Activation and inactivation of Pseudomonas stutzeri methylbenzene catabolism pathways mediated by a transposable element // Applied and Environmental Microbiology. 1999. - 65: 5.-C. 1876-1882.

27. A.M. Boronin / Diversity of Pseudomonas plasmids: to what extent? // FEMS Microbiol Lett. 1992. - 79: 1-3. - C. 461-467.

28. A.M. Boronin, R.P. Naumova, V.G. Grishchenkov, O.N. Ilijinskaya / Plasmids specifying epsilon-caprolactam degradation in Pseudomonas strains // FEMS Microbiology Letters. 1984. - 22: 3. - C. 167-170.

29. L.E. Bryan, S.D. Semaka, H.M, Van den Elzen, J.E. Kinnear, R.L. Whitehouse / Characteristics of R931 and other Pseudomonas aeruginosa R factors // Antimicrob Agents Chemother. 1973. - 3: 5. - C. 625-637.

30. L.E. Bryan, M.S. Shahrabadi, H.M. van den Elzen / Gentamicin resistance in Pseudomonas aeruginosa: R-factor-mediated resistance // Antimicrob Agents Chemother. 1974. - 6: 2. - C. 191-199.

31. C.E. Cerniglia / Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons // Biodegradation. 1992. - 3: 2. - C. 351-368.

32. A.M. Chakrabarty / Dissociation of a degradative plasmid aggregate in Pseudomonas // J Bacteriol. 1974. - 118: 3. - C. 815-820.

33. С. Charnock / Characterization of the cryptic plasmids of the Pseudomonas alcaligenes type strain // Plasmid. 1997. - 37: 3. - C. 189-198.

34. C.M. Chiu, C.M. Thomas / Evidence for past integration of IncP-1 plasmids into bacterial chromosomes // FEMS Microbiology Letters. 2004. - 241: 2. -C. 163-169.

35. A.M. Clennel, B. Johnston, D.E. Rawlings / Structure and function of Tn5467, a Tn21-like transposon located on the Thiobacillus ferrooxidans broad-host-range plasmid pTF-FC2 // Appl Environ Microbiol. 1995. - 61: 12. - C. 42234229.

36. C. Dahlberg, M. Hermansson / Abundance of Tn3, Tn21, and Tn501 transposase (tnpA) sequences in bacterial community DNA from marine environments // Appl Environ Microbiol. 1995. - 61: 8. - C. 3051-3056.

37. N. Datta, R.W. Hedges / Compatibility groups among fi R factors // Nature. -1971. - 234: 5326. - C. 222-223.

38. Y.V. de Peer, R. De Wachter / TREECON: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees // Bioinformatics. 1993. - 9: 2. - C. 177.

39. G. del Solar, R. Giraldo, M.J. Ruiz-Echevarria, M. Espinosa, R. Diaz-Orejas / Replication and control of circular bacterial plasmids // Microbiol Mol Biol Rev. 1998. - 62: 2. - C. 434-464.

40. J.J. Dennis, G.J. Zylstra / Complete sequence and genetic organization of pDTGl, the 83 kilobase naphthalene degradation plasmid from Pseudomonas putida strainNCIB 9816-4 // J Mol Biol. 2004. - 341: 3. - C. 753-768.

41. J J. Dennis, G.J. Zylstra / Plasposons: modular self-cloning minitransposon derivatives for rapid genetic analysis of gram-negative bacterial genomes 11 Applied and Environmental Microbiology. 1998. - 64: 7. - C. 2710-2715.

42. P.E. Dombek, t.A.K. Johnson, S.T. Zimmerley, M.J. Sadowsky / Use of repetitive DNA sequences and the PCR to differentiate Escherichia coli isolates from; human and animal sources // Applied and Environmental Microbiology. 2000. - 66: 6. - C. 2572.

43. W.A. Duetz, G. de Jong, P.A. Williams, J.G. van Andel / Competition in chemostat culture between Pseudomonas strains that use different pathways for the degradation of toluene // Appl Environ Microbiol. 1994. - 60: 8; - C. 2858-2863.

44. M. Espinosa, S. Cohen, M. Couturier, G. Del Solar, R. Diaz-Orejas, R. Giraldo, L. Janniere, C. Miller, M. Osborn, C.M. Thomas / Plasmid replication and copy number control // The Horizontal Gene Pool. 2000. - - C. 1-47.

45. C.G.T. Evans, D. Herbert, D.W. Tempest / The continuous cultivation of microorganisms // Methods in microbiology. 1970. - - C. 277-327.

46. K.P. Fong, C.B. Goh, H.M. Tan / Characterization and expression of the plasmid-borne bedD gene from Pseudomonas putida ML2, which codes for a

47. NAD+-dependent cis-benzene dihydrodiol dehydrogenase // J Bacteriol. 1996.- 178: 19.-C. 5592-5601.

48. K.P.Y. Fong, C.B.H. Goh, H.M. Tan / The genes for benzene catabolism in Pseudomonas putida ML2 are flanked by two copies of the insertion element IS 1489, forming a class-I-type catabolic transposon, Tn5542 // Plasmid. 2000.- 43:2.-C. 103-110.

49. M. Fujita, M. Kubota, M. Futai, A. Amemura h Identification and DNA sequencing of a new plasmid (pPSTl) in Pseudomonas stutzeri MO-19 // Plasmid. 1989. - 22: 3. - C. 271-274.

50. F. Fukumori, C.P. Saint / Nucleotide sequences and regulational analysis of genes involved in conversion of aniline to catechol in Pseudomonas putida UCC22 (pTDNl) // J Bacteriol. 1997. - 179: 2. - C. 399-408.

51. P. Gamas, M.G. Chandler, P. Prentki, D.J. Galas / Escherichia coli integration host factor binds specifically to the ends of the insertion sequence IS1 and to its major insertion hot-spot in pBR322 // J Mol Biol. 1987. - 195: 2. - C. 261272.

52. M.N. Gardner, S.M. Deane, D.E. Rawlings / Isolation of a new broad-host-range IncQ-like plasmid, pTC-F14, from the acidophilic bacterium Acidithiobacillus caldus and analysis of the plasmid replicon // J Bacteriol. -2001.- 183: 11.-C. 3303-3309.

53. M.J. Gibbon, A. Sesma, A. Canal, J.R. Wood, E. Hidalgo, J. Brown, A. Vivian, J. Murillo / Replication regions from plant-pathogenic Pseudomonas syringae plasmids are similar to ColE2-related replicons // Microbiology. 1999. - 145 (Pt 2): - C. 325-334.

54. A. Greated, L. Lambertsen, P.A. Williams, C.M. Thomas / Complete sequence of the IncP-9 TOL plasmid pWWO from Pseudomonas putida // Environ Microbiol. 2002. - 4: 12. - C. 856-871.

55. A. Greated, M. Titok, R. Krasowiak, R.J. Fairclough, C.M. Thomas / The replication and stable-inheritance functions of IncP-9 plasmid рМЗ // Microbiology. 2000. - 146 ( Pt 9): - C. 2249-2258.

56. N.D. Grindley, R.R. Reed / Transpositional recombination in prokaryotes // Annu Rev Biochem. 1985. - 54: - C. 863-896.

57. J. Grinsted, F. de la Cruz, R. Schmitt / The Tn21 subgroup of bacterial transposable elements // Plasmid. 1990. - 24: 3. - C. 163-189.

58. M.E. Gstalder, M. Faelen, N. Mine, E.M. Top, M. Mergeay, M. Couturier / Replication functions of new broad host range plasmids isolated from polluted soils // Res Microbiol. 2003. - 154: 7. - C. 499-509.

59. A.S. Haines, K. Jones, S.M. Batt, I.A. Kosheleva, C.M. Thomas / Sequence of plasmid pBS228 and reconstruction of the IncP-1 alpha phylogeny // Plasmid. -2007.-58-.1.-C. 76-83.

60. A.S. Haines, K. Jones, M. Cheung, C.M. Thomas / The IncP-6 plasmid Rmsl49 consists of a small mobilizable backbone with multiple large insertions // J Bacteriol. 2005. - 187: 14. - C. 4728-4738.

61. B. Hallet, D.J. Sherratt / Transposition and site-specific recombination: adapting DNA cut-and-paste mechanisms to a variety of genetic rearrangements // FEMS Microbiol Rev. 1997. - 21: 2. - C. 157-178.

62. R.W. Hedges, G.A. Jacoby / Compatibility and, molecular properties of plasmid Rms 149 in Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli // Plasmid. -1980.-3: l.-C. 1-6.

63. K.E. Hill, E.M. Top / Gene transfer in soil systems using microcosms // FEMS Microbiology Ecology. 1998. - 25: 4. - C. 319-329.

64. R. Holtwick, A. von Wallbrunn, H. Keweloh, F. Meinhardt / A novel rolling-circle-replicating plasmid from Pseudomonas putida P8: molecular characterization and use as vector // Microbiology. 2001. - 147: 2. - C. 337344.

65. R. Horak, M. Kivisaar / Expression of the transposase gene tnpA of Tn4652 is positively affected by integration host factor // J Bacteriol. 1998. - 180: 11. -C. 2822-2829.

66. L. Ingram, R.B. Sykes, J. Grinsted, J.R. Saunders, M.H. Richmond / A transmissible resistance element from a strain of Pseudomonas aeruginosa containing no detectable extrachromosomal DNA // J Gen Microbiol. 1972. -72: 2. - C. 269-279.

67. Y. Itoh, J.M. Watson, D. Haas, T. Leisinger / Genetic and molecular characterization of the Pseudomonas plasmid pVSl // Plasmid. 1984. - 11: 3. - C. 206-220.

68. T.Y. Izmalkova, D.V. Mavrodi, S.L. Sokolov, I.A. Kosheleva, K. Smalla, C.M. Thomas, A.M. Boronin / Molecular classification of IncP-9 naphthalene degradation plasmids // Plasmid. 2006. - 56: 1. - C. 1-10.

69. G.A. Jacoby / Properties of R plasmids determining gentamicin resistance by acetylation in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob Agents Chemother. -1974. -6:3.- C. 239-252.

70. G.A. Jacoby / Resistance plasmids of Pseudomonas // J.R. Sokatch The Bacteria New York: Academic Press, 1986. - C. 265-293.

71. G.A. Jacoby, L. Sutton, L. Knobel, P. Mammen / Properties of IncP-2 plasmids of Pseudomonas spp // Antimicrob Agents Chemother. 1983. - 24: 2. - C. 168-175.

72. G.A. Jacoby, R. Weiss, T.R. Korfhagen, V. Krishnapillai, A.E. Jacob, R.W. Hedges / An explanation for the apparent host specificity of Pseudomonas plasmid R91 expression // J Bacterid. 1978. - 136: 3. - С. 1159-1164.

73. V. Jencova, H. Strnad, Z. Chodora, P. Ulbrich, W.J. Hickey, V. Paces / Chlorocatechol catabolic enzymes from Achromobacter xylosoxidans A8 // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2004. - 54: - C. 175-181.

74. C. Kehrenberg, S. Schwarz / Plasmid-borne florfenicol resistance in Pasteurella multocida //J Antimicrob Chemother. 2005. - 55: 5. - C. 773-775.

75. H. Kiyohara, K. Nagao, K. Yana / Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, solid hydrocarbons on agar plates // Applied and Environmental Microbiology. 1982. - 43: 2. - C. 454.

76. R. Krasowiak, K. Smalla, S. Sokolov, I. Kosheleva, Y. Sevastyanovich, M. Titok, C.M. Thomas / PCR primers for detection and characterisation of IncP-9 plasmids // FEMS Microbiology Ecology. 2002. - 42: 2. - C. 217-225.

77. S.M. Kwong, C.C. Yeo, A. Suwanto, C.L. Poh / Characterization of the endogenous plasmid from Pseudomonas alcaligenes NCIB 9867: DNA sequence and mechanism of transfer// J Bacteriol. 2000. - 182: 1. - C. 81-90.

78. P.R. Lehrbach, I. McGregor, J.M. Ward, P. Broda / Molecular relationships between pseudomonas INC P-9 degradative plasmids TOL, NAH, and SAL // Plasmid. 1983. - 10: 2. - C. 164-174.

79. T. Leisinger / Microorganisms and xenobiotic compounds // Experientia. -1983.-39: 11.-C. 1183-1191.

80. W. Li, J. Shi, X. Wang, Y. Han, W. Tong, L. Ma, B. Liu, B. Cai / Complete nucleotide sequence and organization' of the naphthalene catabolic plasmid pND6-l from Pseudomonas sp. strain ND6 // Gene, r 2004. 336: 2. - C. 231240.

81. A.K. Lilley, M.J. Bailey, M.J. Day, J.C. Fry / Diversity of mercury resistance plasmids obtained by exogenous isolation from the bacteria of sugar beet in three successive years // FEMS Microbiology Ecology. 1996. - 20: 4.

82. S. Liu, J.M. Suflita / Ecology and evolution of microbial populations for bioremediation // Trends Biotechnol. 1993. - 11: 8. - C. 344-352.

83. C. Llanes, P. Gabant, M. Couturier, Y. Michel-Briand / Cloning and characterization of the Inc А/С plasmid RA1 replicon,// J Bacteriol. 1994. 176: 11.-C. 3403-3407.

84. K.J. Malachowsky, T.J. Phelps, A.B. Teboli, D.E. Minnikin, D.C. White / Aerobic Mineralization of Trichloroethylene, Vinyl Chloride, and Aromatic Compounds by Rhodococcus Species // Appl Environ Microbiol. 1994. - 60: 2. - C. 542-548.

85. M.V. Marques, A.M. da Silva, S.L. Gomes / Genetic organization of plasmid pXF51 from the plant pathogen Xylella fastidiosa // Plasmid. 2001. - 45: 3. -C. 184-199.

86. В. Martinez, J. Tomkins, L.P. Wackett, R. Wing, M.J. Sadowsky / Complete nucleotide sequence and organization of the atrazine catabolic plasmid pADP-1 from Pseudomonas sp. strain ADP // J Bacteriol. 2001. - 183: 19. - C. 56845697.

87. C. McGowan, R. Fulthorpe, A. Wright, J.M. Tiedje / Evidence for interspecies gene transfer in the evolution of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degraders // Appl Environ Microbiol. 1998. - 64: 10. - C. 4089-4092.

88. K. Mizuuchi / Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of mu and other elements // Annu Rev Biochem. 1992. - 61: - C. 1011-1051.

89. R.J. Moore, V. Krishnapillai / Tn7 and Tn501 Insertions into Pseudomonas aeruginosa plasmid R91-5: mapping of two transfer regions // J Bacteriol. -1982.- 149: l.-C. 276-283.

90. T.A. Muller, C. Werlen, J. Spain, J.R. Van Der Meer / Evolution of a chlorobenzene degradative pathway among bacteria in a contaminated groundwater mediated by a genomic island in Ralstonia // Environ Microbiol. -2003. 5: 3. - C. 163-173.

91. C. Nakatsu, J. Ng, R. Singh, N. Straus, C. Wyndham / Chlorobenzoate catabolic transposon Tn5271 is a composite class I element with flanking class II insertion sequences // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1991.- 88: 19. C. 8312.

92. A. Nishi, К. Tominaga, К. Furukawa / A 90-kilobase conjugative chromosomal element coding for biphenyl and salicylate catabolism in Pseudomonas putida KF715 // J Bacteriol. 2000. - 182: 7. - C. 1949-1955.

93. R.P. Novick / Plasmid incompatibility // Microbiol Rev. 1987. - 51: 4. - C. 381-395.

94. R.P. Novick, M. Schwesinger / Indepencence of plasmid incompatibility and replication control functions in Staphylococcus aureus // Nature. 1976. - 262: 5569. - C. 623-626.

95. R.H. Olsen, G. DeBusscher, W.R. McCombie / Development of broad-host-range vectors and gene banks: self-cloning of the Pseudomonas aeruginosa РАО chromosome // J Bacteriol. 1982. - 150: 1. - C. 60-69.

96. R.H. Olsen, J J. Kukor, B. Kaphammer / A novel toluene-3-monooxygenase pathway cloned from Pseudomonas pickettii PKOl // J Bacteriol. 1994. - 176: 12.-C. 3749-3756.

97. S.R. Partridge, C.M. Collis, R.M. Hall / Class 1 integron containing a new gene cassette, aadAlO, associated with Tnl404 from R151 // Antimicrob Agents Chemother. 2002. - 46: 8. - C. 2400-2408.

98. J.M. Pemberton, AJ. Clark / Detection and characterization of plasmids in Pseudomonas aeruginosa strain РАО // J Bacteriol. 1973. - 114: 1. - C. 424433.

99. M. Peters, E. Jogi, I. Suitso, T. Punnisk, A. Nurk / Features of the replicon of plasmid pAMlO.6 of Pseudomonas fluorescens // Plasmid. 2001. - 46: 1. - C. 25-36.

100. D.E. Rawlings, R.A. Dorrington, J. Rohrer, A.-M. Clennel / A molecular analysis of a broad-host-range plasmid isolated from Thiobacillus ferrooxidans // FEMS Microbiology Reviews. 1993. - 11: 1-3.

101. D.E. Rawlings, E. Tietze / Comparative biology of IncQ and IncQ-like plasmids // Microbiol Mol Biol Rev. 2001. - 65: 4. - C. 481-496.

102. W. Reineke, D.J. Jeenes, P.A. Williams, H.J. Knackmuss / TOL plasmid pWWO in constructed halobenzoate-degrading Pseudomonas strains: prevention of meta pathway // J Bacteriol. 1982. - 150: 1. - C. 195-201.

103. H. Sagai, K. Hasuda, S. Iyobe, L.E. Bryan, B.W. Holloway, S. Mitsuhashi / Classification of R plasmids by incompatibility in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob Agents Chemother. 1976. - 10: 4. - C. 573-578.

104. E. Scherzinger, V. Haring, R. Lurz, S. Otto / Plasmid RSF1010 DNA replication in vitro promoted by purified RSF1010 RepA, RepB and RepC proteins//Nucleic Acids Res. 1991. - 19: 6. - C. 1203-1211.

105. P. Scholz, V. Haring, B. Wittmann-Liebold, K. Ashman, M. Bagdasarian, E. Scherzinger / Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad-host-range plasmid RSF1010 // Gene. 1989. - 75: 2. - C. 271-288.

106. Y.R. Sevastsyanovich, M.A. Titok, R. Krasowiak, L.E.H. Bingle, C.M. Thomas / Ability of IncP-9 plasmid pM3 to replicate in Escherichia coli is dependent on both rep and par functions // Molecular Microbiology. 2005. -57: 3.-C. 819-833.

107. D.J. Sherratt / Tn3 and related transposable elements: site-specific recombination and transposition I I D.E. Berg and M.M. Howe Mobile DNA -Washington: ASM Press, 1989. C. 163-184.

108. M. Sota, H. Kawasaki, M. Tsuda / Structure of haloacetate-catabolic IncP-lbeta plasmid pUOl andf genetic mobility of its residing haloacetate-catabolic transposon//J Bacteriol. 2003. - 185: 22. - C. 6741-6745.

109. D. Springael, S. Kreps, M. Mergeay / Identification of a catabolic transposon,

110. Tn4371, carrying biphenyl and 4-chlorobiphenyl degradation genes in

111. Alcaligenes eutrophus A5 // J Bacteriol. 1993. - 175: 6. - C. 1674-1681.

112. A.O. Summers, G.A. Jacoby / Plasmid-determined resistance to boron and chromium compounds in Pseudomonas aeruginosa // Antimicrob Agents Chemother. 1978. - 13: 4. - C. 637-640.

113. M. Syvanen / Bacterial insertion sequences // R. Kucherlapati and G.R. Smith Genetic recombination Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1988. - C. 331-356.

114. H.M. Tan / Bacterial catabolic transposons // Appl Microbiol Biotechnol. -1999.-51: l.-C. 1-12.

115. C.M. Thomas / The Horizontal Gene Pool. Bacterial Plasmids and Gene Spread Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 2000.

116. E. Tietze / Nucleotide sequence and genetic characterization of the novel IncQ-likeplasmidpIEl 107//Plasmid. 1998. -39:3.- C. 165-181.

117. M.A. Titok, I.N. Olekhnovich, A.N. Evtushenkov / Cloning of the REP-region of plasmids from a broad circle of pM3 hosts (IncP-9) // Molekuliarnaia genetika, mikrobiologiia i virusologiia. 1991. - 8. - C. 20-22.

118. E.M. Top, У. Moenne-Loccoz, T. Pembroke, C.M. Thomas / Phenotypic traits conferred by plasmids // The horizontal gene pool. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, The Netherlands. 2000. - - C. 249-286.

119. E.M. Top, Springael, D., Boon, N. / Catabolic mobile genetic elements and their potential use in bioaugmentation of polluted soils and waters // FEMS Microbiology Ecology. 2002. - 42: - C. 199-208.

120. M. Tsuda / Catabolic transposons in pseudomonads // Molecular Biology of Pseudomonads. 1996. - - C. 219-228.

121. Mt Tsuda, T. lino / Genetic analysis of a transposon carrying toluene degrading genes on a TOL plasmid pWWO // Molecular and General Genetics MGG. -1987.-210:2. C. 270-276.

122. M. Tsuda, T. lino / Identification and characterization of Tn4653, a transposon covering the toluene transposon Tn4651 on TOL plasmid pWWO // Mol Gen Genet. 1988. - 213: 1. - C. 72-77.

123. M. Tsuda, T. lino / Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon // Mol Gen Genet. 1990. - 223; 1. - C. 33-39.

124. M. Tsuda, K. Minegishi, T. lino / Toluene transposons Tn4651 and Tn4653 are class II transposons // J Bacteriol. 1989. - 171: 3. - C. 1386-1393.

125. P.M. Tuomi, J.M. Salminen, K.S. Jorgensen / The abundance of nahAc genes correlates with the 14 C-naphthalene mineralization potential in petroleum hydrocarbon-contaminated oxic soil layers // FEMS Microbiology Ecology. -2004.-51: l.-C. 99-107.

126. S.L. Turner, M.J. Bailey, A.K. Lilley, C.M. Thomas / Ecological and molecular maintenance strategies of mobile genetic elements // FEMS Microbiology Ecology. 2002. - 42: 2. - C. 177-185.

127. J.B. van Beilen, G. Eggink, H. Enequist, R. Bos, B. Witholt / DNA sequence determination and functional characterization of the OCT-plasmid-encoded alkJKL genes of Pseudomonas oleovorans // Mol Microbiol. 1992. - 6: 21. -C. 3121-3136.

128. J.R. van der Meer, R. Ravatn, V. Sentchilo / The clc element of Pseudomonas sp. strain В13 and other mobile degradative elements employing phage-like integrases // Arch Microbiol. 2001. - 175: 2. - C. 79-85.

129. J.R. van der Meer, A.J. Zehnder, W.M. de Vos / Identification of a novel composite transposable element, Tn5280, carrying chlorobenzene dioxygenase genes of Pseudomonas sp. strain P51 // J Bacteriol. 1991. - 173: 22. - C. 7077-7083.

130. E. Vedler, M. Vahter, A. Heinaru / The completely sequenced plasmid pEST4011 contains a novel IncPl backbone and a catabolic transposon harboring tfd genes for 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation // J Bacteriol. 2004. - 186: 21. - C. 7161-7174.

131. A.M. Warhurst, C.A. Fewson / Microbial metabolism and biotransformations of styrene // J Appl Bacteriol. 1994. - 77: 6. - C. 597-606.

132. W.G. Weisburg, S.M. Barns, D.A. Pelletier, D.J. Lane / 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // Journal of bacteriology. 1991. - 173: 2. -C. 697-703.

133. G.M. Whited, D.T. Gibson / Separation and partial characterization of the enzymes of the toluene-4-monooxygenase catabolic pathway in Pseudomonas mendocina KR1 // J Bacteriol. 1991. - 173: 9. - C. 3017-3020.

134. G.M. Whited, D.T. Gibson / Toluene-4-monooxygenase, a three-component enzyme system that catalyzes the oxidation of toluene to p-cresol in Pseudomonas mendocina KR1 // J Bacteriol. 1991. r 173: 9. - C. 3010-3016.

135. G. Whittle, M.E. Katz, E.H. Clayton, B.F. Cheetham / Identification and characterization of a native Dichelobacter nodosus plasmid, pDNl // Plasmid. -2000.-43:3.-C. 230-234.

136. L.G. Whyte, Т.Н. Smits, D. Labbe, B. Witholt, C.W. Greer, J.B. van Beilen / Gene cloning and characterization of multiple alkane hydroxylase systems in Rhodococcus strains Q15 and NRRL B-16531 // Appl Environ Microbiol. -2002. 68: 12. - C. 5933-5942.

137. P. Wikstrom, A. Wiklund, A.C. Andersson, M. Forsman / DNA recovery and PCR quantification of catechol 2, 3-dioxygenase genes from different soil types // Journal of biotechnology. 1996. - 52: 2. - C. 107-120.

138. P.A. Williams, S.J. Assinder, P. De Marco, K.J. O'Donnell, C.L. Poh, L.E. Shaw, M.K. Winson. Catabolic gene duplications in TOL plasmids. in FEMS symposium. 1992. UK: Plenum Press.

139. M.S. Wilson, C. Bakermans, E.L. Madsen / In situ, real-time catabolic gene expression: extraction and characterization of naphthalene dioxygenase mRNA transcripts from groundwater // Appl Environ Microbiol. 1999. - 65: 1. - C. 80-87.

140. A. Wright, R.H. Olsen / Self-mobilization and organization of the genes encoding the toluene metabolic pathway of Pseudomonas mendocina KR1 // Appl Environ Microbiol. 1994. - 60: 1. - C. 235-242.

141. K.M. Yen, I.C. Gunsalus / Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation // Proc Natl Acad Sci USA.- 1982. 79: 3. - C. 874-878.

142. K.M. Yen, I.C. Gunsalus / Regulation of naphthalene catabolic genes of plasmid NAH7//J Bacteriol. 1985.- 162:3. - C. 1008-1013.

143. K.M. Yen, C.M. Serdar / Genetics of naphthalene catabolism in pseudomonads // Crit Rev Microbiol. 1988. - 15: 3. - C. 247-268.

144. G.J. Zylstra, E. Kim, A.K. Goyal / Comparative molecular analysis of genes for polycyclic aromatic hydrocarbon degradation // Genet Eng (N Y). 1997. -19: - C. 257-269.

Информация о работе

Соколов, Сергей Львович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.07

Диссертация

Организация плазмидных репликонов групп несовместимости P-7 и P-9 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы