Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Системы генетического обмена патогенных псевдомонад

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Системы генетического обмена патогенных псевдомонад"

сг,

г, сг.

^ ' На правах рукописи

ге: сг>

г- со г". Ы

Меринова Людмила Константиновна

СИСТЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА ПАТОГЕННЫХ ПСЕВДОМОНАД

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Волгоград- 1997

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском прс тивЬчумном институте.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

В.И. Илюхин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Б.Н. Мишанькин

• доктор медицинских наук, профессор Л.Ф.Зыкин

доктор биологических наук, профессор Ю.А. Попов

{ ■ , *

Ведущая организация: Ставропольский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится 997 г. в^-^ часов на засе

дании диссертационного. совета Д 074. 32.01 по защите диссертаций ш соискание ученой степени^1 доктора наук при Российском научно исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г. Са ратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке инсти тута "Микроб". _ .

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Г.А. Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Возбудители мелиоидоза (Pseudomonas pseudomallei) и сапа (Pseudomonas mallei) являются высокопатогенными для человека и животных представителями обширного рода псевдомонад, в большинстве своем состоящего из убиквитарных сапрофитов и фитопатогенных бактерий ( Илюхин, 1985; Беляков и др., 1990; Смирнов, Киприанова, 1990; Bergan, 1981; Palleroni, 1984).

В отличие от многих известны; патогенных микроорганизмов, P.pseudomallei и P.mallei имеют ограниченное географическое распространение. Тем не менее, случаи заболевания мелиоидозом и сапом постоянно регистрируют в странах, отдаленных от эндемичных районов (США, Франция, Канада, Япония), куда инфекции оказываются завезенными больными людьми или инфицированными животными (Howe et al.,1971; Dodin, Galimand, 1976; Mayer, 1981; Bremmelgaard et al., 1982; Galimand, Dodin, 1982; Wilks et al., 1994).

Надежных средств защиты от мелиоидоза и сапа не найдено. Лечение их, несмотря на непрерывно растущий арсенал химиотерапев-тических веществ, остается серьезной проблемой, связанной с высокой естественной резистентностью видов к антибиотикам (Антонов и др. 1991; Батманов, 1991, 1994; Eickhoffet al., 1970; Ashdown, Frettingham, 1984; Mc Eniry et al., 1988; Yamamoto et al., 1990; Haase et al., 1995). К этому необходимо добавить отсутствие препаратов для специфической профилактики заболеваний, во-многом объясняющееся эклектичностью подходов к получению вакцин, неизбежного при недостатке теоретически обоснованных представлений о реализации микроорганизмами патогенных свойств.

Современные знания биологии P.pseudomallei и P.mallei нуждаются в притоке новых научных данных, способных раскрыть природу и механизмы адаптационной изменчивости и патогенности, присущих бактериям, что требует разработки у них эффективных способов анализа геномов. Изучение структуры и функции генетических детерминантов, ответственных за важнейшие биологические признаки рассматриваемых псевдомонад, является определяющим фактором целенаправленной перестройки их генетического аппарата, выделения штаммов с заданными свойствами, конструирования вакцин, создания средств профилактики и лечения вызываемых микроорганизмами заболеваний.

P.pseudomallei и P.mallei мало известны в качестве объектов генетического исследования. Публикации непосредственно относящиеся к генетике мелиоидоза и сапа относительно немногочисленны. Это, преж-

де всего, работы по получению у того и другого видов маркировании штаммов (Ряпис, Ширяев, 1971; Шиповская, Ряпис, 1982; Шиповская др. 1983; Тарасова, Ряпис, 1984; Levine, Maurer, 1958; Evans, 1966;), а так же изучению у P.pseudomallei генетической трансформации (Тарасове Ряпис, 1983; Буланцев, Лозовая, 1985). У возбудителя мелиоидоза выявле естественный механизм формирования компетентности клеток, разрабс таны основные параметры трансформации хромосомной ДНК на плот ной среде, определены частотные характеристики образования peKOMÖJ нантов при передаче признаков ауксотрофности.

Осуществлен ряд работ по применению трансформации для карта рования участков хромосомы P.pseudomallei, ответственных за биох* мическую активность микроорганизма (Тарасова, Меринова, 1984; Тс расова, 1984; Тарасова, Антонов, 1984), а также для идентификации ш тогенных псевдомонад.

Наряду с природной трансформабельностью у P.pseudomallei yen новлена способность к восприятию в конъюгации плазмиды RP4, рециш ентные свойства в отношении этой плазмиды одновременно была выя: лена у P.mallei (Петере и др. 1983). При конъюгации в жидкой сре,с плазмида с низкой частотой передавалась в штаммы микроорганизме от гегерологичного донора (P.aeruginosa), проявляя стабильное наслед< вание в новых бактериальных хозяевах и эффективную экспрессию д< терминируемых RP4 признаков резистентности к тетрациклину и каш мицину.

В данном контексте следует упомянуть также работы по изученш фагов P.pseudomallei, как возможных инструментов генетического и< следования (Манзенюк и др., 1993; Денисов, Каплиев, 1995; Гришкин; 1996), и собственных плазмид микроорганизма (Петере, 1982; Ahtohoi 1995). Фаги и плазмиды возбудителя мелиоидоза не нашли пока прим! нения в изучении геномов патогенных псевдомонад, скорее они выявил необходимость в дальнейшем развитии методического базиса ген тического анализа видов, требующейся для самостоятельного исследов; ния структуры и функции обнаруженных внехромосомных репликонов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в изучении у P.pseudomallei и P.mall систем генетического обмена и оценке их возможностей в качестве мег< дической основы для исследования геномов микроорганизмов и m лучения штаммов с заданными свойствами.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Совершенствовать технику проведения трансформации у P.pseudomall для создания эффективного способа передачи у неё различных хром<

сомных признаков. Изучить возможность проведения трансформации у P.mallei. Разработать трансформацию микроорганизма хромосомной ДНК в условиях естественной или индуцированной компетентности.

2. Выяснить возможность трансформационной передачи возбудителям сапа и мелиойдоза ДНК плазмид, способных реплицироваться в широком круге бактериальных хозяев.

3. Изучить реципиентную способность различных штаммов P.pSeudo-mallei и P.mallei в отношении R-плазмид Iric Р1 группы и плазмид других групп несовместимости. Разработать оптимальные условия проведения у обоих видов конъюгации.

4. Разработать у P.pseudomallei и P.mallei способы инсерционного мутагенеза с использованием транспозонов Тп 10, Тп9, Тп5. Оценить перспективность транспозонного мутагенеза дня получения мутантов, недостаточных по продукции некоторых внеклеточных ферментов и поверхностных антигенов, потенциальных факторов патогенносги возбудителей мелиоидоза и сапа.

5. Исследовать в штаммах P.mallei и P.pseudomallei мобилизующую активность плазмид Inc Р1 группы в отношении хромосомных генов. Определить возможность использования этих плазмид для конструирования донорных штаммов, пригодных для первичного картирования хромосом микроорганизмов.

6. Изучить у P.pseudomallei и P.mallei мобилизующую способность плазмид Inc Р1 группы в отношении неконъюгативных репликонов. Разработать альтернативный трансформации способ переноса в клетки псевдомонад рекомбинантных ДНК и собственных критических плазмид возбудителя мелиоидоза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Изучены системы генетического обмена патогенных псевдомонад.

Впервые показан феномен генетической трансформации у возбудителя сапа. Определены условия проведения ее по маркерам ауксотроф-ности при использовании в качестве донорного материала хлороформных лизатов клеток микроорганйзма или очищенных препаратов ДНК. Наряду с мелиоидозным микробом возбудитель сапа охарактеризован как природнотрансформирующийся вид, отличающийся от P.pseudomallei более низким уровнем трансформационной активности.

Разработаны условия трансформации возбудителя мелиоидоза в системе естественной компетентности. Установлено, что минимальная среда не является определяющим фактором развития компетентности клеток микроорганизма и может быть заменена плотными средами пол-

ноценного состава, в том числе, селективными для исследуемых трансформантов. Варьирование условий скрещиваний позволило трансформировать P.pseudomallei по различным признакам, не связанным с ауксо-трофносгью - подвижности, антибиотикорезистентности, внеклеточной ферментативной активности.

Впервые отмечена возможность трансформации обоих видов микроорганизмов ДНК плазмвд RSF1010 OncQ) и RP4 (IncPl) в условиях, не требующих специальной подготовки клеток реципиентов. Показано,что трансформация плазмидными ДНК, в сравнении с передачей хромосомы, является малоэффективным процессом переноса, протекающим с низкой частотой.

У возбудителей мелиоидоза и сапа изучен опосредованный R-плазмидами Р1 группы несовместимости процесс конъюгации. В качестве основного фактора, обеспечивающего эффективную передачу плазмид в межвидовых и внутривидовых скрещиваниях, отмечено значение инкубирования конъюгационных смесей на плотной среде при температуре оптимальной для роста каждого микроорганизма. Установлены особенности наследования плазмид и выражение плазмидных генов антибиотикорезистентности в новых хозяевах. Обнаружено значительное снижение конъюгативных свойств Р1 репликонов в клетках P.pseudomallei. Показано, что контакт клеток донорных и реципиентных культур на плотной среде у этого микроорганизма дает начало одновременно двум, протекающим независимо друг от друга процессам - конъюгации и естественной трансформации, при этом первая служит преимущественно способом передачи плазмид, вторая - хромосомной ДНК.

Впервые у возбудителей мелиоидоза и сапа осуществлен инсерци-онный мутагенез. Определены основные условия для включения транспозонов ГпЮ и Тп9 в хромосому P.pseudomallei из репликонов тем-пературочувсгвитеяьных плазмид RPl::TnlO Rep ts и RPl::Tn9 Rep ts и Tn5 ( в хромосомы обоих микроорганизмов) из репликона "суицидной" плазмиды pSUP5011. Установлены наиболее типичные сайты ауксо-трофности, служащие хггом внедрения транспозонов, отмечено отсутствие способности Tn-элементов индуцировать в хромосоме псевдомонад вторичные геномные перестройки. Показано стабильное наследование клетками инсерционных мутантов возбудителя мелиоидоза плазмиды RP1 Rep ts - вектора транспозонов ТпЮ и Тп9. Получены и охарактеризованы инсерционные ауксотрофные мутанты микроорганизмов, а также мутанты с дефектами в генах, ответственных за признак подвижности, синтез ряда внеклеточных ферментов (лецитиназы, протеазы, липазы), гемолитическую активность и продукцию антигена 8.

Изучено поведение температурочувствительной по репликации плазмиды RP1 Rep ts в клетках P.pseudomallei. Высказано предположение этносительно нестабильной интеграции плазмид Р1 группы несовместимости с хромосомой микроорганизма и ограниченной способности их к мобилизации хромосомы. Установлена возможность интеграции с хромосомой P.mallei плазмиды рТНЮ в клетках, резистентных к фагу PRD1 клонов штамма Ц-4. Охарактеризованы свойства полученного впервые сонорного штамма P.mallei Ц-4 Д53, с помощью которого проведено начальное картирование участка хромосомы возбудителя сапа, ответ-ггвенного за синтез рада аминокислот.

Впервые показана возможность эффективной мобилизации конъ-югативными плазмидами Inc PI группы в клетки P.pseudomallei и P.mallei яеконъюгативных репликонов (плазмиды Inc Q группы RSF1010, ре-комбинантных ДНК на её основе, а также найденных в штаммах возбудителя мелиоидоза криптических плазмид). Установлены условия селекции, а также общие закономерности наследования клетками обеих псевдомонад мобилизуемых и мобилизующих плазмид в виде автономных репликонов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Разработаны методы трансформации P.pseudomallei и P.mallei на эснове природной способности клеток обоих видов поглощать ДНК, гозволяющие осуществлять передачу различных хромосомных маркеров "'Способ картирования хромосомы псевдомонад" защищен авторским ;видегельством 1067821).

В качестве метода идентификации патогенных псевдомонад гене-гическая трансформация включена в методические рекомендации " Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа", утвержденные 16.03.95 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г. Они-ценко.

Разработаны способы проведения у P.pseudomallei и P.mallei сонъюгации. Предложен оригинальный подход для отбора трансконъ-огантов P.mallei, несущих интегрированную с хромосомой микроорга-адзма плазмиду рТНЮ. Получен донорный штамм P.mallei Ц-4 Д53, 1ригодный для начального картирования её хромосомы.

Разработаны способы включения в хромосому P.pseudomallei гранспозонов ТпЮ, Тп9, Тп5. Приемы, необходимые для инсерции ГпЮ, изложены в "Методических рекомендациях по использованию гранспозона ТпЮ для получения инсерционных мутантов возбудителя лелиоидоза", утвержденных директором ВолгНИПЧИ 12.03.92.

Предложен эффективный способ переноса в клетки Р-рэеийотаМ Р.та11а ДНК плазмид (рекомбинантных молекул или собственных вн хромосомных решшконов возбудителя мелиоидоза) путем мобилизаци их конъюгативными плазмидами Р1 группы несовместимое! ("Методические рекомендации по применению конъюгативных I плазмид для мобилизации в штаммы Рзеийотопаэ рзеийотаМ некой-, югативных плазмид" утверждены директором ВолгНИПЧИ 12.03.92).

В ходе выполнения работы получены коллекции маркировании штаммов, нашедших применение при разработке у патогенных псевд< монад систем генетического обмена, а также использованных в исслед* ваниях по совершенствованию средств профилактики и лечения сапа мелиоидоза (авторские свидетельства NN 255040, 255041, 29823 322767, 193486). "Методические рекомендации по получению ауксотро<] ных, температурочувеггвительных, антибиотикорезисгентных мутанте возбудителей сапа и мелиоидоза" утверждены начальником Главног Управления МЗ СССР В.И.Михайловым 5.03.82. Генетически измене! ные штаммы нашли применение при испытании питательных сред ра: личного целевого назначения (патент N 2070924 на изобретем "Транспортная среда для патогенных псевдомонад" зарегистрирован Государственном реестре изобретений 27.12.96).

Коллекции мутантов Р.рэеиёотаМ с инсерциями в хромосом ТпЮ, Тп9, дефектных по продукции внеклеточных ферментов, а так» мутантов Р.та11е1, индуцированных Тп5, недостаточных по синтезу аг тигена 8, предназначенных для изучения генетических детерминанте факторов патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа, депонированы Российской коллекции патогенных бактерий научно-исследователъског противочумного института "Микроб". В этой же коллекции депонирова набор чистых линий бактериофагов, выделенных из различных штаммо Р.рвеийотаНа.

ПОЛОЖЕРИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. У возбудителей лелиоидоза и сапа выявлено наличие двух» стем передачи генетического материала - трансформации и конъюгацш обеспечивающих этим микроорганизмам способность к обмену хроме сомной ДНК и ДНК плазмид.

2. Р.рвеиёотаНе! и Р.та11е1 относятся к природнотрансформирук щимся микроорганизмам с различным уровнем естественной компетеш ности. Трансформация у них является, главным образом, способом пер« дачи хромосомной ДНК и менее эффективно может служить перенос ДНК плазмид.

3. Возбудители сапа и мелиоидоза воспринимают в конъюгации от гетерологичных доноров R-плазмиды Inc Р1 группы, стабильно наследуют Р1 репликоны и эффективно экспрессируют их гены, детерминирующие признаки резистентности к антибиотикам.

4. Трансконъюганты P.pseudomallei и P.mallei, несущие плазмиды Р1 группы несовместимости, проявляют, с некоторыми отличиями, донор-ную активность во внутривидовых скрещиваниях или в скрещиваниях с гетерологичными микроорганизмами. У P.pseudomallei в условиях, оптимальных для конъюгационной передачи плазмид, происходит также ее-, тественная трансформация хромосомной ДНК.

5. Транспозоны ТпЮ, Тп9, Тп5 при включении в хромосомы P.pseudomallei или P.mallei индуцируют повреждения в различных участках геномов, что позволяет получать инсерционные мутанты псевдомонад с различными свойствами.

6. Температурочувсгвительные плазмиды , RPl::TnlO Rep ts RP1 ::Tn9 Rep ts, векторы транспозонов TnlO и Tn9, находятся в клетках инсерционных мутантов P.pseudomallei в состоянии нестабильной интеграции с хромосомой и не обйаруживают мобилизующей активности в отношении хромосомных генов. При определенных условиях плазмиды' Р1 группы способны интегрироваться с хромосомой P.mallei, опосредуя направленный перенос хромосомных маркеров.

7. Плазмиды Inc PI группы проявляют выраженную мобилизующую активность в отношении неконъюгативных плазмвд, способных реплицироваться в P.pseudomallei и P.mallei. Мобилизация с помощью . плазмид Р1 группы является эффективным методом переноса в клетки • этих псевдомонад рекомбинантных ДНК и собственных нетрансмиссив-: ных репликонов возбудителя мелиоидоза.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены Hat Всесоюзной конференции "Молекулярная биология и генетика возбуди-; / телей ООИ (Маркс, 1982); выездном заседании союзной проблемной ко-' миссии "Генетика бактерий" (Ставрополь, 1984); Всесоюзной конференции "Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ" (Ростов-на-Дону, 1984); на научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 1982, 1983, 1985, 1986, 1987, 1989, 1990 гг.; на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности ООИ" (Волгоград, 1992), на юбилейной конференции, посвященной 25-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 46 работ, в том числе патент и 6 авторских свидетельств на изобретения. Материалы диссертации вошли в две коллективные монографии.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена в форме монографии на 232 листах машинописного текста, состоит из введения и 5 глав собственных исследований, содержащих необходимые литературные справки и иллюстрации в виде 56 таблиц, 14 рисунков, заключения, выводов. Указатель литературы включает 570 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Возбудители мелноидоза и сапа как объекты генетических исследований

В главе приведены сведения об основных биологических свойствах и таксономической позиции патогенных псевдомонад, а также данные, касающиеся их природной изменчивости и, в связи с ней, характеристики обнаруженных у возбудителя мелиоидоза критических плазмид и бактериофагов.

Описаны выделение и свойства маркированных штаммов P.pseudomallei и P.mallei. Дана общая характеристика полиауксотрофных вариантов P.pseudomallei, большую часть которых, в том числе с дополнительно сформированной резистентностью к хлорамфениколу, рифам-пицину, в настоящей работе использовали в качестве реципиентов при проведении генетических скрещиваний и разработке у возбудителя мелиоидоза систем генетического обмена.

С помощью НГ у P.pseudomallei были индуцированы, наряду с ауксотрофными, мутанты других типов, в частности дефектные по подвижности и температурочувствительности (Меринова и др., 1990). В обоих случаях приобретение фенотипов Mot- и Ts у некоторых мутантов сопровождалось снияк таем вирулентности, что определило значение указанных признаков как её косвенных маркеров.

Перспективным оказалось выделение методом селекции в питательной среде с иммунной сывороткой мутантов с измененной способностью к синтезу поверхностного клеточного антигена 8. Изучение этих мутантов выявило существенную роль антигена 8 в проявлении вирулентности P.pseudomallei, как фактора противостоящего фагоцитозу (Пивеньидр., 1991).

В перечне маркированных штаммов P.pseudomallei обозначена также группа мутантов с повышенной чувствительностью к антибиотикам (Меринова и др., 1990). Отобранные после воздействия НГ по приз-

наку чувствительности к тетрациклину они показали снижение резистентности к ряду других, различающихся по механизму действия препаратов, таких как канамицин, эритромицин, гентамицин, хлорамфеникол. Свойства tets-nrraMMOB позволили рассматривать их как мутанты с нарушенной проницаемостью клеточной стенки (Антонов и др., 1991).

Что касается P.mallei, то до настоящего времени ауксотрофы разных видов остаются основным классом мутантов, известных у этого микроорганизма (Шиповская, Ряпис, 1982; Evans, 1966). Важной группой вновь полученных измененных штаммов, стали мутанты с признаками наведенной резистентности к антибиотикам. Получение их явилось большим разделом наших работ по созданию резистентных штаммов двух типов. Одни из них оценивались как перспективные для развития и совершенствования средств неспецифической профилактики сапа, поскольку несли маркеры устойчивости к химиотерапевтическим препаратам, эффективным при экспериментальной инфекции, другие представляли интерес для использования в генетических скрещиваниях, так как при* обрели за счет формирования резистентности необходимые контрселективные признаки.

Возможности индуцированного мутагенеза у возбудителей мелиои-доза и сапа в последнее время были совершенствованы за счет применения транспозонов. Использование транспозонов позволило нам выделить, наряду с ауксотрофными, мутанты P.pseudomallei, дефектные по подвижности, протеолитической, лецитиназной, липазной, гемолитической активностям, а также мутанты P.mallei, недостаточные по синтезу антигена 8. Перечисленные штаммы представляют собой у этих микроорганизмов мутанты новых фенотипов, предназначенные для исследования генетических детерминантов их патогенносги.

2. Генетическая трансформация у P.pseudomallei и P.mallei

Способность P.pseudomallei трансформироваться хромосомной ДНК без специальной, для достижения компетентности обработки клеток показана в работах Т.Д.Тарасовой и Л.А.Ряписа (1983), А.Л.Буланцева, Н. А Лозовой (1985). Проведенное ими всестороннее изучение трансформации по маркерам ауксотрофности выявило основные условия, необходимые для её осуществления при использовании ДНК-содержащих хлороформных лизатов и чистых препаратов ДНК. Установлено, что трансформация происходит при совместном инкубировании донорного материала и культуры реципиента на плотной минимальной среде, содержащей добавки аминокислот или азотистых оснований, требующихся для отбора рекомбинантных клонов по исследуемому признаку.

Успешная разработка у возбудителя мелиоидоза трансформации по признакам ауксотрофности послужила основанием к дальнейшему использованию её для передачи других хромосомных маркеров. Прежде

всего, мы предприняли попытку осуществить в трансформации передачу антибиотикорезистентности. Трансформацию проводили на минимальной среде, если реципиентами были ауксотрофные мутанты, или на полной среде, где рост культур с неизмененными питательными потребностями ограничивали с помощью ингибиторов. Остальные параметры трансформации (температуру, рН сред, концентрации клеток реципиентов, насыщающие концентрации ДНК) выдерживали в соответствии с установленными ранее рекомендациями (Тарасова, Ряпис, 1983). Дополнительно в методику вводили этап промежуточного (до высева на селективные среды) культивирования на полной среде без антибиотика, обычно требующегося для улучшения фенотипической экспрессии признаков. Процесс трансформации контролировали добавлением ДНКазы в количестве 200-300 мкг в 4,2 тМ МяСЬ.

Анализ полученных данных показал принципиальную возможность трансформации по каждому из исследуемых признаков резистентности (табл. 1, 2).

Таблица 1.

Трансформация P.pseudomallei по маркерам резистентности крифампицину и хлорамфениколу

Реципиенты P.psendomaDei Количество клеток реципиента, мл ДНК Частота образованна клонов на число клеток реципиента

Rif» ChP Pur*

С141 (L) 2x10« + 1,4 х 1<Н 0 2,3x10-' 0 -

57576 (L) 2x10« + 3,3 х 10-' 5,6 х 10-« 2,5 x1fr' 1,0 x Ifr« ;

100 (L) 1 х 10« + 1,3x10-» 6,0 х 1fr« 0 0 -

VPA (G) 2x10« + 8,7 х 10-' 0 1,4x1fr' 0 l,2x 1fr« 0

VPA (L) 2x10« ■ + . 5,3 х 10-' 4,0 х 1fr« 3,1 x 10-' 2,0 x 1fr« -

60806-90 (G) 3x10« + 2,3 х 10-' 1,7 х 1fr« 2,1 x 1fr« 1,0 x 1fr« 5,3 x 1(H

60806-90 (L) 1 х 10« + 6,7 х 1fr' 3,0 x 1fr« 0 0 -

Примечания: ДНК - хлороформные лизаты клеток P.pseudomallei С141 Rif* и CHI ChlR; VPA - C141 pur-206; 60806 pur-90; (G) - минимальная среда для инкубирования трансформационных смесей и отбора прототрофных клонов; (L) - полноценная среда с добавками рифампицина или хло-рамфеникола в субингибирукицих концентрациях; 0 - отсутствие клонов данного фенотипа; (-) - клоны не определяли.

Таблица 2.

Трансформация P.pseudomallei по признаку тетрациклинрезистентности

Количество

Реципиенты клеток ДНКаза Количество Частот»

P.pseudomallei реципиента TetR -клонов трансформации

С 141 (L) 1x10' - 0 -

+ 0

57576 (L) 1 х 10» - 7 7,0 х 10-»

+ 5 5,0 х 10-«

57576-4 (L) 5х 10« - 170 3,4 х 10-'

- + 4 < 1 х 1fr«

VPA Tets (G) 2х 10« - 230 1,2 х 1fr«

+ 8 4.0 х 1fr«

Примечания: трансформация препаратом ДНК из штамма P.pseudomallei С141 TetR;

57576-4 (Tets Кап3 - мутант с множественной чувствительностью к антибиотикам); VPA Tets - мутант, чувствительный к тетрациклину; остальные обозначения как в табл. 1.

Наиболее стабильно осуществлялась передача резистентности к рифампицину. По маркерам ChlR и TetR трансформацию получить, удалось не на всех штаммах, причем по тетрациклинрезистентности трансформировались только чувствительные к антибиотику культуры, что могло указывать на положительное значение при отборе рекомбинантов по этому признаку низких концентраций в среде селективного агента.

Использование для трансформации по антибиотикорезисгентности минимальной среды, как фактора, способствующего формированию компетентного состояния, не обнаружило каких-либо преимуществ перед полноценными средами с ингибиторами - в обоих случаях образование рекомбинантов происходило примерно с одинаковой частотой.

В связи с этим, мы решили уточнить, насколько минимальная среда вообще является необходимой для развития компетентности у данного микроорганизма, как это предполагалось в работах »Т.Д.Тарасовой, Л.А.Ряписа (1983).

Для проведения трансформационных скрещиваний приготовили ряд сред. Помимо обычной для трансформации по ауксотрофности минимальной среды использовали также полноценную среду L без каких-либо ингибирующих добавок и G (Gilardi,1976), из которой исключили глюкозу.

В результате выяснилось, что динамика роста трансформантов на всех использованных для предварительного инкубирования реципиента и донорной ДНК средах, даже если это были совершенно различные по питательной ценности среды L или "голодная" (без глюкозы) среда G, выглядела однотипно. Начиная от 1-часового контакта клеток реципиента с трансформирующей ДНК и далее до 18ч, наблюдали плавное увеличение в диапазоне частот (n х Ю-6 -10 5) выхода рекомбинантных клонов (рис.1). Максимальные показатели частоты трансформации на уровне n х 105

фиксировали на любой из сред через 18 ч и далее отмечали некоторое увеличение их вплоть до 30-часовой экспозиции.

«г4

ю-

10

10-'

0 2 « 16 Время, ч

Рис. 1. Динамика образования трансформантов Р.р5еис1ота11е1 в зависимости от среды для инкубирования трансформационных смесей и продолжительности контакта реципиента с ДНК.

Обозначения: во - минимальная среда без глюкозы; С - минимальная среда обычного состава с пурином; Ь - полноценная среда ; С> - минимальная среда обычного состава с пурином, на которой клетки инкубированы с ДНК до появления прототрофных клонов; реципиент - штамм СВБК риг-206 1уз-3 (селектируемый маркер 1ув*); донорный материал - хлороформный лизат клеток штамма С141; ДНКаза в указанные промежутки времени добавлена в количестве 300 мкг.

Количество трансформантов варьировало в зависимости от среды. С наименьшей частотой образование их происходило после инкубирования трансформационных смесей на в, не содержавшей глюкозы, две другие среды (Ь и в обычного состава) обеспечивали примерно равноценную трансформационную активность реципиентных клеток. Для проявления реципиентной ак гивности культур Р.рзеийотаМ, в основном было достаточно 8 ч, о чем свидетельствовали результаты трансформации непосредственно на среде С, где трансформационные смеси оставляли до образования прототрофных клонов без каких-либо манипуляций, не считая нанесения через различные промежутки времени ДНКазы.

Установленная возможность полноценного использования др проведения трансформации у Р.рзеиёотаЦа сред различного состава и уточнение параметров инкубирования на них культур реципиентов расширили представление об условиях трансформации микроорганизма и позволили изменить их в направлении,. нужном для передачи тех или иных признаков. Так, мы попытались избежать дополнительных мани

[уляций с трансформационными смесями, которые естественно возни-:али при переносе их со сред трансформации на среды селекции, в ряде лучаев, сразу соединяя клетки реципиента с ДНК на среде для отбора »екомбинантных клонов. Таким путем стали передавать признаки по-: ;вижности и трансформировать дефекты по синтезу некоторых внекле-очных ферментов. Качественный характер детекции указанных признаке требовал исследования изолированных клонов, поэтому концентрами клеток реципиента при необходимости снижали до 1 х 106 м.к./мл.

Отбор рекомбинантов проводили на специальных средах, позво-сяющих выявлять тот или иной тип ферментативной активности, приго-овленных в соответствии с Difco manual. На этих средах с частотой L х Ю-6 - 1(И осуществляли передачу по признакам лецитиназной, протейной, гемолитической активностей. . ;

Таким образом, выявленная у возбудителя мелиоидоза природная пособность к поглощению из окружающей среды хромосомной ДНК поволила разработать у этого микроорганизма эффективный способ гене-ической трансформации по ряду хромосомных признаков,: ауксотрофности, антибиотикорезистентности, подвижности, функции гекоторых внеклеточных ферментов). Основным условием её проведения ледует считать создание контакта клеток микроорганизма и материала ЩК (в виде хлороформных лизатов клеток или очищенных препаратов) ia поверхности плотной питательной среды, которая в определенных лучаях может бьгть одновременно средой трансформации и селекции. Трансформация протекает при оптимальной для роста культур темпера-УРе-

Продолжительность трансформации от начала ДНК-клеточного гонтакта до появления рекомбинантных клонов определяется особенно-ггями реципиентного штамма и исследуемого фенотипического призна-;а. Однако обязательное время инкубирования должно составлять не ме-гее8-18ч.

Трансформация у возбудителя сапа долгое время оставалась не шработанной. Начав её исследование, мы предположили, что P.mallei, сак близкородственный мелиоидозному микробу вид, должен обладать ¡войсгвенной последнему природной компетентностью, но, по-видимому, выраженной в меньшей степени. Дальнейшее изучение у него трансформации подтвердило это предположение.

Прежде всего, трансформационную способность проявляли только ^многие ауксотрофные реципиенты возбудителя сапа. Основным усло-шем трансформации штаммов P.mailei, как и P.pseudomallei, являлось ювместное инкубирование культур реципиентов с ДНК на плотной ми-шмальной среде. Передача на ней различных признаков ауксотроф-юсти осуществлялась с частотой, в основном не превышающей 1х 10-7-Ю-6.

Трансформирующей активностью обладали как хлороформные ли-1аты клеток донорных штаммов, так и выделенные из них препараты

ДНК. Трансформация протекала при температуре 37°С, оптимальной для роста микроорганизма, и требовала высокой концентрации клеток реципиента ( 1 х 108 - 109 м.к./мл) и минимальной среды, обеспечивающей их эффективный рост. Примечательно, что ДНКаза до конца не снимала трансформацию ДНК-содержащими лизатами в гомологичных скрещиваниях, но целиком прекращала её, если донорный материал принадлежал Р.р8еис1ота11е1.

Культуры Р.ша11е1 не трансформировались в жидкой среде. Нам не удалось также индуцировать компетентность с помощью хлористого кальция (Маниатис и др., 1984) или замораживания-оттаивания (Дитяткин, Ильяшенко, 1974).

Динамика роста трансформантов Р.ша11е1 заметно отличалась от таковой у возбудителя мелиоидоза. Так, продолжительность контакта клеток её реципиентов с ДНК в промежутке времени от 1 до 18 ч практически не влияла на выход рекомбинантов, образование которых происходило с низкой частотой, не превышающей п х 107 в расчете на исходное количество клеток реципиента (рис. 2). Через 24 ч и далее количество отбираемых клонов увеличивалось, видимо, как результат начавшегося интенсивного размножения культуры рекомбинантов.

О I 2 4 6 18 24 30

Время, ч

Рис. 2. Динамика формирования трансформантов P.mallei в зависимости от времени инкубирования трансформационной смеси. Реципиент - штамм Ц-4 his 2422; донорный материал - хлороформный лизат P.mallei 10230. Обозначение сред: G - минимальная среда, скрещивание в пятне с последующим высевом на среду селекции; G* - трансформация на поверхности минимальной среды на газоне реципиента, соединенного с ДНК. ДНКаза добавлена в количестве 300 мкг в 4,2mM MgCh.

В случае, когда отбор прототрофных клонов осуществлялся сразу на среде, являющейся одновременно средой трансформации и селекции, максимум частоты трансформации приходился на начало инкубирования трансформационной смеси и оставался на этом уровне в последующие экспозиции, вплоть до 30 и 48 ч. По-видимому, поглощение ДНК немногочисленными компетентными клетками Р.та11и на поверхности плотной среды было непродолжительным и заканчивалось в первые часы инкубирования реципиентной культуры с ДНК.

Процесс трансформации Р.та11а находился в зависимости от концентрации ДНК. Число прототрофных клонов возрастало как функ-, ция количества ДНК, добавленной к реципиентной культуре на плотной среде. Концентрация хромосомной ДНК в пробе 1 мкг обеспечивала выход трансформационной кривой на плато.

0,0001 г

57576-4 УРА ТВ

НДНК+ СЗДНК- ■ДНКаза*

Рис. 3. Трансформация Р.рвеиёотаИе! и Р.таИя ДНК ЮТЮЮ.

По оси У: частота образования Зт^к^онов на клетку реципиента.

Таким образом, возбудитель сапа, как и возбудитель мелиоидоза, может быть трансформирован хромосомной ДНК (в форме хлороформных лизатов или очищенных препаратов) без какой-либо специальной обработки клеток реципиента. Достаточным условием для его трансформации по признакам ауксотрофности является совместное инкубирование реципиентной культуры с ДНК на поверхности плотной минимальной среды. :

Решающее значение для развития трансформации у P.mallei имело получение маркированных по ауксотрофности мутантов микроорганизма, среди которых удалось отобрать штаммы, обладающие естественной трансформабельностью, и применение для проведения трансформации универсальной для представителей Pseudomonas минимальной среды G (Gilardi, 1976), выявлявшей трансформационную активность культур обеих исследуемых псевдомонад.

Далее естественную компетентность P.pseudomallei и P.mallei использовали для передачи им плазмидных ДНК. Для трансформации были выбраны RSF1Ü1Q (Inc Q) и RP4 (Inc PI) - плазмиды с широким кругом бактериальных хозяев, способные стабильно поддерживаться и экспрессироваться в псевдомонадах.

Плазмиды передавались в трансформации в клетки возбудителя мелиоидоза и сапа с частотой n х 10 8 - 10-7 (рис. 3). Обработка трансформационных смесей ДНКазой ограничивала появление резистентных клонов. Трансформанты приобретали устойчивость к стрептомицину или тетрациклину и канамицину, детерминируемую плазмидными генами, в 10-20 раз превышающую её у исходных культур.

Электрофоретический анализ выявлял ДНК плазмид только в отдельных клонах с фенотипическими признаками RSF1010 (SmR) и RP4 (TcR KmR), что указывало на вероятную интеграцию их с хромосомами P.pseudomallei и P.mallei. В последующем обе плазмиды удавалось мобилизовать или передать в конъюгации в реципиентные штаммы E.coli, где их присутствие обнаруживали при электрофоретическом исследовании.

Следовательно, в условиях природной компетентности трансформация у P.pseudomallei и P.mallei может служить методом передачи им не только хромосомной, но и плазмидной ДНК. В последнем случае трансформация менее эффективна и, как правило, не обеспечивает автономное состояние плазмидных репликонов в клетках этих микроорганизмов.

3. Конъюгация у возбудителей мелиоидоза и сапа

Выявленная у P.1¡seudomallei и Р.таМ природная способность к трансформации не исключала необходимость в разработке у этих псевдомонад других способов генетического обмена, тем более, что возможности трансформации в исследовании геномов ограничены (Феррари, Хоч, 1992).

Наибольшие перспективы дня развития генетического анализа представляет конъюгация, особенно если микроорганизмы могут быть реципиентами R-плaзмид 1пс Р1 группы, обеспечивающих создание эффективных приемов изучения геномов.

Главным условием передачи плазмид этой группы с клетки Р.рзе'^ота11е1 и Р.таШ, как показали наши исследования, стало скре-

щивание их с донорами плазмид ( P.aeruginosa, P.putida, E.coli) на плотных питательных средах. Здесь прослеживается общность возбудителей меяиоидоза и сапа с другими представителями рода Pseudomonas, способности которых воспринимать плазмиды определяется степенью контакта конъюгирующих клеток, в необходимой мере достигаемой только на плотной среде (Curier, Morgan, 1982; Bredley, 1983). Фиксация клеток на мембранных фильтрах, делающая межклеточные взаимодействия более тесными, способствовала у обоих микроорганизмов, повышению частоты передачи плазмид, выявляя отчетливые преимущества перед конъюгацией в жидкой среде или осадке (рис.4).

* • i

Н в осадке EZ3 ив плотной вреде

Рис. 4. Эффективность конъюгационной передачи ЯР4 в штаммы Р.та11е1 при различных условиях скрещивания.

Обозначения: ось У - количество Тск-рекомбикантов на1 х 10® м.к. конъюгационной смеси; штаммы Р.шаНа: I - 10230,2 - Ц-4,3 - Р-1, 4 - Будапешт, 5- Ц-5, 6-г-12,7-Иванович, 8-8,9-11. ... ,

В остальном конъюгация у P.pseudomallei И Р.таИи требовала соблюдения обычных для этого процесса факторов, разработанных в соответствии с некоторыми особенностями исследуемых видов. Проведение конъюгации при температуре оптимальной для каждого микроорганизма, подготовка культур к скрещиваниям с учетом фаз роста и создание необходимых условий селекции трансконъюгантов, обнаруживало реципиент-ную активность большинства штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа (табл.3 ). Частота передачи им плазмид по основному селективному маркеру (Тса) варьировала в интервале п х 10 8 - 10 5 на клетку донора,

в зависимости от плазмиды и реципиента, что является закономерным для передачи R-плазмид в межвидовых скрещиваниях, для которых существуют определенные ограничения (Вивиан и др., 1988; Jin, 1992). Процесс переноса был нечувствителен к ДНКазе.

Таблица 3.

Реципиентные свойства штаммов P.pseudomallei и P.mallei в отношении различных плазмид Inc PI группы

Плазмида Число реципиентов Число штаммов, воспринявших плазмиды

Абсолютное Относительное (%) * с частотой на клетку донора

пх10-7-ИН | пх1<К

RP4 37 29 89,7 10,3

RP1 40 32 78,2 21,8

R68.4S 37 32 53,5 46,7

рТНЮ 37 30 73,3 26,7

pRP19.6 37 29 79,3 20,7

P.raalki

RP4 9 6 83,3 16,7

RP1 9 6 66,7 33,3

R68.45 9 6 66,7 33,3

рТНЮ 9 6 100 0

pRP19.6 9 1 100 0

Примечания: * по маркеру TcR; доноры плазмид указаны в табл. 3.13; конъюгация 18 ч на фильтрах на Pseudomonas agar F ("Difco") при температуре 32°С (для P.pseudomallei) и 37°С (для P.mallei).

Переданные в штаммы возбудителей мелиоидоза и сапа плазмиды 1пс Р1 группы наследовались в обоих видах с выражением всех детерминантов антибиотикорезистентности. Но при этом в новых хозяевах отчетливо более низкой , в сравнении с исходными донорами, была экспрессия гена ампициллинрезистентности (рис. 5).

Несмотря на то,1 то наличие маркера Арк всегда регистрировали в культурах трансконъюх антов, опосредованная атр-геном устойчивость превышала собственный показатель резистентности к ампициллину микроорганизмов не более , чем в 2-5 раз, обнаруживая тенденцию к дальнейшему снижению.

Следует подчеркнуть стабильный характер наследования плазмид 1пс Р1 группы клетками Р.рвеиёотаИе! и Р.таИеи что естественно для плазмид, обладающих свойством широкого круга хозяев. Плазмиды не утрачивались клетками возбудителей мелиоидоза и сапа при длительном культивировании на питательных средах различного состава, их также практически не удавалось исключить из клеток микроорганизмов с по-

мощью элиминирующих агентов (акридинового оранжевого, митомици-на С и др.).

Рис. 5. Резистентность штаммов Р.р5еис1ота11е1 и Р.та11е1 - трансконъюгантов плаз-мид 1пс Р1 группы.

Обозначения: ось У - МПК препаратов, мкг/мл; 1 - Р.р$еис1отаШ 56830 (рТНЮ); 2- Р.р8еис1ота11е1 56830; 3 - Р.таМ 10230 (Б1Р4); 4 - Р.та11е1 10230; 5 -Р.аеги^пова РАО 2607 (ИР4); 6 - Е.соН КБ 707 (рТНЮ)

Определенные различия в поведении плазмид были обнаружены при изучении конъюгационной передачи внутри видов. Трансмиссия плазмид в Р.таМ осуществлялась более эффективно, чем при межвидовой конъюгации. Кроме того, частоту её можно было существенно повысить, прибегнув к поочередной смене донора и реципиента (табл. 4).

Таблица 4.

Эффективность передачи ЯР4 в штаммы Р.таМ при последовательной смене доноров

Доиср Реципиент Количество Тск - клонов на 1x10s клеток реципиента

Ц-4 (RF4) Ц-4 3305 3,4x10'

! 1 (RP4) Ц-4 3305 5,2 х 10*

Ц-4 3305 (RP4) Ц-4 3245 4,2 х 105

Ц-4 1360 1,7 х KP

Ц-4 3245 (RP4) Ц-4 1092 5,5 х 10*

Ц-4 1028 7,2 х 104

Пртмвч.-.чаи: реципиенты P.maüei - Ц-4 3305 (Met Sti*), Ц-4 3245 (His), Ц-4 1360 (Leu), Ц-4 1092 (Met), Ц-4 1028 (Met); рост доноров ограничивали, до-батяя в селективные среды стрептомицин или исключая из неё необходимые им факторы питания; скрещивания на фильтрах на L-arape 18 ч при 37°С.

б*«.-.,..-. ;

Иначе протекал процесс внутривидовой конъюгации у Р.рзеиёотаИй. После непродолжительного культивирования транс-конъюганты её, несущие любые плазмиды 1пс Р1 группы, при использовании в качестве доноров в скрещиваниях с гомологичными культурами демонстрировали низкую частоту переноса или вообще не проявляли конъюгативной активности. Между тем донорные клоны полностью сохраняли фенотип резистентности, обусловленный плазмидами. Судя по данным электрофоретического анализа, плазмиды присутствовали в них в автономном состоянии.

Таким образом, в Р.рзешкмпаЛй конъюгативные свойства плазмид 1пс Р1 группы, по-видимому, подвергались репрессии. Мы ничего не можем сказать относительно возможных изменений в структуре плазмид-ных репликонов, так как стандартный метод анализа ДНК плазмид, применявшийся в работе, не позволял ответить на этот вопрос.

Условия, оптимальные для конъюгации, выявляли у Р.рзеис1ота11а одновременно и другой процесс передачи генетического материала - естественную трансформацию. Формально эти процессы можно было разделить, применяя ДНКазный тест. Чувствительность к ДНКазе или отсутствие её, разграничивали их на два самостоятельных явления - конъюга-ционную передачу плазмид и спонтанный трансформационный перенос хромосомных маркеров (табл. 5).

Таблица 5.

Независимый перенос плазиидных и хромосомных генов в скрещиваниях между штаммами Р.р$еис1ота11е|

Количество рекомбннантов на 1 х 10*

Скрещивание клеток реципиента

DxR L Тс Rif G Per G His G Met

57576-37 (R68.45) х 60806-90-69 Rif

+ ДНКаза 850 0 - 0

- ДНКаза 780 10 - 5

56830-281 -1 (рТН 10) х С141 -206-10 Rif

+ ДНКаза 670 0 0 0

-ДНКаза 860 35 12 18

Примечания: доноры - 57571 -37 (asp glu), 56830-281-1 (trp phe met); реципиенты -60806-90-69 Rif (pur met Rif*) и С 141-206-10 Rif (pur his Rii*); L Te Rif -L-arap с тетрациклином и рифампицином; G Pur - минимальная среда с пурином; G His - минимальная среда с гистидином; G Met - с метиони-ном; (-) - отбор не проводили; скрещивание 18 ч на L-arape без применения фильтров.

Использование ауксотрофных доноров и реципиентов позволяло наблюдать двунаправленное течение спонтанной трансформации. По частоте оба процесса находились в пределах 10"8 - Ю-5. Процесс конъюгации доминировал, если культуры скрещивались на полноценной среде

на мембранных фильтрах. Для трансформации, напротив, преимущества создавало инкубирование доноров и реципиентов непосредственно на селективной для рекомбйнантных клонов минимальной среде, где конъ-югационная активность культур была выражена в гораздо меньшей степени. В редких случаях имея место чувствительный к ДНКазе перенос плазмид. Резистентные по маркерам плазмид клоны удавалось отбирать среди прототрофных по различным признакам трансформантов.

Следует отметить, что установленное состояние процессов конъюгации и спонтанной трансформации было характерно именно для Р.рзеи<1ота11е1. Плазмидсодержащие штаммы Р.таШ могли выполнять одновременно роль доноров и плазмидной и хромосомной ДНК только в скрещиваниях с Р.рзеис1ота11еь Первая передавалась конъюгационным путем, вторая, как и внутри вида Р.р8еи(1ота11й, в спонтанной трансформации. Но самостоятельно между сапными штаммами спонтанный, чувствительный к ДНКазе процесс, практически не имел места. Во всяком случае, он не был выявлен в условиях, оптимальных для конъюгации.

^Мигрирующие генетические элементы в исследовании геномов патогенных псевдомонад

В настоящем разделе приведены результаты разработки у P.pseudomallei и P.mallei транспозонного мутагенеза. Способность возбудителей мелиоидоза и сапа воспринимать и стабильно наследовать плаз-миды PI группы несовместимости послужила основанием для использования их у этих видов в качестве векторов транспозонов.

Отсутствие условий для элиминации из клеток P.mallei плазмид с "Р-фенотипом из-за неспособности к росту при 42°С ограничивало выбор вектора для транспозиции в ней "суицидной" плазмидой pSUP5011, несущей Tn5 (Simon et al., 1985), тогда как температурный диапазон роста возбудителя мелиоидоза позволял применять для этих целей также температурочувсгвительные репликоны RPl::Tn9 Rep ts, RPl::TnlO Rep ts.

Отметим некоторые особенности, обнаруженные в процессе манипуляции с Т'-плазмидами в клетках P.pseudomallei. Прежде всего, включение Тп9 и ТпЮ в хромосому микроорганизма оказалось возможным только при условии культивирования клонов TcR TR на плотной среде с неоднократной сменой непермиссивных и пермиссивных температур. Необходимость в этом приеме, который, по мнению S. Harayama (1981), повышал частоту транспозиции Tnl за счет повторяющегося включения плазмиды в хромосому, указывал на низкую способность RP1 Rep ts к интеграции с хромосомой P.pseudomallei или на нестабильный характер их взаимодействия.

Клоны с ауксотрофными свойствами составляли 0,7- 2,6% от числа исследованных культур с маркерами резистентности Тп-элементов. Спектр мутаций варьировал в зависимости от штамма и транспозона (табл.6). При этом было отмечено, что у инсерционных мутантов ни в одном случае не происходила потеря Ктк-маркера плазмиды. Таким образом, при непермиссивной температуре создавались условия для включения в хромосому Р.рвеиёотаМ Тп-элементов, но векторная плазмида при этом не элиминировалась из клеток микроорганизма.

Таблица 6.

Характеристика ауксотрофных инсерционных мутантов Р.рзеис1ота11е1, полученных при включении в хромосому ТпЮ, Тп9,Тп5

Штаммы Частота Тип Число Частота

включения, */• * ауксотрофности мутанов, % реверсий

Ilv 33,3 1 х 10-*

His 20,0 2х 10-»

56770 Met 20,2 1 х 10-«

(RPI::TnlO) 0,7 Lvs 13,3 Зх 10-7

Repts Asp Glu 6,6 1 X Ю'

Arg 4,0 5 х 10-'

Tyr 2,4 2 х 1 О'

57576 (RPl::TnlO) 2,6 Trp 87,5 2х 10-'

Repts Pan 12,5 1 х 10«

57562 (RPl::TnlO) Met 41,3 1 х 10-«

Repts 0,8 Thr 35,1 Зх 10*

His 23,6 1 х 1<Н

56830 (RPl::TnlO) 2,3 Trp 78,4 1 х 10-'

Repts Met 21,6 5х 10»

57576 (RPl::Tn9) Repts 1,6 Trp 100 2х 10«

56770 (RPl::Tn9) Trp 80,2 1 х 10«

Яф ts 1,2 Arg 12,8 Зх Ю«

His 7,0 1х 10«

57576-T4 Met 45,7 2х 10-»

(pSUP5011) 32 Glu 12,4 Зх Ю'

Nid 41,9 -

Примечания: * - количество , уксотрофов в процентах от общего числа исследованных TcR, CmR - клонов или от числа KmR-клонов ( в случае Tn5); Nid- неустановленная питательная потребность.

Все мутанты, полученные на основе ТпЮ и Тп9, в том числе ревер-тировавшие к прототрофности, сохраняли маркеры транспозонов и плазмиды. Температурорезистентный фенотип инсерционных мутантов не оставался постоянным (табл. 7). В процессе хранения культур происходило выщепление Тск Кшк Тя-вариантов с плазмидами температу-рочувствительными по репликации, что служило подтверждением нестабильности интеграции их с хромосомой. В зависимости от того, имела

плазмида TR или Ts, или вариабельный по температурочувствительности фенотип, проявлялись и её конъюгативные свойства.

Таблица 7.

Показатели изменения фенотипа температурозависимости плазмиды RPI ::Тп10 Т* в инсерционных ауксотрофных мутантах P.pseudomallei

Штамм Мутация ауксотрофности Количество клонов с Xs фенотипом, %

56770 chr::Tnl0 (RPl::TnlO) Rep TR his-13 86,7

his-5 49,2

arg-1 67,5

ilv-16 91,3

ilv-4 36,9

ilv-10 43,9

met-8 92,6

met-15 46,4

Особенности поведения температурочувствительных векторов в клетках P.pseudomallei позволяли думать о возникающих инсерциях, как о возможном результате встраивания в хромосому плазмиды. Однако это предположение опровергала неспособность RPI Rep ts без TnlO или Тп9 индуцировать хромосомные дефекты, и, отчасти, также комплементация при трансформации фенотипически одинаковых мутаций по триптофану (trp::TnlO, trp::Tn9), указывавшая на возникновение их вследствие повреждения в различных локусах. Реверсии мутантов к прототрофности также не зависели от сохранения плазмидой температурорезистентного или температурочувствительного фенотипов. Важным для характеристики исследуемого процесса являлся тот факт, что TnlO и Тп9 не индуциро-. вали вторичные перестройки генома P.pseudomallei.

Внедрение в хромосомы Тп5 из вектора pSUP5011 у обеих псевдомонад опосредовало узкий спектр мутаций ауксотрофности и, кроме того, у P.pseudomallei - мутации по подвижности. При этом наследование плазмиды наблюдали только у части Ктк-клонов P.mallei. Отсутствие маркеров pSUP5011 у основной массы мутантов того и другого микроорганизмов указывало на вероятность появления их в результате собственно транспозиции Тп5. Тем не менее Тп5, как и транспозоны Тп9 и TnlO, не индуцировал в хромосомах P.pseudomallei и P.mallei вторичные перестройки. . .

Выявленная у,, перечисленных Tn-элементов способность к включению в различные участки геномов исследуемых псевдомонад позволила применить их для получения инсерционных мутантов с дефектами в генах потенциальных факторов патогенности этих микроорганизмов. С помощью TnlO, Тп9 были индуцированы мутанты P.pseudomallei, недостаточные по продукции ряда внеклеточных ферментов. Часть из

них имела изолированные дефекты по протеазной, лецитиназной, липаз-ной, гемолитической активностям, тогда как другие представляли собой их фенотипические варианты с различными сочетанными признаками (табл. 8).

Таблица 8.

Фенотипические классы инсерционных мутантов P.pseudomallei 56770, индуцированных Tn9, Tn 10

Первоначальный ига включения Фенотипы

1ес::Тп9 Lee .

Lec- Hem- Exp- Lipra Mot-

Lec- Hem- Expa Lip1* Mot*

Lecra Hem+ Exp* Lip* Mot*

Lec» Hem- Exp+ Lip+ Mot+

hem::Tn9 Henr

Неш- Lec- Exp- LipM Mot-

Hem- Lec- Exp" LipD1 Mot+

Hem- Lec- Exp1» Lip* Mot+

Hem- Lec- Exp* Lip* Mot*

ехр::Тп9 Exp«

Exp- Lee Hem- LipM Mot-

Exp- Lec Hem- Lip+ Mot*

Exp« Lec- Hem- Lip™ Mot*

Exp° Lec* Hem- Lip* Mot*

lip::Tn9 Lip«

Lip™ Lec* Exp* Hem- Mot*

hem::TnlO Hem-

Hem- Lec* Exp131 Lip™ Mot-

Hem- Lec* Exp1" Lip* Mot*

exp::TnlO ExpDl

Exp" Lec* Hem- Lip* Mot*

lip::TnlO Lip»

Примечания: Lee- - дефект по лецитиназе; Нет- - по гемолитической активности; Lip01 - по твин-эстеразе; Ехр- - по протеазе; Mot- - по подвижности; (D1) - появление признака в поздние (на S-7 сут.) сроки.

У возбудителя сапа выделили индуцированные Тп5 мутанты, утратившие вирулентность с неидентифицированными пока изменениями в поверхностных клеточных структурах, а также штаммы, недостаточные по синтезу антигена 8, установленного фактора патогенное™ Р.рзеис1ота11е1 и Р.гаа11е1 (Пивень, 1997).

5. Использование плазмид 1псР1 группы для мобилизации у Р.рэеийотаНе! и Р.таИе! хромосомных генов и неконъюгативных репликонов

Предпринятое в работе исследование мобилизующей функции плазмид Р1 группы несовместимости явилось первой попыткой получения донорных штаммов патогенных псевдомонад и разработки альтернативного трансформации способа переноса у них плазмид, не обладающих собственной трансмиссивностью. Нам удалось найти оригинальный методический прием отбора клонов Р.таМ Ц-4(рТН10), в которых плазмида интегрировалась с хромосомой, среди культур этого штамма, проявляющих резистентность к фагу Р1Ш1. Фенотипические варианты Ц-4(рТН10) Тсэ Ктя Арк, с высокой частотой воспринимавшие рТНЮ при повторной передаче, показали способность к мобилизации хромосомных генов. Изучение донорных свойств штамма Ц-4 Д53 установило направленный перенос хромосомы плазмидой рТН10 и дало возможность провести первичное картирование её участка, включающего гены, ответственные за синтез у возбудителя сапа рада аминокислот.

В отличие от Р.таНе!, Р.рзеис1ота11е1 оказалась менее подходящим объектом для конструирования донорных штаммов, так как передача у нее хромосомы в спонтанной трансформации в целом превалировала над мобилизующей активностью плазмид. Не исключено, что развитая у возбудителя мелиоидоза способность к обмену хромосомным материалом в процессе естественной трансформации, является доминирующим способом его передачи, ограничивающим проявление других систем генетического переноса.

Далее отметим, что плазмиды 1пс Р1, мобилизующая активность которых в отношении хромосомных генов неравноценно проявлялась в Р.рзеиёотаИй и Р.иаМ, показали себя как эффективный инструмент переноса в эти микроорганизмы плазмид, не обладающих конъюга-тивными свойствами. Трансконъюганты Р.рвеисЬтаНа, в которые мобилизовали с помощью рТНЮ или ЯР1 плазмиду широкого круга хозяев ИЗРЮЮ,наследовали мсбилизуемые репликоны в высоком проценте случаев (табл. 9). Практически с тем же успехом можно было передавать эту плазмиду в Р.таПеь Микроорганизмы отличались по способности поддерживать мобилизукнщй вектор, который в 100% случаев, наряду с мобилизуемым, сохранялся в клетках Р.ряеидотаНа, но закономерно утрачивался Р.таИеь В клетках возбудителя мелиоидоза переданные плазмиды находились в автономной состоянии, не показывая способности к образованию коинтегратов, свойственной многим микроорганизмам, в которые перенос плазмид осуществляется при мобилизации (рис.6).

Мобилизация была использована для передачи и изучения стабильности в Р.рзеис1опа11е1 и Р.таНе!, пригодных для клонирования в этих микроорганизмах, рекомбинантных ДНК рУА1 и рУА4, сконструированных на основе ИБРЮЮ. Приемы мобилизации позволили осу-

ществить перенос в клетки Р.ша11е1 собственных внехромосомных реп-ликонов возбудителя меяиоидоза рСМ2, рСМЗ (рис.7), известных как его критические плазмиды (Антонов, 1995).

Таблица 9.

Перенос с помощью конъюгативных плазмид Р1 группы ВДРЮЮ, рУА1 и рУА4 в

штаммы Р.рзеиёота11е1

Скрещивания с Р.р$ев<1ота11е1 Наследование плазмид по маркерам Стабильность маркера Бт" Тс», % МПК стрептомицина, мкг/мл

Тс® на клетку донора вш», от Тс"

Е.соИ С600 (рТНЮ-ЯБРЮЮ) х 57576 х 56770 хС141 2,0 х 10« 1,5 х 10-* 2,5 х 10« 80 87 86 100 100 98 5000 2500 •"2500

Е.соН СбООфП -1^1010) х 57576 хС141 1,7 х 10« 2,3 х 10« . 89 76 10Си„ 97 5000 2500

Е.соИ НВ101(рТНЮ - рУА1) х 57576 х 110 1,8 х МИ 3,1 х 83 87-И 96 /' 89- 5000 ■ 5000

Е.соИ НВ101(рТН10 - рУА4) х 56770 хС141 4,6 х 10« 2,6 х 10« ' 81 " 79 81 84 5000 5000

ю ' о (й о сэ с! &

чвЛ 'Ж11'*11 41'ЧВч» ЧЮТ*

ЯШ ^^ ЙЩ

^^^ ^^

1 23456 7 89 10

Рис. 6. Электрофореграммы ДНК плазмид, мобилизованных в штаммы Р.р$еис1о-ша11е1 и Р.та11е1. г ' <;г .

Обозначения: 1 - Е.соИ НВ10» (рУА1); 2/ Е.еоН НВ101 (рУА4); 3 - Е.соН С600 (1^1010); 4 - Р.рэеиаотаПе! 56770 (р.ТШО - рУА1); 5 - Р.рвеиаотаиы 56770 (рТНЮ - рУА4); 6 - Р.р8еиёогаа11е1 56770 (ИР1 - ЯБРЮЮ); 7 - Р.та11е1 Иванович (рУА1); 8 - Р.та11е1 Иванович (рУА4); 9 - Р.та11е1 10230 (ЮТ 1010); 10 - Е.соИ С600 (рТН 10 - ИБР1010).

Рис. 7. Электрофореграммы ДНК из клеток трансконъюгантов Р.ша11е1 Ц-4 ШГ, полученных от скрещивания с Р.рвеиёошаНе} 130 (КР1::Тп10, рСМЗ). Обозначения: 1 - Р.р8еи<1ота11е1 130 (11Р1::Тп10, рСМЗ); 2 - Р.та11е1 Ц-4 3 -Р.та11е1 Ц-4 БМ (11Р1::Тп10, рСМЗ); 4 - Р.таИм Ц-4 ШГ (рСМЗ); 5 - Р.та11м Ц-4 М (КР1::Тп10).

Мы рассматриваем мобилизацию с использование конъюгативных плазмид Р1 группы как надежный способ осуществления передачи возбудителям сапа и мелиоидоза любых способных реплицироваться в них плазмид, в чем её несомненное преимущество перед трансформацией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено обсуждение особенностей выявленных у Р.рвеиёотаИи и Р.таИа процессов трансформации и конъюгации. Отмечено, что настоящие исследования позволили определить основные системы генетического обмена патогенных псевдомонад, разработать методические приемы их практического использования и показать закономерности и различия в способах передачи генетической информации, имеющиеся у этих близкородственных видов. Все это дает возможность наметить ближайшие перспективы анализа геномов возбудителей сапа и мелиоидоза и уже сейчас применять полученные результаты для картирования их хромосом, изучения генетического детерминирования патогенных свойств, изучения структуры и биологической роли бактериофагов и плазмид, разработки техники молекулярного клонирования.

ВЫВОДЫ

1. Проведено исследование систем генетического обмена возбудителей мелиоидоза и сапа. Показано, что они обладают двумя способами передачи генетического материала - трансформацией и конъюгацией, по-разному проявляющими себя у каждого вида псевдомонад.

2. У обоих микроорганизмов установлен естественный (не требующий специальной подготовки клеток реципиентов) механизм формирования компетентности на плотной питательной среде, позволяющий осуществлять трансформацию их хромосомной ДНК и ДНК плазмид. Выявлены отчетливые видовые различия в трансформационной активности Р.рБешкшаИй и Р.таПй, отмечено преимущественное значение трансформации для передачи им хромосомного материала.

3. Разработаны основные условия проведения трансформации на плотной питательной среде у Р.таМ по ауксотрофным маркерам и у Р.рэеис^таМ по ряду признаков, не связанных с ауксотрофносгью (антибиотикорезистентности, подвижности, ферментативной активности), а также условия трансформации обеих псевдомонад плазмид-ными ДНК ЯБРЮЮ (1пс О) и ЯР4 (1пс Р1). Показана равноценность применения при трансформации возбудителя мелиоидоза минимальной и полноценной по ростовым качествам сред, обеспечивающих сходную динамику образования трансформантов.

4. Изучены реципиентные свойства штаммов Р.рБеиёотаНе! и Р.та11е1 в отношении плазмид 1псР1 группы ЯР4, ЯР1, 1168.45, рТН 10, рЯР19.6, а также плазмид К.388 и 11245, относящихся к группам несовместимости и N. при конъюгационной передаче от гетерологичных доноров (Р.аеги^поза, Р.рийёа, Е.соЦ). Установлено, что конъюгация наиболее эффективно протекает при 18-часовом скрещивании культур доноров и реципиентов на плотной среде с фиксацией конъюгирующих клеток на мембранных фильтрах при температуре, оптимальной для роста каждого микроорганизма. Частота передачи по основному селективному признаку Тск варьирует от п х 10~8 до 10 5 на клетку донора в зависимости от штамма и плазмиды.

5. Плазмиды Р1 группы несовместимости стабильно наследуются трансконъюгантами Р.рзеш1ота11й и Р.таНеь Экспрессия плазмидных генов опосредует в новых хозяевах резистентность высокого уровня к тетрациклину, канамицину, карбенициллину и относительно низкую, не

достигающую показателей исходных гетерологичных доноров, резистентность к ампициллину.

6. Определены основные условия конъюгации с использованием плазмид Р1 группы несовместимости внутри видов. Отмечено изменение конъюгативных свойств плазмид в клетках патогенных псевдомонад: снижение конъюгативной активности их в P.pseudomallei и повышение на 1-2 порядка (по частоте передачи) в P.mallei, наблюдающееся при последовательной смене гомологичных доноров и реципиентов.

7. У возбудителя мелиоидоза при совместном инкубировании плазмидсодержащих доноров с маркированными по ауксотрофности культурами реципиентов показан, наряду с конъюгационной передачей плазмид, независимый от неё процесс переноса хромосомного материала в естественной трансформации. Последний отличается чувствительностью к ДНКазе и прекращается при добавлении её в смеси скрещивающихся культур в высоких концентрациях.

8. У возбудителей мелиоидоза и сапа разработана техника инсер-ционного мутагенеза с использованием температурочувствительных по репликации плазмид RPl::TnlO Rep ts, RPl::Tn9 Rep ts и "суицидной" плазмиды pSUP5011. Внедрение транспозонов TnlO и Тп9 в хромосому P.pseudomallei достигается при культивировании TcR Тк-клонов на плотной среде в условиях чередования непермиссивной (42°С) и пермис-сивной (32°С) температур. Спектр и частота появления мутаций имеют штаммовые различия и зависимость от Tn-элемента. Векторная плазмида не элиминируется из клеток инсерционных мутантов, проявляя в них вариабельность по TR - Ts - фенотипу и конъюгативности. Инсерции Тп5 индуцируют ограниченный спектр мутаций ауксотрофности в хромосомах обеих псевдомонад. Не обнаружено, что Тп9, Тп 10 и Тп5 опосредуют вторичные геномные перестройки в пределах участков включения.

9. Получен набор индуцированных транспозонами Тп9 и ТпЮ мутантов P.pseudomallei, имеющих измененные питательные потребности десяти различных типов, а также мутантов, недостаточных по подвижности, гемолитической активности и продукции внеклеточных ферментов (протеазы, лецитиназы, липазы). Выделены, основные феногипические классы мутантов с дефектами в генах потенциальных факторов патогенное™ возбудителя мелиоидоза. С помощью транспозона Тп5 получены мутанты возбудителя сапа, утратившие вирулентность с неидентифици-

рованными изменениями в поверхностных структурах клеточной стенки, а также варианты, дефектные по синтезу антигена 8.

10. Разработан оригинальный подход для отбора клонов P.mallei с предполагаемым включением в хромосому плазмид Inc PI группы среди культур, резистентных к фагу PRD1. Выявлена мобилизующая активность интегрированной с хромосомой P.mallei плазмиды рТНЮ в отношении хромосомных генов. Получен и охарактеризован донорный штамм P.mallei Ц-4 Д53, в котором плазмида осуществляет направленный перенос хромосомных генов. Штамм использован для начального картирования участка генома возбудителя сапа, включающего около 20 мутаций ауксотрофности.

11. Обнаружена способность плазмид Inc PI группы к эффективному переносу в P.pseudoraallei и P.mallei неконъюгативных репликонов. С помощью конъюгативных плазмид RP1, рТНЮ, RP1 ::Тп 10 Rep ts в различные штаммы микроорганизмов мобилизованы нетрансмиссивные плазмиды RSF1010 и рекомбинантные ДНК pVAl, pVA4. Установлено совместное наследование клетками возбудителя мелиоидоза мобилизуемой и мобилизующей плазмид в виде изолированных репликонов. Показана эффективная мобилизация в P.mallei собственных критических плазмид возбудителя мелиоидоза рСМ2 и рСМЗ и стабильное поддержание их вместе с конъюгативным вектором без образования коинтегра-тивных структур. Продемонстрированы преимущества метода мобилизации плазмид в клетки P.pseudomallei и P.mallei перед передачей их в трансформации.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Петере М.К., Uli повская Н.П., Меринова J1.K. Изучение возможности конъюгационного переноса плазмиды RP4 от Pseudomonas aeruginosa штаммам Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei // Микробиол, журн. - 1983. - N3. - C.l 1-14.

2. Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А., Меринова Л.К., Сычева Н.М, Использование трансформации для картирования хромосомы Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. - 1983. - N1. -С. 33-36.

3. Тарасова Т.Д., Меринова JI.K. Способ картирования хромосомы возбудителя мелиоидоза с помощью трансформации. Авторское свидетельство на изобретение N 1067821. Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т. 15.9.83.

4. Шиповская Н.П., Меринова Л.К., Ряпис Л.А. Свойства ауксотроф-ных мутантов Pseudomonas mallei II Журн. микробиол. ,эпидемио л., им-мунобиол. - 1983. - N 4. - С.36-39.

5. Авторское свидетельство на изобретение N 193486 / Фарбер С.М., Илюхин В.И., Ефременко В.И., Меринова Л.К. и др. / Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т. 3.10.83.

6. Тарасова Т.Д., Меринова Л.К. Генетическое картирование сцепленных локусов ауксотрофности у Pseudomonas pseudomallei // Молекул, генет., микробиол.,вирусол.-1984.-N1.-С. 37-40. , .

7. Агеева Н.П., Меринова Л.К. Влияние условий скрещивания на эффективность передачи плазмиды RP4 у Pseudomonas mallei // Микробиол. журн. - 1987. - N5. - С.3-6.

8. Авторское свидетельство на изобретение N 255040 / Агеева Н.П., Антонов Ю.В., Меринова Л.К. и др./ Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т. 4.5.87.

9. Сеимова И.К., Меринова Л.К., Петере М.К. Особенности kohv югационной передачи некоторых плазмид Р-1 группы несовместимости штаммам Pseudomonas pseudomallei // Микробиол. журн. - 1988. - N3. -С. 68-71.

10. Авторское свидетельство на изобретение N 255041 / Агеева Н.П., Антонов Ю.В., Меринова Л.К. и др./ Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т. 4.5.87.

11. Агеева Н.П., Меринова Л .К., Петере М.К. Применение плазмиды рТНЮ для получения донорных штаммов Pseudomonas mallei // Молекул., генет., микробиол., вирусол. - 1989. - N4. - С. 14 -18.

12. Сеимова И.К., Меринова Л.К., Варыханова Т.Г. Конъюгацион-ный перенос плазмиды R68.45 между штаммами Pseudomonas pseudomallei // Особо опасн. инф. забол.: иммунол., генет. и биол. свойства возбудителей: Сб. науч. работ. - Волгоград, 1989. - N5. - С. 192196.

13. Меринова Л.К., Сеимова И.К., Анищенко М.А. Применение конъюгативных R-плазмид для мобилизации в штаммы Pseudomonas pse-udomallei плазмиды RSF1010 II Особо опасн. инф. забол.: иммунол., ге-нет. и биол. свойства возбудителей. Сб. науч. работ. - Волгоград, 1989. -вып.5. - С. 150-153.

14. Авторское свидетельство на изобретение N 298237 / Анищенко М.А., Меринова Л.К., Илюхин В.И. и др./ Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т. 3.6.89.

15. Кучеряева В.Т., Анищенко М.А., Меринова Л.К. Трансформационная передача плазмиды RP4 Pseudomonas pseudomallei II Особо опасн. инфекц. заболевания : иммунол, генег. и биол. свойства возбудителей. - Волгоград, 1989. - вып.5. - С. 126 -129.

16. Кучеряева В.Т., Меринова JI.K., Разработка генетической трансформации у возбудителя сапа// Особо опасн. инф. забол.: иммунол., генег. и биол. свойства возбудителей. Сб. науч. работ. - Волгоград, 1989. -вып.5. - С. 143-146.

17. Получение маркированных штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа / Меринова J1.K., Пивень H.H., Замараев B.C. и др. II Особо опасн. инф. забол.: диагн., проф. и биол. свойства возбудителей: Сб. науч.работ. - Волгоград, 1990. - вып.4. - С.57-62.

18. Меринова .Л.К., Сеимова И.К. Конъюгационная передача плазмид Inc Р-1 группы между, штаммами Pseudomonas pseudomallei II Лабораторная диагностика и генет. вирулентности возбудителей особо опасн. инф. - Саратов, 1990. - вып.2 - С. 130-135.

19. Фарбер С.М., Илюхин В.И., Меринова Л.К. Изучение возможности применения гетерологичных вакцин для профлактики мелиоидоза II Актуальные вопросы профил. опасн. инфекц. заболеваний . - Киров, 1991.-С. 74-75.

20. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Выделение и характеристика умеренных фагов Pseudomonas pseudomallei II Генет., микробиол. и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасн. инф.: Сб. науч. работ. -Саратов,1991.-С.131-135.

21. Авторское свидетельство на изобретение N 322767 / Анищенко М.А., Агеева Н.П., Меринова Л.К. и др./ Волгоградский научно-исслед. противочумн. ин-т., 2.1.91.

22. Гришкина Т.Д., Меринова J1.K. Изучение возможности индукции профага под действием физических и химических факторов у Pseudomonas pseudomallei // Генет. и биохим. вирулентности возб. особо опасн. инф.: Матер. Росс, научн. конф. - Волгоград, 1992. - С. 13.

23. Гришкина Т.А., Меринова JI.K. Бактерицидное действие штаммов Pseudomonas pseudomallei на различные виды псевдомонад // ; Генет. и биохим. вирулентности возб. особо опасн. инф.: Матер. Росс, научн. конф. - Волгоград, 1992. - С.187.

24. Меринова Л.К., Сеимова И.К. Мобилизующая способность плазмид Р-1 группы несовместимости в отношении хромосомных генов Pseudomonas pseudomallei // Генет. и биохим. вирулентности возб. особо опасн. инф.: Матер. Росс, научн. конф. - Волгоград, 1992. - С. 44.

25. Сеимова И.К., Меринова Л.К., Тимофеева Е.В. Применение транспозона Тп9 для получения инсерционных мутантов возбудителя . мелиоидоза // Генет. и биохим. вирулентности возб. особо опасн. инф.: . Матер. Росс, научн. конф. - Волгоград, 1992. - С.52.

26. Мфинова J1.K., Сеимова И.К. Транспозиция Тп 5 на хромосому Pseudomonas pseudomallei II Генет. и биохим. вирулентности возб. особо.. опасн. инф.: Матер. Росс, научн.конф.-Волгоград, 1992.-С.43.

27. Анищенко М.А., Меринова JT.K. Мобилизация с помощью плазмид группы несовместимости PI в штаммы Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei потенциальных векторов для клонирования ДНК // Молекул, генет., микробиол., вирусол. -1992. - N 5-6. - С.13-16.

28. Кучеряева В.Т., Вырыханова Т.Г., Меринова Л.К. Генетическая грансформация Pseudomonas pseudomallei пр признаку подвижности // Генет. и биохимия вирулентности возбудителей особо опасн. инф.: Матер.Росс.науч.конф. - Волгоград, 1992.- С. 17-18.

29. Агеева Н.П., Меринова Л.К. Особенности наследования Тп5 клетками Pseudomonas mallei // Генет. и биохимия вирулентности возбу-[щтелей особо опасн. инф.: Матер.Росс.науч.конф. - Волгоград, 1992,- С. 26-27.

30. Гришкина Т.А., Меринова Л.К. Изучение спонтанной фагопро-*укции Pseudomonas pseudomallei и круга "хозяев" медиоидозных фагов зреди представителей рода Pseudomonas // Микробиол. журн. - 1993. -<¡4. - С.43-47.

31. Разработка систем генетического обмена на моделях Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei / Меринова Л.К., Агеева Н.П., Сеимова И.К. и др. // Информ. бюлл. МНС по сан.-зпид. охране территорий РФ. - Саратов,1993. - N2. - С.34.

32. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К., Захарова И.Б. Изучение критических плазмид возбудителя мелиоидоза II Информ. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территорий РФ.-Саратов, 1994. -N3.-С.32.

33. Меринова Л.К., Гришкина Т.А., Каплиев В.И. Изучение явления лизогении в биологии Pseudomonas pseudomallei II Информ. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территорий РФ. - Саратов, 1994. - N3. - С.68-69.

34. Тимофеева Е.В., Меринова Л.К. Использование Tn-элементов в изучении экстраклеточных ферментов возбудителя мелиоидоза II Информ. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территорий РФ. - Саратов, 1994. -N3. - С.35-36.

35. Тришкина Т.А., Меринова Л.К. Метод получения умеренных фагов Pseudomonas pseudomallei в высоком титре // Информ. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территорий РФ. - Саратов, 1994. - N3. - С.36-37.

36. Меринова Л.К., Гришкина Т.А., Тарасова Т.Д., Антонов В.А. Генетика возбудителя мелиоидоза // " Мелиоидоз" под ред. Н.Г.Тихонова. - Волгоград: Нижне-Волжское кн. изд-во. - 1995. - С.26-46.

37. Меринова Л.К., Агеева Н.П. Генетика Pseudomonas mallei II "Сап" по ред. Н.Г.Тихеяюва. - Волгоград: Нижне-Волжское кн. изд-во. - 1995. - С. 30-37.

38. Меринова Л.К., Агеева Н.П., Тимофеева Е.В., Викторов Д.В. Инсерционные мутации i генах, ответственных за патогенные свойства Pseudomonas pseudomallei ь Pseudomonas mallei // "Идеи И.И.Мечникова в развитии современного естествознания" Международн. науч. конф., посвященная 150-легию со дня рождения И.И.Мечникова: Тез.докл. -Харьков, 1995, - С. 201-202.

39. Антонов В.А., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Замараев B.C. Критические ■ плазмиды возбудителя мелиоидоза // "Идеи И.И. Мечникова в развитии современного естествознания" Международн. науч. конф., посвященная 150-летию со дня рождения И.И. Мечникова: Тез.докл. - Харьков, 1995, - С. 9-10.

40. Агеева Н.П., Тимофеева Е.В., Меринова J1.K. Применение транспозонного мутагенеза для изучения генов, ответственных за патогенные свойства Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei II Ин-форм. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территорий РФ. - Саратов, 1995. - N4. - С.68.

41. Транспортная среда для патогенных псевдомонад /Жога JI.K., Илюхин В.И., Самыгин В.М., Меринова JI.K. и др. //Пат. № 2070924 на изобретение. РФ: MnKC12N Чго.

42. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова J1.K. Мобилизация критических плазмид Pseudomonas pseudomallei в гегерологичные виды микроорганизмов И Эколого - эпидемиол. надзор за природно очаговыми инф. в Северном Прикаспии: Сб.науч. трудов. - Астрахань, 1996.-С.99-100.

43. Тимофеева Е.В., Меринова JI.K. Получение инсерционных мутантов возбудителя мелиоидоза, дефектных по продукции экстраклеточных ферментов // Эколого-эпидемиол. надзор за природно очаговыми инф. в Северном Прикаспии: Сб.науч. трудов. - Астрахань, 1996. - С. 104-105.

44. Тимофеева Е.В., Меринова JI.K. Трансформационная передача генов продукции экстраклеточных ферментов возбудителя мелиоидоза // Эколого-эпидемиол. надзор за природно очаговыми инф. в Северном Прикаспии: Сб.науч. трудов. - Астрахань, 1996. - С. 111-112.

45. Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Меринова JI.K., Тимофеева Е.В. Серологическое исследование генетически измененных вариантов мелиоидозных бактерий с помощью МКА // Эколого-эпидемиол. надзор за природно очаговыми инф. в Северном Прикаспии: Сб.науч. трудов. -Астрахань, 1996. - С.149-150.

46. Меринова Л.К., Тимофеева Е.В., Сеимова И.К. Инсерционные мутации в геноме Pseudomonas pseudomallei, индуцированные транспо-зонами ТпЮ, Тп9, Тп5 // Молекул, генет., микробиол., вирусол. - 1997. -N1.-C. 14-17.