Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов"



0 ^

- г

На правах рукописи

МУЛЮКИН АНДРЕЙ ЛЬВОВИЧ

ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ У НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Специальность: 03.00.07 - Микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА-1998

УДК 579.22 : 579.242

Работа выполнена в лаборатории классификации и хранения уникальных микроорганизмов Института микробиологии Российской Академии Наук.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, Г.И. Эль-Регистан

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова

доктор биологических наук, Г.М. Зенова

Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится фгЯ&^иЪ 199^г.. в часов, на заседании Диссертационного совета Д. 002.64.01 в Институте микробиологии РАН по адресу: 117811 Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, к.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН

Автореферат разослан

ИОЯ^иЯ^ 1998 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, к.б.н. —л.Е. Никитин

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, что чаще всего связано с исчерпанием питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей. В ответ на такие условия микроорганизмы или продолжают размножаться, но со сниженной скоростью, или деление прекращается, и стратегия микробного роста заменяется стратегией переживания. Стратегия переживания реализуется за счет образования форм, отличающихся повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. Таким свойством обладают покоящиеся (анабиотические) или, в меньшей степени, гипометаболические формы. К гипометаболическим клеткам относят описанные, глазным образом, для грамотрицательных бактерий жизнеспособные некультивируемые клетки (Colwell, etal., 1985; Roszak & Colwell, 1987) и ультрамикробакгерии (Morita, 1988), одной из основных характеристик которых является неспособность образовывать колонии при высеве на твердые питательные среды. Следует отметить, что специализированные анабиотические формы, такие как эндо- и экзоспоры, миксоспоры, цисты и акинеты, известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов, и поэтому вопрос об образовании покоящихся форм неспорообразующими микроорганизмами остается открытым, а исследования в этой области не теряют актуальности.

Как показано ранее, микроорганизмы различных таксономических групп обладают специфической системой ауторегуляции роста и развития их культур, осуществляющейся при участии внеклеточных метаболитов с функциями аутоиндукторов анабиоза (факторов d-,) и аутоиндукгоров автолиза (факторов d2). Повышение концентрационного уровня факторов d, в клеточной суспензии индуцирует образование цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), что было продемонстрировано для Bacillus cereus, Pseudomonas carboxydoflava, Methylococcus capsulatus и Saccharomyces cerevisiae (Эль-Регистан с соавт., 1979; Пронин с соавт., 1982; Грязнова с соавт., 1985; Светличный с соавт., 1986; Эль-Регистан, 1988; Бабусенко с соавт., 1991). ЦРК, формирующиеся под воздействием факторов d1f были отнесены к новому типу анабиотических форм микроорганизмов. Для отнесения ЦРК к покоящимся формам необходимы доказательства, что их образование является естественной стадией в циклах развития микробных культур. В направлении развития этих исследований данная работа преду-

сматривала как расширение круга объектов - неспорообразующих микроорганизмов, так и изучение условий образования анабиотических клеток е циклах развития культур или при отмирании микробной популяции. Цель работы - изучение закономерностей образования и характеристики покоящихся клеток неспорообразующих бактерий, а также дрожжей. Задачи: (1) выявление ауторегуляторных факторов d, - аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий Micrococcus luteus и изучение их динамики в развивающейся микробной культуре; (2) изучение условий образования покоящихся цистоподобных рефрактерных клеток в цикле развития культур M.luteus и Bacillus cereus (при репрессии спорообразования); (3) исследование условий образования покоящихся форм про- и эукариот Micrococcus luteus, Escherichia со//', Methylococcus capsulatus, Bacillus cereus, и Saccharomyces cerevisiae в автолизирующихся клеточных суспензиях; (4) применение химических аналогов фактора d, в качестве биоцидов для защиты ряда материалов от микробных биоповреждений. Научная новизна работы. У неспорообразующих бактерий Micrococcus luteus впервые обнаружен аутоиндуктор анабиоза - фактор d^ в состав активного начала которого входят производные апкилоксибензолов с углеводородными заместителями во 2- и 4- положении ароматического кольца. С применением специфического колориметрического метода изучена динамика фактора d, в культуральной жидкости и клетках М. luteus.

Показано, что при модификации условий культивирования, направленных на усиление биосинтеза фактора d1f неспорообразующие бактерии M.luteus и спорообразующие бактерии B.cereus (при репрессии их спорообразования) завершали цикл развития их культур образованием ЦРК, которые обладают всеми необходимыми и достаточными признаками покоящихся форм: длительно сохраняют жизнеспособность, являются метаболически неактивными, обладают повышенной терморезистентностью и особенностями ультраструктурной организации.

Впервые установлено, что ЦРК образуются частью микробной популяции при её спонтанном и индуцированном автолизе, вследствие создания необходимого для их формирования концентрационного уровня факторов d, за счет выхода аутоиндукторов анабиоза из автолизирующихся клеток другой части популяции. Возможность образования ЦРК в таких условиях была продемонстрирована для неспорообразующих микроорганизмов М. luteus, Е. coli, M.capsulatus, B.cereus (при репрессии спорообразования) и

фожжей S. cerevisiae. Постулируется, что автолиз - не только стадия отми->ания часта микробной популяции, но и этап, предшествующий переходу оставшихся клеток микробной культуры в стратегию выживания. Практическая ценность работы Выявленные условия образования по-:оящихся форм неспорообразующих микроорганизмов при модификации условий роста их культур или в процессе автолиза микробных суспензий логут найти применение при разработке способов получения бактериаль-<ых препаратов. Химические аналоги факторов с^ успешно испытаны в ка-(естве биоцидов нового типа и рекомендованы для защиты кожевенного ;ырья и полуфабрикатов от микробного разрушения, а также создания био-ггойких гелевых композиционных материалов медицинского и косметологи-шского назначения.

Упробация работы. Результаты работы были представлены на: I Между-юродной конференции "Криопедология" (Пущино,1992); совещании Научно-методические основы мониторинга биоразнообразия"(Москва, I996); конференции "Биологически активные вещества в косметологии" Москва, 1996); на 5 и 6-ой международных конференциях "International Workshop on Bioencapsulation" (Потсдам, Германия, 1996; Барселона, Испа-1ия, 1997); конкурсе научных работ ИНМИ РАН за 1996 г. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора лите->атуры, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 180 ^именований работ отечественных и зарубежных авторов. Материалы из-южены на 150 страницах и включают 12 таблиц и 28 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Микроорганизмы, среды и условия культивирования

Клетки Micrococcus luteus NCIMB 13267 выращивали на синтетиче-:кой питательной среде следующего состава (г/л): лактат лития - 5; NH4CI -t; КН2Р04 - 4; микроэлементы (мг/л): MgS04 -7Н20 - 50; FeS04 - 20; MnCI2 • iH20 - 20; ZnS04 - 0,4; В(ОН)3 - 0,5; CuS04 • 5Н20 - 0,05; Na2Mo04 • 2Н20 -),2; факторы роста (мг/л): тиамин-40, метионин-20, рН после стерилизации '.2 - 7.4. Клетки Micrococcus roseus коллекционного штамма ССМ 1145 и 130лята, выделенного из мерзлотных пород, растили на МПБ или голодной :реде, содержащей (г/л): глюкозу - 1; (NH4)2S04 -1; КН2Р04 -0,1; микроэле-

менты (мг/л): MgS04-7H20-100; CaCI2-20; FeCI3- 6Н20 - 0,4; MnS044H20 -0,4; ZnS04 - 0,4; KJ - 0,1; CuS04-5H20 - 0,04; Na2Mo04-2H20 - 0,2; NaSflTA -3; дрожжевой экстракт - 200; pH среды 7,4.

Бактерии Bacillus cereus шт. 504 (ВКМ) выращивали на синтетической питательной среде следующего состава (г/л): глюкоза - 0.2; NH4H2P04 -1.0; MgS04 -7Н20 - 0.2; KCI - 0.2; CaCI2 -0.2; FeCI3- 6Н20 - 0.001; MnS04 • Н20 -0.017; дрожжевой автолизат - 0.2; рН после стерилизации 7.0 ± 0,1. Для репрессии спорообразования в среду добавляли 20% МПБ и 6% глюкозы.

Бактерии Escherichia coli шт. М-17 (ВКМ) выращивали на МПБ или на среде следующего состава (г/л): NH4CI - 1; КН2 Р04 - 3; Na2 НР04 -2Н20 - 6; MgS04- 0,13; аспарагиновая кислота - 0,2; никотиновая кислота - 0,02; ка-заминовые кислоты "Difco"- 10; рН после стерилизации 7.2.

Метанокисляющие бактерии Methylococcus capsulatus шт. 874 (ВНИИ-синтезбелок) выращивали на минерально-солевой среде (г/л): KN03 - 1; MgS04-7H20 - 0,1; Na2HP04 - 0,6; КН2Р04 - 0,14; NaCI - 0,1; (рН 7.2) в атмосфере смеси природный газ - воздух (1 : 3).

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae шт.380(ВКМ) выращивали на 2,3 сусле.

Для получения покоящихся форм использовали среды с лимитами источников N и Р; для создания лимита по кислороду объем среды в колбе увеличивали, завышая в три раза (см. главу 2).

Клетки бактерий и дрожжей культивировали при 28°С в колбах объемом на 250 мл (50 мл среды) или 750 мл (200 мл среды) на качалке при 140-160 об./мин, либо в ферментере "Biotec" объемом Зл при скорости перемешивания 200 об/мин, подаче воздуха 1л/1л среды мин. Инокулят вносили в количестве, дающем оптическую плотность суспензии 0.2. Микробиологические методы. Жизнеспособность микроорганизмов определяли путем подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий на плотные питательные среды. Массу сухих клеток (МСК) определяли после их высушивания в течение 24 ч при 105 °С. Оптическую плотность (ОП) суспензий микробных культур измеряли нефе-лометрически на спектрофотометре "Specord" (X = 660 нм, / = 10 мм). Термоустойчивость микроорганизмов определяли при подсчете числа клеток, оставшихся жизнеспособными после прогревания клеточных суспензий (0,2 мл) в ультратермостате U-10. Эндогенное дыхание клеток определяли на полярографе "LP7E" в кислородной ячейке (Шольц, Островский, 1975). Мик-

роскопические наблюдения проводили с помощью микроскопа Amplival (ГДР) с фазово-контрастным устройством. Для ультрамикроскопических исследований клетки фиксировали по методу (Spurr, et al., 1980) и заливали смесью эпоксидных смол. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-III (Швеция) и просматривали на микроскопе "JEM-100B" (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении от 10000 до 35000 раз.

Биохимические методы. Сырые препараты фактора d, выделяли из отделенной от клеток культурапьной жидкости (КЖ) путем экстракции н-бутанолом в соотношении 1:1. Бутанол отгоняли на роторном испарителе, остаток фракционировали в бифазных системах разделения липидов (Кейтс, 1975). Полученные сырые препараты фактора d, очищали от примесей методами колоночной и препаративной тонкослойной хроматографии (ТСХ) до получения хроматографически гомогенных фракций. Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинах "Silufol" (ЧССР) или "Kodak" (ФРГ) в различных системах растворителей. В процессе хромато-графической очистки факторов от примесей биологическую активность каждой из полученных фракций определяли: а) количественно - по влиянию на эндогенное дыхание клеток продуцента, принимая за условную единицу активности такое количество спиртового раствора фактора, при котором эндогенное дыхание клеток ингибировапось на 50 %; б) качественно - по способности индуцировать образование ЦРК при времени экспозиции 30 мин., что контролировали микроскопически в фазовом контрасте. Для количественного определения фактора d, применяли колориметрическую реакцию с диазотиевой солью 3,3'-диметоксибензидина (реактивом FBB,"Sigma") (Tluscik, et al., 1981). В качестве стандартов использовали синтетические апкилрезорцины (АР). Спектроскопические измерения проводили на спектрофотометре "Specord М-400, Jena".

Действие лизоцима на клетки М. luteus исследовали по методу Jolles (Jolles, 1963). Состав цитохромов определяли по дифференциальным спектрам поглощения восстановленных дитионитом против окисленных перекисью водорода и феррицианидом препаратов клеток. Спектры регистрировали на спектрофотометре "Hitachi-557'в интервале длин волн X = 380 - 650 нм. Об ингибирующем действии KCN судили по подавлению дыхательной активности клеток в ячейке объемом 1 мл, в которую вносили клеточную суспензию (0,1 мл), ресуспендированную в 0,9 мл 0,1 М КН2Р04 буфера, а

затем - свежеприготовленный раствор KCN различной концентрации объе мом 5-10 мкл.

Статистический анализ проводили с использованием стандартных матема тических методов: расчета среднеквадратичного отклонения внутри группы f-теста Стьюдента и вычисления корреляции двух групп данных; критерии вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разниць групп данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Обнаружение и исследование динамики накопления ауторегулятор ного фактора ci1 Micrococcus luteus

Основным объектом исследования были грамположительные бактерии Micrococcus luteus и Micrococcus roseus , для которых не известны специализированные покоящиеся формы и не описана система ауторегу-ляции роста и развития их культур, осуществляющаяся с участием факторов d, и d2l. Дополнительный интерес к этим объектам был обусловлен тем, что род Micrococcus включает организмы, обладающие в вегетативной фазе повышенной устойчивостью к неблагоприятным внешним воздействиям по сравнению с другими эубакгериями.

1.1. Некоторые физиологические характеристики микрококков

В первой части работы проведен сравнительный анализ некоторы> физиологических характеристик коллекционного штамма M.roseus CCW 1145 и изолята М. roseus из осадочных пород вечной мерзлоты. Если рост коллекционного штамма на богатой питательной среде - МПБ - характеризовался короткой лаг-фазой, высоким выходом биомассы и высокой максимальной удельной скоростью роста (цтах) 0,39 ч"1, то в тех же условия* клетки изолята М. roseus начинали рост после длительного лаг-периода, а Umax составила 0,11 ч'1 при сниженном накоплении биомассы. В условиях лимита основных источников питания развитие коллекционного штамма и изолята M.roseus характеризовалось снижением скорости роста (ц^ = 0,05 ч"1) и выхода биомассы (рис.1).

Устойчивость ферментов дыхательной цепи к цианиду была наименьшей у клеток М. гозеиз 1145 экспоненциальной и линейной фаз при росте на МПБ (рис. 2), а по достижении стационарной фазы чувствительность клеток к КСМ снижалась. В противоположность этому клетки мерзлотного изолята М. говеив экспоненциальной фазы, выращенные на МПБ, обладали высокой устойчивостью к действию ингибитора, так же как и медленнорастущие на среде с лимитом по основным источникам питания. По сравнению с цианид-чувствительными клетками коллекционного штамма М.гозеиэ у цианид-устойчивых вариантов максимумы поглощения, соответствующие цитохрому а(601), практически не выявлялись.

8

1 3

2 4

3 2 1

8 10

концентрация KCN, мМ

Vic.1. Рост культур М. roseus шт. 1145 на Рис.2. Ингибирование дыхательной активно-

ЛПБ - (1) и голодной среде - (2) и изолята Iroseus на МПБ - (3) и голодной среде -4)

ста клеток М. roseus цианидом К; обозначения те же, что к рис.1.

Таким образом, растущие со сниженной скоростью клетки коллекционного штамма и изолята М. roseus экспоненциальной фазы роста обладали повышенной устойчивостью к действию цианида по сравнению с быст-роделящимися клетками коллекционного штамма (при росте на МПБ), у которого резистентность к цианиду отмечалась только в стационарной фазе роста. Подобная взаимосвязь между скоростью роста и устойчивостью к KCN продемонстрирована ранее для Rhodococcus minimus (Ермакова с со-авт., 1990). Повышенная устойчивость к цианиду, по-видимому, связана с

реорганизацией функционирования дыхательной цепи, включающей зам! ну терминального цитохрома на альтернативную, менее чувствительную KCN цитохромоксидазу (Акименко, 1984; Artzatbanov, et.al, 1991).

В порядке обсуждения можно предположить, что снижение метабол! ческой активности (гипометаболизм) бактерий, выражающееся в такой И1 тегральной характеристике, как скорость роста, всегда сопровождаете развитием резистентности к экстремальным воздействиям. Следующк раздел работы включал поиск, изучение природы и динамики синтеза аул регуляторных факторов d,, ответственных за индукцию образования ан. биотических форм микроорганизмов, в основном, определяющих стратеги переживания в неблагоприятных для роста условиях.

1.2. Выделение и изучение динамики фактора d.

Фактор d, выделяли из культуральной жидкости М. luteus стациона| ной фазы роста, выращенных на основной среде с 0,5% лактата, путем эк тракции бутанолом с последовательным трехкратным бифазным фракци! нированием в системах хлороформ - метанол - вода (2:2:1,8 и 2:2:1). В би( логических тестах в верхних водно-метанольных фракциях обнаружили а тивность, свойственную аутоиндукторам анабиоза - факторам d,. В nepi крестном тестировании показано, что препараты фактора d, микрококка бь ли активны в отношении не только клеток продуцента, но и других микроо| ганизмов - В. cereus, Е. coli и S. сerev/s/ae и индуцировали образована ЦРК. При очистке фактора d, на колонке с силикагелем при последовател! ной элюции в системах растворителей хлороформ - метанол (10:1; 10:; 10:5; 10:7; 10:10 об/об) наибольшей активностью обладала фракция, элю1 руемая системой хлороформ-метанол 10:1 об/об. ТСХ этой фракции вь явила наличие двух компонентов с R, 0.3 и 0.1 в системе (а) хлороформ метанол - вода (65:25:5 об/об) и R, 0.75 и 0.4 в системе (б) хлороформ метанол - уксусная кислота - серный эфир (35:5:5:45 об/об). Эти два кол понента были выделены препаративной ТСХ. Биологическое тестировани показало, что основной в количественном выражении активностью облада компонент, располагающийся на хроматограмме в пятне с Rf 0.3 в систем (а) и 0.75 в системе (б). Активный препарат давал синее окрашивание, х< ракгерное для фенолов (с раствором хлорного железа с красной кровянс солью) и специфическое серое окрашивание, характерное для резорцина (

реакции со спиртовым раствором хлорного железа). УФ-спектр имел максимумы поглощения при X = 228 и X = 274 нм. В инфракрасном спектре присутствовали полосы поглощения с максимумами: около 3300 см"1 (валентные колебания связей Н-О); 2930, 2855 см"1 (алифатические С-Н связи); 1605 и 1470 см'1 (ароматическое кольцо); 1375, 1190 и 1170 см"1 (гидро-ксильные группы, связанные с фенолом); 930, 850 и 754 см"1 (замещенное ароматическое кольцо). ЯМР-спектроскопия' очищенного препарата фактора d, показала наличие в его составе алкилоксибензолов (АОБ) с углеводородными заместителями во 2 - и 4- положениях ароматического кольца. Ауторегуляторный фактор d, M.luteus, также как у P. carboxydoflava (Осипов с соавт., 1985), B.cereus (Эль-Регистан, 1988), S.cerevisiae (Батраков с соавт.,1993) относится к алкилоксибензолам, но отличается положением ОН-групп в кольце, числом и длиной углеводородных заместителей.

На основании данных о химической природе фактора d, M. luteus при изучении динамики ауторегуляторов в развивающейся культуре микрококков нами был использован модифицированный колориметрический метод количественного определения АОБ в реакции с реагентом FBB. Содержание АОБ (реакция с FBB) во фракциях и очищенных препаратах коррелировало с их удельной биологической активностью (усл. ед.), свойственной фактору d,.

Закономерности динамики накопления фактора di (АОБ) в клетках и культуральной жидкости (КЖ) (рис.3) и продуктивности культуры (рис.4) были аналогичны показанным ранее для других микроорганизмов (Светличный, 1982; Эль-Регистан, 1988). Высокий уровень внеклеточных АОБ в лаг-фазе объясняется их внесением с инокулятом (стационарная культура). Первый максимум накопления и продуктивности клеток по фактору d, (АОБ) в фазе логарифмического роста, вероятно, сопряжен с антиоксидантной функцией АОБ, обеспечивающей неферментативную защиту липидов мембран от пере-кисного окисления (Эль-Регистан, 1988).

* ИК-спектроскопия выполнена в сотрудничестве с к.б.н. И.Н.Щинановой (ИХФ РАН), ЯМР-спектроскопический анализ препарата фактора <1, осуществлен к.б.и. В.Г. Сахаров-ским (ИБФМ РАН), за что автор приносит глубокую благодарность.

щущ

x^a-yrCHj

Повышение абсолютного количества внеклеточных и внутриклеточных АОБ в фазе линейного и замедленного роста может рассматриваться как эндогенная причина перехода культуры к стратегии переживания. Несовпадение максимумов накопления АОБ в КЖ и клетках микрококка в стационарной фазе роста, по-видимому, связано с их высвобождением при автолизе части популяции и их последующим перераспределением через внеклеточный пул. Этс может иметь экологическое значение в случае, когда в неавтолизировавшейся части клеточной популяции под воздействием возрастающей концентрации фактора с! 1 образуются анабиотические клетки, чем обеспечивается сохранение вида. Аналогичные исследования выполнены с культурами М. гоэеиз, растущими на голодной среде. Уровень максимального накопления внеклеточного фактора с^ для мерзлотного изолята составил 4,1 Ю"5 М, а для коллекционного штамма - 2,0-10"5 М.

Полученные данные можно рассматривать как еще одно свидетельство

(утки СуТМ!

Рис. 3. Динамика накопления фактора и АОБ в культуре М. 1и1еиэ в расчете на единицу объема : оптическая плотность культуры - (1); содержание АОБ в КЖ при определении с РВВ, мг/л-(2); содержание АОБ в клетках при определении с РВВ, мг/л - (3); содержание фактора с!, в КЖ, ед. биол. акт./л-(4).

Рис. 4. Содержание АОБ и фактора с!) в культуре М. Ыеиз в расчете на единицу биомассы: масса сухих клеток (МСК) - (1); содержание АОБ в КЖ при определении с РВВ, мг/г сухих клеток - (2); содержание АОБ в клетках при определении с РВВ, мг/г сухих клеток - (3); содержание фактора с!1 в КЖ, ед. биол. акт./ г сухих клеток - (4).

Полученные данные можно рассматривать как еще одно свидетельство в пользу универсальности ауторегуляции роста и развития микробных культур с участием факторов с!. При том, что динамика фактора с1, в развивающихся культурах микрококков и культурах других микроорганизмов аналогична, у М.Меиэ накопление ауторегупяторов имеет свои особенности. Уровни внеклеточных АОБ (в максимуме накопления) у ММеиз и P.carboxydofIava одинаковы, но их биологическая активность у псевдомонад на порядок выше, а содержание АОБ в клетках, напротив, выше у микрококков (табл.1).

Таблица 1. Сравнительное содержание вне- и внутриклеточных АОБ и фактора ф в культурах М. 1Меиз и Р. сагЬохусЗоПауа (Светличный, 1982)_

Культура Кол-во внеклеточного фактора с!,, ед.акт./л Содержание внеклеточных АОБ, М Содержание АОБ в клетках,нмоль/мг МСК

ММеиэ 2,3 2,5 - Ю-5* 1 *

Р. сагЬохубоАауа 22 5 • 10"5** 0,1 **

данные получены в реакции с РВВ (*) и радиоизотопным методом (**)

Такое различие внутриклеточной концентрации АОБ у разных бактерий может быть причиной неодинаковой их чувствительности к фактору с!,. Подтверждение этого вывода было получено на другой паре сравнения. Так, чувствительность вегетативных клеток М. к вносимому химическому аналогу фактора была выше, чем у В. сегеив, т.е. ингибирование эндогенного дыхания и индукция перехода вегетативных клеток М. Меиэ в анабиоз обеспечивались меньшими концентрациями аналога (табл.2).

Таблица 2. Чувствительность клеток М. Ыеиз и В. сегеиэ (Эль-Регистан, 1988) к действию химического аналога фактора б, (4-н-гексилрезорцина)._

Культура Кол-во внеклеточного фактора ф, ед.акт./ л. Концентрация аналога, ингибирующая на 50% дыхание клеток*, М Концентрация аналога, достаточная для образования анабиотических клеток*, М

ММеиэ 2,3 7,5-Ю"5- 8-Ю-5 30 - 10"6 -50- 10"5

В. сегеиз (вегет.) 20 20 • 10"5 - 30- 10* 10,3- 10"4 -25-10"4

*фазы линейного роста (рН среды 7.2)

Возможно, из-за относительно высокого уровня фактора ф в клетках микрококков требуется небольшая его додача для образования анабиотических клеток. Помимо количественной компоненты ауторегуляции следует учитывать влияние особенностей химической структуры ауторегуляторов на

Таблица 3. Действие химических аналогов фактора с1, на дыхательную активность клеток

Аналог Концентрация для подавления активности на 50 %, М

4-н-гексил резорцин 8-Ю-5

4-н-децилрезорцин 40 -Ю"6

5-н-децилрезорцин 5-10"5

2,5-дибутилрезорцин 13 -10"5

2-нонил-5-децилрезорцин 28 -Ю-5

их биологическую активность. А именно, к различающимся по химической структуре изомерам и гомологам алкилоксибензо-лов, входящим в состав факторов с)1, клетки проявляют разную чувствительность, как показано на примере М. 1и1еиз (табл.3).

Третий фактор, определяющий результативность регуляции, еидимо, следует искать в специфике структурной организации мембран.

Полученные результаты, демонстрирующие достаточность относительно невысоких концентраций фактора с!1 для образования покоящихся и более устойчивых к экстремальным внешним воздействиям клеток микрококка, важны для объяснения существования вида в микробном сообществе и его переживания в природных условиях, неблагоприятных для роста и размножения клеток. Следующим этапом работы явилось изучение образования покоящихся форм МШеив и других неспорообразующих микроорганизмов при воздействии фактора с!1 в тех или иных условиях.

2. Образование покоящихся форм Micrococcus luteus и Bacillus cereus при модификации условий культивирования

Внесение фактора d, М. luteus или его химического аналога в культуру микрококка линейной фазы роста индуцировало образование ЦРК, жизнеспособность которых в течение 1 мес. хранения снижалась незначительно в отличие от контрольного варианта без внесения фактора (табл.4). Полученные ЦРК М, luteus не обладали экспериментально выявляемым уровнем дыхания и характеризовались повышенной устойчивостью к термообработке (табл.6) и действию лизоцима. Однако, для отнесения ЦРК к покоящимся формам необходимо доказательство, что их образование является естественной стадией в цикле развития культуры (Sudo, Dworkin, 1973; Калакуцкий, Агре, 1977). В микробиологической практике известно, что обычно в длительно хранящихся куль-

Таблица 4. Жизнеспособность ЦРК М. Меиз, турах неспорообразующих

бактерий выявляется незнанительная доля (0,01-0,2%) жизнеспособных клеток, образующихся, по нашему предположению, под воздействием факторов с!,. В частности, при хранении клеток М. 1и(еи8, выращенных на среде с 0.5 %лактата, в течение 2 мес., число жизнеспособных клеток снижалось до 0,06 % (табл.5) при параллельном снижении массы, сухих клеток.

Таблица 5. Число КОЕ М. Ыеиэ при хранении в среде роста в течение 6 мес, КОЕ- мл1 (% от исх.) _

Вариант среды

0,5% лактат (контроль**) 1 % лактат 0,5% лактат с лимитом N (0,4 г/л) 0,5% лактат с лимитом Р (0,4 г/л) 0,5% лактат с лимитом о2

0* (5.7±0,4)Ю10 (100) (1.1±0,1)-1011 (100) (4,4+0,5)-109 (100) (3,7±0,5)-101° (100) (5,2+0,7)1010 (100)

1 (1±0,3)-101° (19) (9,5+ 0,7)Ю10 (86) (4,0+ 0,Э)-10Э (91) (3,6±0,4)-101° (97) (4,8±0,4)-101° (92)

2 (3,2±0,6)-107 (0, 06) (7,2 ± 0,6)-10э (6,5) (3,7+0,5)108 (8,4) (4,0± 0,9)-109 (10,8) (4,8± 0,7)-109 0,2)

4 (7,2±0,7)-106 (0,013) (4,1 ±0,3)Ю3 (0,37) (1,1+0,3)-107 (0,25) (2,8+ 0,6)-107 (0,08) (1,6± 0,5)-108 (0,31)

6 (1,4 ±0,4)Ю6 (0,003) (1,7 + 0,3)Ю7 (0,015) (2,3 ± 0,5)-106 (0,05) (6,0 ± 2,3)-106 (0,016) (5,0 ± 0,8)-106 (0,01)

6 (Р) (8,0 ± 1,2)-10э (7,2) - (5,6± 0,7)-109 (15,1) -

'Соответствует концу фазы замедленного роста

"Состав среды по основным источникам питания (г/л): лактат-5; МН4С1-4; КН2Р04-4.

полученных при экзогенном внесении сырца фактора с!ч и его химического аналога.

Вариант Титр жизнеспособности, КОЕ ■ мл"1, (% от контр.) через:

1ч.после внесения (контроль^ 1 мес. хранения

суспензия без сЬ (1,9 ±0,4)-Ю10 (100) (2 ± 0,2) '109 (Ю)

+сырец фактора с), (4 ед./л) (1,7 ± 0,5)-101° (100) (1,5 ± 0,5)-1010 (92)

+4-гексилрезор-цин (30-10'5М) (1,5 ±0,3)-101° (100) (1,4 ± 0,6)-101и (91)

•суспензия клеток линейной фазы роста (ОП=2,3), выращенных на среде с 0,5% лактата

При культивировании бактерий М. 1и1еиз на синтетической среде с 1 % лакгата (рис.5) на третьи сутки клетки приобретали высокую рефрактер-ность, сохраняя ее в течение 1 мес.; ОП суспензий и МСК снизились незначительно, а число жизнеспособных клеток составило 86 % от максимального их количества в развившейся культуре. В вариантах культивирования при низкой аэрации (лимит по 02), а также на средах с уменьшенным содержанием азота (ЫН4С1-0,4 г/л) и фосфора (КН2Р04-0,4 г/л) выход биомассы был ниже по сравнению с первым вариантом. Цикл развития культур завершался образованием ЦРК, жизнеспособность которых при хранении в течение 1 мес. составляла 80-90% (табл.5).

Также отметим, что уровень внеклеточных АОБ был на 50100 % выше в вариантах с модификацией условий культивирования, чем в контрольном варианте. При более длительных сроках хранения наблюдалось снижение числа выявляемых жизнеспособных клеток до уровня 0,01 - 0,05% (к 6 "у месяцу), хотя клетки сохраняли интактность и высо-(г- 0 . . . о кую рефрактерность. Падение

колониеобразующей способности могло быть следствием продолжительность роста либо потери клетками жизне-

Рис. 5. Рост культуры ММеиэ на среде с 1% способности, либо возраста-лакгата при нормальной аэрации: оптическая ния бинь| их покоя в п0. плотность культуры , ОП; масса сухих клеток,

МСК, г/л; число жизнеспособных клеток, КОЕ, следнем случае для реверсии кл мл пролиферирующей способно-

сти необходимо проведение специальных процедур реанимации анабиотических клеток. Для ЦРК ММеиэ была предложена 1-2-часовая обработка, включающая отмывку клеток с последующей инкубацией в жидкой среде с жерминантами. Визуальным показателем реверсии к росту была потеря клетками рефракгерно-сти. Через 1-2 ч реанимации число жизнеспособных клеток в вариантах с

ч

и4

а о н

I3

г,2

ы я

и 1 и1

СЗ

г

0 12 24 36 48 54 14 30 чассутсут

избытком лактата и лимитом Р возрастало на 3 порядка по сравнению с вариантами без реанимации и составило 7,2 и 15,1%, соответственно (табл.5, последняя строка). Резкое увеличение величины КОЕ за краткий период реанимации (1-2 ч) исключало возможность восстановления численности жизнеспособных клеток за счет криптического роста.

Помимо сохранности жизнеспособности ЦРК М. /и/еиз обладали другими необходимыми свойствами покоящихся форм: резко сниженным уровнем метаболической активности, о чем судили по отсутствию эндогенного или экзогенно стимулируемого дыхания клеток, и повышенной терморезистентностью (табл.6).

Таблица 6. Жизнеспособность ЦРК М.1и(еи8 после термообработки (80°С)

Клетки М. 1и(еиБ Титр жизнеспособности, КОЕ ■ мл'1 после термообработки, в течение

0 мин. 10 мин.

Вегетативные (1,1 ±0,4 ) • 1011 (1,5 ±0,4)- Ю10 (1,7 ± 0,3) • 107 (6,0 ± 2,3) - 105 < 103 (2 + 0,5)- 108 (1 ±0,5)- 107 (2 ± 0,3) -10®

ЦРК (внесение фактора с!,)

ЦРК (среда с 1% лактата)

ЦРК (недостаток Р)

Особый интерес для выявления роли ЦРК неспорообразующих бактерий в реализации стратегии переживания микробной популяции представляют результаты определения устойчивости этих покоящихся форм к действию гидролитических ферментов (рис.6). В опытах ЦРК М. Ыеиз, образующиеся в цикле развития (лимит Р) и хранившиеся в течение 4 мес., были устойчивы к действию лизоцима (2 мкг/мл; 0,06 М фосфатный буфер, рН 6,25), практически не лизирова-

лись на протяжении всего экспери-Рис.6 Действие лизоцима на М Шиз: мента (у2 ч_} и оставались ИНТакт-вегетативные клетки - контроль-(1); ЦРК

(вариант среды с недостатком Р)-(2); ЦРК ными, что выявлено при микроско-после отмывки(З). пировании суспензий. Отмечено,

-э

0,75

0,65

¡3 0,55

н с о

0,45

0 200 400 600 800 время, сек.

1

что после отмывки от фактора d, клетки восстанавливали чувствительность к действию лизоцима. Образующиеся при экзогенном воздействии химического аналога фактора d, (50-Ю'5 М) ЦРК также устойчивы к действию фермента. Электронно - микроскопические исследования1 показали, что, по сравнению с вегетативными клетками, ЦРК М. luteus обладали рядом особенностей ультраструктурной организации: у них наблюдалось снижение электронной плотности цитоплазмы, агрегация рибосом, существенное увеличение толщины клеточной стенки и появление в ней слоистости.

Аналогичными методами исследовали возможность образования ЦРК спорообразующими бактериями В. cereus в условиях репрессии спорообразования. На среде с избытком глюкозы (6 %) в конце стационарной фазы до 40% клеток приобретали высокую степень рефрактерности; титр их жизнеспособности (рис.7), оставался неизменным в течение 1 месяца (5,3-109 КОЕ мл"1), снижаясь в 2,5 раза к 6-му месяцу хранения (2,1-Ю9 КОЕ-мл"1).

Эндогенное дыхание ЦРК В. cereus в длительно хранящихся суспензиях экспериментально не выявлялось, что свидетельствовало о торможении метаболической активности клеток. По сравнению с вегетативными клетками ЦРК бацилл обладали повышенной устойчивостью к действию высоких температур (табл.7).

ЦРК В.cereus имели следующие особенности ультраструктурной организации по сравнению с вегетативными

' Эти и дальнейшие исследования проводились совместно с д.б.н. В.И. Дудой, к.б.н. K.M. Лустой (ИБФМ РАН) и и. с. Л.Л.Митюшиной (ИНМИ РАН), за что автор приносит глубокую благодарность.

£

еЗ о

ä 2

О

t -в-т • к-

0 4 8 12 16 20 42 15 30 45 ч сут сут сут

продолжительность роста

W

о'

*

ц

S W

о «

о ы о

Рис. 7. Рост культуры В.сеясив на среде с избытком глюкозы при нормальной аэрации: оптическая плотность культуры , ОП; масса сухих клеток, МСК, г/л; количество жизнеспособных клеток, КОЕ, кл-млг1;

5

4

3

2

клетками: мелкозернистую текстуру цитоплазмы при агрегации рибосом с образованием электронноплотных гранул, неравномерное появление зон с различающейся электронной плотностью, наличие включений и несколько утолщенную клеточную стенку.

Таблица 7.Жизнеспособность ЦРК B.cereus после термообработки (80°С)

Клетки В. cereus Титр жизнеспособности, КОЕ • мл'1 после термообработки в течение

0 мин. 15 мин. 30 мин.

Вегетативные (2 ±0.5)-108 (3 ±0.7)-108 (3 ±0.4)-105 (1+0.3)- 108 < 103 (4±0.6)- 107

ЦРК

Таким образом показано, что при модификации условий культивирования цикл развития М. luteus и В. cereus (при репрессии спорообразования) завершался образованием ЦРК, длительно сохраняющих жизнеспособность, с невыявляемым уровнем эндогенного дыхания, повышенной терморезистентностью и специфической ультраструктурной организацией, что позволяет рассматривать их как покоящиеся формы бактерий. Если для М. luteus ЦРК - по-видимому, единственная форма покоя, то для В. cereus -альтернатива спорообразованию. Полученные результаты свидетельствуют о полиморфизме покоящихся форм микроорганизмов. Отметим, что при исследовании циклов развития Myxococcus xanthus наряду с миксоспорами были описаны периферические палочковидные клетки, образующиеся после исчерпания источников питания (O'Connor & Zusman, 1991). В регуляции жизнедеятельности микробного сообщества разнообразие покоящихся форм одного вида (эндоспоры и ЦРК В. cereus, миксоспоры и периферические палочки М. xanthus) может обеспечивать более гибкую стратегию его переживания.

3. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях Escherichia coli, Methylococcus capsuiatus, Micrococcus luteus, Bacillus cereus и Saccharomyces cerevisiae

Сопряженность автолиза и цитодифференцировки была впервые обнаружена при изучении циклов развития миксобакгерий (Sudo&Dworkin, 1964). После прекращения фазы роста вследствие исчерпания источников питания миксобактерии агрегируют и формируют плодовое тело, в котором

происходит автолиз части клеточной популяции под воздействием аутоин-дукторов автолиза - AMI, идентифицированных впоследствии как свободные ненасыщенные жирные кислоты (Rosenbluh & Rosenberg, 1990). За счет выхода из автолизирующихся клеток повышается внеклеточная концентрация ауторегуляторов, индуцирующих миксоспорообразование у оставшихся ин-такгными бактерий (Gerth, et а/., 1993).

Изучаемая система аугорегуляции, свойственная микроорганизмам других таксономических групп, включает как аутоиндукторы анабиоза - факторы ф (производные АОБ), так и аутостимуляторы автолиза - факторы d2 (свободные ненасыщенные жирные кислоты).Мы предположили, что основные закономерности модели цитодифференцировки миксобактерий правомерны для образования покоящихся форм в автолизирующихся культурах широкого круга микроорганизмов. Скорость и глубина автолиза части популяции, зависящие от уровня внеклеточных факторов d2, определяют тогда повышение концентрационного уровня внеклеточных факторов d1, что способствует индукции образования ЦРК другой частью популяции.

Возможность формирования ЦРК исследовали: (1) в автолизирующихся клеточных суспензиях различной плотности; (2) в условиях спонтанного или индуцированного автолиза, что достигалось суспендированием клеток в нативной среде роста или буферных растворах, соответственно; (3) при различных скоростях автолиза в зависимости от концентрации вносимого химического аналога фактора d2 (олеиновой кислоты).

Микроскопические наблюдения выявили, что в сгущенных суспензиях бактерий и дрожжей во всех вариантах автолиза: в нативной среде роста, в голодных буферных средах, с внесением химического аналога фактора d2 или без него - доля ЦРК составляла 10 -15% от общего числа клеток, в то время как в разбавленных суспензиях количество ЦРК было низким - 0,01 -0,2%.

Количество жизнеспособных клеток через 1 месяц экспозиции в сгущенных автолизирующихся суспензиях Е. со// и S. cerevisiae зависело от их плотности, наличия в инкубационной среде ионов Са2* (CaCI2 - 0,2 %) и рН среды. По сравнению с вариантами автолиза клеток, суспендированных в нативной среде роста, число КОЕ было на порядок более высоким, когда автолиз индуцировали перенесением сгущенных в 10-20 раз суспензий бактерий и дрожжей в буферные растворы со значением рН 8 для E.coli и 5.5 для S.cerevisiae (табл.8).

Аналогичные данные получены при изучении автолизирующихся сгущённых суспензий метанотрофных бактерий Ме^уЬсоссиэ сарзиШиэ, а также В.сегеиз, выращенных в условиях репрессии спорообразования. Для формирования ЦРК М. сервисе были оптимальными условия автолиза при сгущении суспензий в 20 раз, рН среды 5.5, в присутствии СаС12; для В. сегеиз - сгущение в 10 раз, при рН среды 6.0 и наличии ионов Са2+.

Таблица 8. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) Е.соН и Э. сегечмае в условиях спонтанного и индуцированного автолиза клеточных суспензий, хранившихся в течение 1 мес. при 28°С; КОЕ • мл-1 (% от контроля)_

Среда Сгущение

10 раз 20 раз 30 раз

Е.соН

контроль* среда роста + СаС12 буфер рН 6 + СаС12 буфер рН 7 + СаС12 буфер рН 8 + СаС12 (1.3±0.2)-10п (100) (3.5±0.5)-103 (0.27) (1.5±0.3)-10э (1.15) (1.9±0.4)Ю10(14.6) (2.3+0.5)-1010(17.6) (2.2±0.4)-1011(100) (3±0.3)Юв (0.14) (2 ±0.4)10й (0.83) (2.1±0.5)-101° (9.5) (4±1.0)-1010 (18.2) (3.5±0.5)-1011 (100) (4.0±0.3)-10е (0.11) (2.5+0.3)-109 (0.71) (1.9±0.4) Ю10 (5.4) (3.4±0.7) Ю'° (9.7)

асегемз/ае

контроль* среда роста + СаС12 буфер рН 4.5+ СаС12 буфер рН 5.5+ СаС12 (1.1 ±0.2)10" (100) (2.0±0.2)Ю8 (0.2) (7.0+0.6)-10Э (7) (2.5+0.5)-1010 (25) (2 ±0.2) 10" (100) (2.5±0.2)-108 (0.13) (9 ±1.0)-109 (4.5) (3±0.4)-1010(13.3) (3.0±0.6)-101' (100) (2.5±0.4)Ю8 (0.08) (8.9±0.9)ЮЭ (3) (4.0±0.5)-1010 (13)

На титр жизнеспособности образующихся в автолизатах ЦРК (помимо внешних физико-химических факторов) влияет такой эндогенный параметр, как "качество" клеток, зависящее от условий их культивирования. В опытах ЦРК получали в автолизирующихся суспензиях М. 1Меиз, выращенных на средах с избытком лактата или лимитированных по N и Р, а затем сгущенных в 10 раз и перенесенных в среду роста и буферные растворы (рН 5,25 и 7,25). При этом число жизнеспособных клеток было существенно выше в культурах микрококка, выращенных при недостатке Р, а в рамках этого варианта - в том случае, когда автолиз индуцировали перенесением сгущенных суспензий в буферный раствор с рН 7,25, по сравнению с вариантом автолиза в нативной среде роста (табл.9).

Таблица 9. Число жизнеспособных клеток (КОЕ) М. Ыеиэ при автолизе клеточных суспензий, сгущённых в 10 раз и хранившихся в течение 1 мес. при 28°С; КОЕ • мл-1 (% от контроля)__

среда Вариант среды

1 % лактат 0,5% лактат с лимитом N 0,5% лактат с лимитом Р

контроль* (1,1+0,3) 101г(100) (1,1±0,3)-1011 (10) (1,6±0,4)-1011 (14) (1,8±0,4)-101' (16) (2,0+0,5)-101° (100) (1,Э±0,4)-109 (10) (2,6+0,5)103 (13) (4,1±0,6)-108 (21) (2,6±0,5)Ю10(100) (7,0±0,8)-108 (2,7) (5,9±0,8)-10э (23) (9,0+0,9)-10э (37)

среда роста + СаС12

буфер рН 5,25+СаС12

буфер рН 7,25+СаС12

*число жизнеспособных клеток сразу после сгущения

На образование ЦРК при автолизе сгущенных суспензий также влияла его скорость. В экспериментах автолиз индуцировали внесением в клеточные суспензии бактерий и дрожжей химического аналога фактора д2 (олеиновой кислоты) в концентрациях 600-1600 нмоль/мл с целью повысить скорость выхода из автолизирующихся клеток факторов с!,, обуславливающих образование ЦРК. Число жизнеспособных покоящихся клеток, определяемое по величине КОЕ, и число ЦРК, определяемое фазово-контрастной микроскопией, при всех указанных концентрациях аналога фактора с)2 оказалось выше, чем в вариантах без его внесения (табл. 10).

Таблица 10. Число жизнеспособных клеток в клеточных суспензиях Е.соН и S.ceгevisiae в условиях автолиза, индуцированного химическим аналогом фактора с12, КОЕ • мл"1 (% от контроля), 1 мес. хранения._

С«, нмоль/мл Е.соН* З.се№1з1ае**

контроль*** 0 600 1200 1600 (2.2 + 0.2)-1011 (100) (2.5 + 0.4)-1010 (11.2) (4.7 + 1.4)-1010 (21) (7.9 + 0.5)-1010 (36) (8.5 + 0.4)-1010 (40) (1.0 + 0.2)-1011 (100) (1.4 + 0.2)-1010 (14) (2.5 + 0.7)-1010 (25) (3.0 + 1.1)-Ю10 (30) (4.4 + 1.8)-1010 (44)

* в суспензии, сгущенной в 20 раз (рН 8, без СаС12) и хранившейся в течение 1 мес. при 28°С; ** в суспензии, сгущенной в 10 раз (рН 5.5, без СаС12) и хранившейся в теч. 1 мес. при 28°С; '"число жизнеспособных клеток сразу после сгущения.

Клетки в длительно хранящихся автолизных суспензиях исследуемых бактерий и дрожжей не обладали экспериментально выявляемым уровнем эндогенного дыхания, что свидетельствовало об ингибировании их метаболической активности и могло рассматриваться как признак состояния покоя.

По сравнению с вегетативными клетками, ЦРК, образующиеся при автолизе в микробных суспензиях, имели ряд цитоморфологических особенностей. Для покоящихся клеток Е. coli были характерны: существенное снижение содержания рибосом в цитоплазме, более компактный нуклеоид и менее четко выявляемая цитоплазматическая мембрана. У ЦРК М. capsulatus наблюдались: резкое уменьшение внутрицитоплазматического мембранного комплекса; неравномерность электронной плотности цитоплазмы с чередующимися темными и светлыми зонами и агрегация рибосом. Покоящиеся формы дрожжей S. cerevisiae характеризовались снижением электронной плотности цитоплазмы, менее выраженным кристообра-зованием при относительно стабильном содержании митохондрий, резким увеличением объёма вакуолей при общем снижении их численности в клетке.

Таким образом показано, что микроорганизмы различных таксономических групп про- и эукариот - неспорообразующие бактерии М. luteus, Е. coli, М. capsulatus, бациллы В. cereus в условиях репрессии спорообразования, а также дрожжи S. cerevisiae способны при спонтанном и индуцированном автолизе клеточных суспензий к формированию покоящихся ЦРК. Их число зависит от: плотности клеточных суспензий; наличия ионов Са2+ в среде; pH среды; скорости автолиза, влияющей на скорость выхода из клеток и накопление в среде факторов ф; а также физиологического потенциала клеток, зависящего от модификации среды роста и их культивирования. По-видимому, процесс формирования ЦРК свойственен широкому кругу микроорганизмов (если не всем) и является более древним в эволюционном отношении способом образования покоящихся клеток, предназначенных для сохранения вида в неблагоприятных для роста условиях.

В порядке обсуждения можно предположить, что стратегия роста микробной культуры переходит в стратегию выживания через стадию автолиза, глубина и скорость которого регулируются эндогенными метаболитами с ауторегуляторной функцией.

4. Прикладные аспекты исследований

Химические аналоги факторов ф, обладающие в определенных концентрациях микробоцидным и микробостатическим эффектом в отношении широкого круга микроорганизмов, а также антиоксидантной активностью,

были испытаны в качестве биоцидов нового типа. Совместно с ЦНИИ кожевенной и обувной промышленности были разработаны условия консервации кожевенных полуфабрикатов и сырых шкур с помощью биоцидов с различающейся гидрофобностью, которые в концентрациях 0,05 -1 % обеспечивали защиту различных видов кожевенного сырья и хромированного полуфабриката от микробной деструкции в провокационных условиях в течение не менее 1 мес. Антимикробная защита обеспечивалась за счет проникновения биоцидов в кожевенный материал с обеих сторон на глубину 2,5 - 4 мм. По итогам работы имеются заключения специалистов отрасли о целесообразности применения новых биоцидов в качестве консервантов для кожевенной промышленности.

Совместно с Федеральным центром детской хирургии, ИНЭОС РАН и ИОНХ РАН были разработаны гелевые композиции на основе белковых и полисахаридных полимеров с добавлением стабилизирующих молекулярную структуру ионов Са2+ (в составе сложного неорганического полимера -гидроксиапатита). Пролонгированная антимикробная защита композиционных полимерных гелевых материалов, а также их антисептические свойства обеспечивались введением биоцида в концентрациях 0,05 - 0,1% в гели без гидроксиапатита и 0,5% в гели с гидроксиапатитом, что объяснимо связыванием молекул биоцида с этим неорганическим полимером. Полученные гелевые материалы были использованы в остеохирургии, а также для мик-рокапсулирования биологического материала. В опытах ЦРК или споры B.cereus были закапсулированы в гели с потерями не более 5-10%. Разработка способов капсулирования микроорганизмов может быть перспективной для создания живых бакпрепаратов на основе анабиотических клеток, особенно тех видов, для которых специализированные покоящиеся формы неизвестны, а также для хранения коллекционных микроорганизмов ex situ.

ВЫВОДЫ

1. Впервые из неспорообразующих бактерий M.luteus и M.roseus выделены внеклеточные ауторегуляторные факторы d, - аутоиндукторы анабиоза, биологическую активность которых определяют алкилоксибензолы (АОБ) с углеводородными радикалами во 2— и 4— положениях ароматического кольца, что отличает эти ауторегуляторы по химической природе от ранее описанных для P.carboxydoflava, B.cereus и S.cerevisiae.

2. Изучены основные закономерности динамики фактора d, в развивающейся сультуре M.luteus. Обнаруженная высокая внутриклеточная концентрация фактора d, (по сравнению с другими бактериями) может рассматриваться как эндогенная причина устойчивости клеток к неблагоприятным воздействиям.

3. Впервые получены анабиотические формы микрококков - цистоподобные зефрактерные клетки, образующиеся в циклах развития культур при модификации условий роста, направленных на усиление биосинтеза факторов d,. 1. Обнаружено, что неспорообразующие микроорганизмы Micrococcus luteus, Escherichia coli, Methylococcus capsulatus, бациллы B.cereus (при репрессии спорообразования), а также дрожжи Saccharomyces cerevisiae образуют цистоподобные рефрактерные клетки при автолизе клеточных суспензий, сопровождающемся повышением внеклеточного уровня фактора d,.

5. Показано, что цистоподобные рефрактерные клетки исследуемых бактерий 1 дрожжей обладают всеми необходимыми и достаточными признаками по-соящихся форм микроорганизмов.

3. Выявлена возможность практического применения химических аналогов фактора d, в качестве эффективных и экологически безопасных биоцидов, з частности для защиты кожевенных материалов и сырья от микробных эиоповреждений и создания биостойких гелевых композиционных материа-юв для остеохирургии, фармацевтики и биотехнологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воробьева Е.А., Соина B.C., Мешкова Н.В., Мулюкин А.Л. Сравнительнау оценка биологической активности в тундровых почвах и вечномерзлых породах// Сб. материалов I Международной конференции "Криопедология' (10-14 ноября 1992, Пущино), С. 222-225.

2. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d, е культуральной жидкости и клетках Micrococcus /и/еивШикробиология, 1996 т. 65, №1, С. 20-25.

3. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н.. Дужа М.В., Дудг В.И., Эль-Регистан Г.И., Образование покоящихся форм Bacillus cereus v Micrococcus luteus //Микробиология, 1996,T.65, №6,C. 782-789

4. Vorobyova ,E.A., Soma, V.S., Mulukin, A.L., Microorganisms and Enzyme Activity in Permafrost after Removal of Long-term Cold Stress//Adv. Space Res. 1996, vol. 18, no. 12, pp. 103-108.

5. Krylova, E.A., Babak, V.G., Mulyukin, A.L., Kozlova, A.N., Duzha, M.V., El-Registan, G.I., Gelatin Microcapsules Impregnated with Non-toxic Antimicrobia

Agent Having A Broad Range of Action //Proceedings of 5th International Workshop on Bioencapsulation, September 22-25, 1996, Potsdam, Germany, P. 26 I - 26 V.

6. Мулюкин А.Л., Луста K.A., Грязнова M.H., Бабусенко Е.С., Козлова А.Н. Дужа М.В., Митюшина Л.Л., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И., Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов II Микробиология, 1997, Т. 66, №1 , С. 42-49.

7. Krylova, Е.А., Mulyukin, A.L., Lukina, I.G., Kozlova, A.N., El-Registan G.I., Plashchina, I.G., Babak, V.G., and Poncelet, D., Stable Polysaccharide Gelling Systems for Bioencapsulation // Proceedings of 6th International Workshop on Bioencapsulation, August 30 - September 1, 1997, Barcelona, Spain, pp. 2.5. I -2.5. IV.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мулюкин, Андрей Львович, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ РАН

На правах рукописи УДК 579.22 : 579.242

МУЛЮКИН АНДРЕЙ ЛЬВОВИЧ

ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ У НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ

специальность: 03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Эль-Регистан Г.И.

МОСКВА 1998

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные понятия. 9

1.2. Специализированные покоящиеся формы микроорганизмов. 11

1.3. Состояние покоя у неспорообразующих микроорганизмов. 21

1.4. Ауторегуляторные факторы микроорганизмов. Аутоиндукторы анабиоза. 38

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 49

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 59

3.1. Обнаружение и динамика накопления ауторегуляторного

фактора d1? синтезируемого Micrococcus luteus. 59

3.1.1. Некоторые физиологические характеристики микрококков. 59

3.1.2. Выделение фактора dj. 68

3.1.3. Количественное определение алкилоксибензолов, входящих в состав фактора d{. 70

3.1.4. Динамика накопления ауторегуляторного фактора d,

в развивающейся культуре Micrococcus luteus. 77

стр.

3.2 Образование покоящихся цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК) Micrococcus luteus и Bacillus cereus при модификации условий культивирования бактерий. 84

3.3 Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях Escherichia coli, Methylococcus capsulatus, Bacillus cereus , Micrococcus luteus и Saccharomyces cerevisiae. 104

3.4 Прикладные аспекты исследований. 119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. 128

ВЫВОДЫ. 131

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

133

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Микроорганизмы способны гибко адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, что чаще всего связано с исчерпанием питательных веществ, источников энергии и пространственных возможностей. В ответ на такие условия микроорганизмы или продолжают размножаться, но со сниженной скоростью, или деление прекращается, и стратегия микробного роста заменяется стратегией переживания. Стратегия переживания реализуется за счет образования форм, отличающихся повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям. Таким свойством обладают покоящиеся (анабиотические) или, в меньшей степени, гипометаболические формы. К гипометаболическим клеткам относят описанные, главным образом, для грамотрицательных бактерий жизнеспособные некультивируемые клетки (Colwell, et al., 1985; Roszak & Colwell, 1987) и ультрамикробактерии (Morita, 1988), одной из основных характеристик которых является неспособность образовывать колонии при высеве на твердые питательные среды. Следует отметить, что специализированные анабиотические формы, такие как эндо- и экзоспоры, миксоспо-ры, цисты и акинеты, известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов, и поэтому вопрос об образовании покоящихся форм неспорообра-зующими микроорганизмами остается открытым, а исследования в этой области не теряют актуальности.

Как показано ранее, микроорганизмы различных таксономических групп обладают специфической системой ауторегуляции роста и развития их культур, осуществляющейся при участии внеклеточных метаболитов с функциями аутоиндукторов анабиоза (факторов dj) и аутоиндукторов автолиза (факторов d2). Повышение концентрационного уровня факторов dj в клеточной суспензии индуцирует образование цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), что было продемонстрировано для Bacillus cereus,

Pseudomonas carboxydoflava, Methylococcus capsulatus и Saccharomyces cerevisiae (Эль-Регистан с соавт., 1979; Пронин с соавт., 1982; Грязнова с соавт., 1985; Светличный с соавт., 1986; Эль-Регистан, 1988; Бабусенко с соавт., 1991). ЦРК, формирующиеся под воздействием факторов dl5 были отнесены к новому типу анабиотических форм микроорганизмов. Для отнесения ЦРК к покоящимся формам необходимы доказательства, что их образование является естественной стадией в циклах развития микробных культур. В направлении развития этих исследований данная работа предусматривала как расширение круга объектов - неспорообразующих микроорганизмов, так и изучение условий образования анабиотических клеток в циклах развития культур или при отмирании микробной популяции. Цель работы - изучение закономерностей образования и характеристика покоящихся клеток неспорообразующих бактерий, а также дрожжей. Задачи: (1) выявление ауторегуляторных факторов dj - аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий Micrococcus luteus и изучение их динамики в развивающейся микробной культуре; (2) изучение условий образования покоящихся цистоподобных рефрактерных клеток в цикле развития культур M.luteus и Bacillus cereus (при репрессии спорообразования; (3) исследование условий образования покоящихся форм про- и эукариот Micrococcus luteus, Escherichia coli, Methylococcus capsulatus, Bacillus cereus, и Saccharomyces cerevisiae в автолизирующихся клеточных суспензиях; (4) применение химических аналогов фактора dj в качестве биоцидов для защиты ряда материалов от микробных биоповреждений. Научная новизна работы. У неспорообразующих бактерий Micrococ cus luteus впервые обнаружен аутоиндуктор анабиоза - фактор dl5 в состав активного начала которого входят производные алкилоксибензолов с углеводородными заместителями во 2м и 4- положении ароматического кольца.

С применением специфического колориметрического метода изучена динамика фактора (1! в культуральной жидкости и клетках М. Шеш.

Показано, что при модификации условий культивирования, направленных на усиление биосинтеза фактора неспорообразующие бактерии МЛШеиз и спорообразующие бактерии В.сегет (при репрессии их спорообразования) завершали цикл развития их культур образованием ЦРК, которые обладают всеми необходимыми и достаточными признаками покоящихся форм: длительно сохраняют жизнеспособность, являются метаболически неактивными, обладают повышенной терморезистентностью и особенностями ультраструктурной организации.

Впервые установлено, что ЦРК образуются частью микробной популяции при её спонтанном и индуцированном автолизе, вследствие создания необходимого для их формирования концентрационного уровня факторов (¿1 за счет выхода аутоиндукторов анабиоза из автолизирующихся клеток другой части популяции. Возможность образования ЦРК в таких условиях была продемонстрирована для неспорообразующих микроорганизмов М. \uteus, Е. соН, М.сарзиШт, В.сегет (при репрессии спорообразования) и дрожжей & cerevisiae. Постулируется, что автолиз - не только стадия отмирания части микробной популяции, но и этап, предшествующий переходу оставшихся клеток микробной культуры в стратегию выживания.

Практическая ценность работы Выявленные условия образования покоящихся форм неспорообразующих микроорганизмов при модификации условий роста их культур или в процессе автолиза микробных суспензий могут найти применение при разработке способов получения бактериальных препаратов. Химические аналоги факторов сЦ успешно испытаны в качестве биоцидов нового типа и рекомендованы для защиты от микробного разрушения кожевенного сырья и полуфабрикатов, а также создания

биостойких гелевых композиционных материалов медицинского и косме-тологического назначения.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: I Международной конференции "Криопедология" (ПущиноД992); совещании "Научно-методические основы мониторинга биоразнообразия"(Москва, 1996); конференции "Биологически активные вещества в косметологии" (Москва, 1996); на 5 и 6-ой международных конференциях "International Workshop on Bioencapsulation" (Потсдам, Германия, 1996; Барселона, Испания, 1997); конкурсе научных работ ИНМИ РАН за 1996 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Воробьева Е.А., Соина B.C., Мешкова Н.В., Мулюкин А.Л. Сравнительная оценка биологической активности в тундровых почвах и вечномерзлых породах// Сб. материалов I Международной конференции "Криопедология" (10-14 ноября 1992, Пущино), С. 222-225.

2. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрелъянц А.С., Элъ-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология, 1996, т. 65, №1, С. 20-25.

3. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н.. Дужа М.В., Дуда В.И., Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus //Микробиология, 1996,Т.65, №6,С. 782-789

4. Vorobyova Е.А., Soina, V.S. Mulukin, A.L. Microorganisms and Enzyme Activity in Permafrost after Removal of Long-term Cold Stress//Adv. Space Res., 1996, vol. 18, no. 12, pp. 103-108.

5. Krylova, E.A., Babak, KG., Mulyukin, A.L., Kozlova, A.N., Duzha, M.V., and El-Registan, G.I. Gelatin Microcapsules Impregnated with Non-toxic Antimicrobial Agent Having A Broad Range of Action // Proceedings of 5th

International Workshop on Bioencapsulation, September 22-25, 1996, Potsdam, Germany, P. 26 I - 26 V.

6. Мулюкин A.JI., Луста K.A., Грязнова M.H., Бабусенко E.C., Козлова A.H.. Дужа М.В., Митюшина Л.Л., Дуда В.К, Элъ-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов // Микробиология, 1997, Т. 66, №1 , С. 42-49.

7. Krylova, Е.А., Lukina, I.G., Mulyukin, A.L., Kozlova, A.N., El-Registan G.I., Plashchina, I.G., Babak, KG., andPoncelet, D., Stable Polysaccharide Gelling Systems for Bioencapsulation // Proceedings of 6th International Workshop on Bioencapsulation, August 30 - September 1, 1997, Barcelona, Spain, pp. 2.5. I -2.5.IV.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Основные понятия.

Микроорганизмы обнаруживают удивительное свойство адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Жизнь микробов в естественных средах обитания весьма отличается от лабораторных условий культивирования, когда микроорганизмы, главным образом, выращиваются в искусственных "богатых" средах, что довольно редко имеет место в природе. В отличие от лабораторных условий микроорганизмы в природных средах обитания (почвах или водоемах) находятся в условиях ограниченной доступности субстрата и источников энергии (Stevenson, 1978; Mason, et al., 1986; Morita, 1988; Звягинцев, 1987). Ответы микроорганизмов на наступление неблагоприятных для активного вегетативного роста, в частности при дефиците питательных веществ (голодании), включает следующее (Калакуцкий, Сидякина, 1987): 1) продолжение роста, часто с умеренной скоростью и соответствующим изменением организации и состава вегетативных клеток в ходе физиологических и биохимических адаптаций; 2) прекращение роста и переход к "переживанию", что может осуществляться как в результате образования специализированных покоящихся клеток, так и путем перехода вегетативных клеток в состояние, ассоциируемое с представлениями о покое и анабиозе и позволяющее клеткам существовать длительное время без размножения.

Покой, в соответствии с определением Сюссмана и Холворсона, представляет "любой обратимый перерыв в фенотипическом развитии организма" (Sussman & Halvorson, 1966). Приведенное определение является достаточно широким понятием, под которым подразумевается множество

состояний, отличающихся по уровню метаболической активности - от ги-пометаболизма до анабиоза.

Согласно общепринятому и устоявшемуся в литературе по спороло-гии определению, к покоящимся формам микроорганизмов относятся жизнеспособные клетки, предназначенные для репродукции, характеризующиеся экспериментально невыявляемым уровнем метаболизма, резко сниженным или отсутствующим эндогенным дыханием, обладающие повышенной устойчивостью к экстремальным воздействиям (температуры, облучению, действию спиртов, кислот, ксенобиотиков и т. д.) и отличающиеся от вегетативных форм особенностями ультраструктурной организации. Особо следует отметить, что необходимой характеристикой покоящихся форм является их образование в естественном жизненном цикле развития микробных культур (Sudo & Dworkin, 1973; Cross & Atwell, 1975; Калакуцкий, Агре, 1977).

У микроорганизмов принято различать два вида покоя - конститутивный (эндогенный) и экзогенный (Sussman & Halvorson, 1966). Эндогенный покой обусловлен внутренними событиями в живой клетке и является естественным состоянием организма при возникновении неблагоприятных условий окружающей среды. Это состояние рассматривается как неотъемлемая часть онтогенеза в цикле развития культур микроорганизмов. Примерами клеток с эндогенным покоем являются специализированные покоящиеся формы микроорганизмов, такие как споры и цисты. Специализированные покоящиеся клетки микроорганизмов можно расположить в ряд: эндоспоры бактерий > мемноспоры грибов > ксеноспоры грибов > экзоспоры и цисты бактерий, в котором постепенному упрощению структурной и биохимической организации обычно соответствует и постепенное падение сроков сохранения жизнеспособности в физиологических условиях (Калакуцкий, Сидякина, 1987).

Экзогенный покой появляется вследствие обезвоживания клеток при действии внешних физических или же химических факторов, лиофилиза-ции, высушивании, замораживании, консервировании в концентрированных растворах сахарозы и солей (Беккер, Рапопорт, 1981). Вопрос об образовании форм, обладающих эндогенным покоем, у неспорулирую-щих бактерий остается открытым. В последнее время большое внимание уделяется описанию ультрамикробактерий (УМБ) и жизнеспособных, но некультивируемых клеток - ЖНК, обнаруженных, главным образом, у гра-мотрицательных бактерий.

1.2. Специализированные покоящиеся формы микроорганизмов.

К основным и наиболее изученным типам покоящихся форм прокариот с различной морфологией относят: 1) эндоспоры бактерий родов Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina (Holt & Ledbetter, 1969; Fitz-James & Young, 1969; Hanson, 1979; Tipper & Ganthier, 1972) и термофильных стрептомицетов Thermoactinomyces и Actinobifida (Калакуцкий, Агре, 1977; Hardisson & Manzanal, 1978); 2) миксоспоры (микроцисты) миксобактерий родов Sporocytophaga и Myxococcus (Dworkin & Gibson, 1964; Жилина, 1968; White, 1975); 3) цисты азотобактера (Cagle, et al, 1972; Vela, et al., 1970; Reusch, Sadoff, 1983); 4) акинеты цианобактерий (Clark & Jensen, 1969; Nichols & Carr, 1978; 5) конидии стрептомицетов (Cross, Atwell, 1974; Калакуцкий, Агре, 1977); 6) экзоспоры некоторых ме-тилотрофных бактерий (Whittenbury, et al., 1970) и Rhodomicrobium (Гор-ленко, 1969; Горленко и соавт., 1977).

Известны два механизма образования специализированных покоящихся форм, приводящие к образованию эндо- и экзоспор. Бактериальные эндоспоры образуются грамположительными бактериями (фирмакутами),

формируются внутри спорангия и обладают специфическими клеточными структурами: многослойными белковыми покровами, наружной и внутренней мембранами, кортексом, сердцевиной - споровым протопластом. Процесс образования эндоспор - это особый тип клеточной дифференциации, который можно отнести к разновидности эндоцитоза и который выражается в поглощении одной клетки другой с последующим внутриклеточным преобразованием поглощенной клетки (Дуда, 1979; 1982; 1987).

Эндоспорообразование, свойственное представителям родов Bacillus и Clostridium, подробно рассмотрено в обзорах (Hanson, 1979; Дуда, 1982). Этот процесс разделён на семь стадий. На начальной - хромосомы располагаются вдоль длинной оси спорулирующей клетки (1 ст.) . Затем происходит разделение хромосом, асимметричная септация материнской клетки, которая отчленяет будущую проспору (2 ст.). Третья стадия характеризуется поглощением проспоры и переводом ее внутрь материнской клетки, в результате чего образуется особая клетка, отделенная от цитоплазмы материнской клетки двумя мембранами, внешние стороны которых ориентированы друг к другу. На четвертой стадии между двумя мембранами синтезируется материал кортекса эндоспоры - модифицированный пептидог-ликан. Затем образуются покровы споры за счет белков цитоплазмы материнской клетки (5,6 ст.), споропласт обезвоживается, проспора приобретает свойства рефрактерности и термоустойчивости. На седьмой стадии материнская клетка лизируется и освобождает рефрактерную и термоустойчивую спору.

Спорообразование у термофильных стрептомицетов родов Thermoactinomyces и Actinobifida протекает аналогично образованию бактериальных эндоспор (Калакуцкий, Агре, 1977).

Экзогенный тип спорообразования свойственен большинству стрептомицетов и наиболее детально изучен для различных штаммов

Streptomyces. В основе этого процесса лежит деление гифы перегородками на участки, каждый из которых представляет собой будущую спору. На ранних стадиях образования экзогенных спор - конидий - происходит деление ядерного вещества, изменения в функционировании мембранного аппарата спорулирующей гифы, появление многочисленных мезосом и закладка споруляционных септ, с которыми ассоциированы мезосомы. Процесс формирования конидий у Streptomyces coelicoíor подразделен на пять стадий (McVittie, 1974). На начальном этапе воздушная гифа сходна по строению с вегетативной гифой (0 ст.). Затем апикальный участок гифы отделяется септой, и начинается спирализация этого участка гифы. Нук-леоиды, расположенные по длинной оси гифы, еще не реплицированы (1 ст.). На второй стадии формируются споруляционные септы с одновременным делением ядерного материала. Третья стадия характеризуется активным синтезом веществ стенки споры, которая становится в два раза толще. Споры округляются и начинают обособляться друг от друга. Они удерживаются в цепочке тонким слоем материнской гифы, которая постепенно автолизируется. На следующей стадии толщина стенки спор достигает наибольшей величины (в 3-5 раз толще стенки вегетативной гифы). Зрелые экзоспоры начинают освобождаться из цепочки при разру