Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивное поведение Шигелл Флекснера на начальной стадии образования микроколоний

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Адаптивное поведение Шигелл Флекснера на начальной стадии образования микроколоний"

ЛШНИСТЕРСГВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВ Олег Ювенальевич

УДК 576.85.49.093.1

АДАПТИВНОЕ ПОВЕДЕНИЕ ШИГЕЛЛ ФЛЕКСНЕРА НА НАЧАЛЬНОЙ СТАДИИ ОБРАЗОВАНИЯ МИКРОКОЛОНИИ

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск 1990

/О/

</ ¿г ■') <?( > *

Работа выполнена в Ивановском государственном медицинском институте им. А. С. Бубнова.

Научный руководитель —

доктор медицинских наук, профессор С. Г. Смирнов.

Научный консультант—

доктор медицинских наук, профессор А. А. Миронов.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор 3. Н. Кондрашова; доктор медицинских наук, профессор Б. Я. Усвяцов.

Ведущая организация —

Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт.

Защита состоится « /Р. » . . . 199£Ггода

в . 'А часов на заседании специализированного совета К.084.04.03 Челябинского медицинского института (454092, Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан « » "Г' . 1990 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук,

доцент К. М. ЛЕБЕДЕВА

Актуальность проблемы. Развитие биотехноло-' гии и¡медицинской микробиологии ставит проблему управляемого культивирования микроорганизмов, исследование закономерностей адаптации, роста и деления клеток, развития популяций в различных условиях выращивания.

Бактериальная популяция может изучаться на целостно-популяцион-ном (Иерусалимский Н.Д.,1963; Работнова И.Л.,1971) и клеточно-попу--ляционном (Печуркин Н.С., Терсков ¡I.A.,1975; Пшеничное P.A. и др., 1977; Печуркин Н.С.,1978) уровнях организации биологической системы. В последнее время приоритетное развитие в исследовании процессов жизнедеятельности популяций микроорганизмов получает клеточно-популяционныЯ подход, учитывающий гетерогенность клеток популяции по различным свойствам, причины возникновения этой гетерогенности (Иванов В.Н.,.Угодчиков Г.Д.,1984). Присутствие в популяции определенной доли атипичных особей повышает пластичность популяции Шаслов Ю.Й., Парамонова З.Л.,1983) при адаптации к неблагоприятным воздействиям внешней средн. Изучение динамики поведения микробных популяций с учетом гетерогенности (на популяционном уровне) является одной из наиболее актуальных биологических задач (Кяохиня И.Н., Угодчиков Г.А.,1980).

До сих пор недостаточно изучен и слабо освещен в литературе механизм адаптации клеток бактерий на самом раннем этапе развития популяции. Известно (Коротяев А.И.,1973; Перт С.Дж.,1970; Елохина И.П., Угодчиков Г.А.,1980; Iandolo X., Ordal Z.,19S6;AUv;ood I.t.C., Rüssel д. В. ,1968), что лаг-Фаза является еашвйаим и

определяющим периодом развития культуры, что в ней наблюдаются бурные физико-химические и клеточные процессы (Смирнов К.К., Смирнов С.Г., Смирнова З.Г.,1982; Смирнова 3. Г, ,1985). До сих пер >гег ясности в тонких механизмах морфо-функциональной пцпптзчни клпток инонулста и породе дочерних клеток, хотя w"»Hi>n гчог оякчЯ ршшлй

период б значительной степени определяет последующее развитие бактериальной популяции.

Вышесказанное и определило направление, цели и задачи наших исследований.

Цель работы. Изучение особенностей действия метаболитов (фильтратов), полученных из культур разного возраста шигелл Флекснера (зь.Пезгаег! з ,иа ,М ), на адаптивное поведение клеток инокулята и клеток следующего поколения тех же штаммов на . начальной стадии формирования макроколоний.

Основные задачи исследования :

1. Отработать методику исследования адаптивного поведения клеток шигелл на ранних стадиях развития в микрокамерах стационарного и проточного типов.

2. Отработать морфометрические аспекты измерения клеток при исследовании их с помощью микрокиносъемки. Найти наиболее информативные показатели оценки адаптивного поведения клеток на начальной стадии образования ыикроколонии при посеве на плотную питательную среду. ».

3; Исследовать адаптивное поведение разновозрастных клеток шигелл Флекснера ( зь. Пвхпег! 3 , йа , 1Ш ) при воздействии на них комплекса метаболитов (фильтратов) тех же штаммов в различных сочетаниях по диссоциативной принадлежности из периодических культур разного возраста. .

Научная новизна. При использовании собственных методических и конструкторских разработок в области стационарного и проточного микрокультивирования впервые были проведены исследования по количественной оценке адаптивного поведения шигелл на ранних стадиях образования ыикроколоний. Доказано, что наиболее информативными показателями при этом являются I (время генерации клеток! и К(отношение Ьк/Ьо ) клеток.-Обнаружено, что распределения

данных показателей имеют полимодальный характер и с различных сторон характеризуют процесс адаптации популяции к среде обитания Кластерность временной гетерогенности популяции шигелл по распределениям "С клеток отражает динамику адаптивных процессов и глубину стрессовой ситуации изучаемого поколения клеток. Морфофизиоло-гическая кластерная гетерогенность, устанавливаемая по показателю к характеризует структурно-адаптивные процессы в исследуемых поколениях клеток, в том числе при включении sos -функции (при стрессовых ситуациях). Адаптивное поведение hi.fiexnari S , Ra , Rd Определяется только возрастом инокулята и но зависит от возраста фильтратной добавки в среду культивирования, а также их штаммовой принадлежности.

Впервиэ метрологически доказано, что использование высококонтрастного фотоматериала при йазовоконтрастной микрокиносвемке позволяет повысить разрешагацую способность светового микроскопа на порядок относительно измереглй при визуальных микроскопических наблюдениях.

Проведенные эксперименты по проточному микрокультивированию о введением в среду в процессе развития популяции клеток шигелл пенициллина. Впервые показано, что в физиологической структуре инокулята присутствуют неразмножагадиеся и нерастущие клетки, которые госле удаления пенициллина подвергаются аутолизу. Впервые по данным трансмиссионной микроскопии показано, что эти клетки имеют особенности в строении оболочки и организации нуклеоида.

Основные защищаемые положе н и я .

I. Сконструированы и изготовлены камеры для проточного микрокультивирования микроорганизмов, обеспечивающие быструю замену питательной среды при одновременной оптической регистрации процесса их развития (а.с.» 133 9123,1987; а.с.№ 141 4868,1958). Доказана высокая информативность показателей X (время генерации) и к(отно-

шения Ь^/Ьф )'для оценки адаптивного поведения клеток палочковидных бактерий на ранних стадиях проточного и стационарного микрокультивирования.

2. Показано, что применение высококонтрастного фотоматериала, как светочувствительного приемника, повышает разрешающую способность светового микроскопа на порядок относительно визуального предела разрешения, что позволяет при фазовоконтрастной микрофотографии проводить достоверные измерения размеров клеток бактерий с точностью до сотых долей микрометра.

3. Впервые показана временная и шрфофизиологическая кластерная гетерогенность клеток шигелл на ранних этапах адаптации к среде обитания, заключающаяся в полимодальности распределений клеток по X. (времени генерации) и показателю к ( ), анализ которых позволяет судить как о динамике, так и об особенностях развития структурно-адаптивных процессов в популяции, в частности, под воздействием фильтратов шигелл, полученных на различных фазах их развития. Адаптивное поведение клеток аь.Деговг! 3 , йа , на определяется возрастом шокулята и не зависит от штаммовой принадлежности и возраста фильтратной добавки в среду культивирования.

4. Впервые показано, что при проточном микрокультивировании адаптивное поведение клеток шигелл определяется возрастом иноку-лята: при использовании 18-часового инокулята адаптивные процессы ускоряются, а при использовании 3-часового инокулята они замедляются. При введении пенициллина в проток питательной среды происходит массовый лизис растущих клеток шигелл, в поле зрения остаются неповрежденными ранее нерастущие клетки, которые после активного перфузирования свежей средой подвергались медленному лизису по типу таяния. По данным трансмиссионной электронной микроскопии они имеют различное строение с пролиферирувдими клетками популяции.

4

1

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых ИГЙИ в 1985,1966, 1987 годах; на научно-практических конференциях микробиологов и инфскнионистов ЙГМИ в 1965,1986,1987,1963-1909 годах; на Первом межинститутском совещании по этологии бактерий (Иваново,1935); на Всесоюзном научно-техническом семинаре "Электронная микроскопия для исследования функциональных изменений структуры клетки при различных воздействиях" (Иваново,1987); на Всесоюзной конференции "Биофизика микробных популяций" (Красноярск,1967); на Всесоюзной конференции "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (Пущино,1987); на Всесоюзной конференции "Колонизационная резистентность и химиотерапевтические антибактериальные препараты" (Москва,1988); на конференции молодых ученых биологического .факультета Iffy (Москва,1989).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 15 научных работах, в том числе II в центральной печати.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка цитированной литературы, приложения. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков и 16 таблиц. Список литературы состоит из 360 источников, в том числе 205 отечественных и 155. иностранных.

Практическая значимость работы.

Разработанные методические приемы и устройства для стационарного и проточного микрокультивирования микроорганизмов позволяют исследовать на количественном уровне адаптивное поведение как отдельных клеток, так и совокупности клеток при образовании микроколоний. На основании информативных показателей адаптивного поведения ( X и Т^/г ) клеток популяций шгелл можно оценивать влияние

различных веществ, в том числе и аутометаболитов на начальных оталах развития их популяций. Показано, что в фильтратах культур диссертационных мутантов э и а-форм шигелл различного возраста содержатся сигнальные метаболиты, действие которых может быть тестировано с помощью индикаторной культуры тех же шгелл, что может содействовать открытию новых, полезных веществ - стимуляторов ■ или ингибиторов развития шигелл йлекснера.

Показано, что проточное ыикрзкультивкрование значительно расширяет экспериментальные возможности управления развитием популяции бактерий и может служить методом определения воздействия антибактериальных веществ на развитие популяций микроорганизмов.

Камера для проточного микрокультивирования микроорганизмов (а.с.№ 133 9123,1967) внедрена в практику научно-исследовательской работы в лаборатории Конструирования и моделирования замкнутых систем Института биофизики СО АН СССР и кафедры микробиологии Крымского медицинского института.

Материалы и методы. В работе использованы диссоциативные 'мутанты ЗЬ.Петег! 3 , Па ■ Нй ИЗ набора 31>„топз,а полученные из ЮМ им. Н.<5.Гамалеи. Штаммы различались генетически детерминированным строением поверхностного липополисахарвда обо-, лочки.

Культивирование бактерий проводили в стационарной (отраслевое рац.пр. 0-2893,1987) и проточных микрокамерах (а.с.№ 133 9123,1987 а.с,№ 141 4668,198о) на среде Дифко. Термостатирование выполняли с точностью 37,0+0,1°. Для наблюдения и фильмирования адаптивного поведения ¡слеток шигелл использовали микрокичоустановку МКУ-1 (СССР), работающую в режиме цейтраферной съемки. Съемку Еели в течение 6-12 часов с интервалом между кадрами 5-10 минут. Всего проведено 180 экспериментов по изучению адаптивного поведения Б и к -форм шигелл в оптимальных условиях роста и под влиянием фильтратов

шигелл различных фаз развития при стационарном и проточном микрокультивировании.

В поле зрения микроскопа находилось 25-150 исходных клеток. В большинстве экспериментов применяли несшхронизированный 3- и 18-часовой инокулят шигелл.

Основным инструментом исследования адаптивного поведения клеток шигелл на плотной питательной среде использовали разработанный нами метод сигмум-морфометрии. Дополнительными методами исследования при решении отдельных задач были: мембранная фильтрация, сканирующей и трансмиссионная электронная микроскопия, селективная синхронизация клеток инокулята шигелл по c.E.Heimstetter (1968) и др.

Основные этапы метода сигмум-морфометрии заключается в следующем: I. Проводится цейтраферная микрокиносъемка клеток популяции в процессе их развития. 2. Фотопечать микрофильма цейтраферной съемки. 3. Лз ¡дарения межполвсной длины бактериальных клеток, их диаметра в начале и в конце цикла роста, расчет их индивидуального L (времени генерации) с повторением этих операций у клеток-потомков в следующем поколении. 4, На основании результатов измерений морфологии и установленных значений клеток рассчитывались следующие показатели: константа скорости роста (с), объем ( v ) и площадь поверхности ( s ), отношение площади поверхности к объему (S/V ) бактерий в начале и конце цикла роста, отношение длины клеток конца и начала цикла роста (Ь]/Ьа) и др.

Расчеты выполняли на ЭВМ EC-I0.33 и М-6000 по формулам:

V=fTr2(b- 2/3 г) I 3= 2 ifLr } с» * УЬр

0,4343' i

где: l - длина, г - радиус клетки, X - время генерации. Проводили статистическую обработку полученных расчетных данных по формулам статистики и построение кривых отдельных параметров.

Фильтраты 3-' и 18-часовых культур иигелл получали с помощью нитроцеллюло зных фильтров "Сынпор" (ЧССР). Для культивирования клеток шигелл свежую питательную среду перед введением в микрокамеры смешивали с фильтратами в соотношении 1:1.

Препараты для сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии готовили по общепринятым методикам (Уикли П..1975).

Стабильность диссоциативной чистоты музея 3 и р. -форм шигелл поддерживали при пересевах путем просмотра 100 колоний каждой культуры при косом освещении и отбором колонии с характерными морфологическими свойствами.

Результаты работы. Обзор и анализ литературы, представленной в первой главе, показал целесообразность исследований адаптивного поведения клеток шигелл на раннем этапе формирования микроколоний в плане изучения процесса морфофизиологической дифференциации. '

Любая бактериальная популяция представляет собой сложную саморазвивающуюся систему с ауторегуляторным типом функционирования, которая состоит из клеток различных диссоциативных форм. Ранее бы--ли обнаружены отличия в поведении клеток з и к -форм шигелл на плотной питательной среде (Воскун С.Е.,19а5). Однако неизученным, оставался вопрос об адаптивном поведении как отдельных клеток, так и всей популяции в целом под влиянием ауторегуляторпнх метаболитов на самых ранних этапах формирования бактериальной популяции. Основньвд препятствием для этого служило отсутствие объективных информативных показателей, которые могли бы однозначно охарактеризовать наличие и особенности адаптивного процесса о начальных стадиях развития популяции клеток шигелл. К дополнительным сложностям следует отнести низкий уровень методических разработок в области микрокультивирования бактериальных популяций, а также недостаточную метрологическую обеспеченность регистрации процесса разе

вития популяции на клеточно-популяционном уровне.

Поэтому в работе уделено значительное место усовершенствованию приборного оснащения и методов-камерного координатно-фиксированно-го микрокультивирозания бактерий в стационарном и проточном режимах. Этому посвящена вторая глава. Анализ недостатков конструкций подобных микрокамер способствовал разработке собственных оригинальных устройств (а.с.» 133 9123,1967; а.с.}® 141 4868,1986) и модификации известных (отр.рац.пр. 0-2893,1987).

Количественное описание процесса развития одной клетки при микрокультивировании представлено в ограниченном количестве работ (Воскун С.Е.,1984,1985; CaUlns J.F. , Hichmond K.M. ,1962). Это определяется, главным образом, тем, что существует мнение о недостаточной разревеяцей способности фазовоконтрастной микроскопии бактерий ( Koch А. et al.,I987). Предпринятый теоретический анализ литературных источников показал, что широко используемое понятие "предел разрешающей способности светового микроскопа" нуждается в дополнении и конкретизации. Рассмотрение теоретических аспектов получения изображения с учетом дифракционных погрешностей позволило нам связать повышение разрешающей-способности микроскопа с возможностью светочувствительного приемника регистрировать меньшую величину контраста при той же освещенности. В результате мы пришли к заключению, что использование в качестве светочувствительного приемника высококонтрастной пленки типа "Микрат-300" вместо человеческого глаза способно повысить предел разрешающей способности светового микроскопа..Из анализа литературных данных (Кругер М.Я. я др.,1967; Гороховский В.Н., Баранова В.П.,1970) нами было установлено, что благодаря большему количеству светочувствительных центров на единицу площади, определяющих формирование изображения объекта, высококонтрастная пленка повышает разрешение объектамалой протяженности по сравнении с человеческим глазом от

3 до 18 раз. Вместе с тем всюду, даже в случае использования при морфометрии высококонтрастных фотоматериалов, по-прежнему сохраняется значение предела разрешающей способности для светового микроскопа +0,2 мкм, что справедливо только для визуальных наблюдений. Для проверки этого нами был проведен ряд метрологических исследований. На микрофотометре 10-4 профотометрировали микроско-. пическое изображение на пленке "Микрат-300" стандартной меры (объект-микрометра), применяемого обычно в качестве эталона при измерениях линейных размеров микрообъектов с помощью микроскопа. В результате, как мы и предполагали, разрешающая способность светового микроскопа с учетом применения высококонтрастного фотоматериала составляла +0,04 мкм. Кроме того, была проведена сравнительная поверка на микрообъектах презентативного количества с применением фаэовоконтрастной и сканирующей электронной микроскопии, выбранной за эталонный метод. В первом случае в качестве микрообъекта были выбраны малоусадочные латексные сферы, а во втором. -клетки зь.Пехпог! Б . В обоих случаях при статистической обработке данных измерений было получено совпадение по значениям порядка погрешностей измерений на фотоотпечатках фаэовоконтрастной и сканирующей электронной микроскопии, превышающее разрешающую способность при визуальных наблюдениях (для бактериальных клеток - +0,05 мкм).

В результате этих исследований впервые нам удалось показать, что разрешающая способность фазовоконтрастного микроскопа при использовании высококонтрастного фотоматериала выше, чем при визуальных наблюдениях и это позволяет на порядок повысить информативную значимость измерений размеров бактериальных клеток с точностью до сотых долей микрометра.

Клетки инокулята на поверхности питательной среды в микрокамере исходно имеют различное взаикнае расположение. Га; предположили,

что это накладывает отпечаток на их дальнейшее развитие. Дня выяснения этого вопроса клетки инокулята после помещения я микрокамеру на поверхность питательной среды были подразделены на несколько групп: одиночных, парных близлежащих и агрегатов из трех и более клеток.

Установлено, что время генерации клеток из группы парных (близлежащих) клеток достоверно увеличено относительно времени генерации одиночных клеток. В то же время Т клеток в агрегатах из трех и более клеток достоверных отличий от Ь клеток из группы парных в поколении клеток инокулята на имеет. Значения константы скорости роста (С) одиночных клеток ниже, чем в других группах. Во втором поколении клеток-потомкоа в тех же группах, значения практически всех показателей, в том числе и и о выравниваются для всех групп клеток. Эти результаты позволили предположить, что в популяции клеток инокулята на самых первых этапах ее развития вццеляютея информационные аутометаболиты как ингибирующего, так й стимулирующего действия, обеспечивающих перевод стратегии поведения клеток к соответствующей фазе развития популяции. Поэтому в дальнейшей работе неочищенные фильтраты культур шигелл- определенного возраста были выбраны как факторы, дестабилизирующие обычное "нормальное" развитие клеток шигелл после помещения их в новые условия среды обитания, вызывающие разбаланс стратегии поведения основной массы клеток.

Прижизненная световая микроскопия бактериальных клеток может представить а распоряжение исследователя сравнительно небольшой объем первичной информации (длины, диаметр клеток). Ррзовчо измерения этих параметров без привязки к событиям клеточного никла малоинформативны. Регистрация их в динамике развития популяции, в начале и конце цикля роста определенных клеток с помощью раэработан-

. X

ного нами метода сигмум-морАометрии позволяет анализировать с

/

помощью формализованных показателей интегральные ыорфофизиологи- . ческие свойства клеток популяции в исследуемых поколениях.

При исследовании клеток бактериальных популяций в связи с их клеточным циклом, как правило, применяют сиюфонизированный тем или иным способом инокулят (Позмогова И.Н.,1981; Иванов В.Н.,-Угодчиков Г.А.,1984). Использовав, как наиболее щадящий клетки, метод избирательной синхронизации по C.E.Helmatet-ter (1968), нами обнаружено, что даже в пределах первых трех поколений клеток при развитии популяции на плотной питательной среде нельзя получить полностью синхронной культуры Sh.flexneri . В связи с этим мы сочли возможным отказаться в дальнейшем от синхронизации клеток инокулята в наших исследованиях.

При выполнении сигмум-морфометрии клеток развивающейся популяции ■ после обработки экспериментальных данных в конечном счете получается большое число морфофизиологических параметров; длина, диаметр клеток в начале и конце цикла роста ( Ьо , Ь^. , Dq , D^ ),

X , С, So , v0 , Sk , vfc , S0/V0, vvk . Vs0 • Vv0 и ДР-

Все эти показатели так или иначе способны характеризовать процесс адаптации клеток, но информативность их оказалась различной. В ходе анализа каждого из этих морфофизиологических показателей уста-, новлено, что наиболее чувствительными, а следовательно, информативными показателями является показатель к , характеризующий отношение bjj/li клеток популяции и L (время генерации) клеток. Безразмерный показатель к отражает структурно-адаптивные тенденции.в развитии-бактериальной популяции от состояния покоя до активизации и проявления sos-функции первого порядка (Беляков В.Д. и др.,19Ь7). Пот* 1 казатель L клеток является временной характеристикой структурно-

адаптивных перестроек популяции, в том числе и в состоянии стресса. На рис. I приведены типичные распределения показателя к иХ клеток Sli.flexceri S при использовании Ib-часового инокулята. Обнаружено

Рис. Г. Распределения показателя к (отнесение1 ).

£ и С клеток аь.Пехпег1 (18-часовой шокулят) • ' ('Объяснения в тексте).

что распределения этих показателей клеток имеют кластерный полимодальный характер даже при оптимальных условиях роста клеток, что экспериментально подтверждает их высокую чувствительность и информативность для оценки адаптивного поведения клеток популяции. На этом же рис. I для сравнения представлены распределения константы скорости роста клеток (С). Они имеют одномодалькый Гауссово^ кий характер, что отражает малую чувствительность и информативность данного показателя.

Для изучения закономерностей адаптивного поведения популяций клеток БЬЛХехпег! 3 , На , на нами было исследовано их развитие в первых двух поколениях под влиянием фильтратных добавок (3-часовых и 18-часовых) культур ЗЬ.Пе*аег1 3 , На , на . Общая схема проведения этих экспериментов представлена на рис. 2.

Инокулят, использованный "$ильтратная добавка

для засева в микрокамеру в среду культивирования (1:1)

Рис. 2. Общая схема экспериментов по определению влияния фильтратов различного возраста sh.fiexn.eri з,Ке, иа , на адаптивное поведение клеток ННЛ1ехпог1 Б,

Мы исходили из того, что основная масса клеток 3-часового ино-кулята ориентирована на стратегию максимальной скорости роста (с выходом на фазу экспоненциального размножения), а клетки 18-часового инокулята, перейдя в стационарную фазу, ориентированы на

стратегию вшивания.

Соответственно, получая фильтрат 3-часовой культуры, мы считаем, что он должен содержать специфические информационные аутоме-таболиты, ориентирующие клетки на стратегию максимального развития (при незначительном содержании продуктов жизнедеятельности). В 18-часовом фильтрате должны быть специфические информационные метаболиты, переводящие клетки на стратегию пппчвания, и значительное количество продуктов метаболизма.

Добавляя одновозрастныо и разновозрастные фильтраты в среду для посева 3- и 18-часового даокулята БЬ.Пехпег! Э ,йа ,114 с клетками разной стратегической ориентации, мы рассчитывали получить большую гашу разнообразных проявлений адаптивного поведения клеток инокулята и второго поколения шигелл при образовании микроколоний, т.е. на самом раннем этапе формирования популяции на плотной питательной среде.

I. Б результате экспериментов выявлено, что адаптивное поведение клеток sh.fiехпвг! а' зависит от возраста инокулята и не зависит от штаммовой принадлежности и от возраста фильтратной добавки в среде. При использовании 18-часового инокулята и фильтратов культур ЗЬ,Г1ехпег1 Б ,Яа ,Ес1 одинакового с инокулятом возраста в поколении клеток инокулята наблюдается сокращение X клеток. Анализ значений показателя к. показывает, что в популяции существует тенденция ингибирования роста части клеток инокулята во всех зкепери-нентах с добавлением фильтратов. Во втором поколении происходит увеличение значений С клеток относительно контроля и сохранение тенденции ингибирования роста клеток при фильтратных добавках ЗЬ.Пехпег! Б и Еа .

При добавлении в среду 3-часового фильтрата различных штаммов БЬ.Иеглег-! з , Ка ,на адаптивное поведение клеток Я11.Плотлг1 з неоднозначно (табл. 2). Так, филътратиая добавка гомологичного

Таблица 2 .

•Морфофункциональные показатели клеток Sii.fiexn.eri. 8 (18-часовой инокулят) при добавлении в среду 3-часовых фильтратов шигелл зь.Пехпвг! з,На,Ш.

■ Фильт- Поко- Ъп bk k L

рат ления клеток И+ m I.I+ и U+ m Ц+ m

- V % V % V % V

Контроль (среда без фильтрата) I 2,45+0,06 4,85+0,06 2,05+0,05 271+6

20,8 10,7 20.3 17,9

П 2,54+0,02 3,85+0,03 1,52+0,01 106+2

II,.4 9,6 9,5 23,0

I 2,46+0,05 4,57+0,09 2,07+0,06 326+5

Shigella 18,6 16,2 22,9 13,7

flexneri n 2,59+0,04 4,22+0,06 1,66+0,03 40I+I

S 19,5 18,1 19,3 6,4

Shigella flexneri Еа I 2,64+0,13 4,59+0,31 1,67+0,15 I3I+II

22,3 30,7 41,3 37,0 .

П 2,51+0,12 4,77+0,12 1,99+0,07 112+5

30,1 16,6 22,6 ■ 26,3

I 2,51+0,07 3,87+0,09 1,48+0,04 341+23

Shigella 19,0 15,5 15,3 35,9

flexneri П 2,22+0,04 2,22+0,04 1,00+0 0

Rd 13,3 13,3 0 0

штамма вызывает увеличение t клеток, Фильтратная добавка Shigella flexneriRaстимулирует развитие клеток инокулята Sh.flesneri s. Уменьшение значений показателя к на первый взгляд свидетельствует4 об ингибировании роста части клеток инокулята, но в связи с тем, что неизвестнаXQ клеток инокулята, то возможно предположение, что

происходит активизация метаболизма и клетки делятся при меньших значениях Lk< Во втором поколении наблюдается активизация sos-функции первого порядка, что приводит к удлинению клеток. Однако совместное рассмотрение значений показателя к и X говорит о стимулирующей влиянии фильтрата SU.fJemeri На • ©ильтратная добавка Sh.flomeri ftd крайне неблагоприятно воздействует на исходные клетки, лызшая увеличение t клеток. Значения показателя к. свидетельствуют с наличии тенденции ингибирования роста клеток уже в поколении клеток инокулята. Во втором поколении наступает полное ш-гибирование роста клеток. Изучение адаптивного поведения клеток sh.fiexnori s при использовании 3-часового инокулята выявило неоднозначную реакцию исходных клеток на фильтратные добавки различного возраста культур Sh.flexnerl S , йс , ВД • Обнаружено, что во втором поколении происходит стимулирование развития клеток sh. fleraeri 3 под влиянием любых разновозрастных добавок Sh.flexneri S , йа |М (судя по значениш I ). Распределение клеток по X в исследованиях поколениях полимодалыш. Однако в большинстве этих экспериментов в конце второго поколения наблюдается тенденция ингл-бирования роста основной части клеток популяции (судя по значениям показателя к ). '

2. Установлено, что адаптивное поведение клеток Sh.ílexnori Ra зависит от возраста инокулята и не зависит от возраста фильтратной добавки в среду, а также щтаммовой принадлежности фильтрата. §ильт-ратиая добавка гомологичного 18-часовому инокуляту штамма Sh.flox-neri Вп независимо от ее возраста способствует одинаковой динамике морфофизиологи<>еских показателей ( к и X ) в исследованных поколениях. Добавление в среду 3-часового фильтрата a¡;.fie:aie~i На ведет к сокрацени» L клеток ь исследуемых поколениях при сохранении характерной бимодально сги распределений. Показано, что активация .íes -Функции первого порядка происходит у неболчлой части

клеток при воздействии 3-часовых фильтратов Sh.fiexneri S ,Rd, . причем при фильтратной добавке sh,.flexneri S этот процесс идет как в первом, так и во втором поколениях. При использовании 18-часовых фильтратов Sh.flexneri S и Rd обнаружено неблагоприятное воздействие, приводящее к увеличению значений "С исходных клеток. Фильтрат Sh.fle.-meri Ra не оказывает.существенного влияния на значения показателей к исходных клеток, но во втором поколении влияние веществ данного фильтрата уже неблагоприятно. При добавлении в среду 18-часовых фильтратов различных штаммов Sh.flexneri S, Ra , Rd обнаружено, что у клеток Sh.flexneri Ra (3-часовой ино-нулят) к концу второго поколения происходит активация SOS -функции первого порядка. Лишь фильтратная добавка SH.flexneri S неблагоприятно влияет на исходные клетки и на клетки второго поколения, способствуя увеличению L клеток относительно контроля. Присутствие в среде R -фильтратов неблагоприятно для адаптивного поведения клеток Sh.flexneri Ra , что ведет к увеличению значений L и'показателя к. Вещества, содержащиеся в фильтрате Sh.flexneri S не оказывают существенного влияния на развитие исходных, клеток Sh. floxneri Ra , но во втором поколении происходит активация у части клеток sos-функции первого порядка и увеличение L клеток.

3. Изучение адаптивного поведения клеток Sh.flexneri Rd при фильтратных добавках в среду культивирования показало неоднозначную реакцию меток инокулята и второго поколения на эти добавки. В поколении клеток 10-часового инокулята Sh.flesmeri Rd всех экспериментов с 18-часовыми фильтратными добавками происходит активация SOS -функции первого порядка. Фильтратные добавки r-штаммов вызывают увеличение L исходных клеток. Во втором поколении, судя по значениям показателя к и его распределениям, существует тенденция ингибирования роста клеток Sh.flemeri Rd . При использовании в экспериментах 3-часовых фильтратов f3h.flpxncr.ri. S,Rc..Rd,

IB

несмотря на различие значений I исходных клеток во втором поколении зарегистрировано сокращение Ь относительно контроля.

Бо всех экспериментах с использованием 3-чесового инокулята эь.Лехлог! ца и 18-часовыми фильтратиьми добавками наблюдается увеличение ^ клеток относительно контроля в исследуемых поколени- о

ях (табл. 3).

Таблица 3

Морфофункциональные показатели клеток sh.fiеапог! га (3-часовой инокулят) при добавлении в среду 3-часовых фильтратов шигелл ЗЬ.Позтег! 3,Па,ка.

Фильт- Поколе- \ к L

рат ния клеток И+ m И+ И Ы+ n M+ m

4J&__ V Й V <S V Я

Контроль (среда без фильтрата) I 3,20+0,15 4,72+0,23 1,48+0,06 81+12

22,7 22,2 10,9 23,0

П 2,60+0,09 4,26+0,10 1,68+0,05 68+3

22,4 13,5 18,3 22,2

I 3,22+0,20 3,22+0,20 0 0 ,

Shigella 21,5 2T,5 0 0

flexneri П 0 0 0 0

3 0 0 0 0

I 2,93+0,14 4,20+0,09 1,52+0,05 88^9

Shigella 17,3 9,3 13,5 46,2

flexneri П 2,33+0,04 4,13+0,08 1,79+0,04 64+3

Ha 11,5 И,I 12,8 19,3

1 2,95+0,09 5,30j0,35 1,66+0,0?; 161+12

Shigella 26, С 34,0 21,2 36,5

flexneri П 2,82+0,08 4,39x0,12 5_+0,07

Hd ' 18,5 1С,4 2-3 ,V 35,1

_______ . ______ _____ _________.

Значения показателя к при фильтратных добавках эь.Псхпег! 3. и иа не отличаются от контроля, а при фильтрате зь.гхвхпег! Ла происходит его уменьшение. Использование в экспериментах 3-часовых фильтратов БЬ.Пестег! Б , Еа И инокулята 8Ь.Псжпсг1 Ей одного с ними возраста вызывает различные адаптивные реакции клеток в исследованных поколениях. Так, например, фильтрат аи.Г1етвг1 3 полностью ингибирует развитие клеток ЗЬ.Г1ехпог1 ла уже в первом поколении. Фильтраты й-форм во втором поколении стимулируют обменные процессы в популяции Sh.fl етег! яа , вызывая сокращение их С , но одновременно основная часть клеток проявляет тенденцию ингиб!фования роста клеток. Наблвдается также,.незначительная доля клеток популяции с активизированной. зоз-функцией первого порядка.

Таким образом, адаптивное поведение клеток Зьл1ехпег1 8,Ла, на определяется возрастом инокулята и не зависит от возраста фильтратной добавки в среду, а также юс штаммовой принадлежности,

Адаптивное поведение клеток шигеял зависит также от режима культивирования: стационарного или проточного.'Культивирование клеток БЬ.Пехпег! на в проточном режиме показало, что адаптивное поведение клеток зависит от возраста инокулята: при использовании 18-часового инокулята происходит стимулирование, а при 3-чосовом -ухудшение развития клеток (особенно в первом поколении). Это позволяет предположить, что развитие клеток инокулята определяется веществами-метаболитами (ингибиругацего или стимулирующего действия) привнесенными вместе с клетками инокулята, удаление которых изменяет время адаптации. ' >

Для проверки значимости в развитии популяции адаптивного поведения клеток инокулята был проведен эксперимент, где ингибиругаций * развитие клеток 3-часового инокулята вп.П.е-лпег1 ла , фильтрат

3h.fl стог! з был зведон в микрокамеру после завершения клетками инокулята цикла^ роста (табл. 4).

Таблица 4

Морфойизкологические показатели клеток зк.Пехпог! ял (3-часовой кнокулят) при проточном микрокультивировании в присугстпии в среде фильтратов с"п.Лв-кг.вг1 з разного возраста

По- По- Возраст Фильтрата (в часах) контроль

ка-за- коле- 1,5 3 18 Вез фильтрата

те-ль ния [слеток К+ п V Й Ц+ га V Й Н+ я V % М+ га V %

I 2,68+0,09 21,8 2,77+0,07 18,7 2,87+0,09 25,6 2,83+0,14 27,4

П 2,18+0,04 12,3 2,38+0,05 17,7 2,18+0,04 17,2 2,09+0,11 21,1

\ I 3,99+0,0? .9,0 4,41+0,13 18,9 3,97+0,08 14,7 3,68+0,29 21,0

П 3,78+0,10 19,9 4,14+0,00 16,6 3,75+0,05 14,0 3,97+0,12 И,7

I 1,43+0,05 18,0 1,56+0,05 21,2 1,46+0,04 22,1 1,50+0,11 21,7

1\ п 1,73+0,05 20,1 1,79+0,04 15,0 1,76+0,03 15,7 1,90+0,12 16,2

I 191+10 34,1 181+8 47,а 179Гб 62,4 210+24 32,4

и п 100+4 38,0 90+3 29,3 79+2 28,8 119^7 22,4

Обнаружено, что фильтраты Шг.Пехиог! з различного возраста не оказывают на клетки второго поколения ПИ.Пехпсг! па существенного ингибирующего воздействия при проточном режиме культивирования, а выступают как добавки, изменяющие реологические свойства среды. Таким образом, основная адаптивная нагрузка приходится на клетки инокулята и все дальнейиее поведение популяции клеток и ее развитие зависит, очевидно, от Физиологической структуры шюкуля.'о, а таете физико-химических свойств сре,пы обитания я данный момент.

?Л

В структуре клеток инокулята при стационарном и проточном куль» тивировании наблюдали неразмножанциеся нерастущие клетки и лизи-рущиеся клетки. При введении пенициллина в проток питательной среды покоящиеся клетки не повреждались, в то время как растущие клетки лизировались в течение часа. После отмывки от пенициллина большими количествами свежей питательной среды неразмножаяздиеся нерастущие клетки подвергались медленному лизису по типу таяния. Сравнительное изучение этого процесса с помощь» сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) и фазовоконтрастной микроскопии показало, что лизис клеток в микрокамере и на чашке не совпадает по времени й интенсивнее протекает в мшфокамере. Однако и при обзорной СЭМ обнаруживаются в популяции клетки не подвергшиеся лизису.

Была проведена трансмиссионная микроскопия нерастущих неразмно-жаицихся клеток, вьщеленных с помощью пенициллина. Обнаружены особенности строения этих клеток,- сходных при использовании как 3-часовой, так и 18-часовой культуры ЕЬЛ1ехпег1 я а : наличие осмио-негативных зон в центре клеток, г.е. центральная локализация нук-леоида, а также отсутствие меэосомальных образований. Ве® это позволяет предположить, что нерастущие неразмножающиеся клетки в популяциях шигелл являются разновидностью покоящихся клеток, морфологически неразличимы от пролиферирущих клеток популяции. - *

ВЫВОДЫ

1. Созданы и внедрены оригинальные конструкции проточных микрокамер (а.с.(Г3 133 9123,1987; а.с.К-' 141 486В,1988), расширяющие экспериментальные возможности исследования поведения бактерий на ранних стадиях образования микроколоний.

2. Доказано повышение разрешающей способности светового микроскопа при морфометрии клеток бактерий до сотых долей микрометра при

использовании высококонтрастного фотоматериала при фазококонт-растной микрокиносъемке.

3. Теоретически и экспериментально обоснована высокая информативность показателей С (время генерации) и к(отношение ) для оценки адаптивного поведения клеток палочковидных бактерий на ранних стадиях развития популяции.

4. Впервые выявлена морфофизиологическая кластерная гетерогенность популяций шигелл Флекснера по показателю к ( Ь^Ьд )» характеризующая структурно-адаптивные процессы, в том числе при включении б03 -функции при стрессовых ситуациях на этапе формирования микроколоний. Обнаружена кластерность временной гетерогенности популяций шигелл йлекснера, выражающаяся в полимодальности распределений Ь клеток, отражанцая динамику адаптации. Включение этих механизмов адаптивного поведения происходит с момента инокуляции клеток в среду обитания, при этом наиболее яр, ко и однозначно проявляясь" ' во втором поколении.

5. Впервые обнаружено, что механизмы адаптивного поведения клеток Sh.ilехпег! Б, На ,-ГШ ,'выращиваемых в стационарных микрокамерах, определяются лишь возрастом инокулята и не зависят от* возраста и штаммовой принадлежности фильтратных добавок к питательной среде. Показано, что в одинаковых условиях культивирова ния клетки БЬ. Пегое г! з и й-форм различаются по механизмам адаптивного поведения.

6. Под действием пенициллина при проточном микрокультивировании клетки популяции БИ.Пехпвг! подвергаются аутолизу. Единичные оставшиеся клетки отличоптся по структуре оболочки организации нуклеовда, подвергаются аутолизу лишь после отмывки от пенициллина.

7. Впервые обнаружено, что при проточном микрскультивиропании адаптивно о поведение клеток определяется возрастом иноку;, ята: у 1623

часового адаптивные процессы ускоряются, а у 3-часового- они. ■ замедляются. Основная адаптивная нагрузка при этом приходится на клетки инокулята, поскольку введение в проток питательной среды фильтратных добавок не оказывает существенного влияния на развитие клеток второго поколения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузнецов О.Ю. Информационная характеристика гетерогенности S и R -форм Sh.flexneri //Тез.докл.конф.молодых ученых ИГМИ,

6 мая 1985.-Иваново,1985.-C.I5-I6.

2. Кузнецов О.Ю. Время генерации s и R -форм шигелл при стационарном и проточном шкро^льтивировании//1ез.докл.науч.конф.молодых ученых ИГМИ,20 февраля 1986.-Иваново,1986.-С.51-52.

3. Кузнецов О.Ю. Покоящиеся клетки популяции Sh.flexneri в условиях "мягкого стресса"//Физико-хим,исследования патогенных эн-теробактерий d процессе культивирования.-Иваново,1985.-С.56-61.

4. Кузнецов О.Ю. Камера для проточного культивирования микроорганизмов и клеток тканей.-А.с.№ 133 9123,198?.-Вил.изобр.Р 35,1987

5. Кузнецов О.Ю,, Воекун С.Е., Смирнов С.Г. Гетерогенность клеток шигелл Флекснера в процессе избирательной синхронизации.-МЭИ, 1987,№ 12.-С.20-22.

6. Кузнецов О.Ю. Влияние продуктов жизнедеятельности на поведение клеток шигелл Флекснера//Тездокл.науч.науч.сотр. и молодых ученых ИГМИ,21 октября 1987.-Иваново,1987.-С.16.

7. Кузнецов О.Ю., Воскун С.Е., Смирнов С.Г. Морфофункциональная гетерогенность в период адаптации энтеробактерий к среде обитания/Дез .конф.Биофизика микробных популяций.-АН СССР.Сиб. отде-~ дение,Красноярск.-1987.-С.12.

8. Кузнецов О.Ю. Камера для культивирования микроорганизмов.-А.с.№ 141 4868,.-Балл.изобр.29, 7.08.88,19ЬЗ.

9. Кузнецов О.Ю. Структурно-функциональная организация колонии Sh.flemori Ed //Тр.Всес.семинара НТО РЭС им. Л.С.Попова, Иваново,1938,КГМИ им. A.C.Бубнова.-174с.-Деп.в ВИНИТИ,» 4767-В

Ю.Кузнецов О.О., Смирнов С.Г, Проточное микрокультивиропание как, метод исследования действия антибиотиков на бактерии//Колониза-циончая резистентность и хишюгерапевтические антибактериальные препараты:Тез.докл.Всес.семинара,28-29 июня 1988.-И.,1988,-4.1.-С.56.

11.Кузнецов О.Ю. Микрокультивирование - метод оценки процесса дифференциации клеток при формировании популяции энтеробактерий//. Проблемы современной биологии:Тр.20 науч.конф. мол. ученых биол. фак.}ЯУ,Москва,24-28 апр. 1989/МП/.М. ,-1989,-4.2.-С. 103-107.-Деп.в ВИНИТИ 5.02.90,№ 642-В90. '

12.Кузнецов С.Ю., Смирнов К.К. Некоторые метрологические аспекты морфометрических измерений клеток бактерий//ИГМИ им. А.С.Бубно-ва,Иваново,1990.-20с.-Деп^ в ВИНИТИ № I374-B90.

13.Кузнецов О.Ю., Смирнов С.Г., Миронов A.A. Сравнительное изучение " покоящихся" клеток шгелл с помощью фазовоконтрастной и электронной микроскспии//ИГМИ им. А.С,Бубнова,Иваново,1990,-21с.-Библиограф.22 назв.-Деп.в ВИНИТИ- 26.Об.90,№ 3634-В90.

14.Кузнецов О.Ю., Смирнов К.К., Смирнов С.Г. Оценка информативности формализованных показателей адаптивного поведения клеток Sh.flcxneri на этапе формирования микроколоний//ИГМИ им. A.C. Бубнова,Иваново,1990.-ЛЗс.-Деп.в ВИНИТИ 10.07.90,№ ЗГЙ5-В90.

15.Кузнецов О.Ю., Смирнов С.Г., Голубев O.A. Стационарные и проточные микрокамеры для исследования формирования микроколсяий бак-терий//ИШ[ им. А.С.Зубнова,Иваново,1990.-2Сс.-Библиограф.97 наээ.-Деп.в ЕИНйТИ 10.07.90,ЗН59-В90.