Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Патогенные бактерии в почвенных и водных сообществах (экспериментально-экологическое исследование)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ

Р Г 5 ОД

На правах рукописи

ПУШКАРЕВА Валентина Ивановна

ПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ В ПОЧВЕННЫХ И ВОДНЫХ СООБЩЕСТВАХ

(экспериментально-экологическое исследование)

Специальности: 03.00.07 — Микробиология 14.00.30— Эпидемиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-^ 1994

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи РАМН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Е. А. Ведьмина доктор медицинских наук, профессор Н. Н. Костюкова, академик РАМН, доктор медицинских наук,

Ведущая организация — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии ГКСЭН РФ.

на заседании Специ;

Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н .Ф. Гамалеи РАМН, по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан: «¿¡¿о» 1994 г.

профессор В. Д. Беляков

Защита состоится

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук

Е. И. Коптелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Итогом экспериментальных и теоретических разработок последних десятилетий явилось признание факта самостоятельного существования ряда патогенных микроорганизмов в почвах и водоемах, способных служить естественной средой обитания возбудителей сапронозов (Терских, 1958). Тогда на повестку дня встал вопрос о конкретных факторах и механизмах, обеспечивающих существование возбудителей инфекций в так называемой сапрофити-ческой фазе. К таким факторам в почвах и водоемах относят абиотические (температура, влажность, pH, органический состав, содержание солей, микроэлементов) и биотические, включающие микрофлору (бактерии, грибы, дрожжи), микро- и мезофауну (простейшие, черви, членистоногие и др.), а также водоросли и корневую систему высших растений.

Детально и многосторонне изучено воздействие абиотических факторов на существование и популяционную динамику ряда патогенных бактерий - псевдотуберкулезного микроба, кишечных иерсиний, листерий и др. (Сомов и др., '1974, 1979; Варвашевич, 1978; Макси-менкова, 1987; Гершун, 1988 и др.). Известен ряд работ по экологии эризипелотриксов (Головачева, 1966; Белова, 1972), псевдомонад (Беляков, Ряпис, 1988), а также некоторых других возбудителей сапронозных (сапрозоонозных) инфекций.

Внимание к специальному изучению биотических факторов привлечено сравнительно недавно. Пионерскими были работы по взаимодействии легионелл со свободноживущими амебами и инфузориями, а также сине-зеленйки водорослями СAnand е. а., 1983; Fields е.а., 1984; 1986; Fliermans, 1983; Holden е.а., 1984; Rowbotham, 1980; Tison, 1980). В этом цикле констатирован факт совместного существования легионелл со свободноживущими простейшими; на ультраструктурном уровне доказана способность возбудителя размножаться внутри амеб и инфузорий.

Обобщение материалов по экологии многих патогенных бактерий привели к выводу об определяющей роли биотических факторов при их существовании в окружающей среде (Литвин, 1988; 1991).

Вместе с тем остаются невыясненными важные вопросы: круг возможных хозяев возбудителей сапронозов и конкретны© пути их цир-

-г -

куляции в почвенных и водных экосистемах; динамика численности бактериальных популяций в сообществах окружающей среды; вирулентность и изменчивость бактерий при взаимодействии с хозяевами; характер фагоцитоза простейшими и его результат для возбудителя и хозяев.

Все эти моменты в совокупности определяет значение тех или иных обитателей почвы и воды как природных резервуаров патогенных бактерий, а также возможные пути передачи возбудителей, что обеспечивает их устойчивое существование в почвенных и водных сообществах. В отличие от наземных экосистем, где традиционно изучались природные хозяева и закономерности циркуляции возбудителей при-родкоочаговых болезней человека, почвенные и водные экосистемы как компоненты природных очагов инфекций практически не изучены.

Цель работы - экспериментальное изучение закономерностей существования различных патогенных бактерий в почвенных и водных биоценозах, а также факторов И механизмов, обеспечивающих эти закономерности.

Основные задачи:

1. Разработать методические подходы для анализа взаимодействий патогенных бактерий с простейшими и другими гидробионтами на популяционном, клеточном и ультраструктурном уровнях.

2. Оценить динамику численности иерсиний, псевдомонад, лис-терий, зризипелотриксов, стафилококков в ассоциации с простейшими.

3. Определить характер, ультраструктурные механизмы и исход взаимодействия грамотрицательных и грамлоложительных бактерий с организмом инфузорий.

4. Выявить биотические факторы, способные поддерживать вирулентность возбудителя при обитании в почве и воде.

5. Изучить возможную изменчивость основных свойств патогенных бактерий в 'ходе взаимодействия с простейшими.

6. Экспериментально установить круг потенциальных хозяев патогенных иерсиний в водных экосистемах среди различных животных -обитателей планктона, бентоса и нектона; определить динамику численности возбудителя в ассоциации с различными гидробионтами.

7. Проверить в условиях эксперимента возможность миграции иерсиний по основным трофическим цепям водкой экосистемы с учао-

тием различных гидробионтов.

8. На математических моделях оценить динамику заражения гидробионтов в процессе передачи иерсиний и концентрацию возбудителя на разных уровнях трофической пирамиды.

Научная новизна

Анализ взаимодействий различных патогенных бактерий (иерсиний, псевдомонад, листерий, зризипелотриксов,- стафилококков) с инфузориями на популяционном, клеточном и ультраструктурном уровнях позволил впервые оценить численность, гетерогенность и изменчивость бактериальной популяции в ассоциации с проетейшими.

Выявлены новые закономерности внутриклеточного паразитизма ряда патогенных бактерий в организме простейших: селекция устойчивых к перевариванию микробных клеток, незавершенность фагоцитоза, Л - трансформация бактерий. Установлена аналогия процессоз фагоцитоза иерсиний в эволюционно отдаленных эукариотических клетках - простейших и макрофагах млекопитающих.

Впервые показано усиление одного из важных факторов вирулентности - устойчивости к фагоцитозу - в процессе пассирования иерсиний, листерий и псевдомонад как через инфузорий, так и через макрофаги млекопитающих.

Впервые выявлена изменчивость ряда фенотипических признаков (морфологических и культуральных свойств, биохимической активности, цитопатогенности) у иерсиний, псевдомонад, листерий, зризипелотриксов, стафилококков в результате взаимодействия с простейшими.

В результате экспериментальных исследований выявлен широкий круг неизвестных ранее потенциальных хозяев псевдотуберкулезного микроба (простейшие, низшие ракообразные, черви, моллюски, личинки насекомых, рыбы, водные растения) и' впервые оценена динамика численности возбудителя в ассоциации с данными гидробионтами.

Впервые экспериментально доказана возможность миграции возбудителя по различным трофическим цепям водного сообщества - от простейших до рыб; в математических моделях оценены динамика заражения гидробионтов и вероятные концентрации иерсиний на разных трофических уровнях сообщества.

Сформулирована и экспериментально обоснована оригинальная гипотеза клонально-селекционного механизма, обеспечивающего под-

- Ч -

держание численности и вирулентности патогенных бактерий в почвенных и водных сообществах.

Практическая значимость

Методы и результаты исследований автора нашли применение в работе Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" С г. Саратов) и научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (г. Иркутск).

Разработки, представленные в диссертации, оформлены в виде следующих методических рекомендаций:

1. "Анализ взаимодействий патогенных бактерий с инфузориями на популяционном, клеточном и ультраструктурном уровнях" Сутверждены Федеральным управлением медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве РФ).

2. "Изучение гидробионтов как потенциальных хозяев возбудителей инфекций" (утверждены Федеральным управлением медико-биологических и экстремальных проблем при Минздраве РФ).

Отработан экспресс-метод оценки общей цитотоксичности микроорганизмов, веществ, соединений с использованием аксенической культуры инфузорий для первичного скрининга их биологической безопасности.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на объединенном пленуме Проблемных комиссий "Природноочаговые болезни человека", "Медицинская микробиология", "'Научные основы дальнейшего снижения и ликвидации заболеваемости инфекционными болезнями", посвященном экологии возбудителей сапронозов (Новороссийск, 1988), на XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней (Новосибирск, 1989), У1 Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Н-Новгород, 1991), Юбилейной научно-практической конференции НИИЗМ им. Пастера (С-Петер-бург, 1993). Фрагменты работы отмечены премиями на конкурсах научных работ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (1989, 1991 г.г.).

Диссертация апробирована на совместной конференции отдела природноочаговых инфекций, отдела медицинской микробиологии и отдела эпидемиологии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН 26 мая 1994 г. (протокол .48),

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 работа

(см. список).

Структура и объем диссертации. Диссертация написана в монографическом стиле и включает: введение, 6 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключение и выводы. Список литературы содержит 217 наименований отечественных и зарубежных работ. Диссертация изложена на 210 страницах машинописного текста и иллюстрирована 13.таблицами, 80 рисунками и фотографиями.

Основные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором. Исследования по отдельным разделам работы проводились в комплексе с лабораторией анатомии микроорганизмов (руководитель - д. б.н. В.Л.Попов, старший научный сотрудник к. б. н. Н.Д. Константинова) и лабораторией эпидемиологической кибернетики (руководитель - д. т.н. Б. В. Боев) НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.

I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Культивирование микроорганизмов

- иеосинии (Yersinia pseudotuberculosis, штаммы 623 и 2160 (серогруппа I); Y.enterocolitica, штамм 79В (серовар 09) - на среде Хоттингера; Y.pseudotuberculosis (RifR - мутанты) - на высокоселективной среде с рифампицином (100 мкг/мл);

- псевдомонады (Pseudomonas cepacia, P. aeruginosa, P.putida, P.fluorescens, P.pickettii) - на Cetrimide agar ("Serva") с глицерином - среде, оптимальной для продукции пигмента;

- листерии (Listeria monocytogenes, авирулентный штамм, L.monocytogenes, вирулентный штамм EGD) - на мясо-пептонном агарэ и агаризованной почвенной вытяжке;

- эризипелотриксы (Erysipelothrix rhusiopathiae, штаммы 50 и 124) - на мясо-пептонном агаре;

- стафилококки (Staphylococcus xylosus, сапрофитический, S.aureus, патогенный, штамм Wood-46) - на мясо-пептонном агаре.

Инкубации посевов проводили при температурах 4, 20, 37°С.

Идентификация микроорганизмов

Идентификацию бактерий и оценку их ферментативной активности проводили с помйщью индикаторных API-систем 20Е, 20NE, 'Staph CERCI - Франция), а также отечественных тест-систем MMT-EI (НПО "Аллерген", г. Ставрополь). При постановке тестов руководствова-

лись инструкциями, разработанными для каждой тест-системы. Для определения микробного пейзажа гидробионтов, почв и воды делали высевы на селективные среды: SS-, MRS-, Biggt-, Cetrimide-, Enterococcus agar Thioglycollate Medium, Saburo-, Candida-, RAT-Agar ("Serva") с последующим использованием указанных тест-систем идентификации бактерий.

Морфологические и культуральные свойства бактерий оценивали общепринятыми критериями и методами: анализ морфологии колоний на плотных питательных средах; микроскопия фиксированных мазков, окрашенных по Граму и Гимза; оценка скорости и характера роста колоний на плотных питательных средах.

Культивирование и заражение инфузорий. Аксеническую культуру Tetrahymena pyriformis (штамм GL) поддерживали на 0,3^ сердечно-мозговом бульоне (BHI, "Difco"), пересевая 1 раз в неделю в соотношении 0,1 мл культуры на 10,0 мл среды, инкубировали при 25°С. Заражение инфузорий бактериями проводили во флаконах со стерильными или нестерильными субстратами (прудовая вода, почвенная вытяжка); микробная нагрузка варьировала, в зависимости от условий опыта, от 101 до 10^ мко на 1 инфузорию. Изоляты из опытных образцов высевали на плотные питательные среды;' подсчет бактерий проводили по КОЕ (колоние-образуюаие единицы) с последующим пересчетом на 1 мл (г) субстрата. Параллельно в камере Горяева подсчитывали численность инфузорйй по формуле, принятой для эукариотных клеток.

Люминесцентная и фазово-контрастная микроскопия проведена на микроскопе ЛЮМАМ-И2, после витальной окраски инфузорий акридиновым оранжевым (2 мкг/мл), инкубации в течение 30 минут при 25°С и заражения бактериями.

Электронно-микроскопические исследования в динамике (от 5 мин до 24 час) осуществляли после многоэтапной подготовки каждого образца: отмывки зараженных инфузорий от внеклеточных бактерий на фильтрах "Millipore" (диаметр пор 5 мкм) холодным (4°С) 0,2н как-кодиллатным буфером (рН 7,2) с последующей фиксацией 4у. глутаро-вым альдегидом и IV. тетроксидом осмия; проводки в спиртах и заливки в смолы. Просматривали препараты на микроскопе JEM-100B (Япония) при инструментальных увеличениях от хЗООО до 50000, проводя выборочную фоторегистрацию. , , '

Культивирование и заражение гидробионтов

Низшие ракообразные: дафний (Daphnia magna) заселяли в аквариумы с прудовой водой, подкармливая одноклеточными водорослями и Х'л суспензией дрожжей 1 раз в сутки. Циклопов (Acanthocyclops viridis) кормили инфузориями. Опыты проводили в естественной воде, рачков заражали генетически маркированными (RiA штаммами иерси-ний - либо прямым способом - внесением бактерий в воду (10® мко/ мл), либо кормлением рачков инфузориями, фагоцитировавшими иерсиний.

Свободноживучше плоские черви - планарии (Dugesia tigrina) тали в воде с грунтом, поедая личинок хирономид (мотыль) 1 раз в неделю. Заражали червей внесением иерсиний в воду (10® мко/мл) или кормлением зараженным "мотылем".

Кольчатые черви (Enchytraeus albidus) содержались в кюветах с парниковой почвой; кормили их смесью, состоящей из 5 частей молока, 1 части дрожжей и 1 части муки, 2 раза в неделю. Черви получали бактерий вместе с кормом (10® мко/мл).

Брюхоногие моллюски (Viviparus viviparus и Planorbis corne-US) содержались в воде с песчаным грунтом. Кормили моллюсков дафниями, салатом, экскрементами рыб. Заражение иерсиниями проводили через воду (10 мко/мл).

Личинки двукрылых насекомых (Chironomus pluraosus) - "мотыль" культивировали в кюветах с илом при 10°С. Кормили хирономид 1% суспензией дрожжей 2 раза в неделю. Заражали личинок, внося культуру иерсиний (10® мко/мл) вместе с кормом в субстрат.

Аквариумные рыбы - гуппи (Lebistes reticulatus) - модель, репрезентативная для промысловых рыб. Заражали рыб двумя способами: через воду аквариума и через предварительно инфицированный корм (дафнии, циклопы, мотыль). Бактериологическому исследованию подвергали жабры и кишечник рыб.

Водные растения - элодею (Elodea canadensis) заражали в специальных сосудах, вводя бактериальную суспензию (10® мко/мл) в воду, в область корневой системы. Стебли и листья находились в другом сосуде, чтобы исключалась их наружная контаминация псевдотуберкулезным микробом. -

Бактериологические исследования во всех экспериментах проводили по единой схеме, описанной выше.

Объем экспериментальных исследований

В работе использовали 16 штаммов бактерий - представителей 4 семейств; 10 монокультур различных гидробионтов (от простейших до рыб). Поставлено 134 опыта (схемы приведены в диссертации), в том числе 4 опыта по воспроизведению трофических цепей с участием патогенных иерсиний в почве и воде. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрических критериев (Гублер, Генкин, 1974).

2. МЕЖПОПУЛЯЦИОННЬЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИИ С ИНФУЗОРИЯМИ

Свободноживущие простейшие - обязательный -компонент -почвенных и водных экосистем. Как сапрофитические, так и патогенные бактерии служат обычной пищей для амеб и инфузорий. Принято считать, что отношения между ними строятся исключительно по типу "хищник - жертва" - с однозначным исходом для бактерий, которые утилизируются простейшими.

Исходя из фактов сохранения легионелл в простейших (Anand е. а., 1983; Fields е.а., 1984 и др.), мы провели первую серию экспериментов по оценке динамики численности различных патогенных бактерий в ассоциации со свободноживущими инфузориями Tetrahymena pyriformis, аксенические (безмикробные) культуры которых гарантировали необходимую "чистоту" опытов.

2.1. Псевдотуберкулезкый микроб

При культивировании Y.pseudotuberculosis на сердечно-мозговом бульоне отмечали значительное накопление иерсиний, находящихся в сообществе с инфузориями - до 10 КОЕ/мл (в течение 7 суток), затем их число возвращалось к исходному уровню (10s КОЕ/мл) и в течение 20 суток оставалось постоянным (рис. 1). В контрольном образце (без инфузорий) динамика численности псевдотуберкулезного микроба была сходной.

Численность тетрахимен также изменялась: в первый месяц темпы размножения и отмирания были примерно одинаковы, однако в более поздние сроки концентрация инфузорий значительно снизилась СЮ2 - 5' 10* особей/мл).

1д КОЕ/мп

9 10 11 12 13 14

недели

Рис. 1 Динамика численности псевдотуберкулезного микроба в ассоциации с инфузориями на протяжении 14-ти недель (стерильная среда ВН1, 25°С).

1 - иерсинии из ассоциации с инфузориями;

2 - иерсинии из среды (контроль);

3 - инфузории С кснтрс.ть).

Совсем иной характер взаимодействия наблюдался в нестерильной почвенной вытяжке С иловато-болотная почва). По физико-химической характеристике данная почва является весьма благоприятной для существования различных бактерий (Максименкова, 1987). Общее микробное число использованной в опытах почвы составляло 10® КОЕ/ г; микробное сообщество было представлено широким спектром энте-робактерий (Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Serratia, Vibrio, Aeromcnas), неферментирующими грамотрицательными палочками, кокками, а также грибами, актиномицетами, дрожжеподобными клетками.

При оптимальной для иерсиний и тетрахимен температуре (25°С) через сутки отметили некоторый подъем численности (10®) иерсиний в ассоциации с инфузориями, после чего их концентрация снизилась: к 3 суткам до 105 КОЕ/мл, к 18 суткам - до 103 КОЕ/мл. В отсутствие тетрахимен (контрольный образец) отмечали быстрое снижение концентрации псевдотуберкулезного микроба на протяжении 9 суток; при последующих высевах (в течение 5 недель) вырастало всего от 1 до 50 колоний на всей поверхности агара, что соответствует концентрации 101 КОЕ/мл. Через 6 недель в ассоциации с инфузориями иерсинии сохранялись на уровне 10^ КОЕ/мл, тогда как из контрольных образцов иерсинии не высевались, либо вырастали единичные колонии (рис. 2).

Что касается инфузорий, то при температуре 25°С число активных форм оставалось неизменным (104 особей/мл) на протяжении 6 недель; при низкой температуре (4°С) их численность была на порядок ниже.

2.2. Кишечные иерсиний

При культивировании в стерильных субстратах (сердечно-мозго-еой бульон, почвенная вытяжка) кишечных иерсиний в сообществе с инфузориями выявлен сходный тип динамики численности, так что кривые обоих опытов практически накладывались друг на друга, концентрация иерсиний составляла через 30 суток 10 -104 КОЕ/мл соответственно.

В контрольном образце (без инфузорий) динамика численности кишечных иерсиний описывалась кривой, характерной для роста бактериальной популяции на питательной среде.

1д КОЕ Сособей)/мл

недели

*

Рис. 2. Динамика численности псевдотуберкулазного микроба в ассоциации с инфузориями Снестерильная почвенная вытяжка, 25° С) за 7 недель.

1 - иврсинии из ассоциации с инфузориями;

2 - иерсинии из среды (контроль);

3 - инфузории (контроль).

2. 3. Псевдомонадьг

Межлопуляционные взаимодействия псевдомонад пяти видов (Pseudomonas aeruginosa, P.cepacia, P.pulida, P.fluorescens, P.pickettii) с инфузориями изучали в сердечно-мозговом бульоне при 25°С. Графики динамики их численности в сообществе с инфузориями однотипны: они иллюстрируют устойчивое сосуществование псевдомонад и инфузорий в течение срока наблюдений (9 суток). Вместе с тем численность P. putida, P. fluorescens, P.pickettii в ассоциации с тетрахименами снижалась несколько быстрее: через 7 суток до 101 КОЕ/мл, в контроле - 10Б КОЕ/мл, тогда как концентрации P. aeruginosa и P. cepacia в этот срок составляли соответственно 102 и 104 КОЕ/мл, а в контроле - 106-107 КОЕ/мл.

Таким образом, мы не наблюдали полной утилизации псевдомонад тетрахименами, несмотря на постепенное снижение их численности в сообществе с простейшими. Темпы размножения изученных псевдомонад были, очевидно, достаточно высоки, чтобы компенсировать выедание простейшими, что позволяло бактериальным популяциям сохраняться в ассоциации с инфузориями в течение всего срока наблюдений (9 суток).

2. 4. Дистерии

Взаимодействие авирулентного штамма Listeria monocytogenes (выделен из силоса) с инфузориями (10 особей/мл) продолжалось в течение 60 суток (срок наблюдений); численность листерий составляла 10* КОЕ/мл. Результаты экспериментов в стерильной прудовой воде и почвенной вытяжке совпадали.

Вирулентные листерии (штамм EGD) также длительно существовали в ассоциации с инфузориями: в первые сутки отмечен рост численности обеих популяций, затем - медленное падение концентрации бактерий и инфузорий и к 45 суткам (срок наблюдений) она составляла соответственно 102 КОЕ/мл и 10* особей/мл.

2. S. Эриэипелотриксы

В этих опытах сохранялись закономерности популяционной дина-

мики, отмеченные для иерсиний, псевдомонад и листерий. В несте-

рильной почвенной вытяжке без простейших (контроль) уже через 3

суток эриэипелотриксы не обнаруживались (рис. 3), очевидно подав-

1д КОЕ Сособей)/мл

. 1

6

8

»- 3

- 2 - 1

10 12 14 сутки

Рис. 3 Динамика численности эриэипелотриксов в ассоциации

с инфузориями (нестерильная почвенная вытяжка, 4° С).

1•- эриэипелотриксы из ассоциации с инфузориями;

2 - эриэипелотриксы из среды (контроль);

3 - инфузории из ассоциации с зризипелотриксами.

ляясь микробным сообществом. В ассоциации с инфузориями бактерии поддерживались в низкой концентрации СЮ1 КОЕ/мл) в течение 15 суток Серок наблюдений).

2.6. Стафилококки

Сапрофитические стафилококки CS. xylosus), выделенные из почвы, и патогенные S.aureus при культивировании в ассоциации с инфузориями Ссердечно-мозговой бульон) утилизировались тетрахимена-ми в течение 1-7 суток (рис. 4). Численность простейших при этом резко возрастала - до 10 особей/мл. ■

Обобщая результаты этих экспериментов, можно утверждать, что популяционная динамика различных патогенных бактерий Скак грамот-рицательных, так и грамположительных) - представителей семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Corynebacteriaceae в ассоциации со свободноживущими инфузориями Т. pyriformis имеет принципиально общие закономерности. Иерсинии, псевдомонады, листерии, эризипелотриксы длительно и стабильно существуют в сообществе с инфузориями, и их отношения не сводятся, как принято считать, к простому выеданию бактерий простейшими, имея симбиотическую Св широком смысле) природу. Исход этих взаимодействий неоднозначен и в конечном счете благоприятен для бактериальной популяции, существование которой поддерживается простейшими.

Этот феномен ярко проявляется в нестерильных субстратах С почве, воде), где в отсутствие простейших бактериальная популяция интенсивно элиминируется, очевидно, подавляясь микробным сообществом, тогда как в ассоциации с инфузориями наблюдается устойчивое существование возбудителей в течение длительного времени.

Характер взаимодействий стафилококков с инфузориями носил принципиально иной характер. S. xylosus и S. aureus быстро и полностью утилизировались простейшими. Это может служить одной из причин, по которым они не являются обычными обитателями почв и водоемов, редко обнаруживаясь в микробных ассоциациях.

В ходе длительного взаимодействия с инфузориями отмечена изменчивость ряда признаков у иерсиний, листерий и зризипелотрик-сов. Наблюдали выраженный гетероморфизм бактериальных клеток; имело место замедление роста колоний на плотных питательных средах С до 72 часов); у иерсиний и листерий происходила S-R

lg КОЕ Сособей)/ыя

сутки

Рис. 4 • Динамика численности патогенных стафилококков (St. aureus) s ассоциации с инфузориями,

1 - стафилококки из ассоциации с инфузориями;

2 - стафилококки из среды (контроль);

3 - инфузории из ассоциации со стафилококками.

диссоциация колоний.

Цитопатическое действие изолятов на интактные клетки инфузорий усиливалось в ранние сроки взаимодействия, в дальнейшем вновь ослабевая.

Особенно заметно изменялась скорость биохимических реакций: после взаимодействия иерсиний с инфузориями реакции ускорялись в 4-6 раз. Ферментативная активность листерий Савирулентных, вирулентных) и эризипелотриксов также изменялась при длительных взаимодействиях с инфузориями: в ранние сроки она усиливалась, в поздние (45 суток) бактерии теряли способность к утилизации Сахаров (табл. 1). В эти же сроки окраска листерий по Граму смещалась в сторону красного спектра.

Описанная изменчивость бактерий в ассоциации с простейшими обратима и, видимо, имеет адаптивную природу, свидетельствуя о высокой экологической пластичности иерсиний, листерий и эризипелотриксов при смене условий существования.

3. КЛЕТОЧНЫЕ И УЛЬТРАСТРУКТУРНЬЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИИ С ИНФУЗОРИЯМИ

Закономерности межпопуляционных взаимодействий патогенных бактерий и инфузорий являются интегрированным результатом отношений партнеров на уровне отдельных особей. .Именно здесь кроются причины и механизмы поддержания простейшими бактериальных популяций.

Характер таких взаимоотношений изучали фазово-контрастной, люминесцентной микроскопией с применением витального красителя акридинового оранжевого, а также электронной микроскопией' (по единой схеме) в динамике: анализировали разные стадии взаимодействия бактерий с клеткой-хозяином - в сроки от 5 минут до суток.

Активный фагоцитоз изученных грамположительных и грамотрица-тельных бактерий начинался в первые минуты контакта с инфузориями. При этом тетрахимены увеличивались в размерах в 2-3 раза по сравнению с исходной культурой за счет формирования большого числа пищеварительных вакуолей (фагосом), заполненных бактериями. У отдельных особей их насчитывали до 30-40. В более поздние сроки (6-24 часа) появлялись разрушенные клетки инфузорий.

Таблица 1

Изменение биохимических свойств вирулентных листерий (штамм ЕСО) в разные сроки взаимодействия с инфузориями

Тесты Исходная Изоляты в разные сроки (сутки)

культура 1 7 45

Активность каталазы + + + +

Наличие:

Лизиндекарбо-ксилйЪы + + + -

Орнитиндекар-боксилазы + + + -

Гидролиз эскулина + + - -

Утилизация:

Глюкозы + + + +

Лактозы + + - -

Сахарозы + + + -

Мальтозы + + - -

Рамнозы + + + -

Фруктозы + + + +

Сорбита + + + -

Дульцита + + + -

Маннита + - - -

Малоната

натрия

± - слабая реакция

Более детально судьба патогенных бактерий в инфузориях была проанализирована при электронно-микроскопических исследованиях в динамике.

Закономерности внутриклеточного паразитизма патогенных бактерий в инфузориях

Иерсинии ухе через 5 минут после заглатывания инфузориями подвергались начальной стадий деструкции (уплотнение цитоплазмы, изменение формы клеток, концентрация лизосомоподобных гранул во-

круг фагосом), что свидетельствует о начале процесса переваривания.

Через 1-6 часов фагосомы содержали бактерий в разной степени сохранности: полностью переваренные клетки с остатками в фагосо-мах лишь концентрических мембран; бактерии с разрушенной или отсутствующей клеточной стенкой; наконец, морфологически неизменные иерсинии, в том числе делящиеся клетки.

Через 24 часа взаимодействия сами инфузории претерпевали значительные изменения: отмечали лизис эндоплазмы, нарушение структуры митохондрий и других органелл. Для многих тетрахимен последствия были необратимы - клетки погибали.

Таким образом, установлены 3 основных варианта исхода взаимодействий иерсиний с простейшими: переваривание бактерий; образование сферопластов и протопластов; сохранение и размножение иерсиний в фагосомах.

Псевдомонады (Pseudomonas cepacia) в первые часы взаимодействия подвергались деструктивным изменениям по аналогии с иерсини-ями. Однако обращают на себя внимание необычные фагосомы, которые формировались за счет слияния нескольких пищеварительных вакуолей, превращаясь через 6 часов в гигантскую фагосому, заполнявшую всю клетку-хозяина. Характерны изменения макронуклеуса инфузорий: увеличение в размерах, дольчатое строение с выростами вглубь эндоплазмы.

Результатом внутриклеточных событий стала дифференциация псевдомонад в инфузориях на те же 3 категории: быстро размножающиеся, устойчивые к фагоцитозу клетки; особи сферопластного и протопластного типа и утилизированные бактерии. Сами инфузории в большинстве своем погибали.

Листерии - как авирулентные, так и вирулентные - в процесс© длительного взаимодействия с инфузориями (до 24-48 часов) проходили стадии деструкции, характерные для грамотрицательных бактерий (см. выше), а отдельные бактериальные клетки сохранялись.

В ранние сроки бактерии не претерпевали значительных изменений в фагосомах; через 3 часа и более нарастало число переваренных или необратимо деструктированных клеток. В поздние сроки - на фоне множества разрушенных инфузорий отмечены особи, содержащие бактерий различной степени сохранности, в том числе и неповреж-

денных. Таким образом, и у листерий констатирован незавершенный характер фагоцитоза инфузориями, свойственный как авирулентным, так и вирулентным штаммам.

Эризипелотриксы в первые часы взаимодействия с инфузориями вызывали низкую фагоцитирующую активность простейших: клетки -хозяева содержали единичные фагосомы, заполненные бактериями на разных стадиях деструкции (лизис клеточной стенки, уплотнение цитоплазмы и др.). Через 8-24 часа взаимодействия отмечен лизис многих бактерий, в то же время отдельные клетки без признаков деструкции свободно располагались в фагосомах инфузорий.

Очевидно, что процесс фагоцитоза шел по иному сценарию, однако исход взаимодействия в целом был благоприятным для эризипе-лотриксов.

Стафилококки CS.xylosus, S.aureus) демонстрировали принципиально иной тип взаимодействия с инфузориями. На ранней стадии С15 минут) фагосомы содержали сотни кокков, часть которых уже утилизировалась путем лизиса цитоплазмы. Через 3 часа зарегистрированы примерно те же процессы, однако сами фагосомы значительно уменьшились в размерах. В более поздние сроки С9-24-48 часов) фагосомы содержали остатки множества утилизированных стафилококков. Описанные процессы протекали сходным образом как у сапрофитичес-ких, так и у патогенных стафилококков. Таким образом, несмотря на сохранность единичных кокков в первые часы взаимодействия с тет-рахименами, бактериальная масса все же полностью утилизировалась. Сами инфузории не имели выраженных патологических изменений.

Сравнение иерсиний и псевдомонад с грамположительными бактериями Слистериями, эризипелотриксами) выявило принципиальное сходство ультраструктурных механизмов их взаимодействия с инфузориями, хотя процесс фагоцитоза в каждом случае имел свои особенности. Наиболее важная закономерность внутриклеточного паразитизма данных бактерий - сохранение и размножение устойчивых к перевариванию микробных клеток на фоне утилизации большого числа бактерий, что определяет незавершенный характер фагоцитоза. Напротив, стафилококки, в том числе патогенные, демонстрируют завершенный характер фагоцитоза, полностью перевариваясь простейшими.

Анализируя результаты ультраструктурных изменений патогенных бактерий в ходе их взаимодействия с простейшими, нетрудно заме-

тить принципиальное сходство с процессами, протекающими при .заражении "профессиональных" фагоцитов млекопитающих.

При изучении псевдотуберкулезного и чумного микробов рядом авторов (Кириллова, Тимченко, 1984; Барбул и др., 1987; Исачкова и др. , 1993; Васильева и др., 1990) в опытах in vitro и in vivo установлена гетерогенность иерсиний по устойчивости к фагоцитозу макрофагами. Бактерии, как и в наших исследованиях, были представлены тремя категориями: переваренные, L-трансформированные и неповрежденные (покинувшие макрофаги), так что фагоцитоз оставался незавершенным. Те же закономерности выявлены при взаимодействии с фагоцитами псевдомонад и листерий (Bishop е.а., 1987; VelijanoY е-а., 1992; Karunasagar, 1993). Аналогия внутриклеточного паразитизма легионелл в амебах и макрофагах отмечена C.Richmond (1985).

В отличие от факультативных внутриклеточных паразитов, стафилококки считаются "внеклеточными" бактериями и легко утилизируются различными фагоцитирующими клетками (Hahn, 1983). Наши исследования на инфузориях и в этом случае выявили аналогию характера и исхода фагоцитоза стафилококков простейшими и "профессиональными" фагоцитами.

Можно заключить, что для патогенных бактерий различные клетки, способные к фагоцитозу (от простейших до фагоцитов млекопитающих), принципиально сходны как хозяева: чтобы противостоять перевариванию, бактерии должны обладать определенной устойчивостью к фагоцитозу - одним из важных факторов вирулентности.

Итак, принципиальный вывод, вытекающий из данного цикла исследований - наличие в бактериальных популяциях микробных клеток, различающихся по устойчивости к фагоцитозу простейшими. Иерсинии, псевдомонады, л'истерии, эризипелотриксы в процессе взаимодействия с организмом инфузорий дифференцируются на три категории: большинство бактерий переваривается в фагосомах, другая часть подвергается JI-трансформации, и, что особенно важно, отдельные клетки сохраняются и способны к размножению. Этот механизм, очевидно, и обеспечивает поддержание численности бактериальной популяции в сообществе с хищными простейшими: устойчивые к фагоцитозу бактерии, размножаясь и выходя из погибших хозяев, компенсируют "выедание" хищниками в почве и воде.

4. КЯОНАЛЬНО-СЕЛЕКЦИОНКЬИ МЕХАНИЗМ ПОДДЕРЖАНИЯ ВИРУЛЕНТНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ В АССОЦИАЦИИ С ПРОСТЕРШИМИ

Для проверки предположения, что устойчивые к фагоцитозу простейшими бактериальные клетки могут накапливаться в популяции возбудителя, поставлено несколько серий опытов по пассированию иерсиний, листерий и псевдомонад через аксеническую культуру инфузорий.

Иерсинии. Первичное заражение инфузорий кишечными иерсиниями и псовдотуберкулезным микробом (штамм 623) вызывало гибель небольшого числа простейших (3-650. На втором пассаже (через сутки после подселения к интактным инфузориям особей, фагоцитировавших бактерий) доля тетрахимен с цитопатическими изменениями или вовсе разрушенных существенно возросла (10-4050. Третий пассаж вызвал дальнейший рост гибели инфузорий (30-955<) - см. рис. S.

Несколько иная картина наблюдалась в экспериментах с использованием другого штамма псевдотуберкулезного микроба (2160), отличающегося весьма высокой исходной вирулентностью. Уже при первичном заражении поврежденными оказались 70V. тетрахимен, однако при дальнейшем пассировании также имело место усиление цитопати-ческого действия (гибель 9054 клеток).

Листерии. Авирулентный штамм L.monocytogenes не оказывал видимого цитопатического действия на инфузорий ни при первичном заражении, ни при дальнейшем пассировании. В противоположность ему вирулентный штамм (EGD) оказывал выраженный цитопатический эффект после третьего пассажа (около 9054 разрушенных клеток).

Псевдомонады. В процессе пассирования P.cepacia через аксеническую культуру инфузорий также было отмечено нарастание цитопатического действия, хотя и не столь ярко выраженное, как у иерсиний и листерий. Средние показатели гибели инфузорий при первичном заражении составляли 305i, на втором пассаже - 40%, на третьем - 50'/..

Чтобы проверить, имеет ли место подобная закономерность при взаимодействии с "профессиональными" фагоцитами, проведены'параллельные опыты по пассированию кишечных иерсиний на перитонеальных макрофагах морских свинок и мышей. Цитопатическое действие иереи- • ний на клетки также усиливалось при пассажах, однако эффект был

Гибель инфузорий (макрофагов), X

//_____96,0 ± 3,0.

//

100,0

.95,0 ± 3,1

'W////

WW//.

, ш

ущШ.

у

пассаж

макрофаги

инфузории

Рис. 6 Усиление цитопатического действия Yersinia enteroco-litica в процессе пассирования на инфузориях к макрофагах.

более значительным Срис. 5). Очевидно, что как в одном, так и в другом случае происходит нарастание вирулентности бактериальной популяции по одному из важнейших факторов - устойчивости к фагоцитозу.

Известно (Васильева, 1992), что "остаточная" вирулентность вакцинного штамма чумного микроба также повышается при пассажах через макрофаги млекопитающих.

Результаты экспериментов этого и предыдущего разделов служат основой рабочей гипотезы о механизме изменения основных популяци-онных характеристик патогенных бактерий - численности, гетерогенности и изменчивости - при обитании в почвенных и,водных сообществах.

По-видимому, в гетерогенной по вирулентности' бактериальной популяции при интенсивном пассировании через простейших (и, возможно, других гидробионтов) происходит дифференциация авирулент-ных и вирулентных (устойчивых к фагоцитозу) клонов, причем последние получают селективное преимущество, накапливаясь в популяции и приводя к возрастанию общего уровня ее вирулентности.

Эти процессы, трудно воспроизводимые в экспериментах, были проверены расчетами на математической модели (Боев и др., 1991), которые убедительно демонстрируют, как в условиях непрерывного взаимодействия иерсиний и инфузорий возрастает доля вирулентных особей в гетерогенной популяции возбудителя на фоне увеличения общей численности бактерий.

Подобные сдвиги гетерогенности бактериальной популяции по признаку устойчивости к фагоцитозу, которые могут иметь противоположную направленность в организме простейших и в почве (воде) укладываются в рамки известной концепции о направленной самоперестройке бактериальной популяции,"сформулированной В.Д.Беляковым с соавторами (1985, 1987) применительно к циркуляции возбудителей среди людей и теплокровных животных.

Экологический смысл поддержания и повышения в определенных условиях вирулентности бактериальной популяции заключен в том, что устойчивость к фагоцитозу служит надежным орудием защиты бактерий от хищников, обеспечивая возможность существования возбудителей сапронозов в естественных сообществах почв и водоемов.

Следствием повышения вирулентности бактерий при одновремен-.

ном возрастании их численности Спри массовом размножении простейших или других хозяев) может быть формирование "эпидемических вариантов" возбудителей сапронозных инфекций в почвах и водоемах.

Гипотеза клонально-селекционного механизма поддержания вирулентности бактерий в процессе взаимодействия с хозяевами в почвенных и водных сообществах, несомненно, нуждается в дальнейшей проверке экспериментальными и полевыми исследованиями, которые, можно надеяться, она будет стимулировать.

5. ШРОБИОНТЫ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ХОЗЯЕВА ИЕРСИНИИ И ДРУГИХ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИИ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ

5.1. Спонтанная зараженность некоторых гидробионтов потенциально патогенными бактериями

Изучен микробный пейзаж водной среды и некоторых гидробионтов. Забор образцов Сиз озера Неро, прудов и отстойников полей орошения) проводили весной и осенью, когда концентрация бактерий в 1 мл воды колебалась от 10® до 10 КОЕ.

Микрофлора всех проб была представлена основными родами семейства энтеробактерий, среди которых чаще всего встречались клебсиеллы, знтеробактеры, цитробактеры, гафнии, серрации. Самыми распространенными среди "неферментирующих"■ бактерий оказались псевдомонады и ацинетобактеры. Анаэробные бактерии не идентифицировались.

Параллельно исследовали микрофлору зоопланктона С циклопов, дафний, простейших), которая по составу и разнообразию не уступала образцам воды. .В них присутствовали почти все представители энтеробактерий Скроме сальмонелл, иерсиний и некоторых других родов), а также вибрионы, "неферментирующие" бактерии, актиноми-цеты, грибы, дрожжеподобные кхбтки.

При исследовании обитателей бентоса - личинок насекомых Схи-рономид) выявлен не столь широкий спектр бактерий, однако и здесь присутствовали клебсиеллы, серрации, псевдомонады, ацинетобактеры.

Таким образом, водные экосистемы с их обитателями, как и наземные, служат обычной средой обитания энтеробактерий, псевдомо-

над и других микроорганизмов - известных или потенциальных возбудителей болезней человека и животных.

5.2. Роль водных и почвенных организмов в существовании

псевдотуберкулезного микроба (экспериментальная оценка)

В экспериментах использовали наиболее массовых животных планктона (низшие ракообразные), бентоса (черви, моллюски, личинки насекомых) и нектона (рыбы), а также водные растения. Применяли генетически маркированные шА штаммы псевдотуберкулезного микроба.

Низшие ракообразные

Прямое заражение дафний иерсиниями (через воду) приводило х стабильному и длительному существованию возбудителя в организме дафний (21 сутки), что составляет большую часть жизни рачков в природе. При этом численность иерсиний в дафниях к середине этого срока возрастала на 2 порядка, в дальнейшем постепенно снижаясь (рис. 6).

Кормление дафний инфузориями, фагоцитировавшими иерсиний, также вызывало заражение дафний, в которых возбудитель регистрировался в течение 3 недель. Из прудовой воды (контроль) иерсинии изолировали нерегулярно и в низкой концентрации (рис. 6).

Представители другого отряда - циклопы, в отличие от дафний - хищники, при заражении через воду сохраняли иерсиний в течение 30 суток. При кормлении циклопов зараженными инфузориям!, которых рачки охотно поедали, отмечали аналогичную динамику численности псевдотуберкулеэного микроба (стабилизация в течение 3 недель на уровне Ю3 КОЕ), после чего - резкое снижение численности до 35 суток.

Плоские черви

Свободноживущие плоские черви - планарии повсеместно распространены в донных субстратах водоемов и во влажных биотопах суши. Планарии из всех изученных животных оказались наиболее чувствительными к заражению иерсиниями (как через воду, так и с кормом).

1д К0Е/10 особе:; Сил)

Рис. в Динамика численности псевдотуберкулеэного микроба при взаимодействии с зоопланктоном Сдафнии).

, 1 - иерсинйи в дафниях, зараженных через инфузорий; • | 2 - иерсинии в дафниях, зараженных от воды; | 3 иерсини!} в воде (контроль).

погибая через 2 суток. Псевдотуберкулезный микроб элиминировался из кишечного тракта червей в течение суток.

Кольчатые черви

Олигохеты (энхитреи) - обитатели бентоса и влажных почв -экологически близки к пяанариям. В противоположность им энхитреи оказались способны сохранять иерсиний на протяжении 35 суток Серок наблюдений) в стабильной концентрации 103 КОЕ/особь, не испытывая при этом видимого отрицательного воздействия. Из почвы, где содержались зараженные энхитреи, иерсиний удавалось изолировать лишь в течение 7 суток.

Моллюски

Брюхоногие моллюски, инфицированные через воду СЮ® мко/мл), также длительно С 40 суток) сохраняли псевдотуберкулезнкй микроб на уровне 102-103 КОЕ/особь. В воде, где содержались моллюски, как и в прежних опытах, иерсиний обнаруживали не позднее 7 суток С рис. 7).

Дичинки насекомых

Личинки двукрылых насекомых - хирономид С"мотыль") широко распространены в пресных водоемах, питаясь в основном детритом и одноклеточными организмами. Как и при заражении кольчатых червей или моллюсков, ш наблюдали длительное существование псевдотуберкулезного микроба в этих личинках Сболее 35 суток). Численность иерсиний в личинках, снижаясь к 7 суткам до Ю КОЕ/особь, стабильно удерживалась на этом уровне весь срок наблюдений. В воде Сконтроль) иерсинии не обнаруживались через 7 суток С рис. 7).

Рыбы

Внесение лсевдотубериулетното микроба в воду приводило к заражению рыб уже в первые часы (аерсавш выделяли из аабер в концентрации 103 КОЕ/особь). Через неделю концентрация псевдотуберкулезного микроба снизилась до 10^ КОЕ и оставалась стабильной в последующие 2 недели. Бактериологическое исследование кишечника

lg КОЕ/особь Сил) С!

—i—1—Г-1—г—~—I—I—Г—I—I—I—1—I---1 ' I "I 1 I—1111—I 1 I 1 I I I 1 I I I

1 3 б 7 10 15 20 25 30 35'

сутки

Рис ..7 Динамика1 численности псевдотуберкулеэного микроба при взаимодействии с животными бентоса (личинки насекомых, моллюски).

1 - иерсинии в личинках хирономид ("мотыль");

2 - иерсинии в моллюсках;

3 - иерсинии в воде (контроль).

этих же особей выявило иерсинии в низкой концентрации - единичные колонии на протяжении всего срока наблюдений. Из воды (контроль), как и в предыдущих опытах, псевдотуберкулезный микроб не выделяли Через 7 суток, так что длительное (21 сутки) обнаружение иерсиний в жабрах рыб не может быть объяснено постоянным их поступлением с водой.

Результаты экспериментов по заражению рыб через корм (низшие ракообразные и личинки насекомых) изложены в следующей главе.

-Водные растения

Опыты проводили с элодеей (Elodea canadensis), убиквитарно распространенной-в пресноводных водоемах и способной вытеснять из Водных ценозов другие растения. В течение всего срока наблюдений (30 суток) в стеблях и листьях элодеи, не контактировавших с инфицированной водой, обнаруживали псевдотуберкулезный микроб, однако его концентрация после 7 суток не превышала S-101 КОЕ/г. В более поздние сроки посевы были отрицательными. Из воды, где содержались растения, иерсинии элиминировались через неделю.

Обобщая результаты этого цикла экспериментов, можно утверждать, что все испытанные животные (за исключением плоских червей - планаркй), а также высшие водные растения в принципе ' являются благоприятной средой обитания иерсиний. Длительность существования и концентрация бактерий в этих гидробионтах значительно превышают показатели для воды (почвы), что свидетельствует об их самостоятельной и существенной резервуарной роли.

Зоопланктон (дафнии, циклопы) способны поддерживать численность псевдотуберкулезного микроба, вместе с тем являясь важным эвеном цепи его циркуляции в водной экосистеме. Известно, что с циклопами и дафниями ассоциированы и другие патогенные бактерии', & частности холерные вибрионы.

Бентосные животные - кольчатое червя, моллюски и личинки насекомых - также обеспечивали длительное и стабильное существование иерсиний, поддерживая их численность на более высоком•уровне, чем в почве или воде, откуда иерсинии быстро исчезали в отсутствие хозяев.

Обитатели нектона - рыбы - могут получать иерсиний непосред-

ственно из воды или с кормом, длительно сохранять их и служить самостоятельным источником заражения человека. Различные виды иерсиний неоднократно изолировали из рыб (Шубин, 1993; Vladic, 1990; Tellervo е. а. , 1992).

Нашими экспериментами показано, что высшие водные растения способны заражаться иерсиниями через корневую систему и сохранять их в вегетативных органах. Водные растения как возможные резервуары патогенных бактерий только начинает изучаться. Установлено, что при определенных абиотических условиях (Голубев, 1993) фитопланктон стимулйрует размножение холерных вибрионов.

Таким образом, различные гидробионты способны служить потенциальными хозяевами иерсиний. Надо полагать, что в естественных условиях круг.хозяев патогенных иерсиний в почвеннйх и водных экосистемах может быть весьма широким.

' 6. МИГРАЦИЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗНОГО МИКРОБА В ВОДНОМ СООБЩЕСТВЕ

В отличие от наземных, почвенные и водные экосистемы в отношении закономерностей циркуляции возбудителей практически не изучены. В известной нам литературе нет специальных работ о миграции патогенных микроорганизмов по трофическим цепям водных и почвенных сообществ; известны лишь отдельные предположения на этот счет (Liston, 1S90). Ф.Н.Шубин (1993) считает, что циркуляция возбудителей в природном очаге псевдотуберкулеза в значительной мере связана с водой и гидробиоктами: инфицирование рыб и рыбоядных птиц может осуществляться через корм и воду круглогодично.

Экспериментальное изучение миграции иерсиний по трофическим цепям

Моделирование трофических взаимодействий в цепях водной экосистемы с участием патогенных бактерий в эксперименте представляет собой известное упрощение, однако в первом приближении позво-. ляет проверить возможность и воспроизвести конкретные пути передачи возбудителя, а также оценить численность бактериальной популяции в ходе миграции возбудителя от низших трофических уровней сообщества к высшим.

В данной работе проведена оценка возможности передачи возбудителя псевдотуберкулеза по трем трофическим цепям водного сообщества, включающим животных планктона, бентоса и нектона.

Первая трофическая цепь, воспроизведенная в эксперименте, состояла из 4 звеньев: "иерсинии - инфузории - дафнии (циклопы) -рыбы". Инфузорий в среде культивирования заражали вирулентной культурой псевдотуберкулезного микроба (10® мко/мл). В первые часы тетрахимены активно фагоцитировали бактерий из среды, при этом каждая инфузория содержала десятки пищеварительных вакуолей, заполненных иерсиниями. Через сутки концентрация иерсиний снижалась до 10® КОЕ и тогда фагоцитировавших инфузорий подселяли к дафниям и циклопам. Дело в том, что кормление рачков тетрахи^эками с более высокой концентрацией бактерий (10® КОЕ/мл биомассы) сказывало сильное патогенное воздействие на низких ракообразных.

В дафниях, поедавших зараженных инфузорий, через 3 суток отмечали снижение концентрации псевдотуберкулезного микроба до 10^ КОЕ, после чего происходил рост численности (до 107 К0Е/10 ссобей).

Рыбы, получавшие в качестве корма дафний с таким максимальным накоплением псевдотуберкулезного микроба, сохраняли его в течение 30 суток (срок наблюдений), однако концентрация гозбудителя в кишечнике рыб неуклонно снижалась (рис. 8).

В трофической цепи "иерсинии - инфузории - циклопы - рыбы" прослеживалась тенденция к постепенному падению концентрации возбудителя с течением времени и от одного звена к другому, так что к концу опыта численность псевдотуберкулезного микроба составляла 101 КОЕ/особь.

Таким образом, иерсинии способны передаваться по данной трофической цепи, включающей планктонных животных, от инфузорий до рыб, сохраняясь во всех ее звеньях.

Вторая трофическая цепь водного сообщества - "иерсинии -кольчатые черви - рыбы", Численность псевдотуберкулезного микроба в червях, зараженных бактериальной суспензией иерсинкй (см. выше), через 3 суток стабилизировалась на уровне 10^ КОЕ/оесбь, после чего червей скармливали рыбам. В кишечнике рыб иерсинии сохранялись в течение срока наблюдений в концентрациях 10^-Ю1 КОЕ/особь. .Длительнее выделение возбудителя из кишечника рыб

сутки

Рис. 8 Динамика численности псевдотуберкулезного микроба при взаимодействии с рыбами (заражение с пищей).

1 - иерсинии из кишечника рыб, зараженных через зоопланктон;

2 - иерсинии из кишечника рыб, зараженных через личинок

хирономид ("мотыль");

3 - иерсинии в воде (контроль).

свидетельствует о получении его с пищей, т.е. о передаче именно по трофической цепи.

Третья трофическая цепь - "иерсинии - личинки насекомых -рыбы" также включала животных бентоса - излюбленный корм рыб. После кормления рыб зараженным "мотылем" наблюдали стабильное существование псевдотуберкулеэного микроба в течение 15 суток в концентрации 10^ КОЕ/особь С рис. 8). В предыдущем звене данной цепи - хирономидах - иерсинии также стабильно сохранялись до 35 суток, так что оба звена цепи поддерживали существование возбудителя.

Таким образом, экспериментальное воспроизведение процессов миграции иерсиний по 3 различным трофическим цепям водного сообщества с участием животных планктона (дафнии, циклопы), бентоса (кольчатые черви, личинки насекомых) и нектона (рыбы) показали, что псевдотуберкулезный микроб способен передаваться по основным пищевым цепям сообщества, мигрируя от низших трофических уровней к высшим. Именно так, очевидно, иерсинии попадают в организм пресноводных и проходных рыб (в том числе употребляемых в пищу человеком) , ■ откуда культуры псевдотуберкулезного микроба были неоднократно изолированы (Шубин, 1993).

Трудоемкость и сложность описанных опытов ограничивают объем экспериментальных данных, характеризующих процессы ■ распространения иерсиний в популяциях гидробионтов, и делают целесообразным проведение анализа и соответствующих расчетов с помощью математических моделей водного сообщества.

Математическое моделирование динамики заражения гидробионтов в ходе передачи иерсиний по трофической цепи

Материалы экспериментальных исследований послужили фактологической основой для построения математических моделей трофических взаимодействий в цепи водного сообщества "бактерии - инфузории - дафнии - рыбы" с учетом гетерогенности взаимодействующих популяций.

Схема иерархической структуры и взаимодействий сочленов моделируемого водного сообщества показана на рис. 9. Переменные xi и ui для i = 1, 2, 3, 4 на схеме отражают процессы "движения" вирулентных (устойчивых х перевариванию) иерсиний (ul) по трофичес-

кой пирамиде сообщества, при этом xi - особи популяции, свободные от возбудителя, ui - зараженная часть популяции хозяев (для 2, 3 и 4).

Использована система математических моделей типа Вольтерра: 1) бактериальной микрофлоры (иерсиний) в ассоциации с инфузориями - модель MB; 2) инфузорий в ассоциации с дафниями - модель MD; 3) дафний в ассоциации с рыбами - модель MF. Объединение этих моделей в единую модель М=(МВ + MD + MF) позволяет изучать интегрированные процессы взаимодействий в сообществе и миграции Y.pseudotuberculosis с одного уровня трофической пирамиды на другой.

Рис. 9. Принципиальная схема трофических связей бактерий (включая иерсиний), инфузорий, дафний и рыб в водном сообществе.

МВ - бактерии (иерсинии) - инфузории; Ю - инфузории - дафнии; № - дафнии - рыбы. •

При этом мы ограничились классическими моделями "хищник-жертва": ' .

йх1^=С1озС2)Л.Ьх1)«х1-С1одС0.5)Лбх1)'х1-к„1,х1а; Х1С0)=Х1°,

где: 1Ьх1 - среднее время удвоения 1-ой популяции в водной среде; 1сЬи - среднее время гибели половины 1-ой популяции; кх^=(1од(2)/ /1Ьх1)>оит»х - коэффициент конкуренции внутри видовой популяции за жизненные ресурсы; х!тах - предельная концентрация 1-ой популяции.

Для максимально адекватного отображения реальных процессов в водном сообществе потребовалось создание математических моделей двух типов:

- М1, "фоновая" модель взаимодействий в сообществе при отсутствии патогенных иерсиний в составе бактериальной микрофлоры;

- М2, "полная" модель, где бактериальная микрофлора включает гетерогенную по .вирулентности С устойчивости к " перевариванию) популяцию иерсиний.

Динамика трофических взаимодействий различных видовых популяций сообщества задается сложной нелинейной системой дифференциальных уравнений для популяций: бактериальной микрофлоры - хОСО; иерсиний - х1Си; инфузорий - х2СО; дафний - хЗСО; 4) рыб -х4СО. Исходные данные моделей приведены, в таблице 2.

Из расчетов следует, что процессы последовательного "выедания" жертв С бактерий, инфузорий и дафний) соответствующими хищниками (инфузориями, дафниями и рыбами)- имеют различную динамику, однако численность популяции на каждом уровне трофической пирамиды устанавливается на максимально возможном уровне Сх1тах для 1 = О, 1, 2, 3, 4) в разные сроки,'увеличивающиеся от уровня к уровню.

Таблица 2

Начальные условия и параметры по уровням сообщества

Сочлены сообщества нач. условия параметры модели

ХХтах «ас. 1йх, час.

Ьактеоиальная микрофлора 10ь' юу 3. 50 38.0

Популяция иерсиний 10* 10в 3. 00 27.0

Популяция инфузорий Ю^ 10й 10.0 88.0

Популяция дабний 101 10й 72.0 680.0

Популяция рыб 10~" ю-1 > 24С0 > 10000

Примечание: концентрации указаны в расчете на 1 л воды.

После создания и верификации "фоновой" модели водного сообщества (Ml) стало возможным "ввести" в состав бактериальной микрофлоры популяцию патогенных иерсиний, которая должна изменить характер межпопуляционных взаимодействий и динамику всех звеньев трофической цепи. В этой связи напомним неоднозначность исхода взаимодействий гетерогенной популяции иерсиний, состоящей из перевариваемых и устойчивых к фагоцитозу бактериальных клеток, с инфузориями С см. выше).

В модели использована предельно простая схема, согласно которой каждая 1-ая видовая популяция гидробионтов С yi = xi + ui для i = 2, 3, 4) состоит из двух субпопуляций: xi - часть популяции, свободная от Y.pseudotuberculosis;, ui - часть популяции, зараженная Y.pseudotuberculosis. Взаимодействие иерсиний Сyl = xl + ul] с соответствующими хищниками - инфузориями [у2 = х2 + u2J задается нормированными произведениями сочленов:

у1-у2Ду1 + у2) = (xl + ul) *(х2 + u2)/(yl + у2).

В модели принимается, что популяции всех взаимодействующих видов гетерогенны (иерсикии - по признаку устойчивости к фагоцитозу простейшими, остальные - по поглощению или непоглощению своих жертв в данный момент времени). В этом случае процессы последовательного заражения Y.pseudotuberculosis всех сочленов сообщества задаются системой нелинейных дифференциальных уравнений для популяций: бактериальной микрофлоры; иерсиний в составе микрофлоры; инфузорий; дафний; рыб.

Процесс заражения инфузорий стабилизируется на 10-12 день, при этом соотношение зараженных и незараженных частей популяции составляет '1:1'(в расчете на 1 л воды). Процессы заражения дафний и, особенно, рыб развиваются значительно медленнее и не столь интенсивно. Так, численность зараженных особей в популяции дафний нарастает весьма плавно, и максимум ее сохраняется до 30 дней. Начиная с 20 суток, они составляют от четверти до половины популяции. Популяция рыб на 30 день почти наполовину заражена патогенными иерсиниями. В диссертации приведены графики динамики заражения инфузорий, дафний и рыб, рассчитанные на модели.

Расчеты по оценке вероятной численности патогенных иерсиний на разных трофических уровнях в течение 50 суток дали следующие

показатели Сна 1 л воды): в составе бактериальной микрофлоры CU1) - 105- 106 КОЕ/л; в популяции простейших (U2) - 10б КОЕ/л; в популяции дафний CU3) - 107 КОЕ/л; в популяции рыб (U4) - 101 КОЕ/л. Функция распределения численности иерсиний в трофической пирамиде имеет достаточно сложные закономерности - повышение концентрации (накопление) возбудителя до уровня низших ракообразных и затем резкое падение численности возбудителя в рыбах. Последнее, возможно, обусловлено низкой численность» самих рыб в объеме воды - в расчете на 1 л.

Таким образом, посредством математического моделирования мы впервые попытались определить динамику заражения иерсиниями различных гидробиок-foB, иными словами, списать возможное развитие эпизоотии в популяциях животных водной экосистемы. •

Заключение диссертации подводит итоги проведенных исследований, обобщает их результаты и намечает перспективы развития этого нового направления в экологии возбудителей инфекций к природной очаговости болезней человека,

ВЫВОДЫ

1. Межпопуляционные взаимодействия различных патогенных Сус-ловно-патогенных) бактерий со свободноживущими простейшими не сводятся к известным отношениям "хищник - жертва", а имеют выраженную симбиотическую природу: инфузории обеспечивают длительное и устойчивое существование бактериальных популяций в естественных субстратах.

2. Закономерности внутриклеточного паразитизма в организме простейших являются общими для различных грамотрицателънкх и грамположительных бактерий - иерсиний, псевдомонад, листериЯ и эризипелотриксов. В процессе фагоцитоза инфузориями исходно гетерогенная популяция этих бактерий дифференцируется: значительная часть микробных клеток утилизируется в фагосоках; другие трансформируются в сферопласты и протопласты; отдельные бактерии сохраняются неизменными, размножаются и Еьгаывают гибель простейших.

Напротив, фагоцитоз еапрофитических и патогенных стафилококков носит завершений характер: бактерии полностью переваривается простейшими.

3. Незавершенность фагоцитоза служит механизмом поддержания численности бактериальных популяций в ассоциации с простейшими: выживание и размножение устойчивых к фагоцитозу микробных клеток отчасти компенсирует снижение численности бактерий в результате переваривания инфузориями.

4. Пассирование через инфузорий иерсиний, листерий, псевдомонад вызывает значительное возрастание устойчивости к фагоцитозу, что проявляется в последовательном увеличении гибели простейших от пассажа к пассажу.

Аналогично возрастает устойчивость к фагоцитозу у иерсиний при пассировании на перитонеальных макрофагах млекопитающих, что свидетельствует об общности закономерностей фагоцитоза бактерий филогенетически отдаленными зукариотическими клетками.

5. На основе обобщения экспериментальных данных сформулирована гипотеза клонально-селекционного механизма поддержания и изменения вирулентности патогенных бактерий в почвенных и водных сообществах: селекция.и накопление устойчивых к фагоцитозу клонов в процессе естественного пассирования через гидробионтов способны вызывать соответствующие сдвиги в гетерогенной популяции бактерий, создавая условия для формирования эпидемически значимых вариантов возбудителя.

6. В результате взаимодействия с инфузориями у иерсиний, листерий, эризипелотриксов имеет место адаптивная изменчивость ряда признаков.

Наблюдаются выраженный гетероморфизм бактериальных популяций, существенное замедление роста колоний на плотных питательных средах; у иерсиний и листерий происходит Б-К диссоциация колоний.

Цитопатогенные свойства й биохимическая активность бактерий в ранние сроки С до 7 суток) возрастают, а в дальнейшем снижаются; у листерий к эризипелотриксов ферментация углеводов исчезает через 7-45 суток взаимодействия с инфузориями.

7. Экспериментальная оценка динамики численности псевдотуберкулезного микроба в ассоциациях с низшими ракообразными, кольчатыми червями, моллюсками, личинками насекомых, рыбами, водными растениями выявила устойчивое существование возбудителя в течение 30-40 суток Серок наблюдений); в водной и почвенной средах (контроль) иерсинии бактериологически нб обнаруживались через 7 суток.

Данные гидробионты, активно поддерживающие популяцию псевдотуберкулезного микроба, могут служить его хозяевами и природными резервуарами в водных (почвенных) экосистемах.

8. Экспериментальное воспроизведение трофических цепей водной экосистемы с участием животных планктона, бентоса и нектона впервые показало возможность передачи псевдотуберкулезного микроба по цепям; иерсинии - инфузории - низшие ракообразные (дафнии, циклопы) - рыбы; иерсинии - кольчатые черви - рыбы; иерсинии -личинки насекомых - рыбы. Получены первые оценки численности патогенных иерсиний в хозяевах - сочленах водного сообщества.

9. В математических моделях впервые оценена динамика заражения различных гидробионтов в процессе передачи псевдотуберкулезного микроба по трофической цепи сообщества. Подтверждена устойчивость бактериальной популяции в водном сообществе и рассчитаны вероятные концентрации иерсиний на разных его трофических уровнях.

10. Выявленные закономерности существования и циркуляция патогенных бактерий в сообществах окружающей среды позволяют считать почвенные и водные экосистемы обязательными компонентами природных очагов сапронозов, расширяя тем самым- общие представления о структуре, функционировании в эпидемическом потенциале природных очагов болезней человека.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Боев Б. В., Литвин B.D., Пушкарева В. И. Динамическая модель популяционных взаимодействий иерсиний с инфузориями // Потенциально патогенные бактерии в природе. - М., 1991.- С. 60-68.

2. Боев Б. В., Литвин В. Ю., Пушкарева В. И. Миграция псевдоту-беркулеэного 'микроба по трофическим цепям сообщества. 2. Математическая модель // Патогенные бактерии в сообществах.- М., 1994. -С. 89-102.

3. Гордейко В.А., Пушкарева В. И. Иерсинии в воде колодцев вблизи зоны орошения стоками свинокомплекса //ЖМЗИ. - 1990;- Й10.-С. 64-65.

4. Константинова Н. Д. , Попов В. Л. , Пушкарева В. И. , Меркуров А. 3., Тартаковсхий И.С. , Литвин В. Я Ультраструктурная характера-

стика динамики взаимодействия возбудителей сапронозов (иерсиний и легионелл) с инфузориями // Тез. докл. VI Всеросс. съезда микро-биол. , эпидемиол., паразитол. - Н. -Новгород, 1992. - С. 101-102.

S. Литвин В. Ю., Максименкова И. А., Пушкарева В. И. , Шустрова Н. М. Анализ факторов, определявших существование иерсиний в сап-рофической фазе Ж. гиг. эпид. микроб, иммунол. (Прага).-1990. - Т. 34. - ЙЗ. - С. 289-299.

Б. Литвин В. ¡3., Шустрова Н. М. , Гордейко В. А., Пушкарева В. И., Мисуренко Е. Н. Экспериментальное изучение иерсиний в растениях // МЭИ. -• 1991. - К9. - С. 5-7.

7. Литвин В. X)., Пушкарева В. И., Гордейко В. А. , Шустрова Н. М. К адаптивной изменчивости иерсиний в разных средах обитания // Тез. докл. VI Всеросс. съезда микробиол. , эпидемиол., паразитол. - Н. -Новгород, 1992. - С. 97-98.

8. Литвин В. В. , Пушкарева В. И. Возможный механизм формирования эпидемических вариантов возбудителей сапронозов в почве или воде // ЖЮИ. - 1994. - КЗ.

9. Литвин В. Ю. , Пушкарева В. И. 0 вероятном механизме поддержания вирулентности бактерий в почвенных и водных сообществах // Патогенные бактерии в сообществах. - М., 1994.- С. 24-34.

10. Литвин В. Ю., Пушкарева В. И. Факторы патогенности бактерий: функции в окружающей среде // МЭИ. - 1994. - КЗ.

И. Меркуров А.Э., Тартаковский И. С., Пушкарева В. И., Литвин В. Ю. Инфузории как хозяева легионелл в природе (экспериментальное исследование) // Тез. докл. XII Всес. конф. по прир. очаг. 6-неЛ. - И. , 1989,- С. -101-102.

12. Пргорелов В. И. •, Пинигин А. Ф., Марамович А. С., Пушкарева

B. И., Литвин В. Ю., Лыкова М.В., Капустин М. С. Холерные вибрионы и инфузории: анализ взаимодействий // Патогенные бактерии в сообществах. - М.. 1994. - С. 42-48.

13. Пушкарева В. И., Литаш В. Ю., Тартаковский И. С. Популяци-онная динамика У. pseudotuberculosis в ассоциации с инфузориями // ЖЮИ.- 1989.- т.-'С. 17-21.

14. Пушкарева В. И., Константинова Н.'Д. Свободноживущие инфузории как возможные хозяева псевдотуберкулезного микроба // Тез. докл. XII Всес. хонф. по прир. очаг, бол-ней. - Новосибирск, 1989.-

C. f •

15. Пушкарева В. И., Константинова Н. Д. Закономерности взаимодействия патогенных иерсиний с инфузориями на популяционном, клеточном и субклеточном уровнях // "Иерсиниозы".- Владивосток, 1989. - С. 47-48.

16. Пушкарева В. И., Литвин В. Ю., Константинова Н. Д., Попов В. Л. Анализ механизмов межпопуляционных взаимодействий иерсиний с инфузориями Tetrahymena pyriformis на клеточном и субклеточном уровнях // ЖМЭИ. - 1990. - »1. - С. 3-8.

17. Пушкарева В. И., Литвин В. Ю., Константинова Н. Д.Попов В. Л. Инфузории как хозяева иерсиний и псевдомонад // Потенциально патогенные бактерии в природе, - М., 1991.- С. 50-60.

18. Пушкарева В. И., Литвин В. Ю. Усиление вирулентности Yersinia enterocolitlca в процессе пассирования через макрофаги и инфузорий // ЖМЭИ. - 1991,- Я7. - С, 2-5.

19. Пушкарева В. И., Константинова Н. Д. , Литвин В. Ю., Попов

B. Л. Псевдомонады как паразиты простейших ✓✓ ЖМЭИ. - 1992. - й2. -

C. 4-10.

£0. Пушкарева В. И. Дафнии - потенциальные хозяева псевдотуберкулезного микроба // 6-й Всеросс. съезд микроб. , эпид. и паразит. - М., 1S92. - С. 121-122.

21. Пушкарева В.П., Литвин В.К. О возможности миграции иерсиний по трофическим цепям водной экосистемы // Акт. г.робл. инфекц. патол.- С-Петербург, 1993. - С. 63.

22. Пушкарева В. И. Экспериментальное изучение хозяев псевдотуберкулезного микроба в воде // Там же, - С. 51.

23. Пушкарева Б. И. Методы экспериментального изучения хозяев и путей циркуляции возбудителей инфекций в водных (почвенных) экосистемах -у/ Патогенные бактерии в сообществах. - М., 1994.- С. 35-42.

24. Пушкарева В. И. ,. Константинова Н. Д. , Тартаковский И. С., Бархатова 0. И. , Литвин В. Ю. Численность и изменчивость листерий в сообществе с инфузориями // Там же. - С. 48-55.

25. Пушкарева Б. И., Константинова Н. Д. , Литвин В. С. Эризипе-лотриксы в сообществе с простейшими (популяциснный и ультраструктурный анализ) // Там же. - С. 55-60.

25. Пушкарева В. И. , Константинова Н. Д. , Литвин В. И. Взаимоотношения сапрофитических и патогенных стафилококков с инфузория-

ми // Там же. - С. 60-65.

27. Пушкарева В. И. , Троицкая В.В. Спонтанная зараженность некоторых гидробионтов потенциально патогенными бактериями // Там же. - С. 70-74.

28. Пушкарева В. И., Литвин В. Ю., Шустрова Н. М. Гидробионты как хозяева псевдотуберкулезного микроба: экспериментальное исследование // Там же. - С. 74-84.

29. Пушкарева В.И. Миграция псевдотуберкулезного микроба по трофическим цепям сообщества. 1. Экспериментальные данные // Там же. - С. 84-88.

30. Пушкарева В. И., Литвин В. Ю. , Шустрова Н. М. Потенциальные хозяева и пути циркуляции Yersinia pseudotuberculosis в водной экосистеме // ЖМЭИ.- 1994,- ИЗ- С. 52 - 57.

31. Шустрова Н. М., Гордейко В. А., Мисуренко Е. Н., Пушкарева В. И. Иерсинии в растениях // Сб. Потенциально патогенные бактерии в природе, - М/, 1991. г С. 86-92.