Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий

Мулюкин, Андрей Львович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий"

На правах рукописи

'С

4845979

МУЛЮКИН Андрей Львович

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИИ: СВОЙСТВА, РАЗНООБРАЗИЕ, ДИАГНОСТИКА

Специальность: 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

МОСКВА-2010

4845979

Работа выполнена в лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Учреждения Российской Академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор

Галина Ивановна Эль-Регистан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ доктор биологических наук доктор биологических наук

Елена Петровна Феофилова Ольга Ивановна Баулина Наталья Дмитриевна Новикова

Ведущая организация:

Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук (ИЭГМ УрО РАН)

Защита диссертации состоится 01 ноября 2010 г. в 1400 на заседании Диссертационного совета Д.002.224.01 при Учреждении Российской Академии наук Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по адресу: 117312 Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской Академии наук Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Автореферат диссертации разослан «Щ> сентября 2010 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д. 7, корп. 2, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Ученому секретарю диссертационного совета к.б.н. Т.В. Хижняк или по факсу: (499) 135 65 30.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук , Т.В. Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы и состояние вопроса. При изменении условий окружающей среды - исчерпании питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей, происходит или снижение скорости роста микроорганизмов, или стратегия роста заменяется стратегией переживания и перехода в состояние покоя. Начало исследований покоящегося состояния у микроорганизмов положили работы Ф. Кона и Р. Коха, описавших в 1876 г. эндоспоры бацилл. Наибольшую интенсивность и разносторонность изучение форм и механизмов покоя приобрело в середине XX века в рамках отдельного направления микробиологии. В настоящее время интерес к явлению покоя обусловлен явлением персистенции возбудителя туберкулеза [Wayne, 1994; Zhang, 2004] и других заболеваний [Watson et al., 1998; Бухарин и соавт. 2005], феноменом существования антибиотикоустойчивых клеток-персисторов [Keren et al. 2004, Lewis, 2007] и, наконец, обнаружением древних микроорганизмов [Cano, Borucky, 1995; Vreeland et al. 2000], в том числе, в глубокомерзлых породах [Звягинцев и соавт., 1985]. Отметим, что для большинства видов неспорообразующих бактерий покоящиеся формы неизвестны, что определило актуальность диссертационной работы.

Множество публикаций посвящено жизнеспособному некультивируемому (ЖНК) состоянию бактерий, в котором клетки, сохраняя потенциальную жизнеспособность, утрачивают способность образовывать колонии в стандартных условиях [Xu et al., 1982; Colwell et al., 1985; Oliver et al., 1993; Mukamolova et al., 1995; Oliver, 2005; Sachidanandham, Yew-Hoong Gin, 2009]. Несмотря на дискуссии по поводу адекватности этого термина состоянию неделения и сохранения клетками жизнеспособности [Bloomfield et al. 1998; Головлев, 1998; Barer, Har-wood, 1999], не вызывает сомнений существование самого явления и важность его исследований в связи с мониторингом патогенных и условно-патогенных бактерий в природных местах обитания. ЖНК-состояние рассматривают и как форму покоя [Kaprelyants et al., 1993; Rahman et al., 1996], и как стадию на пути к отмиранию популяции [Joux et al., 1997; McDougald et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что пребыванием клеток в таком состоянии нельзя объяснить длительное выживание бактерий в неростовых условиях [Bogosian et al., 1996].

Облигатное свойство всех бактерий формировать в циклах развития их культур покоящиеся «микроцисты», предназначенные для выживания вида, постулировалось Биссетом [Bisset, 1952]. Экспериментальные доказательства справедливости этой гипотезы - образование клеток цистоподобного типа, были получены позже для узкого круга микроорганизмов [Дуда и соавт., 1982; Sadasivan, Neyra, 1987; Бабусенко и соавт., 1991; Garduño et al., 2002; Berleman, Bauer, 2004]. При описании новых таксонов ряда неспорообразующих прокариот отмечалось

образование клеток, схожих по строению с цистами [Горленко и соавт., 1976; Жи-

лина, Заварзин, 1979; Heulin et al., 2003; Zhang et al., 2003; Zhilina et al., 2004; Ahmed et al., 2007]. При этом в работах таксономической направленности не исследовали их свойства как форм, предназначенных для длительного переживания вида. Отсутствие информации о покоящихся формах неспорообразующих бактерий обусловлено, во многом, отсутствием сведений об условиях, оптимальных для их образования в лабораторных культурах. При этом без достаточного количества покоящихся клеток невозможно исследование их свойств. Следует отметить, что трактовка термина «покой» для неспорообразующих бактериям широка и охватывает: (1) клетки культур стационарной фазы [Vulic, Kolter, 2001]; (2) некультиви-руемые формы [Roszak, Colwell, 1987; Kaprelyants et al., 1993]; (3) неактивные клетки в биопленках [Costerton et al., 1999; Xu et al., 1998]; (4) антибиотико-устойчивые персисторы [Shah et al., 2006]; (5) вышеупомянутые клетки цистопо-добного типа. Это не тождественные состояния пролиферативного и метаболического покоя. Основанием для отнесения клеток к покоящимся формам прокариот является доказательство: 1) длительного сохранения их способности к репродукции; 2) резко сниженной или экспериментально не выявляемой метаболической активности; 3) повышенной устойчивости к повреждающим воздействиям; 4) отличий в ультраструктурной организации от вегетативных (делящихся и стационарных) клеток; 5) их образования в циклах развития культур - в соответствии с определением, принятым в литературе по спорам [Sudo, Dworkin, 1973; Cross, Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977].

Другой важной проблемой при изучении способов выживания микроорганизмов в природе в неростовых условиях является выяснение закономерностей и регуляции образования покоящихся форм. К настоящему времени накоплен обширный материал о сигнальных метаболитах и регуляторных системах, контролирующих многие процессы в циклах развития микробных популяций, такие как длительность лаг-фазы, споро- и антибиотикообразование, реактивацию некуль-тивируемых клеток микрококков и др. [Хохлов, 1988; Fuqua et al., 1994; Олескин и соавт., 2000; Lazazzera, 2000; DeLisa, Bentley, 2002; Mukamolova et al., 1998; 2006]. Описаны плотностные ауторегуляторы - ацилированные гомосеринлактоны (ГСЛ) у ряда грамотрицательных бактерий, которые в зависимости от клеточной плотности популяции контролируют индукцию ряда синтезов в стационарной фазе [Fuqua et al., 1994; Greenberg et al., 1996; Taga, Bassler, 2005]. Участие этих факторов в регуляции состояния покоя неизвестно. Регуляторы другого типа - факторы d|, представленные у ряда бактерий алкилоксибензолами (АОБ), имеют функции аутоиндукторов анабиоза [Эль-Регистан и соавт., 1979; 1980; Светличный и соавт., 1986; Осипов и соавт., 1985; Батраков и соавт., 1993; Лойко и соавт., 2002]. Безусловную важность представляет дальнейшее развитие исследований регуляции образования покоящихся форм у широкого круга микроорганизмов, осущест-

вляющейся с участием коммуникативных факторов из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, а также изучение их видо(не)специфичности и функциональной роли в переходе клеток в состояние покоя и выходе из него.

Таким образом, изучение способов и форм покоя у неспорообразующих бактерий представляет фундаментальный и практический интерес для микробной экологии, медицины, биотехнологии.

Цель работы - изучить способы выживания неспорообразующих бактерий в неростовых условиях: морфотипы покоя, условия и регуляцию образования и характеристики покоящихся клеток.

В настоящей работе были поставлены следующие задачи:

(1) выявить условия, способствующие образованию цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий в циклах развития их культур;

(2) охарактеризовать ЦПК как формы покоя по показателям: длительности сохранения пролиферативного потенциала; отсутствия метаболической активности; устойчивости к повреждающим воздействиям; особенностям ультраструктурной организации;

(3) охарактеризовать внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм по морфологическим типам, способности ревертировать к росту, степени глубины покоя, устойчивости к повреждающим воздействиям, фе-нотипической диссоциации при прорастании;

(4) изучить роль внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов в контроле перехода бактерий в состояние покоя и его поддержании;

(5) разработать подходы к диагностике покоящихся форм бактерий в лабораторных культурах и природных образцах.

Научная новизна и значимость работы. Для широкого круга неспорообразующих грамположительных и грамотрицательных бактерий доказано, что при их росте в различных условиях цикл развития культур завершается образованием цистоподобных клеток (ЦПК), обладающих всеми признаками покоящихся форм прокариот. Для массового образования ЦПК в лабораторных культурах разработаны воспроизводимые условия, имитирующие природные. Эти условия принципиально применимы для получения покоящихся форм бактерий других таксонов с учетом специфики их ростовых потребностей.

Впервые показано внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий. Внутривидовое разнообразие проявляется как полиморфизм покоящихся форм и зависит от условий их образования. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся клеток определенного морфотипа выражается в их разнокачественности по устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия прорастания и потребности в специальных процедурах реактивации. Показаны различия в способности покоящихся клеток разных типов к фе-

нотипической диссоциации. Расширены представления о функциях плотностных ауторегуляторов в процессах образования покоящихся форм. Продемонстрировано видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных ал-килоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не прорастающих на плотных средах («некультивируемых») клеток и 3) нежизнеспособных микромумий. Показана принципиально сходная и видонеспецифичная функция алки-локсибензолов и неацилированного гомосеринлактона в ограничении роста численности клеток популяции и смене стадий развития бактериальных культур.

Для повышения эффективности экологического мониторинга разработаны диагностические критерии обнаружения ЦПК в природных образцах in situ, в том числе глубокомерзлых осадках. Критерии основаны на учете особенностей ультраструктурной организации покоящихся форм и соотношения в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Для покоящихся форм, не образующих колонии на обычных средах, применены разные методы учета и приемы выявления жизнеспособных клеток за счет варьирования состава сред для снятия эффекта субстрат-ускоренной смерти и защиты от окислительного стресса. Показана возможность повышения чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) как источников матриц ДНК.

Постулируется, что внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий обеспечивает длительное, не сопоставимое со временем генерации клеток, выживание вида в природе при неблагоприятных для роста условиях и его расселение при наступлении ситуаций, предусматривающих возможность реверсии к росту.

Практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для: 1) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов; 2) разработки способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов; 3) повышения эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга окружающей среды за счет учета покоящихся и не прорастающих на плотных средах клеток. Цистоподобные покоящиеся клетки сапротрофных аналогов патогенных бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов (АОБ) испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде 2 заявок на патенты РФ. Личный вклад соискателя состоял в планировании и проведении исследований, разработке новых экспериментальных подходов, анализе полученных результатов и их оформлении для опубликования. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора состоял в непосредственном участии в определенных или всех эта-

пах исследования - от постановки задач и проведения экспериментов до обсуждения полученных данных и подготовки их к опубликованию. Апробация работы. Устные и стендовые сообщения на конференциях: Frontiers of Life (Блуа, Франция, 2000); GeoExtreme Workshop (Тремити, Италия, 2001); Bacterial Paleontology/Astrobiology (Москва, 2002); Second European Workshop on Exo/Astrobiology (Грац, Австрия, 2002); European Geophysical Society (Ницца, Франция, 2003); 1st и 2nd FEMS Congress European microbiologists (Любляна, Словения, 2003; Мадрид, Испания, 2006); 35th Scientific Assembly COSPAR (Париж, 2004); Российско-французском семинаре «Восток 2005» (Репино); Open Science Conference SCAR-IASC-IPY (СПБ, 2008); «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007), «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (МГУ 2006; 2009). Публикации: 74 работы: 37 экспериментальных статей, 2 обзора (38 в списке журналов ВАК), 3 главы в монографиях, 5 работ в материалах научных мероприятий, 2 заявки на патент, 26 тезисов докладов.

Место проведения работы. Работа проводилась с 1994 по 2009 гг. в лаб. классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН по плановым темам (№ гос/рег. 01200213054; 01200213058; 01200601980) при поддержке РФФИ (гранты 99-04-49144, 01-0448771, 02-04-49150, 03-04-48403, 04-04-49710, 05-04-49520, 06-08-01469, 07-0401011; 07-04-12121офи). Ряд исследований проведен в ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, ИНБИ им. А.Н. Баха РАН, МГУ им. М.В. Ломоносова, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Университете им. М.Лютера (Халле-Витгенберг, Германия), ФГУП Гос-НИИОХТ, МИРЭА, КазНЦ РАН и Латвийском университете (Рига). Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность проф. Г.И. Эль-Регистан и чл.-корр. РАН В.Ф. Гальченко за постоянное внимание и поддержку. Искреннюю признательность за многолетнюю совместную работу выражаю сотрудникам ИНМИ РАН: А.Н. Козловой, Ю.А. Николаеву, Н.Г. Лойко, Е.В. Дем-киной, С.Н. Филипповой, Е.В. Менько, В.В. Сорокину, И.А. Цаплиной, Т.И. Богдановой. За плодотворное и длительное сотрудничество выражаю особую признательность к.б.н. Н.Е. Сузиной и проф., В.И. Дуде (ИБФМ РАН), к.б.н. В.Н. Да-нилевичу (ИБХ РАН). Автор благодарен проф. Л.И. Воробьевой, B.C. Соиной и Е.А. Воробьевой (МГУ), проф. A.C. Капрельянцу (ИНБИ РАН), д.б.н. Л.П. Анто-нюк (ИФБРМ РАН), Н.Б. Стражевской и проф. Р.И. Жданову (НИИ общей патологии и патофизиологии), проф. В.П. Тычинскому (МИРЭА), Ю.В. Гоголеву (КазНЦ РАН), H.A. Тилькуновой и Д.Ю. Залепугину (ГосНИИОХТ), Ю.Н. Трофимовой (Латвийский университет) за совместные исследования. Выражаю при-

знательность д.г.-м.н. Д.А. Гиличинскому (ИБиФХПП РАН) за образцы вечно-мерзлых пород. Благодарю всех соавторов публикаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 349 страницах текста и включает 86 рисунков и 51 таблицу; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы (100 русских и 628 иностранных наименований). Основные защищаемые положения:

1. Широкому кругу неспорообразующих бактерий свойственен переход в состояние эндогенного покоя, являющегося необходимой стадией в циклах развития их культур. Его формой являются цистоподобные покоящиеся клетки (ЦПК), обладающие всеми признаками покоящихся форм прокариот.

2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм проявляется как образование ЦПК разных типов при развитии микробной популяции (культуры) в различных условиях ее роста и является важным эволюционно приобретенным свойством для длительного выживания вида.

3. Популяции покоящихся форм гетерогенны по показателям их устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия роста, потребности в процедурах реактивации и популяционному спектру в новом цикле развития.

4. Покоящиеся формы бактерий можно выявлять по их диагностическим критериям прямыми микроскопическими методами, более полно учитывать культу-ральными методами и использовать в ПЦР.

5. Процессы приобретения, развития и поддержания состояния покоя контролируются внеклеточными видонеспецифичными низкомолекулярными авторегуляторами, представленными у ряда бактерий моно- и диалкилоксибензолами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований

Объекты исследований. Штаммы бактерий из коллекций ВКМ, NCIMB, каф. микробиологии биологического ф-та МГУ и ИБФРМ РАН: 1) спорообра-зующие Bacillus cereus штамм В-504 (ВКМ), В. subtilis В-720 (ВКМ), В licheniformis (промышленный штамм 103), Sulfobacillus thermosulfidooxidans В-1269 (ВКМ), Alicyclobacillus tolerans В-2304 (ВКМ); 2) грамположительные не-спорообразующие: Arthrobacter globiformis В-1112 (ВКМ), Lactobacillus plantarum (промышленный штамм), Micrococcus luteus NCIMB 13267, Mycobacterium smeg-matis mc2 155, Mycobacterium phlei K-4140, Staphylococcus aureus 209-P, Rhodococ-cus rhodochrous K-3285; 3) грамотрицательные неспорообразующие Azospirülum brasilense Sp7 и Sp245, Erwinia carotovora (подвид atroseptica SCRI1043), Escherichia coli M-17, Pseudomonas aurantiaca B-1558 (BKM), P.fluorescens NCIMB-9046 и цистообразующие Azotobacter vinelandii B-1617 (BKM); 4) экстремально

галофильная архея Natrinema pallidum K-l; 5) дрожжи Saccharomyces cerevisiae 380 (ВКМ). Состав питательных сред и условия культивирования бактерий для получения цистоподобных покоящихся клеток (ЦПЮ рассмотрены в главе 2. Природные объекты представлены: 1) грунтами и почвами (возрастом до 2 млн. лет) зон вечной мерзлоты Восточной Сибири; 2) мерзлым фунтом (170 тыс. лет) Антарктического р-на Сухих Долин, любезно предоставленными д.г-м.н. Д.А. Ги-личинским (ИБФХПП РАН, Пущино); 3) пылевым наносом внутреннего помещения. Химическими аналогами факторов di бактерий были алкилоксибензолы С7-АОБ и С12-АОБ (Sigma); факторов с1г — олеиновая кислота; кворум-сенсорных факторов - гомосеринлактон (Sigma).

Микробиологические методы. Жизнеспособность клеток определяли по: 1) численности колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) при посевах клеточных суспензий на агаризованные среды; 2) числу микроколоний (мКОЕ/мл), образующихся в полужидких средах; 3) наиболее вероятному числу клеток (НВЧК/мл), способных к росту в жидких средах и определяемых методом предельных разведений (МПР). Приемы реактивации покоящихся клеток включали: 1) двукратную отмывку клеток от инкубационной среды в дистиллированной воде или растворе 0.1 M КН2Р04 (pH 7.4); 2) инкубацию клеток с лизоцимом (1 и 10 мкг/мл; 28°С; 45 мин); 3) инкубацию клеток с внеклеточным реактивирующим фактором (РФ) Luteococcus casei [Воробьева и соавт., 2003]; 4) внесение в плотные среды пиру-вата натрия (0.1% в/об) [Mizunoe et al., 1999; Bogosian et al., 2000]; 5) использование полноценных по составу, но разбавленных (в 2-5 раз) сред, а также полужидкого агара (0.25% в/об). Устойчивость клеток к повреждающим воздействиям (теплового шока, окислителей, осмотического стресса, у-облучения, токсикантов, лизоцима, антибиотиков) определяли по сохранению жизнеспособности или изменениям ростовых характеристик. Индекс диссоциации популяций определяли как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний. Для выделения диссоциантов и изучения их признаков использовали метод многократных пассажей [Кузнецов, 1972].

Микроскопические наблюдения проводили с помощью микроскопов Zetopan (Австрия), МБИ-15 У42 (Россия), Axioplan (Carl Zeiss, Германия) и Eclipse Е4000 (Nicon, Japan). В качестве флюорохромов использовали: ДНК-связывающие красители - Live/Dead Baclight kit® L-13152 (Molecular Probes); ио-дистый пропидий (3 мкМ); маркер на дыхательную активность - тетразолиевый краситель СТС (1-3 мкМ); маркер на липидные включения - Nile red (4 мкг/мл). Для электронно-микроскопических исследований клетки фиксировали, обезвоживали и заливали смесью эпоксидных смол. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция) и просматривали на микроскопе JEM-100В (Япония). Динамическую фазовую микроскопию проводили с использованием коге-

рентного фазового микроскопа Эйрискан с регистрацией Ah - максимальной фазовой толщины (ФТ) клетки, и d-ее диаметра [Tychinsky et al., 1997; Weiss et al., 1999]. Рентгеновский микроанализ элементного состава клеток осуществляли с помощью микроскопа JEM-100CXII (JEOL, Япония) со сканирующей приставкой EM-ASID4D, рентгеновским микроанализатором LINK-860 и детектором Е5423 (Link-System, Англия). Рентгеновские спектры получали для 30 объектов при 3-5 измерениях в каждом и преобразовывали с помощью программы ZAF/PB-LINK-Systems в массивы данных по величинам площади пика элемента и соотношения площади пика к фону. Для атомно-силовой микроскопии использовали микроскоп Asylum Research (MFP-3D-Bio, Канада) и зонды Olympus (18-21 nN/nm, 358360 КГц) в полуконтактном режиме [http://ntmdt.com]. Цитометрические исследования с регистрацией распределения клеток по интенсивности флуоресценции и светорассеянию (размеру) проводили на приборе FACS Calibur system (Becton Dickinson) с обработкой данных программой WinMDI 2.8.

Биохимические методы. Для выделения и очистки ауторегуляторных факторов di использовали методы экстракции, колоночной и тонкослойной хроматографии; биологическую активность фракций оценивали в биотестах [Эль-Регистан и соавт., 1981]. Алкилоксибензолы (АОБ) в составе фактора d( количественно определяли с реактивом FBB (Sigma) [Tluscik et al., 1981]. Структуру АОБ определяли методом ГХ/МС (квадрупольный хроматомасс-спектрометр FISONS TRIO 1000) при использовании библиотеки масс-спектров NIST 2.0. Надмолекулярные комплексы ДНК (НК ДНК) выделяли из клеток бактерий мягким фенольным [Стручков, 1962] и детергент-фенольным [Stonington et al., 1971; Sueoka, Hammers, 1974] методами. Эластовязкость растворов НК ДНК определяли по методу [Стручков, Стражевская, 1986]. Содержание ДНК определяли спектрофотометри-чески [Спирин, 1958]. Клеточные липиды выделяли методом [Bligh, Dyer, 1959], содержание фосфора в составе фосфолипидов определяли микрометодом Бартле-та [Кейтс, 1975]. Неполярные липиды микобактерий экстрагировали по методикам [Parish, Stoker, 1998]. Фракции ДНК-связанных липидов выделяли из НК ДНК двустадийно с включением стадии обработки ДНКазой I [Стручков, Стражевская, 1993]. Метиловые эфиры жирных кислот (МЭЖК) анализировали методом ГХ/МС. Активности ферментов определяли стандартными спектрофотометриче-скими методами (Specord UV VIS, Германия). Эндогенное дыхание клеток определяли полярографически [Шольц, Островский, 1975]. О метаболической активности клеток судили по интенсивности включения радиоактивно-меченых предшественников нуклеиновых кислот и белков - [3Н]- урацила и [3Н] L-аспарагина. В блоке молекулярно-генетических исследований применены усовершенствованные методы получения ДНК-матриц из вегетативных клеток и покоящихся форм.

Биомассу кипятили в буфере D с солями-хаотропами (4 М гуанидинийтиоцианат,

25 мМ цитрат натрия, pH 7.0, 0.1 М ß-меркаптоэтанол, 0.5% саркозил) (одностадийная обработка) и после отмывки инкубировали с протеиназой К (100 мкг/мл) 2 час при 37 °С (двустадийная обработка) [Данилевич, Гришин, 2002; Данилевич и соавт., 2007]. В ПЦР использовали универсальные праймеры 27f и 1522г на ген 16S рРНК и подобранные ген-специфичные праймеры: bc-clsAB-f и bc-clsAB-r (B.cereus); Saur-dnaA-f и Saur-dnaA-r (S.aureus); Msmeg-sigF-f и Msmeg-sigF-r, Msmeg-gyrA-f и Msmeg-gyrA-r (M.smegmatis).

Статистический анализ проводили методами расчета среднеквадратичного отклонения внутри группы данных, /-теста Стьюдента и вычисления корреляции двух групп данных; критерий вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы между ними. Минимальная повторность измерений в экспериментах 3-кратная, максимальная -11-кратная.

РЕЗУЛЬТАТЫ Глава 1. Свойства цистоподобных покоящихся форм

Объекты исследования были представлены родами гетеротрофных мезо-фильных грамположительных и грамотрицательных неспорообразующих бактерий (pp. Micrococcus, Arthrobacter, Rhodococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Azospirillum и др.), важных для биотехнологии, клинических исследований и экологии. Другими объектами послужили бациллы Bacillus cereus и В. subtilis, развивающиеся в условиях, когда спорообразующий фенотип не проявлялся. Для выявления и характеристики покоящихся форм неспорообразующих бактерий были разработаны специальные условия, которые обеспечивали массовое образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) в циклах развития микробных культур. ЦПК были свойственны: 1) отличия в морфологии и ультраструктурной организации от вегетативных клеток; 2) длительное сохранение способности к репродукции; 3) резко сниженная или экспериментально не выявляемая метаболическая активность; 4) повышенная устойчивость к повреждающим воздействиям; 5) образование в циклах развития культур, что рассматривается ниже. Совокупность этих характеристик являлась необходимой для отнесения ЦПК к покоящимся формам прокариот.

1.1. Особенности морфологии и ультраструктурной организации. В постстационарных культурах бактерий, выращенных в периодическом режиме при соответствующих модификациях условий культивирования, часть клеток автоли-зировалась, а оставшиеся интактными приобретали повышенную степень светопреломления (рефрактерность) по сравнению с вегетативными клетками (рис. 1). Степень рефрактерности была высокой у покоящихся клеток микрококков, азос-пирилл, родококков и др., аналогично спорам и цистам некоторых бактерий. Особенностями ультраструктурной организации исследуемых покоящихся форм, от-

дичающими их от предшествующих вегетативных клеток, являлись: 1) усложнение и утолщение клеточных оболочек; 2) неоднородность текстуры цитоплазмы;

3) появление электронопрозрачных включений полиалканатов (у ряда бактерий);

4) конденсация и компактизация нуклеоида; 5) отсутствие признаков деления (рис. 2).

и к л м

Рис. 1. Вид клеток в фазово-контрастном микроскопе: (а) вегетативные клетки (ВК) и (б) ЦПК М. luteus; (в) ВК и (г) ЦПК P. aurantiaca; (д) ВК и (е) ЦПК М. phlev, (ж) ВК и (з) ЦПК М. smegmatis. Вид ЦПК: (и) В. cereus; (к) В. subtilis; (л) A. brasilense; (м) A. globiformis. Масштабные метки: (г, к) 2 мкм, остальные - 10 мкм

Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий контрастно отличались по своему строению и способу образования от эндоспор, которые формируются внутри клетки-спорангия и обладают специфическими структурами: многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней споровыми мембранами, располагающимся между ними кортексом, зачаточной клеточной стенкой и сердцевиной - споровым протопластом [Fitz-James, Young, 1969; Дуда, 1982; Driks, Setlow, 2000]. В структурном отношении исследуемые покоящиеся формы были отличны также от экзоспор стрептомицетов [Калакуцкий, Агре, 1977; Chater, 1984; Flärdh, Buttner, 2009], миксоспор миксобактерий [Dworkin, Gibson, 1964], акинет цианобактерий [Nichols, Carr, 1978]. По признаку наличия утолщенных и дифференцированных клеточных стенок выявленные формы покоя у грамполо-жительных бактерий Arthrobacter globiformis, Rhodococcus rhodochrous, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium phlei и др. (рис. 2) оказались сходными с цистами

азотобактера и родоспирилл | \Vyss е1 а1., 1961; Sadoff, 1975; Вег1етап, Ваиег, 2004].

Рис. 2. Ультратонкие срезы: (а) вегетативных клеток (ВК) и (б) ЦПК Асегеад; (в) ВК и (г) ЦПК типа цист А.ЬгсиЦеюе; (д) ВК и (е) ЦПК М. smegmatis; (ж) ВК и (з) ЦПК Ь.р1апшгит; (и) ВК и (к) ЦПК Е. соИ. ЦПК: (л) М. рЫег, (м) Я.г/юг/осЛгог«; (н) Л^/обг/огти. Длина масштабной метки: (в, т) - 300 нм; (ж, з) - 500 нм; остальных - 1 мкм.

Однако типичные цисты АхоюЬасЛег \inelandii обладают структурно дифференцированной многослойной оболочкой, состоящей из внутренних покровов (интины), клеточной стенки грамотрицательного типа и внешних покровов (экзины), а также обширными электронопрозрачными включениями полиоксибутирата. У исследуемых покоящихся форм бактерий (за исключением АгояртПит Ьгаъйете) слои,

подобные интине и экзине, отсутствовали (рис. 2). Многослойность клеточных оболочек и их сильно выраженное утолщение были характерны для покоящихся форм грамположительных бактерий A.globiformis, М. smegmatis, М. phlei, R.rhodochrous и др. (рис. 2). Наличие включений полиалканатов, характерных как для цист азотобактера, так и для «липидных» и «незрелых» цист ряда фотосинте-зирующих и метанотрофных бактерий [Whittenbury et al., 1970; Горленко и соавт., 1976; Гальченко, 2001], не являлось облигатным у исследуемых форм покоя.

Структурные трансформации при переходе вегетативных клеток неспоро-образующих бактерий в покоящееся состояние носят комплексный характер (рис. 2), что свидетельствует о реализации программ цитодифференцировки. Доказательством этого явилось отсутствие образования жизнеспособных покоящихся форм М. luteus в культурах, хранившихся в атмосфере аргона (без 02), что препятствовало метаболическим процессам (энергетическим и конструктивным), обеспечивающим построение многослойных и дифференцированных оболочек.

Поэтому, как по особенностям ультратонкого строения, так и способу образования, формы покоя исследуемых грамположительных и грамотрицательных бактерий было предложено вынести в отдельную категорию с обозначением их как цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК).

С привлечением других микроскопических методов были выявлены некоторые другие особенности строения ЦПК. В отличие от вегетативных клеток они обладали бугристым рельефом клеточной поверхности и наличием участков с высокой плотностью вещества, составляющего наружные клеточные покровы (данные атомно-силовой микроскопии АСМ). Сохранение барьерной функции клеточных мембран ЦПК было выявлено в реакции клеток на прокрашивание красителем Live/Dead. Однако характер флуоресценции у ЦПК М. luteus, A.globiformis, A.brasilense, P. aurantiaca и др. был переходным (желто-зеленое и желтое свечение или его отсутствие) и отличался от живых (ярко-зеленых) и мертвых (красных) клеток в культурах стационарной фазы. Изменение у ЦПК характера флуоресценции с красителем Live/Dead, по-видимому, было обусловлено особенностями организации цитоплазматической мембраны, утолщением клеточных оболочек и появлением капсульного слоя. Характеристики структуры ЦПК бактерий, существенные для выживания, суммированы в таблице 1.

1.2. Длительность сохранения колониеобразуюшей способности (от 1.5 мес до 3 лет) была показана для пост-стационарных культур или клеточных суспензий всех исследуемых бактерий A. globiformis, М. luteus, М. phlei, R. rhodochrous, P. fluorescens, P. aurantiaca, A. brasilense (табл. 2) и др., в которых доля ЦПК составляла 45-80% от общего числа интактных клеток (по данным микроскопических просмотров).

Характеристики ЦПК Связь с покоящимся состоянием

Наличие капсульных слоев Дополнительный защитный слой; матрикс для сорбции ор-ганоминеральных частиц, повышающих защиту клетки in situ; коммуникативная структура для передачи сигналов к развитию и поддержанию покоя и выходу из него.

Утолщенная и слоистая клеточная стенка Обеспечение устойчивости к термообработке, действию ли-тических ферментов и другим повреждающим физическим, химическим и биологическим факторам.

Измененное состояние клеточных мембран Обратимая инактивация мембраносвязанных ферментов (в т.ч., электрон-транспортной цепи); изменение проницаемости мембран для моновалентных ионов и обезвоживание клетки.

Измененная структура цитоплазмы Уменьшение числа рибосом или их агрегация, что обеспечивает обратимую инактивацию метаболизма

Компактизация нуклеоида Обратимое прекращение репликации и транскрипции; обеспечение устойчивости генетического материала к повреждающим воздействиям;

Наличие включений Резервный материал, утилизируемый при прорастании.

Таблица 2. Сохранение способности ЦПК к образованию колоний

Вид Модификации сред Срок инкубации, мес Численность КОЕ/мл (% КОЕ в культурах стационарной фазы)

М. luteus 10-кратный лимит N 9 1.5 -Ю'ЧН).

A. globiformis 5х лимит С и 4х лимит N 4 3.6 -10s (48)

М. smegmatis 5х лимитЫ 5 3.7 • 105(1)

М. phlei 5х лимит Р 9 1.8 -10' (35)

R. rhodochrous 5х лимитЫ 9 3.6 10' (65)

P. aurantiaca 2х лимит N 6 3.0 -10' (20)

P.fluorescens 2х лимитЫ 6 7- 106 (7)

Способность к образованию колоний на плотных средах явилась важным критерием для разграничения ЦПК и жизнеспособных некультивируемых клеток бактерий. Отметим, что учет покоящихся форм по численности КОЕ на богатых плотных средах обусловливало недооценку числа способных к пролиферации клеток, возрастающую по мере хранения культур ЦПК. Например, число ЦПК микрококков, артробактерий и псевдомонад, образовавшихся в условиях длительного голодания (4-6 мес), практически не изменялось, о чем судили по доле ин-тактных рефрактерных клеток, морфологически отличных от вегетативных и ав-толизированных клеток и легко диагностируемых при просмотрах в светооптиче-

ском микроскопе, а также при анализе ультратонкого строения по данным электронной микроскопии. При этом колониеобразующая способность снижалась. Для более полного выявления числа жизнеспособных, но не дающих колонии клеток была рекомендована комбинация разных методов учета их численности (МПР, мКОЕ) при варьировании состава сред для прорастания. Так, при низком титре КОЕ (1%, табл. 2) в 5-мес культурах микобактерий М. smegmatis, содержавших ЦПК, численность клеток, способных к реверсии роста в жидкой среде, оказалась на 2 порядка выше и составила 6-107 кл/мл. Свойство покоящихся популяций сохранять пролиферативный потенциал в течение времени (1.5 мес до 3 лет), не сопоставимого по длительности со временем генерации клеток, было показано для ЦПК всех исследуемых бактерий.

1.3. Об экспериментально не выявляемом уровне метаболизма у ЦПК не-спорообразующих бактерий свидетельствовало отсутствие дыхательной активности (рис. За, линия 1). Доказательства ингибирования дыхательных процессов у ЦПК аэробных бактерий М. smegmatis, М. luteus, S. aureus были получены также в микроскопических тестах с тетразолиевым красителем СТС: ЦПК не давали ярко-красного свечения, характерного для метаболически активных клеток. Об инги-бировании биосинтетических активностей (у ЦПК М. smegmatis) также судили по отсутствию включения в клетки меченых предшественников нуклеиновых кислот - [3Н] урацила, и белков - [3Н] L-аспарагина. После перенесения отмытых ЦПК в свежую среду восстанавливались дыхательные процессы и включение меченых предшественников биополимеров. Полученные данные свидетельствовали об обратимом торможении метаболической активности у исследуемых форм покоя.

О различиях между делящимися и покоящимися клетками B.cereus и М. luteus также судили по различиям в содержании ряда биогенных элементов и их соотношениях. которые определяли методом рентгеновского микроанализа. Покоящиеся клетки бацилл (эндоспоры и ЦПК) отличались от клеток стационарной фазы и в еще большей степени от делящихся клеток повышенным содержанием Са и сниженным уровнем К. Отличительными признаками покоящихся форм было низкое соотношение P/S и высокое - Са/К (табл. 3), что, по-видимому, отражает изменения ионного гомеостаза, снижение пула АТФ и деградацию РНК при переходе клеток в состояние покоя. Наличие сниженного, но выявляемого уровня калия у ЦПК свидетельствовало о сохранении у них барьерной и изменении транспортной функции цитоплазматических мембран.

1.4. С состоянием пролиферативного и метаболического покоя была сопряжена повышенная устойчивость ЦПК к действию повреждающих факторов, прежде всего, их терморезистентность. Так, у ЦПК М. luteus, прогретых при 80 °С, 10 мин, численность КОЕ снизилась на 2 порядка, тогда как у вегетативных клеток (контрольные варианты) - на 8 и более порядков (рис. 3 в, г).

0,75

100 80

ja Ц

Я 60

0) К

1 U

ч ю

1) CL

н о

40 20 0 -20

5 10 Время, мин.

s I О

Е О

0,65

0,55

0,45

200 400 600 800 Время, сек.

вегетативные клетки

ЦПК

Рис. 3. Свойства ЦПК: (а) Дыхательная активность (1) длительно инкубируемых ЦПК и (2) вегетативных клеток. Типовой график для М. ЫеиБ А. %1оЫ}огт1в, Р. аигаппаса, А. ЬгазИепзе. (б) Действие лизоцима на М. Ыем: (1) ЦПК; (2) вегетативные клетки; (3) отмытые ЦПК, (в, г) Терморезистентность (80 °С, 10 мин) вегетативных клеток и ЦПК М. 1шеш.

Таблица 3. Данные рентгеновского микроанализа клеток бактерий

Вариант Соотношения площадей пиков (П/П)

Са/К Р/в

Bacillus cereus

Вегетативные клетки 0.29± 0.01 3.06±0.10

Эндоспоры 22.78±2.78 1.90+0.01

ЦПК 1.36+0.41 1.30+ 0.16

Micrococcus luteus

Вегетативные клетки 0.48± 0.03 3.49± 0.18

ЦПК 1.39+0.04 2.85± 0.11

Повышенная устойчивость к прогреванию была показана для ЦПК всех исследуемых бактерий. При образовании в относительно однотипных условиях ЦПК грамположительных бактерий оказались более терморезистентными, чем ЦПК грамотрицательных бактерий (табл. 4). Среди покоящихся форм исследуемых грамположительных бактерий более устойчивыми к термообработке были ЦПК бацилл, образующиеся в условиях катаболитной репрессии как альтернатива эндоспорам, а также ЦПК ряда немицелиальных актинобактерий (родов Arthro-bacter, Micrococcus, Mycobacterium). Высокая устойчивость к прогреванию при 70 °С (10 мин) и гипоосмотическому шоку (~ 100% выживших) характерна также для ЦПК экстремально галофильной археи Natrinema pallidum.

Таблица 4. Сравнительная характеристика термоустойчивости ЦПК бактерий

Вид бактерий Возраст Доля вы- Температура

(условия образования ЦПК) ЦПК, мес живших кле- (°С) и время

ток*, % прогрева (мин)

ЦПК грамположительных бактерий

В. зиЫШя (среда с 12% глюкозы) 6 50 80 10

В. сегеия (среда с 6% глюкозы) 1.5 30 80 10

А^1оЫ/оггп15 (лимит С и >}) 4 37 80°; 10

Б.аигеия (ФР с 100 мМ СаС12) 4 44 60°; 10

М.ьте£таИз (среда СР-1, лимит 14) 5 20 60°; 10

Ь. р1апШгит (сгущение в 30 раз) 4 10 60°; 15

R.rhodochrous (среда СР-1, лимит 14) 9 10 60°; 10

М.ркШ (среда СР-1, лимит Р) 9 2 60°; 10

ЦПК грамотрицательных бактерий

A.brasilense Sp7(5x лимит N) 4 1.2 60 10

P. aurantiaca (2х лимит N) 6 1 60°; 5

E.coli (сгущение в 20 раз) 1 0.07 55 5

* от числа жизнеспособных клеток (титр КОЕ) до термообработки. Доля вегетативных клеток, устойчивых к прогреванию в тех же условиях, была на 3-7 порядков ниже.

ЦПК обладали существенно меньшей термоустойчивостью, чем эндоспоры бацилл, которые выдерживают прогревание при 90-100 °С [Briggs, 1966]. При этом ЦПК как грамположительных, так и ряда грамотрицательных бактерий оказались более устойчивы к термообработке, чем цисты Azotobacter vinelandii [Layne, Johnson, 1964], фотосинтезирующих бактерий Rhodospirillum centenum [Berleman, Bauer, 2004], бделловибрионов [Tudor, Conti, 1977], азоспирилл [Sadasivan, Neyra, 1985]. Повышенная терморезистентность покоящихся форм бактерий - объектов исследования (по сравнению с цистами), послужила дополнительным основанием для обособления их в категории ЦПК.

Сохранение жизнеспособности и приобретение термоустойчивости образовавшимися ЦПК зависели от условий их последующей инкубации (хранения).

Сохранение максимально высокой численности колониеобразующих ЦПК азос-пирилл A. brasilense (1.2-108 кл/мл) наблюдалось при их хранении в нативной среде роста при температуре -20 °С, при этом доля терморезистентных клеток была низкой (0.01%). В условиях инкубации ЦПК азоспирилл в нативной среде роста при комнатной температуре, когда возможно созревание покоящихся форм, было выявлено снижение числа КОЕ (1-107 кл/мл) одновременно с увеличением количества и доли (27%) терморезистентных клеток, что объясняется возрастанием степени глубины покоя. В вариантах хранения ЦПК исследуемых бактерий в условиях, препятствующих их созреванию (в физрастворе или в замороженном состоянии), доля термоустойчивых клеток оказалась низкой. Обратная корреляция между долей термоустойчивых клеток и численностью клеток, способных к образованию колоний, была отмечена и для 5-6-месячных суспензий ЦПК В. subtilis (50-69%; 2-104 КОЕ/мл) и М. smegmatis (20%; 3.7-105 КОЕ/мл).

Другим важным показателем устойчивости ЦПК неспорообразующих бактерий к повреждающим воздействиям явилась их нечувствительность к действию гидролитических ферментов. Резистентность ЦПК М. luteus к разрушению лизо-цимом (1 мкг/мл) была обратима и терялась после 3-кратной отмывки ЦПК слабощелочным раствором (рис. 3 б). При этом вегетативные клетки не выдерживали обработки лизоцимом (0-5 КОЕ/мл). Высокая устойчивость к агрессивным воздействиям у ЦПК определяет их значение для выживания микробных популяций в неблагоприятных условиях.

1.5. Доказательствам образования ЦПК как этапа в цикле развития бактериальных культур посвящена отдельная глава.

Таким образом, обобщенные в настоящей главе данные позволяют сформулировать важный вывод о наличии у широкого круга неспорообразующих бактерий конститутивной формы покоя - цистоподобных покоящихся клеток.

Совокупность результатов морфологических и физиологических исследований ЦПК в сравнении с предшествующими им вегетативными клетками не только демонстрировала существование покоящихся форм у исследуемых бактерий, но и обосновывала корректность заключения, что способность образовывать колонии в старых бактериальных культурах принадлежала именно ЦПК. Приведение такого аргумента было важным ввиду обсуждаемой возможности поддержания численности клеток за счет критического роста минорной субпопуляции [Zambrano et al., 1993; Scmeulders et al., 1999]. Поэтому были проанализированы данные, полученные для 6-месячных культур микрококков и псевдомонад, с оценкой максимально возможного вклада вегетативных клеток в образование колоний. Анализ основывался на показателях: 1) численности всех клеток (прямой счет) и живых (Live/Dead); 2) доли покоящихся рефрактерных клеток из 1000 объектов в фазово-

контрастном микроскопе и при условном учете нерефрактерных клеток как веге-

тативных; 3) доли вегетативных клеток и ЦПК, дифференцируемых по результатам анализа ультратонких срезов 100 клеток; 4) численности КОЕ при посеве культур; 5) доли клеток, устойчивых к повреждающим воздействиям (табл. 5).

Таблица 5. Оценка вклада вегетативных клеток и ЦПК в показатели колониеобразования

N клеток/мл Доля (%) и численность*(кл/мл) Титр КОЕ/ мл Вклад в КОЕ:

всех живых** «вегетативных» клеток (ВК) интактных неделящихся «вегетативных» клеток ЦПК

Культуры с ЦПКM.luteus (10хлимит N, 6 мес)

2.6-108 2.6-107 Светооптическая микроскопия 35%***; 0.9-1071 65%; 1.7-107 1.7-107 не определяется

Анализ ультра-0.99%***; 2.6-105 0 ВК из 100 онких срезов 60%; 1.6-107 60 ЦПК из 100 1.5% 98.5%

Обработка лизоцимом (1 мкг/мл)**** <0.000001%; 1-5 | все ЦПК 9106 0.0002% 99.9998%

Культуры с ЦПК P.aurantiaca (2хлимит N, 6 мес)

2.5-108 1.4-108 Светооптическая микроскопия 55%***; 7.7-1071 45%; 6.3-107 3-107 не определяется

Анализ ультра' 0.99%***; 1.4-106 0 ВК из 100 онких срезов 27%; 3.8-107 27 ЦПК из 100 4.6 95.4%

Термообработка (60 "С, 5 мин)**** <0.000001%; 1-5 | 3-105 0.002% 99.998%

* N (живых) х показатель доли; **тест с Live/Dead; ***100% - % неделящихся; ****на основании данных для культур вегетативных клеток; величины отклонений не приводятся.

Хотя по результатам просмотров в светооптическом микроскопе удалось распознать 45 - 65% клеток как покоящихся, но из-за возможной неоднозначности статуса остальных: вегетативные, поврежденные, автолизированные клетки (?), вклад в образование колоний ЦПК и вегетативных форм оставался неясен. Уровень этой неопределенности снижался при электронно-микроскопическом анализе клеток в популяции. Так, сравнение срезов 100 клеток (и более) в 2 - 9 месячных культурах ЦПК не выявило вегетативных форм, распознаваемых по особенностям ультратонкого строения, на основании чего наибольшая их встречаемость составляла 0.99%. С учетом этого максимальный вклад «вегетативных клеток» в образование колоний не превышал 5%, который нивелировался до нулевых значений за счет дополнительного анализа данных по устойчивости тех же культур к повреждающим воздействиям (табл. 5). При обработке популяций покоящихся микрококков лизоцимом (1 мкг/мл), а популяций псевдомонад прогреванием (60 °С, 5 мин), численность КОЕ снизилась на 50% и 2 порядка, соответственно. Вегетативные клетки не выдерживали такие воздействия (данные о практически полной гибели

клеток культур стационарной фазы или активно растущих). Таким образом, использование повреждающих воздействий, щадящих для ЦПК и при этом полностью летальных для вегетативных клеток, также целесообразно для аргументации образования колоний за счет прорастания только ЦПК. Аналогичным образом был доказан вклад ЦПК остальных исследуемых бактерий в пул образующих колонии или жизнеспособных клеток, прорастающих из покоящихся популяций и выявляемый МПР.

Наконец, на модели микобактерий М. smegmatis были отработаны подходы к получению однородных фракций ЦПК, основанные на центрифугировании 5-мес культур (СР1 с лимитом Ы) в ступенчатом (1.8 М и 2.1 М) или линейном (0 -2.1 М) градиенте сахарозы. Микроскопические наблюдения показали, что нижняя фракция была на 95 - 100% (в зависимости от типа градиента) обогащена покоящимися клетками и практически не содержала палочковидных форм. Жизнеспособность клеток гомогенной фракции ЦПК, по данным посевов на ЫВ-среду, составила 2.6-105 КОЕ/мл и 6-107 НВЧК /мл. Эта фракция отличалась от общей суспензии большей долей ЦПК, устойчивых к прогреванию при 70 °С (13%).

Для доказательства образования в пост-стационарных культурах ЦПК и их характеристики как покоящихся форм, предназначенных для переживания бактериями неростовых условий, было необходимо разработать специальные условия для их формирования в количествах, достаточных для исследований микроскопическими и физиологическими методами.

Глава 2. Условия образования покоящихся форм неспорообразующих бактерий

2.1. Трофическая регуляция образования ЦПК в пост-стационарной стадии развития бактериальных культур основывалась на создании стресса голодания за счет лимитирования среды роста источником N или изменения баланса С>Ы, а также недостатка 02 или Р. Эти ситуации стандартны для природных систем. В условиях исчерпания лимитирующего субстрата бактериальные культуры росли с меньшими удельной скоростью роста и выходом биомассы (в 5 - 10 раз), чем в базовых безлимитных средах. При этом стратегия роста сменялась стратегией выживания за счет перехода клеток большой части популяции в состояние покоя. Так, численность жизнеспособных клеток в 2-мес культурах М. ¡Шеиз, растущих в богатых средах, была существенно ниже (0.06% от числа КОЕ в стационарной культуре), по сравнению с их численностью в культурах, развивавшихся в модифицированных средах: 75% при лимите Ы; 10.8% при лимите Р; 9.2% при сниженной аэрации. Соответственно доля ЦПК от общего числа клеток, выявляемых по результатам микроскопических просмотров, была на 2-3 порядка выше в постстационарных культурах микрококков, выращенных при лимитах N или Р, по сравнению с вариантами развития в богатых средах. Аналогичное влияние моди-

фикаций условий культивирования на повышение эффективности образования жизнеспособных ЦПК установлено для артробактерий, родококков, псевдомонад, азоспирилл и других бактерий - объектов исследования.

Условия роста культур, наиболее эффективные для образования ЦПК и длительного сохранения ими колониеобразующей способности, приведены в таблице 2. Отмечено, что тип лимитации среды определял динамику титра КОЕ в

процессе инкубации культур с образовавшимися покоящимися формами. Создание в среде лимита С и N способствовало формированию ЦПК М. 1Шеия, которые полностью утрачивали свойство образовывать колонии к 6 - 9 мес хранения, в отличие от вариантов развития микрококка в других условиях культивирования (рис. 4). У ЦПК Р. аигапНаса, образовавшихся при 5-кратном лимите источника 1\т, титр КОЕ снижался до единичных значений к 2.5 мес, в отличие от условий менее жесткой азотной лимитации. Утрата колониеобразующей способности ЦПК могла быть связана с возрастанием глубины их покоя.

Таким образом, для М. Шеш, Р. aura.ntia.ca и других бактерий были выявлены условия образования покоящихся форм, для которых метод учета по КОЕ оказался неэффективен, и потребовались другие подходы к доказательству их жизнеспособности. Этому посвящены отдельные исследования (Глава 4).

2.2. Вторая группа приемов, направленных на эффективное образование ЦПК, основывалась на создании стресса исчерпания пространства за счет повышения клеточной плотности культур (суспензий), что предусматривало плотност-ную компоненту регуляции смены стратегии роста стратегией выживания. Один из этих приемов включал модификацию среды роста введением в нее избыточных количеств глюкозы (6% для В. сегеш; 12% для В. БиЬШи), что обеспечивало высокий выход биомассы к началу стационарной фазы (109 - Ю10 кл/мл) и репрессировало образование эндоспор. В этих условиях спорообразующий фенотип у бацилл не проявлялся, и цикл развития культур завершался образованием ЦПК, аналогично неспорообразующим бактериям. Численность жизнеспособных ЦПК в 1.5-мес культурах В.сегеш и В. виЬНШ при репрессии спорообразования составляла порядка 60% от числа жизнеспособных клеток в стационарных культурах.

0 3 6 9

время инкубации, мес

Рис. 4. Численность жизнеспособных клеток в культурах М. Ыеш: (1) среда с лимитом N. (2) лимит Р, (3) лимит С + N.

Другой вариант стресса исчерпания пространственных возможностей при развитии культур предусматривал создание высокой клеточной плотности, что обусловливало индукцию автолиза части клеток в суспензиях. Эффективность образования ЦПК в автолизирующихся суспензиях исследовали как при варьировании клеточной плотности, так и состава инкубационных сред (наличие Са2+, рН), при спонтанном автолизе или индуцированном внесением олеиновой кислоты. Результаты типичного опыта на модели Е.соИ приведены в таблице 6. В автолизирующихся сгущенных суспензиях бактерий численность КОЕ составляла 237%, тогда как в контрольных вариантах (пост-стационарных культурах того же возраста) количество жизнеспособных клеток было низким - 0.01 - 0.2%.

Таблица 6. Число жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) Е.соН в автолизирующихся клеточных суспензиях, хранившихся 1 мес при 28°С_

Среда Численность КОЕ (% от КОЕ в стационарной фазе) в суспензиях разной степени сгущения в:

10 раз 20 раз 30 раз

среда роста с 20 мМ СаС12 (3.5±0.5)-108 (0.3) (1.5±0.3)-109(1) [1.9±0.4)-101°(15) (2.3+0.5)- 101О( 18) (3±0.3>108(0.1) (2±0.4)-109 (1) (2.1±0.5)-101О(10) (4+1.0)Ю10(18) (4.0+0.3)-108 (0.1) (2.5+0.3)-109 (0.7) (1.9±0.4)1010(5) (3.4+0.7)-Ю10(Ю)

0.1 М КН2РО, буфер с 20 мМ СаС12, рН 6

0.1 М КН2РО, буфер с 20 мМ СаС!2, рН 7

0.1 М КН2Р04 буфер с 20 мМ СаС12, рН 8

Оптимальными условиями образования жизнеспособных ЦПК в автолизирующихся суспензиях бактерий (до 4 мес хранения) являлись:

• Е.соИ - 20-кратное сгущение в 0.1 М КН2Р04 фосфатном буфере с 20 мМ СаС12, рН 8; титр жизнеспособных ЦПК 18%;

• М. Шем - 10-кратное сгущение в 0.1 М КН2Р04 буфере с 20 мМ СаС12, рН 7.25; титр жизнеспособных ЦПК 37%;

• Ь. р1апШгит - 30-кратное сгущение в растворе 0.09% №28Ю3-9Н20, рН 6.3; титр жизнеспособных ЦПК 2%.

Таким образом, автолиз части популяции в пост-стационарных бактериальных культурах может рассматриваться не только как фаза отмирания, но и стадия развития, сопряженная с образованием покоящихся форм.

2.3 Третья группа приемов, разработанных для массового образования ЦПК, имитировала ситуации развития стресса голодания у бактерий в присутствии природных субстратов или биокосных компонентов, что наблюдается при резком изменении окружающих условий или смене хозяина для симбиотрофных бактерий. Так, оптимальной для образования ЦПК псевдомонад была инкубация клеток стационарных культур в почвенной вытяжке или развитие популяции на поверхности почвенного агара (1.5 - 2 мес). Эффективным оказалось перенесение с последующей инкубацией (до 4 мес) стационарных клеток псевдомонад, артробактерий,

стафилококков и эрвиний в: 1) раствор водорастворимой окиси кремния 0.09% Na2Si03 • 9Н20; 2) физраствор (ФР) с 10 - 300 мМ СаС12; 3) безуглеродную минеральную среду. Результаты опытов на модели S. aureus приведены в таблице 7.

Таблица 7. Общее число и численность жизнеспособных клеток S. aureus в

различных инкубационных средах через 4 мес инкубации

Вариант инкубации Общая численность (К, кл/мл), титр КОЕ и доля жизнеспособных клеток (% от титров КОЕ или НВЧК в стационарной фазе)

N, кл/мл КОЕ/мл % от КОЕ % от НВЧК

ФРс ЮмМСаСЬ (4.0±1.3)-10v (1.2±0.1)- 10s 1.2 13.2

ФР с 100 мМ СаС12 (9.0±1.9)-10* l.OiO.iyiO* 1 9.9

ФР с 300 мМ СаС12 (4.7±1.5)-10* (4.7±0.7)-10' 0.08 1.3

среда роста (6.0± 1.5)-10s (3.0± 0.4)-106 0.01 0.7

2.4. Четвертая группа приемов, разработанная для получения ЦПК, основывалась на повышении в культурах начала стационарной фазы концентрационного уровня микробных аутоиндукторов анабиоза за счет внесения их химического аналога - С12-АОБ. Титр жизнеспособных ЦПК, полученных этим способом, составлял, например: 91% для МЛШеш (3 -10"4 М С]2-АОБ, 1 мес); 38-45% для Р. аи-гапйаса и Р. ]1иоге$сет (10"4 М - 2.510"4 М С^-АОБ, 1.3 мес); 12% для Е. саго1о-гога (1-Ю"4 М Сп-АОБ, 1.5 мес). Закономерности биологического действия АОБ подробно рассмотрены в Главе 5.

Обобщенный и формализованный статистический анализ с ранжированием числа успешных из предпринятых экспериментов показал наличие достоверной коррелятивной связи (г8 0.933-0.946) между эффективностью образования ЦПК и применением вышеописанных модификаций условий культивирования и сред. Таким образом, разработаны воспроизводимые (80 - 100%) подходы к интенсификации образования ЦПК у широкого круга неспорообразующих бактерий. Приемы могут быть использованы для изучения форм покоя у других микроорганизмов с учетом специфики их роста и развития.

Образование ЦПК неспорообразующими бактериями рассматривается как экстремальная форма ответа микробной культуры на такие стрессовые условия (голодания и исчерпания пространства), когда ее дальнейший рост невозможен. При постоянном притоке субстрата и удалении части клеточной популяции условия, способствующие переходу клеток в состояние покоя, не создаются.

Важно отметить, что образование ЦПК у М. 1и1ет, Р.аигапйаса, А. %1оЫ-/огт1з и др. обеспечивалось применением всех разработанных приемов. Таким образом, каковы бы ни были условия роста бактериальных культур, циклы их развития всегда завершаются образованием покоящихся форм, хотя и с разной ин-

тенсивностью и с различающимися свойствами. Выявлению их разнообразия посвящен следующий раздел исследований.

Глава 3. Разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий

3.1. Внутривидовое разнообразие. В разных условиях роста бактериальные культуры одного и того же штамма завершали цикл развития образованием покоящихся форм, отличающихся: морфологически и ультраструктурной организацией; устойчивостью к повреждающим воздействиям; быстротой отклика на условия, способствующие их реактивации и росту; изменением популяционного спектра в новом цикле развития.

3.1.1. Внутривидовое разнообразие ЦПК псевдомонад Р.аигапИаса и Е йиогексет. проявляющееся при развитии культур в разных условиях, выражалось в формировании нескольких типов покоящихся клеток, которые различались толщиной и слоистостью клеточных оболочек, отсутствием или наличием кап-сульного слоя и внутрицитоплазматических включений. ЦПК разных морфотипов (рис. 5 а - в) обладали неодинаковой степенью сохранения пролиферативного потенциала и термоустойчивостью. Формы, сходные по тонкому строению с типичными бактериальными цистами, были выявлены в популяциях псевдомонад, развивавшихся на почвенном агаре (рис. 5 в). Для образования ЦПК псевдомонад, длительно сохранявших колониеобразующую способность, оптимальными были: (1) двукратное уменьшение в среде содержания >1; 2) инкубация в растворе с окисью кремния или почвенной вытяжке; 3) развитие на почвенном агаре. Устойчивыми к термообработке (60 "С, 5 мин) оказались ЦПК, образовавшиеся в 6-мес культурах при лимите азота (1% выживших клеток, тест по КОЕ) или голодной среде с окисью кремния (0.1%). ЦПК, полученные при развитии на почвенном агаре, были устойчивы к высушиванию, но не термообработке (рис. 6 а).

3.1.2. Разнообразие покоящихся форм было продемонстрировано для мико-бактерий М. хте^таИх (рис. 5, г-е). При развитии их культур в среде СР1 с лимитом N образовывались дифференцированные ЦПК с выраженной рефрактерно-стью, утолщенными клеточными оболочками и спороподобной головкой (рис. 1з, 5г). При развитии культур М. smegmatis в среде Сатона при сниженном рН образовывались кокковидные формы без цитоплазматических включений (рис. 5 д). В культурах, инкубированных в среде Сатона с лимитом Р, были выявлены «слабо-дифференцированные» покоящиеся клетки с включениями (рис. 5е). Дифференцированные формы со сложной ультраструктурной организацией обладали свойствами углубленного покоя, о чем судили по высокой терморезистентности и

Рис. 5. Структурное разнообразие форм покоя неспорообразующих бактерий: (I) внутривидовое: Р. аигапНаса: (а-в) (а) 2х лимит М, 6 мес инкубации; (б) + С12-АОБ (2.5-КГ4 М), 1.3 мес.; (в) развитие на почвенном агаре, 1 мес. Метка 500 нм; М. зтеетайз-. (г) дифференцированные ЦПК (среда СР1, лимит N. 5 мес); (д) кокковидные формы (среда Сатона, рН 6.2, 4 мес); (е) слабодифференцированные клетки (среда Сатона, лимит Р, 5 мес); (II) межштаммовое: А. ЬгазИгпэе: (ж,з) ЦПК штамма 8р7 (стартовый лимитом N. 4 мес.) (и) циста штамма 8р245 (физраствор 4 мес.); (III) внутипопуляционное: М. Шеш: ЦПК (к) I, (л) II и (м) III структурных типов (10х лимит N. 9 мес). Метки (г-м): 300 нм.

50 55 60 65 70 75 Температура, С

Рис. 6. Термоустойчивость ЦПК по показателям порядков снижения титра КОЕ: (а) ЦПК Р. aurantiaca после термообработки при 60°С (5 мин) в зависимости от варианта их образования: (1) - в среде с 2х лимитом N, 1.5 мес, (1а) то же, 6 мес; (2) внесение С12-АОБ (1- КГ4 М); 1.3 мес, (3) с Na2Si03, 1.3 мес; (4) в почвенной вытяжке; (5) на почвенном агаре; (к) - вегетативные клетки, (б) ЦПК М. smeematis (в среде CP 1, лимит N, 2 мес) после прогревания при 50 -80 °С (10 мин): 1 - титр КОЕ, 2 - титр мКОЕ.

необходимости создания специальных условий для реверсии к вегетативному росту. Так, глубокопокоящиеся (5 мес) ЦПК микобактерий реактивировались в жидкой среде, что определяли по высокому титр НВЧК (6-107 кл/мл) в тестах по МПР. При этом не было выявлено потребности в специальных условиях для реактивации кокковидных и слабодифференцированных клеток. По показателям терморезистентности три типа покоящихся форм М. smegmatis одного возраста (4-5 мес) ранжированы в ряду: дифференцированные ЦПК (20% выживших после прогревания при 60 °С, 10 мин, тест по КОЕ) > слабо дифференцированные клетки (0.3%) > кокковидные формы (0%). Выраженный полиморфизм оказался свойственен также ЦПК М. 1меш. Так, у шестимесячных ЦПК микрококков, полученных при дисбалансе С>К или сниженной аэрации, клеточные стенки были значительно толще и имели обширный капсульный слой по сравнению с ЦПК того же возраста, образовавшимися в условиях лимита источника Р.

3.1.3. Внутривидовое разнообразие проявлялось в полиморфизме покоя у В.сегеш и В. виЫИй (эндоспоры и ЦПК), когда цикл развития бацилл в условиях репрессии спорообразования завершался образованием цистоподобных клеток, обладавших всеми характеристиками покоящихся форм прокариот.

3.2. Межштаммовый уровень разнообразия покоящихся форм был выявлен для неэндофитного (Зр7) и эндофитного (Бр245) штаммов диазотрофных бактерий А. ЬгсиИете, представлявших хорошую пару сравнения. При развитии штамма 8р7 в синтетической среде с 5-кратно сниженным стартовым источником N

формировались ЦПК двух структурных типов (рис. 5 ж, з). Образованию ЦПК у штамма Sp245 способствовало создание дефицита Р. В более жестких условиях голодания - при переносе клеток стационарных культур (среда с лимитом N) в физраствор, у него наблюдалось образование структурно дифференцированных покоящихся клеток (рис. 5 и), сходных с цистами азотобактера. Большей термоустойчивостью (50, 55, 60°С; 10 мин) обладали ЦПК неэндофитного штамма Sp7, что коррелирует с усложнением их структурной организации и наличием внеклеточного матрикса (рис. 5 ж, з). Таким образом, полученные данные демонстрировали зависимость формирования покоящихся клеток определенных морфотипов симбиотрофными бактериями от характера их взаимодействий с растительным партнером (неэндофитного или эндофитного).

3.3. Важным уровнем разнообразия является гетерогенность по степени проявления свойств покоя внутри популяции ЦПК одного типа, образовавшихся в данных конкретных условиях. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПК проявлялось в длительно инкубируемых популяциях М. luteus (среда с лимитом N, 2-9 мес) в наличии различных типов ЦПК, имевших толстые оболочки с одним (I тип), двумя (II тип) и более (III тип) слоями различной электронной плотности (рис. 5 к, л, м). По мере созревания увеличивалась доля толстостенных ЦПК II и III типов (до 70 - 80% к 6-9 мес.) и параллельно возрастала их устойчивость к ли-зоциму (1 мкг/мл; снижение титра КОЕ на 40-50%), что подтверждает вывод о развитии общей резистентности ЦПК с увеличением физиологического возраста.

Гетерогенность популяций ЦПК М. smegmatis (среда СР1, лимит N, 2 мес) была документирована результатами проточно-цитометрического анализа их клеточных суспензий (рис. 7). При прокрашивании ЦПК красителем Nile Red была авыявлена субпопуляция (45 ± 17% от

общего числа клеток) с сильной флуоресценцией, отражающей повышенное содержание триацилгли-^церидов в составе внутриклеточных

Г>1 о

~электронопрозрачных включений.

Обогащенность ЦПК этими липида-°ми (в 1.5 раза) по сравнению со ста-

ционарными клетками была под-°отверждена результатами ТСХ выде-

ленных фракций неполярных липи-

Рис. 7. Распределение покоящихся форм М. smeg- дов Особо отметим, что индивиду-matis по интенсивности флуоресценции (ось Y) по-

еле прокрашивания Nile Red и светорассеянию ™ Фракция ЦПК М. smegmatis,

клеток как функции диаметра вращения и размера полученная при центрифугировании

ютеток (ось X). В заштрихованном треугольнике ше.точ}1ЪВ, суспензий в градиенте фракция ЦПК с сильной флуоресценцией.

сахарозы и оказавшаяся гомогенной по морфологии, была гетерогенной как по характеристикам термоустойчивости, так и способности клеток ревертировать к росту на питательном агаре или в жидкой среде. Обнаружено нарушение способности у ЦПК микобактерий, прогретых при 65°С (10 мин), к образованию макроколоний, притом, что их жизнеспособность сохранялась, и они образовывали микроколонии (мКОЕ) на плотной среде (рис. 6 б). Аналогичная тенденция прослеживалась для ЦПК 5. aureus: резкое снижение титра КОЕ после обработки клеток при 55 - 60°С (но не выше) при сохранении колониеобразующей способности при температурах прогрева 65 - 75°С. По-видимому, термообработка при «критической» температуре не была достаточной для активации той субпопуляции ЦПК, которая прорастала в виде макроколоний (КОЕ) только после большей дозы теплового воздействия. Отметим, что прогревание при 70 — 80 °С используется для активации эндоспор бацилл.

Гетерогенность популяции покоящихся форм по отклику на термообработку и «нестандартность» реакции при 65 °С была выявлена в исследованиях эндоспор В. licheniformis неинвазивным методом динамической фазовой микроскопии (ДФМ). Метод давал возможность: (1) регистрации максимальной (Ah) фазовой толщины (ФТ) микробных клеток как маркера их физиологического состояния: для покоящихся с пор Ah > 80 нм, инициированных спор Ah ~ 40 нм, убитых нагреванием спор Ah < 20 нм; (2) анализа, как единичной споры, так и популяции (100 спор). При нагревании спор в неблагоприятных для прорастания условиях (в физрастворе) выявлены немонотонность изменения максимальной Ah с ростом температуры (18-75 °С) и ее возрастание при 65 °С. Высокое значение Ah (100 нм) единичной споры (и большинства спор в популяции) было постоянным в интервале 20-35°С, снижалось до 45 нм в диапазоне 38-40°С; затем возрастало до величины, характерной для покоящихся спор, при 65°С (критической температуре для прорастания прогретых ЦПК М. smegmatis) и снижалось при дальнейшем нагревании. При этом у преобладающего количества спор снижение Ah было обратимым, что соответствует состоянию обратимой тепловой активации эндоспор в неростовых условиях. У большинства (95%) инициированных спор (15 мин после добавления питательного субстрата) величина Ah составляла 40 нм, однако у минорной части она оказалась повышенной, что отражало гетерогенность популяции по скорости прорастания спор и отклику на условия роста.

3.4. Фенотипическая вариабельность как еще одно проявление разнообразия покоящихся форм бактерий выражалась в существенном изменении диссоциативного спектра популяции, выросшей при посеве ЦПК на плотную среду. Качественные и количественные изменения в диссоциативных спектрах, полученных в первом пассаже при рассеве ЦПК, зависели от условий их образования и сроков хранения. У Р. aurantiaca диссоциация проявлялась как переход исходного фенотипа, дававшего S-колонии, в R-тип или более пигментированный Р-тип и была

наиболее выражена при рассеве ЦПК, полученных на среде с двукратным лимитом N. а также под воздействием Сп-АОБ. Частота переходов 8—>11 (до 70%) и Б—>Р (до 80%) зависела от концентрации С12-АОБ и сроков хранения суспензий ЦПК. Выщепление диссоциантов Я-типа (до 45%) наблюдали при рассеве ЦПК, полученных в условиях лимитации N и хранившихся не менее 4 мес. У Е Аиогеясепз проявление диссоциативных переходов 8—зависело не только от условий получения ЦПК, но и от состава плотных питательных сред, использованных для их посева. Диссоцианты псевдомонад различались по скорости роста, устойчивости к антибиотикам и стрессам (повышенной солености и окислительному), продуктивности по внеклеточным протеазам и чувствительности к действию аналогов микробных ауторегуляторов - С12-АОБ (табл. 8). Таким образом, стратегия переживания псевдомонадами неростовых условий обеспечена не только образованием ЦПК различных морфотипов, но и внутрипопуляционной фено-типической вариабельностью, проявляющейся при их прорастании.

Таблица 8. Свойства некоторых диссоциантов

Тип колоний Характеристики Тип колоний Характеристики

P. aurantiaca P. fluorescens

шШГШ Скорость роста, цшах: 0.04 ч"1 Устойчивость (ЬВ5<|) к: стрептомицину: 180 мкг/мл тетрациклину: 40 мкг/мл Внеклеточные протеазы: 5.3 мЕ/мл МНИ р - r Скорость роста, цтах: 0.41 ч"1 Устойчивость (LD50) к: Н202: 1800 мкМ NaCÏ: 380 мМ Си - АОБ: 54 мкМ

Скорость роста, цтах: 0.02 ч"1 Устойчивость (ЬВ50) к: стрептомицину: 235 мкг/мл 1 Скорость роста, цтах: 0.64 ч'1 Устойчивость (LDso) к: Н202: 600 мкМ

3(Д) тетрациклину. 25 мкг/мл Внеклеточные протеазы: 15 мЕ/мл S (Д) NaCÏ: 185 мМ С,2 - АОБ: 370 мкМ

A. brasilense Sp7 A. brasilense Sp245

Тип подвижности Swa+Grf~ (роение)

Тип подвижности Swa+Gri+ (роение и миграция в виде микроколоний)

Тип подвижности

(отсутствие подвижности)

Тип подвижности Бмнх Оп (роение)

Д - доминантный вариант. Величины отклонений ±5% не приводятся.

Еще один уровень различий диссоциантов был связан со способностью к формированию покоящихся форм разных типов, что проявлялось в образовании

эндоспор или ЦПК диссоциантами S- и Mr- (муарового) типов В. subtilis и М -микоидного, W - белого и Тг- прозрачного вариантов В, cereus. Катаболитная репрессия спорообразования и формирование ЦПК происходили при развитии в средах с 4-8% глюкозы у всех диссоциантов, кроме Mr-типа В. subtilis и W-типа B.cereus. Образование ЦПК W-вариантом было выявлено только при повышении концентрации глюкозы в среде до 12% и не наблюдалось у Mr-типа, который и в этих условиях образовывал споры.

Повышенную фенотипическую диссоциацию наблюдали при прорастании ЦПК симбиотрофных бактерий A. brasilense (шт. Sp7 и Sp245), которая была более выражена у неэндофита (Sp7). Основными колониально-морфологическими вариантами шт. Sp7 были: доминантный S-тип; сильно пигментированный Pg-тип; R-тип; Sm-тип, образующий мелкие колонии; Sg-тип с сегментированными колониями. Частота появления фенотипических вариантов зависела не только от условий и сроков хранения ЦПК штамма Sp7, но и их предобработки перед посевом (прогрев при 55 и 60е С, 10 мин). Максимальная частота переходов S—»Pg (до 74%) отмечена при прорастании ЦПК, хранившихся в нативной среде роста при -20 °С 4 мес, a S->Sm (до 100%) - при рассеве ЦПК после термообработки. Для симбиотрофных бактерий важным признаком являлся тип их роста и подвижности в полужидком агаре, имитирующем прикорневой полисахаридный матрикс. Для S- варианта был характерен смешанный тип подвижности; для Pg- и Sg - вариантов - роение; для Sm-варианта - отсутствие подвижности (табл. 8). Спектр диссоциантов эндофитного штамма Sp245 был менее разнообразным, чем штамма Sp7, и представлен S-, Sm- и М- вариантами с разной подвижностью клеток. Различия между неэндофитным и эндофитным штаммами азоспирилл в фенотипиче-ской диссоциации могут отражать особенности адаптации к меняющимся условиям роста и характер взаимоотношений этих бактерий с растениями.

Расширение диссоциативного спектра при прорастании ЦПК было показано для Е. carotovora, В. subtilis, М. smegmatis, S. aureus. При рассеве разных типов покоящихся клеток микобактерий и стафилококков на средах с канамицином или тетрациклином выявлена диссоциация с появлением антибиотикоустойчивых фенотипов, что важно для понимания роли покоя в появлении клонов, резистентных к действию антимикробных препаратов. Таким образом, повышенная фенотипи-ческая вариабельность, реализующаяся при прорастании ЦПК, отражает пластичность бактериального генома и обеспечивает большие возможности успешного развития популяции в новых условиях окружения.

Полученные результаты позволили заключить, что внутривидовое и внутри-популяционное разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий -важный механизм, повышающий адаптационный потенциал бактерий для длительного выживания вида.

Глава 4. Диагностика и более полное выявление покоящихся форм бактерий

Разработка критериев для мониторинга покоящихся форм микроорганизмов составляет важную задачу при изучении структуры и функционирования микробных сообществ в природных системах. Вклад в ее решение внесли результаты, показавшие возможность выявления покоящихся форм прямыми методами и приемы более полного учета численности жизнеспособных клеток в покоящихся популяциях культуральными методами.

4.1. Прямые методы. Результаты электронно-микроскопических исследований выявили аналогию ультраструктурной организации клеток непосредственно в образцах длительно мерзлых пород (без применения процедуры подращивания) (рис. 8) и ЦПК, полученных в лабораторных условиях (рис. 2 и 5), в т.ч., для изо-лятов из мерзлоты. «Портретная» диагностика микробных клеток предложена в качестве подхода к оценке их возможного физиологического состояния in situ.

Рис. 8. Тонкие срезы бактерий in situ в мерзлых образцах возрастом (а, б) 30-40 тыс. лет, (в) 200 тыс. лет, (г) 2 млн. лет; ЦПК: (д) штамма Micrococcus sp. 4-1 из образца мерзлого отложения, полученных на среде с лимитом Р и хранившихся 3 года при 20 °С; (е) A.globiformis (среда с лимитом N). Метки: (а-в, г) 0.2; (д, е) 0.1 мкм.

Другой подход к выявлению микроорганизмов в объектах окружающей среды и прогнозирования физиологического статуса обнаруживаемых клеток основывался на использовании дифференциальных характеристик их элементного состава. Методом рентгеновского микроанализа были исследованы бактериоморфные частицы в образцах Антарктических мерзлых осадков (170 тыс лет) и пылевого наноса (рис. 9). Разработанный алгоритм диагностики включал анализ содержания Р, S, Ca и К и соотношений Са/К и P/S в частицах в сопоставлении с аналогичными характеристиками, свойственными микробным клеткам различного физиологиче-

ского состояния (табл. 3), а также полученными другими авторами [Никитин и соавт., 1998]. Отсутствие пиков Р и S в рентгеновских спектрах позволяло характеризовать частицы как неживые (рис. 9 в, г). Среди объектов, предположительно отнесенных к клеткам, покоящиеся формы предложено выявлять по повышенному содержанию Ca, соотношениям Са/К >1.0 и P/S (0.5 - 3.0).

Рис. 9. Вид в сканирующем микроскопе и рентгеновские спектры: (а, б) бактериоморфных частиц, по-видимому, клеток, и (в, г) абиогенных частиц в (а, в) мерзлоте и (б, г) пылевом наносе.

Таким образом, разработаны диагностические критерии для дифференцированного выявления покоящихся форм непосредственно в природных объектах. Совокупность приведенных результатов прямых микроскопических исследований позволила заключить, что выживание неспорообразующих бактерий в таких экосистемах, как древние (до 2 млн лет) вечномерзлые породы, обеспечивается за счет покоящихся форм типа ЦПК.

4.2. Для повышения результативности учета потенциально жизнеспособных клеток в популяциях ЦПК М. luteus, A. globiformis, P. aurantiaca, Е. carotovora, для которых метод учета по КОЕ оказался неэффективен, а доля живых клеток (тест с Live/Dead) - высокой (10-44%), были использованы следующие приемы для реверсии ростовых процессов. Прединкубация суспензий ЦПК М. luteus в буферном растворе 0.1 М К2НР04 (рН 7.4) обеспечивала увеличение численности

живых клеток, что свидетельствовало о восстановлении барьерной функции мембран. Однако при этом не наблюдалось существенного повышения числа КОЕ при рассеве ЦПК на LB-arape. Варьирование состава сред для посева с добавкой пи-рувата Na и разбавление сред способствовало образованию макроколоний лишь небольшой частью популяции ЦПК М. luteus (50-80 КОЕ/мл). Однако в тех же условиях численность клеток, способных к микроколониальному росту (мКОЕ), была на 4 порядка выше, чем титр КОЕ. Наиболее успешными оказались учет численности мКОЕ в полужидком агаре и использование МПР, когда наблюдалась практически полная реверсия ЦПК микрококков к росту (табл. 9).

Таблица 9. Повышение эффективности (в N раз) выявления жизнеспособных клеток за счет применения разных методов учета и модификаций сред_

Число живыхТитр КОЕ/мл Учет Среда Титр жизнеспособ-клеток,кл/мл по: для посева ных клеток N

не образующие колоний ЦПК М.luteus (лимит C+N, 6 мес) разбавленный в 5 2.6-107 0.2 мКОЕ раз LB-arap (1.8 ±0.2)-105 мКОЕ/мл полужидкий LB-МПР агар (2.3 ± 0.5)-107 кл/мл 106 108

не образующие колоний ЦПК A.globiformis (дефицит N. 4 мес") разбавленный в 2 3.2-108 3 - 5 КОЕ раза LB-arap (3.3±0.7> 106 КОЕ/мл 106

не образующие колоний ЦПК P. aurantiaca (5-кратный лимит N, 2 мес)

6.5-107 1-2 МПР LB-бульон 1.1 (0.3-3.3)-103 кл/мл 670

не образующие колоний E.carotovora (Сп-АОБ, 4-10"4 М. 6 мес) отмывка в безугле-2109 1-2 К0Е родной среде, LB-arap Ю7 -108 КОЕ/мл 107108

фракция ЦПК M.smegmatis (среда СР1, лимит N. 5 мсс) 7-107 (2.6±0.2)-105 мпр NB-среда 6- Ю7 кл/мл 260

ЦПК S. aureus (инкубация в ФР с 100 мМ СаСЬ, 4 мес) 7-Ю9 (1.0±0.1)-108 МПР LB-бульон 3.0-109кл/мл 30

Примеры повышения эффективности учета жизнеспособных клеток в популяциях покоящихся форм других бактерий приведены в таблице 9.

Таким образом, показана возможность выявления ЦПК, потенциально способных к росту, но не образующих колонии. Также обнаружена большая по численности субпопуляция покоящихся клеток, способных в первом пассаже только к микроколониальному росту, а при пересевах восстанавливавшая способность к образованию макроколоний.

4.3. Повышение чувствительности ПЦР для детекции покоящихся форм бактерий. Для определения покоящихся форм в ПЦР и их использования как источника ДНК-матриц были применены ранее разработанные методы (1) одностадийной обработки солями-хаотропами для пермеабилизации клеточных оболочек и (2) двустадийной обработки с дополнительной инкубацией с протеиназой К для деградации белков оболочек и депротеинизации клетки [Данилевич, Гришин, 2002; Данилевич и соавт., 2007]. В результате образовывались клеточные «чехлы», содержащие ДНК и обедненные примесными компонентами. Метод хорошо воспроизводим и относительно дешев; полученные клеточные «чехлы» можно исследовать прямыми микроскопическими методами. Их концентрацию в исходных пробах с пересчетом на объем аликвоты (1 мкл), вносимой в ПЦР-смесь, было удобно определять в камере Горяева, а долю пермеабилизованных ДНК-оболочек - по флуоресценции после окрашивания йодистым пропидием (табл. 10).

Таблица. 10. Порог обнаружения вегетативных клеток (ВК) и покоящихся форм бактерий в ПЦР при разных методах получения ДНК- матриц_

Источ- Метод" Концентрация Доля пермеа- Разведение Минимальная концен-

ник 1атриц в исход- билизованных матриц, доста- трация матриц в пробе

матриц юй пробе, мкл"1 оболочек, % точное для ПЦР для ПЦР, мкл"'

В. cereus (ПЦР с праймерами bc-clsAB-f и bc-clsAB-r на фрагмент гена clsAB)

ВК 1 1.3-104 100 10 13

2 6.2-103 100 103 6

ЦПК 1 1.6-105 100 ю4 16

2 1.2-105 100 10s 1

Споры 1 2.8-10s 100 ю1 2.8-104

2 2.8-10s 100 104-105 3-30

S. aureus (ПЦР с праймерами Saur-dnaA-f и Saur-dnaA-r на фрагмент гена dnaA)

ВК 1 4.0-106 100 10" 4

2 2. МО6 100 106 2

ЦПК 1 2.7-106 3.5 104 270 (9**)

2 2.4-106 30 ю5 24 (7**)

M.smegmatis (ПЦР с праймерами Msmeg-sigF-f и Msmeg-sigF-r на фрагмент гена sigF)

ВК 1 1.7- Ю5 4.5 ю2 1.7-103 (77**)

2 2.0-10s 11 103 200 (22**)

ЦПК 1 7.0-103 8.4 101 700 (58**)

2 1.4-103 6 ю1 140 (9**)

* 1 метод одностадийной пробоподготовки; 2 - метод двустадийной пробоподготовки; **с учетом доли пермеабилизованных ДНК-содержащих оболочек

Процедуры оказались эффективными для получения ДНК- матриц из вегетативных клеток и ЦПК В. cereus, М. luteus, A. globiformis, М. smegmatis, S. aureus, A. brasilense, а также эндоспор бацилл, что подтверждалось наличием продуктов ПЦР (~1500 п.о.) с универсальными праймерами 27f и 1522г на фрагмент гена 16S

рРНК. Повышение чувствительности ПЦР особенно важно для детекции спор. На

примере спор В. сегеш было показано, что амплификация фрагмента гена сЬАВ (~1510 п.о.) происходила при использовании разведенных в 104 - 105 раз матриц, полученных при двустадийной пробоподготовке (уровень обнаружения - 3 - 30 спор в пробе). При этом ПЦР с матрицами из спор, полученными при одностадийной пробоподготовке, оказалась на три порядка менее чувствительна (обнаружение 104 спор в пробе) (табл. 10). Хотя пермеабилизованные споровые оболочки, полученные обоими методами, были проницаемы для йодистого пропидия, но только обработка протеиназой К обеспечивала разрушение споровых белковых покровов (данные электронной микроскопии), вследствие чего повышалась доступность ДНК в ПЦР. Аналогичным образом обеспечено повышение чувствительности ПЦР (в 5-10 раз) при использовании ЦПК бацилл, стафилококков и ми-кобактерий как источника ДНК-матриц (табл. 10). Усовершенствование пробо-подготовки представляется важным для ПЦР-анализов образцов, в которых бактериальные клетки присутствуют в виде покоящихся форм, а не вегетативных клеток.

Таким образом, показана возможность повышения чувствительности ПЦР при обнаружении покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор).

Глава 5. Ауторегуляция покоящегося состояния 5.1. Химическая природа аутоиндукторов анабиоза. В настоящем исследовании были получены дополнительные доказательства широкой распространенности среди бактерий системы ауторегуляции роста и развития их культур с участием внеклеточных метаболитов с функциями аутоиндукторов анабиоза. У новых объектов - неспорообразующих бактерий М. Ыеш, в составе аутоиндукторов анабиоза обнаружены алкилоксибензолы (АОБ) новой структуры - алкилрезор-цины с углеводородными заместителями во 2 - и 4- положениях ароматического кольца (рис. 10). Хроматомасс-спектрометрическим анализом в экстрактах КЖ псевдомонад Р. aura.ntia.ca были идентифицированы гидрохиноны и ароматические соединения с алкоксильными заместителями ОН-групп бензольного кольца. В клетках Р.аигапПаса культур стационарной фазы обнаружен 2-бутил-5-нонил-резорцин (рис. 10).

ОН

Рис. 10. Структура АОБ:

М. 1меиз И, = (СН2)2.3СН3; Я2 = (СН2)4-5СНз; Яз = Н; Кг Р. аигапНаса Я, = (СН2)зСН}; = Н; = (СН2)8СН3;

1*1

На основании данных о химической природе аутоиндукторов анабиоза был применен высокоспецифичный колориметрический метод количественного определения АОБ с реагентом ГВВ [КогиЬек е1 а!., 1996] для изучения их динамики в

развивающейся культуре М. Шеш (рис. 11 а) и при подборе условий, способствующих эффективному образованию ЦПК. Так, направленная модификациях условий культивирования (раздел 2.1) была сопряжена с повышением биосинтеза АОБ при, что иллюстрируется результатами оценки продуктивности М. Ыет по АОБ, которая была в 3 - 5 раз выше при развитии культур на средах с пониженным содержанием N. Р или 02 по сравнению с ростом на стандартной среде (табл. 11).

Таблица 11. Содержание внеклеточных АОБ в культуре М. 1мет при

модификациях условий культивирования

Вариант среды Содержание АОБ на единицу:

объема, мг/л биомассы, мг/г МСК

Базовая: 0.5% лактата Ш4С1 - 4 г/л; КН2Р04 - 4 г/л) 5.1 3.3

1% лактата (Ш4С1 - 4 г/л; КН2Р04 - 4 г/л) 13.4 6.4

0.5% лактата с недостатком N (ЫН4С1 - 0.4 г/л) 3.7 17.5

0.5% лактата с недостатком Р (КН2Р04 -0.4 г/л) 7.5-8 12.5

0.5% лактата при пониженной аэрации (УШ1:У,= 3:1) 6.7 9.6

В исследованиях биологической активности ауторегуляторных факторов, выделенных из М. luteus и Р. aurantiaca, или их химических аналогов (С,2-АОБ и 2-С9, 5-Сю-АОБ) установлено, что их внесение в культуру микрококков и псевдомонад в подобранных концентрациях вызывало образование ЦПК. Полученные в этих условиях ЦПК сохраняли жизнеспособность, не обладали экспериментально выявляемым уровнем дыхания и характеризовались повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям: прогреванию, действию лизоцима (M.luteus).

Внеклеточные АОБ были выявлены у других бактерий - объектов исследований, а также установлены различия в продуктивности по этим соединениям. Неспецифичность биологического действия этих регуляторов была установлена в перекрестных биотестах на образование ЦПК. АОБ, синтезируемые одним продуцентом, действовали на разные микроорганизмы, а синтезируемые различными продуцентами - на один вид. Химический аналог аутоиндукторов анабиоза - С[2-АОБ, вносимый в определенных концентрациях в стационарные культуры неспо-рообразующих бактерий, способствовал образованию ими ЦПК. На внесении С)2-АОБ в бактериальные культуры был основан один из приемов получения покоящихся форм этого типа (раздел 2.4). Таким образом, выявлена видонеспецифиче-ская роль АОБ в образовании цистоподобных покоящихся клеток.

5.2. Основные закономерности динамики накопления АОБ в клетках и куль-туральной жидкости (КЖ) были продемонстрированы на модели М. luteus при засеве культурой стационарной фазы (рис. 11 а). В развивающейся культуре наблюдали два максимума накопления АОБ в КЖ и клетках в лаг-фазе и при переходе в стационарную фазу. Интересно отметить, что развитие стресса в ответ на тепло-

вой шок (45°С, 15 мин) в культуре микрококков линейной фазы роста также сопровождалось усилением биосинтеза АОБ. Как при «запланированном», так и «незапланированном» стрессах накопление внеклеточных АОБ опережало повышение их внутриклеточной концентрации. Это предполагает возможность перераспределения АОБ в системе среда-клетка через их внеклеточный пул. Повышение уровня АОБ в культуре при стрессе голодания является причиной ее перехода в стационарную фазу, в которой клетки приобретают состояние пролиферативно-го покоя, и может определять динамику образования ЦПК и их свойства. Искусственное повышение уровня АОБ в культуре фазы логарифмического роста обусловливало прекращение деления клеток и переход культуры в стационарную фазу. Важно отметить, что таким же рост-ингибирующим эффектом обладал неаци-лированный гомосеринлактон (ГСЛ). При его внесении в культуры спорообра-зующих бактерий В.сегеш, А.Ыегат и ^ЛкегтотЩйоох1йап$, развивавшиеся на средах для спорообразования, наблюдали прекращение роста, переход культур в стационарную фазу и затем спорообразование, наблюдавшееся раньше, чем в контрольной культуре (рис. 11 б на примере В. сегеиз). При развитии культур бацилл в условиях частичной репрессии спорообразования внесение ГСЛ снимало репрессию образования эндоспор, а АОБ - обусловливало образование ЦПК.

л н о о X н о

Ьй о о V

о в

ч с

10 14 18 Время, сут

10 15 20 25 Время, ч

Рис. 11. (а) Динамика накопления АОБ (на единицу объема) в культуре М. 1Шеш: (1) оптическая плотность культуры; содержание АОБ в (2) КЖ и (3) клетках, мг/л. (б) Развитие культуры В. сегеш на среде для спорообразования в (1) контроле и при внесении ГСЛ (10 ч) в концентрациях: (2)10"4 М и (З)Ю"3 М. Время начала спорообразования отмечено стрелками.

У грамотрицательных бактерий Р. аигапИаса и А. гте1апс1и внесение АОБ или ГСЛ обеспечивало раннее, по сравнению с контролем, образование ЦПК. Таким образом, АОБ и ГСЛ, будучи плотностными ауторегуляторами, контролировали переход пролиферирующей микробной культуры в стационарную фазу, завер-

шавшуюся образованием покоящихся клеток, морфотипы которых зависели от условий развития и состава среды роста.

5.3. Биологические эффекты АОБ. Характер действия АОБ зависел от их концентрации и физиологического возраста клеток-реципиентов и был видонес-пецифичен.

5.3.1. Зависимость эффектов АОБ от возраста культур показана для большинства объектов исследования. Воздействие С12-АОБ в концентрации 3-10"4 М на активно растущие клетки S. aureus приводило к резкому и необратимому падению титра КОЕ. Внесение АОБ в той же концентрации в культуру стафилококка начала стационарной фазы обусловливало образование ЦПК, длительно (до 4 мес) сохранявших колониеобразующую способность. Таким образом, физиологическая «подготовленность» клеток к действию определенной дозы АОБ существенна для реализации программ выживания или гибели клеток популяции.

5.3.2. Зависимость эффектов АОБ от их концентрации. В отношении микробных культур начала стационарной фазы дозозависимые эффекты АОБ выражались в переходе клеток: 1) в состояние покоя с сохранением у большей части популяции ЦПК колониеобразующей способности - при концентрациях АОБ (1-3)-10"4 М (раздел 2.4); 2) в состояние обратимой неспособности образовывать колонии в стандартных условиях («некультивируемости») - при концентрации АОБ (3-7)- КГ4 М; 3) в пост-анабиотическое состояние с образованием мумифицированных клеток, у которых полностью утрачивалась способность реверсии к росту - при сверхпороговых концентрациях АОБ (5-Ю"4 - 2-Ю"3 М). Закономерности действия АОБ были однотипными для бактерий Е. carotovora, P. aurantiaca, М. luteus и дрожжей S. cerevisiae и иллюстрируются на примере S. aureus (табл. 12).

Таблица 12. Дозозависимые эффекты химического аналога аутоиндукторов

анабиоза С12-АОБ на клетки S. aureus культур стационарной фазы роста

Сси-АОБ м Численность клеток*: Доля клеток* (%) Переход большей части популяции в:

живых**, кл/мл жизнеспособных культиви руемых некульти-вируемых

ю-4 2-108 1.2-10е КОЕ/мл 60 40 покой с сохранением колониеобразующей способности

3-10"4 2-108 2.8-10' КОЕ/мл 14 86 покой с утратой способности образовывать колонии

7-Ю"4 6-10' 0 КОЕ/мл 2-103 НВЧК/мл 0 0.03 100 99.7 состояние некультивируемости* * *

2-10' <порога выявления 0 КОЕ/мл 0 НВЧК/мл 0 0 100 100 пост-анабиотическое (мумифицированное) состояние

♦через 1 мес после внесения АОБ; **по данным прямых микроскопических подсчетов (с Live/Dead); *** часть популяции была способна к росту в жидкой среде (МПР).

Таким образом, продемонстрирована роль коммуникативных ауторегуля-торных факторов бактерий (АОБ) в контроле перехода клеток микроорганизмов в разнокачественное состояние покоя - с сохранением или утратой колониеобра-зующей способности.

5.3.3. Функции АОБ в образовании нежизнеспособных мумифицированных клеток. Обратим внимание на процессы, приводящие не только к развитию анабиотического состояния, но и к полной утрате микроорганизмами пролифератив-ной способности при сохранении внешней формы клеток. В лабораторных условиях клетки в «пост-анабиотическом» состоянии были получены под влиянием С12-АОБ, добавленного к клеточным суспензиям бактерий B.cereus, A. globiformis, М. luteus, S. aureus, P. aurantiaca и дрожжей S. cerevisiae в концентрациях от 5-10"4 до 2-10"3 М, сверхпороговых для образования ЦПК. В этих условиях численность жизнеспособных клеток (КОЕ, мКОЕ) при любых процедурах реактивации падала до невыявляемых значений в динамике инкубации клеточных суспензий (3 сут - 1 мес). Эти нежизнеспособные сильно рефрактерные клетки сохраняли внешнюю форму в течение всего периода наблюдений (до 3 лет) в условиях, благоприятствующих автолизу (жидкая среда, Т = 18-20 °С), и были названы микромумиями (ММ). В процессе мумификации клеточная стенка сохранялась, и цитоплазма во многих ММ становилась мелко гранулированной и электроноплотной. Сохранение целостности биополимеров свидетельствовало о подавлении автолитических процессов под воздействием С12-АОБ. В цитоплазматической мембране ММ бактерий были зафиксированы обширные участки разрывов, а в дрожжевых ММ мембранные структуры органелл не выявлялись. Основной липидный компонент мембран - фосфолипиды, частично выходили в окружающую среду. Последнее подтверждается снижением в 3 раза содержания фосфора фосфолипидов в ММ дрожжей (35.6 ±0.4 мкг/г МСК), по сравнению с вегетативными клетками (101.0 ± 7.0 мкг/г МСК). О нарушении барьерной функции мембран в ММ свидетельствовали также данные рентгеновского микроанализа, выявившие сверхвысокое содержание элементов-метчиков (Si), накапливавшихся в результате облегченного тока в системе среда - клетка по задаваемому градиенту концентрации, в отличие от вегетативных клеток и ЦПК. Важно отметить, что клетки, схожие по ультратонкому строению с ММ, обнаружены в старых (9-10 мес) культурах дрожжей, а идентичная микромумиям структура цитоплазмы была свойственна микрофосси-лиям керита возрастом ~1.85 млн. лет [Gorlenko et al., 2000].

5.4. Механизмы действия АОБ в процессах приобретения и поддержания состояния покоя

5.4.1. Роль АОБ в ингибировании метаболических процессов у покоящихся форм и их устойчивости. Показаны свойства длинноцепочечных АОБ как структурных модификаторов белков, что приводит к повышению их стабильности и

ингибированию функциональной активности. Так, С12-АОБ неспецифически ин-гибировал активность химотрипсина (ICso= 10 мМ), РНКазы (1С50= 3.5 мМ), трипсина (1С50= 0,6 -1.4 мМ). В общую картину ингибирования гидролитических процессов в покоящихся клетках может также вносить вклад модификация алкилок-сибензолами полимерных субстратов. Так, внесение Си-АОБ в суспензию клеток М luteus в концентрациях от 0.2 до 1 мМ обеспечивало подавление лизиса при действии лизоцима (1С5о= 0.4 мМ). После отмывки клеток от АОБ, чувствительность к лизоциму восстанавливалась, что свидетельствовало об обратимости структурной модификации пептидогликана клеточной стенки. Таким образом, функционирование АОБ как структурных модификаторов клеточных биополимеров, играет важную роль в приобретении бактериями состояния покоя и повышении устойчивости ЦПК к повреждающим физическим, химическим и биологическим факторам. При перенесении ЦПК в свежую среду или слабощелочные растворы (рН 7.5-8) АОБ отмывались из клеток в силу их амфифильности, и метаболический блок снимался. Роль АОБ в поддержании состояния покоя была подтверждена данными об ингибировании прорастания спор B.cereus на плотных средах с Сп-АОБ: на 90% в концентрации 0.05 г/л и 100% в концентрации 0.5 г/л.

5.4.2. Роль АОБ в изменении структурной организации надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК). Об измененной структурной организации нуклсоида при переходе клеток бактерий в состояние покоя свидетельствовали результаты определения эластовязкости НК ДНК, а также данные электронной микроскопии. Выделенные из пролиферирующих и покоящихся клеток P. aurantiaca НК ДНК отличались по эластовязкости (602 ± 18 дл/г и 851 ±24 дл/г, соответственно), что отражало различия в степени суперспирализации ДНК [Стручков, Стражевская, 1993]. В опытах in vitro была продемонстрирована способность АОБ к взаимодействию с НК ДНК с изменением их структурной организации. Кривая зависимости эластовязкости НК ДНК от концентрации С12-АОБ имела точку излома в области молярных концентраций (10"4 М), которые индуцировали образование ЦПК псевдомонад. Роль гидрофобных участков для связывания с алкильными группами АОБ могут играть ДНК-связанные липиды. Пул прочно- и слабосвязанных с ДНК липидов, выделенный из клеток P. aurantiaca разного физиологического возраста, отличался по составу жирных кислот, входящих в состав разных классов липидов. Наличие специфического пула липидов, связанных с ДНК, расширяет представления о возможных механизмах взаимодействия АОБ с генетическим материалом клетки и их функциях при переходе клеток в покой.

Таким образом, внеклеточные видонеспецифичные низкомолекулярные ау-торегуляторы, представленные у ряда бактерий моно- и диалкилоксибензолами, контролировали в зависимости от их концентрации процессы приобретения и

поддержания клетками состояния покоя.

Обсумедение

Для широкого круга неспорообразующих бактерий доказано, что при их росте циклы развития культур завершаются образованием цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК). Выбор объектов исследования ограничивался, в основном, гетеротрофными эубактериями. Однако образование цистоподобных клеток показано для литоавтотрофно растущих бактерий Pseudomonas carboxydoßava [Эль-Регистан, 1988]; галоалкалофильных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkali-vibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum [Лойко и соавт., 2003]; метано-трофных бактерий Methylococcus capsulatus [Бабусенко, 1991]; экстремально га-лофильных архей Natrinema pallidum (результаты настоящей работы). Поэтому правомочно экстраполировать способность к образованию покоящихся форм этого типа на представителей разных физиологических групп прокариот.

Использование двух детерминант цистоподобные и покоящиеся для обозначения типа переживающих форм исследуемых бактерий обусловлено следующими соображениями. ЦПК морфологически схожи с типичными цистами азотобактера, образуются путем модификации вегетативной клетки, но отличаются от цист особенностями ультратонкого строения и характеристиками устойчивости (Глава 1). Итак, применение термина «цистоподобные» можно считать обоснованным. Однако морфологическое сходство ЦПК с цистами недостаточно для их отнесения к покоящимся формам. Так, у мутантов Rhodospirillum centenum описаны делящиеся гиперцисты [Berleman et al., 2004], а у Azospirillum brasilense - схожие с цистами С-формы с высокой нитрогеназной активностью [Berg et al., 1980], которые не являются пролиферативно или метаболически покоящимися. Поэтому для ЦПК бактерий - объектов исследования, выявлены физиологические характеристики (Глава 1), необходимые и достаточные для детерминации форм покоя прокариот [Sudo, Dworkin, 1973; Cross, Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977].

Повышенная устойчивость ЦПК к повреждающим воздействиям была сопряжена с экспериментально не выявляемым уровнем метаболической активности (Глава 1), хотя вопрос об интенсивности остаточного метаболизма остается открытым. Предметом дискуссий было наличие остаточной дыхательной активности у эндоспор бацилл: полное ее отсутствие [Spencer, Powell, 1952] или крайне низкое [Crook, 1952] потребление кислорода в зависимости от условий их хранения [Desser, Broda, 1969]. По-видимому, положение о невозможности существования абсолютно инертных биологических систем [Doi, Halvorson, 1961] распространяется на покоящиеся формы бактерий разных типов. Вопрос о длительности существования покоящихся (анабиотических) клеток целесообразно рассматривать с учетом их окружения. Периоды сохранения их пролиферативного потенциала могут быть различны в глубокомерзлых осадках или при хранении в провокационных условиях доступа влаги при положительных температурах.

В работе впервые показано внутривидовое разнообразие форм покоя бактерий, когда в разных условиях развития бактериальных культур в них образовывались покоящиеся клетки, различающихся структурной организацией, устойчивостью к повреждающим воздействиям и характером развития в новом цикле. Полиморфизм покоящихся клеток был известен ранее и присущ стрептомицетам, образующим эндо- и экзоспоры [Калакуцкий, Агре, 1977; Филиппова и соавт., 2005], миксобактериям (миксоспоры - периферические палочковидные клетки) [O'Connor, Zusman, 1991] и, по-видимому, многим микроорганизмам. Разная устойчивость различных типов покоящихся форм, образующихся одним и тем же штаммом бактерий при развитии культур в разных условиях, может быть обусловлена различиями в экспрессии ряда генов, в том числе существенных для ци-тодифференцировки и приобретения клетками стрессоустойчивости. Так, для бактерий показана экспрессия белков, которые специфичны для определенного типа голодания и, по-видимому, являются шаперонами, стабилизирующими структуру соответствующих белков [Matin, 1992; Holmquist, Kjelleberg, 1993]. Предложена гипотеза, согласно которой в ситуации голодания по аминокислотам (при дефиците источника N) в клетках накапливается гомосеринлактон, который положительно регулирует экспрессию альтернативного as- фактора, ответственного за транскрипцию генов стационарной фазы, важных для морфогенеза и развития стрессоустойчивости [Huisman, Kolter, 1994]. Альтернативные ст-факторы обнаружены у Bacillus subtilis [Haldenwang, Losick, 1980; Sonenshein, 2000], Mycobacterium smegmatis [DeMaio et al., 1996; Singh, Singh, 2008], Staphylococcus aureus [Kullik, Giachino, 1997], Pseudomonas [Fujita et al., 1994; Suh et al., 1999] и других бактерий. Однако зависимость регуляции ст-факторов при развитии бактерий в разных трофических условиях не изучена и требует дальнейших исследований.

Важным результатом работы является выявление универсальных закономерностей регуляции образования ЦПК, которая определяется трофическими условиями и клеточной плотностью и осуществляется при участии низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов (Глава 2). Трофическая регуляция образования ЦПК в пост-стационарной стадии развития бактериальных культур основана на создании в среде лимитов или дисбалансов источников питания, что имитирует ситуации в природных экосистемах. Универсальность применения лимитированных сред для массового образования ЦПК можно объяснить стимуляцией биосинтеза микробных аутоиндукторов анабиоза - алкилоксибензолов (АОБ) (табл. 11), контролирующих процессы перехода клеток в состояние покоя и приобретения ими повышенной устойчивости. Для синтеза АОБ - моноалкилрезор-цинов, обнаруженных в цистах азотобактера [Su, Sadoff, 1981] и в составе факторов di Pseudomonas carboxydoflava [Осипов и соавт., 1985], необходимы ацетил-

КоА, поли-Р-оксимасляная кислота и энергия НАДН [Sankawa et al., 1981]. Их пул повышается при стимуляции липогенеза и увеличении количества восстановителей за счет лимитирования среды роста источником N, изменения баланса ON, или недостатка 02 или Р [Su Sadoff; 1981; Романова, Емнова, 1980]. Разработка условий плотностной регуляции образования ЦПК (раздел 2.2) осуществлялась с учетом сопряженности автолиза и цитодифференцировки миксобактерий [Sudo, Dworkin, 1964]. В сформировавшемся плодовом теле с высокой клеточной плотностью происходит автолиз части популяции под воздействием смеси свободных ненасыщенных жирных кислот [Rosenbluh, Rosenberg, 1990]. В результате этого повышается внеклеточная концентрация аутоиндукторов спорообразования, и из интактных клеток формируются миксоспоры [Gerth et al., 1993]. В данной работе мы экстраполировали модель миксоспорообразования на другие микроорганизмы, у которых в контроле образования ЦПК участвуют аутоиндукторы автолиза [Светличный и соавт., 1986; Бабусенко и соавт., 1991] и анабиоза (АОБ).

Существенно расширены представления о функциях плотностных ауторегу-ляторов в процессах образования покоящихся форм (Глава 5). Ранее было установлено, что образование цистоподобных рефрактерных клеток у ряда бактерий и дрожжей контролируется аутоиндукторами анабиоза, представленных алкилокси-бензолами (АОБ) [Эль-Регистан и соавт., 1979; Осипов и соавт., 1985; Батраков и соавт., 1993]. Соединения того же класса - моноалкилрезорцины, были обнаружены в цистах грамотрицательных бактерий Azotobacter vinelandii [Su, Sadoff, 1981]. Однако недавно полученные данные о роли алкилрезорцинов в механизмах цис-тообразования у азотобактера оказались противоречивыми [Funa et al., 2006; Segura et al., 2009]. Поэтому в развитие этого направления исследований были выделены и идентифицированы аутоиндукторы анабиоза у бактерий — новых объектов, выявлены биологические эффекты АОБ, и выяснены некоторые механизмы их участия в процессах приобретения и поддержания состояния клеточного покоя.

Наличие алкилрезорцинов с двумя алкильными заместителями во 2- и 4- или во 2- и 5- положениях ароматического кольца (рис. 10) в составе аутоиндукторов анабиоза у микрококков и псевдомонад подтверждает возможность пути биосинтеза АОБ за счет конденсации «голова-к-голове» двух Р-кетоацильных эфиров -предшественников [Nowak-Thompson et al., 2003]. Закономерности динамики накопления АОБ в клетках и культуральной жидкости М. luteus (рис. 11а) при развитии запланированного стресса [Феофилова, 2003] в лаг-фазе (стресс новой среды) и при переходе в стационарную фазу (стресс голодания) оказались схожими с данными, показанными для других микроорганизмов [Коновалова и соавт., 1985; Светличный и соавт., 1986]. Приоритетным является доказательство видонеспе-цифичного и концентрационно-зависимого действия АОБ при образовании: 1)

жизнеспособных ЦПК; 2) утрачивающих колониеобразующую способность («не-культивируемых») клеток и 3) нежизнеспособных микромумий (раздел 5.3).

Проанализируем возможность участия АОБ в приобретении ЖНК-состояния [Xu et al., 1982; Colwell et al., 1985]. Основным подходом к получению ЖНК-клеток было создание стресса голодания у активно растущих культур при суспен-дировании в голодных средах с низкой клеточной плотностью [Kell et al., 1998; Oliver, 2005], где межклеточная коммуникация затруднена или отсутствует. Принципиально другой сценарий перехода клеток в состояние утраты колониеоб-разующей способности был обнаружен для пост-стационарных культур М. luteus, выросших в сбалансированной среде, с высокой клеточной плотностью и высоким потенциалом межклеточной коммуникации [Kaprelyants, Kell, 1993; Mukamolova et al. 1995]. В наших экспериментах была воспроизведена вторая модель и показан переход практически всей популяции микрококков в состояние невозможности образовывать колонии в культурах, развивавшихся в условиях жесткой лимитации азота, что способствовало повышенному биосинтезу АОБ (табл. 11). Снижение численности колониеобразующих клеток в длительно инкубируемых культурах ЦПК можно объяснить критическим повышением концентрации аутоиндук-торов анабиоза (для многих объектов - АОБ).

При изучении механизмов действия АОБ выявлены их модифицирующие и стабилизирующие эффекты, неспецифичные в отношении ферментных белков (раздел 5.4.1). Эти данные объясняют функции АОБ в ингибировании гидролаз, что предупреждает развитие автолитических процессов и обеспечивает интакт-ность ЦПК. Важная функция АОБ в процессах приобретения и поддержания состояния покоя определяется их антиоксидантной активностью [Ревина и соавт., 2003] в неферментативной системе защиты от активных форм кислорода, когда антиоксидантные ферменты обратимо инактивированы. Не менее важно действие АОБ как низкомолекулярных антиоксидантов при выходе клеток из покоя. В работе показано, что для прорастания ЦПК оптимальным было ограничение доступа кислорода (полужидкий агар, погруженный рост в МПР). Механизмы действия АОБ в обеспечении стабильности ДНК в покоящихся формах и их повышенной способности к фенотипической диссоциации могут быть обусловлены непосредственным взаимодействием с ДНК [Давыдова и соавт., 2005; 2006] или модифицирующим действием на надмолекулярные комплексы ДНК (раздел 5.4.2).

Видонеспецифичность действия АОБ, их распространенность [Kozubek, Tyman, 1999], широкий спектр биологического действия [Бухарин и соавт., 2005; Stasiuk, Kozubek, 2010], аутоиндукция их синтеза [Rejman, Kozubek, 2004] важны для понимания координации межклеточной и межвидовой коммуникации микроорганизмов в процессах сукцессии и функционирования микробного сообщества, а для симбиотрофных бактерий для контроля отношений с макроорганизмами.

выводы

1. Доказано образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорооб-разующих бактерий - грамположительных Micrococcus luteus, Arthrobacter glo-biformis, Mycobacterium smegmatis, M. phlei, Lactobacillus plantarum, Rhodococ-cus rhodochrous, Staphylococcus aureus и грамотрицательных Pseudomonas au-rantiaca, P. fluorescens, Escherichia coli, Azospirillum brasilense.

2. Эффективность образования покоящихся форм обеспечивается дисбалансом источников питания в среде; стрессом голодания; индукцией автолиза у части популяции с высокой клеточной плотностью; повышением в культуре концентрации аутоиндукторов анабиоза (алкилоксибензолов).

3. ЦПК неспорообразующих бактерий образуются в циклах развития их культур и обладают всеми признаками покоящихся форм прокариот: длительным сохранением жизнеспособности; экспериментально не выявляемым уровнем метаболической активности; повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям; особенностями ультраструктурной организации.

4. В разных условиях развития в культурах неспорообразующих (Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aurantiaca, Azospirillum brasilense и др.) и спорообра-зующих {Bacillus subtilis, В. cereus) бактерий формируются покоящиеся формы различных морфологических типов и степени устойчивости к повреждающим воздействиям. Наличие ЦПК у спорообразующих бацилл является проявлением полиморфизма форм покоя и альтернативой эндоспорам в условиях репрессии спорообразования.

5. Доказана внутрипопуляционная гетерогенность покоящихся форм одного и того же типа по устойчивости к повреждающим воздействиям; отклику на ростовые условия; потребности в специфических условиях для прорастания.

6. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПК проявляется в расширении спектра фенотипической диссоциации популяций, прорастающих из этих покоящихся форм. Это сопровождается появлением и развитием фенотипов, отличных от доминантного типа по колониально - морфологическим, ростовым, биохимическим признакам и устойчивости к антимикробным агентам.

7. Покоящиеся формы поддаются выявлению в природных образцах прямыми микроскопическими методами. Для дифференциального определения вегетативных и покоящихся клеток бактерий разработаны диагностические критерии, основанные на особенностях ультраструктурной организации и различиях в соотношениях Са/К и P/S. Показана возможность более полного учета численности потенциально жизнеспособных покоящихся форм, а также повышения чувствительности ПЦР при использовании эндоспор и ЦПК как источника матриц.

8. Выявлено видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных микробных ауторегуляторов - алкилоксибензолов (АОБ), в ингибирова-нии роста бактериальных культур и переходе клеток в состояние покоя.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Экспериментальные статьи

1. Мулюкин А.Л.. Козлова А.Н., Капрельянц A.C., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d! в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus И Микробиология. 1996. T. 65. С. 20-25

2. Мулюкин А.Л.. Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н.. Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И., Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus // Микробиология 1996. Т.65 С. 782-789

3. Vorobyova Е.А., Soina V.S., Mulukin A.L. Microorganisms and enzyme activity in permafrost after removal of long-term cold stress//Adv. Space Res. 1996. V. 18. N. 12. P. 103-8.

4. Мулюкин А.Л.. Луста K.A., Грязнова M.H., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н.. Дужа М.В., Митюшина Л.Л., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автоли-зируюгцихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология 1997 Т. 66 С. 42-49

5. Беспалов М.М., Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л.. Козлова А.Н., Варламова Е.А., Колпаков А.И., Курганов Б.И., Эль-Регистан Г.И. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при создании метаболического блока в клетке // Микробиология. 2000. Т.69. С. 217-223.

6. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Мулюкин А .Л.. Дрейер Ф., Эль-Регистан Г.И. Влияние мембраноактивных микробных ауторегуляторов на рост культуры ras-трансформированных фибробластов мыши // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т. 62. С. 475-480.

7. Мулюкин А.Л.. Демкина Е.В., Козлова А.Н., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и осадочных породах // Микробиология 2001.Т.70 С.620-628.

8. Сузина Н.Е., Мулюкин AJI.. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев B.C., Горленко М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Гонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндук-тора анабиоза // Микробиология. 2001. Т. 70. С. 776-787.

9. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л.. Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология 2002 Т.71 С.23-29.

10. Мулюкин А.Л.. Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Воробьева Е.А., Эль-Регистан Г.И. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов // Микробиология. 2002. Т. 71. С. 37-48.

П.Богданова Т.И., Мулюкин А.Л.. Цаплина И.А., Эль-Регистан Г.И., Каравайко Г.И. Влияние состава среды и условий культивирования на спорообразование хемолито-трофных бактерий // Микробиология. 2002. Т. 71. С. 187-193.

12. Мулюкин А.Л.. Сорокин В.В., Воробьева Е.А., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Применение метода рентгеновского микроанализа для выявления и предварительной оценки физиологического состояния микроорганизмов в объектах окружающей среды // Микробиология. 2002. Т. 71. С. 836-848.

13. Mulvukin A.L.. Soina V.S., Demkina E.V., Kozlova A.N. Suzina N.E., DmitrievV.V., Duda V.l., El-Registan G.I. Formation of resting cells by non-spore-forming microorganisms as strategy of long-term survival in the environment // Proc. SPIE 2003.V.4939 P. 208-218.

14. Степаненко И.Ю.,Страховская М.Г., Беленикина H.С., Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л.. Ревина A.A., Эль-Регистан Г.И. Защита Saccharomyces cerevisiae алкилоксибензолами от окислительного и радиационного поражения // Микробиология 2004 Т.73 С. 204-210.

15.Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий //Микробиология 2004. Т.73 С.516-529.

16. Soina V.S., Mulvukin A.L.. Demkina E.V. Vorobyova E.A. El-Registan G.I. The structure of resting microbial populations in soil and subsoil permafrost//Astrobiology 2004 V. 4 P.345-358.

17. Степаненко И.Ю., Мулюкин A.JI.. Козлова A.H., Николаев Ю.А., Эль-Регистан Г.И. Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteus к температурному шоку // Микробиология. 2005. Т. 74. С. 26-33.

18. Мулюкин А.Л.. Вахрушев М.А., Стражевская Н.Б., Шмырина А.С., Жданов Р.И., Су-зина Н.Е., Дуда В.И., Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И. Влияние микробных аутоиндук-торов анабиоза- алкилоксибензолов - на структурную организацию ДНК P. aurantiaca и индукцию фенотипической диссоциации // Микробиология 2005 Т.74.С. 157-165.

19. El-Registan G.I., Mulvukin A.L.. Nikolaev Yu.A., Stepanenko I.Yu., Kozlova A.N., Marti-rosova E.I., Shanenko E.F., Strakhovskaya M.G., Revina A.A. The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation and heat shock // J. Adv. Space Res. 2005 V.36 P. 1718-1728.

20. Мулюкин А.Л.. Филиппова C.H., Козлова A.H., Сургучева Н.А., Богданова Т.И., Цап-лина И.А., Эль-Регистан Г.И. Видонеспецифичность действия низкомолекулярных ау-торегуляторов - неацилированного лактона гомосерина и гексилрезорцина - на рост и развитие бактерий // Микробиология. 2006. Т. 75 С.472-482.

21. Suzina N.E., Mulvukin A.L.. Dmitriev V.V., Nikolaev Y.A., Shorokhova A.P., Bobkova Yu.S., Barinova E.S., Plakunov V.K., El-Registan G.I., Duda V.I. The structural bases of long-term anabiosis in non-spore-forming bacteria// J.Adv.Space Res.2006 V.38. P.1209-1219.

22.Zhdanov R.I, Shmyrina A.S., Zarubina T.V., Mulvukin A.L.. El-Registan G.I., Haupt N., Kraus A., Lorenz W. The nature of DNA-bound fatty acids in Pseudomonas aurantiaca II FEMS Microbiol. Lett. 2006. V. 265 N 2. P. 151-158.

23. Жданов Р.И., Шмырина A.C., Мулюкин А.Л.. Эль-Регистан Г.И., Зарубина Т.В., Краус А., Гаупт Н., Лоренц В. В прокариотах присутствует фракция липидов, прочносвязанная с геномной ДНК // Доклады Академии Наук. 2006. Т. 410. С.828-831.

24. Tychinsky V.P., Mulvukin A.L.. Lisovskii V.V., Nikolaev Yu. A., Kretushev A.V., Vyshen-skaya T.V., Suzina N.E., Duda V.I., El-Registan G.I. Dynamic phase microscopy, a new method to detect viable and killed spores and to estimate the heterogeneity of spore populations // J. Adv. Space Res. 2007 V.40. P. 1678-1685.

25. Мулюкин А.Л.. Сузина H.E., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Структурное и физиологическое разнообразие цистоподобных покоящихся форм бактерий рода Pseudomonas И Микробиология. 2008. Т.77. С. 512-23.

26.Мулюкин А.Л.. Козлова А.Н., Эль-Регистан Г.И.Свойства фенотипических диссоциан-тов бактерий Pseudomonas aurantiaca и /\/7«ог«се/«//Микробиология 2008 Т.77 С.766-776

27. Мулюкин А.Л.. Сузина Н.Е., Погорелова А.Ю., Антонюк Л.П., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Разнообразие морфотипов покоящихся клеток и условия их образования у Azospirillum brasilense 11 Микробиология. 2009. Т. 78. С. 42-51.

28. Стражевская Н.Б., Мулюкин А.Л.. Шмырина А.С., Краус А., Лоренц В., Жданов Р.И., Эль-Регистан Г.И. Различия жирнокислотного профиля ДНК-связанных липидов Pseudomonas aurantiaca в зависимости от физиологического возраста бактерий // Микробиология. 2009. Т.78. С. 59-67.

29.Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л.. Козлова А.Н., Каплун А.П., Сорокин В.В., Борзенков И.А., Николаев Ю.А., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Влияние гексилрезорцина - химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза - на стабильность мембранных структур // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45 С. 181-187.

30.Anuchin A.. Mulvukin A.. Suzina N., Duda V., El-Registan G., Kaprelyants A. Dormant forms of Mycobacterium smegmatis with distinct morphology //Microbiology 2009 V.155 P.1071-1079.

31. Голод H.А., Лойко H.А., Мулюкин А.Л.. Нейматов А.Л., Воробьева Л.И., Сузила Н.Е., Шаненко Е.Ф., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Микробиология 2009. Т.78 С. 317-327.

32. Мулюкин А.Л.. Демкина Е.В., Кряжевских Н.А., Сузина Н.Е., Воробьева Л.И., Дуда В.И., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы Micrococcus luteus и Аг-throbacter globiformis, не прорастающие на стандартных средах // Микробиология 2009. Т. 78. С. 456-468.

33. Погорелова А.Ю., Мулюкин А.Л.. Антонюк Л.П., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Фенотипическая вариабельность у Azospirillum brasilense шт. Sp7 и sp245: сопряженность с состоянием покоя и свойства диссоциантов //Микробиология. 2009 Т.78 С.618-628.

34. Горшков В.Ю., Петрова О.Е., Мухаметшина Н.Е., Агеева М.В., Мулюкин А.Л.. Гоголев Ю.В. Образование «некультивируемых» покоящихся форм фитопатогенной энте-робактерией Erwinia carotovora II Микробиология. 2009. T. 78. С. 647-655.

35. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Мулюкин А.Л.. Торопыгин И.Ю. Механизм действия реактивирующего фактора Luteococcus japonicus subsp. casei II Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. С. 544-549.

36. Мулюкин А.Л.. Сузина Н.Е., Данилевич В.Н., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Формы длительного выживания неспорообразующих бактерий // Бюллетень Московского Общества Испытателей природы. 2009. Т. 114. Вып. 2. п. 1. С. 179-180.

37. Мулюкин А.Л.. Кудыкина Ю.К., Шлеева М.О., Анучин A.M., Сузина Н.Е., Данилевич В.Н., Дуда В.И., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм Mycobacterium smegmatis // Микробиология. 2010. Т. 79. С. 486-497.

Обзоры

1. Эль-Регистан Г.И., Мулюкин А.Л.. Николаев Ю.А., Сузина Н.Е., Гальченко В.Ф., Дуда В.И. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов // Микробиология. 2006. Т.75. С. 446-456.

2. Николаев Ю.А., Мулюкин А.Л.. Степаненко И.Ю., Эль-Регистан Г.И. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов // Микробиология 2006. Т. 75. С.489-496.

Главы в книгах

1. Mulvukin A.L.. Sorokin V.V., Suzina N.E., Duda V.I., Kolpakov A.N., Ilinskaya O.N., El-Registan G.I. Resting microbial forms. Dormancy inducing autoregulatory factors//In: Frontiers of Life (Gelnikier, L.M., Trân Thanh Vân, J., Ed). THÉ GIÔI Publisher. 2003. P. 145-151.

2. Vorobyova E., Soina V, Yaminsky I., Mulvukin A.. Mamukelashvili A. Living cells in permafrost as models for astrobiology research. In: "Life in Ancient Ice" (Castello, J.D. and Rogers S.O., eds). Princeton University Press. 2005. P. 277-288.

3. Демкина E.B., Соина B.C., Мулюкин А.Л.. Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах // В кн. «Почвенные процессы и пространственно-временная организация почв». Москва: Наука. 2006. С. 158-173.

Заявки на патенты

1. Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гальченко В.Ф., Борзенков И.А.,

Козлова А.Н., Мулюкин А.Л.. Гернет М.В, Шаненко Е.Ф., Воронина Н.А., Кочеткова А.А.

Заявка о выдаче патента РФ на «Способ защиты материалов от микробного разрушения»

№ 2009 109569 от 17.03.2009 (положительное решение).

2. Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Калинин М.В., Гальченко В.Ф., Борзенков И.А.,

Козлова А.Н., Мулюкин А.Л.. Гернет М.В, Шаненко Е.Ф., Воронина Н.А., Кочеткова А.А.

Заявка о выдаче патента РФ на «Способ защиты материалов от микробного разрушения»

№ 2009 122403 от 11.06.2009.

Публикации в материалах научных мероприятий

1. Воробьева Е.А., Соина B.C., Мешкова Н.В., Мулюкин A.J1. Сравнительная оценка биологической активности в тундровых почвах и вечномерзлых породах// Сб. мат. I Международной конференции "Криопедология" (10-14 ноября 1992, Пущино), С. 222-225.

2. Krylova Е.А., Babak V.G., Mulyukin A.L., Kozlova A.N., Duzha M.V., El-Registan G.I. Gelatin microcapsules impregnated with non-toxic antimicrobial agent with a broad range of action //Proc.5 Int. Workshop on Bioencapsulation, Sept. 22-25, 1996, Potsdam, Germany. P. 26126 V.

3. Krylova E.A., Mulyukin A.L., Lukina I.G., Kozlova A.N., El-Registan G.I., Plashchina I.G., Babak V.G., Poncelet D. Stable polysaccharide gelling systems for bioencapsulation //Proc. 6 Int. Workshop on Bioencapsulation, Aug.30 - Sept. 1,1997, Barcelona, Spain, P. 2.5.1 - 2.5.IV.

4. Soina V. S., Mulyukin A.L., Vorobyova E.A., Sorokin V.V., El-Registan G.I. Diagnostics of the physiological state of bacteria in terrestrial permafrost as analogue of Martian environment // Proc. Second European Workshop on Exo/Astrobiology, Graz, Austria, 16-19 Sept. 2002 (ESA-SP-518, November 2002). P. 291-294.

5. Bolshakova A.V., Vorobyova E.A., Yaminsky I.V., Mulyukin A.L., Soina V.S. Atomic force microscopy studies of bacteria from natural environments // Proc. Ill European Workshop on Exo-Astrobiology. Mars: The Search for life. 18-20 Nov 2003, Madrid, Spain. P. 171-172. Тезисы докладов (наиболее существенных)

1. Moulioukine A.L., Sorokin V.V., Suzina N.E., Duda V.I., El-Registan G.I., Viable and nonviable resting microbial forms // Abstr. 12-emes Rencontres de Blois "Frontiers of Life". 2000, June 25-July 1, Blois, France. P. 39-40.

2. Moulioukine A.L., Sorokin V.S., Suzina N.E., Duda V.I., El-Registan G.I., Electron microscopy studies and X-ray microanalysis of individual microbial cells in different physiological states // Proc. GeoExtreme Euro Workshop, May 5-10,2001, Tremiti, Italy, pp. 3-4.

3. Mulyukin A.L., Soina V.S., Kozlova A.N. Suzina N.E., Dmitriev V.V., Duda V.I., El-Registan G.I., Formation of resting cells by asporogenous microorganisms as a strategy of long-term survival in the environment // Abstr. Int. Conference Instruments, Methods and Missions for Astrobiology V, Moscow, PIN RAS, May 24-25, 2002, p. 115.

4. Mulyukin, A.L., Suzina, N.E., Sorokin, V.V., Soina, V.S., Vorobeva E.A., Dmitriev, V.V., Duda, V.I., El-Registan, G.I., Some promising approaches to analysis of physiological state of microorganisms in situ // Abstr. 2ld European Workshop on Exo/Astrobiology. Graz, Austria, September 16-19,2002, p. 161-162.

5. Mulyukin A., Suzina N., Sorokin V., Soina V., Vorobyova E., Duda V., El-Registan G. Dormant state in bacteria: Conceptions and implications for terrestrial biogeoscience and astro-biology// Geophysical Research Abstracts, Vol. 5, 01003. 2003 (Eur. Geophys. Soc. 2003)

6. El-Registan G.I., Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Stepanenko I.Yu., Kozlova A.N., Shanenko E.F., Strakhovskaya M.G., Revina A.A. The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation // Abstr. 35th Scientific Assembly COSPAR. 2004. July 17-24. Paris, France.

7. Мулюкин A.JI., Сузина H.E., Николаев Ю.А., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий: условия образования, свойства и значение // Тез. Межд. научной конференции памяти проф. М.В.Гусева «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва, МГУ, 16-19 мая, 2006 г. С. 60.

8. Mulyukin A.L., Nikolaev Yu.A., Suzina N.E., Duda V.I., El-Registan G.I. Formation of resting forms by non-spore-forming microorganisms in response to stress // Abstr. 2nd FEMS congress of European microbiologists, Spain, Madrid, July 4-8,2006. P. 301.

9. Mulyukin A.L., Suzina N.E., Danilevich V.N., Duda V.I., El-Registan G.I. Dormancy in some non-spore-forming as the strategy of their survival in cold habitats // Abstr. SCAR-IASC-IPY Open Science Conference. July 8-11. St. Petersburg. 2008. S3.3/016.

ЛР № 063109 от 04.02.1999 г

Формат 60x90/16. Заказ 936. Тираж 120 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Мулюкин, Андрей Львович

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Явление покоя у бактерий

1.1. Основные термины и положения

1.2. Стационарные (пролиферативно покоящиеся) клетки

1.3. Специализированные покоящиеся формы бактерий

1.3.1. Типы специализированных покоящихся форм

1.3.2. Генетические механизмы контроля образования покоящихся форм

1.3.3. Свойства специализированных покоящихся форм 41 1.3.4 Механизмы устойчивости и прорастания покоящихся форм (на примере эндоспор)

1.3.5. Диагностика покоящихся форм

Глава 2. Состояние покоя у неспорообразующих бактерий

2.1. Некультивируемые клетки "

2.1.1. Ультрамикробактерии

2.1.2. Жизнеспособные некультивируемые клетки

2.1.3. Восстановление способности некультивируемых клеток ревертировать к росту

2.2. Недостаточно изученные способы выживания неспорообразующих бактерий

2.3. Цистоподобные формы

Глава 3 . Ауторегуляция процессов образования покоящихся форм

3.1. Ауторегуляция процессов образования спор и акинет

3.2. Ауторегуляция цитодифференцировки и синтеза вторичных метаболитов стрепто-мицетов

3.3. Ауторегуляторы развития миксобактерий

3.4. Кворум-сенсинговая регуляция стационарной фазы

3.5. Ауторегуляторные факторы и сЬ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования

4.1. Объекты

4.2. Базовые среды и условия культивирования микроорганизмов

4.3. Микробиологические методы

4.4. Стрессорные воздействия и устойчивость клеток

4.5. Приемы реанимации покоящихся клеток

4.6. Исследование фенотипической диссоциации

4.7. Микроскопические методы

4.8. Биохимические методы 91.

4.8.1. Включение радиоактивно-меченых предшественников белков и нуклеино- 91 вых кислот

4.8.2. Выделение, очистка и идентификация ауторегуляторнык факторов (¿

4.8.3. Выделение надмолекулярных комплексов ДНК (НК ДНК)

4.8.4. Выделение клеточных липидов и определение их содержания

4.8.5. Анализ метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК)

4.8.6. Определение активности ферментов

4.9. Молекулярно-генетические методы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 5. Свойства цистоподобных покоящихся форм.

5.1. Особенности морфологии и ультраструктурной организации

5.2. Длительность сохранения колониеобразующей способности

5.3. Экспериментально не выявляемая метаболическая (дыхательная) активность

5.4. Устойчивость к повреждающим воздействиям

5.5. Доказательства образования ЦПК как этапа в цикле развития культур

Глава 6. Условия образования цистоподобных покоящихся клеток неспорообразующих бактерий

6.1. Трофическая регуляция образования ЦПК

6.2. Плотностная регуляция образования ЦПК

6.3. Развитие стресса голодания

6.4. Внесение химического аналога аутоиндукторов анабиоза

Глава 7. Разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий

7.1. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм неспорообразующих бактерий

7.1.1. Разнообразие ЦПК P. awantiaca и P.flnorescens

7.1.2. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм М. smegmatis

7.2. Межштаммовый уровень разнообразия покоящихся форм

7.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм

7.3.1. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПКМ luteus

7.3.2. Внутрипопуляционный уровень разнообразия покоящихся форм у

М. smegmatis

7.3.3. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) по показателям термоустойчивости и реверсии к росту

Глава 8. Фенотипическая вариабельность: сопряженность с состоянием покоя и свойства дпссоциантов

8.1. Фенотипическая диссоциация у P. aurantiaca и P. flitorescens

8.2. Фенотипическая вариабельность у штаммов Sp7 и sp245 A. brasilense

8.3. Фенотипическая диссоциация с выщеплением антибиотикоустойчивых вариантов

8.4. Изучение фенотипической диссоциации с выщеплением вариантов, различающихся по показателям устойчивости и способности к образованию покоящихся форм как механизма переживания бактерий в окружающей среде

Глава 9. Диагностика и более полное выявление покоящихся форм

9.1. Изучение покоящихся клеток в природных субстратах in situ прямыми микроскопическими методами '

9.2. Разработка специальных процедур и применение различных методов учета для выявления пролиферативно-активных покоящихся клеток, не обнаруживаемых методами посевов

9.3. Повышение чувствительности ПЦР для детекции покоящихся форм как источника ДНК-матриц

Глава 10. Ауторегуляция процессов перехода бактерий впокоящееся состояние

10.1. Выделение и изучение природы ауторегуляторных факторов di

10.2. Динамика накопления ауторегуляторного фактора di Micrococcus luteus

10.3. Биологические эффекты АОБ

10.3.1. Биологическая активность ауторегуляторных факторов

10.3.2. Зависимость эффектов АОБ от возраста культур

10.3.3. Зависимость эффектов АОБ от их концентрации

10.3.4. Универсальность и особенности ауторегуляции, осуществляющейся при участии факторов di (АОБ)

10.3.5. Функции АОБ в образовании нежизнеспособных мумифицированных кле- 249 ток

10.4. Механизмы действия АОБ в процессах приобретения и поддержания состояния покоя

10.4.1. Роль АОБ в ингибировании метаболических процессов у покоящихся форм и их устойчивости

10.4.2. Роль АОБ в изменении структурной организации ДНК

10.4.3. Функции АОБ при прорастании покоящихся форм 268 10.5. Сравнительное изучение действия низкомолекулярных ауторегуляторов - неаци-лированного лактона гомосерина и алкилоксибензола - на рост и развитие бактерий

Прикладные аспекты исследований

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий"

Актуальность проблемы и состояние вопроса

При изменении условий окружающей среды - исчерпании питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей, происходит или снижение скорости роста микроорганизмов, или стратегия роста заменяется стратегией переживания и перехода в состояние покоя. Начало исследований покоящегося состояния у микроорганизмов положили работы Ф. Кона и Р. Коха, описавших в 1876 г. эндоспоры бацилл. Наибольшую интенсивность и разносторонность изучение форм и механизмов покоя приобрело в середине XX века в рамках отдельного направления микробиологии. В настоящее время интерес к явлению покоя обусловлен явлением персистенции возбудителя туберкулеза [Wayne, 1994; Zhang, 2004] и других заболеваний [Watson et al., 1998; Бухарин и соавт. 2005], существованием антибио-тикоустойчивых клеток-персисторов [Keren et al. 2004, Lewis, 2007], обнаружением древних микроорганизмов [Cano, Borucky, 1995; Vreeland et al. 2000], в том числе, в глубокомерзлых породах [Звягинцев и соавт., 1985]. Однако у большинства видов неспорообразующих бактерий покоящиеся формы неизвестны, что определило актуальность диссертационной работы.

Множество публикаций посвящено жизнеспособному некулътивируемому (ЖНК) состоянию бактерий, в котором клетки, сохраняя потенциальную жизнеспособность, утрачивают способность образовывать колонии на плотных средах [Xu et al., 1982; Colwell et al., 1985; Oliver et al., 1993; Mukamolova et al., 1995; Oliver, 2005; Sachidanandham, Yew-Hoong Gin, 2009]. Несмотря на дискуссии по поводу адекватности этого термина состоянию неделения и сохранения клетками жизнеспособности [Bloomfield et al. 1998; Головлев, 1998; Barer, Har-wood, 1999], не вызывает сомнений существование самого явления и важность его исследований особенно в связи с мониторингом патогенных и условно-патогенных бактерий в природных местах обитания. ЖНК-состояние рассматривают и как форму покоя [Kaprelyants et al., 1993; Rahman et al., 1996], и как стадию на пути к отмиранию популяции [Joux et al., 1997; McDougald et al., 1998]. Некоторые авторы считают, что пребыванием клеток в таком состоянии нельзя объяснить длительное выживание бактерий в неростовых условиях [Bogosian et al., 1996]. Облигатное свойство всех бактерий формировать в циклах развития их культур покоящиеся «микроцисты», предназначенные для выживания вида, постулировалось Биссетом [Bisset, 1952]. Экспериментальные доказательства справедливости этой гипотезы - образование клеток цистоподобного типа, были получены позже для узкого круга микроорганизмов [Дуда и соавт., 1982; Sadasivan, Neyra, 1987; Бабусенко и соавт., 1991; Garduno et al., 2002; Berleman, Bauer, 2004]. При описании новых таксонов ряда неспорообразующих прокариот отмечалось образование клеток, схожих по строению с цистами [Горленко и соавт., 1976; Жилина, Заварзин, 1979; Heulin et al., 2003; Zhang et al., 2003; Zhilina et al., 2004; Ahmed et al., 2007]. При этом в работах таксономической направленности не исследовали их свойства как форм, предназначенных для длительного переживания вида. Отсутствие информации о покоящихся формах неспорообразующих бактерий обусловлено, во многом, отсутствием сведений об условиях, оптимальных для их образования в лабораторных культурах. При этом без достаточного количества покоящихся клеток невозможно исследование их свойств. Следует отметить, что трактовка термина «покой» для неспорообразующих бактериям широка и охватывает: (1) клетки культур стационарной фазы [Vulic, Kolter, 2001]; (2) некультивируемые формы [Roszak, Colwell, 1987; Kaprelyants et al., 1993]; (3) неактивные клетки в биопленках [Costerton et al., 1999; Xu et al., 1998]; (4) антибиотико-устойчивые персисторы [Shah et al., 2006]; (5) вышеупомянутые клетки цистоподобного типа. Это не тождественные состояния пролиферативного и метаболического покоя. Основанием для отнесения клеток к покоящимся формам прокариот является доказательство: 1) длительного сохранения их способности к репродукции; 2) резко сниженной или экспериментально не выявляемой метаболической активности; 3) повышенной устойчивости к повреждающим воздействиям; 4) отличий в ультраструктурной организации от вегетативных (делящихся и стационарных) клеток; 5) их образования в циклах развития культур - в соответствии с определением, принятым в литературе по спорам [Sudo, Dworkin, 1973; Cross, Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977].

Другой важной проблемой при изучении способов выживания! микроорганизмов в природе в неростовых условиях является выяснение закономерностей и регуляции образования покоящихся форм. К настоящему времени накоплен обширный материал о сигнальных метаболитах и регуляторных системах, контролирующих многие процессы в циклах развития микробных популяций, такие как длительность лаг-фазы, споро- и антибиотикообразование, реактивацию некультивируемых клеток микрококков и др. [Хохлов, 1988; Fuqua et al., 1994; Олескин и соавт., 2000; Lazazzera, 2000; DeLisa, Bentley, 2002; Mukamolova et al., 1998; 2006]. Описаны плотностные ауторегуляторы — ацилированные гомосеринлактоны (ГСП) у ряда грамотрицательных бактерий, которые в зависимости от клеточной плотности популяции-контролируют индукцию ряда синтезов в стационарной фазе [Fuqua et al., 1994; Greenberg et al., 1996; Taga, Bassler, 2005]. Участие этих факторов в регуляции состояния покоя неизвестно. Регуляторы другого типа - факторы d|, представленные у ряда бактерий алкилоксибензо-лами (АОБ), имеют функции аутоиндукторов анабиоза [Эль-Регистан и соавт., 1979; 1980; Светличный и соавт., 1986; Осипов и соавт., 1985; Батраков и соавт., 1993; Лойко и соавт., 2002]. Безусловную важность представляет дальнейшее развитие исследований регуляции образования покоящихся форм у широкого круга микроорганизмов, осуществляющейся с участием коммуникативных факторов из групп алкилоксибензолов и гомосеринлактонов, а также изучение их видо(не)специфичности и функциональной роли в переходе клеток в состояние покоя и выходе из него.

Цель работы

Цель настоящего исследования - изучить способы выживания неспорообразующих бактерий в неростовых условиях: морфотипы покоя, условия и регуляцию образования и характеристики покоящихся клеток.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) выявить условия, способствующие образованию цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий в циклах развитая их культур;

2) охарактеризовать ЦПК как формы покоя по показателям: длительности сохранения про-лиферативного потенциала; отсутствия метаболической активности; устойчивости к повреждающим воздействиям; особенностям ультраструктурной организации;

3) охарактеризовать внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм по морфологическим типам, способности ревертировать к росту, степени глубины покоя, устойчивости к повреждающим воздействиям, фенотипической диссоциации при прорастании;

4) изучить роль внеклеточных ауторегуляторных факторов микроорганизмов в контроле перехода бактерий в состояние покоя и его поддержании;

5) разработать подходы к диагностике покоящихся форм бактерий в лабораторных культурах и природных образцах.

Научная новизна и значимость работы

Для широкого круга неспорообразующих грамположительных и грамотрицательных бактерий доказано, что при их росте в различных условиях цикл развития культур завершается образованием цистоподобных клеток (ЦПК), обладающих всеми признаками покоящихся форм прокариот. Для массового образования ЦПК в лабораторных культурах разработаны воспроизводимые условия, имитирующие природные. Эти условия принципиально применимы для получения покоящихся форм бактерий других таксонов с учетом специфики их ростовых потребностей.

Впервые показано внутривидовое и внутрипопуляционное разнообразие покоящихся форм бактерий. Внутривидовое разнообразие проявляется как полиморфизм покоящихся клеток и зависит от условий их образования. Внутрипопуляционное разнообразие покоящихся клеток определенного морфотипа выражается в их разнокачественности по устойчивости к повреждающим воздействиям, отклику на условия прорастания и потребности в специальных процедурах реактивации. Показаны различия в способности покоящихся клеток разных типов ■ к фенотипической диссоциации. Расширены представления о функциях плотностных ауторе-гуляторов в процессах образования покоящихся форм. Продемонстрировано видонеспеци-фичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных алкилоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не прорастающих на плотных средах, некультивируемых клеток и 3) нежизнеспособных микромумий. Показана принципиально сходная и видонеспе-цифичная функция алкилоксибензолов и неацилированного гомосеринлактона в ограничении роста численности клеток популяции и смене стадий развития бактериальных культур.

Для повышения эффективности экологического мониторинга разработаны диагностические критерии для обнаружения ЦПК в природных образцах ш situ, в том числе глубокомерзлых осадках. Критерии основаны на учете особенностей ультраструктурной организации покоящихся форм и соотношения в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Для покоящихся форм, не образующих колонии на обычных средах, применены разные методы учета и приемы выявления жизнеспособных клеток за счет варьирования состава сред для снятия эффекта субстрат-ускоренной смерти и защиты от окислительного стресса. Показана возможность повышения чувствительности ПЦР при использовании покоящихся форм бактерий (ЦПК и эндоспор) как источников матриц ДНК.

Практическая значимость работы

Полученные результаты могут быть использованы для: 1) совершенствования методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов; 2) разработки способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов; 3) повышения эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга ок- -ружающей среды за счет учета покоящихся и не прорастающих на плотных средах клеток. Цистоподобные покоящиеся клетки сапротрофных аналогов патогенных бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов (АОБ) испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде 2 заявок на патенты РФ.

Основные защищаемые положения:

4. Покоящиеся формы бактерий можно выявлять по их диагностическим критериям прямыми микроскопическими методами, более полно учитывать культуральными методами и использовать в ПЦР.

5. Процессы приобретения, развития и поддержания состояния покоя контролируются внеклеточными видонеспецифичными низкомолекулярными ауторегуляторами, представленными у ряда бактерий моно- и диалкилоксибензолами.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены в форме устных и стендовых сообщений на: International Workshops on Bioencapsulation" (Потсдам, Германия, 1996; Барселона, Испания, 1997); 12-emes Rencontres de Blois "Frontiers of Ше"(Блуа, Франция, 2000); Geo-Extreme Workshop (Тремити, Италия, 2001); 3rd Int. Conference on Protein Stabilisation (Тулуза, Франция, 2002); Bacterial Paleontology/ Astrobiology (Москва, ПИН РАН, 2002); Second European Workshop on Exo/Astrobiology (Грац, Австрия, 2002); European Geophysical Society-2003 (Ницца, Франция, 2003); 1st и 2nd FEMS Congress European microbiologists (Любляна, Словения, 2003; Мадрид, Испания, 2006); 35th Scientific Assembly COSPAR (Париж, Франция, 2004); Российско-французском семинаре «Восток 2005» (Репино, Ленинградская обл., 2005); Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиоти-ческих систем» (Саратов, 2007); Open Science Conference SCAR-IASC-IPY (Санкт-Петербург, 2008); Конференциях памяти проф. М.В.Гусева «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (МГУ, 2006; 2009); конкурсах научных работ ИНМИ РАН.

Публикации- По материалам диссертации опубликовано 74 работы, включая 37 экспериментальных статей, 2 обзора (38 в списке журналов ВАК), 3 главы в монографиях, 5 работ в материалах научных мероприятии, 2 заявки на патент, 26 тезисов докладов.

Бюджетное финансирование. Работа выполнена в рамках тем «Разработка методических приемов хранения, поддержания и учета культур уникальных и экстремофильных микроорганизмов» (№ гос/рег. 01200213054); «Ауторегуляция адаптации и устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям» (№ 01200213058); «Выживание микроорганизмов: клеточные формы, механизмы, регуляция» (№ 01200601980). Исследования были осуществлены при поддержке грантов РФФИ 99-04-49144, 01-04-48771, 02-04-49150, 03-04-48403, 04-0449710, 05-04-49520, 06-08-01469, 07-04-01011; прикладного гранта РФФИ-офи-07-04-12121.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 349 страницах текста и включает 86" рисунков и 51 таблице; состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием методов и результатов исследования, заключения, выводов и списка литературы (100 русских и 628 иностранных наименований).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мулюкин, Андрей Львович

выводы

1. Доказано образование цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) у неспорообразующих бактерий - грамположительных Micrococcus luteus, Arthrobacter globiformis, Mycobacterium smegmatis, M. phlei, Lactobacillus plantarum, Rhodococcus rhodochrous, Staphylococcus aureus и грамотрицательных Pseudomonas aurantiaca, P. fluorescens, Escherichia coli, Azospirillum brasilense.

3. ЦПК неспорообразующих бактерий образуются в циклах развития их культур и обладают всеми признаками покоящихся форм прокариот: длительным сохранением жизнеспособности; экспериментально не выявляемым уровнем метаболической активности; повышенной устойчивостью к повреждающим воздействиям; особенностями «ультраструктурной организации.

4: В ^разных условиях развития в культурах неспорообразующих (Mycobacterium smegmatis, Pseudomonas aurantiaca, Azospirillum brasilense и др.) и спорообразующих (Bacillus snb-tilis, В. се re us) бактерии формируются покоящиеся формы различных морфологических типов и степени устойчивости к повреждающим воздействиям. Наличие ЦПК у спорообразующих бацилл является проявлением полиморфизма форм покоя и альтернативой эндоспорам в условиях репрессии спорообразования.

5. Доказана внутрипопуляционная гетерогенность покоящихся форм одного и того же типа-по устойчивости к повреждающим воздействиям; отклику на ростовые условия; потребности в специфических условиях для прорастания.

6. Внутрипопуляционное разнообразие ЦПК проявляется в расширении спектра фенотипи-ческой диссоциации популяций, прорастающих из этих покоящихся форм. Это сопровождается появлением и развитием фенотипов, отличных от доминантного типа по колониально - морфологическим, ростовым, биохимическим признакам и устойчивости к антимикробным агентам.

7. Покоящиеся формы поддаются выявлению в природных образцах прямыми микроскопическими методами. Для дифференциального определения вегетативных w покоящихся

• клеток бактерий разработаны диагностические критерии, основанные на особенностях ультраструктурной организации и различиях в соотношениях Са/К и P/S. Показана возможность более полного учета численности потенциально жизнеспособных покоящихся форм, а также повышения чувствительности ПЦР при использовании эндоспор и ЦПК как источника матриц.

8. Выявлено видонеспецифичное концентрационно-зависимое действие внеклеточных микробных ауторегуляторов - алкилоксибензолов (АОБ), в ингибировании роста бактериальных культур и переходе клеток в состояние покоя.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе диссертационного исследования была решена важная фундаментальная проблема, а именно, доказано наличие форм покоя - цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) - у широкого круга неспорообразующих бактерий, обеспечивающих длительное выживание вида в условиях, когда рост невозможен. Образование ЦПК в циклах развития бактериальных культур правомочно рассматривать как экстремальную форму ответа неспорообразующих бактерий на стрессы голодания и ограничения пространства. Приоритетным является выявление закономерностей регуляции образования ЦПК, которая определяется трофическими условиями и клеточной плотностью культур и осуществляется при участии низкомолекулярных внеклеточных ауторегуляторов. На основе выявленных закономерностей разработаны условия, имитирующие природные ситуации и способствующие массовому образованию покоящихся форм. Практическая ценность этих разработок состоит в их применимости для дальнейших исследований форм покоя у других микроорганизмов.

Установлено, что ЦПК обладают всеми характеристиками покоящихся форм микроорганизмов и отличаются от цист азотобактера особенностями ультратонкого строения и большей устойчивостью к стрессорным нагрузкам. Доказательства образования ЦПК неспорооб-разующими бактериями в разных условиях развития, хотя и с различными эффективностью и свойствами, позволяют констатировать неотъемлемость стадии покоя в онтогенезе культур неспорообразующих бактерий. Интерес для микробной экологии представляют данные о распространенности цистоподобных клеток бактерий в природных объектах, в том числе, древних глубокомерзлых подпочвенных осадках. Таким образом, постулируется, что длительное выживание неспорообразующих бактерий обеспечивается образованием ЦПК, обладающих повышенной стрессоустойчивостью и высоким потенциалом возобновления роста.

Впервые показано внутривидовое разнообразие форм покоя бактерий, когда в разных условиях роста культур цикл их развития завершается образованием покоящихся клеток, различающихся структурной организацией, устойчивостью к повреждающим воздействиям и характером развития в новом цикле. Важной закономерностью является гетерогенность популяции покоящихся форм бактерий по их отклику на возврат условий роста и потребности в процедурах реактивации. Многоуровневое разнообразие ЦПК обеспечивает гибкость стратегии выживания вида в меняющихся условиях. Представляет теоретический и практический интерес связь между пребыванием клеток бактерий в состоянии покоя в виде цистоподобных форм и повышением фенотипической вариабельности популяций, развивающихся при их прорастании. Перспективу для дальнейших исследований имеют данные о повышении частоты появления антибиотикорезистентных вариантов микобактерий и стафилококков, выявляемых при прорастании определенных морфологических типов покоящихся форм этих бактерий.

Новизну составляет также разработка критериев для прямого выявления покоящихся клеток в природных образцах in situ на основе особенностей их ультраструктурной организации и соотношений в них ряда биогенных элементов (Са/К, P/S). Этот блок исследований приобретает важность для выявления и оценки физиологического состояния микробных клеток in situ, поскольку покоящиеся формы не поддаются обнаружению прямыми молекулярными методами (FISH). Теоретически и практически значимым результатом работы является повышение эффективности учета жизнеспособных покоящихся клеток, которые не выявляются традиционными методами посевов. Данный раздел исследований создает предпосылки к повышению эффективности экологического и санитарно-эпидемиологического мониторинга. В работе установлены закономерности видонеспецифичного, концентрационно-зависимого действия микробных ауторегуляторов класса алкилоксибензолов при образовании: 1) жизнеспособных ЦПК; 2) не прорастающих на плотных средах (некультивируемых) форм и 3) принципиально нежизнеспособных микромумий. На основании выявленных закономерностей регуляции развития микробных культур разработаны подходы к обеспечению обратимого или необратимого подавления развития микроорганизмов с участием алкилоксибензолов и их производных.

Практическая значимость работы состоит в совершенствовании методов хранения коллекционных культур и промышленных штаммов микроорганизмов и разработке способов получения длительно хранящихся стабильных бактериальных препаратов за счет перевода клеток в состояние покоя. Цистоподобные покоящиеся клетки бактерий рекомендованы для включения в тест-системы для проверки действия антимикробных агентов. Химические аналоги ауторегуляторных факторов испытаны в качестве новых биоцидов для защиты различных материалов от микробного разрушения, что оформлено в виде заявок на патенты РФ.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Мулюкин, Андрей Львович, Москва

1. Акименко В.К Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М. : Наука.1989. 263 с.

2. Бабусенко Е.С., Элъ-Регистан Г.И., Градова Н.Б., Козлова А Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий //Успехи химии. 1991. Т. 60. С. 2362 2373.

3. Батраков С.Г., Придачина H.H., Кругляк Е.Б., Новогрудская Е Д, Чекасина Е.В. Необычный полиольный липид, 2-С-с1-талопиранозил-5-алкил-(С19 С21)-резорцин, из азотфикси-рующей бактерии Azotobacter chroococcwn II Биоорг. химия. 1982. Т.8. С. 980 986.

4. Батраков С.Г., Элъ-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Гряз-нова М.Н., Золотарева ИН., Тнрозол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces serevisiae //Микробиология. 1993. Т. 62. С. 633 - 638.

5. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л, Романова Ю.М., Элъ-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина. 2005. 367 с.

6. Волкогон В.В., Мамчур А.Е, Лемешко С.В., Минягто В.Г. Азоспириллы эндофиты семян злаковых растений //Микробиологич. журнал. 1995. Т. 57. С. 14-19.

7. Галъчеико В. Ф. Метанотрофные бактерии. М.: ГЕОС. 2001. 500 с.

8. Герасименко Л.М., Заварзин Г.А., Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. Роль цианобактерий в образовании фосфатных минералов//Журн. общ. биологии. 1999. Т. 60. С. 415-430.

9. Головлев Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. 1998. Т. 67. С. 725-735

10. Головлев ЕЛ. Академик Николай Дмитриевич Иерусалимский (1901—1967) II Микробиология. 1999.~T.68. С.800-808

11. Голод H.A., Лойко Н.Г. Лобанов КВ., Миронов С.А. Воейкова Т.А., Галъченко В.Ф., Николаев Ю.А., Элъ-Регистан Г.И. Роль микробных ауторегуляторов — алкилоксибензолов, в контроле экспрессии стрессовых регулонов //Микробиология. 2009. Т. 78. №6. С. 731741.

12. Гордеев К.Ю., Битков В.В., Придачина H.H., Ненагиев В.А., Батраков С.Г. Бактериальные 5-н-алкил(С19-С25)резорцины- неконкурентные ингибиторы фосфолипазы А2 // Биоорг. химия. 1991. Т. 17. С. 1357-1364.

13. Горленко В.М. Спорообразование у почкующейся фотогетеротрофной бактерии // Микробиология. 1969. Т. 38. С. 128-134.

14. Горленко В.М., Kennen О.И., Пучков А.Н. Морфологическая дифференциация несерных пурпурных бактерий //Микробиология. 1976. Т. 47. Вып. 5. С. 817-823.

15. Горленко В.М., Дубинина Г.А., Кузнег.ов С.И. Экология водных микроорганизмов. 1977. М: Наука. 287 с.

16. Давыдова O.K., Дерябин Д.Г., Никиян А.Н., Элъ-Регистан Г.И. О механизмах взаимодействия ДНК с химическими аналогами аутоиндукторов анабиоза // Микробиология 2005. Т. 74. С.616-625.

17. Давыдова O.K., Дерябин Д. Г., Элъ-Регистан Г.И. Исследование влияния химических аналогов ауторегуляторных di факторов микроорганизмов на структурные переходы ДНК методом ИК-спектроскопии //Микробиология. 2007. Т.76. С.306 312.

18. Данилевич В.Н., Гришин Е.В. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в

19. ПЦР //Биоорг. химия. 2002. Т. 28. С. 156-167.

20. Данилевич В.Н., Дуда В.И., Сузина Н.Е., Гришин Е.В. Получение и характеристика ДНК-содержащих микромумий дрожжей и грамположительных бактерий с увеличенной проницаемостью клеточной оболочки: Применение в ПЦР// Микробиология. 2007. Т. 76. С. 72-82.

21. Демкипа Е.В., Соина B.C., Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т. 69. №3. С. 383-388.

22. Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Баринова Е.С., Дуда В.Е., Воронин A.M. Электронно-микроскопическое изучение ультраструктуры микробных клеток in situ в экстремальных биотопах//Микробиология. 2004 Т. 73. С 832-840

23. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.В., Элъ-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus шт. 504 // Микробиология. 2001. Т. ,70. С. 811-819.

24. Дуда В.И. Особенности клеточной дифференциации бактерий // В сб. : Онтогенез микроорганизмов, 1979. С. 186-197.

25. Дуда В.И. Особенности цитологии спорообразующих бактерий // Успехи микробиол. 1982. вып. 17. С. 87-116.

26. Дуда В.И., Пронин С.В., Эль-Регистан Г.И., Капрельтщ A.C., Митюшина Л.Л., Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под воздействием ауторегуля-торного фактора//Микробиология. 1982. Т. 51. С. 77 81.

27. Дуда В.И. Анабиоз бактериальных спор // В кн. "Торможение жизнедеятельности микроорганизмов (ред. Бекер М.Е, Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. и др.), Рига, "Зинатне",. 1987, с. 155-159.

28. Евдокимова Н.В., Дорофеев А Г., Паников Н.С. Динамика выживания и перехода в покоящееся состояние бактерий Pseudomonas fluorescens в процессе азотного голодания // Микробиология. 1994. Т.63. С. 195-203.

29. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле. М.: КМК Scientific Press. 1997. 144 с.

30. Ермакова М.Т., Шнырова В.А., Головлев Е.А., Взаимосвязь между скоростью роста и дыханием Rhodococcus minimus II Микробиология. 1990. Т. 59. С. 558-564.

31. Жданов К.И., Дьячков Е.П., Стручков В.А., Стражевская Н.Б., Дьячков П.Н. ДНК-связанные липиды: моделирование взаимодействия ДНК со стеариновой и ненасыщенными жирными кислотами // Изв. Акад. наук. Сер. химическая. 2003. №9. С. 1794-1800.

32. Жилина Т.Н. Жизненные структуры миксобактерий Archangium // Микробиология. 1968. Т. 37. С. 903-907.

33. Жилина Т.Н., Заварзин Г.А. Образование цист метаносарциной // Микробиология. 1979. Т. 48. №3. С. 451-456

34. Жилина Т.Н., Турова Т.П., Кузнецов Б.Б., Кострикина H.A., Лысенко A.M. Orenia sivashensis sp.nov. новая умеренно галофильная анаэробная бактерия из лагун Сиваша // Микробиология. 1999. Т. 68. С. 529-537.39.

Информация о работе

Мулюкин, Андрей Львович
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы