Влияние алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцененные с использованием люминесцирующих тест-систем

Грязева, Ирина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцененные с использованием люминесцирующих тест-систем
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцененные с использованием люминесцирующих тест-систем"

005537824 На правах рукописи

Грязева Ирина Владнмировна

ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА СТРЕССОВЫЕ РЕАКЦИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК, ОЦЕНЕННЫЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЛЮМИНЕСЦИРУЮЩИХ ТЕСТ-СИСТЕМ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 4 НОЯ 2СІЗ

Саратов-2013

005537824

Работа выполнена на кафедре микробиологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Дерябин Дмитрий Геннадьевич

Официальные оппоненты: Шелудько Андрей Вячеславович,

доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, лаборатория генетики микроорганизмов, ведущий научный сотрудник

Черкасов Сергей Викторович,

доктор медицинских наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт клеточного и внутриклеточного

симбиоза УрО РАН,

директор

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, г. Пермь

Защита диссертации состоится «4» декабря 2013 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г.Саратов, просп. Энтузиастов, 13). Тел. / факс: (8452) 97-03-83.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки РФ и на сайте ИБФРМ РАН: http://ibppm.ru/dissertacionnw-sovet/

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореф ерат разослан «1» н оября 2013 г.

И.о. Ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук Л у^йк-- Л.П. Антонюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Существование бактерий в природных экосистемах сопряжено с запрограммированными и незапрограммированными в цикле их развития стрессами, обусловленными воздействием целого ряда физических, химических и биологических факторов (Баснакьян, 2003). Эти ситуации предопределили возникновение у бактерий разнообразных «активных» и «пассивных» механизмов стрессоустойчивости, обеспечивающих сохранение жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях среды обитания (Ткаченко 2012).

Важную роль в устойчивости бактерий к стрессорным факторам играют индуцибельные защитные системы, относительно специфично «запускающиеся» в ответ на определенные воздействия и приводящие к активации транскрипции адекватных природе и интенсивности воздействующего фактора групп генов -регулонов, с образованием соответствующих защитных продуктов (Schumann, 2006). В частности, значимой системой, противодействующей воздействию температурного фактора, являются белки теплового шока (БТШ), представленные молекулярными шаперонами и шаперонинами, удерживающими белки от денатурации, а также способствующими восстановлению их структуры в процессе рефолдинга (Smith, 2013). Аналогичным образом устроены система сохранения бактериального генома (SO-S-система), активируемая при повреждении ДНК и включающая широкий спектр ферментов ее репарации (Janion, 20Q8), а также поликомпонентная система защиты бактерий от воздействия активных форм кислорода (Chiang, Schellhorn, 2012).

Другой аспект устойчивости бактерий к стрессам связан с реализацией биологической активности видонеспецифичных низкомолекулярных ауторегуляторов, в отечественной литературе традиционно обозначаемых как алкилоксибензолы (АОБ) (Эль-Регистан и др., 2006), а в англоязычной - как резорцинольные липиды или алкилрезорцины (Stasiuk, Kozubek, 2010). Совокупность ранее проведенных исследований позволила оценить алкилоксибензолы как важные бактериальные адаптогены, биосинтез которых активизируется стрессорными воздействиями (El-Registan et al., 2005). В свою очередь спектр биологической активности АОБ включает стабилизацию широкого круга биополимеров, включающего белки (Коротина, Крупянский, 2008) и нуклеиновые кислоты (Давыдова и др., 2005), а также реализацию присущей им антиоксидантной активности (Николаев, 2011).0дновременно накапливающиеся данные свидетельствуют о потенциальном участии АОБ в регуляции экспрессии стрессовых регулонов, что может рассматриваться в качестве дополнительного механизма популяционного контроля развития стрессового ответа (Miche et al 2003; Голод и др., 2009).

Однако, до настоящего времени целостная картина взаимоотношений между названными активными и пассивными механизмами антистрессовой защиты бактериальной клетки с участием алкилоксибензолов отсутствует. При этом важным условием для решения этой задачи представляется использование высокочувствительных репортерных бактериальных тест-систем, в частности на основе развития бактериального свечения (биолюминесценции), позволяющих в режиме реального времени оценивать экспрессию стрессовых генов

Цель работы - изучить влияния алкилоксибензолов (химических аналогов ауторегуляторных факторов микроорганизмов) на стрессовый ответ бактериальных клеток при различных экстремальных воздействиях, оцененный с использованием специфически индуцируемых люминесцирующих тест-систем.

Задачи исследования:

1. Определить влияние алкилоксибензолов на процессы термоденатурации и шаперон-независимого рефолдинга ферментных белков, а также индуцируемый воздействием температурного фактора синтез белков теплового шока.

2. Изучить воздействие алкилоксибензолов на чувствительность ДНК к УФ-облученшо, а также индуцируемый повреждением ДНК 505-ответ бактериальных клеток при подобном воздействии.

3. Оценить соответствие между прямой антирадикалыюй активностью алкилоксибензолов и их влиянием на индукцию лохЯ регулона в условиях окислительного стресса.

Научная новизна

Впервые проведено сравнение двух механизмов биологической активности алкилоксибензолов (АОБ), определяемых непосредственным участием в стабилизации биополимеров при воздействии физических (температура, УФ-излучение) и химических (окисление) факторов, а также их опосредованным влиянием на уровень экспрессии соответствующих стрессовых регулонов.

Установлены эффекты АОБ на чувствительность белков к денатурирующему температурному воздействию, выраженность и направленность которых определяются длиной алкильного радикала в их молекулах. Показана протекторная активность короткоцепочечных (СГС3) АОБ, заключающаяся в защите ферментных белков от термоденатурацни, частичном повышении эффективности шаперон-независимого рефолдинга, а также сохранении жизнеспособности бактерий при относительно низких уровнях индукции БТШ. С другой стороны, эффект длинноцепочечных (С5-С12) АОБ зависел от их действующих концентраций: в диапазоне Ю^-Ю^М они проявляли термопротекторную активность на фоне умеренно выраженной индукции БТШ, в то время как в диапазоне Ю^-Ю^М вели к значительному повышению термочувствительности ферментных белков и бактерий с одновременной репрессией синтеза БТШ.

Получены новые данные о прямых фотопротекторных эффектах АОБ при УФ-облучении, заключающихся в предупреждении одно- и двуцепочечных разрывов молекул ДНК. В условиях интенсивного (сублеталыюго) УФ-облучения АОБ в большинстве случаев снижали относительную активность 505"-ответа, тем не менее, повышая выживаемость бактерий при подобном воздействии с одновременным увеличением частоты диссоциативных Б—>11 переходов.

Установлена прямая антирадикальная активность длинноцепочечных гомологов АОБ, функционирующих в качестве «перехватчиков» супероксид-аниона. В свою очередь в клеточной тест-системе эффекты АОБ заключались в умеренно выраженной индукции лохБ регулона, увеличивающейся при использовании их предварительно окисленных продуктов. Следствием этих процессов является предадаптация к окислительному стрессу, проявляющаяся в

увеличении относительного количества выживших клеток при более низких уровнях индукции «иЗ регулона.

Совокупность полученных результатов впервые позволила оценить универсальность действия АОБ в условиях стрессоров различной природы, заключающуюся в концентрационно-зависимой индукции/ингибировании стрессовых регулопов. При этом низкие концентрации АОБ наиболее типично индуцируют стрессовый ответ бактериальных клеток, что характеризует их как «алармоны» (сигналы тревоги), предадаптирующие бактериальные клетки к последующему воздействию экстремальных физических и химических факторов. В свою очередь высокие концентрации АОБ преимущественно ведут к репрессии стрессового ответа, тем не менее, сохраняя жизнеспособность бактериальных клеток за счет непосредственной стабилизации входящих в них биополимеров.

Теоретическая и практическая значимость

Выявление молекулярных механизмов регуляции стрессового ответа бактериальных клеток, в том числе реализуемых с участием образуемых и воспринимаемых ими ауторегуляторов - алкилоксибензолов, представляет значительный интерес для микробиологии, биотехнологии и биомедицины.

Полученные результаты, свидетельствующие о влиянии АОБ на процессы позитивной и негативной регуляции стрессовых регулонов с последующим формированием устойчивости к экстремальным воздействиям, потенциально могут быть использованы в качестве основы для разработки новых подходов к длительному сохранению микроорганизмов в биотехнологических системах, а также в составе лечебно-профилактических препаратов.

Обнаруженные прямые термо-, фотопротекторные и антиоксидантные эффекты АОБ определяют перспективу их использования в качестве стабилизаторов функциональных биополимеров на этапах выделения и длительного хранения. В частности, выявленный в рамках настоящей работы выраженный фотопротекторный эффект С6-АОБ положен в основу «Способа защиты ДНК от ультрафиолетового излучения при детекции результатов гель-электрофореза» (патент РФ на изобретение № 2465576 от 27.10.2012 г.), ориентированного на защиту структурной целостности и функциональной активности данного биополимера при УФ-детекции в агарозных гелях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Алкилоксибензолы изменяют чувствительность бактериальных клеток к температурному воздействию через сочетанное влияние на термочувствительность входящих в их структуру белков, а также модуляцию уровня экспрессии белков теплового шока. Короткоцепочечные гомологи АОБ проявляют себя как термопротекторы, защищающие белки от денатурации, повышающие эффективность их рефолдинга, а также сохраняющие жизнеспособность бактериальных клеток при низких уровнях индукции белков теплового шока.

2. Алкилоксибензолы (преимущественно их длинноцепочечные гомологи) защищают бактериальные клетки от сублетального действия УФ-излучения, что при подавлении экспрессии 505-ответа реализуется через прямые фотопротекторные эффекты в отношении ДНК.

3. Алкилоксибензолы проявляют способность выступать в качестве перехватчиков супероксид аниона, что прогрессирует с увеличением длины алкилыюго радикала. В клеточной системе ЛОБ (особенно их предварительно окисленные продукты) индуцируют экспрессию 5олг5 регулона. Результатом сочетанной активности АОБ является защита бактериальных клеток от окислительного стресса.

Связь автора с выполнением научных программ и собственный вклад автора

Исследования выполнены в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК №11327 «Использование люминесцнрующих клеточных тест-систем при оценке механизмов активности бактерицидных и бактериорегуляторных молекул»); Государственного задания на выполнение НИР №4.2312.2011 «Исследование эффектов бактериальных ауторегуляторов (алкилоксибензолов и гомосеринлактонов) в гомологичных и гетерологичных системах», а также при поддержке гранта Оренбургской области для аспирантов в сфере научной и научно-технической деятельности «Протекторные свойства акилоксибензолов природного и растительного происхождения в условиях окислительного и УФ-радиациоиного стресса».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов; 2010, 2012); VII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва; 2011); I Всероссийской с международным участием, конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь; 2011).

Экспонат «Технология сохранения функциональных свойств биополимеров для проведения диагностических исследований» награжден дипломом V Российского форума «Российским инновациям - российский капитал» (Нижний Новгород, 2012).

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, глава в коллективной монографии; получен 1 патент РФ на изобретение.

Струт-ура и объем диссертации

Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 166 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При проведении исследований использованы химически синтезированные аналоги микробных АОБ со степенью очистки 99,9%, различающиеся длиной и расположением гидрофобного алкилыюго радикала, в том числе СгАОБ, С5-АОБ, С6-АОБ («Sigma», США), а также С3-АОБ и С,2-АОБ («Enamine», Украина) (рисунок 1).

Методической особенностью работы явилось использование ряда молекулярных и клеточных люминесцирующих тест-систем, определившее возможность комплексной оценки стрессового ответа бактериальных клеток при различных повреждающих воздействиях.

Эффекты алкилоксибензолов на процессы температурной денатурации ферментных белков оценивались с использованием смеси хроматографически очищенных люциферазы и ЫАО(Р)Н:РМШ-оксидоредуктазы Pfiotobacterium leiognathii, коммерчески доступной как «Комплект реактивов аналитической биолюминесценции» (КРАБ), выпускаемый Институтом биофизики СО РАН. В основе данной системы лежит ферментативная реакция, сопровождающаяся освобождением избыточной энергии в виде кванта сине-зеленого света:

FMNHj + 02 + RCHO -> FMN + Н20 + RCOOH + hv (495 им)

Ферменты выдерживали с исследуемыми АОБ в течение 60 мин, нагревали в твердотельном термостате «Термит» («ДНК-Технология», Россия) в диапазоне температур от 30°С до 44°С в течение 5 мин и переносили в кюветы с предварительно составленной смесью субстратов для реакции свечения, включающей флавинмононуклеотид («Sigma», США), восстановленный никотинамиддинуклеотид («AppliChem», Германия) и миристиновый (С14) альдегид («Merck», ФРГ). Регистрацию свечения в пробах проводили на двухканальном биолюминометре БЛМ 8802М2К (СКТБ «Наука», Россия). На основании полученных данных рассчитывали относительный индекс биолюминесценции по формуле [={luxKffhixO„)l(JiLxK,,-1ихОо), где tiLxKo и haK„ -уровни свечения контрольной пробы (ферменты без АОБ) на нулевой и п-минутс; 1гаО(, и htxO,,- уровни свечения опытной пробы (ферменты ц присутствии АОБ) на нулевой и п-минуте.

Влияние АОБ на процесс шаперон-независимого рефолдинга бактериальной люциферазы оценивали с использованием рекомбинантного штамма Е. coli К12 MG/655 (pF2) [hoc Ab], несущего гибридную плазмиду pF2 с конститутивно транскрибируемыми /нЫЯ-генами Vibrio fischen. Штамм выращивали при 28°С на LB-бульоне («Sigma», США) в присутствии 100 мкг/мл ампициллина до достижения ранней экспоненциальной фазы роста (OD640=0,2). Перед постановкой эксперимента в пробы вносили антибиотик хлорамфеникол (167 мкг/мл) для

Рисунок 1 - Общая структурная формула использованных гомологов алкилоксибензолов (Я -алкильный радикал (СпН2п+1), где п>1; цифрами показана нумерация атомов углерода в ароматическом

'r кольце)

подавления синтеза белков de novo, штамм нагревали 5 мин при 42°С как описано выше с целью температурной денатурации внутриклеточной люциферазы и дополнительно инкубировали при 20-22°С в течение 60 мин в присутствии исследуемых гомологов АОБ. Восстановившуюся после рефолдинга активность люциферазы оценивали с использованием микропланшетного биолюминометра LM OIT («Immunotech», Чехия) после внесения в реакционную смесь длинноцепочечиого альдегида деканаля (СЮ).

Влияние АОБ на индуцируемый воздействием температурного фактора синтез БТШ изучали с использованием рекомбинантного штамма Escherichia coli pibpA ': : h ixCDA BE- A mpR (таб л и ца 1). Штамм выращивали при 37°С в LB-бульоне в присутствии 20 мкг/мл ампициллина. Перед постановкой эксперимента культуру экспоненциальной фазы роста (ODM0=0,2) смешивали с АОБ до конечных концентраций 10"6, 10 s, 10"4 и 10'3 M или дистиллированной водой в случае контроля и инкубировали 60 мин. Температурное воздействие осуществляли путем нагревания 300 мкл суспензии при 55°С в течение 5 мин в твердотельном термостате «Термит».

Интенсивность биолюминесценции клеток измеряли с использованием микропланшетного биолюминометра LM 01Т. Количественную оценку индукции БТШ проводили по формуле F^(hixAfluxAn)/Nb, где: ккАи и /их/1, - световая эмиссия суспензии клеток на 0-й и 60-ой минуте инкубации в ростовой среде после нагревания; JVff - относительное количество жизнеспособных клеток (в долях единицы от исходного) после нагревания. Учет жизнеспособных клеток проводили путем высева аликвот по 10 мкл на поверхность LB-arapa с последующей инкубацией в течение 24 часов при 37°С и КОЕ.

Эффекты АОБ на чувствительность ДНК к УФ-облучению оценивали на примере коммерческих препаратов: ДНК фага к, расщепленной эндонуклеазой HindIII на линейные фрагменты длиной от 10000 до 250 н.п., а также плазмиды pUCl9 (2686 н.п.) («СибЭнзим», Россия), представленной совокупностью кольцевых суперскрученных, кольцевых релаксированных и линеаризованных молекул. Гель-электрофорез данных молекул проводили в 0,8% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидиума бромида в трис-боратном буфере (рН 7,2) при силе тока 100 мА и напряженности электрического поля 5 В/см, задаваемыми источником питания «Эльф-4» («ДНК-Технология», Россия).

Таблица 1 - Использованные клеточные люминесцирующие тест-системы

Штамм Генетические особенности Исследуемые процессы

Escherichia coli pibpA '.■.ImCDABE-Amp" ПлазмидаpibpA '::haCDABE-AmpR с полной кассетой /m'-генов Photorhabdiis luminescence ZM 1, клонированных под икдуцибельным промотором белка-шаперона IbpA Синтез БТШ

Escherichia coli precA '::htxCDABE-Amp* Плазмида precA '::lmCDABE-AmpR с полной кассетой /иг-генов P.huninescence ZM 1, клонированных под индуцибелышм промотором регуляторного белка RecA Активация SOS-системы

Escherichia coli psoxS';: ItixCDABE-Am-p" ПлазмидаpkutCi ';;hixCDABE-AmpR с полной кассетой /і«-генов P.luminescence ZM 1, клонированных под нндуцибельпым промотором saxS - транскрипционным активатором генов ответа клетки на супероксид-аннон Окислительный стресс

Примечание: штаммы любезно предоставлены И В. Мануховым (ГосНИИгенетпка, Москва)

Дополнительное УФ-воздействие на препараты ДНК осуществляли при их облучении через полосовой светофильтр с максимумом пропускания 254 нм с использованием широкополосной УФ-лампы («Osram», Германия). Гель визуализировали на УФ-трансиллюминаторе («Vilber Lourmat», Франция), фотографировали и полученные цифровые изображения обрабатывали с помощью инструментов универсальной компьютерной программы «ImageJ» («NIH», США).

Влияние АОБ на SOS-атвст бактериальных клеток, индуцируемый УФ-облучением изучали с использованием рекомбинантного штамма E.coli precA'::ltixCDABE-AmpR (таблица 1). Штамм выращивали аналогично предыдущему и подвергали действию стрессора путем УФ-облучения клеток в объеме 1 мл широкополосной УФ-лампой с расстояния 10 см через интерференционный светофильтр с максимумом пропускания в области 254 нм. При этом энергетическая освещенность образцов, измеренная с использованием УФ-радиометра «ТКА-ПКМ» (ООО «НТП «ТКА», Россия), составила 6,7 Вт/м2, время экспозиции варьировало от 0 до 180 мин с дискретностью 60 мин, а рассчитанные дозы УФ-облучения составили 1,21, 2,43 и 3,64 Дж/м2. Затем измеряли интенсивность биолюминесценции клеток, как описано выше. Ее количественную оценку вычисляли по формуле Fi=(haAi-Bí¡)/(haAi)-B¡), где 1ихАц и IitxAj - световая эмиссия суспензии клеток до и после стрессового воздействия, Во и B¡ - количество жизнеспособных клеток до и после стрессового воздействия. Также проводили учет числа жизнеспособных клеток (КОЕ).

Прямую антираднкальную активность АОБ оценивали на примере неферментной реакции фотохимической индукции супероксид-аниона, основанной на спонтанном реокислении фотовосстановленного флавина. Модельная система включала 100 мкл 0,05 мМ раствора рибофлавина и 5 мкл 1 мМ раствора тетраметилэтилендиамина - ТЕМЕД («Reanal», Венгрия) в 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,8), облучаемых лампой дневного света мощностью 20 Вт с расстояния 10 см в течение 5 мин при температуре 20±1°С. Активность реакции в присутствии (опыт) и в отсутствие (контроль) гомологов АОБ детектировали по предупреждению выхода окрашенного продукта - формазана (560 нм), образующегося при взаимодействии супероксид-аниона с предварительно внесенным в систему (10 мкл; 10"3 М) нитросиним тетразолием - НСТ («Fermentas», Литва), что оценивалось на спектрофлюориметре «Флюорат-02-Панорама» («Люмэкс», Россия).

Влияние АОБ на индукцию soxS регулона в условиях окислительного стресса изучалось с использованием рекомбинантпого штамма E.coli psoxS'::lwcCDABE-AmpR (таблица 1). Штамм выращивали аналогично предыдущим и подвергали действию стрессора путем инкубации аликвот суспензий по 300 мкл в присутствии 4-10"3 М индуктора окислительного стресса параквата («Sigma», США) в течение 10 мин. Затем, как описано выше, измерялась интенсивность биолюминесценции клеток; осуществлялась ее количественная оценка и проводился учет жизнеспособных клеток.

Все эксперименты выполнены минимум в трех повторностях. Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Statistica» и пакета программ «Microsoft Excel».

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Исследование эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ бактерий, индуцируемый воздействием высоких температур

3.1.1 Исследование эффектов апкилоксибензолов на процесс температурной денатурации бактериальной люциферазы. В предварительных экспериментах были установлены закономерности термоденатурации ферментного комплекса люцифераза / NAD(P)H:FMN-0KCH;i0pe/iyKTa3a Р. leiognathi. Предварительный эксперимент позволил установить закономерности термоденатурации данного ферментного комплекса в диапазоне от 30°С до 44°С и выбрать в качестве режима воздействия его тепловую обработку при 40°С в течение 5 мин, в результате чего достигалась выраженная денатурация ферментов при сохранении до 20% исходной активности (рисунок 2а).

Введение в данный ферментный комплекс исследуемых гомологов АОБ позволило зарегистрировать и количественно оценить ряд эффектов на процессы термоденатурации, направленность и выраженность которых зависела от особенностей химической структуры и действующих концентраций АОБ (рисунок 26).

Так предварительный контакт ферментного комплекса с короткоцепочечными гомологами СрАОБ и С3-АОБ в широком диапазоне концентраций вел к пропорциональному росту его термостабильности. В частности, СгАОБ уже в наименьшей использованной концентрации Ю^М повышал остаточную активность люциферазы / ЫАО(Р)Н:РМЫ-оксидоредуктазы в 1,9±0,7 раза, и с увеличением своего присутствия в системе до 10"3М демонстрировал рост подобного эффекта уже в 4,9±0,6 раз относительно термоденатурированного контроля.

В отличие от названных короткоцепочечных АОБ, гомологи с числом атомов углерода в ацилыюй цепи от 5 и выше обуславливали формирование термопротекторного эффекта только в узком диапазоне концентраций I0"4 -Ю^М, что проявлялось в росте относительных индексов биолюминесценции до

30 ¡2 34 36 І5 40 4; 44 0 1С.Є 1С- ИИ 10'

Температура, °С Концентрация АОБ, і!

Рисунок 2 - Характеристики денатурации люциферазы P.leiognathi при различной интенсивности температурного воздействия (а), а также относительные значения ее активности после инкубации с Сі-АОБ (1), С,-Л О Б (2), С5-АОБ (3), С6-АОБ (4), Сп-АОБ (5) и последующего температурного воздействия 40°С в течение 5 мин (б)

Увеличение действующих концентраций данных факторов до 10"3М, напротив, усиливало процессы термоденатурации модельного ферментного комплекса, приводя индексы биолюминесценции к значениям менее единицы: 0,15±0,01 для С6-АОБ и 0,13±0,01 для С12-АОБ.

3.1.2 Изучение влияния алкилоксибензолов на процесс шаперон-независимого рефолдинга бактериальной термоденатурированной люциферазы V.fischeri, конститутивно экснрессированной в штамме E.coli К12 MG1655 pF2. В контрольных вариантах (рисунок За) шаперон-независимое свечение штамма на 60 мин рефолдинга достигало 34% от исходного. В опытных вариантах внесение в подобную систему исследованных гомологов существенно изменяло эффективность рефолдинга, параметры которого вновь зависели от структуры и действующих концентраций АОБ (рисунок 36).

Короткоцепочечные гомологи и, в первую очередь, СрАОБ в диапазоне концентрации повышали эффективность происходящего рефолдинга,

увеличивая восстановление функциональной активности люциферазы в 1,18±0,6-1,35±0,70 раз. Другой важной особенностью действия короткоцепочечных АОБ было увеличение скорости восстановления нативной структуры люциферазы: уже через 30 мин активность фермента, прединкубированного с Сі-АОБ (1 (Г6 М), превышала уровень активности в контроле в 2,5 раза и достигла максимальной, тогда как максимум в контроле наблюдался только через 60 мин. В то же время рост действующих концентраций названных АОБ вел к инверсии эффекта с переводом соотношения VIfc к значениям меньше 1, т.е. препятствовал рефолдингу.

На этом фоне длинноцепочечные АОБ устойчиво блокировали восстановление функциональной активности термоинактивированной люциферазы, переводя значения соотношения Vit в диапазон менее 1. При этом внесение этих гомологов уже в минимальной концентрации 10"бМ обусловливало снижение значений активности люциферазы до 0,44 ± 0,05 (в случае С^-АОБ), а использование их максимальной концентрации 10"5М доводило соотношение I0/Ik уже до 0,06 ±0,01.

Рисунок 3 - Восстановление активності! люциферазы V.fischeri при рефолдинге (а) и характеризующие его значения Уїс в присутствии С]-АОБ (1), СУДОВ (2), С5-АОБ (3), Св-АОБ (4), С12-АОБ (5) на 60 мин рефолдинга (б). Показаны моменты нагревания (t°), внесення хлорамфеннкола (Cm) и Сі-АОБ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности интенсивного взаимодействия АОБ с нативными и денатурированными формами ферментных белков. При этом разнонаправленность белок-модифицирующей активности у короткоцепочечных и длинноцепочечных АОБ может быть объяснена различиями в механизмах их взаимодействия с белковой молекулой. Так, показанная термопротекторная активность у Сг и С3-АОБ согласуется с представлениями о возможности их взаимодействия с функциональными группами белка, одновременно с интеграцией в сольватную оболочку белковой глобулы (Крупянский, 2011). В противоположность этому, взаимодействие Cs-, С6- и Сп-АОБ, ведущее к ингибированию рефолинга, может быть объяснено гидрофобным взаимодействием с «обнажившимися» в процессе термоденатурации остатками ароматических аминокислот, следствием чего является стабилизация подобной измененной конформации с препятствием ренатурации белка в исходную функционально активную форму.

3.1.3 Оценка индукции синтеза белков теплового шока в присутствии алкилоксибензолов с использованием люмипесцирующией тест-системы Е. coli pibpA '::!uxCDABE-AmpR. В следующей серии экспериментов исследовали влияние АОБ на индукцию синтеза белков теплового шока (в частности, белка-шаперона IbpA) в клетках рекомбинантного штамма Е. coli pibpA '::luxCDABE-AmpR. Выбранный режим стрессового воздействия (55°С, 5 мин) обеспечивал полную денатурацию предшествующей люциферазы с сохранением достаточного количества жизнеспособных клеток (14,8% от контроля), способных сформировать последующий биолюминесцентный отклик с максимумом, в 5 раз превосходящим фоновый уровень.

Инкубация тестерного штамма в контакте с АОБ без температурного воздействия позволила зафиксировать собственные эффекты гомологов на фоновый уровень свечения и ростовую способность клеток. Так обнаружена 20% индукция биолюминесценции при использовании АОБ в наименьшей концентрации 10"6М и последующая репрессия данного показателя, прогрессирующая с увеличением присутствия данных молекул. Для ростовой способности продемонстрировано сонаправленное с изменением уровня биолюминесценции снижение численности КОЕ, определяемое ростингибирующей активностью данных молекул, выраженность которого прогрессивно возрастала в ряду СрАОБ С12-АОБ.

В свою очередь, исследование анализируемых показателей у клеток, подвергнутых нагреванию после предварительной инкубации в контакте с АОБ, позволило выявить ряд эффектов, характеризующих особенности проявления регуляторной активности данных молекул (таблица 2; рисунок 4).

Общим проявлением действия АОБ на биолюминесцентпый отклик данного штамма в условиях стрессорного воздействия являлись абсолютная (рисунок 4а) и рассчитываемая на ее основе относительная (таблица 2) индукция биолюминесценции минимальной использованной концентрацией 10"®М, отражающая стимуляцию экспрессии БТШ, следствием чего могут являться более высокие значения последующей терморезистентности шаперонов, и, тем самым, функционально интерферирующих с системой БТШ обработанных ими клеток.

9.0E-CH S.0E-04 7-OE-04 6,0E*04 5.6E-04 4.0Ї+04 3.0E-Ö4 2-0E~04 t.CE+04 OiiEHsO

[КОЕ:.\ Li] б

1<И ю-1 10'5 Концентрация АОБ, M

\b к і

Рисунок 4

w-s ю-4 io-ä Концентрация АОБ, М Влияние теплового шока на

уровень биолюминесценции (а) и ростовую способность (б) штамма Е. coli pibpA '::luxCDABE-AmpR, предварительно инкубированного с различными

концентрациями С|-АОБ (1), Сч-АОБ (2), С,-АОБ (3), Сб-АОБ (4), С,2-АОБ (5). По оси абсцисс - концентрация АОБ, М; по оси ординат - интенсивность биолюминесценции, I (а); количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (б).

Таблица 2 - Влияние АОБ на относительные показатели индукции образования БТШ клеток E.coli ibpA '::lnxCDABE-AmpR при

температурном воздействии

Исследуемое соединение; концентрация, М Фактор индукции шаперона IbpA (Fi)

Ci-АОБ,

10"6 122,97±1,4

ю-5 П5,59±1Д

ю-4 78,35±8,1*

ю-1 46,38±3,6**

С,-АОБ,

кг" 124,26±11,3

ю-5 110Д0±10,9

10"4 63,86±7,6*

10"' 23,53±2,2**

ОгАОБ,

10"6 129,84±12,2

ю-5 109,33±9,8

10 4 37,54±4,3**

10"' 30±2,8**

С6-АОБ,

10"6 132,99±9,7

Ю-5 79,37±8,5*

10"4 25,75±3,4**

10"' 4,0±0,01**

Сп-АОБ,

10 й 134,3±1,7

Ю-5 74,03±6,7*

Ю-4 21,60±1,8**

10' 3,8±0,02**

Контроль 128,70±13,4

Обозначения: * - Р<0,05;** - Р<0,01.

С другой стороны, результатом увеличения действующих концентраций АОБ являлось снижение уровня индукции свечения, вплоть до полной репрессии при использовании наибольшей концентрации 10"3М, следствием чего явилось повышение чувствительности клеток к действию данного стрессора. На этом фоне короткоцепочечные гомологи и, особенно, СрАОБ, в широком диапазоне концентраций также обуславливали подавление синтеза БТШ (значения до 46,4 - 115,6 против /7=128,7 в контроле).

Влияние АОБ на показатели жизнеспособности клеток заключалось в формировании повышенной терморезистентности обработанных ими бактериальных клеток (рисунок 46). Так значимое увеличение относительного количества КОЕ после экстремального температурного воздействия (в 1,03 - 1,16 раза по сравнению с соответствующим контролем), было установлено после их предварительной обработки С,-АОБ, что хорошо согласуется с представлениями о термопротекторной активности данного гомолога. В тоже время подобный

защитный эффект прогрессивно убывал в ряду СгАОБ -> С)2-АОБ, а внутри этих групп снижался по мере увеличения действующих концентраций. Кроме того, высокие концентрации длинноцепочечных гомологов усиливали действие стрессора. При этом согласование последнего эффекта с результатами, полученными при исследовании влияния АОБ на процессы температурной денатурации и рефолдинга ферментных белков, позволяет предполагать, что в данном случае защита бактериальных клеток обеспечивается реализацией прямых термопротекторных эффектов АОБ, функционально интерферирующих с системами белков теплового шока.

3.2 Исследование эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ бактерий, индуцируемый воздействием УФ-излучения

3.2.1 Изучение влияния алкилоксибензолов па чувствительность ДНК к УФ-облучению in vitro. Эффекты АОБ оценивали по результатам гель-электрофореза линейных и кольцевых молекул ДНК, предварительно подвергнутых УФ-облучению. Так, электрофорез нативного образца, линеаризованных фрагментов ДНК фага X, в отсутствие подобного воздействия выявлял семь фрагментов с фиксированной длиной от 10000 до 250 н.п. В вариантах интенсивного УФ-облучения дозой 3,64 Дж/м2 электрофоретическая картина качественно изменялась: полностью исчезали характерные полосы фрагментов ДНК с фиксированной длиной, они превращались в единый «шмер», что являлось результатом множественных двунитевых разрывов и дезинтеграции линейной ДНК на фрагменты нерегулярной длины.

В опытных вариантах, предварительный контакт линейных молекул ДНК с АОБ изначально не изменял их электрофоретическую подвижность, но сопровождался существенным снижением чувствительности возникающих комплексов к последующему УФ-облучению. Эффекты зависели от структуры и концентрации АОБ. Так, С,-АОБ в концентрации 10"3М при УФ-облучении предохранял от фотодеструкции на 5,9±0,6% больше ДНК, чем в контроле без АОБ, в то время как использование этого же гомолога в концентрации 10 М существенно не изменяло данный показатель. Фотопротекторная активность более длинноцепочечного С6-АОБ оказалась существенно выше, формирование заметного защитного эффекта проявлялось уже при концентрации ЮМ, а в концентрации 103М С6-АОБ защищал от фотодеструкции на 22,4±1,7% больше ДНК по сравнению с контролем.

В свою очередь, на электрофореграммах нативная плазмидная ДНК pUCl9 выявлялась в виде двух конформаций с различной подвижностью: кольцевой суперскрученной формы (I), составляющей 60,4% от общего количества ДНК, и кольцевой релаксированной формы (II), составляющей 39,6% (рисунок 5). УФ-облучение приводило к изменению конформации плазмидной ДНК: исчезала типичная полоса I и усиливалась интенсивность полосы II, что можно интерпретировать как результат перехода кольцевой суперскрученной формы в кольцевую релаксированную вследствие образования на первой из них однонитевых разрывов ДНК, а также появлялась полоса III, по-видимому, в результате перехода замкнутых молекул плазмидной ДНК в линеаризованную форму вследствие формирования на каждой из них по одному двунитевому

разрыву ДНК. При этом общее количество электрофоретически выявляемой плазмиды р11С19 при УФ-облучении составило 83,6±4,1% от ее исходного содержания в пробе.

В опытных вариантах взаимодействие кольцевых молекул ДНК с АОБ также характеризовалось выраженным фотопротекторным эффектом, который зависел как от особенностей химической структуры используемых гомологов, так и их воздействующих концентраций и проявлялся в предотвращении конформационпых переходов плазмиды, индуцируемых УФ-облучением дозой 0,61 Дж/м* (рисунок 5). При этом короткоцепочечные гомологи СрАОБ и С3-АОБ проявляли слабую фотопротекторную активность, незначительно защищая молекулы ДНК от образования 1- и 2-цепочечных разрывов и лишь препятствуя их более глубокой деградации. Длинноцепочечные гомологи С6-АОБ и С12-АОБ практически полностью предупреждали появление полосы III (не более 1,2% при использовании Сб-АОБ), а также сохраняли количественное присутствие суперскручеиной конформации (полоса Г), составившей 87,3-98,7% по сравнению с исходным необлученным препаратом.

60 50

и -10

% 30

□I

я а ■ш

Рнсунок 5 — Элекгрофоретическая подвижность ДНК рі!С19 после УФ-облучения (а) и относительное содержание ДНК (б) в составе полос І-Ш. Обозначения: 1 - контроль; 2 - после УФ-облучения в дозе 0,61 Дж/м2; 3 - то же в присутствии 10' М Сі-АОБ; 4 - Сі-АОБ; 5 - С5-АОБ; 6 - Сб-АОБ; 7 - С12-АОБ. Стрелкой показано направления движения

3.2.2 Разработка способа защиты ДНК от УФ-облучения на этапе детекции результатов гель-электрофореза. Выявление прямой фотопротекторной эффекта АОБ было положено в основу нового подхода к защите ДНК от УФ-облучения при проведении гель-электрофореза на этапе детекции результатов (патент РФ на изобретение № 2465576 от 27.10.2012 г.). Предложенная технология заключается в введении в буферный раствор для электрофореза С6-АОБ в конечной концентрации 10"3М (0,194 г/л) с его последующим использованием для разделения препаратов ДНК в агарозном геле и детекции результатов путём УФ-облучения с длиной волны 254 нм. Основным достигаемым положительным результатом является защита структурной целостности и функциональных свойств анализируемых молекул ДНК при подобном воздействии. Так в отдельной серии экспериментов было

продемонстрировано повышение эффективности трансформации Е.соН плазмидным вектором рИС19, предварительно подвергнутым электрофоретическому разделению с последующей УФ-детекцией. Полученные результаты свидетельствовали о 1,25-кратном увеличении эффективности трансформации в случае проведения процедуры в соответствии с предлагаемой технологией.

3.2.3 Оценка индукции БОБ-ответа в присутствии алкилоксибензолов с использованием люминесцирующией тест-системы Е.соН ргесА'::1ихС£)АВЕ-

Атрк. Изучение закономерностей реагирования тест-штамма на изменение дозы УФ-облучения позволило определить количественные параметры активации 505-системы. Анализ реакции штамма показал сонаправленное увеличению дозы повышение уровня биолюминесценции с максимумом в 2,65 раз превосходящим фоновый уровень при дозе 1,21 Дж/м2 и последующее снижение его фактически до исходных значений при дозе облучения 3,64 Дж/м2. Расчет фактора индукции биолюминесценции, учитывающего количество бактериальных клеток, сохранивших жизнеспособность после воздействия стрессора, свидетельствовал о выраженной индукции 505-системы, достигающей наибольшего своего значения = 282,85) при максимальной дозе воздействия. Дополнительный анализ показал усиление фенотииической диссоциации, проявляющейся в переходе от доминантных Б- к Я-типам колоний (до 50% от 8% в контроле).

Исследование собственных эффектов АОБ на показатели свечения и жизнеспособности тест-штамма позволило зафиксировать ряд зависимостей от особенностей строения и концентраций данных молекул. Обнаружена слабо выраженная индукция биолюминесценции наименьшей концентрацией 10"6М АОБ, не превышающая 7% от контроля. Во всех остальных случаях увеличения абсолютных значений биолюминесценции не наблюдалось, напротив, зарегистрировано значимое снижение фонового уровня свечения. Выраженность подобного эффекта возрастала в ряду СгАОБ С,2-АОБ, одновременно характеризуясь относительно прямой концентрационной зависимостью. В свою очередь анализ ростовых свойств клеток Е.соН ргесА'::каСОАВЕ-Атр , инкубированных в контакте с АОБ, позволил констатировать сонаправленное с уровнем биолюминесценции снижение количества КОЕ. На этом фоне еще одним установленным фактом стало влияние АОБ на интенсивность диссоциативных переходов штамма. В частности, присутствие АОБ, особенно Ср и С5-АОБ, в концентрации Ю^М усиливало интенсивность Б —> II перехода до 24% против 8% в контроле с выщеплением до 26% промежуточных 118-фенотипов. Данный факт явился дополнительным подтверждением возможности непосредственного взаимодействия АОБ с ДНК, приводящего к формированию ее структурных изменений.

Проводимый на этой основе анализ воздействия УФ-излучения на клетки, предварительно инкубированные в контакте с АОБ в концентрации I О^М, позволил охарактеризовать ряд взаимосвязанных эффектов (рисунок 6), выражающихся в однозначном защитном эффекте АОБ бактериальных клеток от УФ-облучения при блокаде активности 505-систсмы. Так сравнительный анализ коэффициента У, показал относительное снижение ^ОХ-ответа клеток в присутствии АОБ (таблица 3). Степень репрессии оказалась пропорциональна

длине алкильного радикала и была более выражена у длинноцепочечных АОБ, значения которых до 76,43 раз уступали параметрам контроля (Сб-АОБ в концентрации Ю^М). Снижение концентрации АОБ до 10"5 и 10"6М вело к формированию статистически неотличимых абсолютных значений биолюминесценции контрольных и опытных проб, но сопровождалось менее выраженной репрессией 505-ответа. Увеличение же концентраций АОБ до 1(ГМ вело к более выраженному снижению абсолютных, но несколько меньшему - относительных значений свечения.

Количество КОЕ в подобных условиях закономерно увеличивалось в ряду С1-АОБ —> С12-АОБ, при максимальной дозе УФ-облучения в 2,0-14,4 раза превышая контрольные значения. Уменьшение концентраций АОБ до 10"6 и 10° М или их увеличение до кг'м сопровождалось соответствующим ослаблением или усилением подобного эффекта (таблица 3; рисунок 66).

lg[KOE 'MiJ б 1 Г->1

läk-V

Ш Шш о

2,43 Зг64

Доза, Дж/м'

' '-й" S ~Я ¿4S6

1.0E.es ; 56

• 1

_ _ HB I v 1

1,0£»С5

1,21

2.43

3 64

Доза, Дж/м

Рисунок 6 - Закономерности реагирования штамма Я coli precA '. . IwxCDABE-AmpR на воздействие УФ-облучения без (1) и после инкубации с АОБ: С,-АОБ (2), Cj-АОБ (3), С5-АОБ (4), Сб-АОБ (5), С12-АОБ (6) в концентрации Ю^М. По осям абсцисс - доза облучения, Дж/м2; по осям ординат -интенсивность биолюминесценции, 1 (а); количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (б).

Таблица 3 - Влияние АОБ на относительные показатели индукции 505-системы клеток Е.соИ

ргесА '::IихСВЛВЕ-Атрк при воздействии УФ-излучения (3,64 Дж/м2)

Исследуемое соединение; концентрация, М Фактор индукции SOS-системы (F,)

Сі- АОБ,

Ю'6 249,3±24,1

ю-5 238,3421,1

1СГ4 234,9±21,0

ю-1 92,15±9,1**

С,- АОБ,

10'6 253,0422,3

ю-5 250,0423,3

W4 141,9±13,3*

10" 57,43±5,5**

С5- АОБ,

10 е 155,0t 12,9

ю-5 1 12,0410,1*

ю-4 38,3±3,5**

ю-5 51,244,8**

С6- АОБ,

106 !43,0±13,7

ю-5 65,2±5,0**

ю-4 3,740,3**

10'3 18,941,7**

С,2- АОБ,

КГ6 139,0413,1

ю-5 54,345,0**

10 4 7,040,6**

W3 13,7±1,4**

Контроль 282,8±26,5

Обозначения; * - Р<0,05;** - Р<0,01;*** - Р<0,001.

Анализ показателей фенотипической диссоциации в популяции, предварительно инкубированной в контакте с АОБ в концентрации 10 М и подвергнутой максимальной дозе стрессора, продемонстрировал значимое увеличение колониального разнообразия. В наибольшей степени эффект был характерен для популяций, УФ-облучению которых предшествовал контакт с длинноцепочечными С6-АОБ и С^-АОБ. Таким образом, полученные данные позволяют предполагать, что АОБ реализуют особенный механизм регуляции чувствительности бактерий к УФ-излучению, опосредованный их комплексным и, в определенном смысле, альтернативным влиянием на «пассивные» и «активные» механизмы защиты ДНК при подобном воздействии. В его основе лежит прямое взаимодействие АОБ с ДНК, ведущее к изменению физико-химических свойств биополимера и сопровождающееся формированием его устойчивости к воздействию стрессоров. Подобный «пассивный» механизм снижает последующую повреждаемость ДНК при УФ-облучении, что результируется в меньших показателях активации 505-системы, реализующих «активный» механизм защиты данного биополимера. В результате сохранение жизнеспособности бактериальных клеток оказывается возможным при минимальных значениях активности репарационных процессов.

3.3 Исследование эффектов алкилоксибензолов на окислительный стресс у бактерий

3.3.1 Изучение прямой антирадикальной активности алкилоксибензолов проводилось с использованием неферментативной системы генерации супероксид-аниона, детектируемого по переходу красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в восстановленную нерастворимую форму - формазан, имеющий максимум поглощения при 560 нм. Регистрация изменения оптической плотности после освещения компонентов системы в течение 5 мин позволила детектировать формирование ярко-окрашенного продукта, что результировалось в повышении значений оптической плотности, в 3,56 раза превышающих контрольные (рисунок

7а)- „ дл.

Внесение в тест-систему длинноцепочечных гомологов С6-Аиь в

концентрации >10"5М, а С,гАОБ в концентрации > Ю^М позволило зафиксировать у них значимую антирадикальную активность, что выражалось в дозозависимом снижении интенсивности перехода НСТ в формазан на 10% и более (рисунок 76). В частности, возрастающие концентрации С6-АОБ снижали значения ОП560 до 87±8%, а С12-АОБ до 89±6% по сравнению с соответствующим контролем. Кроме того, использование этих соединений в наибольшей концентрации 10 М приводило к качественному изменению характера реакции - в анализируемых пробах проявлялась красно-бурая окраска, определяемая по увеличению экстинкции в области 500-525 нм. Согласно существующим представлениям данный факт может быть объяснен образованием нестабильных хинонных радикалов, а также метастабильных три- и тетрагидроксибензолов как результата окисления АОБ, что подтверждает принципиальную возможность функционирования данных молекул в качестве конечного акцептора электронов.

200 300 400 500 600 700 SCO 0 10-s 10 ? UH 10-!

Дайна волны, нм Концентрация ЛОБ. М

Рисунок 7 - Динамика перехода HCT (1) в формазан (2) (а) и влияние С,-АОБ (3), С3-АОБ (4), С5-АОБ (5), Сц-АОБ (6), С12-АОБ (7) на количественные показатели данного процесса (б)

С другой стороны, гомологи АОБ с числом атомов углерода в ацильной цепи 5 и меньше в использованных экспериментальных условиях не проявляли выраженной активности, а наиболее корогкоцепочечный гомолог СгАОБ даже несколько увеличивал выход формазана, в своем максимуме (в концентрации 10"3 М) превышающий контрольные значения на 19±1,4% (рисунок 76).

Полученные результаты, с одной стороны, подтверждают возможность участия АОБ в неферментативной антиоксидантной системе защиты от АФК, в рамках которой данные молекулы функционируют в качестве перехватчиков супероксид-аниона, а с другой - позволяют констатировать значимость размера их алкильного радикала в обеспечении подобной антирадикальной активности.

3.3.2 Оценка индукции soxS регулона в присутствии алкилоксибензолов с использованием люминесцирующией тест-системы E.coli psoxS'::luxCDABE-AmpR. Антиоксидантное действие различных гомологов АОБ было также проанализировано в клеточной системе на модели рекомбинантного штамма E.coli psoxS'::htxCDABE-AmpR при внесении в систему индуктора свободнорадикальных процессов — параквата. Выбранная концентрация модельного стрессора (410"3М) обеспечивала выраженную индукцию soxS регулона, о чем свидетельствовали значения коэффициента F, = 109,96 при сохранении 4,6% жизнеспособных клеток.

Предварительная часовая инкубация исследуемого штамма с АОБ как и в случае других описанных тест-систем обусловливала изменения показателей уровня свечения и численности жизнеспособных клеток (КОЕ). Влияние АОБ на уровень биолюминесценции, отражающий величину индукции soxS регулона, зависело от их концентрации и структуры. При использовании АОБ в наименьшей концентрации 10"6М наблюдалась небольшая стимуляция свечения, на 14,9% превышающая фоновые значения в случае С12-АОБ. Увеличение концентрации АОБ вело к прогрессивной репрессии стрессового регулона, выраженность которой прогрессивно возрастала в ряду СгАОБ —» С^-АОБ. Влияние АОБ на жизнеспособность клеток было аналогично действию на клетки двух предыдущих штаммов и зависело от структуры и концентрации исследуемых гомологов.

В условиях окислительного стресса, вызванного паракватом, предварительная инкубация штамма с АОБ приводила к значительному изменению анализируемых показателей. Анализ биолюминесцентного отклика тест-штамма при воздействии окислителя продемонстрировал разнонаправленные эффекты АОБ, зависящие от их структуры (рисунок 8а). Так, длинноцепочечные гомологи в

концентрациях Ю"6 и 10"5М вызывали активацию стрессового регулона с последующим снижением уровня свечения (Ю^М) при увеличении их концентрации вплоть до полной репрессии при использовании концентрации 10~3М. Короткоцепочечные АОБ не влияли на активацию регулона, но в больших концентрациях (10"4 - 10"3М) несколько подавляли его экспрессию.

Анализ коэффициента подтвердил наличие значимой индукции стрессового регулона микромолярными концентрациями длинноцепочечных АОБ на фоне большего сохранения количества КОЕ, а также последующее отключение стрессового регулона, определяемого увеличением концентрации данных молекул, характеризующееся повышением чувствительности клеток к воздействию параквата (таблица 4). Для короткоцепочечных АОБ данный коэффициент продемонстрировал умеренно выраженную репрессию soxS регулона с одновременным снижением чувствительности клеток к воздействию окислителя; эффект возрастал с увеличением концентрации данных гомологов.

® Таблица 4 - Влияние АОБ на

относительные показатели

экспрессии 50x5 регулона клеток Е.соН рхохБ': :1ихСОЛ В Е-А тря при воздействии параквата (4-10"3М)

О ю-< ¡с-5 ю-1 10" концентрация ЛОБ. М

6 10- 1С- 1С"1 1С»

Концентрация ОБ М 'КОЕ.'М ] г

1,:Е-Н>5 -

Г ГшЛмтг -Ь 111 с

; .1 * 1 Ш Р

1 11 1 I».1 ■ | •

1 1 11111 Из

О 15-= 10'! 10"' 1С'г С' 10' 1С-' 1СН 10>

Концентрация ЛОБ. М Концентрация ЛОБ. М

Рисунок 8 - Влияние окислительного стресса на

уровень биолюминесценции (а, б) и ростовую

способность (в, г) штамма Е.соН рзох$'::1ихСОАВЕ-

Атра, предварительно инкубированного с

исходными (а, в) и предварительно окисленными (б,

г) С,-АОБ (1), С3-АОБ (2), С5-АОБ (3), С6-АОБ (4),

С12-АОБ (5). По оси абсцисс - концентрация АОБ, М;

по оси ординат - интенсивность биолюминесценции,

I (а, б); количество жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Исследуемое Фактор индукции Фактор индукции регулона яохЗ (/ч) в присутствии окисленных АОБ

соединение; концентрация, М регулона (П) в присутствии АОБ

СгАОБ.

10"6 109,84±9,3 116,82*9,1

Ю"5 101,46*10,2 107,63*8,9

104 59,01*4,5* 82,66*7,6

КГ1 44,96*5,4" 68,73*6,7*

Сз-АОБ,

10"6 114,64±10,5 115,61*9,8

10"5 105,74*9.9 110,55*10,1

ю-4 72,29*6,7* 85,80*8,5

КГ3 42,66*6,5** 71,99*8,0*

Сз-АОБ,

КГ6 116,62*9,8 128,57*11,2

10"5 112,48*11,3 128,02*10.0

Ю" 89,99*9,6 103,88*9,4

ю-3 9,03*0,7** 13,51*0,9**

Сб-АОБ,

10'6 119,99*11,8 143,96*11,0

ю-5 115,29*10,6 145,03*9.6*

ю-4 104.46*9,0 126,46*9,9

10'3 1,03*0,2** 1,14*0,1**

С12-АОБ,

10* 114,29*13,6 146,18*10,1*

ю5 116,60*9,9 151,64*10,3*

ю-4 107,49*10,7 122,90*9,9

ю-3 1,87*0,2** 2,02* 0,3**

Контроль 109,96*9,7

Обозначения: * -Р<0,05;** Р<0,01.

Интегральным показателем эффектов АОБ явилось сохранение количества КОЕ после контакта с паракватом при использовании как короткоцепочечных, так и длинноцепочечных гомологов (рисунок 8в). Однако, характер изменения данного показателя у обозначенных АОБ резко отличался. Так, в случае короткоцепочечных гомологов эффект возрастал с увеличением их количества и максимальные значения сохранения КОЕ регистрировались в наибольшей концентрации 10"3М (6,99±0,3 для Ci-АОБ на фоне 4,96±0,5 в контроле). В случае длинноцепочечных АОБ эффект изменялся в противоположном направлении и максимальные значения сохранения КОЕ для данных АОБ регистрировались в наименьшей концентрации 10"6М (5,32±0,8 для С6-АОБ и 5,54±0,6 для Сп-АОБ).

Полученные результаты подтвердили данные модели in vitro о влиянии размера алкильного радикала в реализации антиоксидантных эффектов АОБ. Однако характер влияния в случае использования сложной клеточной системы отличался противоположной направленностью. Характеризуясь значимым ингибирующим эффектом на метаболизм и рост клеток, длинноцепочечные АОБ проявляли максимальный антиоксидантный эффект в концентрациях, не приводящих к его отключению: 10"6- 10'5М. В свою очередь короткоцепочечные гомологи, не проявляющие значимых ростингибирующих эффектов, тем не менее во всем диапазоне используемых концентраций повышали показатели КОЕ после воздействия параквата, что требует своего дальнейшего изучения и объяснения.

С целью уточнения механизма антиоксидантной активности АОБ на заключительном этапе данной части работы было проведено исследование влияния предварительно окисленных форм АОБ на экспрессию soxS регулона. Продемонстрированные выраженные антиоксидантные эффекты in vivo, а также обнаруженная способность АОБ к окислению с образованием окрашенных продуктов позволили предположить отсутствие данных эффектов в случае введения в клеточную систему предварительно окисленных гомологов. С данной целью тест-штамм инкубировался в течение часа в присутствии гомологов, предварительно подвергнутых контакту с супероксид анионом, как описано выше, и затем вносился паракват. Подобное предварительное воздействие вело к значимым изменениям эффектов АОБ на клетки в условиях окислительного стресса. Так, внесение всех вариантов гомологов не приводило к повышению количества КОЕ выше контрольных значений, кроме того, снижало данный показатель пропорционально увеличению своего присутствия в данной системе. Эффект был наиболее ярко выражен у длинноцепочечных АОБ (рисунок 8г).

На этом фоне анализ коэффициента F¡ демонстрировал значительную индукцию биолюминесценции концентрациями 10"6, 10"5М, что свидетельствовало о более интенсивной стимуляции экспрессии промотора soxS в присутствие окисленных растворов АОБ (таблица 4). Использование длинноцепочечных гомологов приводило к наибольшему отклонению данного показателя от контрольных значений: 1,32 для С6-АОБ и 1,38 для С,2-АОБ в концентрации 10"5М. Таким образом, предварительно окисленные растворы АОБ повышали чувствительность бактериальных клеток к окислительному стрессу, обуславливая снижение количества КОЕ на фоне индукции стрессового промотора soxS.

Выводы

1. Алкилоксибензолы - АОБ (химические аналоги ауторегуляторных факторов микроорганизмов) оказывают комплексное влияние на устойчивость бактериальных клеток к различным экстремальным воздействиям, реализуемое через стабилизацию входящих в них биополимеров и развитие прямого антиоксидантного эффекта, а также через модуляцию активности специфических стрессовых регулонов.

2. Короткоцепочечные (СГС3) АОБ предупреждают термоденатурацию ферментных белков и в микромолярной концентрации способствуют их шаперон-независимому рефолдингу, в то время как длинноцепочечные (C5-Ci2) АОБ в миллимолярных концентрациях усиливают процессы термоденатурации, а во всем исследованном диапазоне концентрационно-зависимо препятствуют рефолдингу белков.

3. Алкилоксибензолы (особенно их длинноцепочечные гомологи) в микромолярной концентрации вызывают умеренно выраженную индукцию белков теплового шока, оцененную с использованием люминесцирующей тест-системы Escherichia coli pibpA '::htxCDABE-hmp'\ а при увеличении действующих концентраций обуславливают подавление синтеза БТШ, что при использовании короткоцепочечных АОБ обеспечивает сохранение жизнеспособности обработанных ими бактериальных клеток.

4. Длинноцепочечные (С5-С|2) АОБ в сравнении с короткоцепочечными (СрСз) проявляют выраженный фотопротекгорный эффект, предотвращая формирование одно- и двуцепочечных разрывов линейных и кольцевых молекул ДНК.

5. В условиях сублеталыюго УФ-облучения алкилоксибензолы в большинстве случаев обуславливают репрессию ^ЛУ-ответа люминесцирующей тест-системы Е. coli precA '::hcxCDABE-AmpR, тем не менее, существенно увеличивая относительное количество бактериальных клеток, сохранивших свою ростовую способность после подобного экстремального воздействия с одновременным увеличением интенсивности процессов S—»R диссоциации.

6. В молекулярной системе генерации супероксид-аниона длинноцепочечные алкилоксибензолы проявляют свойства перехватчиков активных радикалов кислорода, образуя окрашенные продукты с максимумом поглощения в диапазоне 500-525 нм.

7. Алкилоксибензолы и, особенно, их окисленные продукты вызывают индукцию soxS регулона в люминесцирующей тест-системе Е. coli psoxS'::luxCDABE-AmpR, при этом АОБ предадаптируют бактериальные клетки к последующему окислительному стрессу, достоверно увеличивая их количество после подобного воздействия.

Сппсок работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Давыдова O.K., Грпзева И.В. Защита ДНК от повреждений, вызванных ультрафиолетовым излучением при детекции результатов гель-электрофореза // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - №2. - С. 127.

2. Грпзева II.В., Давыдова O.K., Кузнецова Н.В. Влияние алкилоксибензолов на стрессовый ответ бактериальных клеток, оцененный с использованием люминесцирующих тест-систем // Вестник Уральской медицинской академической науки.-2011.-№4/1 (38).-С. 28.

3. Дерябин Д.Г., Давыдова O.K., Грязева И.В., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в ответе Escherichia coli на летальное воздействие ультрафиолетового облучения // Микробиология. - 2012. -Т.81. -№2. - С. 185-195.

4. Грязева II.B., Давыдова O.K. Роль алкилоксибензолов в регуляции стрессового ответа бактерий // Вестник Челябинского государственного университета. -2013,-№7.-С. 55-57.

5. Грязева И.В., Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Свиридова Т.Г., Свиридов А.П. Прогнозируемая и экспериментально выявляемая антиоксидантная активность алкилоксибензолов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2013. - № 8. - С. 41-46.

Публикация в зарубежной печати

6. Deryabin D., Davydova О., Gryazeva I. Alkylresorcinols protect the DNA from UV-damage in vitro and in vivo models // Products and Applications of Biopolymers / Ed. by C.J.R. Verbeek Croatia: In tech. - 2012. - P. 185-200. doi: 10.5772/34782.

Патент РФ на изобретение

7. Дерябин Д.Г., Давыдова O.K., Грпзева II.В. Способ защиты ДНК от ультрафиолетового излучения при детекции результатов гель-электрофореза // Патент РФ на изобретение № 2465576. Опубл. 27.10.2012 г. Бюл. № 30.

Прочие публикации

8. Грязева И.В., Давыдова O.K. Эффекты алкилоксибензолов на устойчивость ДНК к ультрафиолетовому облучению в молекулярных и клеточных системах // Матер. V Всеросс. конф. «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов, 2010. - С. 48.

9. Грязева II.B., Давыдова O.K. Эффекты алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцениваемые с использованием люминесцирующих тест-систем // Матер. VII конф. с междунар. участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2011. - С. 16-18.

10. Грязева II.В., Давыдова O.K. Влияние алкилоксибензолов па экспрессию ряда стрессовых генов, оцененное с использованием репортерпых люминесцирующих тест-систем // Матер. VI Всеросс. конф. «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». - Саратов, 2012. — С.65.

Экспонат на выставке

11. Дерябин Д.Г., Давыдова O.K., Ромапепко H.A., Свиридова Т.Г., Грязева II.В. Технология сохранения функциональных свойств биополимеров для проведения диагностических исследований // V Росс, форум «Российским инновациям -российский капитал». - Нижний Новгород. - 2012.

Лицензия № ЛР020716 от 02.11.98 Формат 60х84 1/и. Бумага офисная. Усл. печ. листов 1,2. Тираж 100 экз.

ИПК ОГУ

460018, г. Оренбург, ГСП, пр. Победы, 13 Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Грязева, Ирина Владимировна, Оренбург

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный университет»

На правах рукописи

04201452142

Грязева Ирина Владимировна

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.м.н., профессор Дерябин Д.Г.

Оренбург-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................5

Глава 1 Обзор литературы. Стрессы у бактерий и механизмы

адаптации к ним..............................................................................................................................................................12

1.1 Стрессы у бактерий..............................................................................................................................................12

1.1.1 Определение стресса, типы стрессоров......................................................................................12

1.1.2 Действие высоких температур............................................................................................................15

1.1.3 Повреждающее воздействие УФ-облучения..........................................................................17

1.1.4 Активные метаболиты кислорода....................................................................................................21

1.2 Механизмы адаптации микроорганизмов....................................................................................25

1.2.1 Уровни организации адаптивных реакций у микроорганизмов............................25

1.2.2 Адаптация к тепловому шоку..............................................................................................................28

1.2.3 5Ш-ответ................................................................................................................................................................31

1.2.4 Адаптация к окислительному стрессу..........................................................................................33

1.3 Роль алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов..........................36

1.3.1 Многообразие алкилкосибензолов - ауторегуляторных ёгфакторов микроорганизмов........................................................................................................................................................36

1.3.2 Адаптогенные функции алкилоксибензолов..........................................................................38

Глава 2. Материалы и методы..........................................................................................................................45

2.1 Объекты исследования..................................................................................................................................45

2.1.1 Химические аналоги алкилкосибензолов - ауторегуляторных 45

ё]-факторов микроорганизмов............................................................

2.2 Методы изучения эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ, индуцируемый воздействием высоких температур......................................................................46

2.2.1 Метод оценки температурной денатурации ферментных белков......................46

2.2.2 Изучение процесса шаперон-независимого рефолдинга ферментрных белков....................................................................................................................................................................................47

2.2.3 Метод исследования индукции синтеза белков теплового шока....................48

2.3 Методы изучения эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ, индуцируемый воздействием УФ-излучения......................................................................................49

2.3.1 Метод изучения чувствительности ДНК к УФ-облучению in vitro......... 49

2.3.2 Метод оценки индукции SOS-ответа............................................... 51

2.4 Методы изучения эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ, индуцируемый окислительным стрессом............................................... 53

2.4.1 Метод исследования прямой антирадикальной активности.................. 53

2.4.2 Метод оценки индукции soxS регулона........................................... 53

2.5 Статистическая обработка экспериментальных данных......................... 54

Глава 3. Исследование эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ бактерий, индуцируемый воздействием высоких температур..................... 56

3.1 Исследование эффектов алкилоксибензолов на процесс температурной денатурации бактериальной люциферазы.............................................. 56

3.2 Изучение влияния алкилоксибензолов на процесс шаперон-независимого рефолдинга бактериальной люциферазы.............................................. 58

3.3 Оценка индукции синтеза белков теплового шока в присутствии алкилоксибензолов с использованием люминесцирующией тест-системы

Escherichia colipibpA'::luxCDABE-AmpR.............................................. 60

Глава 4. Исследование эффектов алкилоксибензолов на стрессовый ответ бактерий, индуцируемый воздействием УФ-излучения.............................. 71

4.1 Изучение влияния алкилоксибензолов на чувствительность ДНК к УФ-облучению in vitro..................................................................... 71

4.2 Разработка способа защиты ДНК от УФ-облучения на этапе детекции результатов гель-электрофореза.......................................................... 74

4.3 Оценка индукции ^О^-ответа в присутствии алкилоксибензолов с использованием люминесцирующией тест-системы E.coli

ргесА'::lwcCDABE-AmpR.................................................................. 80

Глава 5. Исследование эффектов алкилоксибензолов на окислительный стресс у бактерий........................................................................... 94

5.1 Изучение прямой антирадикальной активности алкилоксибензолов...... 94

5.2 Оценка индукции soxS регулона в присутствии алкилоксибензолов с использованием люминесцирующией тест-системы E.coli

psoxS':: IwcCDABE- Amp*.................................................................. 97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................. 108

Список условных сокращений............................................................. 117

ВЫВОДЫ.................................................................................... 118

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ........... 120

ВВЕДЕНИЕ

Существование бактерий в природных экосистемах сопряжено с запрограммированными и ^запрограммированными в цикле их развития стрессами, обусловленными воздействием целого ряда физических, химических и биологических факторов (Баснакьян, 2003). Эти ситуации предопределили возникновение у бактерий разнообразных «активных» и «пассивных» механизмов стрессоустойчивости, обеспечивающих сохранение жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях среды обитания (Ткаченко, 2012).

Важную роль в устойчивости бактерий к стрессорным факторам играют индуцибельные защитные системы, относительно специфично «запускающиеся» в ответ на определенные воздействия и приводящие к активации транскрипции адекватных природе и интенсивности воздействующего фактора групп генов -регулонов, с образованием соответствующих защитных продуктов (Schumann, 2006). В частности, значимой системой, противодействующей воздействию температурного фактора, являются белки теплового шока (БТШ), представленные молекулярными шаперонами и шаперонинами, удерживающими белки от денатурации, а также способствующими восстановлению их структуры в процессе рефолдинга (Smith, 2013). Аналогичным образом устроены система сохранения бактериального генома (^О^-система), активируемая при повреждении ДНК и включающая широкий спектр ферментов ее репарации (Janion, 2008), а также поликомпонентная система защиты бактерий от воздействия активных форм кислорода (Chiang, Schellhorn, 2012).

активизируется стрессорными воздействиями (El-Registan et al., 2005). В свою очередь спектр биологической активности АОБ включает стабилизацию широкого круга биополимеров, включающего белки (Коротина, Крупянский, 2008) и нуклеиновые кислоты (Давыдова и др., 2005), а также реализацию присущей им антиоксидантной активности (Николаев, 2011).Одновременно накапливающиеся данные свидетельствуют о потенциальном участии АОБ в регуляции экспрессии стрессовых регулонов, что может рассматриваться в качестве дополнительного механизма популяционного контроля развития стрессового ответа (Miche et al., 2003; Голод и др., 2009).

Цели и задачи исследования

Целью работы явилось изучение влияния алкилоксибензолов (химических аналогов ауторегуляторных факторов микроорганизмов) на стрессовый ответ бактериальных клеток при различных экстремальных воздействиях, оцененный с использованием специфически индуцируемых люминесцирующих тест-систем.

Для достижения поставленной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

2. Изучить воздействие алкилоксибензолов на чувствительность ДНК к УФ-облучению, а также индуцируемый повреждением ДНК SOS-ответ

бактериальных клеток при подобном воздействии.

3. Оценить соответствие между прямой антирадикальной активностью алкилоксибензолов и их влиянием на индукцию эохБ регулона в условиях окислительного стресса.

Научная новизна

Установлены эффекты АОБ на чувствительность белков к денатурирующему температурному воздействию, выраженность и направленность которых определяются длиной алкильного радикала в их молекулах. Показана протекторная активность короткоцепочечных (СрСз) АОБ, заключающаяся в защите ферментных белков от термоденатурации, частичном повышении эффективности шаперон-независимого рефолдинга, а также сохранении жизнеспособности бактерий при относительно низких уровнях индукции БТШ. С другой стороны, эффект длинноцепочечных (с5-с12) АОБ зависел от их действующих концентраций: в диапазоне 10"6-10"5М они проявляли термопротекторную активность на фоне умеренно выраженной индукции БТШ, в то время как в диапазоне 10"4-10"3М вели к значительному повышению термочувствительности ферментных белков и бактерий с одновременной репрессией синтеза БТШ.

Получены новые данные о прямых фотопротекторных эффектах АОБ при УФ-облучении, заключающихся в предупреждении одно- и двуцепочечных разрывов молекул ДНК. В условиях интенсивного (сублетального) УФ-облучения АОБ в большинстве случаев снижали относительную активность ЗОБ-ответа, тем не менее, повышая выживаемость бактерий при подобном воздействии с одновременным увеличением частоты диссоциативных Б—переходов.

Установлена прямая антирадикальная активность длинноцепочечных гомологов АОБ, функционирующих в качестве «перехватчиков» супероксид-аниона. В свою очередь в клеточной тест-системе эффекты АОБ заключались в умеренно выраженной индукции яохб' регулона, увеличевающейся при использовании их предварительно окисленных продуктов. Следствием этих процессов является предадаптация к окислительному стрессу, проявляющаяся в увеличении относительного количество выживших клеток при более низких уровнях индукции регулона.

Совокупность полученных результатов впервые позволила оценить стереотипность действия АОБ в условиях стрессоров различной природы, заключающуюся в концентрационно-зависимой индукции/ингибировании стрессовых регулонов. При этом низкие концентрации АОБ наиболее типично индуцируют стрессовый ответ бактериальных клеток, что характеризует их как «алармоны» (сигналы тревоги), предадаптирующие бактериальные клетки к последующему воздействию экстремальных физических и химических факторов. В свою очередь высокие концентрации АОБ преимущественно ведут к репрессии стрессового ответа, тем не менее, сохраняя жизнеспособность бактериальных клеток за счет непосредственной стабилизации входящих в них биополимеров.

Теоретическая и практическая значимость

Обнаруженные прямые термо-, фотопротекторные и антиоксидантные эффекты АОБ определяют перспективу их использования в качестве стабилизаторов функциональных биополимеров на этапах выделения и длительного хранения. В частности, выявленный в рамках настоящей работы выраженный фотопротекторный эффект Сб-АОБ положен в основу «Способа защиты ДНК от ультрафиолетового излучения при детекции результатов гель-электрофореза» (патент РФ на изобретение № 2465576 от 27.10.2012 г.), ориентированного на защиту структурной целостности и функциональной активности данного биополимера при УФ-детекции в агарозных гелях.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Алкилоксибензолы (преимущественно их длинноцепочечные гомологи) защищают бактериальные клетки от сублетального действия УФ-излучения, что при подавлении экспрессии ЗОЯ- ответа реализуется через прямые фотопротекторные эффекты в отношении ДНК.

3. Алкилоксибензолы проявляют способность выступать в качестве перехватчиков супероксид аниона, что прогрессирует с увеличением длины алкильного радикала. В клеточной системе АОБ (особенно их предварительно окисленные продукты) индуцируют экспрессию 5охБ регулона. Результатом сочетанной активности АОБ является защита бактериальных клеток от окислительного стресса.

Связь автора с выполнением научных программ и собственный вклад

автора

Исследования выполнены в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК №П327 «Использование люминесцирующих клеточных тест-систем при оценке механизмов активности бактерицидных и бактериорегуляторных молекул»); Государственного задания на выполнение НИР №4.2312.2011 «Исследование эффектов бактериальных ауторегуляторов (алкилоксибензолов и гомосеринлактонов) в гомологичных и гетерологичных системах», а также при поддержке гранта Оренбургской области для аспирантов в сфере научной и научно-технической деятельности «Протекторные свойства акилоксибензолов природного и растительного происхождения в условиях окислительного и УФ-радиационного стресса».

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 1 статья в зарубежном издании;

получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссерт�

Информация о работе

Грязева, Ирина Владимировна
кандидата биологических наук
Оренбург, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Влияние алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцененные с использованием люминесцирующих тест-систем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Влияние алкилоксибензолов на стрессовые реакции бактериальных клеток, оцененные с использованием люминесцирующих тест-систем - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы