Наноформы бактерий в системе "почва - растение"

Ванькова, Анна Андреевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Наноформы бактерий в системе "почва - растение"
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Наноформы бактерий в системе "почва - растение""

На правах рукописи

Ванькова Анна Андреевна

Наноформы бактерий в системе «почва - растение»

Специальность 03.02.03. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 4 ОКТ 2013

Москва 2013

005535790

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии факультета почвоведения, агрохимии и экологии Российского государственного аграрного университета - МСХА имени К.А.Тимирязева

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Емцев Всеволод Тихонович

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор [Шильникова Викторина Кузьминична

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент кафедры биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова Лысак Людмила Вячеславовна

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН Ананьева Надежда Дмитриевна

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной фитопатологии Центра «Биоинженерия» РАН Игнатов Александр Николаевич

Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится 13ноября 2013г.в 14.30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете -МСХА имени К. А. Тимирязева по адресу: 127 550, Москва, ул. Прянишникова, 15.(тел./факс:8 (499) 976 24 92) dissovet@timacad.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К. А. Тимирязева.

Автореферат разослан 11октября 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

О.В.Селицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Глобальные проблемы XXI-го столетия -ограниченность энергетических, пищевых, сырьевых ресурсов, загрязнение окружающей среды - способствуют тому, что мысль человека все больше обращается к микроорганизмам, как мощным и многообразным каталитическим системам, способным трансформировать вещества различной природы при относительно небольших затратах энергии и «наличии у них могущественной химической силы» (Вернадский, 2001).

Почвенная микробиология на современном этапе развития решает ряд фундаментальных проблем: участие микроорганизмов в круговороте веществ и превращении энергии в биосфере, роль микроорганизмов в почвообразовательных процессах, взаимодействие микроорганизмов и растений, охрана почв, управление микробными популяциями в почве и др. Одно из важнейших фундаментальных направлений почвенной микробиологии - исследование биоразнообразия микроорганизмов. Вопрос об исследовании почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования биосферы Земли, особенно остро был поставлен после проведения в Мексике в 1994г. Международного конгресса почвоведов «Почвы и биоразнообразие» (Добровольский, 1996; Tate, 1997), где почву рассматривали как среду обитания, генератор и хранитель жизни на Земле. «Почвы являются живыми, динамическими, сложными, комплексными системами» (Чернов и др., 2011), обладающими исключительным биологическим разнообразием. Внедрение молекулярных методов исследования в последние десятилетия существенно изменило традиционное представление о микробном разнообразии почв. Было показано, что в 1г почвы может находиться более 10 млрд микробных клеток - от нескольких тысяч до миллиона геномных видов, при том что к настоящему времени охарактеризовано не более 5тыс. видов. Только 0,1 - 1% микроорганизмов почвы представлены культивируемыми видами (Torsvik et al., 1996). Одним из основных достижений в области изучения биоразнообразия является выявление группы архей как самостоятельного домена живых организмов (Woese et al., 1977; Воробьева, 2007).

методическими трудностями. Между тем, знание указанных особенностей необходимо для понимания закономерностей функционирования микробного сообщества почвы. Кроме того, среди представителей НФ встречаются возбудители заболеваний растений, животных и человека, например, микоплазмы или Ь - формы патогенных бактерий. Эти ультрамикроскопические бактерии традиционно служат объектом пристального внимания медиков, ветеринаров и фитопатологов, но до сих пор не попадали в поле зрения экологов и почвенных микробиологов. Поэтому, вопросы, связанные с их обитанием в почве и циркуляцией в биоценозе остаются практически не изученными.

В связи с вышеизложенным целью работы было изучение численности и разнообразия НФ бактерий в почве и корневой зоне растений, их участия в почвенных процессах и взаимодействия с растениями.

Задачи исследования:

1. Разработка новых методических подходов к изучению НФ бактерий в почве.

2. Исследование динамики численности и разнообразия НФ бактерий в дерново- подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны.

3. Изучение влияния железоокисляющих микоплазм на свойства лугово-черноземной почвы под культурой риса.

4. Оценка почвы как возможной среды обитания фитопатогенных микоплазм (на примере АсИо1ер1азта \aidlawii).

5. Изучение особенностей взаимодействия микоплазм (А. ШсИстИ) и растений.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение численности мелких и крупных форм бактерий в почве, ризосфере и ризоплане растений. Экспериментально показано, что значительная часть бактерий в дерново-подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны имеет ультрамикроскопически малые размеры - средний диаметр клеток составляет 0,31±0,22мкм, длина - 0,55±0,27мкм. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляет 65%, в ризосфере и ризоплане - 37% и 43% соответственно. Численность НФ в почве, их процентное содержание от общего числа бактерий, увеличивается в летнее время и снижается в зимний период. Обнаружено, что за время вегетации растений численность НФ и их количественная доля в составе популяций всех изученных групп бактерий (кроме олиготрофов) возрастает в ризосфере и снижается в ризоплане. Впервые методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлен микроколониальный характер распространения НФ в почве, адгезированное состояние на поверхности почвенных частиц, наличие в клетках запасных веществ, что свидетельствует об их физиологической активности.

Из лугово-черноземной почвы под культурой риса выделены 8 новых штаммов микоплазм, отнесенных на основе проведенной идентификации к р. Siderococcus. Установлено, что бактерии интенсивно окисляют железо, которое откладывается на поверхности их клеток в капсулах, и служат «центрами осадкообразования» этого элемента в почве, повышают эффективную растворимость его гидроокиси, не вызывая при этом значительных изменений окислительно-восстановительного состояния окружающей среды. Выявлена способность изученных бактерий к образованию комплексных соединений с железом.

Впервые предложены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в ее механической обработке, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые охарактеризовано поведение интродуцированной популяции микоплазмы А. laidlawii в различных типах почв. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция микоплазмы A. laidlawii сохраняется в черноземной почве в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой - 1 сутки. Численность интродуцированной популяции не стабилизируется. Время выживания определяется исходным уровнем обилия популяции и факторами окружающей среды.

Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм. Показано, что A. laidlawii способна проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в наземные органы, длительно персистировать в них и вызывать специфические морфологические изменения.

Впервые изучено влияние микоплазм на формирование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза. Разработана лабораторная модель взаимодействия растений, микоплазм и клубеньковых бактерий Установлено, что влияние A laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa - Rhizobium meliloti выражается в задержке инфицирования ризобиями растения-хозяина и стимулирующем действии на нитрогеназную активность сформировавшейся системы.

Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве, заключающиеся в способе десорбции микробных клеток с поверхности почвенных частиц, использовании селективных сред, режиме инкубации, проведении ПЦР. Показано, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном ее экстрагировании происходит ингибирование реакции. Разработанные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что расширит имеющиеся представления об этой малоизученной группе бактерий.

Полученные экспериментальные доказательства того, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм, обнаружение ранее неизвестного пути проникновения бактерий через корневую систему обозначает направление поиска новых подходов к решению проблемы борьбы с микоплазмозами растений и предотвращения эпифитотий.

Для совместного культивирования растений и микоплазм в лабораторных условиях и выделения железоокисляющих микоплазм из почвы предложена питательная среда на основе растительного отвара.

Установлена устойчивость томатов сорта Золотая Капля к A. laidlawii.

Количественная оценка процесса окисления железа микоплазмами, их комплексообразующей способности дает основание для разработки биотехнологических способов регулирования подвижности питательных элементов в корневой зоне растений как приема повышения их продуктивности.

Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах по почвенной микробиологии, биологии почв, читаемых на факультете почвоведения, агрохимии и экологии РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева.

Проведение исследований было поддержано проектами ГКНТ СССР «Интербиоазот-2000», Ф-503-35-2А, ФЦНТП «Интеграция», грантом правительства г. Москвы «Земля Москвы», ЗАО ФЦСР.

Основные защищаемые положения диссертации

1. Значительная часть бактерий в почве и корневой зоне растений представлена НФ. Динамика численности НФ в почве, ризосфере и ризоплане, их доля в бактериальном сообществе существенно различаются, отражая экологическую специализацию местообитаний.

2. В структуре бактериального комплекса лугово-черноземной почвы рисовников функционирует группа железоокисляющих микоплазм р. Siderococcus. Окисление железа приводит к увеличению его подвижности, миграции к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному накоплению в почве.

3. Почва является естественным резерватором и источником фитопатогенных микоплазм (A. laidlawii). Длительность выживания интродуцированной в почву популяции определяется факторами среды и исходным уровнем обилия.

4. Микоплазмы (A. laidlawii) способны проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы, длительно персистировать в них, вызывать специфические морфологические изменения.

5. При инфицировании растений (Medicago sativa и Lycopersicum esculentum) микоплазмами (A. laidlawii) происходят деградация

ультраструктуры клеток листовой ткани, изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях,в то же время более интенсивный рост и развитие, стимулирующий (протективный) эффект на нитрогеназную активность.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции по быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Пущино, 1992), 9-ом (Эймс, США, 1992) и 12-ом (Сидней, Австралия, 1998) Конгрессах Международного общества микоплазмологов, 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1992), 1-ой Международной конференции «Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность» (Днепропетровск, 1995), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарию) (Москва, 2000), Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в 19-21вв.» (Санкт-Петербург, 2001), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, 2003), 13-ой Всероссийской школе «Экология и почвы» (Пущино, 2005), Международной научной конференции «С.П Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология» (Ялта, 2007), 6-ой Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и вирусологии» (Алматы, 2009), Международной научно-практической конференции «Люцерна в кормопроизводстве» (Лобня, 2013), научных конференциях РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (2004,2007,2008), заседаниях кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА им.К.А. Тимирязева (2009,2013).

Личный вклад автора в работу. Автор принимал личное участие во всех этапах исследования, ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Он участвовал в выполнении экспериментальной работы, обобщении и интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций. В работе использованы материалы, полученные аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 10 - в изданиях, рекомендуемых ВАК, 7 статей в сборниках, 15 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, б глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего ¿"VJjl наименований, в том числе «?^ЗиностРаннь1Х источника. Работа изложена на X¡íX страницах, содержит /¿таблица ^¿рисунков.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность научным консультантам проф. В.Т. Емцеву и проф. |В.К. Шильниковой! за постоянную поддержку, критические замечания и ценные рекомендации. Автор благодарен своим коллегам и друзьям: П.И.Иванову, JI.B.Васильевой, В.М. Чернову, O.A. Черновой, [B.C. Гузеву1 Г.Б. Барановой за помощь при выполнении экспериментальной работы, консультации и поддержку, а также аспирантам и студентам, принимавшим участие в проведении экспериментов: JI.A. Свиридовой, Г.А. Мидянник, А.Ю. Погореловой, О.В.Бирюковой, A.A. Куприянову, Г.М. Чергейко, Ю.А. Дедовской. Отдельная благодарность всем сотрудникам кафедры микробиологии и иммунологии за теплую доброжелательную атмосферу и понимание.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

На основании анализа отечественных и зарубежных литературных источников приводятся сведения о наноформах бактерий, истории их изучения, морфологии, экологии, методах исследования; биологии и систематике микоплазм, сапротрофных микоплазмах и их роли в почвах, микоплазмах -патогенах растений.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили образцы дерново-подзолистой хорошо окультуренной почвы Полевой опытной станции РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева под посевами люцерны (Medicago sativa), лугово-чернозёмной почвы рисовых полей Краснодарского края, чернозёма обыкновенного карбонатного (Воронежская область, Таловский район). В опытах использованы микоплазма Acholeplasma laidlawii, штамм 1 (получен из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и штамм 2 (предоставлен лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КНЦ РАН); клубеньковые бактерии Rhizobium meliloti штамм 425а (из коллекции ВНИИ СХМ г.Санкт - Петербург); люцерна посевная Medicago sativa, томат Lycopersicum esculentum Mill., сорта Морковный, Золотая Капля и Манимейкер.

Численность наноформ (НФ) и общего числа бактерий определяли по физиологическим группам стандартным методом посева на следующих

питательных средах: мясо-пептонном агаре (МПА) - бактерии, минерализующие органические формы азота; крахмало-аммиачном агаре (КАА) - бактерии, использующие минеральные соединения азота; на среде Эшби - олигонитрофилы; на почвенном агаре - олиготрофы. В опытах использовали также среду на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС), которую применяют в медицинских исследованиях для выделения и культивирования L - форм бактерий и микоплазм. Целесообразность использования этой среды для изучения экологии почвенных микроорганизмов обоснована в предшествующей работе (Асфур и др., 1992). Почву для анализа отбирали ежемесячно в течение года из междурядий с глубины 5 - 15 см. Численность бактерий в ризосфере и ризоплане люцерны определяли по методу Теппер (Теппер и др., 2004) в три срока - июле, августе и сентябре. Для получения НФ бактерий использовали метод фильтрации через мембранные фильтры Millipore (диаметр пор 0,22 мкм) на стерильных фильтровальных установках Зейтца под давлением 0,2 атм. Подробная методика приведена в тексте диссертации.

Железоокисляющие бактерии выделяли методом посева на агаризованную среду на основе растительного отвара (Ванькова, 1991). Колонии железобактерий определяли по качественной реакции на Fe3+ с K4Fe(CN)6]. Идентификацию чистых культур проводили на основании изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков (Bergey's manual of systematic bacteriology, 1989). Содержание железа определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perlón Elmer-503 и колориметрически, рН и Eh - потенциометрически по общепринятым методикам. Образцы для снятия ИК-спектров получали прессованием таблеток сухой биомассы бактерий с КВг.

Для интродукции в почву использовали маркированную по стрептомицину популяцию микоплазмы A. laidlawii (штамм 1). Выявление и учет A. laidlawii после предварительной десорбции клеток проводили параллельно 2-мя методами: посевом на агаризованную (1,4%) среду Mycoplasma Broth Base (MB) (Becton Dickinson, USA) со стрептомицином и ПЦР с применением непрямого метода выделения ДНК. Из осажденных центрифугированием клеток выделяли ДНК, которую затем очищали классической процедурой фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984). В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, синтезированные в НПО «Литех». Последовательность праймеров составлена на основе опубликованной (Kong et al., 2001) первичной структуры рибосомного оперона A. laidlawii-. AF( прямой праймер) - 5'GAG АТС ТТТ GAA AAG TAG ATA ААТ GAT GTC TGA AAA GAA ATA AGG3', AR (обратный праймер) - 5'CTT CGA CCG ATT TTC CCA CAT CGT TCA TC 3', фланкирующие ампликон размером 362 п.о. в области

межгенного спейсерного района ДНК 16S-23S рРНК. Детальное изложение методик представлено в тексте диссертационной работы.

В модельных опытах с растениями люцерны семена стерилизовали концентрированной серной кислотой (Nutman, 1949), проращивали при комнатной температуре и помещали в стерильные сосуды с агаризованной питательной средой на основе растительного отвара. Инфицирование проростков проводили через 2 недели путем введения в среду суспензии микоплазмы A. laidlawii (штамм 1, 106 КОЕ/мл) или совместно A. laidlawii и клубеньковых бактерий R. meliloti (10s КОЕ/мл). Опыты проводили в люминостате при 12 - часовом световом дне, Т 20° - 22°С, освещенности 4 тыс. лк. Обнаружение микоплазм в тканях инфицированных растений проводили методами ДНК-ДНК гибридизации и электронной микроскопии. Дот - гибридизацию тотального препарата ДНК, выделенного из листьев люцерны, проводили со следующими ДНК - зондами: рА132, специфичным к A. laidlawii, pMgl6, специфичным ко всем представителям класса Mollicutes (Чернов, 1998). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).

При проведении модельных опытов с растениями томата инфицирование проводили путем выдерживания 5 - дневных проростков в водной бактериальной суспензии A. laidlawii (штамм 2) с исходным титром 106 КОЕ/мл в течение суток или внесением бактериальной суспензии непосредственно в почву (109 КОЕ/г). Опыты проводили в фитотроне при 18 - часовом световом дне, температуре 22 - 24С°, освещенности 5 тыс. лк. Присутствие микоплазм в тканях растений устанавливали ПЦР (Серебренникова, 2005). Длину эпикотиля и площадь листовой поверхности растений измеряли с помощью фотопланиметра.

Ультраструктуру НФ бактерий, а также клеток растений, инфицированных микоплазмами, изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). При изучении НФ бактериальные клетки из фильтрата почвенной суспензии (разведение 10"2) осаждали центрифугированием. Препараты готовили по общепринятой методике (Уикли, 1975). Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе Hitachi - 500 (Япония). Биометрический анализ проводили по фотографиям ультратонких срезов бактерий с учетом увеличения микроскопа и при фотографировании. Для изучения клубеньков и утолщений на корнях люцерны использовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) (Гузев и др., 1984; 2003; 2006).

Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel 2007.

Глава 3. Наноформы бактерий в почве и корневой зоне растений

В течение многих лет микробиологи наблюдают в природных местообитаниях (почва, водоемы, породы и минералы, живые организмы) существование бактерий, обладающих сверхмалыми размерами: диаметром клетки <0,4мкм, объемом 0,1...0,01 мкм3. Их описывают под различными названиями - ультрамикробактерии, фильтрующиеся или ультраформы, нан(н)обактерии, карликовые бактерии и др. (Новогрудский, 1933; Крисс и

VI VIIVIII IX X XI XII I П Ш IV месяц

Q-,

VI VIIVIII IX X XI XII I месяц

II П1 IV

120 Í100 80 60 40 20 0

VI VII Vin IX X XI ХП I II Ш IV е месяц

'ис. 1 Численность бактерий в дерново-подзолистой почве до фильтрации и фильтрующихся форм

a) олигонитрофильные

b) использующие органические формы азота

c) использующие минеральные формы азота

d) олиготрофы

e) учитываемые на среде ГБС

др.,1948; Виноградский, 1952; Красильников, 1954; Никитин, 1964; Ананьева и др., 1979; Мишустина и др., 1987; Гузев и др., 2003; Дмитриев и др., 2008; Лысак, 2010; Сузина и др., 2011; Дуда и др., 2012; Федотова и др., 2013; Casida, 1969; Вае et al., 1972; Monta, 1985; Bakken et al., 1987; Baath, 1992;

□до фильтрации БЭ фильтрующиеся формы

Panikov, 2005). Физиологические особенности, таксономия и экологические функции этих бактерий до сих пор мало изучены. Между тем, знание указанных особенностей представляет большой общебиологический интерес и имеет практическое значение.

Результаты исследований, проведенных на Полевой опытной станции РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева показали, что численность наноформ (НФ) бактерий в дерново-подзолистой почве высока и колеблется в широком диапазоне значений за исследуемый период времени (рис. 1 а-е).

Наибольшее количество НФ было обнаружено в сентябре (26,0±1,9-50,0±2,8 млн КОЕ/г почвы), наименьшее - в марте (0,04±0,01 - 0,08±0,01 млн КОЕ/г почвы). Динамика численности соответствующих групп бактерий до и после фильтрации имеет, как правило, сходную тенденцию - количество бактерий возрастает в летние и осенние месяцы и снижается зимой и весной. Максимальные значения численности НФ и общей численности бактерий всех изученных физиологических групп, кроме бактерий, использующих органические формы азота, совпадают и приходятся на сентябрь. Доля НФ от общей численности выявляемых бактерий в среднем за исследуемый период составляет 65%. В отдельные месяцы некоторые физиологические группы представлены преимущественно мелкими формами.

Численность НФ бактерий в ризосфере люцерны в составе всех групп бактерий (кроме олиготрофов) возрастает в течение вегетации растений, вне зависимости от характера динамики общей численности бактерий до фильтрации (табл.1). Неодинаковый характер динамики численности НФ свидетельствует о различиях в закономерностях их развития, проявляющихся в данной среде обитания. Максимальное число НФ выявлено на среде ГЪС к концу вегетационного периода - 38,0±2,4 млн КОЕ/г почвы. По-видимому, эта среда для НФ бактерий, использующих органические соединения азота, более благоприятна, чем МПА и позволяет выявить большее их количество. В общей массе бактериальных клеток всех исследованных физиологических ipynn доля НФ в среднем составляет 37%. В процессе вегетации растений она увеличивается до 73-75%. Выявленные закономерности развития НФ свидетельствуют о возможном стимулирующем действии растений люцерны на образование и функционирование НФ в зоне ризосферы. Известно, что ризосфера характеризуется более высокой численностью и метаболической активностью микроорганизмов благодаря постоянному притоку эксудатов.

Малые размеры дают бактериям биологическое преимущество в конкуренции за питательные вещества с крупными организмами в соответствии с общебиологическим правилом, согласно которому интенсивность обмена веществ обратно пропорциональна величине особи (Стейниер и др., 1979).

Более высокая метаболическая активность бактерий в ризосфере

Табл. 1.

Численность бактерий в ризосфере растений люцерны до фильтрации и фильтрующихся форм

Группа бактерий Июль Август Сентябрь

общее число бактерий фильтрующиеся формы общее число бактерий фильтрующиеся формы общее число бактерий фильтрующиеся формы

млн КОЕ / 1г почвы % млн КОЕ / 1г почвы % млн КОЕ / 1г почвы %

Олигонитрофилы 26,0±11,8 1,6±0,3 6 13,1±0,8 3,9±0,8 30 10,0±0,9 4,2±0,4 42

Использующие органические формы азота 11,0±2,4 0,5±0,1 5 28,0±8,6 4,7±1,0 17 32,0±2,3 5,3±0,4 17

Использующие минеральные формы азота 42,0±5,5 23,0±2,3 55 38,0±2,4 28,0±3,7 74 35,0±2,0 26,0±2,2 74

Олиготрофы 69,0±23,0 14,0±1,5 20 40,0±9,3 30,0±3,2 75 12,0±0,8 6,6±0,1 55

Учитываемые на среде ГБС 67,0±6,7 4,7±0,5 7 34,0±7,8 3,2±0,5 9 52,0±2,9 38,0±2,4 73

Табл. 2.

Численность бактерий в ризоплане растений люцерны до фильтрации и фильтрующихся форм

Группа бактерий Июль Август Сентябрь

тыс. КОЕ / 1г корней % тыс. КОЕ / 1г корней % тыс. КОЕ / 1г корней %

Олигонитрофилы 130,0±9,0 53,0±11,8 41 62,9±12,2 41,7±6,8 66 17,0±9,1 15,0±2,5 88

Использующие органические формы азота 65,0±10,6 16,0±2,8 25 120,0±6,5 12,8±2,9 11 30,0±7,4 3,9±2,1 13

Использующие минеральные формы азота 120,0±5,7 50,0±7,2 42 10,0±ЗД 6,7±1,8 67 62,9±12,2 7,0±1,9 И

Олиготрофы 99Д±7,2 64,0±11,1 65 10,0±5,6 7,9±6,3 79 700±647 520,0±72,2 8

Учитываемые на среде ГБС 94,4±5,1 56,0±6,2 59 100,0±11,8 32,5±3,8 3 23,0±8,7 17,0±2,4 74

сопровождается увеличением плотности популяций и уменьшением размера клеток.

Особенностью ризопланы, как экониши бактерий, отличающей ее от ризосферы, является то, что у всех изученных групп бактерий полностью совпадает характер динамики численности бактерий до и после фильтрации. У бактерий, использующих органические, минеральные формы азота, олигонитрофилов и бактерий на среде ГБС наблюдается уменьшение как общего количества бактерий, так и числа мелких клеток в процессе вегетации. Численность олиготрофов в обоих случаях за тот же период времени возрастает (табл. 2). Доля НФ, использующих органические, минеральные формы азота, и олиготрофов уменьшается в течение вегетационного периода до 8 -13%. Процентное содержание НФ олигонитрофилов и бактерий на среде ГБС в общей массе бактерий соответствующих групп увеличивается (88 и 74%). Доля НФ от общего числа выявленных бактерий составляет в среднем 43%. Отмечено, что показатели доли НФ и общей численности бактерий в ризоплане изменяются в противофазе: минимальный процент НФ регистрируется в период, когда численность всех бактерий максимальна и наоборот.

Выявленные закономерности свидетельствуют о возможном существовании определенных механизмов регуляции численности мелких форм бактерий в ризоплане растений, отличающих ризоплану от почвы и ризосферы и отражающих их глубокую экологическую специализацию.

При электронномикроскопическом исследовании НФ установлено, что диаметр прошедших через мембранный фильтр клеток варьирует от 0,15 до 1,50 мкм, длина от 0,21 до 1,75 мкм (рис. 2 а-е). Наиболее часто встречаются клетки с диаметром в интервале 0,20 - 0,35 мкм и длиной в интервале 0,45 -0,80мкм. Средний диаметр и длина клеток - 0, 31±0,22мкм и 0,55±0,27мкм. Выявлено значительное разнообразие морфотипов НФ: сферические, овальные и палочковидные бактерии с Г4" и Г" типом строения клеточной стенки, лишенные ригидной клеточной стенки, цистоподобные клетки. В некоторых клетках НФ бактерий выявлены включения липидов (рис. 2 в, д), и полифосфатов (рис. 2 б, г, д). Большинство наблюдаемых на электронограммах клеток находится в адгезированном состоянии на поверхности почвенных частиц (рис 2 в) и имеет микроколониальный характер распространения, что свидетельствует об их физиологической активности в природной среде.

Таким образом, биометрический анализ НФ бактерий показал, что их средний диаметр составляет 0,3 мкм, а длина - 0,6 мкм. Редукция размеров почвенных бактерий, их тенденция к карликовости, по-видимому, являются общим законом микробной жизни в условиях почвы и характерной чертой

где

Рис. 2 Ультраструктура фильтрующихся форм почвенных бактерий. Размер масштабной линейки 0,5 мкм.

природных форм почвенных микроорганизмов. В то время как у одних организмов малые формы наследственно закреплены, у других они, возможно, носят модификационный характер. Высокая численность НФ бактерий в почве и корневой зоне растений, их морфологическое

разнообразие, физиологическое состояние позволяют предположить, что уменьшение размеров почвенных бактерий имеет адаптивное значение и связано с их большей устойчивостью к условиям окружающей среды.

Глава 4. Железоокисляющие микоплазмы.

Самыми мелкими из известных организмов, имеющих клеточную структуру, являются микоплазмы (Борхсениус и др., 2002; Чернов, 1998; Razin et al., 1998). Они представляют собой простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты, способные к самостоятельному воспроизведению. Малый размер генома и ограниченные биосинтетические возможности обусловили их сосуществование с клетками высших эукариот. Большинство микоплазм, встречающихся в природе, относят к паразитам растений, животных и человека, способным вызывать заболеващм (Тимаков и др., 1973; Власов и др., 1985; Скрипаль, 1988; Коромыслов и др., 1987; Прозоровский и др., 1995; Раковская, 1999; Чернова, 1999; McCoy et al., 1989; Taylor-Robinson et al., 1997). Менее изучены свободноживущие сапротрофные микоплазмы, обитающие в почвах, сточных водах, донных отложениях, вулканических материалах, характеризующиеся хемоорганогетеротрофным типом метаболизма и способностью откладывать на поверхности клеток окислы железа, марганца или алюминия (Перфильев и др., 1964; Заварзин, 1968; Мирчинк и др., 1970; Балашова, 1974; Болотина, 1975; Дубинина, 1977; Аристовская, 1980; Пиневич, 2005; Кутузова, 2011). Ограниченные метаболические возможности являются причиной методических трудностей, возникающих при культивировании микоплазм на искусственных питательных средах. Эта бактерии находятся «на грани культивируемости».

Для изучения железоокисляющих микоплазм в лугово-черноземной почве рисовников Краснодарского края впервые была предложена плотная питательная среда на основе растительного отвара с щавелевокислым железом (II) и витамином В п.

Данная среда позволила оценить общую численность железоокисляющих бактерий, которая оказалась сопоставима с таковой других групп, традиционно изучаемых в затопленных почвах рисовых полей (маслянокислых, ацетонобутиловых, железо- и сульфатредуцирующих), и составила в среднем 10,2 - 14,0 млн. КОЕ/г почвы, а также выделить 8 новых штаммов, отнесенных на основании проведенной идентификации к сапротрофным микоплазмам p. Siderococcvs.

Выделенные чистые культуры образуют характерные для микоплазм точечные двухфазные колонии, напоминающие "яичницу-глазунью", которые отличаются по цвету и размеру у разных штаммов. С помощью

электронной микроскопии установлено, что клетки лишены клеточной стенки и вследствие этого крайне полиморфны - варьируют по форме от овальных и более или менее правильной формы палочек до сильноизогнутых, бобовидных и нитей разной длины (рис. 3).

к ГЧ Я* Ш к£

Рис.3 Ультраструктура железоокисляющих бактерий, х18000

Диаметр клеток 0,3 - 1,2мкм, длина 0,9-3,0мкм. Присутствуют НФ, округлые или неправильно округлые, диаметром 0,1 -0,2мкм. Выделенные культуры не способны расти на богатых органических средах (МПБ, МПА), но хорошо развиваются на КАА и картофельном агаре с образованием пигмента от розового до кирпично-красного цвета, среде Тилера и голодном агаре. Использование простых Сахаров в качестве единственного источника углерода выявлено у штаммов 2, 5 и 8. Исследуемые культуры проявляют большую потребность во влаге, обладают каталазной активностью, микроаэрофилы, мезофилы. Все изучаемые штаммы способны к окислению железа, которое откладывается на поверхности клеток в капсулах.

Результаты исследований показали, что окисление железа штаммами идёт с различной интенсивностью (табл. 3). Наибольшей активностью обладает штамм 9. Процесс окисления идёт практически без изменения рН и окислительно-восстановительного потенциала (ЕЬ) в среде. Степень окисленности системы - гНг (Орлов, 1985) в целом несколько увеличивается.

Для оценки деятельности железоокисляющих микоплазм в почве необходимо знать механизмы их взаимодействия с субстратом. Влияние железобактерий на состояние соединений железа в почве обусловлено выделением в окружающую их среду специфических продуктов обмена. На основании изучения морфологии и физиологии выделенных штаммов бактерий можно предположить несколько вариантов их воздействия на

субстрат, в результате которого происходит окисление железа и его отложение на поверхности клеток.

Табл. 3.

Влияние железобактерий на содержание закисного железа, рН и ЕЬ в

№ штамма Содержание Ре2* в среде РН ЕЙ, мВ по ХСЭ гН2

мг/л %к контролю

Контроль 16,50 7,97 279 25,2

1 12,83 78 7,96 305 26,1

2 19,33 117 8,38 287 26,3

3 11,33 69 7,78 278 24,8

4 14,00 85 8,16 265 25,2

5 10,58 64 7,90 267 24,7

7 15,83 96 8,46 266 25,8

8 10,41 63 8,40 267 25,7

9 8,66 53 8,53 265 25,9

НСР 3,02 0,41 17,66

Большинство выделенных

штаммов обладает каталазной активностью, поэтому отложение окислов железа на поверхности клеток может происходить в результате взаимодействия перекиси водорода, конечного или промежуточного продукта окисления органических веществ, с ионами железа в реакции сопряжённого окисления с участием каталазы (Дубинина, 1977). чд,^ Гетеротрофный тип питания выделенных бактерий позволяет также предположить их способность Рис.4 ик-спектры биомассы штаммов 4,5, разлагать железоорганические

9, выращенных при концентрации соединения с последующим лимоннокислого железа (II) вереде 10мг/л

(верхняя кривая) и 100мг/л (нижняя кривая), использованием органической части В

метаболических процессах и

га та ял г:'.17..т'

отложением окисного железа в капсулах или на поверхности клеток (Аристовская, 1980).

При наличии на поверхности клеток соединений с отрицательным зарядом: мукополисахаридов, полисахаридов и фосфолипидов возможна физико-химическая адсорбция железа (Дубинина, 1977). Поскольку большинство изученных штаммов имеет слизистую капсулу, присутствие на поверхности их клеток перечисленных выше органических соединений весьма вероятно. Кроме того, осаждение железа в виде гидроокиси на клетках возможно в связи с локальным повышением окислительно-восстановительного потенциала или рН, вследствие выделения бактериями щелочных продуктов обмена, временного избытка ионов (Мп4+, вО*,2" Ы03" и др.) или молекулярного кислорода. Весьма динамичное окислительно-восстановительное состояние поверхности клеток бактерий вполне допустимо, если принять во внимание отсутствие у большинства штаммов истиной клеточной стенки и учесть специфические условия их местообитания. Одним из механизмов накопления железа бактериями может быть процесс комплексообразования, который сводится к выделению в окружающую среду специфических хелатообразующих соединений, своеобразных "переносчиков" железа к клетке (КаИес^е е1 а1., 1976). Комплексообразующая способность выделенных штаммов тем более вероятна, что процесс окисления ими железа практически происходит без изменения окислительно-восстановительного потенциала и кислотности среды. У одного организма вполне вероятно существование одновременно нескольких механизмов осаждения или накопления железа. Преобладание одного или совместное функционирование нескольких механизмов зависит от конкретных условий среды обитания и физиологических особенностей бактерий. В конечном итоге рассмотренные выше процессы приводят к миграции железа из среды к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному его накоплению.

Изучение механизма связывания железа проводили методом ИК-спектроскопии сухой биомассы чистых культур, выращенных при контрастных концентрациях железа (II) в питательных средах. ИК-спектр является "отпечатком пальцев" молекулы: поглощение в ИК-области характерно для отдельных атомных группировок, при этом интенсивность поглощения прямо пропорциональна их концентрации. Сравнение характеристичных пиков ИК-спектров (Кончиц, Черников, 1990) биомассы штаммов, выращенных при различных концентрациях (10 и 100мг/л) лимоннокислого железа (II) в среде показало, что при увеличении концентрации железа доля свободных карбоксильных, спиртовых и фенольных функциональных групп сокращается, что свидетельствует об их

возможной заблокированное™ катионом металла и позволяет предположить способность исследуемых штаммов к комплексообразованию (рис. 4). Для. проверки гипотезы о возможной способности клеток железобактерий или их метаболитов вступать в реакции хелатизации с железом в модельном опыте была проведена оценка комплексообразующей способности бактерий по эффективной растворимости гидроокиси железа Ре(ОН)з при внесении их в раствор в различной концентрации (103 и 105 клеток/мл). Результаты опыта показали, что штаммы 1, 2, 4, 5 повышают эффективную растворимость гидроокиси железа и обладают комплексообразующей способностью (КС) (Савич и др., 1988) по отношению к железу. Штаммы 3 и 7 проявляют лишь тенденцию к увеличению содержания растворимого железа в среде (табл. 4).

Табл. 4.

Комплексообразующая способность железоокисляющих микоплазм

№ штамма 103 клеток/мл 105 клеток/мл

рн ЕЬ, мВ Ре3"" мг/л КС рН ЕЙ, МВ Ре3+ мг/л КС

Контроль 4,63 363 0,27 1,0 4,63 363 0,27 1,00

1 4,71 345 0,48 10,2 4,84 367 0,44 7,08

2 4,81 365 0,48 10,2 4,83 395 0,34 2,52

3 4,77 372 0,09 0,01 4,82 405 0,30 1,53

4 4,77 362 0,10 0,02 4,91 391 0,37 3,53

5 4,82 361 0,42 5,87 5,00 401 0,30 1,53

7 4,8 359 0,34 2,52 4,93 384 0,29 1,34

8 4,73 379 0,13 0,05 4,93 388 0,22 0,43

9 4,72 348 0,20 0,30 4,75 408 0,26 0,87

НСР 0,04 9 0,13 0,06 10 0,08

Таким образом, в лугово-черноземной почве рисовников выявлены железоокисляющие микоплазмы р. 8и1егососсив, составляющие значительную часть микробного сообщества. Бактерии интенсивно окисляют железо, не вызывая при этом значительных изменений окислительно-восстановительных условий в окружающей среде. Одним из механизмов окисления железа микоплазмами является комплексообразование. Способность бактерий образовывать комплексы с железом облегчает мобилизацию этого элемента из труднорастворимых природных соединений. Известно, что в составе комплексных и внутрикомплексных (хелатных)

соединений железо теряет свойства характерные для катиона: образование труднорастворимых фосфатов, осаждение в виде гидроокиси и др. (Кононова и др., 1961; Кауричев и др.,1961; Антипов-Каратаев и др., 1966). Благодаря хорошей растворимости, устойчивости и высокой подвижности в широких пределах рН, железоорганические комплексы имеют большое значение в выветривании, миграции элементов в почвенном профиле, снабжении растений микроэлементами и поливалентными катионами.

Глава 5. Почва как среда обитания фитопатогенных микоплазм

Большинство известных микоплазм относят к симбионтам (паразитам) высших эукариот, понимая под симбиозом (Стейниер и др., 1979) биологическое явление тесной и длительной ассоциации различных организмов и расценивая паразитизм как один из множества вариантов симбиоза, при котором паразит физиологически зависит от своего хозяина, а его репродуктивный потенциал выше, чем у последнего. Микоплазмы вызывают более 600 заболеваний растений 96 семейств. Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного возделывания сельскохозяйственных культур - Воронежской, Орловской, Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае и наносят существенный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля - на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 2000; Скрипаль, 1988; Борхсениус и др., 2002). Потери от микоплазмозов растений ежегодно возрастают, что связывают с увеличением антропогенной нагрузки на экосистемы. Одна из самых распространенных в природе микоплазм Acholeplasma laidlawii впервые была выделена из сточных вод и отнесена к сапротрофам. Однако, в настоящее время известно, что многие штаммы A. laidlawii являются возбудителями микоплазмозов растений, животных и человека. Источником биозагрязнения агроценозов служат сточные воды, которые используются для орошения сельскохозяйственных угодий, бытовые и сельскохозяйственные отходы, микробные производства. Для обеспечения экологической безопасности продукции необходимо разработать эффективные методы контроля и меры по предотвращению данного вида загрязнения. Решение этой проблемы невозможно без знания экологии и особенностей циркуляции возбудителя. Основную роль в распространении микоплазмозов растений традиционно отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985; Богоутдинов, 2001). В то же время, в условиях in vitro экспериментально подтверждена возможность проникновения A. laidlawii в надземную часть растений через неповрежденную корневую систему (Иванов, 1992; Чернов, 1998). Этот факт позволяет иначе взглянуть на пути циркуляции A. laidlawii в природе,

экологию этой бактерии, предположить возможность проникновения микоплазм в растения непосредственно из почвы. Однако служит ли почва средой активной деятельности возбудителя или играет роль резерватора -промежуточной среды, где возбудитель лишь сохраняется в жизнеспособном состоянии, носит гипотетический характер. Для разрешения выдвинутой гипотезы был применен экспериментальный популяционный подход -прямой способ оценки приспособленности конкретного микроорганизма к определенному местообитанию. Критерием оценки почвы как возможной среды обитания какого-либо организма является поведение интродуцированной популяции этого организма в почве (Кожевин, 1989). Исследованию интродуцированной в почву популяции A. laidlawii предшествовала разработка эффективных селективных методов выделения и количественного учета микоплазм, так как методические приемы работы с этой группой бактерий в условиях почвы отсутствуют.

Для изучения поведения фитопатогенного штамма A. laidlawii (штамм 1) в почве использовали генетически маркированную по стрептомицину популяцию, которую получили методом "приучения" исходной культуры к возрастающей концентрации антибиотика путем постепенного отбора резистентных форм (Звягинцев, 1987). Идентичность полученного стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii исходному штамму подтверждена с помощью иммунофлюоресцентного (ИФ) и ПЦР анализов.

Для оценки численности интродуцированной популяции A. laidlawii в почве необходимо было подобрать питательную среду, на которой бы микоплазмы при выделении из почвы хорошо развивались. При этом необходимо учесть, что микоплазмы чрезвычайно требовательны к компонентам питательной среды (Раковская, 1999; Борхсениус и др., 2002) в значительной степени из-за ограниченных биосинтетических способностей. Для культивирования и выделения из почвы A. laidlawii испытывали среды ГБС (рН 6,5) (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), Mycoplasma Broth Base (MB) (Becton Dickinson, USA) (pH 8,0), и среду на основе растительного отвара (Ванькова, 1991). По совокупности показателей наилучшей была признана среда MB. Важным преимуществом выбранной среды является то, что на ней выявляется гораздо меньше почвенных микроорганизмов, особенно грибов, что, очевидно, связано с ее щелочной реакцией. Рост A. laidlawii изучен в различных по плотности средах MB. В жидкой среде -это слабое равномерное опалесцирующее помутнение. В полужидкой (0,3% агара) - колонии появляются на 3-4 сутки и имеют вид белых полупрозрачных сфер диаметром 0,5 -1,5 мм. На плотной (1,4% агара) среде вырастают округлые, точечные колонии (0,1-1,0 мм) в виде яичницы-глазуньи с приподнятым центром и плоским ободком. При культивировании

стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii и высеве его из почвы на плотную среду MB наблюдалось явление диссоциации популяции: кроме классических колоний в виде яичницы-глазуньи развивались атипичные колонии двух видов - без плоского периферического ободка "пузырчатые" и шероховатые. Колонии диссоциантов меньше классических. Идентичность типичных колоний и диссоциантов исходному штамму подтверждена методом ПЦР.

Оптимальная температура роста A. laidlawii составляет +20 - +40°С (Определитель бактерий Берджи, 1997). В результате сравнения различных температурных режимов в данном диапозоне установлено, что оптимальная температура культивирования стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii в жидкой среде составляет +28°С, а инкубирования посевов из почвы - +37°С. Относительно высокая температура угнетает рост большинства почвенных микроорганизмов, колонии же микоплазм развиваются быстрее, что дает возможность для их более полного учета. Поэтому температуру 37°С приняли как "элективную" для выделения A. laidlawii из почвы.

Для максимального выявления интродуцированной популяции A. laidlawii необходимо было выбрать наиболее эффективный метод десорбции. Клетки ахолеплазм обладают капсулой (Борхсениус и др., 2002), поэтому можно предположить, что они будут легко адгезироваться почвенными частицами. Испытания различных общепринятых (Звягинцев, 1987) способов десорбции показали, что наибольшее количество клеток выделяется при встряхивании почвенной суспензии в колбе на механической качалке в течение 10 мин (табл. 5).

Для идентификации микоплазм в черноземной почве с помощью ПЦР отработан метод выделения ДНК, поскольку в литературе данный метод не был найден. Испытывали 2 известных способа выделения ДНК: непосредственное экстрагирование ДНК из почвы (прямой метод) и экстрагирование ДНК из предварительно выделенных клеток микроорганизмов (непрямой метод). Прямой метод дает более достоверный результат, так как экстрагируется вся ДНК, находящаяся в почве, независимо от того, в каком состоянии находятся бактерии в данный момент -адгезированы ли они почвенными частицами или находятся в некультивируемом состоянии. Однако при использовании прямого метода происходило ингибирование ПЦР вследствие присутствия примесей, вероятно гуминовых кислот, очистить от которых ДНК не удалось. Поэтому для детекции микоплазм в почве был принят непрямой метод выделения ДНК с использованием классической процедуры фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984). Детальное описание метода представлено в диссертационной работе.

Табл. 5.

Влияние способов десорбции на численность интродуцированной в __почву популяции Л. ЫЛашп _

№ Варианты опыта КОЕ/г воздушно-сухой почвы

1 Встряхивание в колбе 10 мин. 1,7-Ю8

2 Встряхивание в колбе с 0,01% Т\уееп-60 10 мин. 1,2-Ю8

3 Обработка УЗ 0,5 мин. 1,8-107

4 Обработка УЗ 1 мин. 4,2-107

5 Обработка УЗ 2 мин. 4,8-106

б Обработка УЗ 3 мин. 4,5-106

7 Обработка УЗ с 0,01% БОБ 0,5 мин. <1,0-106

8 Обработка УЗ с 0,01% БОБ 1 мин. <1,0-106

9 Обработка УЗ с 0,01% Т\уееп-60 0,5 мин 3,2-107

10 Растирание в ступке 5 мин. 1.4-106

11 Растирание в ступке с 0,01% вОБ 5 мин. <1,0-106

Таким образом, разработаны селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в предварительной механической десорбции, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Показано, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой метод выделения ДНК.

С целью выяснения пригодности почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм стрептомицинустойчивую популяцию А. ЫеНаки интродуцировали в два типа почвы - дерново-подзолистую и чернозем обыкновенный (Ю9КОЕ/г почвы) и выявляли в динамике посевом

на среду МВ со стрептомицином (1,4мг/мл) и методом ПЦР.

Динамика популяции в дерново-подзолистой почве и черноземе различалась (рис. 5). В дерново-подзолистой почве численность популяции через сутки после интродукции вышла на нулевой уровень. В черноземе популяция снижалась постепенно.

в ] 1(К{КСЕ/гшт>|

Рис. 5. Динамика интродуцированной популяции ¡ц1с11а-л!И в черноземе и дерново-подзолистой почве

тштшттёт. щШШШвЖ!'

1 2 3 4 5 6 7 Рис.б. Электрофореграмма результатов ПЦР по срокам идентификации А. 1аШ1емЦ в черноземе обыкновенном !, 2, 3, 4, 5 - соответственно 1, 5, 10, 15, 17 суток после интродукции А. 1аИ1акИ в почву;

6 - положительный контроль (чистая культура А. ¡аМ/анЦ); 7 - отрицательный контроль (почва без внесения А. 1аШ1акп)

1|11 (КОЕ/г тм|

сутки

15 1К

Рис.7. Динамика численности

интродуцированной популяции А. 1о1с(1а\\ч! в черноземе

в « с м к ^ а 22 Й'"-

Рис.8. Динамика численности популяций А.1аШ1спуи в черноземе в зависимости от начального титра при их интродукции

Через сутки её численность уменьшилась на 2 порядка относительно исходной, а к 4-ым суткам - ещё на порядок. При определении срока выживания популяции ахолеплазм в черноземе в более длительном опыте (17 суток) микробиологическим посевом и ПЦР жизнеспособные микоплазмы выявлялись в почве в течение 15 суток (рис.6, 7).

Итак, методами посева и ПЦР подтверждено, что при исходном титре 109 КОЕ/г почвы интродуцированная популяция А. 1а1<11амИ сохраняется в черноземе в жизнеспособном состоянии в течение 15 суток, однако, численность её не стабилизируется и неуклонно снижается. В дерново-подзолистой почве при таком же исходном уровне внесения популяция А. 1тс11ам>И не идентифицируется уже через сутки после интродукции в почву. Полученные результаты согласуются с данными П. А. Кожевина (2000), который изучал динамику интродуцированных популяций в тех же типах почв и наблюдал более резкое сокращение их численности в дерново-подзолистой почве, связанное с ее неблагоприятной кислотностью. Чернозем обыкновенный, таким образом, более подходящая среда для ахолеплазм, чем дерново-подзолистая почва.

Изучена динамика численности А. Шс11смИ в черноземе при интродукции популяций с разными исходными уровнями популяционной плотности - 108 10' и 10" КОЕ/г почвы. Численность А. 1шс11ам>И в почве снижалась независимо от исходного титра внесения, однако, динамика процесса различалась (рис. 8.). Чем выше уровень вносимой популяции, тем ниже скорость убывания ее численности и больше время

кЯЦК/пшч»!

• ■1с

>с

-•-1с

сохранения в почве. При максимальном титре внесения А. 1тс11а\т 10" КОЕ/г почвы микоплазмы изолировали в течение 19 суток (1,2-102 КОЕ/г почвы). По мере снижения популяционной плотности микроорганизмов наблюдается ослабление отрицательных механизмов антибиоза со стороны почвенных микроорганизмов, но это не всегда ведет к стабилизации популяции. Популяции, характеризующиеся высоким уровнем трат на поддержание жизнеспособности в результате внутрипопуляционной конкуренции, могут быстро погибнуть в условиях голодания (Звягинцев, 1987; Кожевин, 2000)

Изучение влияния температуры на поведение популяции в почве показало, что численность ее сокращалась, но динамика этого процесса различна. Наиболее резкое снижение отмечено при +28°С - в течение 2 суток почти на 3 порядка (рис. 9). На 6-ой день микоплазмы на среде не были

выявлены. Вероятно, высокая температура неблагоприятно влияет на их развитие в почве. Кривые динамики численности при температурах +4°С и +20°С практически совпадали, на 8-е сутки микоплазмы не удалось обнаружить в обоих вариантах. Микоплазмы высоко устойчивы к низким температурам (Коромыслов и др., 1987; Берджи, 1997; Борхсениус и др., 2002). По мере повышения температуры

окружающей среды их численность снижается. Не исключено, что уменьшение количества микоплазм в почве при повышенных температурах связано с их переходом в некультивируемое состояние.

При изучении влияния рН на динамику численности А. ¡аиПами установлено, что через сутки после интродукции ахолеплазм в дерново-подзолистой почве (рНкс! 5,1) они не обнаружены, а в той же почве, нейтрализованной СаО до рНка 8,0, выявлены с титром 103 КОЕ/г почвы (рис. 10.). Через 5 суток и в этом варианте микоплазмы не высевались на питательную среду. Следует отметить, что при одинаковых титрах внесения

I 1

! (

! Ч(

Рис.9. Динамика численности иитродуцированиой в чернозем популяции А. 1аШ1{МП при различных температурных режимах

Рис.10. Динамика численности иитродуцированиой популяции

АсИо1ер1азта 1аШ1смИ в дерново* подзолистой почве с внесением СаО и без внесения

микоплазм и одинаковых значениях рН черноземной и дерново-подзолистой почв длительность выявления A. laidlawii в черноземе составила 15 суток, а в дерново-подзолистой - не более 5. Следовательно, на жизнеспособность микоплазм влияет не только рН, но и другие свойства почвы.

Таким образом, на основании изучения динамики интродуцированных популяций A. laidlawii в дерново-подзолистой и черноземной почвах можно констатировать, что образ жизни и биологические приспособления ахолеплазм достаточно пластичны и варьируют в зависимости от условий среды. Исследование динамики популяций ахолеплазм, внесенных в почву, показало, что с течением времени исходная их численность непрерывно убывает. Продолжительность их жизни ограничена и при максимальной исходной численности популяции, принятой в эксперименте - 1011 КОЕ/г почвы, не превышает 20 суток. Время выживания популяции определяется типом почвы, факторами окружающей среды, а также исходным уровнем популяционной плотности. Чернозем является более предпочтительной средой для ахолеплазм по сравнению с дерново-подзолистой почвой, что объясняется, вероятно, его более благоприятными химическими и физическими свойствами. Сохраняемость популяции в черноземной почве по сравнению с дерново-подзолистой в 15 раз выше и составляет 15 суток при исходном титре 109 КОЕ/г почвы. Повышение кислотности и температуры почвы неблагоприятно для развития микоплазм. Проведенные исследования приводят к заключению о том, что почву нельзя считать средой благоприятной для обитания фитопатогенных микоплазм, но она служит резерватором, где бактерии могут сохраняться определенное время в жизнеспособном состоянии.

Глава 6. Взаимодействие микоплазм с высшими растениями

Ключевым вопросом при разработке практических мер профилактики и борьбы с инфекционным заболеванием является вопрос о механизме передачи возбудителя. Полученные результаты дают основание предположить, что микоплазмы могут проникать в растение непосредственно из почвы через корневую систему. Проникновение A. laidlawii в растения через корневую систему изучали из различных сред - водной суспензии, питательной среды и почвы. Возможность проникновения A. laidlawii (штамм 1) в растения люцерны (Medicago sativa) из питательной среды изучали в условиях стерильного модельного опыта. В вариантах совместного культивирования люцерны и микоплазм последние тестировали в тканях растений в концентрации не ниже 0,1-1,0 клеток на одну клетку растения. В контрольном варианте микоплазмы не обнаружены. При электронномикроскопическом исследовании срезов листовых пластин в

опытных вариантах в проводящих сосудах выявлены типичные по морфологии и ультраструктуре клетки микоплазм. В контрольном варианте такие структуры не обнаружены.

При изучении способности внедрения А. ШсИсти (штамм 2) из водной суспензии в растения томата (Ьусоретсит езси1епШт) результаты ГТЦР анализа показали присутствие А. ШсНсти в 10-дневных проростках всех исследуемых сортов (рис. 11).

В последующие сроки отбора образцов положительный ответ зарегистрирован в растениях сортов Морковный и Манимейкер. В растениях же сорта Золотая Капля присутствие А. ¡аиНстИ не установлено (табл. 6). Это связано, вероятно, с тем, что сорт Золотая Капля обладает устойчивостью к фитопатогену как результат действия механизмов иммунной защиты растения, которые включаются в ответ на проникновение микоплазмы.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 11. Элеетрофореграмма продуктов амплификации ДНК надземной части растений томата через 10 дней после инфицирования.

I-4 - растения томата сорта Золотая Капля, инфицированные А. Ыс11а\™ (4 повторности). 5 - неинфицированные растения томата сорта Золотая Капля (контроль).

6-9 - растения томата сорта Морковный, инфицированные А. Ы(11а\¥Ц (4 повторности). 10 - неинфицированные растения томата сорта Морковный (кошроль).

II-14 - растения томата сорта Манимейкер, инфицированные А. 1а1сИа\ум (4 повторности).

15 - неинфицированные растения томата сорта Манимейкер (контроль).

16 - чистая культура А. Ы(11а\™ (положительный кошроль).

17 - маркер размеров ДНК.

Таблица 6

Идентификация А. \aid\awii в различных сортах томата методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Сорт томата Срок отбора (дни)

10 14 18 22 75

Морковный +

- - - - -

Золотая Капля у® А:

- - - - -

Манимейкер +

- - - - -

инфицированное растение контроль

Аналогично при изучении способности А. ЫсЧстИ проникать из почвы в растения томата сорта Манимейкер методом ПЦР установлено присутствие микоплазм в растениях на 10,14, 22, 30 сутки после интродукции (109 КОЕ/г почвы). Проникновение микоплазм происходит через корневую систему томата непосредственно из почвы, так как это единственное звено контакта микоплазм и растений. ДНК А. ШсНсти обнаружена как в корнях, так и надземной части томата (рис. 12).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18

Рис. 12. Элекгрофореграмма продуктов амплификации ДНК растений томата сорта Манимейкер.

I-3 - корни + надземная часть растений томата 10 дней после инфицирования A. laidlawii 4-6 - надземная часть растений 14 дней после инфицирования A. laidlawii

7 - корни 14 дней после инфицирования A. laidlawii

»-Ю- надземная часть растений 22 дня после инфицирования A. laidlawii

II- корни 22 дня после инфицирования A. laidlawii

12-14 - надземная часть растений 30 дней после инфицирования A. laidlawii

15 - корни 30 дней после инфицирования A. laidlawii

16 - неинфицированные растения томата, отрицательный контроль.

17 - положительный контроль - A. laidlawii.

18 - маркер размеров ДНК.

Однородность результатов, полученных на растениях люцерны и томата, свидетельствуют о том, что корневая система растения как источник питания и сфера обитания благоприятна для A. laidlawii. Микоплазма способна внедряться в неповрежденную корневую систему растения, создавая особую экологическую систему, основными составляющими которой становятся микроорганизм, растение и условия их взаимодействия. Установлена способность A. laidlawii проникать через корневую систему люцерны и томата из водной бактериальной суспензии, питательной среды и непосредственно из почвы. Этот факт позволяет утверждать, что почва может играть роль транзитной среды между зараженными и здоровыми растениями. Микоплазмы способны к миграции от корней в надземные части растений и длительной персистенции в них. Таким образом, можно полагать, что растение служит естественной средой обитания для микоплазм.

В результате экспериментов установлено, что инфицирование М. sativa и L. esculentum клетками A. laidlawii вызывает у растений специфичные морфологические изменения характерные для микоплазмозов, возникающих в природных условиях. Внешние симптомы микоплазменной инфекции у зараженных растений люцерны четко проявились к третьей неделе опыта (табл. 7). Средняя длина инфицированных растений превышала длину контрольных примерно в 2 раза. У зараженных микоплазмами растений

наблюдалось утолщение стеблей и изменение их окраски, увеличение числа листьев, ширины листовых пластин, большее число междоузлий и устойчивая тенденция к увеличению их длины. Увеличение ширины листа, то есть формирование более округлой листовой пластины, удлинение междоузлий и повышенная облиственность - характерные внешние признаки проявления микоплазменной инфекции (Власов и др., 1985).

Табл. 7.

Влияние АсИо1ер1сята ШсИами на рост и развитие растений люцерны

Вариант Биометрические показатели

Длина растения, см Число стеблей Число мевдо узлий Длина междо узлий, мм Число листьев Размеры листа

длина, мм ширина, мм

Контроль (растения без заражения) 6,3+0,9 1,0+0,3 5,0+0,3 10,8+3,7 5,7+0,3 5,0+0,6 4,4+0,1

Растения, инфицированные А. 1аШстп 11,1+2,7 1 >4+0,2 7,9+0,6 18,3+5,9 8,5+0,5 6,1+0,6 5,7+0,5

При анализе ультраструктуры клеток листа, в частности фотосинтезирующих клеток мезофилла, у инфицированных растений выявлены серьезные дегенеративные изменения. Клетки контрольных растений имели типичное строение и характерную структуру основных клеточных компартментов (рис.13 б, в). В растениях, инфицированных микоплазмами, клетки сосудистых тканей выглядят "пустыми", что скорее всего связано с изменением степени гидратации цитоплазмы и некрозом части структур. Органеллы плохо различимы и видоизменены (рис.13 г, д).

Среди клеток сосудистых тканей встречаются клетки с отслоившимся протопластом, заполненные типичными по морфологии и ультраструктуре клетками ахолеплазм - сферической или овальной формы с диаметром 0,20 -0,25 мкм невысокой электронной плотности и более мелкими, плотными структурами.

Эти клетки не содержат пластид. Число митохондрий в растениях, инфицированных микоплазмами, заметно выше, чем в контрольных, причем структура их в разных клетках изменяется от нормальной до чрезвычайно плотной с пузыревидными кристами и признаками начинающейся деструкции. Встречается эндоплазматический ретикулум везикулярной формы. Плазмодесмы видоизменены.

Таким образом, заражение микоплазмами растений люцерны приводит к существенным изменениям в ультраструктуре клеток мезофилла. Очевидно, при этом происходит нарушение пластвдогенеза, что ведет к резкому сокращению числа хлоропластов. Клетки мезофилла постепенно утрачивают

Рис. 13. Ультраструкгура клеток микоплазм (Acholeplasma laidlawii) в жидкой среде (а) и ультраструкггурная организация ¡слеток мезофилла листа люцерны (Medicago sativa): б, в -контрольные растения; г, д - растения, зараженные микоплазмой.

П - пластида; КС - клеточная стенка; В - вакуоль; МТ - митохондрия; Л - липид; ПД -плазмодесма, М - клетки микоплазм. Масштабная линейка 0,5 мкм

фотосинтетическую функцию. Локализация микоплазм в сосудистой ткани приводит к закупорке проводящих элементов и нарушению их нормальной функции. Выявленные на ультраструктурном уровне изменения, очевидно, приводят впоследствии к развитию таких характерных для микоплазмоза симптомов как хлороз и увядание.

Инфицирование 5-ти суточных проростков Ь. езсикшит клетками А. 1аШ1стИ выявило сортовые различия в реакциях растений. Результаты биометрических измерений в динамике показали, что длина эпикотиля и площадь листовой поверхности у инфицированных растений томата сортов Морковный и Манимейкер больше, чем у контрольных. У сорта Золотая капля достоверных различий между инфицированными и контрольными растениями по этим показателям не выявлено (рис. 14, 15). Необходимо отметить, что методом ПЦР А. ШсНаюИ была идентифицирована в растениях томата сорта Золотая капля только в 1-й срок отбора проб- на 10-й день после инфицирования проростков. В последующие сроки анализа микоплазмы не выявлялись, в то время как в растениях других сортов положительный ответ регистрировался в течение всего опыта (75 суток) (табл. б).

Длительная персистенция А. ШсИсти в вегетирующих растениях томата сортов Манимейкер и Морковный стимулировала их развитие:

активизировала метаболические процессы и способствовала интенсивному росту растений, что, очевидно, связано с адаптационными реакциями организма-хозяина на инфекционный агент. В течение всего опыта инфицированные растения не обнаруживали характерных для микоплазмозов симптомов, кроме более интенсивного роста растений.

Ключевую роль в процессах адаптации в рассматриваемой системе микоплазма-растение может играть реорганизация геномов взаимодействующих организмов . Й N N (Чернов и др., 2005; Мухаметшина, 2006).

И|йЦ | | ! Известно, что микоплазменные инфекции

индуцируют образование перестроек в хромосомах растительных клеток. Установлено также, что в процессе взаимодействия происходит трансформация ахолеплазм в некультивируемые формы и наноклетки, сопровождающаяся

Оеорт Морковны» инфицированный Осорт Морковный контроль Осорт Золота* «апп* инфицированный Осорт Золотая шши контроль Осорт Ыамк.узймр инфицированный Осорт МамчмсЯхвр контроль

Рис. 14. Влияние А. ШсИсмИ на длину эпикотиля растений томата.

14 18 2

сутки

Рис. 15. Влияние А. ШсНсми на площадь листовой поверхности растений томата

формы и наноклетки, сопровождающаяся перестройками в их геноме. Микоплазмы имеют очень высокий темп мутирования - до 10% в каждой генерации популяции оказываются мутантными. В этой связи персистенция в растительных клетках микоплазм может обусловливать постоянный "всплеск" защитных реакций растения (окислительный взрыв и синтез физиологически высокоактивных соединений), которые и лежат в основе наблюдаемых морфофизиологических изменений.

Что касается сорта Золотая капля, то в данном случае представляется возможным констатировать подавление микроорганизма иммунной системой растения. Отсутствие признаков инфекционного процесса у зараженных микоплазмами растений позволяет заключить, что существенное значение для развития микоплазмоза имеет генотип растений.

В связи с полученными результатами представляло интерес исследование влияния микоплазм на симбиотическую систему. Влияние А. laidlawii на формирование и нитрогеназную активность бобово-ризобиального симбиоза Medicago sativa-Rhizobium meliloti изучали в условиях стерильного модельного опыта. Для совместного культивирования микоплазм, люцерны и клубеньковых бактерий была предложена питательная среда на основе растительного отвара (Ванькова, 1991), которая позволила совместить эти три биологических объекта в единую лабораторную модель. В варианте совместного внесения ахолеплазм и ризобий в среду с предварительно асептически выращенной люцерной первые инфицированные специфически искривленные корневые волоски появились на 23-и сут. что на 16 сут. позже, чем в контрольном варианте (без ахолеплазм) (рис. 16, 17 в, е). Их количество было в 4-5 раз меньшим, чем в

контроле и наблюдались они только на главном корне. Начиная с 11 сут., вокруг главного корня отмечалось характерное помутнение питательной среды в виде "белого облака", связанное с развитием ахолеплазм (рис. 17 г). Первые клубеньки появились на 61 сут. культивирования, что на 48 сут. позже, « " * " чем в контроле. Более позднее

Рис. 16 Влияние A. laidlawii на образование появление инфицированных КОрнеВЫХ специфически искривленных корневых ВОЛОСКОВ, меньшее ИХ ЧИСЛО, волосков на растениях Medicago sativa. .

значительная задержка в формировании клубеньков свидетельствуют о том, что микоплазмы тормозят процесс инфицирования растения-хозяина ризобиями.

Рисунок 17. а, б - колонии А. ШШомИ штамм А (мелкие округлые) и Л теШоИ штамм 425а при совместном культивировании на питательной среде; в, е -специфически искривленные корневые волоски люцерны; г - эффект «белого облака» вокруг корня; д - ветвистость корневых волосков. Размер масштабной линейки -0,5 мм.

Рисунок 18. Сканирующая микроскопия поверхности клубеньков (а, б, в) и утолщения (г) на корнях растений люцерны. Обозначения: а - контрольное растение, инфицированное только Я теШоН (штамм 425а)

б - г - растения, инфицированные совместно Л теШой (штамм 425а) и А. 1аШац!Ц (штамм 1).

Размер масштабной линейки - 0,5мм.

Электронномикроскопическое (СЭМ) изучение клубеньков выявило деформацию их поверхности при инфицировании растений люцерны А. 1аиИам>п (рис. 18а, б, в). Наблюдаемые изменения, возможно, связаны с внедрением микоплазм в клетки клубеньков или имеют иные, более глубокие причины, обусловленные физиологическими процессами,

которые возникают в клетках растений при инвазии микоплазм в корневую систему. На боковых корнях растений, инфицированных ризобиями и А. 1ешЯет>И, с 21 сут. наблюдались кроме того вздутия (утолщения), имеющие гладкую поверхность и аморфную структуру (рис. 18 г).

Задержка в процессе

инфицирования сказалась и на уровне азотфиксирующей активности

растений. На 10-е сут. азотфиксирующая активность в контроле (заражение только К. теШой) составила 32,8 нМ/ч, в то время как в опытном варианте (заражение ризобиями и ахолеплазмами) активность нитрогеназы не выявлена. На 170-е сут. культивирования растений люцерны азотфиксирующая активность в контроле осталась практически на том же уровне, в инфицированных микоплазмой

растениях она увеличилась до

14.1 нМ/ч, а к 230-м сут. достигла

61.2 нМ/ч, что более, чем в 2 раза превышало показания в контроле (рис. 19).

Полученные результаты

свидетельствуют о том, что влияние

нМ CjHa/растение ■ ч jq P инфицирование R. malllotl

Рис. 19. Влияние A. laidlawii на нитрогеназ-ную активность симбиотической системы Medicago sativa — Rhizobium meliloti.

A. laidlawii на гомеостатичную симбиотическуго систему Medicago sativa -Rhizobium meliloti выражалось, с одной стороны, в задержке процесса

инфицирования ризобиями растения-хозяина, что с позиции биологической целесообразности можно объяснить действием независимого фактора регуляции численности чужеродной для системы бактериальной популяции, а именно конкуренцией ахолеплазм с ризобиями на стадии преинфекции за растительные эксудаты. С другой стороны, ахолеплазмы, как оказалось, не только не подавляли развития растения, но более того - проявляли эффект стимулирующего (протектив-ного) действия на нитрогеназную активность сформировавшейся системы Medicago sativa - Rhizobium meliloti, что, очевидно, связано с их непосредственным и с косвенным - через метаболизм растения воздействием на ризобии.

Заключение

Сравнительный анализ численности НФ бактерий и бактерий обычного размера в почве и корневой зоне растений выявил высокое содержание ультрамикроскопических форм бактерий. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляла 65%, в ризосфере и ризоплане - 37% и 43% соответственно, а в отдельные сроки значительно превышала долю бактериальных клеток с обычными размерами. Редукция размеров почвенных бактерий, их тенденция к карликовости, по-видимому, являются общим законом микробной жизни в условиях почвы и характерной чертой природных форм почвенных микроорганизмов. В то время как у одних организмов малые формы наследственно закреплены, у других они носят, возможно, модификационный характер. Уменьшение размера бактериальной клетки сопровождается возрастанием поверхностно-объемного коэффициента, что приводит к увеличению скорости обмена веществами с внешней средой. Мелкие клетки обладают повышенной проникающей способностью, что позволяет им осваивать субстраты и экологические ниши, недоступные для бактерий обычного размера. Уменьшение размеров почвенных бактерий имеет, по-видимому, адаптивное значение и связано с их большей устойчивостью в условиях почвы.

Большой экологической пластичностью обладают мельчайшие лишенные ригидной клеточной стенки прокариоты — микоплазмы. Изучение поведения интродуцированной в почву популяции фитопатогенных микоплазм А. Ш<11ам/И показало, что длительность сохранения бактерий в почве зависит от условий окружающей среды. Полученные результаты приводят к выводу, что почва не является средой благоприятной для репродукции фитопатогенных микоплазм, то есть средой их обитания, а служит резерватором, где они могут сохраняться определенное время в жизнеспособном состоянии.

Микоплазмы (ахолеплазмы) теснейшим образом связаны с фитобиосферой, поскольку естественная среда обитания для них - растения. Они способны проникать в растения не только с помощью насекомых-переносчиков, но и непосредственно из почвы через корневую систему, мигрировать в надземные органы и длительно персистировать в них. Колонизация клеток тканей растений микоплазмами может как вызывать, так и не вызывать патологические реакции. Степень проявления патогенеза у разных индивидуумов зависит от генетически детерминированных особенностей взаимодействия паразита и организма-хозяина.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что значительная часть бактерий в почве и корневой зоне растений имеет ультрамикроскопически малые размеры - средний диаметр клеток составляет 0,3±0,2мкм, длина - 0,6±0,3мкм. Численность НФ колеблется в широких пределах и определяется условиями среды обитания. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляла 65%, в ризосфере и ризоплане - 37% и 43% соответственно. В отдельные сроки исследования доля НФ значительно превышала долю бактериальных клеток с обычными размерами. Выявлены существенные различия в динамике численности НФ в почве, ризосфере и ризоплане, отражающие их экологическую специализацию.

2. Выявлено значительное разнообразие морфотипов наноформ почвенных бактерий. Большинство наблюдаемых на электронограммах клеток находится в адгезированном состоянии на поверхности почвенных частиц, имеет микроколониальный характер распространения, содержит включения, что свидетельствует об их физиологической активности в природной среде. Многие НФ лишены клеточной стенки, что позволяет их отнести к Ь - формам либо микоплазмам.

3. Исследованы новые штаммы сапротрофных яселезоокисляющих микоплазм р. Siderococcus, выделенные из лугово-черноземной почвы рисовников. Показано, что деятельность железоокисляющих микоплазм приводит к увеличению эффективной растворимости гидроксида железа, при этом не происходит существенных изменений окислительно-восстановительных условий в окружающей среде. Установлена комплексообразующая способность бактерий по отношению к железу.

4. Разработаны селективные методы выделения микоплазм из почвы, включающие процедуру предварительной десорбции клеток, питательные среды и условия культивирования. Установлено, что для проведения ПЦР анализа в черноземной почве целесообразно использовать непрямой метод выделения ДНК, поскольку при прямом экстрагировании ДНК происходит ингибирование реакции.

5. Доказано, что почва не является естественной средой обитания фитопатогенных микоплазм A. laidlawii. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что популяция A. laidlawii после интродукции не сохраняется в почве длительное время, численность ее не стабилизируется. Время выживания определяется факторами внешней среды и уровнем внесения популяции. В черноземной почве интродуцированная популяция A. laidlawii сохраняется более длительное время (15 суток) по сравнению с дерново-подзолистой почвой (не более суток).

6. Выявлена способность микоплазм, на примере A laidlawii, проникать из

почвы через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы растений и длительно в них персистировать. Установленный факт позволяет утверждать, что почва может играть роль источника инфекции, транзитной среды между зараженными и здоровыми растениями, а растение служит естественной экологической нишей для микоплазм.

7. Прослежены изменения морфогенеза в растениях Medicago sativa и

Lycopersicum esculentum при заражении A. laidlawii, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях, и процесс деградации ультраструктуры клеток листовой ткани. Выявлено, что инфицированные растения растут и развиваются более интенсивно, что свидетельствует о включении механизмов защиты растений и развитии адаптивных процессов в системе «микоплазма-растение».

8. Установлена сортовая устойчивость томатов сорта Золотая Капля к A. laidlawii.

9. Выявлено, что влияние A. laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa - Rhizobium meliloti выражается, с одной стороны, в задержке процесса инфицирования ризобиями растения-хозяина, с другой стороны — в стимулирующем (протективном) действии на нитрогеназную активность сформировавшейся системы.

Список публикаций основных результатов докторской диссертации в журналах, рекомендуемых ВАК

1. Ванькова, A.A. Морфоцитологические особенности растений люцерны посевной (Medicago sativa L.) и томата (Lyc.esculentum Mill), инфицированных микоплазмами A. laidlawii / Ванькова A.A., Иванов П.И., Серебренникова Л.А. // Известия ТСХА. - 2007. - Вып.4. - С. 142-148.

2. Ванькова, A.A. Взаимодействие между микоплазмами (A. laidlawii) и растениями (Medicago sativa и Lyc. esculentum Milt) / Ванькова A.A., Иванов П.И., Мидянник Г.А., Серебренникова JI.A.// Известия ТСХА. -

2008. -Вып.1. - С. 129-133.

3. Ванькова, A.A. Взаимодействие микоплазм (A. laidlawii) с симбиотической системой Medicago sativa-Rhizobium meliloti / Ванькова A.A., Иванов П.И., Мидянник Г.А.// Агрохимия. - 2009. -№1.-С.72-78.

4. Ванькова, A.A. Образование цистоподобных покоящихся форм Sinorhizobium meliloti Р221 под влиянием алкилоксибензола / Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. // Известия ТСХА. -

2009. - Вып. 1. - С.149-154.

5. Ванькова, A.A. Регуляция развития и диссоциативных переходов симбиотрофных бактерий / Погорелова А.Ю., Лойко Н.Г., Ванькова A.A. // Известия ТСХА. - 2009. - Вып.2. - С. 176-182.

6. Vankova, A.A. Biological oxidation of iron in flooded soils / Vankova A.A. // Izvestiya of TAA. - 2010. - Issue 7. - P. 117-122.

7. Ванькова, A.A. Поведение интродуцированной популяции Acholeplasma laidlawii в почве / Ванькова A.A., Свиридова Л.А., Васильева Л.В. // Ученые записки Орловского государственного университета. - 2010. - №4 (38). - С. 63-70.

8. Ванькова, A.A. Участие бактерий p. Siderococcus в трансформации соединений железа в затопленных почвах / Ванькова A.A. // Агрохимический вестник. - 2012. - №2. - С. 11-14.

9. Ванькова, A.A. Микоплазмы - патогены растений / Ванькова A.A., Свиридова Л. А. // Нива Поволжья. - 2012. - № 4. - С. 26-32.

Ю.Ванькова, A.A. Фильтрующиеся формы почвенных бактерий / Ванькова A.A., Иванов П.И., Емцев В.Т. // Почвоведение. - 2013. - №3. -С. 335-342

Статьи в сборниках и журналах

11.Ванькова, A.A. Биогенная трансформация железа и изменение физико-химических показателей среды / Сидоренко О.Д., Ванькова A.A. // Биотехнология мшфоорганизмов в сельском хозяйстве. М., МСХА, 1989.-С. 100-107.

12.Вавькова, A.A. Проникновение фитопатогенных микоплазм в растения через корневую систему / Мидянник Г.А., Ванькова A.A., Скопина Т.Е., Бирюкова О.В. // «Savremena poljoprivreda» vol. 46, Vanredni broj, Novi Sad, Yugoslavia, 1998. - S. 191-195.

13.Ванькова, A.A. Динамика популяции Acholeplasma laidlawii в почве / Ванькова A.A., Серебренникова JLA. II Доклады ТСХА, Вып. 176,2004. — С.288-291.

14.Ванькова, A.A. Проникновение микоплазмы Acholeplasma laidlawii из почвы в растения томата через корневую систему / Ванькова A.A., Серебренникова JI.A., Карлов Г.И., Тараканов И.Г., Чергейко Г.М., Куприянов A.A. // Сб. «Актуальные проблемы почвоведения, агрохимии и экологии», МСХА, 2004. - С.368-374.

15.Ванькова, A.A. Экологические особенности фитопатогенных микоплазм // Сб. 13-ой Всерос.школы «Экология и почвы», Пущино, 2006. - С.227-232.

16. Ванькова, A.A. Железоокисляющие бактерии в почвах рисовников // Сб. межд.научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы микробиологии и вирусологию», поев. 80-летию акад.нац. АН респ. Казахстан А.Н. Илялетдинова, Алматы, 2009. - С.27-31.

17.Ванькова, A.A. Микоплазмы - патогены растений / Свиридова Л.А., Ванькова, A.A. // 36. наукових праць «Сшьськогосподарська м1кробюлопя: здобутки та перспективи», Чершпв, 2011. - С.94-100.

Тезисы конференций

18.Ванькова, A.A. Влияние железоредуцирующих и железоокисляющих микроорганизмов на подвижность поливалентных катионов и фосфатов в почвах // Всес. конф. молодых ученых и спец. «Повышение плодородия почв рисовых полей», Краснодар, 1989. С. - 12.

19.Ванькова, АЛ. Сапрофитные формы почвенных микоплазм / Иванов П.И., Ванькова А.А .// Всес. совещание «Микоплазмоз люцерны», Саратов, 1990. - С.47.

20. Vankova, A.A. New medium for isolation and cultivation of Mycoplasmas / Ivanov P.I., Vankova A.A. // Materials of FEMS Workshop «Rapid Diagnosis of Mycoplasmas», Jerusalem, Israel, 1991. - P.37.

21.Ванькова, А.А. Сапрофитные микоплазмы почвы / Иванов П.И., Ванысова А.А., Чернова О.А., Чернов В.М. // 4-ая Всесоюзная конференция «Микроорганизмы в с/х», Пущино, 1992. - С.26

22.Vankova, A. Mycoplasma like organisms isolated from soil / Vankova A., Ivanov P., Chernov V., Chernova O. // Proceedings of the 9th Congress of the IOM, Iova, USA, 1992. - IOM Lett. V.2. - P.144.

23.Vankova, A. Nutrient medium on the plant extract base for the isolation and cultivation of mycoplasmas / Vankova A., Ivanov P.// Proceedings of the 9th Congress of the IOM, Iova, USA, 1992. - IOM Lett. V.2. - P.230.

24. Vankova, A. Mycoplasmas appear out to penetrate into plants through roots / Vankova A., Ivanov P. // Mat. of 6 Int. Symp. Microb. Ecol. Barcelona, 1992.-P. 172.

25.Ванькова, A.A. Почва как среда обитания фитопатогенных микоплазм / Бирюкова О.В., Мидянник Г.А., Ванькова А.А., Иванов П.И. // Тез. 1-ой Международной конференции «Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность», Днепропетровск, 1995. -Т.2. — С.102-103.

26.Ванькова, А.А. Сравнительный анализ численности мелких и крупных форм бактерий в дерново-подзолистой почве / Иванов П.И., Ванькова А.А., Асфур 3. // Тезисы конф. «Микробиология почв и земледелие», С-Петербург, 1998. - С. 104.

27.Vankova, A. Interplay between Acholeplasmas (A. laidlawii) and plants ('Pisum sativum) morphophysiological and molecular aspects / Chernov V., Vankova A., Ivanov P., Chernova O., Gogolev Y., Popova N. // Proceedings of the 12th Congress of the IOM, Sidney, 1998. - P. 191.

28.Ванькова, A.A. Определение фитоплазм в растениях земляники с использованием ДНК-зонда / Белошапкина О.О., Чернов В.М., Ванькова А.А., Батрак Е.Р. // 2-ая Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 2000. - С.134-135

29.Ванькова, А.А. Эффективность инокуляции козлятника восточного штаммами клубеньковых бактерий рода Rhizobium / Ванькова А.А. Дедовская Ю.А. // Всероссийская конференция «С/х микробиология в XIX-XXI вв.», С-Петербург, 2001. - С. 164.

30.Vankova, A. Soil as the habitat for pathogenic mycoplasmas / Vankova A., Ivanov P., Serebrennikova L., Vasiljeva L. // 11th Intern. Congr. on Molecular Plant - Microbe Interaction, S-Pb, 2003. - P.164.

31.Ванькова, A.A. Interplay between mycoplasmas (A. laidlawii) and plants (Medicago sativa and Lyc. esculentum) / Ванькова A.A., Серебренникова Л.А., Хайдарова Г.А., Баранова Е.Н., Чернов В.М., Чернова О.А. // Abstr. Int. sci. conf. «S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology», Yalta, 2007. - P. 32.

32.Ванькова, A .A. Some ecological aspects of soil nanobacteria / Ванькова A.A., Емцев B.T., Иванов П.И. // Abstr. Int. sci. conf. «S.P. Kostychev and contemporary agricultural microbiology», Yalta, 2007. -P. 77.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Формат 60х84,/1б. Усл. печ. л. 2,3. Тираж 100 экз. Заказ 467.

Издательство РГАУ - МСХА 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.: (499) 977-00-12,977-26-90, 977-40-64

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ванькова, Анна Андреевна, Москва

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ -

МСХА имени К.А.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи

05201352092 ВАНЬКОВА АННА АНДРЕЕВНА

НАНОФОРМЫ БАКТЕРИЙ В СИСТЕМЕ «ПОЧВА - РАСТЕНИЕ»

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор В.Т. Емцев доктор биологических наук

профессор рВ.К.Шильникова

Москва-2013

Содержание

Введение...........................................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................10

1.1. Наноформы бактерий.........................................................................10

1.1.1. История изучения наноформ бактерий.........................................10

1.1.2. Методы исследования наноформ бактерий..................................18

1.1.3. Микроорганизмы с дефектной клеточной стенкой.....................24

1.1.4. Современная концепция ультрамикробактерий..........................30

1.2. Микробиологическая трансформация железа в почвах рисовых

полей.............................................................................................33

1.2.1. Соединения железа и их роль в плодородии почв рисовых

полей...........................................................................................33

1.2.2. Железоокисляющие бактерии........................................................41

1.2.3. Железоредуцирующие бактерии в почвах под рисом.................54

1.3. Биология, систематика и распространение микоплазм..................60

1.3.1. Морфологические особенности и ультраструктура микоплазм 60

1.3.2. Физиологические особенности микоплазм..................................64

1.3.3. Таксономия бактерий класса МоШсШеБ.......................................68

1.3.4. Распространение микоплазм в природе........................................72

1.3.5. Методы идентификации микоплазм.............................................75

1.4. Микоплазмы - патогены растений....................................................78

1.5. Почва как среда обитания патогенных микроорганизмов..............87

1.5.1. Почва как среда обитания микроорганизмов...............................87

1.5.2. Фитопатогенные бактерии в почве...............................................92

1.5.3. Патогенные бактерии в почве........................................................94

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.............................97

2.1. Объекты исследований.......................................................................97

2.2. Методы исследований......................................................................100

Глава 3. НАНОФОРМЫ БАКТЕРИЙ В ПОЧВЕ И КОРНЕВОЙ ЗОНЕ РАСТЕНИЙ..................................................................................................107

3.1. Наноформы бактерий в дерново-подзолистой почве....................108

3.2. Наноформы бактерий в ризосфере растений люцерны................110

3.3. Наноформы бактерий в ризоплане растений люцерны.................111

3.4. Ультраструктура и морфология наноформ почвенных бактерий 115 Глава 4. ЖЕЛЕЗООКИСЛЯЮЩИЕ МИКОПЛАЗМЫ...........................132

4.1. Морфологические и культуральные особенности

железоокисляющих микоплазм...............................................132

4.2. Физиологические особенности железоокисляющих микоплазм. 136

4.3. Механизмы окисления железа микоплазмами...............................144

Глава 5. ПОЧВА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ ФИТОПАТОГЕННЫХ МИКОПЛАЗМ.............................................................................................153

5.1. Разработка эффективных селективных методов выделения

Acholeplasma laidlawii из почвы..............................................155

5.2. Метод ПЦР для детекции Acholeplasma laidlawii в почве............167

5.3. Исследование динамики численности интродуцированной

популяции А. laidlawii в почве.................................................170

5.4. Изучение влияния физико-химических факторов среды на

динамику численности А. laidlawii в почве............................173

Глава 6. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОПЛАЗМ С ВЫСШИМИ РАСТЕНИЯМИ...........................................................................................177

6.1. Изучение проникновения микоплазм в растения через корневую

систему.......................................................................................178

6.2. Морфоцитолологические особенности растений Medicago sativa и

Lycopersicum Esculentum Mill., инфицированных микоплазмами Acholeplasma laidlawii....................................181

6.3. Взаимодействие микоплазмы Acholeplasma laidlawii с

симбиотической системой Medicago sativa - Rhizobium meliloti........................................................................................188

ВЫВОДЫ.....................................................................................................198

Список литературы.....................................................................................201

Введение

Актуальность темы. Глобальные проблемы ХХ1-го столетия -ограниченность энергетических, пищевых, сырьевых ресурсов, загрязнение окружающей среды - способствуют тому, что мысль человека все больше обращается к микроорганизмам, как мощным и многообразным каталитическим системам, способным трансформировать вещества различной природы при относительно небольших затратах энергии и «наличии у них могущественной химической силы» [1].

Почвенная микробиология на современном этапе развития решает ряд фундаментальных проблем: участие микроорганизмов в круговороте веществ и превращении энергии в биосфере, роль микроорганизмов в почвообразовательных процессах, взаимодействие микроорганизмов и растений, охрана почв, управление микробными популяциями в почве и др. Одно из важнейших фундаментальных направлений почвенной микробиологии - исследование биоразнообразия микроорганизмов. Вопрос об исследовании почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования биосферы Земли, особенно остро был поставлен после проведения в Мексике в 1994г. Международного конгресса почвоведов «Почвы и биоразнообразие» [2,3], где почву рассматривали как среду обитания, генератор и хранитель жизни на Земле. «Почвы являются живыми, динамическими, сложными, комплексными системами» [4], обладающими исключительным биологическим разнообразием. Внедрение молекулярных методов исследования в последние десятилетия существенно изменило традиционное представление о микробном разнообразии почв. Было показано, что в 1г почвы может находиться более 10 млрд микробных клеток - от нескольких тысяч до миллиона геномных видов, при том что к настоящему времени охарактеризовано не более 5 тыс. видов. Только 0,1-1% микроорганизмов почвы представлены культивируемыми видами [5]. Одним из основных

достижений в области изучения биоразнообразия является выявление группы архей как самостоятельного домена живых организмов [6,7].

В проблеме биоразнообразия определенное место занимают наноформы (НФ) почвенных бактерий. Проблема существования бактерий в почве в виде НФ, размеры которых значительно меньше размеров обычных бактерий и сопоставимы с размерами вирусов, имеет длительную историю [8,9,10,11,12] [13,14,15,16,17,18,19,20,21,22]. Однако, до сих пор физиологические особенности, таксономия и экологические функции этих бактерий практически не изучены в связи с определенными методическими трудностями. Между тем, знание указанных особенностей необходимо для понимания закономерностей функционирования микробного сообщества почвы. Кроме того, среди представителей НФ встречаются возбудители заболеваний растений, животных и человека, например, микоплазмы или Ь-формы патогенных бактерий. Эти ультрамикроскопические бактерии традиционно служат объектом пристального внимания медиков, ветеринаров и фитопатологов, но до сих пор не попадали в поле зрения экологов и почвенных микробиологов. Поэтому, вопросы, связанные с их обитанием в почве и циркуляцией в биоценозе остаются практически не изученными.

Задачи исследования:

1. Разработка новых методических подходов к изучению НФ бактерий в почве.

3. Изучение влияния железоокисляющих микоплазм на свойства лугово-черноземной почвы под культурой риса.

4. Оценка почвы как возможной среды обитания фитопатогенных микоплазм (на примере АсИо1ер1а$та 1шс11ам>и).

5. Изучение особенностей взаимодействия микоплазм (А. \aidlawii) и растений.

Из лугово-черноземной почвы под культурой риса выделены 8 новых штаммов микоплазм, отнесенных на основе проведенной идентификации к р. 81йегососст. Установлено, что бактерии интенсивно окисляют железо, которое откладывается на поверхности их клеток в капсулах, и служат «центрами осадкообразования» этого элемента в почве, повышают эффективную растворимость его гидроокиси, не вызывая при этом значительных изменений окислительно-восстановительного состояния окружающей среды. Выявлена способность изученных бактерий к образованию комплексных соединений с железом.

Впервые предложены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в ее механической обработке, использовании

селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые охарактеризовано поведение интродуцированной популяции микоплазмы A. laidlawii в различных типах почв. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция микоплазмы A. laidlawii сохраняется в черноземной почве в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой - 1 сутки. Численность интродуцированной популяции не стабилизируется. Время выживания определяется исходным уровнем обилия популяции и факторами окружающей среды.

в почве, что расширит имеющиеся представления об этой малоизученной группе бактерий.

Установлена устойчивость томатов сорта Золотая Капля к А. 1тсИашг.

Основные защищаемые положения диссертации

2. В структуре бактериального комплекса лугово-черноземной почвы рисовников функционирует группа железоокисляющих микоплазм

р. Siderococcus. Окисление железа приводит к увеличению его подвижности, миграции к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному накоплению в почве.

3. Почва является естественным резерватором и источником фитопатогенных микоплазм (A. laidlawií). Длительность выживания интродуцированной в почву популяции определяется факторами среды и исходным уровнем обилия.

4. Микоплазмы (A. laidlawií) способны проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы, длительно персистировать в них, вызывать специфические морфологические изменения.

5. При инфицировании растений {Medicago sativa и Lycopersicum esculentum) микоплазмами (A. laidlawií) происходят деградация ультраструктуры клеток листовой ткани, изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях, в то же время более интенсивный рост и развитие, стимулирующий (протективный) эффект на нитрогеназную активность.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Наноформы бактерий

Современные представления о мире прокариот базируются на данных, полученных при изучении бактерий, имеющих клетки обычных размеров 0,5-1,5x1-10 мкм [23,24]. Вместе с тем применение современных методов исследования микроорганизмов - ультрафильтрации, дифференцированного центрифугирования и электронной микроскопии позволило выявить значительное количество "карликовых клеток" в природных местообитаниях [8,9,10,11,12,13,14,15,16,17] [25,18,26,27,19,28,20,21,22,29] [30,31]. Их размеры значительно меньше размеров «обычных» бактерий. В настоящее время к нанобактериям относят прокариоты с диаметром клетки <0,5 мкм [32]. Сведения об этих клетках достаточно многочисленны, однако физиологические особенности, таксономия и экологические функции практически не изучены.

1,1.1. История изучения наноформ бактерий

Первые данные о существовании невидимых и фильтрующихся форм видимых бактерий относятся к началу прошлого века [33,34]. В 1916 году была опубликована обширная работа Лениса и Смита [35]. "Жизненный цикл бактерий", в которой описана способность почвенных и водных сапротрофных бактерий образовывать фильтрующиеся формы. В частности, был установлен факт образования азотобактером клеток (частиц), способных проходить через поры бактериальных фильтров, что в 30-е годы было подтверждено работами H.A. Красильникова [10], Д.М. Новогрудского и М.А. Мессиневой [36], В.А. Бачинской [37]. Исследования Д.М. Новогрудского и М.А. Мессиневой [36] показали, что в почве в значительном количестве (1-10 тыс./г почвы) присутствуют мелкие формы денитрифицирующих, аммонифицирующих и азотфиксирующих бактерии. «Невидимые в обыкновенные микроскопы элементы бактериальных клеток вследствие малых размеров проходят через бактериальные фильтры и при благоприятных условиях способны вновь превращаться в видимые бактерии [36]. Д.М.Новогрудским [8] был дан один

из первых обзоров о "невидимых формах видимых бактерий". В более поздних работах он указывал, что многие виды, находясь в почве, резко уменьшаются в размерах и даже приобретают новые морфологические признаки. Кроме измельчания известных нам форм, в почве обнаруживаются совершенно новые виды и группы микроорганизмов, определение которых очень затруднено. В этот же период были обнаружены и изучены фильтрующиеся формы у клубеньковых бактерий [38].

К значительным работам

Информация о работе

Ванькова, Анна Андреевна
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Наноформы бактерий в системе "почва - растение" - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Наноформы бактерий в системе "почва - растение" ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Наноформы бактерий в системе "почва - растение""

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ванькова, Анна Андреевна, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Наноформы бактерий в системе "почва - растение"
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология