Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Низкотемпературная индукция синтеза стрессовых белков в клетках растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Низкотемпературная индукция синтеза стрессовых белков в клетках растений"

О I РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯНАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

СИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

/

На правах рукописи Корытов Михаил Вениаминович

УДК 501.198:677.112.083

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНАЯ ИНДУКЦИЯ СИНТЕЗА СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ

03.00.1" - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на? соискание ученой степени1, кандидата биологических наук

Иркутск, 1992

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Сибирского института физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, Иркутск

Научный руководитель: доктор биологических наук, R К. Войников-

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

0. а Родченко, -, кандидат биологических наук, А. М. Титенко

Ведущее учреждение: Икстигут цитологии и генетики

СО РАН

• Защита диссертации состоится "10" февраля 1993 г. в 10 час. на заседании специализированного совета rjo защитам кандидатских диссертаций при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по'адресу: 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН

Автореферат-разослан " "декабря 1992 г.

Ученый секретарь s.специализированного совета кандидат биологических наук

П. Акимова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из проблем современного растениеводства является изучение механизмов устойчивости растений к различным природным факторам, среди которых особая роль принадлежит температуре. Это обстоятельство обусловливает ак-. туальность исследований, направленных на познание генетических и Физиологических механизмов, которые определяют толерантность растений к жестким температурным условиям.

В числе физиологических механизмов, обеспечивающих адаптацию живых организмов, в том числе и растений, к неблагоприятным факторам внешней среды, особое место занимает защитная система, известная как "ответ на тепловой шок", обеспечивающая юетг&з группы определенных белков в ответ на резкое изменение температуры окружающей среды.

Этот синтез протекает в ответ не только на гипертермию, но и на многие иные стрессы, в том числе и на гипотермию. Причем большинство работ, посвященных изучению синтеза БТШ И организации соответствующих генов, выполнено не на растительных объектах. Растения в этом отношении изучены значительно хуже»

Учитывая слабую изученность генетико - биохимических ме* ханизмов, контролирующих ответ клеток растений на действие низкой температуры, и важное значение злаков в жизни человека, были выбраны озимая пшеница и кукуруза в качестве объектов изучения индукции синтеза стрессовых белков при гипотермии.

Цель и задачи исследования. | Целью настоящей работы являлось изучение особенностей индукции синтеза стрессовых белков в условиях гипотермии и адаптации растений озимой пшеницы и кукурузы к холоду, а также выяснение роли этих белков в крио- . толерантности растений.

Для достижения этой цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Выяснить возможность низкотемпературной индукции синтеза стрессовых белков (СБ) в клетках суспензионной культуры клеток сои, побегов озимой пшеницы, пшенично-пырейного гибрида и кукурузы.

2. Изучить температурные и временные условия синтеза стрессовых белков растений.

3. Изучить динамику синтеза СБ В отвчт НЧ по нижние тем-

■ ператури, в том числе в процессе адаптации озимой пшеницы к холоду.

4. Определить генетический контроль синтеза СБ при гипотермии на примере генотипов озимой пшеницы и пшенично-пырейно-го гибрида, а также линий и гибридов кукурузы, различающихся по чувствительности к холоду.

5. Выяснить возможность функционирования триггерного механизма индукции синтеза СБ в ответ на факт изменения'температуры и многократное действие холода

6. Изучить роль СБ в холодовой адаптации растений озимой пшеницы.

Научная новизна. В работе изучены феноменология и условия синтеза стрессовых белков под действием гипотермии в клетках различных растений. Исследован их синтез при гипотермии различной длительности, при многократной повторяющейся гипотермии и при адаптации растений к холоду. Установлено, что под действием гипотермии растения озимой пшеницы, ППГ-827, кукурузы и клетки" суспензионной культуры сои синтезируют широкий спектр специфичных стрессовых белков, индивидуальный для каждого исс-ледовэндого генотипа. Этот спектр изменяется в ходе длительного закаливания. За первые сутки гипотермии синтезируется небольшое количество стрессовых полипептидов, число которых затем возрастает 3-х кратно, к концу периода адаптации число стрессовых белков снижается 'и формируется пул белков адаптации, в который входят, в основном, стрессовые полипептиды. Изучено наследование признака "синтез стрессовых белков под действием ' гипотермии" на примере линий и гибридов кукурузы.

Впервые показано, что у клеток растений существуют два типа стрессовых белков: одни появляются в клетках в первые мо' менты стресса, другие обнаруживаются после длительной гипотермии. Установлена связь морозоустойчивости озимой пшеницы с синтезом стрессовых белков. Показано, что повторящееся действие стресса с чередованием периодов "нормальных условий" способствует ускоренному синтезу ряда стрессовых белков. Установлено, что в клетках озимой пшеницы функционирует триггерный механизм активации синтеза стрессовых белков и для "запуска" синтеза ряда стресовых белков важна не длительность стрессового воздействия, а сам факт изменения температуры.

Практическая ценность работы. Настоящая работа направлена

на изучение условий синтеза стрессовых белков под действием гипотермии.и .познание их.биологической роли, в клетках растений. Результаты, полученные при изучении изменений в белкоЕом спектре злаков в ответ на гипотермию, открывают возможность для разработки методов диагностики различных генотипов на хо-лодо- и мороэоусточивость.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, 1 работа находится в печати. Результаты исследований по теме диссертации были доложены на лабораторных и межлабораторных семинарах Сибирского института физиологии и биохимии растений (1986-1991 гг.), 2 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (г. Москва, 1986), на 2 съезде Всесоюзного общества физиологов растений (г.Минск, 4990) и на семинарах лаборатории молекулярной биологии Сассекского университета в Брайтоне (Англия, 1991).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, изложения экспериментального материала и-его обсуждения, заключения, выводов и библиографии, включающей 172 наименования, из них 73 на русском языке; работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 7 таблиц и 16 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали клетки суспензионной культуры сои (Glycine max L.), 3-11 дневные этиолированные проростки озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) морозоустойчивых сортов Альбидум 114 и.Альбидум 24, холодочувствительного сорта Безостая 1 и пшенично-пырейного гибрида ППГ-827.

Кроме того, в эксперимент брали зеленые 15-дневные растения озимых злаков, которые выращивали в сосудах с почвой в камере фитотрона при температуре 24 / 17°С (день/ночь, световой день 12 ч). Одна часть таких растений служила в качестве контроля, другую часть подвергали холодовому закаливанию при 4°С в течение 14 дней (в услоьиях 12 часового светового дня).

Исследовали этиолированные побеги двух линий курузы Сг 25 и Вир 26 (Zea mayz L.) и их ренипрокные гибриды первого поколения <рСг 25 х ¿Вир 26 и дВир 26 хс&г 25. Линия Сг 25 чувстви-

■ тельна, а линия Вир 26 менее чувствительна к

В опытах использовали аминокислоты ^С-лейцин (20 мкКи/мл, удельная радиоактивность 50мКи/ммоль, Реахим, СССР), ^5-метионин (50 мКи/мл, удельная радиоактивность 367 мКи/ммоль, Реахим, СССР).

Колбы с суспензией • клеток сои термостатировали при 27°С (контроль), при 40°С (1 ч) и при 14, 10 и 7°С (24'ч). Трехсуточные проростки кукурузы выдерживали двое-суток при 6°С, про^ ростки пшеницы закаливали в течение 1-11 сут при температуре 3°С.

Прерывистую низкотемпературную обработку проводили по двум схемам. Первая из них состояла, из трехкратного повторения^ охлавдения: (Зое, 16 ч—20°С, 8 ч), т.е. триады повторяли 16-часовую гипотермию, которая, сменялась периодами с "нормальной" температурой. Вторая схема охладения растений предусматривала трехкратное повторение кратковременной гипотермии: (-£? С, 1 ч — 20°С, 2 ч).

Чйсть трехсуточных этиолированных-, проростков пшеницы подергали трехкратному действию теплового шока- (4сРс, 5 мин —• о • С, 20 мин). Метку вводили после каждого цикла нагревания растений. Для этого срезали 20 побегов и помещали их на 20 мин в пробирки с раствором ^S-метионина. Кроме того, проростки пшеницы подвергали тепловому шоку при 40°С в течение 15 мин и 1 часа.

Для оценки холодоустойчивости растения помещай! в кюветы (по 50 растений на кавдую), которые ставили в камеру "Фаэт-' рон",работающую в следующем режиме понижения температуры (градус/час): 5, 3, 1, -1, -2, -3, -4, -5, -6. -7, -8, -9, -10°С. Каждый час отбирали по одной кювете и переносили в камеру с 'температурой 4°С на 24 часа Затем, для отращивания, кюветы переносили в камеру с температурой Через 2 суток опреде-

ляли количество живых и погибших растений.

При экстракцци белков пробы, замороженные жидким азотом, растирали в фарфоровой ступке до порошкобразного состояния и экстрагировали белки в ТРИС-НС1 буфере (0,1 Ы, рН 8,0), содержащем 0,01 М дитиотреитола, 0,01 М ЭДТА и 0,001 U ФШФ (Sigma, США). Полученный гомогенат центрифугировали 20 мин при 20000 е на центрифуге К-24 (ГДР) с целью осаждения грубых клеточных компонентов.- Белок супернатанта использовали для определения

радиоактивности полипептидов и для фракционирования электрофорезом. Перед электрофорезом белки трехкратно- переосавдали ацетоном, в изофокуенроЕке использовали- грубый экстракт.

Определение белка проводили по методу Гринберга и Крэддо-на (1982), основанному на взаимодействии белка с бромфеноловым синим.

Определение радиоактивности белков проводили на бумажных фильтрах, после удаления невключившейся аминокислотной метки с помощью бумажной хроматографии (Остерман, 1983).

Радиоактивность образцов измеряли с помощью жидкостного сцинитилляционного счетчика 1219 RACKBETA (LKB, Швеция), при этом использовали диоксановую сцинтилляциониую жидкость Брея (Вгау, 1060).

Электрофорез проводили в блотах полиакриламидного геля размером 110x100x1 мм в системе Лэмли с некоторыми изменениями (Laemli, 1970). Разделяющий гель содер-тал градиент концентрации от 7,5 до 15 7. полиакрилакида.

Двумерное фракционирование белков с изофокусироваинем в присутствии мочевины в первом направлении и электрофорезом во втором проводили по методу СЧаррела (1975).

Молекулярные массы полипептидов определяли, используя в качестве стандаров набор белков (Pharmacia, Швеция). В этот набор входят: фосфорилаза Б (93 кД), бычий сывороточный альбумин (68 кД), овальбушш (43 кД), карбоангидраза (30 кД), соевый ингибитор трипсина (20,1 кД) и лактоальбумин (14,5 кД).

Выявление на электрофореграмме зон полипептидов, содержащих радиоактивную аминокислоту, проводили флюорсграфически (Остерман, 1933). Для этого гели с импрегнированным ГШО высушивали и экспонировали'с рентгеновской пленкой РМ--Е при -70 С.

Кроликов иммунизировали по схеме, принятой в нашей лаборатории (Марков, Хавкин, 1981). Электрофорез в первом направлении проводили на предметных стеклах б 1% агарозном геле (агароза Б, Реахим, СССР), приготовленном на электродном веро-нал-ацегатном буфере. рН 8,3. Кммуноэлектрофорез во втором направлении веди при градиенте потенциала 8 В/см в течение 4 часов при температ 'уте 4°С, на приборе изготовленном в нашей лаборатории (Марков, Хавкин, 1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Синтез "стрессовых белков" в клетках суспензионной культуры сои при низкой и высокой температуре.

При 27° С наблюдали интенсивное включение радиоактивной метки в белки клеток сои (табл.1). Повышение температуры до 40° С приводило к снижению синтеза белков. Гипотермия (7,'10 и 14° С) также вызывала резкое уменьшение включения меченного С-лейцина в белки. Однако полностью в этих условиях включение радиоактивной метки в белки не прекращалось.

При 27°С (контроль) наблюдали синтез полипептидов с молекулярной массой от 18 до 92 кД, При изменении температуры синтез некоторых из них сохранялся, например синтез полипептида с молекулярной массой 43 кД, а некоторых снижался или прекращался.

Таблица 1

Включение лейцина в белки клеток суспензионной культуры сои при изменении температуры.

Температура,°С Радиоактивность, имп/мин х мкг белка

27 5520 ± 46

40 1320 ± 28

14 426 ± 10

10 360 ± 10

7 ' 70 ± 2

Время включения иетт 24 часа.

1« «4* .4(1* Я*. СИ

„...._ ........................ ... г —2« _

Рис. Г. Флютрограмма полипептидов, полученных из клеток суспензионной культуры сои после гипо- и гипертермии. С правой стороны - молекулярные массы белков-стандартов. Цифры в середине и с леЕОй стороны рисунка - молекулярные массы "стрессовых белков", сверху температура инкубации клеток. Время включения метки: при 27°С - 1 час; при 40°С - I час; при 10 и 14° С - 24 часа.

В то же время под действием разных температур наблюдали синтез "стрессовых белков" (рис.1). Так, повышение температуры в среде инкубации приводило к синтезу белков теплового шока с молекулярными массами 36, 63, 67 и 73 кД (рис. 1). Понижение температуры (с 27 до 14 и 10°С) приводило к существенным изменениям в белковом синтезе клеток суспензионной культура В этих температурных условиях.наблюдали включение радиоактивной метки в целый ряд полипептидов, среди которых были и "стрессовые белки".

2. Синтез стрессовых белков при гипотермии в растениях озимых злаков, различающихся по.морозоустойчивости

Охлаждение 3 дневных этиолированных проросткоЕ озимой пшеницы Альбидум 24 привело к изменениям в спектре белков, выявляемых при двумерном электрофорезе (рис.2) В высокомолекулярной части спектра обнаруживается стрессовый белок 150 кД

(р1 6,3), в средней части спектра - белки 67 кД (р1 9,7), 55 кД (р! К.З и 8,0), 48 кД (р1 8,2) и 40 кД (р1 9,2). В низкомолекулярной части спектра находится множество стрессовых белков с молекулярными массами от 14 до кД. _ _

: !* ' 4«,. V" 7, Ж • ?

67

Т2 / ^ - -*-»■• ° 1$

ЗО

/4 • •• / I •

К'^ч, в> - - /7 - V-« ^

У \ \ 4 Г{ ' ■ Г

к . Б

Рис. 2. Флюорсграмма двумерного электрофореза белков, синтезирующихся в побегах озимой пшеницы Альбидум 24 в контроле (А) .и после гипотермии (Б). А - контроль (27°С, 3 дня); В - 3° С, 3 дня.

Наиболее ярко на препаратах выявляются следующие стрессовые Оелки: 18 кД (р! 3,2), 20 кД (р1 3,2), семейство белков с молекулярной массой 27 кД (р1 5,7, 6,5, 6,8 и 7,8). Всего в препаратах Альбидум 24 выявлено 22 стрессовых, белка, из которых синтез 20 индуцировался холодом, а два белка, обозначенные на рис. 2 как Ю и 21, синтезировались конститутивно и в следовых количествах их можно обнаружить на белковых препаратах, полученных из неохлажденных растений.

Охлаждение проростков пшеницы сорта Безостая 1 также приводило к образованию стрессовых белков (рис.3). Общее число стрессовых белков, обнаруженных у Безостой 1 после действия холода, составляет_ не 22, как у Альбидум 24, а 17 полипептидов, 4 которых являются характерными для пшеницы Безостая 1: 30 кД (р1 5,0), 32 кД (р1 6,5), 33 кД (р1 6,8 и 7,0). В тоже время в белковых препаратах пшеницы Безостая 1 отсутствует ряд стрессовых белков, обнаруженных ранее у Альбидум 24. Это белки обозначенные цифрами 1,6-9,20.

Ю-

•4

-.г

Рис.3. Флюорограмма двумерного электр^ореза белков пше-«ицы Безостая 1 синтезирующихся при 27°С (А) и при гипотершй 3°С (Б).

Специфичными для морозоустойчивой озимой пшеницы являются следующие стрессовые белки: 14 кД (р1 3,6), 20 кД СрГ 3,2)» &зтййТВо белков 27 кД (р! 6,5, 6,8 п 7,8 кД).

3. Синтез стрессовых белков в проростках морозоустойчивой озимой пшеницы при гипотермии и закаливании к холоду

Перед ' изучением влияния гипотермии на белковые спектры было проведено сравнение физиологического возраста проростков при 27°С и 3°С. Сравнивали рост побегов и их массу. Оказалось, что по длине и массе 3 дневным проросткам охлаждавшимся при 3° С в течение первых двух дней, соответствуют 3 дневные, а охлаждавшимся 11 дней - 4 дневные растения, выращенные при 27°С. Следовательно, за одни сутки при 27°С в проростках происходят физиологические изменения, соотьетствуюшие тем, Которые при 3° С происходят за 11 дней. Этот факт следует учитывать при дальнейшем анализе полученных результатов.

Уне в течение первых суток гипотермии можно наблюдать синтез стрессовых белков. В высокомолекулярной части спектра обнаруживается белок с молекулярной массой 150 кД (рI 6,1), в в средней части спектра - Оелок 55 кД-(р1 6,3). -В низкомолеку-

■ лярной области спектра находятся еще несколько полипептидов: 32 кД (Р1 6.3), 30 кд (р1 4,6), 18 и 20 КД (р1 3,2 и 15 кД (р1 5,3).

Через 2-3 суток гипотермии наблюдается включение метки в новые стрессовые белки, которые отсутствовали ранее: 14 кД (р1 3,6), 15 кД СР1 4.0), 15 кД (р1 4,2), 27 кД СРI 7,8). 28 кд (рI б,5), 28 кД СРГ 6,7). 29 кД (р1 9,4), 34 кД (р1 9,5), 36 КД (р1 8,3), 40 кД (р1 9,2), 48 кД (р! 8,1), 54 кД (р1 7,9), 67 кД СрI 9,7). Как еидно, в основном это ниакомолеку-лярные белки, которые можно разбить на несколько групп: 14-20 КД (р1 3,2-5,3), 27-32 кД (р.Г 4,6-9,4) ,43-55 кД (р1 7,9-9,5). Следовательно, в течение первых трех дней гипотермии увеличение длительности холодового воздействия приводит к увеличению числа вновь синтезируемых белков (табл.2-).

В ходе закаливания (4-11 дней при 3е*?) происходят изменения в синтезе меченных полипептидов. В этот период продолжается синтез части стрессовых белков. Преэде всего это низкомолекулярные 'белки 14-32 кД, белки массой 55 и 67 кД и высокомолекулярный белок 150 кД. Эти стрессовые белки синтезировались в клетках озимой пшеницы Альбидум 24 как при низкотемпературном стрессе (1-3 суток, 3°С), так и в течение всего периода закаливания (4-И суток, 3°С), т.е. синтез этих белков индуцировался холодом и продолжался в течение всего эксперимента (табл.2). Синтез некоторых других стрессовых белков прекращался во время закаливания растений к холоду. Например, стрессовые белки 29 кД (р1 9,4). 36 кД (р1 8.3). 48 кД (р1 8.1). 54 кД (р1 7,9) прекращали синтезироваться на четвертый день гипотермии, белки 34" кД (р1 9,5), 40 кД (р1 9,2) на седьмой день. С другой стороны, на четвертый день гипотермии были обнаружены 'некоторые новые белки, 41 кД (р1 8,4), 49 кД (р1 8,6), 60 кД (р1 8,8), которые при дальнейшем закаливании исчезали и которые, вероятно, можно отнести к группе стрессовых белков. Кроме того, во время закаливания (гипотермия 7-11 суток) появляются новые иолипептиды, обозначенные в табл. 2 как 12, 13, 22, 25. Однако синтез этих белков, вероятно, не следует связывать с закаливанием, т. к. они обнанаруживаются у неохлажденных проростков сходного физиологического возраста'(4 суточные проростки выращенные при температуре 27°С). Особый интерес представляют белки обозначенные в таблице 2 как 4, 11, 21 и 24. Они

Таблица 2

Анализ радиоактивномеченых стрессовых белков в побегах озимой пшеницы Альбидум 24 при выращивании проростков в условиях гипотермии

Обозначение U, кД pl / Условия выращивания *

белка

А Б В Г л Е Ж э

1 14 3,6 + + + + +

2 15 4,0 - + + + + + -

3 15 4,2 - + + + + + -

4 15 5,3 - + + + + + . + +

5 18 3,2 + + + + + + -

6 20 3.2 + t- + + + + -

7 27 7.8 - + + - - - -

8 28 6.7 - + + + + + -

9 29 9.4 - + + - - - -

10 30 4.6 - + + + + + -

И 32 6.3 + + + + + + +

12-1 33 6.8 - - - - - + -

12-2 33 6,4 +

13-1 33 7,5 + -

13-2 33 6.4 - - - - - +

14 34 9.5 - + + + - - -

15 36 ' 8,3 - + + - - - -

16 40 - 9.2 - + + + - - -

17 41 8,4 _ - - + - - -

18 48 8.1 - + + - - - -

19 49 8.6 - - - + - - -

20 54 7.9 - + - - - -

21 55 6.3 - + + + + + + +

22 55 8.9 - - - - + - +

23 60 8.8 • - - - + - • - +

24 67 9,7 - + + + + - +

25 67 8.2 - - - - + - +

26 150 ' 6.1 + + + + + + -

27 28 6,5 - - + + + + -

28 17 4.1 - - - - - + + -

* - А - 3 дня, 279с, контроль „

Б - 3 дня, 27?С -t 1 день, 3°С

В - 3 дня, 27? С + 2 дня, &С

Г - 3 дня, 27°С + 3 дня, 3°С

Д - 3 дня, 27?С + 4 ДНЯ. 3°С

Е - 3 дня, 27° С + 7 дней, 3°С

Я - 3 дня, 27?С + И дней, 3°С

3 - 4 дня, 27°С

" + " - присутствие белка

" - " - отсутствие белка

отсутствует в белковом спектре 3 .дневных проростков и появляются только в 4 дневных растениях, выращенных при 27°С. Следовательно, эти белки связаны с ростом и развитием проростков с третьего на четвертый день при 27°С. Однако, при гипотермии в белковом спектре 3 дневных растений эти полипептиды также были обнаружены среди других стрессовых белков. Следовательно, данные белки являются одновременно и "белками развития", и стрессовыми белками. Причем их синтез активизируется сразу с началом действия низкой температуры. Вероятно, при гипотермии, как и на определенном этапе развития побегов при нормальной температуре включается экспрессия некоторых ■"обида" генов.

Таким образом, закаливание проростков озимой пшеницы к холоду приводит к существенным изменениям в спектре растворимых белков. Б значительной степени зт;; .;;з;.;с::сг,;:п скззаны с синтезом новых полипептидов, спектр которых изменяется в ходе закаливания. Сначала (в течение первых суток гипотермии) синтезируется небольшое число белков. Через 2-3 суток гипотермии число этих белков увеличивается почти в три раза. Их, вероятно, можно назвать стрессовыми белками. При даяьнейвем закаливании проростков к холоду число стрессовых полипептидов сокращается и оставшиеся к 7-11 суткам гипотермии формируют основной пул белков адаптации.

4. Синтез белков холодового шока в проростках линий и гибридов кукурузы

При изучении реакции на гипотермию номов клеток двух линий кукурузы Сг 25 и Вир 2Ь и их реципрокных гибридов первого поколения установлен индуцируемый холодом синтез стрессовых белков. Спектры стрессовых белков линий Сг 25 и &ф 26 в основном совпадают, но есть и различия. Они -связаны с конститутивным синтезом белков 33.кД (р!«3,8), 60 кД Ср1 5,0), 94 (р! 4,0-4,8) в клетках линии Вир 26 и с низкотемпературной индукцией синтеза этих белков у линии Сг 25, а также с отсутствием у линии Вир 26 стрессового белка 43 кД {р1 9,0) и белков 92 кД (р1 4,2) и 92 кД 1р1 4,5), обнаруженных у линии Сг 25 . Обнаруженный у растений Вир 26 конститутивный синтез стрессового белка 33 кД наследуется по материнской линии. Предполагается, что отмеченные различия в синтезе стрессовых белков могут быть

связаны с разной холодочувствительностью исследованных линий кукурузы. Показан ядерный контроль большинства стрессовых белков, по которым обнаружены различия между линиями Сг 25 и Вир 26. Белки 92 кД линии Сг 25 наследуются по материнской линии.

5. Триггерный механизм индукции синтеза стрессовых белков.

5.1. Триггерный механизм синтеза стрессовых белков при гипотермии.

Вероятно, часть стрессовых белков может синтезироваться в самые первые моменты охлаждения растений. Проверка этого пред-положеия с помощью двухмерного электрофореза и флюорографии дала положительные результаты. Действительно, уже после 16 ч гипотермии (после первого цикла охлаждения, 3°С, 16 ч—20 й С, 8 ч) синтезируется ряд стрессовых белков. Наиболее хорошо видны следующие белки: 32 кД (р1 6,3), 33 кД (р1 6,8), 55 кД (р1 6,3) и 150 кД (р1 6,1). Кроме того, после первого цикла охлаждения в побегах озимой пшеницы можно обнаружить белки с молекулярной массой 15-кД Ср1 5,3), 18 кД (р1 3,2) и 20 кД (р1 3,2) и 150 кД (р1 6,1).

Повторные действия гипотермии (второй и третий циклы охлаждения) привели к увеличению содержания некоторых стрессовых белков, о чем можно судить по увеличению размеров радиоактив-, ных белковых пятен. Это утверждение представляется справедливым по крайней мере для трех белков с молекулярными массами 15, 32 и 33 кД. Площадь пятен этих белков резко увеличивается во втором и третьем циклах охлаждения и значительно превосходит размеры соответствуют;« пятен, полученных после 4 суточной ' непрерывной гипотермии. Эти результаты наводят на предположение о том, что для индукции синтеза стрессовых белков, является важным не столько длительность охлаждения, сколько сам факт начала действия низкой температуры. Это предположение было проверено в экспериментах с тремя циклами охлаждения с более низкой температурой и очень коротким периодом действия холода в каждом цикле (вторая схема). Оказалось, что уже после первого цикла кратковременной гипотермии происходит синтез стрессовых белков. Причем повторяющееся кратковременное охлаждение (-2°С, 1 ч—-20°С, 2 ч) приводит к увеличению количества

- 15 -

стрессовых utfJiKOb, ио этом можно утверждать по увеличению размеров пятен радиоактивных полипептидов. Это хорошо видно на примере высокомолекулярного белка 150 кД. Его количество в препаратах, полученных после трех часов гипотермии с тремя моментами начала действия холода, вероятно, не ниже, чем в препаратах, полученных после 4 сут. непрерывной гипотермии. Следовательно, в клетках растений, вероятно, функционирует триггерный механизм индуции синтеза стрессовых белков и для увеличения интенсивности синтеза стрессовых белков при гипотермии важно многократное начало действия холода.

В результате трехкратного действия холода, (по 16 часов), холодоустойчивость проростков повысилась на 2 град. , по сравнению с контрольными, неохлаждавшимися растениями. В это же время в клетках побегов происходит синтез стрессовых белков с высокой индукцией синтеза. Поэтому можно предполагать, что эти стрессовые белки, вероятно, принимают участие в повышении морозоустойчивости проростков. Заметим, что криоустойчивость проростков после непрерывного действия гипотермии в течение 4 суток была выше, чем после трехкратного, по 16 часов, охлаждения. Кроме того, продолжительная непрерывная гипотермия приводит к синтезу дополнительного пула стрессовых белков, которые являются, вероятно, белками с низкой индукцией синтеза. Полученные результаты позволяют предполагать, что вклад в морозоустойчивость проростков озимой пшеницы вносят стрессовые белки как с высокой, так.и с низкой индукцией синтеза.

5.2. Триггерный- механизм индукции синтеза стрессовых белков при гипертермии

Стрессовые белки с высокой индукцией синтеза 'были обнаружены не только при гипотермии, но и в условиях теплового шока. Тепловой шок (40°С, i ч) индуцирует синтез большого числа белков теплового шока (БТШ). Причем часть из них можно обнаружить после первого цикла кратковременного прогревания растений в течение 5 мин при 40°С. После третьего цикла прогревания (40°С, 5 мин-* 20°С, 20 мин) х 3, число и количество, судя по размерам радиоактивных пятен, БТШ возрастает. Формируется, фактически, полный спектр БТШ, сходный с тем, который образуются после 1 часовой гипертермии, хотя суммарное время действия

высокой температуры составляло всего 15 мин. Спектр БТШ после 15 минутной непрерывной гипертермии выражен ко так ярко, гсак после третьего цикла прогревания. Как и в случае с гипотермией, прерывистое многократное прогревание растений приводит к эффективной индукции синтеза стрессовых белков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы было установлено, чти темпера-

туры приводит к существенным изменениям в белковом синтезе клеток растений. В частности, при гипотермиии наблюдается синтез стрессовых белков. Причем спектр этих белков очень широк: от низкомолекулярных (14 кД) до высокомолекулярных (150 кд) белков. Поскольку эти результаты были получены в экспериментах с меченными аминокислотами, возможно предположение об измене-нии экспресии ряда генов при гипотермии.

В исследовании были использованы генотипы озимой пшеницы различающиеся по морозоустойчивости, пшенично-пырейный гибрид, а также линии и гибриды кукурузы с разным уровнем холодоустойчивости. Анализ реакции этих растений на действие низкой температуры позволил выявить генотипы с разным уровнем криоус-тойчивости, различающихся.по спектрам стрессовых белков, синтез которых индуцировался холодом. В частности установлено, что специфичными для морозустойчивой озимой пшеницы являйся стрессовые белки 14 кД (р1 3,6), 20 кД (р1 3,2) и семейство белков 27 кД (р1 6,5-7,8). В_ответ на гипотермию две различающиеся по чувствительности к холоду линии кукурузы Сг 25 и Вир 26 и их реципрокные гибриды синтезируют белки холодового шока. Спектры этих белков в основном совпадают, но есть и различия. Часть из .этих белков в клетках побегов холодоустойчивой линии Вир 26 синтезируется конститутивно.

Обнаруженный у растений Вир ■ 26 конститутивный синтез стрессового белка 33 КД наследуется по материнской линии. Материнский эффект обнаружен также в наследовании синтеза при нормальной температуре двух белков 92 кД (р1 4,2 и 4,5) линии Сг 25.

Таким образом, нам удалось установить особенности в спектрах стрессовых белков (СБ) у различающихся по морозо- и холодоустойчивости генотипов озимой пшеницы, а также линий и

_

гибридов кукурузы. Более того выявлены СБ, специфичные для хо-лодо- и морозоустойчивых растений. ;

В то же время было необходимо выяснить: когда изменения в синтезе белков связаны с адаптацией к низкой температуре, а когда с ростом растений, какова динамика синтеза СБ в ответ на понижение температры, в том числе в процессе адаптации озимой пшеницы к холоду. В значительной степени эти изменения связаны с синтезом новых полипептидов, спектр которых изменяется в ходе закаливания. Сначала (в течение первых суток гипотермии) синтезируется небольшое число белков. Через 2-3 суток гипотермии число этих белков увеличивается почти в три раза. Их, вероятно, можно назвать стрессовыми белками. При дальнейшем закаливании проростков к холоду число стрессовых полипептидов сокращается и оставшиеся к 7-11 суткам гипотермии формируют основной пул белков адаптации.

Оказалось, что очень кратковременный тепловой (5 мин, 40° С) или холодовой (1 час, -2° С) шок индуцирует синтез ряда стрессовых белков. Причем повторяющееся действие гипер- или гипотермии приводит к увеличению числа и количества СБ. Вероятно, здесь сталкиваемся с триггерным механизмом индукции синтеза стрессовых белков, когда важное значение имеет сам факт резкого изменения температуры, а не ее продолжительность. В результате образуются стрессовые белки, которые можно назвать стрессовыми белками с высокой индукцией синтеза. Одновременно с синтезом этих белков после нескольких кратковременных циклов охлаждения увеличивается морозоустойчивость озимой пшеницы. В формировании этого уровня морозоустойчивости принимают участие следующие стрессовые белки с высокой индукцией синтеза: 15 кД (р1 5,3), 18-20 КД (р1 3.2), 32 кД (р1 6,3), 33 кД (р1 6,4-6,8), 55 кД (р! 6.3), 150 кД (р1 6,1). Однако, в этом случае уровень морозоустойчивости остается ниже, чем после непрерывного закаливания. Следует заметить, что индукция синтеза других СБ ниже (белки с низкой индукцией синтеза). Эти белки можно обнаружить в заметных количествах только после длительной (несколько суток) гипотермии, в результате которой повышается и морозоустойчивость растений.

Итак, ми имеем дело с двумя типами стрессовых белков в клетках растений: одни появляются в клетке в первые моменты стресса, другие - обнаруживаются только после длительного неп-

рерывнсго стресса. Можно предположить, что существуют', по крайней мере, две системы индукции синтеза стрессовых белгав, связанные с выполнением стрессовыми белками разных функций в клетке. Первая из них осуществляется в рамках чувствительной системы, Которая активизируется при слабых и кратковременных стрессах и направлена на стабилизацию структур и предохраняет их от повреждения (Welch, Sahan, 1985). Вторая - мотет быть связана с восстановлением "нормального" метаболизма. Вероятность наличия двух этих функций у стрессовых белков (на примере- БТШ) обсуждалась и ранее (Блехман, Шеламова, 1992; Nover, 1987; Yost, Lindquist, 1986), более того, поднимался вопрос о возможности существования раздельных систем регуляции этих двух функций (Дианова, Салганик, 1989). Можно предполагать, что "чувствительная" система реагирует индукцией синтеза-стрессовых белков в самые первые моменты действия стресса. В пользу этого предположения говорит тот факт, что принципиальным для образования ряда.стрессовых белков (белки с высокой! индукцией синтеза) является именно изменение температуры, а не продолжительность действия стресса. На примере ВТШ полагают, что регуляция синтеза стрессовых белков'осуществляется за счет изменения конформации- неактирной формы фактора транскрипции и перехода ef-o в активную форму (Bienz, 1985). В этом случае экспрессия генов ВТШ начинается■быстро. Видимо, можно предположить, что подобный механизм работает в клетках растений и'в-первые периоды времени действия стресса.

Вторая система ("восстановительная") включается, вероятно, после продолжительного действия стресса.

ВЫВОДЫ.

1. Показана возможность' низкотемпературной индукции синтеза стрессовых белков в клетках суспензионной культуры сои, а также в побегах озимой.пшеницы, пшенично-пырейного гибрида и кукурузы. Изучены температурные и временные характеристики экспрессии соответствующих генов при гипотермии, определена генетическая специфика и наследование холодовых стрессовых бед-ков кукурузы.

2. Закаливание проростков озимой пшеницы к холоду приводит к изменениям в белковых спектрах. Эти изменения связаны с

синтезом новых стрессовых белков, число и количество которых изменяется в ходе закаливания. В клетках морозоустойчивой озимой пшеницы в течение первых суток адаптации к холоду синтезируется семь стрессовых белков, через 2-3 суток гипотермии число этих белков увеличивается почти в 3 раза, а затем сокращается. К 7-11 суткам гипотермии оставшиеся в спектре белки формируют пул "белков адаптации", в который входят только стрессовые белки (14, 15, 17, 18-20, 28, 30, 32, 55 и 150 КД).

3. Озимые злаки, различающиеся по морозоустойчивости, имеют различия в спектрах стрессовых белков, синтез которых индуцируется гипотермией. После трехсуточной гипотермии специфичными для морозоустойчивой озимой пшеницы являются стрессовые белки 14 кД (р1 3,6), 20 кД (р1 3,2)и семейство белков 27 КД (Р1 6,5-7,8).

4. При гипотермии спектры стрессовых белков у линий кукурузы Сг 25 и Вир 26 различающихся по холодоустойчивости, в основном совпадают, но есть и различия. В побегах Вир 26 обнаружен конститутивный синтез стрессовых белков с молекулярной массой 33, 80 и 94 кД, первый из которых наследуется по материнской линии. Остальные стрессовые белки, по которым обнаружены различия между линиями Сг 25 и Вир 26, находятся под контролем ядерных генов.

5. В клетках озимой пшеницы функционирует триггерный механизм индукции синтеза стрессовых белков при изменении температуры. Важное значение для индукции синтеза этих белков, вероятно, имеет сам • факт изменения температуры, а не продолжительность ее действия.

6. Выявлены стрессовые белки с высокой и низкой индукцией синтеза Белки с высокой индукцией синтеза можно обнаружить уже в самые первые моменты температурного стресса: через 1 час при -2°С и через 5 минут при 40°С. Еелки с низкой индукцией синтеза, обнаруживаются только после длительного стресса.

7. Изучен вклад стрессовых белков в уровень морозоустойчивости озимой пшеницы. Установлено, что в формировании крио-резистентности озимой пшеницы при закаливании к холоду, принимают участие стрессовые белки как с высокой, так и с низкой индукцией синтеза. Среди белков с высокой индукцией синтеза Преобладают следующие: 32 кД (р! 6,3), 33 кД (р1 5,8), 55 кД (р! 6,3) и 150 кД (р1 6,1).

Основные публикациям по теме диссертации

1. Безносов М.Е, Козаренко Т.Д., Труфанов Е А. , Корытов М. В. Электрофорез белков в цилиндрическом блоке полиакриламид-ного геля // Электрофоретичекие методы анализа белков. - Новосибирск; Наука, 1981. - С. 114-117.

2. Илли И. Э. , Корытов м! Е , Безносов М. а , Козаренко Т. Д. Изучение глобулиновых белков зерновки пшеницы на ранних этапах прорастания // Физиология и биохимия культ, растений. - 1985. - Т. 17, N 1. - С. 70-75.

3. Корытов М. Е , Калачева Е. А. Прибор для электрофорети-ческого окрашивания и обесцвечивания плоских полиакриламидных гелей // Лабораторное дело. - 1986. - N 4. - С. 231-232.

4. Войников Е К , Корытов М. Е , Калачева Е. А. Синтез Сел-ков озимой пшеницы при гипотермии // Опер, информ. материалы СИФИБР СО АН СССР. - Иркутск, - 1985. - С. 22-24.

5. Войников Е К , Корытов М. Е , Калачева Е. А. Влияние гипотермии на синтез белков в клетках пырея, пшеницы и пшенично-пырейного амфидиплоида. - Там же. - С. 24-27.

6. Войников Е К. , Иванова Г. Г., Корытов М. Е Синтез иел-ков в растениях при гипотермии // Физиология и биохимия культ, растений. - 1986. -Т. 18, N 3. - С. 211-222.

7. Корытов М. Е , Рудиковский А. Е , Калачева Е. А. Белки теплового шока клеток суспензионной культуры кукурузы // Тезисы докладов 2 Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительных клеток. - Москва, 1986. - С. 12.

. 8. Войников Е К. , Корытов М. Е , Калачева Е. А., Саляев Р. К Синтез стрессовых белков в клетках суспензионной культуры сои при низкой температуре // Докл. АН СССР. - 1987. -Т. 295, N 1. - С. 255-256.

9. Войников Е К. , Корытов Ы. Е , Калачева Е. А. Низкотемпературная индукция синтеза стрессовых белков растений // Физиология растений. - 1989. - Т. 36, N 1. - С. 107-111.

10. Войников Е К., Корытов М. Е , Рудиковский А. Е Экспрессия генома рас1_ний при температурном стрессе // Тезисы докладов 2 съезда Всесоюз. общества физиологов растений. -Минск. 1990. - С. 20.

11. Войников В К , Корытов ПК Синтез стрессовых белков в клетках растений при низкой температуре. - Там же. - С. 20.

12. Войников В. К. , Корытов М. В. Синтез стрессовых белков в проростках различающихся по морозоустойчивости сортов озимой пшеницы при гипотермии // физиология и биохимия культ, растений. - 1991. - Т. 23, N 3. - С. 263-267.

13. Войников Е К. , Корытов М. В. Синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы при закаливании к холоду // Физиология растений. - 1991. -Т. 38, N 5. - С. 960-969.

14. Войников а К , Корытов М. В. Низкотемпературная индукция синтеза белков холодового шока проростков линий и гибридов кукурузы// Цитология и генетика. - 1991. - Т. 25, N 6. -С. 64-69.

15. Войников В. К.., ' Корытов М. В. Влияние условий гипо- и гипертермии на синтез стрессовых белков в проростках озимой пшеницы // Физиология растений. - в печати.

/

Подписано в печать ,3.12.92. Формат 60X84 1/16.

Бумага типографская. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,2.. Уч.-изд. а. 1,25. Тираж 100 эи. Заказ 74.

Иркутский политехнической институт 664074, Иркутск, ул. Лермонтова, 83