Изменения структурной организации бактериальных клеток при стрессовых воздействиях

Абашина, Татьяна Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменения структурной организации бактериальных клеток при стрессовых воздействиях
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изменения структурной организации бактериальных клеток при стрессовых воздействиях"

На правах рукописи

АБАШИНА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА

ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ СТРЕССОВЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ

03.00.07. - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

003176915

Работа выполнена в паборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН и Пущинском государственном университете

Научный руководитель

Консультант

доктор биологических наук М Б Вайнштейн кандидат биологических наук НЕ Сузина

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Л И Евтушенко доктор биологических наук О И Баулина

Ведущая организация Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Защита диссертации состоится «А» октября 2007 г в 9" часов на заседании диссертационного совета Д 002 121 01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН (ИБФМ РАН) по адресу 142290, Московская область, г Пущино, проспект Науки, д 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН

Автореферат размещен на сайте http //www lbpm ru Автореферат разослан 2/ сентября 2007г

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

ВМ Вагабов

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Актуальность проблемы Реакции микроорганизмов на воздействие различных внешних факторов являются объектом постоянного внимания различных исследователей Бактерии подвержены воздействиям агентов, способным вызывать изменения в биохимических и физико-химических процессах, а в дальнейшем - в морфологии и структурной организации клеток Литературные сведения о влиянии экстремальных внешних факторов на морфологию и организацию клеток бактерий посвящены в основном разрушению клеток при сильных стерилизующих воздействиях (высокая температура, ультрафиолетовое излучение, СВЧ высокой мощности) или эффектам длительных неблагоприятных воздействий (голоданию, накоплению метаболитов и т д), а не кратковременных неблагоприятных (здесь и далее по тексту - стрессовых) Вместе с тем при не стерилизующих стрессовых воздействиях также могут происходить изменения в организации клеток, и исследование структурных особенностей бактерий, возникающих в неблагоприятных условиях, представляет значительный интерес для получения новых цитологических сведений Возрастающее давление физических техногенных факторов на окружающую среду увеличивает актуальность таких исследований

Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение структурной организации бактерий после воздействия физическими агентами (ультрафиолетовым излучением, магнитным вакуумом, электрическим током, радиоволновым излучением, видимым светом) В соответствии с целью работы в задачи исследования входило

1 Выявить наличие специализированных структур или структурных модификаций бактериальных клеток, возникающих в результате кратковременных неблагоприятных (стрессовых) воздействий физических агентов (магнитные/геомагнитные поля, электрический ток, радиоволновое и световые излучения)

2 Изучить защитные коммунальные экстрацеллюлярные структуры грамотрица-тельных бактерий Pseudomonas и их изменения при ультрафиолетовом облучении культур

3 Проверить возможное влияние магнитных полей на бактерии и изучить структурные особенности клеток бактерий при изменении магнитной обстановки в присутствии ионов железа в среде

4 Изучить возможность образования наноформ бактерий у грамотрицательных и грамположительных бактерий при неблагоприятных воздействиях, создаваемых постоянным электрическим током, радиоволновым облучением, видимым светом, и провести цитологическое сопоставление образующихся наноформ с обнаруживаемыми в естественных местообитаниях

5 Выявить закономерности в структурных изменениях бактериальных клеток, возникающих под воздействием различных физических стрессовых факторов

Научная новизна При отборе путем скрининга культур грамотрицательных бактерий, переживающих условия стерилизации облучением в ультрафиолетовом диапазоне (УФ, «жесткий ультрафиолет» 8 м), впервые выделены штаммы Pseudomonas, образующие ранее неизвестные коммунальные экстрацеллюлярные структуры Коммунальные структуры у одноклеточных бактерий Pseudomonas представляют новый цитологический феномен Показана защитная роль этих специализированных структур бактерий, обеспечивающих рост и размножение в условиях постоянного облучения УФ

Впервые показано, что «магнитный вакуум» (компенсированное геомагнитное поле) в присутствии в среде соединений ферримагнитного железа приводит к формированию дополнительной микрокристаллической экстраклеточной структуры у Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2170, в то время как в обычных геомагнитных условиях таковой нет, но формируются магниточувствительные включения

Обобщены экспериментальные данные по структурным ответным реакциям клеток бактерий при стрессовых воздействия этектрическим током, радиоволновым изтучением, видимым светом Показано, что во всех случаях грамотрицательные и грамположительные бактерии способны формировать жизнеспособные наноформы, однако, у грамотрицательных образование наноформ происходит путем множественного деления или нанопочкования и сопровождается образованием множественных везикул внешних мембран

Практическая значимость работы. Отработаны методики экспериментов с применением различных физических агентов и их мощностей, позволяющие изучать структурные изменения бактериальных клеток Получены новые сведения о ранее неизвестных коммунальных экстрацеллюлярных структурах формирующих многоклеточные радиоустойчивые ассоциаты бактерий, которые должны учитываться при обеззараживаниях с применением УФ-стерилизации

Апробация работы Результаты и основные положения работы представлены на международной конференции FEMS (Ist FEMS Congress of European Microbiologists), на международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2004), междисциплинарном семинаре «Биологические эффекты солнечной активности» (Пущино, 2004), на конференции МНТЦ (Чонгбук, Южной Корея, 2004), на семинарах в Центре исследований окружающей среды UFZ (Лейпциг, 2006-2007), а также на семинарах и постерных сессиях ИБФМ РАН (Пущино, 2003-2007)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 7 - тезисы, 5 - экспериментальных статей (4 - в реферируемых журналах)

Структура и объем диссертации Диссертация включает введение, обзор литературы (раздел 1), описание объектов и методов исследования (раздел 2), результаты экспериментов и их обсуждение (раздел 3, состоящий из 6 глав), заключение, выводы, список использованной литературы, а также приложение, содержащее собственные материалы с описаниями бактериальных наноформ в естественных местообитаниях Материалы диссертации изложены на 128 страницах машинописного текста, содержат 50 рисунков и 7 таблиц Список литературы включает 184 источника, из которых 141 на иностранных языках

Автор благодарит коллектив сотрудников лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН за постоянное доброжелательство и помощь в работе Особую благодарность и признательность автор выражает руководителю лаборатории проф д б н В И Дуде Автор благодарен своим научным руководителям д б н М Б Вайнштейну и к б н Н Е Сузиной за разностороннюю поддержку в выполнении исследований и ценные советы при подготовке статей Отдельную благодарность за консультации и помощь в проведении идентификации бактерий автор выражает заведующему сектора бактерий отдела ВКМ к б н В Н Акимову

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленной целью работы объектами исследований служили чистые культуры бактерий из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ), рабочей коллекции лабораторий физиологии микроорганизмов, лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН и собственные изоляты (Табл 1) Культуры для сопоставления были отобраны как представители групп с различными цитологическими особенностями (грамотрицательные и грамположительные, образующих и не образующих споры, образующие и не образующие простеки)

Таблица 1 Основные использованные в работе чистые культуры бактерий

N п/п Видовое название Обозначение штамма N п/п Видовое название Обозначение штамма

1 Asticcacauhs taihuensis ВКМ B-2400 9 Pseudomonas fluorescens ВКМ В-894т

2 Bacillus cereus ВКМ В-504т 10 Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2170

3 Bacillus circulans ВКМ В-12421 11 Pseudomonas stutzen ВКМ В-975т

4 Desulfomicrobium baculatum ВКМ В-13781 12 «Pseudomonas stutzen» ЕМ42

5 Escherichia coli ВКМ В-125 13 «Pseudomonas stutzen» ЕМ46

6 Kocuria rosea ВКМ Ас-2200т 14 «Pseudomonas stutzen» ЕМ47

7 Pseudomonas aeruginosa ВКМ В-552 15 Rhodopseudomonas palustris ВКМ В-1620т

8 Pseudomonas aurantiaca |BKMB-1558 16 Rhodospinllum rubrum ВКМ В-162Г

* - типовой штамм вида

В таблице не приведены культуры, взятые для сравнения при обработке жестким УФ-излученисм и не обнаружившие роста после облучения (кроме референтного типового штамма Pseudomonas stutzen ВКМ В-9751), а также испочьзованные в опытах с переносом плазмид

Культивирование бактерий проводили на средах, перечисленных в тексте диссертационной работы

Общие микробиологические и молекулярно-генетические таксономические исследования проводили принятыми методами (Sambrook et al, 1989, Wheeler et al, 1996, De Bruijn, 1992) В частности при идентификации использованы BIOLOG GN Micro Plate, API 20E Интенсивность гетеротрофной ассимиляции карбоната измеряли с использованием Ыаг СОз (Романенко, Кузнецов, 1981) Численность бактерий определяли прямым счетом при фазово-контрастной микроскопии (Вайнштейн, Лауринавичус, 1988) Также в работе широко использовались биохимические методы анализа

Особое внимание было уделено методам электронной микроскопии для разработки приемов анализа структурных изменений клеток бактерий (Гайер, 1974, Luft, 1966, Reynolds, 1963)

В ходе исследований влияния физических агентов на клеточные и надклеточные структуры бактерий использованы ультрафиолетовое освещение (УФ), компенсированное магнитное поле (магнитный вакуум), постоянный электрический ток, высокочастотное радиоизлучение и видимый свет

Облучение бактерий светом в ультрафиолетовом диапазоне проводили двумя способами 1) под ультрафиолетовую лампу (VL-206G, длина волны 254 нм) помещали кварцовые колбы и/или кварцовые чашки Петри с культурами, 2) под ультрафиолетовую лампу (VL-206G, длина волны 254 нм) помещали открытые чашки Петри с культурами Эксперименты проводили при комнатной температуре, в разных экспериментах от 1 часа до 3 дней

Компенсированное магнитное поле получали в специальной установке Геомагнитной обсерватории Института физики Земли РАН, которая основана на системах катушек Гельм-готьца с постоянной компьютерной корректировкой параметров в зависимости от окружающих геомагнитных параметров Напряженность магнитного поля в искусственном «магнитном вакууме» во время экспериментов составляла около 5 10ч Э Для сравнения напряженность магнитного поля при искусственном «магнитном возмущении» (магнитном поле, напряженность которого превышала напряженность геомагнитного на порядок) в период экспериментов составила около 5 Э В экспериментах по воздействию магнитными условиями исследовали не только цитологические параметры, но и удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода 14С, поступающего в клетки в составе ионов

При изучении воздействия электрического тока в качестве источника напряжения использовали блок импульсного питания Б5-7 Как правило, величина подаваемого напряжения для всех экспериментов составляла 12 В, при этом сила тока составляла 6 мА, ее величину дополнительно регулировали тонкой настройкой, а измеряли и периодически контролировали с помощью амперметра М45МОМЗ Дополнительный контроль напряжения осуществляли с помощью тестера Время воздействия варьировали от 3 часов до 3-х суток В отдельном эксперименте величина подаваемого напряжения составляла 200 В, а сила тока при этом достигала значения 100 мА В этом случае время воздействия составляло 30 минут

Для изучения воздействия высокочастотных излучений (радиоизлучений) суспензии бактерий в физиологическом растворе и жидкой синтетической питательной среде подвергали воздействию высокочастотного излучения на спектроанализаторе 8559 А (Hewlett Packard) или «Луч-2» Спектр, дозировку и продолжительность воздействия отрабатывали в ходе экспериментов, используя облучение в диапазоне 150 МГц - 5 ГГц при мощности излучения 300-1400 Вт и времени облучения 5 или 10 мин при комнатной температуре

Облучение естественным светом осуществляли в течение 1 мес при культивировании бактерий на поверхности твердой агаризованной среды при комнатной температуре Интенсивность света, измеренная люксметром Ю-16, варьировала от 0 (ночь) до 30 кЛк

Во всех экспериментах контролем служили те же культуры бактерий, которые помещали рядом, но без указанных воздействий

В целом методы исследований подробно описаны в диссертационной работе и публикациях

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Формирование бактериями коммунальных экстрацеллюлярных структур, обладающих радиозащитным действием при облучении культур УФ-светом

При скрининге грамотрицательных бактерий (более 30 культур, выделенных из разных источников или взятых из коллекции), устойчивых к излучению в диапазоне жесткого ультрафиолета (254 нм), были отобраны 3 штамма ЕМ42, ЕМ46 и ЕМ47 Штаммы выделены соответственно из комнатного растения Rhipsahs, воздух ламинарного бокса с работающим ультрафиолетовым стерилизатором и ила озера Байкал Нуклеотидные последовательности генов 16S гРНК (~ 1500 нуклеотидов) были идентичны у всех трех штаммов, и по результатам филогенетического анализа штаммы оказались наиболее близкими к Pseudomonas stutzen ВКМ В-975т с уровнем сходства более 99% (данные GenBank с использованием программы BLASTn и программы ClustalX) По фенотипическим характеристикам, определенным с помощью тестов BIOLOG GN Micro Plate и API 20Е, штаммы Pseudomonas spp EM42, EM46 и EM47 отличались друг от друга и от типового штамма Pseudomonas stutzen ВКМ В-9751 не

более чем на 5 из 100 фенотипических признаков. Штаммы были также сравнены между собой и типовым штаммом при помощи REP-PCR с ERlC-праймсрами: фингерпринты всех четырех штаммов различаются, что свидетельствует о генетических различиях между ними.

При цитологическом исследовании структур, предположительно обеспечивающих устойчивость к ультрафиолетовому излучению, обнаружено, что штаммы Pseudomonas spp. ЕМ42, ЕМ46, ЕМ47 образуют конгломераты клеток, объединенные коммунальной оболочкой (Рис. 1). При изготовлении препаратов для световой микроскопии с сильным давлением на покровное стекло обнаруживали как конгломераты клеток, так и пустые оболочки при отдельных клетках в окружающей жидкой среде (Рис. 1). При приготовлении препаратов без раздавливания агрегатов (например, заливка в смолы для электронной микроскопии) клетки после облучения оставались внутри оболочек, Рост изучаемых бактерий на твердой среде сопровождается увеличением количества клеток внутри оболочек: количество клеток в такой «микроколонии» варьирует от 2 до 20 и больше. В молодой культуре (лаг-фаза) преобладают единичные клетки, коммунальные оболочки с заключенными в них «микроколониями» малочисленны, число «микроколоний» увеличивается с возрастом культуры.

Рис 1: а - Pseudomonas sp. ЕМ42, b - Pseudomonas sp. EM46, с - Pseudomonas sp. EM47, d — Pseudomonas stutzen BKM В-975т (Фазовый контраст), а - конгломераты клеток в коммунальной оболочке (указано стрелками); на рисунке (Ь) стрелками обозначены делящиеся конгломераты; с - пустые и частично освобожденные от клеток коммунальные оболочки. (х12000). Толстыми короткими стрелками указаны места формирования перетяжек-перегородок в стенке коммунальных оболочек.

Обнаруженная у бактерий Pseudomonas коммунальная оболочка и формирование в

ней «микроколоний» клеток представляют собой новый цитологический феномен, в связи с чем нами проведено его отдельное цитологическое исследование. Ультраструктурная организация коммунальных оболочек представлена плотно упакованными, уложенными параллельно друг другу и клеточной стенке тонкими фибриллами. Толщина коммунальной оболочки варьирует в зависимости от расположения «микроколонии» в бактериальной колонии в целом и условий роста (до 120 нм в приповерхностном слое и 40 нм в глубине колонии). Обнаружено участие везикул внешней мембраны клеток в формировании оболочки и их наличие в экстрацеллюлярном матриксе внутри коммунальной оболочки (Рис. 2). Сравнительный анализ ультратонких срезов и изображений световой микроскопии показал, что коммунальные оболочки способны к делению с формированием септы, которая, как и наружная коммунальная оболочка, образуется с участием мембранных везикул. Формирование септы происходит независимо от деления клеток, таким образом, деление коммунальной оболочки в результате приводит к делению «микроколоний» на более мелкие. Формирование коммунальных оболочек у исследованных штаммов Pseudomonas spp. в общем виде имеет некоторое сходство с чехлами цианобактерий Gloeocapsa, Gloeobacter, Nosioc.

1 0ВМ ' основании данных

^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ кроме того,^ присутствие

Рис. 2. Ультраструктурная организация коммуначьной et ai., 2004)). Содержание крем-

оболочки в колонии клеток штамма Pseudomonas sp. ния достигшю 21 мг/кг биомас_ ЕМ42. О — коммунальная оболочка; ВВМ - везикулы

внешней мембраны; Н - нуклеоид; М - матрикс. Толстой сы против 12 мг/кг биомассы у

короткой стрелкой показано место формирования пере- типового штамма Pseudomonas тяжки-перегородки в стенке коммунальных оболочек.

Длина масштабной метки соответствует 0,1 мкм stutzen ВКМ В-975 , не обра-

зуюхцего коммунальные оболочки.

Анализ изображений, полученных при помощи методов люминесцентной микроскопии, различающих живые и мертвые (покоящиеся) клетки, позволил сделать следующие выводы: клетки внутри экстрацеллюлярных образований у штаммов Pseudomonas spp. ЕМ42, ЕМ46, ЕМ47 после ультрафиолетового облучения остаются живыми. Последующий рост колоний показал, что клетки продолжают активно делиться. Наши эксперименты при выделении, отборе и культивировании этих штаммов позволили предположить, что коммунальная оболочка является барьером при прохождении лучей жесткого ультрафиолета к клеткам бактерий. При параллельных посевах Pseudomonas sp. ЕМ42 и типовой штамм Pseudomonas stützen ВКМ В-975т на агаризованную среду в кварцевых флаконах и культивировании под УФ-облучением в условиях этого стрессового воздействия вырастал только штамм, образующий экстраклеточную структуру. Контролем служил рост без УФ-облучения, где рост был отмечен для обеих культур (Рис. 3).

о,оп+оо

4.0Е+12

3.0E+I2

¡2,0Е+12 ■ 3

1.0В+12

О.ОЕ+00 ■

время (ч) контроль

-УФ

время (ч) контроль ~ УФ

Рис. 3. а) Рост Штамма Pseudomonas sp. ЕМ42 в условиях облучения жестким ультрафиолетом (254 нм), контролем служили культуры, экранированные фольгой. Ь) Рост Pseudomonas stützen ВКМ В-975Т в условиях облучения жестким ультрафиолетом (254 нм), контролем служили культуры, экранированные фольгой.

Электронно-микроскопическое исследование подвергнутого УФ-облучению типового штамма Pseudomonas stutzeri ВКМ В-975т обнаружило известную типичную картину разрушения клеток бактерий. В противоположность этому исследование штамма Pseudomonas sp. ЕМ42, подвергнутого воздействию УФ-излучения, обнаружило следующие структурные особенности по сравнению с контролем: увеличение объема матрикса внутри коммунальной оболочки с уменьшением толщины и плотности ее стенок при сохранении целостности заключенных внутри нее клеток, жизнеспособность которых подтверждается микробиологическими методами (пересевы). Цитохимические анализы показали также, что коммунальные оболочки ограничивают проникновение тяжелых металлов (Ru, Os) внутрь микроколоний.

Обнаруженные и описанные в ходе исследований коммунальные экстрацеллюлярные структуры являются новым, ранее неизвестным цитологическим феноменом для бактерий

рода Pseudomonas Отсутствие индукции образования аналогичных экстрацеллюлярных защитных структур у ближайшего в систематическом отношении вида Pseudomonas stutzen и образование структур у трех исследованных штаммов Pseudomonas spp свидетельствуют о их наследуемом, а не индуцированном характере Все три штамма были исследованы на наличие плазмид бьшо показано, что штаммы Pseudomonas spp БМ42 и ЕМ47 имели одну большую плазмиду IncP (~ 20kb), штамм Pseudomonas sp ЕМ46 - три плазмиды IncPa, IncPß, IncQ (одна ~ 20kb и две многокопийные ~ 2,lkb и ~ 3,5kb), в то время как типовой штамм Р stutzen В КМ В-975т не содержит плазмид При конъюгации штаммов-носителей плазмидной ДНК Pseudomonas spp ЕМ42, ЕМ46 со штаммами Eschenhia coli XL-lblue, Е coli IM109, Р putida PAW340 и Р stutzen ВКМ В-975т полученные коньюганты не приобретали способность расти в условиях жесткого ультрафиолета, то есть гены устойчивости к жесткому ультрафиолету находятся не в плазмидной ДНК

Таким образом, обнаружен ранее неизвестный тип коммунальной экстрацеллюлярной структуры псевдомонад, исследована его организация и показана его защитная роль при неблагоприятных воздействиях Вместе с этим изучены изменения, происходящие в указанной защитной структуре при стрессовых воздействиях ультрафиолетового излучения на бактерии

2. Влияние геомагнитного поля на активность бактерий и на формирование над-клеточных и внутриклеточных структур.

Литература о воздействии магнитных/геомагнитных полей на бактерии разноречива, а основные результирующие данные представлены как сведения о влиянии на биохимическую активность или на численность клеток Нами были исследованы воздействия «магнитным вакуумом» (компенсированным геомагнитным полем 5х 10"4 Э) и «магнитным возмущением» (магнитным полем с повышенной напряженностью 5 Э) в сравнении с естественным геомагнитным по тем на штаммы Р ßuorescens ВКМ В-2170, Косипа rosea ВКМ Ас-2200т, Bacillus circulans ВКМ В-1242т При постановке экспериментов исходно бьшо предположено, что возможные различия в активности легче проследить на ассимиляции ионов как заряженных частиц в магнитном поле и что возможное влияние магнитного поля будет различно проявляться в зависимости от наличия ферримагнитного железа в среде Соответственно цитологические различия следует исследовать в тех случаях, когда есть различия в активности бактерий

В качестве показателя активности бактерий использовали удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода (УСА, скорость гетеротрофной ассимиляции карбонатного углерода в пересчете на клетку) Сравнение результатов показало, что влияние магнитных условий было различно в зависимости от фазы роста бактерий (наличие влияния только в лог-

фазе, на последующих стадиях роста оно не выражено). Обнаруженный нами различный характер реакции на разных стадиях роста может объяснить разброс и противоречивость опубликованных результатов исследователей, работавших вне изучения динамики процесса и оценивавших влияние магнитных полей по таким накопительным характеристикам, как общая численность популяции.

В опытах без добавления железа УСА была ниже в «магнитном вакууме», чем в естественном геомагнитном поле для всех проверенных штаммов {P. fluorescens ВКМ В-2170, К. rosea ВКМ Ас-2200т, В. circulans ВКМ В-12421). Влияние «магнитного возмущения» в сравнении с естественным геомагнитным полем проверено только для P. fluorescens ВКМ В-2170: в этом случае также УСА была ниже при меньшем магнитном напряжении. Примеры полученных результатов показаны на рисунке 4 и 7.

1.4Е-09 1,2Е-09 1Е-09 ï 8Е-10 6Е-10 -4Е-10 2Е-10 0

1,4Е-09 1,2Е-09 1,0Е-09 8,ОЕ-10 6,0Е-10 4,0Е-10 2.0Е-10 0,ОЕ+00

У Ifli an —

время, ч □ Ps.fluorescens^eoMar.nofle S Ps.fhiorescens вакуум В K.rosea вакуум S K.rosea^reoMar.none 0 B.circubns вакуум В В.сшпЛюхеомаг.поле

Рис. 4. Влияние геомагнитной обстановки на УСА P. fluorescens В-2170, К. rosea Ас-2200Т, В. circulans В-1242т без добавления железа в среду.

время

QPs.fluorescens вакуум laPs.fluorescens, геомаг.поле ■ K.rosea вакуум 0 K.rosea, геомаг.поле 0 B.circulans вакуум Ш В.circulans,геомаг.поле

Рис. 5. Влияние геомагнитной обстановки на УСА P. fluorescens В-2170, К. rosea Ас-2200Г, В. circulans В-1242Т в присутствии железа в среде.

□ Ps.fluorescens вакуум И Ps.fluorescens контр ■ K.rosea вакуум Ш K.rosea контр

□ B.circulans вакуум @ B.circulans контр

9 12 22 29 36 Время, ч

□ УСА, вакуум Ш УСА, геомагнитное поле 0 УСА, геомагнитное возмущение

Рис. 6. Влияние геомагнитной обстановки на Рис. 7. Влияние геомагнитной обстановки на

УСА P. fluorescens В-2170. К. rosea Ас-2200Т, УСА P. fluorescens ВКМ В-2170 без добавле-

В. circulons В-12421 в присутствии кобальта ния железа в среду, в среде

4Е-11

3.5Е-11

ЗЕ-11

2.5Е-11

2Е-11

1ДЕ-11

1Е-11 -

5Е-12 -

О •

3 6 9 12 22 29 36 46 Время, ч □ УСА, вакуум (Ре) Ш УСА, геомагнитное поле (Ре) ЕЗ УСА, геомагнитное возмущение (Ре)

□ УСА, вакум (Со) ■ УСА, геомагнитное поле (Со) Ш УСА, геомагнитное возмущение (Со)

Рис. 8. Влияние геомагнитной обстановки па Рис. 9. Влияние геомагнитной обстановки на УСА Р. Аиогеясепя ВКМ В-2170 в присутст- УСА Р. Аиогезсет ВКМ В-2170 в присутствии железа в среде. вии кобальта в среде.

Однако при дополнительном внесении в среду хелатированного трехвалентного железа (конечная концентрация — 19 мг Ре3"7л) ситуация была обратной: УСА в магнитном вакууме была выше, чем в геомагнитном поле у всех проверенных штаммов, пример приведён на рис. 5 и 8. Аналогичные результаты были получены при замене железа на другой ферримаг-нетик - кобальт, 19 мг/л (Рис. 6, 9).

Для штамма Р. Аиоге5сет ВКМ В-2170, обнаружившего заметные различия в удель-

ной скорости ассимиляции карбонатного углерода в различных магнитных условиях, были проведены цитологические анализы организации клеток. Электронно-микроскопические анализы целых клеток и ультратонких срезов показали, что присутствие железа в естественных условиях (условиях геомагнитного поля) приводило к формированию уже описанных ранее (Вайнштейн и др., 1998; УатэЫеш й а1., 2002) внутриклеточных магниточувствитель-ных включений. На рисунке 10а представлен ультратонкий срез клеток Р. Аиогеясепя, где стрелками указана внутриклеточная локализация электронно-плотных глобул, содержащих железо. Эти внутриклеточные включения ничем не отличаются от показанных ранее, также образуемые этим штаммом в других средах, содержащих соединения мсталлов-ферримагнетиков, в условиях естественного геомагнитного поля (Арискина и др., 2002). Однако в «магнитном вакууме» при наличии в среде железа внутриклеточные магниточувстви-тельные включения-глобулы у бактерий отсутствовали, но образовывались неописанные ранее кристаллические структуры, расположенные в непосредственной близости от поверхности клеток (Рис. 10Ь). Следует заключить, что в геомагнитном поле железо проникает внутрь клеток с образованием магниточувствительных включений, а при воздействии магнитного вакуума происходит формирование микрокристаллической надклеточной структуры.

Рис. 10. Ультратонкие срезы клеток Р. /¡иогезеепя ВКМ В-2170, выращенных в различных геомагнитных условиях в присутствии хелатированного железа в среде: а) геомагнитное поле, стрелками показаны магниточувствительные включения, б) магнитный вакуум, стрелками показана надклеточная кристаллическая структура.

Таким образом, изменения геомагнитной обстановки, в частности - воздействие магнитным вакуумом, влияют на удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода в лог-фазе роста бактерий. В присутствии в среде ферримагнетика (19 мг Ре3+/л) обнаружены различия в организации клеток Р. Аиогезсепз ВКМ В-2170: формирование ранее неописанной дополнительной надклеточной структуры в условиях магнитного вакуума в контраст образованию уже известных магниточувствительных включений. Предположительно, эта микрокристаллическая структура играет компенсаторную роль в приспосабливании бактерий к необычным магнитным условиям.

3. Образование наноформ при воздействии на бактерии электрическим током, видимым светом, радиоволновым излучением.

Принципиальная возможность образования бактериями наноформ без голодания и обработок химическими агентами, но при воздействии физическими агентами была показана ранее (Vamshtem et al, 1998, Вайнштейн, Кудряшова, 2000) Настоящее исследование посвящено более подробному электронно-микроскопическому изучению образования на большем количестве тест-объектов и в различных испытываемых условиях Дополнительный интерес представляет электронно-микроскопическое сравнение образуемых наноформ с природными из естественных местообитаний, - сведения о обнаруженных нами природных на-ноформах, как сопоставительный материал, вынесены в приложение

При исследовании влияния физических факторов на бактерии в качестве исследуемых тест-объектов использованы организмы, различные по 1) организации клетки (наличию или отсутствию наружной мембраны - грамотрицательные и грамположительные), 2) отношению к кислороду при культивировании, 3) наличию или отсутствию внутриклеточных структур и внешнеклеточных выростов

В диссертационной работе приведены результаты экспериментов, выполненных с разными культурами и в различных режимах воздействия электрическим током 1) факультативно анаэробные грамотрицательные бактерии Е coli ВКМ В-125, ток мощностью 1 мА, время обработки 5 сут, 2) аэробные грамотрицательные бактерии с внешними структурами Asticcacauhs taihuensis ВКМ В-2400, ток мощностью 100 мА, время обработки 30 минут, 3) аэробные грамотрицательные бактерии с внешними структурами А taihuensis ВКМ В-2400, ток мощностью б мА, время обработки 1 сут, 4) аэробные грамотрицательные бактерии Р aurantiaca ВКМ В-1558, ток мощностью 6 мА, время обработки 2 сут, 5) аэробные грамположительные кокки (изолят из вечной мерзлоты), ток мощностью 6 мА, время обработки 3 часа

В результате воздействий электрическим током в б мА бактерии Р aurantiaca ВКМ В-1558 и Е coli ВКМ В-125 образовывали наноформы, которые представляли собой дочерние нанопочки До сих пор способность бактерий этих видов к почкованию была неизвестна Стимулирование способности к почкованию при воздействии электрическим током как стрессовым агентом (Рис 11) обнаружено впервые

Рис. 11. Электронная микроскопия, негативно окрашенные препараты клеток Е. coli ВКМ В-125, Р. aurantiaca ВКМ В-1558 и А. taihuensis ВКМ В-2400, подвергшихся воздействию электрического тока, а) фрагментация клеток Е. coli ВКМ В-125 по типу множественного почкования; Ь) образование мелких дочерних почек (нанопочек) у Р. aurantiaca ВКМ В-1558; с) клетка Р. aurantiaca с полностью отпочковавшимися дочерними наноклетками; d) клетки А. taihuensis ВКМ В-2400, подвергшиеся 3-часовому воздействию электрического тока (6 мА), через 1 сутки; е) клетки А. taihuensis ВКМ В-2400, подвергшиеся 30-минутному воздействию электрического тока (100 мА), через 3 месяца. Длина масштабной метки соответствует 0,5 м.км. НП — нанопочки; ВВМ - везикулы внешних мембран.

Аналогичным образом у А. taihuensis ВКМ В-2400 воздействие электрического тока в 6 мА стимулировало образование дочерних наноклеток (но не нанопочек) и структурные изменения простек. Воздействие током силой в 100 мА приводило к формированию существенно дочерних клеток, размером меньше исходных, с замедлением рост и деления клеток, что приводило также к затягиванию процесса роста и редукции простек (Рис. 11).

У грамположитсльных кокков также отмечали сходное образование наноформ при воздействии электрическим током, которое происходило путем последовательного измельчания клеток. Таким образом, в целом воздействие электрического тока у всех исследованных культур бактерий приводило к формированию мелких дочерних клеток (включая почкование), а также к формированию множественных везикул внешних мембран на поверхности клеток у грамотрицательных бактерий.

Грамотрицагельные бактерии с внешними структурами А. taihuensis ВКМ В-2400 подвергали также воздействию естественного света в течение 1 месяца культивировании на поверхности твердой среды при комнатной температуре. Интенсивность рассеянного света, измеренная люксметром Ю-16, варьировала от 0 (ночь) до 30 кЛк.

Длительное воздействие яркого рассеянного дневного света приводило к образованию множественных наноклеток: клетки А. taihuensis ВКМ В-2400 формировали множественные наноклетки внутри клеточной оболочки и везикулы, тогда как их внешние выросты, простеки, были выполнены везикулами.

Таким образом, месячное воздействие прямого света на клетки А. taihuensis ВКМ В-2400 по проявлениям качественно оказалось сходно с 3-часовым воздействием слабого (6 мА) постоянного электрического тока образованием множественных наноформ внутри клеточной оболочки с их последующим выходом наружу.

Воздействие радиоволнового излучения (2375 МГц, 15 мин, 14 Вт) на пурпурные фо-тосинтсзирующие бактерии Rhodopseudomonas palustris ВКМ В-16201 и Rhodospirillum rubrum ВКМ В-162Г подтвердил ранее известные данные (Vainshtein et al, 1998) о возможности формирования этими бактериями наноформ.

Штамм Е. coli ВКМ В-125 обрабатывали радиоволновым излучением (2375 МГц, 15 мин, 14 Вт): с помощью электронной микроскопии были обнаружены клетки различного размера: «нормального», с разрушенной клеточной стенкой, и наноклетки с/без клеточной стенки. В дополнительных экспериментах по проверке жизнеспособности наноформ, образуемых Е. coli ВКМ В-125, эту бактериальную суспензию разделяли в градиенте плотности сахарозы с желатином (добавление желатина позволило охлаждением переводить среду с градиентом плотности в твердое состояние и разделять слои без их смешения). Как показал микроскопический и электронно-микроскопический контроль, верхний слой градиента содержал нэноформы (в том числе - частично потерявшие клеточные оболочки). Рассев бактерий из этого слоя подтвердил жизнеспособность наноформ и их последующее возвращение к «нормальным» исходным размерам. Следует заключить, что образование наноформ - это ответная структурная реакция бактерий в стрессовых условиях.

Таким образом, при воздействии электрическим током, прямым светом, радиоволновым облучением были получены жизнеспособные наноформы (мелкие дочерние клетки, множественные клетки, нанопочки), которые при культивировании в благоприятных условиях продолжали рост и размножение с воссозданием популяции клеток исходного размера.

Микробиологические исследования проб из различных естественных местообитаний микроорганизмов, не подвергавшихся экспериментальному воздействию неблагоприятных факторов, позволили обнаружить:

Рис. 12. Электронная микроскопия клеток А. ¡аИтет15 ВКМ В-2400, негативно окрашенный препарат.

• грамотрицательные бактерии с размерностью наноформ в кальцифицирован-ных тканях плаценты (первое обнаружение бактерий в кальцификатах плаценты),

• грамотрицательные симбиотические бактерии с размерностью наноформ, выделенные нами в бинарные культуры из проб почв вечной мерзлоты (первое обнаружение гифы-образукяцих бактериальных наноформ),

• грамотрицательные почвенные ультрамикробактерии

Более подробные сведения об этих проведенных нами работах вынесены в Приложение к диссертации Полученные в этих исследованиях данные не относятся к результатам экспериментальных стрессовых воздействий на клетки бактерий, но позволяют (вкупе с литературными данными по биоразнообразию нанобакгерий и наноархей) заключить, что возможность образования жизнеспособных наноформ может быть широко распространена в природе

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бактерии всех таксономических и физиологических групп чувствительны к неблагоприятным воздействиям внешних факторов Несмотря на то, что ответные реакции клеточной организации не являются первичными, они обнаружены даже при краткосрочных неблагоприятных (стрессовых) воздействиях ряда физических агентов

В ходе исследования возможных структурных перестроек бактериальных клеток выявлены ранее неизвестные для псевдомонад естественные коммунальные экстрацеллюляр-ные структуры, а также экспериментально стимулируемые изменения в организации клеток различных бактерий, функционально связанные с неблагоприятным действием внешних факторов

Природные коммунальные экстрацеллюлярные комплексы обеспечивают защиту клеток от воздействия жесткого ультрафиолетового излучения за счет коммунальных оболочек (образуемых при участии везикул внешних мембран) При долговременном воздействии УФ-облучения отмечены модификации как самих оболочек, так и заключенного в них экстраклеточного матрикса

К числу основных изменений, связанных с воздействиями электрического тока, светового и радиоволнового излучений относятся деформация (округление палочковидных форм, уменьшение размеров) бактериальных клеток, образование внутриклеточных и внеклеточных наноформ (везикул наружной и цитоплазматической мембраны, нанопочек, изолированных наноклеток в том числе и жизнеспособных), лизис части исходной популяции бактериальных клеток Показано, что независимо от выбора действующего агента образование наноформ у представителей разных групп бактерий шло по единому пути структурных трансформаций перераспределению цитоплазмы с ее уплотнением в отдельных участках и под-

разделением клетки на отдельные субъединицы и последующим множественным неравномерным делением При этом образование наноформ у грамотрицательных бактерий сопровождалось также множественным образованием везикул внешней мембраны Жизнеспособность образуемых бактериями наноформ подтверждена их дальнейшими пересевами и микроскопией в динамике роста, подтверждающей восстановление прежних размеров клеток Цитологические исследования наноформ из естественных местообитаний показали, что на-ноформы бактерий или ультрамикробактерии распространены в природе и способны к активным жизненным процессам Таким образом, образование наноформ бактериальных клеток при стрессовых воздействиях можно рассматривать как ответную реакцию и переход к существованию бактерий в виде иного типа клеточных форм

Проведенные в ходе выполнения диссертационной работы исследования привели к получению новых сведений о цитологии изученных видов бактерий, а также позволили обобщить данные о структурных преобразованиях бактериальных клеток при стрессовых воздействиях

ВЫВОДЫ

1 Показано, что неблагоприятные кратковременные (стрессовые) воздействия исследованных физических факторов (магнитные/геомагнитные поля, электрический ток, радиоволновое и световые излучения) вызывают ответные структурные реакции бактериальных клеток

2 Впервые у представителей бактерий рода Pseudomonas обнаружены специфические структуры сложного строения коммунальные оболочки, окружающие группы клеток Показана способность коммунальных оболочек к делению, в том числе - вместе с размножением заключенных в них клеток Охарактеризованы ультраструктурная организация и состав экстраклеточных структур в цикле развития Установлено участие везикул внешних мембран в процессе формирования стенок экстрацеллюлярных оболочек, представленных системой многослойных дифференцированных покровов и наличие вмещающего клеток матрикса В отношении стрессовых воздействий на бактерии показано, что описываемые экстрацеллю-лярные оболочки выполняют защитную функцию, содействуя устойчивости бактерий к высыханию, агрессивному химическому воздействию окружающей среды, а также к ультрафиолетовому излучению

3 Впервые показано, что изменения геомагнитной обстановки («магнитный вакуум» или компенсированное геомагнитное поле) в присутствии в среде соединений ферри-магнитного железа приводят к формированию у Pseudomonasßuorescens ВКМ В-2170 новой экстраклеточной структуры с микрокристаллической организацией Сопоставление удель-

ных скоростей гетеротрофной ассимиляции карбонатного углерода при росте бактерий в геомагнитном поле и магнитном вакууме позволяет предположить, что образуемая экстраклеточная микрокристаллическая оболочка играет компенсаторную роль, обеспечивая более высокую биохимическую активность при иной организации клетки

4 Экспериментально показана возможность получения жизнеспособных бактериальных наноформ у разных групп бактерий под воздействием электрического тока, прямого света и радиоволнового излучения с последующим их восстановлением до обычных размеров в благоприятных условиях Формирование различных морфотипов наноформ является общей ответной реакцией для всех изучаемых тест-объектов Цитологическое сопоставление экспериментально получаемых наноформ с выявленными природными нанобактериями и ультрамикробактериями из различных местообитаний (см Приложение) подтверждает возможность переживания неблагоприятных условий наноформами в жизнеспособном состоянии

5 Обобщение результатов проведенных исследований по влиянию различных физических стрессовых факторов на организацию бактериальных клеток позволяет предположить, что способность к модификации структуры клеток представляет собой общее свойство бактерий, а пути ее реализации могут быть различны в зависимости от действующего агента, мощности и времени его воздействия, а также принадлежности бактерии-объекта к конкретной таксономической группе

Приложение. Бактериальные ианоформы в различных естественных местообитаниях

Впервые обнаружено присутствие нанобактерий в кальцифицированных зонах плаценты Местом локализации скоплений нанобактерий были микрополости, то есть именно те зоны, где происходил процесс отложения кальция в плаценте Обнаруженные нанобактерии были представлены клетками 150-250 нм в диаметре (рис 13), содержащими ДНК и РНК (Рис 13) и покрытыми мембраной По наличию внешней мембраны нанобактерии можно отнести к грамотрицательным бактериям Клеточная оболочка этих нанобактерий отличается большим периплазматическим пространством и не имеет муреинового слоя, который либо сильно модифицирован либо не выявляется методами электронной микроскопии На поверхности наноклеток обнаружены микрокапсулы

Рис. 13. Улыпратонкий срез ткани кальцифицированного участка плаценты, а) Полость представлена электроннопрозрачным участком («карманом») внутри плацентарной ткани. Черный (электронноплотный) объект - минеральные отложения (кальцинаты). Мелкие овальные клетки внутри полости - наноформы бактерий. Ь) Ультратонкий срез наноформ бактерий плацентарной ткан: цитохимическая реакция на присутствие нуклеиновых кислот. с) Ультратонкий срез плацентарной ткани с нанобактериям: формирование защитной надклеточной структуры (указаны стрелкой). М - мембрана. Длина масштабной метки

При исследовании образцов вечномерзлых почв нами обнаружены и выделены бинарные культуры, обозначаемые здесь и далее ЕМ20 и ЕМ21. ЕМ20 является бинарной культурой, представленной Acinetobacter sp. и наносимбионтом (Рис, 14а); ЕМ21 является бинарной культурой наносимбионта и Bacillus sp. (Рис. 14b).

Рис. 14. Иегативноокрашенные препараты наносимбионтов; а) гантелевидная нанофор-ма из симбиотической культуры ЕМ20, Ь) гифыобразующая наноформа из симбиотиче-ской культуры ЕМ21. Длина масштабной метки 200 нм.

По данным электронно-микроскопических исследований ультратонких срезов и негативно окрашенных препаратов выделенные наносимбионты являются грамотрицательными (по наличию внешней мембраны клеточной стенки) и полиморфными микроорганизмами. Муреиновый слой клеточной стенки значительно модифицирован. Клетки всех выделенных наносимбионтов отличаются большим переплазматическим пространством. Клетки одного и того же наносимбионта могут быть сферическими формы 0,2 - 0,3 мкм в диаметре, но могут

200нм.

образовывать гантелевидные образования и структуры схожие со структурой известных ги-фообразующих бактерий.

Присутствие в клетках нуклеиновых кислот подтвердилось цитохимическими реакциями их связывания уравилацетатом с использованием специальных приемов фиксации и обезвоживания.

В чистые культуры из разных источников (пробы нефтешлама от к. б. н. В.В. Дмитриева, ил озера Байкал и культура африканского растения семейства молочаевых) выделены наноформы бактерий - штаммы №1, №2 и №3 соответственно. В данном случае намеренно используется термин наноформы, а не нанобактерии, чтобы подчеркнуть, что выделенные микроорганизмы имеют малые размеры не постоянно, а формируют их в зависимости от условий или на определенных стадиях развития культуры (Рис. 15).

Рис. 15. Электронномикроскопические микрофотографии клеток штамма NF1: а - деление наноклетки перетяжкой (негативный контраст); Ь - почкующаяся клетка, формирующая одновременно три почки, штамм NF1 (негативный контраст); с — увеличенный фрагмент периферической части двух шаровидных структур; показана тонкая структура компартментов шаровидных структур и отходящие от них сферические наноклетки. Обозначения: К - капсулярный слой, H - нуклеоид, ПК - наноклетки, НМ - наружная мембрана, П - переплазма, Пб - гранулы поли-^-гидроксибутирата, ПК - почкующиеся клетки, Пр - перетяжка, Пф - гранулы полифосфатов, Пч - почка, С - стопки палочковидных структур, ЦМ— цитоплазматическая мембрана, ЦК — 1!ентралъная клетка, LUC — шаровидные структуры (агрегаты наноклеток). Длина масштабной линейки 300 нм.

Мелкие клетки имеют сферическую, полигональную, эллипсовидную форму или вид неправильных коротких палочек с размерами: 100-200 нм (толщина сферических клеток), объем - 0,002-0,004 мкм3 и 180-200x300 нм (палочковидные клетки), объем ~ 0,035 мкм3. Особенности ультраструктурной организации оболочки клеток свидетельствуют о том, что бактерии относятся к грамотрицательным формам. В состав оболочки входят: наружная и цитоплазматическая мембраны и расположенный между ними толстый слой гранулированной периплазмы. Толщина наружной и цитоплазматической мембраны аналогичны таковым у других грамотрицательных бактерий. Мелкие клетки способны проходить через фильтр с

порами 0,2 мкм и формировать колонии на агаризованных питательных средах По данным анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штаммы NF1 и NF3 имеют высокую степень сходства (99,4%), являются представителями альфа-протеобактерий, входят в порядок Rhizobiales и наиболее близки к виду Kaistia adipata

Таким образом, жизнеспособные бактерии могут присутствовать в естественных средах обитания в виде ьаноформ (нанопочек, наноклеток)

По теме диссертации опубликованы следующие работы.

Статьи в журналах.

1) Agababov R M , Abashina Т N, Suzina N Е , Vamshtein M В , Schwartsburg P M 2003 Pathological pregnancy, placental calcification, nanobactena infection is there any relation ship between this events7 Frontier perspectives, v 12, №1, p 7-9

2) Анисимов С В , Бакастов С С , Гапеев А К , Копылов А И , Крылова И H , Масленникова Т С , Абашина Т H, Арискина Е В , Вайнштейн M Б , Сузина H Е 2005 Экспериментальное исследование влияния магнитного поля ча удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода у бактерий Pseudomonas fluorescein Биология внутренних вод Вып 2 с 21-28

3) Дуда В И , Сузина H Е , Акимов В H , Вайнштейн M Б , Дмитриев В В , Ба-ринова Е С , Абашина Т H , Олейников P Р , Есикова Т 3 , Воронин A M 2007 Особенности ультраструктурной организации и цикла развития почвенных ультрамикробактерий, относящихся к кlâccy Alphaproteobacteria Микробиология Т 76, №5, сс 652-661

4) Agababov R M , Abashma, Т N , Suzina, N Е , Vamshtem M В , Schwartsbura P M 2007 Link between the early calcium deposition m placenta and its nanobactenal-like infection Journal of Biosciences V 32 №6, p 1163-1168

5) Вайнштейн M Б, Сузина H Е , Абашина Т H 2007 Нанобактерии Наука в России №3 с 10-14

Тезисы и материалы конференций.

6) Абашина Т H , Агабабов P M , Шварцбург П M, Вайнштейн M Б , Сузина H Е 2003 Особенности ультраструктурной организации клеточной оболочки нанобактерии Сборник тезисов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI» С 260

7) Abashina T N, Agababov R M 2003 Diversity of nanobactena and provoked mineral deposits in calcified placenta Abstract Book of the lsl FEMS Congress of European Microbiologists P 236

8) Анисимов С В , Гапеев А К , Галеева М В , Копылов А И, Крылова И Н , Масленникова Т С , Абашина Т Н, Арискина Е В , Вайнштейн М Б, Сузина Н Е 2004 Исследование влияния магнитного поля на удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2170 Сборник тезисов междисциплинарного семинара «Биологические эффекты солнечной активности» Пущино С 61

9) Абашина Т Н 2004 Изучение влияния геомагнитной обстановки на клетки Pseudomonas fluorescens Сборник тезисов 8-й Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI» С 138

10) Vamshtein М , Abashina Т, Kudryashova Е , Ariskma Е, Suzma, N 2004 Formation of Bacterial Nanocells Proceedings of the 4a ISTC Workshop Seoul, Korea, pp 55-65

11) Абашина T H , Сузина H E , Дуда В И , Акимов В Н , Вайнштейн М Б 2006 Новый уникальный тип наружной оболочки (чехла) у клеток радиоустойчивых псевдомонад Сборник тезисов международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Памяти профессора М В Гусева) с 66

12) Абашина Т Н , Сузина Н Е, Акимов В Н , Вайнштейн М Б, Дуда В И 2007 Новый тип экстрацеллюлярной общеклеточной структуры у Pseudomonas stutzen Сборник материалов научного семинара стипендиатов программы «Михаил Ломоносов» 2006/07 года, сс 6-8

Подписано в печать 19 09 2007 г Исполнено 20 09 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 744 Тираж 90 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абашина, Татьяна Николаевна

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Влияние физических агентов на структуру и биохимические процессы жизнедеятельности бактериальных клеток.

1.1.1. Общая характеристика физических факторов.

1.1.2. Влияние гравитации на бактерии.

1.1.3. Влияние давления (гидростатическое или гидравлическое) на бактерии.

1.1.4. Влияние магнитных и электромагнитных полей на бактерии.

1.1.5. Влияние внешних электрических полей на бактерии.

1.1.6. Влияние радиоактивного излучения на бактерии.

1.1.7. Влияние рентгеновского излучения на бактерии.

1.1.8. Влияние высокочастотных воздействий (СВЧ, КВЧ) на бактерии.

1.1.9. Влияние оптического излучения (инфракрасный, видимый, ультрафиолетовый спектры) на бактерии.

1.2. Возможность формирования мелких бактериальных форм из клеток бактерий обычного размера в неблагоприятных условиях.

1.2.1. Возможные (расчетные) минимальные размеры жизнеспособных бактериальных клеток.

1.2.2. Образование наноформ из обычных клеток.

1.3. Мелкие бактериальные формы в природных источниках и общие представления о нанобактериях.

2. Экспериментальная часть.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Объекты исследования.

2.1.2. Среды культивирования.

2.1.3. Определение таксономических признаков.

2.2. Методы разделения бактериальных симбионтов и бактериальных клеток разного размера.

2.2.1. Разделение бинарной культуры в градиенте плотности фиколла.

2.2.2. Отделение мелких клеток от клеток «рутинного» размера в градиенте плотности сахарозы.

2.3. Методы микроскопического анализа.

2.3.1. Световая микроскопия.

2.3.2. Флуоресцентная микроскопия.

2.3.3. Электронная микроскопия.

2.4. Анализы химического состава бактерий.

2.4.1. Рентгеновский микроанализ

2.4.2. Выделение экстрацеллюлярных образований.

2.4.3. Определение общего количества углеводов антроновым методом.

2.4.4. Определение состава полисахарида.

2.4.5. Определение белков по методам Бредфорд, Лоури и с применением двумерного гель-электрофореза.

2.4.6. Анализы содержания соединений фосфора.

2.5. Проведение экспериментов по определению влияния физических агентов.

2.5.1. Эксперименты с воздействием постоянного и переменного магнитного поля на бактерии.

2.5.2. Эксперименты с воздействием постоянным электрическим током на бактерии.

2.5.3. Эксперименты по влиянию высокочастных излучений (радиоизлучений) на бактерии.

2.5.4. Эксперименты по влиянию прямого света и ультрафиолетового света на бактерии.

3. Результаты и их обсузвдение.

3.1. Формирование бактериями коммунальных экстрацеллюлярных структур, обладающих радиозащитным действием при облучении культур УФ-светом.

3.1.1. Краткое описание штаммов на этапе выделения.

3.1.2. Таксономическая характеристика штаммов.

3.1.3. Исследование штаммов устойчивых к ультрафиолету на наличие плазмид.

3.1.4. Световая микроскопия.

3.1.5. Определение жизнеспособности клеток внутри коммунальных оболочек.

3.1.6. Электронно-микроскопические исследования.

3.1.7. Исследование состава коммунальной оболочки бактерий, устойчивых к ультрафиолету.

3.2. Влияние геомагнитного поля на активность бактерий и на формирование экстраклеточных и внутриклеточных структур.

3.2.1. Фазы роста бактериальной культуры.

3.2.2. Сравнительное влияние «магнитного вакуума», естественного геомагнитного поля и «магнитного возмущения» на удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода без дополнительного внесения железа в питательную среду.

3.2.3. Сравнительное влияние «магнитного вакуума», естественного геомагнитного поля и «магнитного возмущения» на удельную скорость ассимиляции карбонатного углерода с дополнительным внесением ферромагнетика в питательную среду.

3.2.3. Формирование дополнительных клеточных структур бактериями Pseudomonas fluorescens ВКМВ-2170 при наличии в питательной среде железа. .90 З.З.Образование наноформ при воздействии на бактерии электрическим током, видимым светом, радиоволновым излучением.

3.3.1. Влияние электрического тока на бактерии.

3.3.2. Влияние прямого света на клеточную структуру бактерий.

3.3.3. Влияние радиоволнового излучения.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения структурной организации бактериальных клеток при стрессовых воздействиях"

Несмотря на относительную простоту организации, бактерии имеют хорошо развитую клеточную структуру, которая ответственна за многие биологические особенности и свойства. Клеточная структура бактерий является одним из первых объектов классической микробиологии, включающей изучение морфологии микроорганизмов. Форма клеток является характеристикой для ряда видов и более высоких таксонов, но может изменяться в зависимости от условий роста. Столь же значимой для морфологии характеристикой, как и форма, обычно является размер клеток, также типичный для вида или на уровне вышестоящего таксона. Изменение формы и размера клетки в сочетании с переменой соотношения площади поверхности и объема клетки является показателем изменений в активности протекающих процессов. При этом обычно увеличение размеров клеток по сравнению с исходными рассматривают как снижение активности и/или увеличение резервов.

Особое значение в структуре клеток бактерий имеет наличие жесткой клеточной оболочки, которая, прежде всего, обеспечивает защиту клетки от внутреннего давления, связанного с более высокой концентрацией веществ в клетке по сравнению с окружающей средой. Различные бактерии разнятся по строению клеточной стенки, подразделяясь на две основные группы: грамотрицательные и грамположительные. Грамположительные бактерии отличаются мощным слоем пептидогликана. Общие характеристики типа клеточной стенки недостаточны для описания ее защитных свойств, - так, относительно устойчивые к радиации бактерии рода Ветососсш и устойчивые к воздействиям высоких температур бактерии группы ТИегтш имеют грамотрицательное строение стенки при формальном классическом окрашивании как грамположительные.

Грамотрицательная клеточная стенка имеет менее мощный слой пептидогликана, но кроме него содержит дополнительную внешнюю мембрану, выполненную фосфолипидами и липополисахаридами. Химическая структура липополисахаридов внешней мембраны может быть высоко специфичной и ответственной за антигенные свойства штаммов. Функции компонентов поверхности клеточной стенки бактерий включают барьерную роль, адгезивную, размещение ряда энзимов, а также сигнальных белков, реагирующих на воздействия температуры, осмоса, солености, света, кислорода, химических соединений и другое. Клеточная оболочка обеспечивает все контакты бактериального организма с окружающей его внешней средой, таким образом, именно она является первичной организационной структурой воспринимающей воздействия любых внешних воздействий.

Известно, что внешние воздействия на бактерии могут изменять численность и активность клеток в популяции. Эти изменения зависят от типа, мощности и продолжительности воздействия. Вместе с этим известно, что длительные неблагоприятные воздействия (голодание и т.п.) сказываются не только на физиологической активности, но также и на морфологии и структурной организации бактерий. Литературные сведения о структурных изменениях клеток бактерий при кратковременных неблагоприятных (стрессовых) воздействиях более ограничены. В настоящее время все живые организмы подвержены возрастающему влиянию техногенных агентов, что не может не отражаться на ответных реакциях клеток не только у высших организмов, но и у бактерий.

Влияние внешних факторов на морфологию и организацию клеток бактерий изучено в основном при сильных стерилизующих воздействиях и как эффекты длительных неблагоприятных воздействий, а не кратковременных неблагоприятных (здесь и далее по тексту - стрессовых). Вместе с тем не стерилизующие стрессовые воздействия также могут сказываться на организации клеток, и исследование структурных особенностей бактерий в неблагоприятных условиях представляет интерес для получения новых цитологических сведений. Возрастающее давление физических техногенных факторов на окружающую среду увеличивает актуальность таких исследований.

Актуальность проблемы.

Реакции микроорганизмов на воздействие различных внешних факторов являются объектом постоянного внимания различных исследователей. Бактерии подвержены воздействиям агентов, способным вызывать изменения в биохимических и физико-химических процессах, а в дальнейшем - в морфологии и структурной организации клеток. Литературные сведения о влиянии экстремальных внешних факторов на морфологию и организацию клеток бактерий посвящены в основном разрушению клеток при сильных стерилизующих воздействиях (высокая температура, ультрафиолетовое излучение, СВЧ высокой мощности) или эффектам длительных неблагоприятных воздействий (голоданию, накоплению метаболитов и т.д.), а не кратковременных неблагоприятных (здесь и далее по тексту - стрессовых). Вместе с тем при не стерилизующих стрессовых воздействиях также могут происходить изменения в организации клеток, и исследование структурных особенностей бактерий, возникающих в неблагоприятных условиях, представляет значительный интерес для получения новых цитологических сведений. Возрастающее давление физических техногенных факторов на окружающую среду увеличивает актуальность таких исследований.

Цель и задачи исследования.

Целью исследований явилось изучение структурной организации бактерий после воздействия физическими агентами (ультрафиолетовым излучением, магнитным вакуумом, электрическим током, радиоволновым излучением, видимым светом). В соответствии с целью работы в задачи исследования входило:

1. Выявить наличие специализированных структур или структурных модификаций бактериальных клеток, возникающих в результате кратковременных неблагоприятных (стрессовых) воздействий физических агентов (магнитные/геомагнитные поля, электрический ток, радиоволновое и световые излучения).

2. Изучить защитные коммунальные экстрацеллюлярные структуры грамотрицательных бактерий Pseudomonas и их изменения при ультрафиолетовом облучении культур.

3. Проверить возможное влияние магнитных полей на бактерии и изучить структурные особенности клеток бактерий при изменении магнитной обстановки в присутствии ионов железа в среде.

4. Изучить возможность образования наноформ бактерий у грамотрицательных и грамположительных бактерий при неблагоприятных воздействиях, создаваемых постоянным электрическим током, радиоволновым облучением, видимым светом, и провести цитологическое сопоставление образующихся наноформ с обнаруживаемыми в естественных местообитаниях.

5. Выявить закономерности в структурных изменениях бактериальных клеток, возникающих под воздействием различных физических стрессовых факторов.

Научная новизна.

При отборе путем скрининга культур грамотрицательных бактерий, переживающих условия стерилизации облучением в ультрафиолетовом диапазоне (УФ, «жесткий ультрафиолет»: Ая^Ю"8 м), впервые выделены штаммы Pseudomonas, образующие ранее неизвестные коммунальные экстрацеллюлярные структуры. Коммунальные структуры у одноклеточных бактерий Pseudomonas представляют новый цитологический феномен. Показана защитная роль этих специализированных структур бактерий, обеспечивающих рост и размножение в условиях постоянного облучения УФ.

Обобщены экспериментальные данные по структурным ответным реакциям клеток бактерий при стрессовых воздействия электрическим током, радиоволновым излучением, видимым светом. Показано, что во всех случаях грамотрицательные и грамположительные бактерии способны формировать жизнеспособные наноформы, однако, у грамотрицательных образование наноформ происходит путем множественного деления или нанопочкования и сопровождается образованием множественных везикул внешних мембран.

Практическая значимость работы.

Отработаны методики экспериментов с применением различных физических агентов и их мощностей, позволяющие изучать структурные изменения бактериальных клеток. Получены новые сведения о ранее неизвестных коммунальных экстрацеллюлярных структурах формирующих многоклеточные радиоустойчивые ассоциаты бактерий, которые должны учитываться при обеззараживаниях с применением УФ-стерилизации.

Апробация работы.

Результаты, полученные при выполнении данной работы, были представлены на международном конгрессе FEMS, 2003, на международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» Пущино 2004, междисциплинарном семинаре «Биологические эффекты солнечной активности» Пущино 2004, на семинарах и постерных сессиях Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН в 2003-2007 гг., на семинаре (Workshop) МНТЦ в Южной Корее, Чонгбук, 2004 г., а также на семинарах в Центре исследований окружающей среды UFZ, Лейпциг, 2007 г.

1. Обзор литературы.

Представляемая в обзоре литературы информация об организации и структуре бактерий в условиях воздействия различных факторов подобрана с учетом наиболее известного общего проявления реакции бактерий на стресс - измельчание клеток и формирование клеткоподобных наноформ различных морфотипов. В этом отношении наиболее показательны физические агенты, так как возможность их одномоментного включения или выключения допускает кратковременное (стрессовое) приложение фактора - в отличие, например, от химических воздействий, для прекращения которых может потребоваться отделение биомассы от среды.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Абашина, Татьяна Николаевна

Выводы.

1. Показано, что неблагоприятные кратковременные (стрессовые) воздействия исследованных физических факторов (магнитные/геомагнитные поля, электрический ток, радиоволновое и световые излучения) вызывают ответные структурные реакции бактериальных клеток.

2. Впервые у представителей бактерий рода Pseudomonas обнаружены специфические структуры сложного строения: коммунальные оболочки, окружающие группы клеток. Показана способность коммунальных оболочек к делению, в том числе -вместе с размножением заключенных в них клеток. Охарактеризованы ультраструктурная организация и состав экстраклеточных структур в цикле развития. Установлено участие везикул внешних мембран в процессе формирования стенок экстрацеллюлярных оболочек, представленных системой многослойных дифференцированных покровов и наличие вмещающего клеток матрикса. В отношении стрессовых воздействий на бактерии показано, что описываемые экстрацеллюлярные оболочки выполняют защитную функцию, содействуя устойчивости бактерий к высыханию, агрессивному химическому воздействию окружающей среды, а также к ультрафиолетовому излучению.

3. Впервые показано, что изменения геомагнитной обстановки («магнитный вакуум» или компенсированное геомагнитное поле) в присутствии в среде соединений ферримагнитного железа приводят к формированию у Pseudomonas fluorescens ВКМ В-2170 новой экстраклеточной структуры с микрокристаллической организацией. Сопоставление удельных скоростей гетеротрофной ассимиляции карбонатного углерода при росте бактерий в геомагнитном поле и магнитном вакууме позволяет предположить, что образуемая экстраклеточная микрокристаллическая оболочка играет компенсаторную роль, обеспечивая более высокую биохимическую активность при иной организации клетки.

4. Экспериментально показана возможность получения жизнеспособных бактериальных наноформ у разных групп бактерий под воздействием электрического тока, прямого света и радиоволнового излучения с последующим их восстановлением до обычных размеров в благоприятных условиях. Формирование различных морфотипов наноформ является общей ответной реакцией для всех изучаемых тест-объектов. Цитологическое сопоставление экспериментально получаемых наноформ с выявленными природными нанобактериями и ультрамикробактериями из различных местообитаний (см. Приложение) подтверждает возможность переживания неблагоприятных условий наноформами в жизнеспособном состоянии.

5. Обобщение результатов проведенных исследований по влиянию различных физических стрессовых факторов на организацию бактериальных клеток позволяет предположить, что способность к модификации структуры клеток представляет собой общее свойство бактерий, а пути ее реализации могут быть различны в зависимости от действующего агента, мощности и времени его воздействия, а также принадлежности бактерии-объекта к конкретной таксономической группе.

Заключение.

Бактерии всех таксономических и физиологических групп чувствительны к неблагоприятным воздействиям внешних факторов. Несмотря на то, что ответные реакции клеточной организации не являются первичными, они обнаружены даже при краткосрочных неблагоприятных (стрессовых) воздействиях ряда физических агентов.

В ходе исследования возможных структурных перестроек бактериальных клеток выявлены ранее неизвестные для псевдомонад естественные коммунальные экстрацеллюлярные структуры, а также экспериментально стимулируемые изменения в организации клеток различных бактерий, функционально связанные с неблагоприятным действием внешних факторов.

Природные коммунальные экстрацеллюлярные комплексы обеспечивают защиту клеток от воздействия жесткого ультрафиолетового излучения за счет коммунальных оболочек (образуемых при участии везикул внешних мембран). При долговременном воздействии УФ-облучения отмечены модификации как самих оболочек, так и заключенного в них экстраклеточного матрикса.

К числу основных изменений, связанных с воздействиями электрического тока, светового и радиоволнового излучений относятся: деформация (округление палочковидных форм, уменьшение размеров) бактериальных клеток; образование внутриклеточных и внеклеточных наноформ (везикул наружной и цитоплазматической мембраны, нанопочек, изолированных наноклеток, в том числе и жизнеспособных); лизис части исходной популяции бактериальных клеток. Показано, что независимо от выбора действующего агента образование наноформ у представителей разных групп бактерий шло по единому пути структурных трансформаций: перераспределению цитоплазмы с ее уплотнением в отдельных участках и подразделением клетки на отдельные субъединицы и последующим множественным неравномерным делением. При этом образование наноформ у грамотрицательных бактерий сопровождалось также множественным образованием везикул внешней мембраны. Жизнеспособность образуемых бактериями наноформ подтверждена их дальнейшими пересевами и микроскопией в динамике роста, подтверждающей восстановление прежних размеров клеток. Цитологические исследования наноформ из естественных местообитаний показали, что наноформы бактерий или ультрамикробактерии распространены в природе и способны к активным жизненным процессам. Таким образом, образование наноформ бактериальных клеток при стрессовых воздействиях можно рассматривать как ответную реакцию и переход к существованию бактерий в виде иного типа клеточных форм.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абашина, Татьяна Николаевна, Пущино

1. Андреев В. С. 1973. Кондуктометрическне методы и приборы в биологии и медицине. М.: Медицина. 335с.

2. Андреев В. С. 1974. Проблемы создания аппаратуры для медицинских лабораторных исследований. JL, Ч. 4. С. 5-17.

3. Андреев В. С., Акатова Н. С., Гранстем К. О., Марченко JI. А. 1973а. Ферменты в лабораторной диагностике. М.: Медицина, Т. 3. С. 111-113.

4. Андреев В. С., Акатова С., Марченко JI. А., Баштанов А. В. 1972. Биологическая и медицинская электроника. Свердловск: Изд-во Свердл. ун-та. Ч. 3. С. 53-55.

5. Андреев В. С., Баштанов А. В., Горшенина Е. С. 1973b. Лаб. дело. № 7. С. 392-396.

6. Андреев В. С., Баштанов А. В., Гранстрем К. О., Марченко Л. А. 1974а. Электрон, обраб. материалов. № 4. С. 73-75.

7. Ачкасова Ю. Н., Петкин К. Д., Брызгунова Н. И., Сарочан Т. Н. 1977. Тез. Докл XVI Всесоюз. Съезда микробиологов и эпидемиологов. Ульяновск, ч. 1, с. 179-180.

8. Биологический энциклопедический словарь. 1986. Ред. М.С.Гиляров. М, Советская энциклопедия, 831 с.

9. Вайнштейн М. Б., Кудряшова Е. Б. 2000.0 нанобактериях. Микробиология.

10. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И. 1982. Влияние давления на интенсивность сульфатредукции иловой микрофлоры. Тез. докл. Всес. конф. «Анаэробные микроорганизмы», с.48-50. Пущино, НЦБИ.

11. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И. 1987. Влияние окислительно-восстановительного потенциала среды на интенсивность образования сероводорода сульфатредуцирующими бактериями. Микробиология. Т.56 (1), с.31-35

12. Вопросы гематологии, радиобиологии и биологического действия магнитных полей, 1965. Томск

13. Гайер Г. 1974. Электронная гистохимия. М. Мир. с. 488.

14. Громов Б. В. 1985. Строение бактерий. Л. ЛГУ. 190 с.

15. Гусев М. В. Минеева Л. А. 1992. Микробиология. М.

16. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С, Дуда В.И., Воронин A.M. 2004. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ вэкстремальных биотопах. Микробиология. Т. 73. № 6. с. 832-840

17. Драчев JI. А., Каулен А. Д., Скулачев В. П. 2004.Молекуляр. Биология. Вып. И, с. 1377-1382.

18. Исин Ж. М., Дубянский М. А., Шатаев М. А. 1978. Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, Вып. 1, с. 59-64.

19. Коган А. Б., Дорожкина JI. И., Сачева Т. С., Гольцева И. Н., Остапенко JI. Б. 1965. О некоторых проявлениях биологического действия постоянного магнитного поля. Материалы XV научной конференции физиологии, биохимиков и фармакологов Юга РСФСР.

20. Коган А. Б., Тихонова Н. А. 1965. Действие постоянного магнитного поля на движения парамеций. Биофизика, 10, вып. 2, с.292

21. Крисс А. Е., Мицкевич И. Н. 1967. Влияние питательной среды на толерантность баротолерантных бактерий к высоким давлениям. Микробиология, т. 36, с. 247-250

22. Крисс А.Е. 1976. Микробиологическая океанография. М.: Наука.

23. Кульский JI. А., Дейнега Ю. Ф., Савлук О. С. и др.//Коллоид, журн., 1980. Вып. 4. С. 755-761.

24. Маркиз Р., Мацумура П. 1981. Жизнь микроорганизмов в условиях повышенного давления. В кн.: Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, с. 124-185

25. Матрончик Ф. Ю., Алипов Е. Д., Беляев И. Я. 1996. Модель фазовой модуляции высокочастотных колебаний нуклеотида в реакции клеток E.coli на слабые постоянные и низкочастотные магнитные поляю Биофизика, 41(3), с. 642-649.

26. Мишустина И.Е. Bull. Ecol. Res. Comm. (Stockholm) 1973.17. с. 143-149.

27. Павлович С. A. 1971. Влияние магнитных полей на микроорганизмы. В кн.: Влияние магнитных полей на биологические объекты. С. 59-85.

28. Пешков М. А. 1955. Цитология бактерий. М-Л. Изд. Ан СССР. 220 с.

29. Пешков М. А. 1966. Сравнительная цитология синезеленых водорослей, бактерий и актиномицетов. М. Изд. "Наука". 246 с.

30. Поликар А. 1972. Молекулярная цитология мембранных систем животной клетки. М.: Мир, 63 с.

31. Прозоровский С. В., Кац JI. Н., Каган Г. Я. 1981. L-формы бактерий. Механизм образования. Структура, роль в патологии. М. Изд. "Медицина". 237 с.

32. Работнова И. JI. 1975. Успехи микробиологии. Вып. 10. С. 120-126

33. Романенко В.И., Кузнецов С.И. 1981. Экология микроорганизмов пресных водоемов: Лабораторное руководство. JL, Наука.

34. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. Под ред. Егорова Н. С.1995.

35. Совещание по изучению влияния магнитных полей на биологические объекты.-Тезисы докладов. 1966

36. Тимаков В. Д., Каган Г. Я. 1973. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. М. Медицина. 392 с.

37. Ткачук Н. Г. 1978. Электрон обраб. Материалов. №4, с. 78-79.

38. Чаморовский С. К., Пикуленко А. Я., Возари Э. 1984. Изв. АН СССР. Серия биол. №2, с. 294-298.

39. Шахов А. И., Душкин С. С. 1965. Бактерицидное действие внешнего магнитного поля. Гигиена и санитарии, №9, с. 106

40. Щербакова В.А., Вайнштейн М.Б. 2000. Образование метана сульфатвосстанавливающей бактерией Desulfosarcina variabilis. Микробиология. Т.69(3), с.341-344

41. Юткин JI. А., Мельникова О.Н., Постоев А. К. 1978. Электронная обработка материалов. №1, с. 67-68.

42. Яворский Б. М., Детлаф А. А. 1979. Справочник по физике. М.

43. Allen М., Soike К. 1966. Sterilization by electrohydraulic treatment. Science, v. 154, pp. 155-157.

44. Anderson J. I. W., Heffernan W. P. 1965. Isolation and characterization of filterable marine bacteria. J. Bacteriol., v. 90, pp. 1713 1718.

45. Bae H. C., Cota-Robles E. H., Casida L. E., Jr. 1972. Microflora of soil as viewed by transmission electron mnicroscopy. Appl. Microbiol., v. 23. P. 637 648.

46. Bell Z. С. E., Morita R. Y. 1957. Barophilic bacteria in the deep sea sediments. J. Bacteriol., v. 73, pp. 563-568.

47. Belyaev I. Ya., Alipov Ye. D., Harms-Ringdahl M. 1997. Effects of zero magnetic field on the conformation of chromatin in human cells. Biochim. Biophys. Acta, v. 1336, pp. 465473.

48. Benning L. G., Phoenix V. R., Yee N., Konhauser К. O. 2004. The dynamics ofcyanobacterial silicification: An infrared micro-spectroscopic investigation. Geochimica et Cosmochimica Acta, Vol. 68, No. 4, pp. 743-757.

49. Bergthorsson U., Ochman H. 1998. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Molecular Biology and Evolution, v .15, pp.6-16.

50. Borisevich G. P., Lukashev E. P., Kononenko A. A, Rubin A. B. 1979. Biochim. et biophys. Acta, v. 546, pp. 171-175.

51. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., v. 72(1), pp.248.

52. Briggs A. P. 1922. Modification of the Bell-Doisy phocphate method. J. Biol. Chemistry, v 53(1), pp 13-16

53. Brown G., Morrison W. 1956. Trans. Ire Med. Electronics. PGME, v. 4, pp. 16-20.

54. Burns C. H., Jacobson A. P., Whipple G. H. 1965. The reversible depression of bacterial luminescence during exposure to X-radiation. Radiat. Res., v. 24(3), pp. 494-502.

55. Button D. K., Robertson B. R., Juttner F. 1996. Microflora of a subalpine lake: Bacterial populations, size and DNA distributions, and their dependence on phosphate. FEMS Microbiol.Ecol., v. 21. P. 87 101.

56. Cavichioly R., Ostrowski M. Ultramicrobacteria. 2003. Encyclopedia of Life Sciences. MacMillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group. P. 1-3. www. els. net

57. Chen P. S., Toribara Jr. T. Y., Warner H. 1956. Microdetermination of Phosphorus. Analytical Chemistry, v. 28(11), pp. 1756-1758.

58. Chen P. S., Totibara T. Y., Warner H. 1956. Microdetermination of phosphorus. Analitical chemistry, v. 28 (11), pp. 1756-1758.

59. Clegg C. D., van Elsas J. D., Anderson J. M., Lappin Scott H. M. 1996. Survival of parental and genetically modified derivatives of a soil isolated Pseudomonas fluorescens under nutrient-limiting conditions. J. Appl. Bacteriol., v. 81, pp. 19 26.

60. Crisogono V., McKenzie J. A. 1997. Microbial mediation of modern dolomite precipitation and diagenesis under anoxic conditions (Lagoa Vermelha, Rio de Janereiro, Brazil) Sediment. Res., v. 67, pp. 378 390.

61. Cyrus H. Fishke, Yellapragada Subbarow. 1925. The colorimetric determination of phosphorus. Jornal of biological chemistry, v. LXVI (2), pp. 376-400

62. Davidson B.E., Kordias N., Dobos M., Hillier A.J. 1996. Genomic organization of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek Intern. J, General. Molecular. Microbiology, v.70, pp. 161-183.

63. Devereux R., Willis S.G., Hines M.E. 1997. Genome sizes of Desulfovibrio desulfuricans,

64. Desulfovibrio vulgaris, and Desulfobulbus propionicus estimated by pulsed-field gel electrophoresis of linearized chromosomal DNA. Current Microbiol., v.34, pp.337-339.

65. Dhawan M.D, Wise F, Baeumner A.J. 2002. Development of a laser-induced cell lysis system. Anal Bioanal Chem., v. 374(3), pp. 421-426.

66. Dienes L. 1967. Morphology and reproductive processes of bacteria with defective cell wall Microbial Protoplasts, Spheroplasts and L-Forms. (Ed. L.B.Guze). Baltimore. Williams & Wilkins, pp.74-93.

67. Dienes L., Weinberger H. 1951. The L-forms of bacteria. Bacteriol. Rev., v. 15, pp. 245 -288.

68. Dorman C.J. 1996. Flexible response: DNA supercoiling, transcription and bacterial adaptation to environmental stress. Trends in Microbiology, v. 4, pp.214-216

69. Dubois R. 1886. Influence du magnetisme sur l'orientation des colonies microbiennes. C. r. Soc. Boil., 8,3,127

70. Duda V.I., Lebedinshy A.V., Mushegjan M.S., Mitjushina L.L. 1987. A new anaerobic bacterium, forming up to five endospores per cell. Anaerobacter polyendosporus gen. et spec. nov. Arch. Microbiol., v. 148, pp. 121-127.

71. Dybwig K., Voelker L.L. 1996. Molecular biology of Mycoplasmas. Annual Rev. Microbiol., v. 50, pp. 25-57.

72. Elsaied H., Sato M., Naganuma T. 2001. Viable Cytophaga-lake bacterium in the 0.2(j.m-filtrate seawater. System. Appl. Microbiol. V. 24. V. 618-622

73. Faegri A., Torsvik V.L., and Goksoyr J. 1977. Bacterial and fungial activités in soil: Separation of bacteria and fungi by a rapid fractionated centrifugation technique. Soil Biol. Biochem. V. 9. P. 105-112

74. Feuerstein O, Persman N, Weiss E.I. 2004. Phototoxic effect of visible light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: an in vitro study. Photochem Photobiol, v. 80(3), pp.412-415.

75. Fiske C. H., Subbarow Y. 1925. The colorimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chemistry, v 66(2), pp. 375-400.

76. Folk R. L. 1992. Bacteria and nannobacteria revealed in hardgrounds, calcite cements, native sulfur, sulfide minerals, and travertines. Proc. Geol. Soc. Amer. Ann. Meeting, p. 104.

77. Folk R. L. 1993. SEM imaging of bacteria and nannobacteria in carbonate sediments and rocks. J. Sediment. Petrol., v. 63, pp. 990 999.

78. Folk R. L. 1994. Interaction between bacteria, nannobacteria and mineral precepitation in hot springs of Central Italy. Geogr. Phys. Quat., v. 48, pp. 233 246.

79. Folk R. L. 1997. Nannobacteria: surely not figments, but what under heaven are they?

80. Natural Science, v. 1. Art. 3 (http://naturalscience.com).

81. Folk R. L. 1998. Nannobacteria in the natural environment and in medicine. Alpe Adria Microbiol. J., v. 7, pp. 87 95.

82. Folk R. L., Lynch F. L. 1997a. Nannobacteria are alive on Earth as well as Mars. SPIE Proceedings, v. 3111, pp. 406 419.

83. Folk R. L., Lynch F. L. 1997b. The possible role of nannobacteria (dwarf bacteria) in clay mineral diagenesis and the importance of careful sample preparation. J. Sed. Res., v. 67, pp. 597-603.

84. Folk R. L., Noble P. J., Gelato G., McLean R. J. C. 1995. Precipitation of opal-CT lepispheres, chalcedony, and chert nodules by nannobacteria (dwarf bacteria). Proc. Geol. Soc. Amer. Ann. Meeting, Abs. A 305.

85. Garcia-Pichel, F., and Castenholz, R.W. 1991. Characterization and biological implications of scytonemin, a cyanobacterial sheath pigment: Journal of Phycology, v. 27, pp. 395-409. pp. 2021-2026.

86. Gerencser V. F., Barnothy M. F., Barnothy J. M. 1962. Inhibition of bacterial growth by magnetic field. Nature, v. 196 (4854), p.539

87. Gilliland S., Speck M. 1967. Inactivation of Microorganisms by Electrohydraulic Shock. Appl. Microbiol., v. 15(5), pp. 1031-1037.

88. Ginard M., Lalucat J., Tummler B„ Romling U. 1997. Genome organization of Pseudomonas stutzeri and resulting taxonomic and evolutionary considerations. Intern. J. Syst. Bacteriol., v.47, pp. 132-143.

89. Giovannoni S.T., Roppe M.S., Vergin K.L., and Adiar N.L 1996. 16rRNA genes reveal stratified open ocean bacteriaplankton population to the Green Non-sulfur Bacteria . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. P. 7979-7984

90. Grassi R.F, Pappalardo S, Frateiacci A, Scortechini A, De Benedittis M, Petruzzi M, Frasca M. 2004. Antibacterial effect of Nd:YAG laser in periodontal pockets decontamination: a in vivo study. Minerva Stomatol., v. 53(6), pp.355-359

91. Hahn M.W., Lunsdorf H., Wu Q., Schaker M., Hofle M.G., Boenigk J., Stadler P. 2003. Isolation of novel ultramicrobacteria classified as Actinobactera.Appl. Environ. Microbiol., v. 69(3), pp. 1442-1451.

92. Halpern M. H., Konikoff J. J. 1964. Effect of magnetic fields on the growth of algae. Aerospace Med., v.35(3), p.269

93. Hamilton W. A., Sale A. J. 1967. Effects of high electric fields on micro-organisms. Biochim Biophis. Acta., v. 148, pp 789-800.

94. Hays J. D. 1971. Faunal extinctions and reversals of the Earth's magnetic field. Geol. Soc.

95. Am. Bull., v. 82, pp. 2433-2447.

96. Hedrick. 1964. Biological effects of magnetic fields. N. Y., Plenum Press

97. Hess B. 1978. Proc. Solvay Conf. Adv. Chem. Phys., v. 39, pp. 224-228.

98. Hofmann 0, Murray K, Wilkinson A.S, Cox T, Manz A. 2005. Laser induced disruption of bacterial spores on a microchip. Lab Chip. V. 5(4), pp.374-377

99. Hondo M., Iwahara M. 1979. Agr. And Biol. Chem., v., pp. 2075-2081.

100. Hood M. A., MacDonnel M. T. 1987. Distribution of ultramicrobacteria in a Gulf Coast estuary and induction of ultramicrobacteria. Microb. Ecol., v. 14, pp. 113-127.

101. Jennison M. W. 1937. The growth of bacteria, yeasts and molds in a strong magnetic field. J. Bacterid., v.33(l), p.3

102. Jones B., Renaut R.W. 1997. Formation of silica oncoids around geysers and hot springs at El Tatio, northern Chile. Sedimentology, v. 44, pp. 287 304.

103. Kahn M. C. 1929. A developmental cycle of the tubercle bacillus as revealed by single-cell studies. Am. Rev. Tuberc., v. 20, pp. 150 200.

104. Kahn M. C. 1930. A growth cycle of the human tubercle bacillus as determined by single-cell studies. Tubercle., v. 11, pp. 202 217.

105. Kajander E.O. and Ciftcioglu N. 1998. Nanobacteria: An alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 95. P. 8274-8279

106. Klienenberger Nobel E. 1949. Origin, development and significance of L-forms in bacterial cultures. J. gen. Microbiol., v. 3, pp. 434 - 443.

107. Klienenberger E. 1935. The natural occurrence of pleuropneumonia-like organisms, its apparent symbiosis with Streptobacillus moniliformis and other bacteria. J. Pathol.

108. Bacterid., v. 40, pp. 93-105.

109. Klienenberger-Nobel E. 1949. Origin, development and significance of L-forms in bacterial cultures. J. gen. Microbiol., v.3, pp.434-443.

110. Klienenberger-Nobel E. 1951. Filterable forms of bacteria. Bacteriol. Rev. V.15, pp.73-103.

111. Knepton J. C. and Beisher D. E. 1964. Effects of veryhigh magnetic fields on living organisms. Aerospace Med., v. 35(3), p. 272.

112. Konhauser K. O., Jones B., Reysenbach A-L., Renaut R. W. 2003. Hot spring sinters: keys to understanding Earth's earliest life forms. Can. J. Earth Sci., v. 40, pp. 1713-1724.

113. Konhauser K. 0.„ Phoenix V. R., Bottrell S. H., Adams D. G., Head I. M. 2001. Microbial-silica interactions in Icelandic hot spring sinter: possible analogues for some Precambrian siliceous stromatolites. Sedimentology, V. 48, pp. 415-433.

114. Lenzi M. 1940. Biologische Wirkungen magnetischer Felder. Strahlentherapie, v.67(2), p. 219

115. Leusden F. P. 1929. Electric and magnetic effects on bacteria. Cbl. Bacteriol., v.l 11, p.321

116. Lewis A. 1978. The molecular mechanism of excitation in visual transduction and bacteriorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. US., v. 75(2), pp. 549-557.

117. Luft J. H. 1966. Ruthenium red staining of the striated muscle cell membrane and the myotendinal junction. VI Internat. Congr. EM, Kyoto, pp. 65 - 66.

118. Lukashev E. P., Vozary E., Kononenko A. A., Rubin A. B. 1980. Electric field promotion of the bacteriorhodopsin BR570 to BR412 photoconversion in films of Halobacterium halobium purple membranes. Biochim. et biophys. Acta, v. 592(2), pp. 258-266.

119. Lyet B. 1935 Culture de moisissures dans un champ magnetique. C. r. Soc. Biol., v.l 19, p.470

120. MacDonneel M. T., Hood M. A. 1982. Isolation and haracterization of ultramicrobacteria from a Gulf Coast estuary. Appl. Environ. Microbiol., v. 43, pp. 566-571.

121. Macherey -Nagel. Plasmid DNA purification. User manual. Macherey -Nagel Germany 2006.

122. Maeda M., Taga N. 1983. Comparisons of cell size and bacteria from four marine localities. La Mer V. 21, pp. 207-210.

123. Magrou J., Manigault P. 1946. Action du champ magnetique sur le development des tumeurs expeimentales chez Pelagonium zonale. C. r. Acad. Sci., v.223 (1), p.8

124. Malko J. A., Constantinidis I., Dillehay D., Fajman W. A. 1994. Search for influence of 1.5 Tesla magnetic field on growth of east cells. Bioelectromagnetics, v. 15, pp. 495-501.

125. Margulis, L., Walker, J.G.C., and Rambler, M., 1976. Reassessment of roles of oxygen and ultraviolet light in Precambrian evolution: Nature, v. 264, pp. 620-624.

126. Marmur J. A. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. V. 3, pp. 345 -350.

127. Mathies R., Stryer L. 1976. Retinal has a highly dipolar vertically excited singlet state: implications for vision. Proc. Nat. Acad. Sci. US, v. 73(3), pp. 2169-2173.

128. Mayrand D., Grenier D. 1989. Biological activities of outer membrane vesicles. Can. J. Microbiol. V. 5, pp. 607-613.

129. McKay D.S., Gibson E.K., Thomas-Keptra K.L., Vali H., Romanek C.S., Clemett S.T., Chillier X.D.F., Maechling C.R., and Zare R.N. 1996. Search for past life on Mars: Possible relic activity in Martian meteorite ALH 84001. Science. V. 273. P. 924-930

130. Miller S.I., Bader M., Guina T. 2003. Bacterial vesicle formation as a mechanism of protein transfer to animals. Cell. V. 115, pp. 2-3.

131. Miyoshi T., Iwatsuki T., Naganuma T. 2005. Phylogenetic characterization of 16 rRNA gene clones from deep-groundwater microorganisms that pass through 0,2 micrometer -pore - size filters. Appl. Environ. Microbiol. V. 71. P. 1084-1088.

132. Morita R. Y. 1988. Bioavailability of energy and starvation survival in nature. Can. J. Microbiol., v. 34, pp. 436 441.

133. Moyer C. L., Morita R. Y. 1989. Effect of growth rate and starvation-survival on the viability and stability of a psychrophilic marine bacterium. Appl. Environ. Microbiol., v. 55, pp. 1122-1127.

134. Mushegian A. R., Koonin E. V. 1996. A minimal gene set for cellular life derived by comparison of complete bacterial genomes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA., v. 93, pp. 10268 -10273

135. Nagy K. 1978. Photoelectric activity of dried, oriented layers of purple membrane from Halobacterium halobium. Biochim. and Biophys. Res. Commun, v. 85(1), pp. 383-390.

136. Novitsky J. A., Morita R. Y. 1976. Morphological characterization of small cells resulting from nutrient starvation in a psychrophilic marine vibrio. Appl. Environ. Microbiol., v. 32, pp. 635-641.

137. Novitsky J. A., Morita R. Y. 1977. Survival of a psychrophilic marine vibrio under long-term nutrient starvation. Appl. Environ. Microbiol., v. 33, pp. 635 641.

138. Olson, J.M. 1981. Evolution of photosynthetic reaction centres. Biosystems, v. 14, pp. 8994.

139. Opdyke N. D., Glass B., Hays J. D., Foster J. 1966. Paleomagnetic study of Antarctic deep-sea cores. Science, v. 154(3747), pp. 349.

140. Oppenheimer C. H. 1952. The membrane filter in marine microbiology. J. Bacterid., v. 64, pp. 783-786.

141. Otto F. J. 1994. High-resolution analysis of nuclear DNA employing the fluorochrome DAPI. Methods in cell Biology. V. 41, pp. 211-217.

142. Panikov, N.S. 2005. Contribution of nanosized bacteria to the total biomass and ctivity of a soil microbial community. Adv. Appl. Microbiol. V. 57. P. 245-296

143. Paulino T. P., Magalhâes P. P., Jr G. C., Tedesco A. C„ Ciancaglini P. 2005. Use of visible light-based photodynamic therapy to bacterial photoinactivation. Biochemistry and Molecular Biology Education., v. 33, pp. 46-49

144. Pedone V. A., Folk R. L. 1996. Formation of aragonite cement by nannobacteria in the Great Salt Lake. Utah. Geology, v. 24, pp. 763 765.

145. Phillips J. L., McChensney L. 1991. Effect of 72 Hz pulsed magnetic field exposure on macromolecular synthesis in CCRF-CEM cells. Cancer Biophys., v. 12, pp. 1-7.

146. Phoenix V. R., Adams D. G., Konhauser K. O. 2000. Cyanobacterial viability during hydrothermal biomineralisation. Chemical Geology, v. 169, pp. 329-338.

147. Phoenix V. R., Konhauser K. O., Adams D. G., Bottrell S.H. 2001. Role of biomineralization as an ultraviolet shield: Implications for Archean life. Geology; September, v. 29; no. 9; pp. 823-826

148. Pierson, B.K., Mitchell, H.K., and Ruff-Roberts, A.L. 1993. Chloroflexus aurantiacus and ultraviolet radiation: Implications for Archean shallow-water stromatolites. Origins of Life and Evolution of the Biosphere, v. 23, pp. 243-260.

149. Psenner R., Loferer M. 1997. Nannobacteria: size limits and evidence. Science, v. 276 (5320), pp. 1776-1777.

150. Rambler M.B., Margulis L. 1980. Bacterial resistance to ultraviolet irradiation under anaerobiosis: Implications for pre-Phanerozoic evolution: Science, v. 210, pp. 638-640.

151. Rappe M.S., Connon S.A., Vergin K.L., Giovannoni S.J. 2002. Cultivation of the ubiquitous SARI 1 marine bacterioplankton clade. Nature, v. 418, pp. 630-633.

152. Reynolds E. S. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque strain in electron microscopy. J. Cell Biol., v. 17, pp. 208 212.

153. Sabatini D. D., Miller F., Barrnet R. J. 1964. Aldehyde fixation for morphological end enzyme histochemical studies with the electro microscope. J. Histochem. Cytochem., v. 12, pp. 57-71.

154. Sale A. J., Hamilton W. A. 1967. Effects of high electric fields on microorganisms : I. Killing of bacteria and yeasts. Biochim et biophys. Acta, v. 148, pp. 781-788.

155. Sale A. J., Hamilton W. A. 1967. Effects of high electric fields on microorganisms : II. Mechanism of action of the lethal effect. Biochim et biophys. Acta, v. 148, pp. 789-800.

156. Schut F., Gottschal J. C., Prins R. A. 1997. Isolation and characterisation of the marine ultramicrobacterium Sphingomonas sp. strain RB2256. FEMS Microbiol. Rev., v. 20, pp. 363-369.

157. Shevchenko A, Wilm M, Vorm O, Jensen ON, Podtelejnikov AV, Neubauer G, Shevchenko A, Mortensen P, Mann M. 1996. A strategy for identifying gel-separated proteins in sequence databases by MS alone. Biochem. Soc. Trans.V. 24(3), pp. 893-896.

158. Shimada K., Shimahara K. J. 1977. Effect of alternating current on growth lag in Escherichia coli B. Gen and Appl. Microbiol., v. 3, pp. 127-136.

159. Simon N. J. 1992. Biological effects of static magnetic fields: A review. International Cryogenic Materials Commission, P. O. Box 3345, Boulder, CO 80303, USA.

160. Size Limits of Very Small Microorganisms. 1999. Proceedings of a Workshop. National Academy Press USA. Washington, D. C.

161. Sommer A.P., Hassinen H.I., Kajander E.O. 2002. Light-induced replication of nanobacteria: a preliminary report. J Clin Laser Med Surg., v. 20(5), pp. 241-244.

162. Stackebrandt E. 2006. The Family Dermatophilaceae. Prokaryotes ed. by. M. Dworkin et al. V.4. pp. 623-653.

163. Stackebrandt E., Schumann P. 2006. Introduction to the Taxonomy of Actinobacteria. Prokaryotes ed. by. M. Dworkin et al. V.4. pp. 623-653.

164. Stersky A., Heldman D„ Hedrick T. J. 1970. Milk and Food. Technol., v. 33(12), pp. 545553.

165. Streatmlined Method to Analyze 16S rRNA Gene Clone Libraries. BioTechniiques Euro Edition, pp. 20-24.

166. Strehler B. L., Johnson F. H. 1954. The temperature-pressure inhibitor relation of bacterial luminescence in vitro. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, v. 40, pp. 606-617.

167. Tabrah F.L., Guernsey D.L., Chou S.-C., Batkin S. 1978. Effect of alternating magnetic fields (60-100 Gauss, 60 Hz) on Tetrahymena pyriformis. TIT life Sci., V. 8, pp. 73-77.

168. Teissie J. 1982. Proc. 2d Europ. Conf. Bioenerg. Lion, p. 17.

169. Torsvik V., Sorheim R., Goksoyr J. 1996. Total bacterial diversity in soil and sediment communities a review. J. Industr. Microbiol., v. 17, pp. 170 - 178.

170. Tsakas S. C. 1984. Geomagnetic reversals as a explanation for periods of punctuated speciation on Earth. Genetics, v. 107, pp. 108.

171. Uffen R. J. 1968. Influence of the Earth's core on the origin and evolution of life. Nature, v. 198, pp. 143-144.

172. Vainshtein M., Kudryashova E., Suzina N., Ariskina E., Voronkov V. 1998. Formation of bacterial nanocells. Proceedings, v. 3441, pp. 95 104.

173. Vainshtein M., Suzina N., Kudryashova E., Ariskina E. New magnet-sensitive structures in bacterial and archaeal cells. Biology of the Cell. 2002. V. 94. pp. 29-35.

174. Valentinuzzi, M., Ferrarest, R. W., and Vasquez, T. 1966, Abstract, Third International. Biomagnetic Symposium, University of Illinois, Chicago, III., pp. 13-15.

175. Venkateswaran A., McFarlan S.C., Ghosal D., Minton K.W., Vasilenko A., Makarova K., Wackett L.P., Daly M.J. 2000. Physiologic Determinants of Radiation Resistance in Deinococcus radiodurans. Appl Environ Microbiol., v.66(6), pp,2620-2626

176. Vobis G. 2006. The Genus Actinoplanes and Related Genera. Prokaryotes ed. by. M. Dworkin et al. V.4. pp. 623-653.

177. Walter M.R. 1983. Archean stromatolites: Evidence of the Earth's earliest benthos, in Schopf, W.J., ed., Earth's earliest biosphere: Princeton, New Jersey, Princeton University Press, pp. 187-213.

178. Waterbury J.B. 2006. The Cyanobacteria Isolation, Purification and Identification. Prokaryotes ed. by. M. Dworkin et al. V.4. pp. 1053-1073.

179. Wheeler Aim. E., Oerther D. B., Laxsen N. Stahl D. A., and Raskin L. 1996. The Oligonucleotide Probe Database. Appl. Environ. Microbiol., v. 62, pp. 3557-35559.

180. Zhou J., Davey M. E., Figueras J. B., Rivkina E., Gilichinsky D., Tiedje J. M. 1997. Phylogenetic diversity of a bacterial community determined from Siberian tundra soil DNA. Microbiology, v. 143, pp. 3913 3919.

Информация о работе

Абашина, Татьяна Николаевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изменения структурной организации бактериальных клеток при стрессовых воздействиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы