Реактивация гетеротрофных бактерий микробных сообществ мерзлых подпочвенных отложений и погребенных почв

Кряжевских, Наталья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Реактивация гетеротрофных бактерий микробных сообществ мерзлых подпочвенных отложений и погребенных почв
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Реактивация гетеротрофных бактерий микробных сообществ мерзлых подпочвенных отложений и погребенных почв"

На правах рукописи

№

005061535

КРЯЖЕВСКИХ НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РЕАКТИВАЦИЯ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ МЁРЗЛЫХ ПОДПОЧВЕННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ И ПОГРЕБЁННЫХ ПОЧВ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

6!;ЮН ¿3)3

Москва-2013

005061535

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук (ИНМИ РАН)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Эль-Регистан Галина Ивановна

Официальные оппоненты: Степанов Алексей Львович

доктор биологических наук, профессор кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова

Новикова Наталья Дмитриевна

доктор биологических наук, заведующая лабораторией микробиологии среды обитания и противомикробной защиты Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственный научный центр РФ Институт медико-биологических проблем РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «24» июня 2013 года в 14-00 на заседании диссертационного совета Д002.224.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук по адресу: 117312, г. Москва, пр-т 60-летия Октября, д. 7, корп. 2

тел. (499) 135-21-39, факс (499) 135-65-30 -'/ Г! Л

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНМИ РАН

Автореферат диссертации разослан <<£{» мая 2013 г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Актуальность проблемы. Мёрзлые подпочвенные отложения и погребённые подкурганные почвы, которые рассматриваются как закрытые, а ранее активно функционирующие системы, являются природными резервуарами длительно (тыс. — млн. лет) законсервированных сообществ микроорганизмов, хранилищами древних генов и биомолекул [Gilichinsky et al., 2008; Margesin, 2009; Демкина с соавт., 2010]. Хотя в последнее время наблюдается концентрация внимания микробиологов и специалистов смежных дисциплин на изучении выживания микроорганизмов в этих уникальных местообитаниях [Vorobyova et al., 1997; Willerslev et al., 2004; Vishnivetskaya et al., 2006; Марфенина с соавт., 2009; Zhang et al., 2013], способы длительного сохранения жизнеспособности бактерий в неростовых условиях изучены недостаточно. Вечная мерзлота и погребённые почвы отличаются как генезисом, так и условиями хранения микробных сообществ [Демкин, 1997; Gilichinsky et al., 2008], что может сказываться на механизмах и формах выживания, а также на свойствах выживших организмов. Эти механизмы должны быть связаны со стрессоустойчивостью клеток; образованием метаболически неактивных (анабиотических) покоящихся форм; способностью к лабильному изменению диссоциативного спектра популяции, аккумулирующему ее адаптационный потенциал [Loewen et al., 1994; Storz et al., 2000; Бухарин с соавт., 2005; Rancio et al., 2007; Zgur-Bertok et al., 2007]. Способность микроорганизмов переходить в неростовых условиях в покоящееся состояние реализована полиморфизмом покоящихся форм (ПФ), в том числе дормантных некультивируемых клеток (НК) [Эль-Регистан с соавт., 1988; 2006; Kaprelyants et al., 1996; Мулюкин с соавт., 2009]. Для природных субстратов это подтверждается расчетами соотношений активной и суммарной микробной биомассы в палео- и современных почвах [Хомутова с соавт., 2004], а также данными прямого электронно-микроскопического анализа образцов вечной мерзлоты, показавшими, что подавляющая часть бактерий находится в виде цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) [Soina et al., 2004; Suzina et al., 2006; Дмитриев с соавт., 2008]. При этом популяции покоящихся клеток гетерогенны по сохранению ими пролиферативного потенциала и скорости реверсии к росту, что частично объясняет наличие образцов мерзлоты, где не выявляются колониеобразующие единицы, КОЕ=0. Поэтому для реактивации труднопрорастающих покоящихся форм и некультивируемых клеток требуются специально подобранные условия. Изучение возможных путей реактивации и свойств клеток покоящихся микробных сообществ перспективно для: 1) выявления форм и механизмов покоя; 2) теории стресса; 3) поиска новых стрессопротекторов, адаптагенов, биорегуляторов; 4) выделения новых микроорганизмов, в том числе продуцентов биологически активных веществ; 5) повышения эффективности мониторинговых исследований. Кроме того, большой интерес представляет перспектива ответить на вопрос о существовании временного предела сохранения жизнеспособности организмов. Вышеизложенное мотивирует актуальность изучения древних микробных сообществ вечной мерзлоты и подкурганных палеопочв.

Цель работы: изучить условия реактивации покоящихся микробных сообществ (на примере гетеротрофных бактерий) мёрзлых подпочвенных отложений и погребённых почв и свойства реактивированных микроорганизмов для выяснения форм и механизмов их длительного выживания в законсервированных экосистемах.

Задачи исследования.

1. Разработать приемы реактивации бактерий почвенных микробных сообществ на примере гетеротрофных мезофильных аэробных бактерий.

2. Провести сравнительный анализ результативности реактивации микробных сообществ мёрзлых подпочвенных отложений, погребённых почв, а также современных фоновых почв.

3. Определить в образцах мёрзлых отложений, погребённых и современных фоновых почв активность почвенных ферментов (на примере амилаз) как компоненты, влияющей на развитие микробиоты. Изучить возможность регуляции почвенной ферментативной активности низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы: алкилоксибензолами (АОБ), аминокислотами (АК), гуминовыми кислотами (ГК).

4. Провести сравнительное исследование адаптационных механизмов бактерий, выделенных из мёрзлых отложений, и их коллекционных аналогов по: а) физиолого-биохимическим характеристикам и устойчивости к стрессорным воздействиям; б) интенсивности образования покоящихся форм; в) внутрипопуляционной диссоциативной активности.

5. Оценить применимость протеомного анализа бактерий методом MALDI-TOF MS для детекции диссоциантов.

Научная новизна. 1. Разработаны способы реактивации клеток из длительно законсервированных микробных сообществ мёрзлых отложений и погребённых палеопочв, учитывающие механизмы и формы метаболического покоя (анабиоза) как основного способа выживания микроорганизмов в неростовых условиях. Приемы реактивации включают: необходимость пробоподготовки образцов, отмывки от (ауто)ингибиторов роста; потребность в регуляторах физиологической активности, стрессопротекторах и факторах межклеточной коммуникации; варьирование условий культивирования. 2. Обнаружены отличия в чувствительности к процедурам реактивации бактерий покоящихся сообществ мёрзлых отложений и погребённых почв, что можно объяснить их разными генезисом и условиями природной консервации. Выявлены различия в отклике покоящихся форм на процедуры реактивации по показателям реверсии к метаболической активности (FISH) и росту (КОЕ). 3. Из образцов реактивированных микробных сообществ мёрзлых отложений выделены 16 бактериальных изолятов родов: Acinetobacter, Arihrobacter, Brevundimonas, Exiquobacterium, Paenibacillus, Promicromonospora, Pseudomonas, Rhodococcus, Sphingomonas\ 8 из них определены до вида. Сравнительный анализ свойств бактерий пар сравнения - Arihrobacter oxydans шт. К14 и Acinetobacter hvoffii шт. ЕКЗОА, выделенных из мёрзлых отложений, и их коллекционных аналогов - шт. Ас-Ii 14 и шт. BSW-27, соответственно, выявил у изолятов из мерзлоты более

выраженный адаптационный потенциал: повышенную устойчивость к действию физических и биологических стрессоров; более интенсивное образование и полиморфизм покоящихся клеток (ЦПК, НК, ультрамелкие клетки с d<0,22 мкм); более выраженную фенотипическую вариабельность. 4. Предложен алгоритм анализа методом MALDI-TOF MS белковых спектров клеток бактерий, позволяющий выявлять диагностические различия на уровне внутрипопуляционных фенотипических диссоциантов, что может быть использовано для их детекции. 5. Выявлен эффект регуляции ферментативной активности (на примере амилаз) мёрзлых отложений, погребённых и современных почв низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы (алкилоксибензолами, аминокислотами и гуминовыми кислотами), обеспечивающий достижение в расконсервированных почвах уровня ферментативной активности, характерного для нативного уровня в фоновых почвах, что может играть существенную роль на этапе восстановления биологической активности палеопочв.

Практическая ценность работы: 1. Разработанные способы реактивации древних микробных сообществ погребённых почв и мёрзлых отложений, обусловливающие увеличение (на 1-7 порядков) численности культивируемых на агаризованных и в жидких средах бактерий, могут быть рекомендованы для повышения результативности экологического и санитарного мониторинга, а также поиска продуцентов биологически активных веществ, в том числе среди групп микроорганизмов, трудно изолируемых из природных субстратов. 2. Доказательства более выраженного у мерзлотных изолятов адаптационного потенциала являются основанием для скрининга среди них продуцентов метаболитов с адаптогенной и стрессопротекторной активностью. 3. Выявленные различия в белковых спектрах диссоциантов бактерий позволяют рекомендовать протеомный анализ MALDI-TOF MS для разработки методов индикации и отбора внутрипопуляционных вариантов бактерий в целях биотехнологии и медицины. 4. Обнаруженная возможность регуляции ферментативной почвенной активности может быть востребована в агротехнике.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); 10-ой Юбилейной Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2009); 1 Ith Student Conference on Conservation Science (Cambridge, UK, 2010); 10-ой международной конференции «European Workshop on Astrobiology EANA'10» (Пущино, 2010); Всероссийской конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012). По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи и 7 тезисов.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 220 страницах и состоит из введения, обзора литературы (ГЛАВА 1), экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 395 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 19 рисунками.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были: 1) 9 образцов мёрзлых подпочвенных отложений (МО) (200 тыс. - 2-3 млн. лет) и 3 - современных криогенных почв (КП) (верховья р. Большой Хомус-Юрях, Колымская низменность, Сибирь); 2) 6 образцов погребённых подкурганных почв (ПП) (4-5 тыс. лет) и 3 - современных степных почв (СП) (Волгоградская область) (табл. 1); 3) штаммы бактерий, выделенные автором из древних микробных сообществ, и 4) модельные коллекционные штаммы: Sinorhizobium meliloti Р221 (ВКПМ); Micrococcus luteus 13267 (NCIMB); Arthrobacter oxydans Ac-1114 Type (BKM); Acinetobacter hvoffii BSW-27 (коллекция Саратовского ГМУ); Escherichia coli шт. dsp 250 и E.coli шт. MG 1655 (коллекция ИМГ РАН); Rhodococcus opacus шт. 1 ср (коллекция ИБФМ РАН); Corynebacterium pseudodiphtheriticum шт. 090497 (коллекция ГНЦ РФ ИМБП РАН); Deinococcus radiodurans шт. 34 и Bacillus cereus шт. 504 (коллекция ИНМИ РАН).

В качестве регуляторных факторов использовали: 1) химические аналоги микробных алкилоксибензолов (АОБ) из группы алкилрезорцинов - С7-АОБ и Ci2-АОБ (Sigma, США); 2) регулятор роста растений - индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (Рапгеас, Испания); 3) регулятор роста из группы фитолектинов - агглютинин зародышей пшеницы (АЗП) (Лектинотест, Украина); 4) реактивирующий фактор (РФ) Luteococcus casei [Воробьева с соавт., 2009]; 5) аминокислоты (АК): L-глицин, D- и L-валин (AJONOMOTO Co. Inc., Япония); 6) глюкозу; 7) дрожжевой автолизат (ДА) (Difco, США); 8) 4 фракции гуминовых кислот (ГК), выделенных из современных и палеопочв [Орлов, Гришина, 1981].

Методы исследования. Микробную фракцию почвенных образцов получали из обработанной ультразвуком (22 кГц, 0,44 А, 2 мин) почвенной водной суспензии (1:100 в/об) после удаления почвенных частиц центрифугированием (3000 g, 10 мин).

Выделение бактерий из образцов мёрзлых подпочвенных отложений проводили прямым посевом на агаризованные среды и очищали последовательными пересевами. Выделенные изоляты хранили (и использовали как инокулят во всех экспериментах) в пластиковых эппендорфах в виде апиквот (1 мл) культур стационарной фазы первого пассажа после выделения, смешанных с глицерином как криопротектором (1:1), при температуре -20°С. Идентификацию выделенных штаммов бактерий проводили на основании фенотипических, хемотаксономических и генотипических характеристик, как описано [Bergey, 1985; Зенова с соавт., 2002]. Анализ последовательностей фрагментов генов 16S рРНК. полученных в ПЦР с применением универсальных праймеров [Lane, 1991], проводили с использованием базы данных GenBank NCBI BLASTIN (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) и редактировали с помощью программы

Chromas, версия 1.45 (http://www.techelvsiurn.com.auychromas.html'). Штамм Acinetobacter hvoffii EK30A определили с использованием тест-системы Gram Negative Identification Card с помощью биохимического анализатора Vitek (bioMerieux, Франция) согласно инструкциям производителя. Оценку разнообразия и численности метаболически активных бактерий методом FISH (fluorescent in situ hybridization) в образцах мёрзлых отложений и в популяциях ПФ исследуемых штаммов проводили с применением зондов, специфичных для представителей доменов Archaea и Bacteria, а также отдельных филогенетических групп Bacteria методом [Атапп, Ludwig, 2000; Dedysh et al., 2001; Манучарова с соавт., 2011].

Таблица 1. Описание природных образцов*, использованных в работе

Место отбора Обозна чение Глубина отбора Особенности, возраст

Подпочвенные мёрзлые отложения (МО) верховья р. Б. Хомус-Юрях, Колымская низменность, Сибирь 11/89 24,0 м; 25,2 м озерно-аллювиальные супеси, 2-3 млн. лет

2/90 23,0 м; 35,0 м озерно-аллювиальные суглинки и супеси, 1540 тыс. лет

2/05 1,9 м аллювиальные пески и супеси, 200 тыс. лет

3/05 8,0 м

4/05 18,0 м; 24,65 м аллювиальные гравелистые пески, 600 тыс. лет

6/06 4,15 м аллювиальные пески и супеси, 200 тыс. лет

Современные криогенные почвы (КП) 1-08 0-2(3) см глеезем грубогумусированный суглинистый

2-08 0-5(7) см глеезем грубогумусированный суглинистый

3-08 10-25 см криозем глееватый

Погребённые подкурганные палеопочвы (ПП) Волго-Донское междуречье, Волгоградская область Д-534 90-99см; 99-115 см; 115-131 см каштановая солонцеватая солончаковатая почва, 5 тыс. лет

Д-510 74-86 см каштановидная карбонатная несолонцеватая солончаковая почва, 4-5 тыс. лет

Д-681 143-153 см каштановая солонцеватая глубокосолончаковатая почва, 2 тыс. лет

Д-719 115-123 см каштановая остаточно-солонцеватая глубоко засоленная среднесуглинистая почва, 300 лет

Современные степные почвы (СП) Д-533 0-10 см каштановая солонцеватая глубокозасоленная почва

Д-678 0-18 см каштановая солонцеватая глубокосолончаковатая средне-тяжелосуглинистая почва

Д-720 0-13 см каштановая солонцеватая глубокосолончаковатая среднесуглинистая почва

* Образцы любезно предоставлены д.г.-м.н. и БПП РАН).

иличинским Д.А.|и д.б.н Демкиным В.А. (ИФХ

Бактерии культивировали в полноценных и разбавленных (в 2-20 раз) средах: LB (Carl Roth GmbH, Германия); TSB (TSA) (Panreac, Испания); TGY (г/л: дрожжевой автолизат- 3; триптон - 5; глюкоза - 1) и TGYg (TGY с глюкозой - 10 г/л); маннитной среде [Golubev et al., 2009], при 28°С в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на роторной качалке (140-160 об/мин). Общее число клеток в почвенных образцах (и микробных фракциях) определяли прямым счетом (микроскопы Axiopan и Axioskop, Carl Zeiss, Германия) с использованием флюоресцентных красителей: Live/Dead (Backlight, Molecular Probes, США) и акридина оранжевого (ПанЭко, Россия). Рост погруженных культур; колониеобразующую способность клеток (КОЕ(мКОЕ)/мл, КОЕ/г почвы); численность клеток в жидких средах (наиболее вероятное число жизнеспособ-ных клеток - НВЧК); термоустойчивость клеток; антибиотикоустойчивость клеток (к ампициллину — 1, 2, 5 мкг/мл или канамицину — 10, 25, 50 мкг/мл); устойчивость клеток к замораживанию-оттаиванию (1-10 циклов замораживания при -20°С - оттаивания при 22°С) определяли стандартными методами. Электронно-микроскопические исследования проводили с использованием электронного микроскопа JEM-100B (JEOL, Япония), как описано [Suzina et al., 2006]. Диссоциативные спектры, индекс диссоциации популяций и стабильность выделенных клонов определяли, как описано [Милько с соавт., 2007]. Покоящиеся формы (ПФ) и некультивируемые клетки (НК) бактерий получали: в условиях: голодания (ПФ1); дисбаланса источников питания с избытком фосфора (ПФ2); недостатком азота (ПФЗ) или азота и фосфора (ПФ4); на почвенном агаре при его высыхании (ПФ5); при действии химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза (С^-АОБ, Ю^-Ю"3 М) (ПФ6), как описано [Демкина с соавт., 2000; Мулюкин с соавт., 2008; 2009]. Фракцию ультрамелких покоящихся клеток получали фильтрованием популяций ПФ (фильтр с диаметром пор 0,22 мкм, Merck Millipore, США). Активность /?-галактозидазы определяли стандартным методом при расщеплении субстрата о-нитрофенил-/?-галактопиранозида [Миллер, 1976]; количество зкзополисахаридов (ЭПС) определяли фенол-сернокислым методом [Chose, 1987]. Ферментативную активность /?-амилазы определяли методом [Bernfeld, 1955]; активность амилаз in situ в образцах древних и современных почв -модифицированным методом Щербаковой [Хазиев, 2005]. Содержание в почвенных образцах АОБ (группы алкилрезорцинов) определяли в реакции с диазопроизводным 3,3-диметоксибензидина (FBB) (Sigma, США) [Tluscik et al., 1981].

Протеомный анализ клеток бактерий методом MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser-desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) проводили по методу [Fenselau, Demirev, 2001] в модификации [Plotnikova et al., 2011]. В качестве матриц использовали синапиновую (SA) и а-циано-4-гидроксикоричную (НССА) кислоты. Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов (Autoflex II, Bruker Daltonics, Германия). Диапазон регистрируемых масс составлял 220 кДа. Обработку масс-спектров проводили с помощью программных пакетов Flex analysis 2.2 и Biotyper 1.0 (Bruker Daltonics). Статистический анализ проводили, используя t-тест Стьюдента в программе Microsoft Excel для вероятности Р>0,95.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Реактивация покоящихся и некультивируемых форм гетеротрофных мезофильных аэробных бактерий из мёрзлых подпочвенных отложений и древних погребённых почв

3.1.1 Жизнеспособность бактерий микробных сообществ в образцах мёрзлых отложений, погребённых и современных почв изучали после стандартной пробоподготовки образцов [Егорова, 1976]. Были выявлены: несоответствие между числом потенциально жизнеспособных клеток, учитываемых прямым счетом (с красителем Live/Dead), и численностью бактерий, дающих колонии на агаризованных питательных средах, а также отличия по этим показателям образцов мёрзлых отложений от погребённых и современных почв (рис. 1).

Рисунок 1. Определяемые в природных образцах стандартными методами: 1 - общая численность (кл/г) интактных (живых) клеток бактерий (краситель Live/Dead); 2 - число жизнеспособных клеток (КОЕ/г, среда TSA/5, до 21 сут, t=22°C). Обозначения: КП - I -криозем глееватый; СП - VIII - каштановая солонцеватая глубокозасоленная Д-533; МО - II - 11/89 24,0 м; III - 11/89 25,2 м; IV - 2/05 1,9 м; V - 3/05 8,0 м; VI - 4/05 18,0 м; VII - 4/05 24,65 м; ПП-Д-534: IX - 0,90-0,99 м; X - 0,99-1,15 м; XI - 1,15-1,31 м.

Так, для погребённых и современных почв была характерна достаточно высокая численность колониеобразующих клеток, тогда как для ряда образцов мёрзлых отложений рост клеток на агаризованной среде отсутствовал (КОЕ=0). При этом показатели общей численности клеток по данным прямого счета во всех образцах были высокие (109-101' кл/г). Причиной показанного несоответствия, согласно рабочей гипотезе, было нахождение подавляющего большинства клеток почвенных микробных сообществ в покоящемся состоянии. Как известно, популяции покоящихся форм гетерогенны по глубине покоя клеток [Калакуцкий, Агре, 1977; Kaprelyants et al., 1996; Мупюкин с соавт., 2009], что ставит вопрос о необходимости создания определенных условий для реактивации труднопрорастающих покоящихся форм.

3.1.2 Реактивация покоящихся форм, в том числе некультивируемых клеток, бактерий коллекционных штаммов. Способы реактивации покоящихся клеток разрабатывали на моделях ПФ, в том числе НК, коллекционных штаммов 5. теШоИ, М. Шега, А. охуйат и Ас. образующихся при развитии культур бактерий в

модифицированных условиях роста (как описано в методах исследования). При этом учитывали, что: 1) согласно гипотезе \Sadoff е1 а1., 1975] состояние покоя обусловлено накоплением в ПФ аутоингибиторов прорастания (аутоиндукторов анабиоза), при выходе которых из клетки метаболический блок снимается; 2) определенные этапы прорастания ПФ контролируются различными низкомолекулярными внеклеточными регуляторами [Волошин, Капрельянц, 2004]; 3) прорастание ПФ сопряжено с развитием стресса и необходимостью защиты от него.

Эффективными приемами реактивации ПФ оказались: 1) предварительная отмывка ПФ от содержащихся в них аутоиндукторов анабиоза физиологическими или буферными растворами, или водой (рН 7,0-8,0); 2) регуляция прорастания отмытых ПФ регуляторными веществами с функциями джерминантов, индукторов метаболизма и стимуляторов роста (РФ Ь. ca.se¡, глюкозой, АК, ДА, АЗП, ИУК); 3) использование для рассева ПФ агаризованных (0,4%, 0,6% или 1,5% агара) и жидких полноценных, но разбавленных сред; 4) внесение в среды антиоксидантов; 5) детекция микроколоний (мКОЕ). Отмечено, что ПФ одного штамма, полученные в разных условиях роста его культур, обладают разной способностью к реверсии ростовых процессов (табл. 2).

Таблица 2. Эффекты реактивации ПФ коллекционных бактерий

Вариант ПФ Способ предобработки Эффект по КОЕ

ЦПК 5. теШой (ПФ4, 4 мес.) Ю^МИУК.гч > 2,4 раза

НК М. Ыеш (ПФ6, 7 сут) 1,0 мкг/мл АЗП, 1 ч > 5 порядков

НК М. Ыеш (ПФ1, 9 мес.) Варианты рассева

на ЬВ-агар на 1/5 ЬВ-агар +0,1% пирувата Ыа НВЧК3

КОЕ/мл мКОЕ2/мл КОЕ/мл мКОЕ/мл ЬВ ЬВ-агар (0,25% агара)

0,5 2,1 х 105 0 1,8x104 11 2,5x107

Эффект1 1 >105 - >104 -20 >107

1 Прирост (раз) по сравнению с КОЕ/мл на ЬВ-агаре; 2 микроколонии; 3 наиболее вероятное число клеток, определяемое методом предельных разведений.

3.1.3 Реактивация клеток микробных сообществ мёрзлых подпочвенных отложений, погребённых и современных почв. Пробоподготовка почвенных образцов перед посевом предусматривала: а) отмывку (1-2 ч) микробных фракций от (ауто)ингибиторов роста буферными растворами или водой (рН 7,0-8,0); б) отмывку в сочетании с индукцией метаболизма клеток предынкубацией микробных фракций (1-2 ч) в вытяжках из современных почв или растений (картофель); в) отмывку в сочетании

с индукцией роста клеток регуляторами роста (ИУК, АЗП и др.) (рис. 2, 3). Разработанные приемы увеличивали число КОЕ на 1-7 порядков, и, что особенно важно, в образцах, где без пробоподготовки роста не было (КОЕ=0) (рис. 2). При этом покоящиеся клетки микробных фракций из почв разного генезиса различались откликом на процедуры пробоподготовки. Воздействие ИУК (10" -10" М) было наиболее эффективно для образцов погребённых и современных почв (число КОЕ возросло на 2-3 порядка) (рис. 2), тогда как оптимальным приемом для реактивации клеток из мёрзлых отложений была их предынкубация с АЗП (5 мкг/мл) (рис. 3 а), после которой число КОЕ возросло до 3,5x105 по сравнению с КОЕ=0 в стандартных высевах. Эти результаты свидетельствуют о различиях в механизмах покоя клеток, находящихся в разных условиях природной консервации.

Рисунок 2. Реактивация клеток в образцах МО: I - 3/05 8,0 м; II - 4/05 24,65 м; ПП: III - Д-534 0,90-0,99 м; IV -Д-510; СП: V - Д-533, по показателям общей численности (4) (кл/г) и числа жизнеспособных клеток бактерий (1-3) (КОЕ/г) (среда ТБА/5, до 21 сут, 1=22°С). Обозначения: 1 - контроль (без реактивации); 2 - отмывка (1,5 ч) в Н20; 3 - предынкубация (1 ч) с ИУК (10"5 М -для образцов МО после их отмывки или 10"4 М - для образцов ПП и СП без предварительной отмывки); 4 - общая

Рисунок 3. Численность жизнеспособных клеток бактерий (КОЕ/г) в образце МО 6/06 4,15 м при разных вариантах пробоподготовки (а) и использовании для посева сред разного состава (б). Обозначения: (а) посев на среду ТБА/Ю (1,5% агара): 1 - без предынкубации (контроль); 2-5 - с предынкубацией (1,5 ч): 2 - в Н20; 3-е дрожжевом экстрактом (0,1%); 4-е С7-АОБ (50 мкг/мл); 5-е АЗП (5 мкг/мл); (б) посев (после отмывки в Н20, 1,5 ч) на среду: 1 - ТБА (1,5% агара), контроль; 2 - Т8А/10 (1,5% агара); 3 - Т8А/10 (1,5% агара) + С7-АОБ (50 мкг/мл); 4 - Т8А/10 (0,4% агара) на подложке из ТБА/Ю (1,5% агара); 5 - бульон ТвВ/Ю, метод предельных разведений (МПР).

численность клеток (с красителем Live/Dead).

При посевах приемами, обеспечивающими повышение полноты учета жизнеспособных клеток в древних микробных сообществах, в том числе НК, были: варьирование состава сред для их рассева - полноценных, но разбавленных, с целью предупреждения гибели клеток, «ускоренной субстратом»; внесение в среды добавок ростстимулирующих соединений: дрожжевого экстракта, АЗП, ИУК; использование полужидкого агара и/или внесение в среды антиоксидантов: С7-АОБ, пирувата Na для предотвращения окислительного стресса (рис. 3 б).

Совокупное действие перечисленных приемов реактивации оказалось эффективным для повышения полноты учета жизнеспособных клеток в длительно законсервированных микробных сообществах.

3.1.4 Влияние микробных ауторегуляторов на физиологический статус клеток почвенных бактериальных сообществ. Обнаруженная разница в эффективности реактивации ПФ из современных почв и мёрзлых отложений (увеличение числа КОЕ на 2 и на 6-7 порядков, соответственно) может объясняться различиями в естественном пуле природных регуляторов, контролирующих состояние покоя, в том числе АОБ, что было подтверждено показанным нами разным содержанием легкоэкстрагируемых АОБ в почвах разного генезиса (табл. 3).

Таблица 3. Содержание легкоэкстрагируемых АОБ в природных образцах

Группа образцов (количество) Содержание АОБ

в мкг/г образца в пересчете на объем почвенной полевой влаги, мкг/мл

Погребённые почвы (5) 2,0-4,1 13,5 - 37,5

Мёрзлые отложения (4) 1,5-9,6 И.о.

Современные почвы (2) 0,3 - 0,6 4,2 - 5,8

Влияние АОБ на метаболизм бактерий in situ было исследовано нами в экспериментах с внесением химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза, С12-АОБ (до 5х 10"4 М), в образцы размороженных мёрзлых подпочвенных отложений и современной тундровой почвы. В обоих образцах несколько возрастала доля клеток с нарушенной мембраной, параллельно с уменьшением доли интактных клеток (тест с Live/Dead) (рис. 4). При этом в образцах мёрзлых отложений (рис. 4 а) число КОЕ снижалось незначительно по сравнению с контролем до внесения С12-АОБ, тогда как в образцах современной почвы (рис. 4 б) бактерии утрачивали способность к росту (КОЕ=0), хотя количество клеток с неповрежденной мембраной, потенциально способных к росту (тест с Live/Dead), было достаточно велико (на уровне 8 порядка). Выявленные различия могут объясняться большей устойчивостью (в том числе к воздействию высоких концентраций С12-АОБ) анабиотических клеток, переживающих в вечномёрзлых отложениях, чем в современных криогенных почвах.

В целом, вышеизложенные результаты демонстрируют высокую степень гетерогенности покоящихся микробных популяций в длительно законсервированных экотопах по требованиям специальных процедур для восстановления метаболической

активности клеток. Последнее было подтверждено независимым методом FISH -флюоресцентной in situ гибридизации.

Рисунок 4. Численность клеток (кл/г) с ненарушенной (1) и нарушенной (2) барьерной функцией мембраны (по данным окрашивания красителем Live/Dead), а также жизнеспособных клеток (КОЕ/г, среда TSA/10) (3) при внесении С]2-АОБ в образцы МО -2/90 23,0 м (а) и КП - криозема глееватого (б).

3.1.5 Оценка разнообразия и численности прокариот в образцах мёрзлых отложений методом FISH. Анализировали мёрзлые отложения, в том числе образец 6/06 4,15 м, в котором без реактивирующих процедур не было выявлено способных к росту клеток (КОЕ=0). Показано, что численность метаболически активных прокариот размороженного и увлажненного контрольного образца (без специальной обработки) составляла 10° кл/г, что соответствует 5% от общего количества микробных клеток (окрашивание акридином оранжевым). В вариантах с пробоподготовкой образца (отмывка в Н20, 1,5 ч) доля метаболически активных клеток возросла на 2 порядка до 108 кл/г, а после предынкубации образца с АЗП (5 мкг/мл) - достигла 77,4% от их общего числа, из них эубактерий - 71,2%, архей - 6,2%.

Таким образом, большинство клеток бактерий в длительно законсервированных почвенных биотопах потенциально жизнеспособны и, находясь в покоящемся состоянии, сохраняют способность ревертировать к активному метаболизму при создании необходимых для этого условий.

3.2 Регуляция ферментативной активности мёрзлых отложений, погребённых и современных почв

Известно, что микробная компонента почв и пул почвенных ферментов взаимосвязаны [Звягинцев, 1979; Burns, 1982]: состояние и состав микробиоты определяют качество и количество поступающих в среду ферментов; ферменты, в свою очередь, влияют на уровень доступности субстратов, потребляемых микроорганизмами. Имеются единичные сообщения о сохранении ферментативной активности в мёрзлых отложениях [Vorobyova et al., 1997; Брушков с соавт., 2011] и палеопочвах [Хомутова с соавт., 2012], о возможности регуляции активности почвенных ферментов ничего не известно. Вместе с тем, эти вопросы представляют интерес для понимания процессов реактивации микробных сообществ после

контроль

6 4 2 0

контроль 1 Концентрация С12-АОБ

расконсервирования палеообъектов.

3.2.1 Определение ферментативной активности мёрзлых отложений, погребённых и современных почв проводили на примере почвенных амилаз. Было показано, что уровень нативной активности амилолитического комплекса в образцах погребённых почв и вечномёрзлых отложений существенно ниже (в 3-12 раз), чем в современных почвах, являющихся активно функционирующими системами (табл. 4).

3.2.2 Регуляция активности модельного фермента р-амилазы. При изменениях водного режима как древних, так и современных почв в них будет меняться концентрация присутствующих в органическом веществе почвы низкомолекулярных соединений, способных модифицировать структуру сохранившихся ферментных белков и, таким образом, влиять на их активность. В качестве модификаторов ферментных белков использовали вещества, типичные для органического вещества почвы: гомологи АОБ, аминокислоты (АК) и фракции гуминовых кислот (ГК). Гидрофобный С12-АОБ дозозависимо стимулировал (0,002-0,06 мг/мл) или ингибировал (>0,06 мг/мл), а амфифильный С7-АОБ стимулировал в широком диапазоне концентраций (0,02-0,2 мг/мл) активность /3-амилазы. Было выявлено стимулирующее действие О- и Ь-аминокислот (0,02-0,2 мг/мл), при этом менее выраженное (до 120% от контроля), чем эффекты АОБ (до 170% от контроля). Впервые показанное дозозависимое действие ГК было аналогично эффектам С12-АОБ и имело концентрационные диапазоны (1,5-9,0 мкгС/мл) стимуляции (до 140-170%) и ингибирования (>9 мкг/мл) (рис. 5 а).

3.2.3 Регуляция амилолитической активности в природных образцах. Исследованные соединения в эффективных концентрациях были применены в качестве модификаторов структуры почвенных ферментов для регуляции их активности (амилолитической) в образцах палеобъектов и современных почв. Действие модификаторов, в целом, имело сходный характер для всех образцов древних и современных почв и было аналогично их эффектам на индивидуальную /?-амилазу, однако наблюдались определенные отличия (рис. 5 б). (1) Уровень активации почвенных амилаз был в 3 и более раз выше, чем индивидуального фермента. (2) Действие АК имело выраженную осциллаторную дозозависимость, одинаковую для Ь-аминокислот и отличную от характера действия О-вапина, что свидетельствует о роли стереоизомеризации аминокислот не только в организации биологических макромолекул, но и в регуляции их функциональной активности. (3) Стимулирующее действие регуляторов на амилолитическую активность в палеобъектах было существенно выше (в погребённых - на 350-800%, глубокомёрзлых - на 350-600%), чем в современных фоновых почвах (на 200-400% от контроля) (табл. 4). (4) И, наиболее интересное, при действии модификаторов ферментативная активность древних почв достигала уровня нативной активности современных почв.

Таким образом, впервые показана возможность гибкой модуляции и более полного проявления энзиматической активности в палеообъектах (мёрзлых отложениях, погребённых почвах) и современных почвах за счет взаимодействия

почвенных ферментных белков с низкомолекулярными соединениями -компонентами органического вещества почв, концентрации которых могут меняться при расконсервировании древних почвенных систем и их увлажнении.

Таблица 4. Нативная и потенциальная (максимальная при внесении АОБ или АК) амилолитическая активность в природных образцах: ПП - погребённых почв; СП -современных степных почв; МО - мёрзлых отложений; КП - современных криогенных почв. В скобках - максимальный прирост активности для образца (раз) по сравнению с нативной

Образец ПП СП ПП СП МО КП МО КП

Д-719 Д-720 Д-681 Д-678 2/90 23 м 1-08 2/90 35 м 2-08

Активность, мг мальтозы /1 г почвы за 24 ч (прирост, раз)

Нативная 0,13 0,65 0,06 0,40 0,14 0,17 0,18 0,29

Макс, потенц. с АОБ 0,44 (3,4) 1,10 (1,7) 0,40 (6,7) 1,51 (3,8) 0,49 (3,5) 0,57 (3,3) 0,64 (3,6) 1,10 (3,8)

Макс, потенц. сАК 0,56 (4,3) 1,28 (2,0) 0,69 (11,5) 1,00 (2,5) 0,67 (4,8) 0,90 (5,3) 1.13 (6,3) 1,49 (5,1)

Рисунок 5. Влияние низкомолекулярных ауторегуляторов на активность /?-амилазы (а) и амилолитического комплекса в древних и современных почвах (б): 1 - ПП (2 тыс. лет); 2 -МО (15-40 тыс. лет); 3 - КП (современная); 4 - СП (современная).

3.3 Изучение адаптационного потенциала микробных изолятов из вечномёрзлых подпочвенных отложений

Микробное сообщество вечной мерзлоты, которое формировалось при чередовании сезонных циклов замораживания-оттаивания и постепенного погружения почвы на уровень неоттаивающего слоя, является крайне интересным объектом для изучения механизмов приспособления и выживания микроорганизмов в резко меняющихся и неростовых условиях за счет реализации физиолого-биохимических и

генетических механизмов устойчивости клеток и отбора соответствующих условиям внутрипопуляционных вариантов, совокупно составляющих адаптационный потенциал организма [Boor, 2006; Магданова, Голясная, 2013]. Поэтому одной из задач работы было сравнить адаптационный потенциал у образующих пары сравнения изолятов из вечномёрзлых подпочвенных отложений и их коллекционных аналогов.

3.3.1 Идентификация мерзлотных изолятов бактерий. Из образцов мёрзлых отложений Колымской низменности Сибири были выделены в чистые культуры 16 изолятов, которые по результатам анализа фрагментов гена 16S рРНК оказались представителями родов: Acinetobacter (2), Arthrobacter (4), Brevundimonas (2), Exiquobacterium (1), Paenibacillus (2), Promicromonospora (1), Pseudomonas (2), Rhodococcus (1), Sphingomonas (1). Восемь изолятов были определены до вида: Arthrobacter oxydans, A. sulfonivorans (2), Pseudomonas mandelii, Brevundimonas vesicularis, Paenibacillus amyloliticus (2), Acinetobacter Iwoffii. Для сравнения адаптационных характеристик бактерий были выбраны: выделенный нами шт. А. oxydans К14 в паре с его коллекционным аналогом - шт. Ас-1114; и шт. Ас. Iwoffii: ЕКЗОА, выделенный из мерзлоты, и соответствующий коллекционный шт. BSW-27.

3.3.2 Физиолого-биохимические характеристики бактериальных изолятов из вечномёрзлых отложений и их коллекционных аналогов. Сравнение физиолого-биохимических характеристик бактерий A. oxydans и Ас. Iwoffii, коллекционных и выделенных из мёрзлых отложений, показало, что последние уступали коллекционным аналогам по ростовым характеристикам, однако имели преимущества по ферментативной активности клеточной /?-галактозидазы, которая у шт. К14 детектировалась на всех фазах развития культуры, а в клетках стационарной фазы была выше в 5-7 раз, чем у шт. Ас-1114. Также мерзлотный штамм К14 был более продуктивен (на 25%) в отношении синтеза экзополисахаридов, имеющих важные защитные функции [Enos-Berlage et al., 2000]. Штаммы Ас. Iwoffii BSW-27 и ЕКЗОА также различались ростовыми характеристиками.

Таблица 5. Устойчивость бактерий А. oxydans штаммов Ас-1114 и К14 и Ас. Ы>о0И штаммов В8\¥-27 и ЕКЗОА к воздействию экстремальных температур и антибиотикам

Штамм Число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл (% от КОЕ до воздействия)

До Т°-обработки 50°С, 5 мин Замораж,-оттаив., 5 циклов До воздействия Ампициллин, 1 мкг/мл Ампициллин, 2 мкг/мл Канами- цин, 50 мкг/мл

А. oxydans Ас-1114 1,ЗхЮ9 (100) 6,4x106 (0,49) 6,5x108 (50,0) 2,4х108 (100) 1,4x103 (0,6x10"3) 0 2,7x102 (0,1 хЮ'3)

К14 6,3x108 (100) 4,5x107 (7,1) 4,6x108 (73,0) 3,1хЮ7 (100) 3,0хЮ2* (1,0хЮ"3) 0 3,0хЮ2* (1,0x10"3)

Ас. Iwoffii BSW-27 2,0x108 (100) 1,1хЮ7 (5,5) 1,7хЮ7 (8,5) 2,1 хЮ8 (100) 7,6хЮ7 (36,2) 8,0x106 (3,8) 0

ЕКЗОА 1,6x108 (100) 8,9x107 (55,6) 4,4x107 (27,5) 3,8хЮ8 (100) 1,8хЮ8 (47,4) 1,1хЮ8 (28,9) 0

* Рост в виде микроколоний.

При сравнении устойчивости штаммов A. oxydans Ас-1114 и К14 и Ас. Iwoffii BSW-27 и ЕКЗОА к воздействию стрессоров были получены ожидаемые результаты: клетки мерзлотных изолятов были более устойчивы к: (1) процедурам замораживания-оттаивания (в 1,5-6,3 раза); (2) тепловому шоку (в 10-14 раз); (3) воздействию антибиотиков (до 7 раз) (табл. 5).

3.3.3 Образование покоящихся форм изолятами из вечномёрзлых отложений A. oxydans и Ас. Iwoffii и их коллекционными аналогами. В неростовых условиях стратегия развития культур микроорганизмов меняется от их размножения к переживанию в виде покоящихся форм (ПФ) [Калакуцкий, Агре, 1977; Дуда с соавт., 1982; Эль-Регистан с соавт., 2006] и некультивируемых клеток (НК) [Roszak, Colwell, 1987; Kaprelyants et al., 1993].

Покоящиеся формы типа ЦПК. ПФ мерзлотных и коллекционных штаммов А. oxydans и Ас. hvoffii получали с использованием приемов культивирования, имитирующих природные условия (как описано в методах исследования). Полученные ПФ обоих штаммов артробактеров имели характеристики, типичные для описанных ранее ЦПК неспорообразующих бактерий Щемкина с соавт., 2000; Suzina et al., 2006; Мулюкин с соавт., 2009]. Интенсивность образования и стрессоустойчивость ПФ артробактеров зависели от среды культивирования бактерий и температуры созревания и хранения ПФ (3°С или 28°С) и были выше у мерзлотного изолята шт. К14 (табл. 6). Колониеобразующая способность ПФ сохранялась дольше в условиях хранения при 3°С, тогда как стрессоустойчивость ПФ, напротив, была выше при их созревании и хранении при 28°С. Так, в суспензиях ПФ2 (дисбаланс фосфора) A. oxydans шт. К14 через 10 мес. хранения при 3°С число КОЕ составило 37%, тогда как хранение при 28°С привело к переходу покоящихся клеток в некультивируемое состояние (число жизнеспособных клеток, КОЕ/мл=0). Самыми термоустойчивыми (50°С, 10 мин) оказались ПФ1 (голодание) шт. К14, хранившиеся при 28СС (сохранялось 28% по числу КОЕ). У Ас. hvoffii шт. ЕКЗОА и BSW-27 способность к образованию ПФ типа ЦПК была менее выражена, чем у артробактеров, при этом интенсивность формирования ЦПК у мерзлотного штамма была больше, чем у коллекционного (табл. 6).

Таблица 6. Число жизнеспособных покоящихся форм (КОЕ/мл) и их доля (% от числа КОЕ/мл в стационарной фазе культур) в культурах мерзлотных и коллекционных штаммов A. oxydans (2 мес. хранения) и Ас. Iwoffii (11 мес. хранения)

Вариант Жизнеспособность ПФ, КОЕ/мл (% от стационарной культуры)

A. oxydans шт. Ас. iwoffii шт.

Ас-1114 К14 BSW-27 ЕКЗОА

Стац. культура 5,0х108(100) 1,0х108 (100) 3,9хЮ8 (100) 3,8хЮ8 (100)

ПФ1 5,3x107 (10,6) 4,8хЮ7(48,0) 2,2x103 (0,00 06) 1,6x105 (0,04)

ПФ2 7,7хЮ7 (15,4) 5,6х107 (56,0) 0 8,0x104 (0,02)

Некультивирумые клетки (НК) образовывались в длительно (до 10 - 18 мес.) хранящихся при 22°С популяциях ПФ обеих бактерий. Детекцию НК проводили, определяя долю метаболически активных клеток (FISH) от их общего числа до и после проведения процедур реактивации (табл. 7). Оказалось, что, несмотря на отсутствие КОЕ, суспензии НК исследуемых штаммов содержали от 0,2 до 9,5% метаболически активных клеток (FISH), доля которых после применения реактивирующих процедур (табл. 7) увеличилась у шт. BSW-27 в 2 - 3 раза, у шт. ЕКЗОА - в 2 - 7 раз, у шт. К14 - более чем в 300 раз от их количества в контроле (до реактивации). При этом корреляция между реверсией клеток к метаболической активности и их делением не наблюдалась.

Следовательно, для восстановления колониеобразующей способности НК помимо регуляторных веществ, использованных в настоящей работе, нужны дополнительные факторы реактивации, возможно, метаболиты типа Rpf-фактора [Kaprelyants et al., 1993] и другие соединения с функциями межклеточной коммуникации.

Таблица 7. Реактивация ПФ2, в том числе НК (дисбаланс фосфора, 28°С, 11 мес.) мерзлотных штаммов Ас. Iwoffii ЕКЗОА и A. oxydans шт. К14 по показателям восстановления метаболической активности клеток (FISH) и способности к колониеобразованию (КОЕ)

Вариант реактивации, 1 ч Ас. Iwoffii, шт. ЕКЗОА А. oxydans шт. К14

FISH КОЕхЮ5/мл (раз от контроля) FISH КОЕ/мл

%* раз от контроля %* раз от контроля

Контроль 9,5 1,0 1,2(1,0) 0,2 1,0 0

Отмывка (pH 7) 15,5 1,6 2,7 (2,3) 1,8 9,0 0

ИУК(2,5х10"4М) 53,6 5,6 1,7(1,4) 62,8 314 0

С7-АОБ (2,5x1 О"4 М) 48,8 5,1 2,4 (2,0) 18,4 92 0

АЗП (3 мкг/мл) 67,9 7,2 1,9(1,6) 7,9 40 0

Др. автолизат(1%) 47,6 5,0 3,2 (2,8) - - -

* % метаболически активных клеток от общего числа клеток, окрашиваемых акридином оранжевым.

Третьей формой покоя, обнаруженной нами у исследуемых бактерий, были ультрамелкие покоящиеся клетки, полученные фильтрованием (фильтр с порами 0,22 мкм) суспензий ПФ и сходные по морфологии с наноклетками почв [Лысак с соавт., 2010]. Ультрамелкие покоящиеся клетки, особенно многочисленные у мерзлотного изолята А. охуёат шт. К14, имели лимоновидную форму (рис. 6 б), утолщенные клеточные стенки (рис. 6 а - г), капсулярный слой (рис. 6 в) и образовывались путем дробления более крупных полиморфных ПФ (рис. 6 а, г, стрелки). На количество и жизнеспособность (КОЕ) ультрамелких ПФ влияли условия получения покоящихся суспензий и их возраст (табл. 8). Ультрамелкие ПФ вырастали при посеве на ЬВ-агар в виде мелких колоний (8т-типа), при пересевах которых наблюдалась реверсия бактерий к исходному колониально-морфологическому 5-типу.

Рисунок 6. Ультратонкое строение (а, г) и препараты целых клеток (б, в) ультрамелких покоящихся форм (ПФЗ) штамма К14 A. oxydans. Длина масштабной метки - 0,2 мкм.

Таблица 8. Численность жизнеспособных (КОЕ/мл) ультрамелких клеток (d<0,22 мкм) и их доля (% от общего числа ПФ, КОЕ/мл) в суспензиях покоящихся форм A. oxydans шт. К14 (посев на LB-arap, без реактивации)

Вариант получения клеток Возраст, мес. Общая численность ПФ, КОЕ/мл Численность ПФ <0,22 мкм

КОЕ/мл % от общего КОЕ

ПФ2 (дисбаланс фосфора) 10 3,7х 107 0* 0

ПФ5 (почвенный агар) 10 8,2* 107 5,7x105 0,7

18 8,1х 105 2,0хЮ2 0,02

* Рост также отсутствовал в полужидком ЬВ-агаре (0,6% агара), среде ЬВ и ЬВ/5 (метод предельных разведений).

Таким образом, способность к образованию покоящихся форм бактерий как важное адаптивное свойство вида была больше выражена у мерзлотных изолятов (по сравнению с коллекционными штаммами) и характеризовалась большими интенсивностью образования ПФ, их стрессоустойчивостью и внутривидовым полиморфизмом ПФ, а также развитием более широкого спектра внутрипопуляционных вариантов при прорастании ПФ, что рассмотрено в следующем разделе работы.

3.3.4 Популяционная вариабельность. О популяционной вариабельности мерзлотных и коллекционных штаммов бактерий А. oxydans и Ас. судили по

удельной доле (%) колоний различающихся колониально-морфологических типов и антибиотикоустойчивых клонов.

Колониально-морфологические варианты. Мерзлотный шт. К14 А. oxvdans отличался от коллекционного штамма большей метастабильностью генотипа: при посевах на агаризованные среды аликвот растущих культур (в среде ЬВ, 15 ч) мерзлотного изолята было отмечено развитие колоний сразу четырех морфотипов: доминантного 8 и минорных — М, К и 8т, составляющих в сумме около 3% (табл. 9). Диссоциативные спектры развивающихся (в среде ЬВ) культур шт. К14 зависели от их физиологического возраста (фазы роста) и селективности среды для рассева клеток

(табл. 9). Так, доля клеток М-фенотипа увеличивалась в стареющих культурах. Диссоциант Я-типа предпочтительно развивался на средах с высоким содержанием глюкозы (ТСУ§). Популяционные спектры при рассеве ПФ, зависели от условий образования ПФ и отличались большим диссоциативным разнообразием (чем при рассеве растущих культур), что коррелирует с ранее полученными данными [Дорошенко с соавт., 2005; Мулюкин с соавт., 2009; Погорелова с соавт., 2009].

Коллекционный шт. Ас-1114 А. охуйат обладал более высокой генотипической стабильностью: погруженные культуры, развивающиеся в разных средах, были представлены только клетками доминантного Б-типа. Однако, при рассеве ПФ (2 мес.) этого штамма в популяциях, выросших на агаризованной среде, были выявлены колонии М-, Я- и 8т-типов (табл. 9). Колониально-морфологические признаки диссоциантов мерзлотного и коллекционного штаммов были аналогичны, а результаты анализа фрагмента гена 16Б рРНК диссоциантов доказали их принадлежность соответствующим штаммам А. охус1ат.

Таблица 9. Индекс диссоциации популяций А. охуйат шт. Ас-1114 и К14, полученных в

различных условиях

Вариант ПФ* Время хранения ПФ, мес. Среда для посева КОЕ/мл Индекс диссоциации, %

Б М Я

коллекционный штамм Ас-1114

Культура в ЬВ 15 ч ЬВ-агар 6,5x108 100 0 0 0

ТОУ§ 6,7x108 100 0 0 0

ПФ1 2 мес. ЬВ-агар 5,3x107 27,5 72,5 0 0

ТОУ8 4,6x107 7,9 46,4 10,0 12,3

ПФ2 ЬВ-агар 7,7x107 1,3 98,7 0 0

ТОУё 6,9x107 16,7 78,3 9,2 12,5

мерзлотный штамм К14

Культура в ЬВ 15 ч ЬВ-агар 1,0x108 97,8 2,3 0 0,9

ТОУё 7,0x107 98,3 0 1,2 0,5

ПФ1 2 мес. ЬВ-агар 8,8x107 23,3 66,7 0 10,0

ТОУ8 6,5хЮ7 20,1 0 72,4 7,5

9 мес. ЬВ-агар 1,7x107 0 26,2 0 73,8

ТОУ8 2,0х Ю7 15,3 0 63,8 20,9

ПФ2 2 мес. ЬВ-агар 5,6х Ю7 9,4 79,6 0 11,0

ТСУ8 5,8х Ю7 16,7 0 75,1 8,2

9 мес. ЬВ-агар 3,7х Ю7 7,2 79,4 0 13,4

ТСУё 4,9x106 14,3 0 71,9 13,8

* Диссоциация шт. Ас-1114 и К14 также изучена для ПФ в ЬВ, ПФЗ и ПФ5 разных сроков

хранения (15 ч, 5 сут, 2, 5, 7, 9, 10 мес.) при посевах на среды ЬВ-агар, ТБА, ТОУ, ТОУё.

Штаммы ВБ\У-27 и ЕКЗОА Ас. ¡\voffii характеризовались высокой колониально-морфологической стабильностью. Диссоцианты были обнаружены только у мерзлотного шт. ЕКЗОА и только при рассеве ПФ1 (2 мес.). В выросшей популяции выявили колонии 3-х морфотипов: доминантные Б^типа- 83,5%; 82 - типа - 8,7%; 8т-типа - 7,8%. Диссоцианты Бг- и 8т-типов не обладали стабильностью: после 2-3 пересевов ревертировали к доминантному Бгварианту.

Отметим, что колониально-морфологическая вариабельность артробактеров, так же как и акинетобактеров описывается впервые.

Антибиотикоустойчивые варианты. При рассеве ПФ мерзлотных штаммов на средах с ампициллином и канамицином было обнаружено, что высокую долю составляют антибиотикоустойчивые клоны. При этом, численность клонов, устойчивых к канамицину (10 и 50 мкг/мл), при посевах 10 мес. ПФ2 шт. К14 А. охус1аж была больше, чем у коллекционного шт. Ас-1114 в 350 и 4600 раз, соответственно. Это объясняется большим количеством у палеобактерий мерзлоты детерминант антибиотикоустойчивости и механизмов их горизонтального переноса \Tiedje й а1., 1994; МЫНп е1 а1., 2004; 2009; Петрова с соавт., 2007; 2012].

Свойства диссоциантов. Штаммы А. охуйат. Полученные диссоцианты обоих штаммов артробактеров различались не только типом колоний, но и биосинтетической активностью /?-галактозидазы, более высокой у клеток Б-типа (определение с хромогенным субстратом Х-§а1), а также способностью продуцировать экзополисахариды, более выраженной у М-диссоциантов (тест с рутением красным). Также диссоцианты обоих штаммов А. охуйат (в том числе доминирующих Б- и М-типов) различались стрессоустойчивостью, которая была более высокой у М-вариантов, а при сравнении штаммов - у мерзлотного изолята К14 (табл. 10). Клетки М-фенотипа были более устойчивы к тепловому шоку (50°С, 5 мин), замораживанию-оттаиванию (5 циклов), действию антибиотиков.

Таблица 10. Жизнеспособность (КОЕ/мл) и количество (%) устойчивых к термообработке и действию антибиотиков клеток диссоциантов А. oxydans шт. Ас-1114 и К14 и Ас. I\voffii шт. ЕКЗОА

Стрессорное воздействие Число КОЕ/мл (% от КОЕ до воздействия)

A. oxydans, штамм

Ас-1114, диссоциант К14, диссоциант

S M S M

До воздействия 3,3х108(100) 4,5х108 (100) 1,8хЮ8(100) 2,9x108 (100)

Прогрев 55°С, 10 мин 1,8х107 (5,5) 2,0х 108 (44,4) 6,0х107 (33,3) 1,7x108 (58,6)

Замораж.-оттаив.(х5) 2,3 xi О7 (7,0) 1,1 хЮ8 (24,4) 1,9х107(10,6) 1,5хЮ8 (51,7)

Канамицин, 10 мкг/л 5,5х 107 (16,7) 1,6x108 (36,2) 1,8ХЮ6 (1,0) 6,7x106 (2,3)

Ас. Iwoffli шт. ЕКЗОА, диссоциант

S, S2

До воздействия 4,8хЮ7 (100) 1,1х108(100)

Прогрев 55°С, 10 мин 1,6x105 (0,33) 1,6х10б (1,5)

Исследование стрессоустойчивости диссоциантов мерзлотного изолята Ас. ЫоШи полученных при рассеве ПФ (2 мес.), выявило в 4,5 раза более высокую устойчивость к прогреванию (55°С, 10 мин) у клеток 52-типа, чем Б^типа (табл. 10).

Таким образом, фенотипическая вариабельность как адаптационный потенциал вида, определяемая различиями морфологических и физиологических признаков диссоциантов, была больше выражена у мерзлотных изолятов артробактеров и акинетобактеров, чем у их коллекционных аналогов.

3.4 Протеомный анализ клеток бактерий методом МА1Л)1-ТОР МБ для индикации внутрипопуляционных диссоциантов бактерий

Так как реализация фенотипической изменчивости бактерий включает вариации состава синтезируемых ими белков [№оис1е, 2011], анализ белковых спектров диссоциантов может быть использован для их идентификации, крайне затрудненной другими методами, особенно для диссоциантов, не имеющих колониально-морфологических различий. В работе были получены МА1ЛЛ-спектры (на матрицах БА и НССА) бактерий 7 родов, в том числе изолятов из вечной мерзлоты и условных патогенов. Анализ МАЬ01-спектров вегетативных клеток диссоциантов исследуемых штаммов доминантных и минорных фенотипов включал: (1) определение сходства спектров белков как долю (%) общих пиков белков от количества всех белков, что отражает филогенетическое родство объектов и рекомендуется рядом авторов для идентификации близкородственных видов \Vargha е! а1., 2006; СгдЬпег е1 а!., 2012; Присяжная с соавт., 2012]; (2) сравнение интенсивности общих пиков и наличия специфичных пиков как детерминирующую характеристику диссоциантов. Показано, что в стандартных условиях проведения анализов в ряду род-вид-штамм-диссоциант сходство МАЬОГ-профилей увеличивается (рис. 7), что согласуется с результатами других авторов [Vagrha & а!., 2006; Присяжная с соавт., 2012].

Рисунок 7. Круги Эйлера, демонстрирующие количество общих (пересечение), а также количество и долю (%) специфичных пиков в МАЬОІ-спектрах: на матрице НССА (а) двух видов рода АгікгоЬасіег; (б) двух штаммов вида Ас. 1м>оЛГй; (в) диссоциантов С. рвеийосИрЫкегШсит шт. 090497; (г) на матрице БА диссоциантов А. охусіапх шт. К14.

Для дифференциации диссоциантов, особенно имеющих профили, обладающие высоким сходством, наиболее применимой оказалась оценка интенсивностей общих пиков. Например, МАІЛП-профили диссоциантов (Б, Я, М и Бщ) А. охуйат шт. К14 содержали 14 общих пиков (100% сходства), однако по характеру распределения интенсивности пиков эти профили различались (рис. 8). У Б-диссоцианта преобладали "легкие" белки, у М-варианта, напротив, - "тяжелые"; пептиды 8т-морфотипа занимали серединное положение, а у Я-диссоцианта - имели примерно одинаковую интенсивность. Отмечено, что диссоцианты А. охусіат шт. К14 с одинаковым морфотипом колоний (или/или Б, Я, М и 8т) при развитии на разных средах (ЬВ-агар, ТБА) имели различия в белковых профилях, что отражало различия в их физиологических свойствах. Таким образом, соответствие колониально-морфологических признаков варианта и его физиологических особенностей -необязательно, что согласуется с результатами скрининга диссоциантов Я. орасш, обладающих при одинаковой морфологии колоний разной субстратной специфичностью в разложении хлорфенолов \Solyanikova еі аі., 2011]. Для таких диссоциантов анализ их МАЬОІ-спектров является, по-видимому, единственным эффективным методом детекции.

Таким образом, применение МАЬЭЬТОР МБ анализа перспективно для дальнейшей разработки методов детекции внутрипопуляционных фенотипических вариантов и изучения внутрипопуляционной диссоциации бактерий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе была рассмотрена биологическая активность двух уникальных закрытых природных систем, различающихся как генезисом, так и условиями хранения микробиоты: мёрзлых подпочвенных отложений и погребённых подкурганных почв, и как объектов сравнения - современных фоновых почв. Показанное несоответствие численности жизнеспособных клеток гетеротрофных бактерий (по КОЕ) и учитываемых прямым счетом, подтвердило имеющиеся данные \Soina е1 а1., 2004;

Хомутова с соавт., 2004; Дмитриев с соавт., 2008] о преобладании в таких системах клеток, находящихся в покоящемся, в том числе некультивируемом состоянии. Методология разработки приемов реактивации природных покоящихся микробных сообществ была основана на необходимости учета механизмов приобретения и поддержания микроорганизмами состояния метаболического покоя, обеспечивающего их длительное выживание в неростовых условиях. Предложенные способы реактивации оказались эффективными: в образцах палеобъектов активизировалась и оказалась способной к росту значительная доля ПФ, в том числе НК (показано молекулярно-биологическими - FISH, и культуральными методами - число КОЕ, НВЧК), что важно для повышения эффективности мониторинговых исследований и изучения биоразнообразия микроорганизмов. При этом впервые продемонстрировано участие в контроле физиологического состояния микроорганизмов почвенных сообществ, в том числе реактивируемых после длительного пребывания в неростовых условиях, секретируемых микробиотой и растениями регуляторных метаболитов (АОБ, ИУК, АЗП), имеющих видонеспецифический и дозозависимый характер действия и функционирующих на уровне сообщества.

Результаты сравнительного изучения адаптационного потенциала бактериальных изолятов из образцов мёрзлых отложений и их коллекционных аналогов имеют важное значение для понимания роли механизмов выживания бактерий в резко меняющихся и неростовых условиях при их длительной консервации в вечной мерзлоте за счет отбора фенотипов с: (1) высокой стрессоустойчивостью к неблагоприятным условиям окружения, (2) интенсивным образованием и полиформизмом покоящихся анабиотических форм (ЦПК, НК, ультрамелких ПФ), (3) высокой диссоциативной активностью. Выделение изолятов бактерий с высоким адаптационным потенциалом из реактивированных длительно законсервированных микробных сообществ представляет значительный интерес для микробиологии, биотехнологии и медицины. При изучении внутрипопуляционной вариабельности бактерий показана принципиальная возможность применения для индикации диссоциантов протеомного анализа клеток методом MALDI-TOF MS, в котором оцениваются, с одной стороны, сходство белковых спектров по наличию общих и набору специфических белков (пиков), с другой - различия в содержании общих белков (интенсивностей одинаковых пиков).

Результаты исследования почвенных ферментных белков (на примере амилаз) как важной компоненты биологической активности почв выявили сохранение их каталитической активности в образцах древних почв, невысокой по сравнению с современными почвами, и возможность ее эффективной регуляции (до уровня нативной активности современных почв) путем модификации структуры ферментных белков низкомолекулярными соединениями, которые являются типичными компонентами органического вещества почвы (АК, АОБ, ГК). Показанная возможность модуляции ферментативной активности палеообъектов может играть существенную роль на этапе восстановления их биологической активности в отсутствие синтеза почвенных ферментов de novo. Таким образом, показаны сложные

регуляторные взаимодействия, в которых малые молекулы органического вещества почвы, образующиеся в результате превращений, катализируемых ферментами, контролируют активность ферментов и влияют на метаболический статус микроорганизмов, в свою очередь синтезирующих ферменты и регуляторные молекулы. В целом, проведенные исследования демонстрируют такое важное свойство организации почвенных экосистем, в том числе длительное время закрытых, как их способность к саморегуляции.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны способы реактивации клеток бактериальной гетеротрофной компоненты покоящихся микробных сообществ мёрзлых отложений и погребённых почв, позволяющие повысить численность культивируемых клеток на 1-7 порядков. Способы основаны на: (1) отмывке клеток микробных фракций от (ауто)ингибиторов роста; (2) необходимости (пред)инкубации микробных фракций со стимуляторами физиологической активности; (3) защите прорастающих клеток от окислительного стресса.

2. Выявлены отличия в отклике на процедуры реактивации клеток покоящихся сообществ мёрзлых отложений и погребённых почв, различающихся генезисом и условиями природной консервации, а также различия в результативности действия реактивирующих факторов по показателям реверсии покоящихся клеток к метаболической активности (FISH) и росту (КОЕ).

3. В образцах мёрзлых отложений, погребённых и современных почв выявлена возможность регуляции почвенной ферментативной активности (амилаз) низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы (аминокислотами, гуминовыми кислотами, алкилоксибензолами), под действием которых активность ферментов расконсервированных древних почв достигает уровня нативной активности современных почв.

4. Обнаружено, что изоляты из мерзлоты Arthrobacter oxydans и Acinetobacter hvoffii отличаются от их коллекционных аналогов более выраженным адаптационным потенциалом: (1) стрессоустойчивостью; (2) интенсивностью образования покоящихся клеток и большим разнообразием их типов (цистоподобных, некультивируемых, ультрамелких); (3) высокой внутрипопуляционной вариабельностью.

5. Для клеток диссоциантов бактерий (представителей 7 родов) показаны различия их белковых спектров, полученных методом MALDI-TOF MS, что позволяет рекомендовать этот протеомный анализ для детекции диссоциантов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Мулюкин А.Л., Демкина Е.В., Кряжевских Н.А.. Сузина Н.Е., Воробьева Л.И., Дуда В.И., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы Micrococcus luteus и Arthrobacter globiformis, не прорастающие на стандартных средах // Микробиология. 2009. Т. 78. № 4. С. 456-468.

2. Лойко Н.Г., Кряжевских Н.А., Сузина Н.Е., Демкина Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В., Козлова А.Н., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Покоящиеся формы

Sinorhizobium meliloti II Микробиология. 2011. Т. 80. № 4. С. 465-476.

3. Кряжевских H.A.. Демкина Е.В., Манучарова H.A., Соина B.C., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Реактивация покоящихся и некультивируемых форм бактерий из древних почв и мёрзлых подпочвенных отложений // Микробиология. 2012. Т. 81. № 4. С. 474-486.

4. Кряжевских H.A.. Демкина Е.В., Лойко Н.Г., Баслеров Р.В., Колганова Т.В., Манучарова H.A., Соина B.C., Гальченко В.Ф., Эль-Регистан Г.И. Сравнение адаптационного потенциала изолятов из вечномёрзлых осадочных пород Arthrobacter oxydans и Acinetobacter Iwoffii и их коллекционных аналогов // Микробиология. 2013. Т. 82. №1. С. 27-41.

5. Кряжевских H.A.. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Реактивация покоящихся форм древних бактериальных сообществ из почв и подпочвенных мёрзлых осадков // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва. 2009. С. 95.

6. Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л., Нейматов А.Л., Кряжевских H.A., Петровский A.C., Толсторожих А.Н. Структурно-пространственная организация клеток различного уровня метаболической активности // Труды X Юбилейной Международной научно-технической конференции Оптические методы исследования потоков. М.: Издательский дом МЭИ.

2009. С. 382-385.

7. Krvazhevskikh N. Different lines of approaches to increase efficiency in soil ecological microbial monitoring // The 11th Student Conference on Conservation Science Abstract Book. Cambridge. UK. 2010. P. 32.

8. Kriagevskich N.A., Demkina E.V., Soina V.S., Manucharova N.A., El-Registan G.I. Modifications of the standard methods of bacterial reactivation from permafrost // The 10th European Workshop on Astrobiology EANA'10 Abstract Book. Pushchino. Russia. 2010. P. 25-26.

9. Кряжевских H.A.. Демкина E.B., Манучарова H.A., Эль-Регистан Г.И. Реактивация бактериальных сообществ из почв и древних подпочвенных отложений // Материалы конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой». Саратов. 2010. С. 128.

10. Кряжевских H.A.. Демкина Е.В., Манучарова H.A. Реактивация биологической активности палеопочв // Материалы VI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва.

2010. С. 108-109.

11. Кряжевских H.A.. Василюк Н.В., Демкина Е.В., Мулюкин А.Л., Хасаева Ф.М., Лойко Н.Г. Изучение возможности применения метода MAILDI-TOF MS для диагностики диссоциантов бактерий // Материалы III международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». Казань. 2012. С. 165-166.

Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.б.н. Эль-Регистан Г.И.; зав. лаборатории выживаемости микроорганизмов Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН чл.-корр. Гальченко В.Ф., а также к.б.н. Демкиной Е.В., к.б.н. Лойко Н.Г., к.б.н. Козловой А.Л., д.б.н. Мулюкину А.Л., д.б.н. Николаеву Ю.А. и к.б.н. Соиной B.C. за оказанное внимание и помощь в работе; д.б.н Демкину В.А. и д.г.-м.н. Гиличинскому Д.А. за предоставление образцов погребённых почв и подпочвенных мёрзлых отложений; к.б.н. Петровой М.А. за помощь в определении бактериальных культур.

Формат 60x90/16. Заказ 1670. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кряжевских, Наталья Александровна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук

На правах рукописи

04201358030

КРЯЖЕВСКИХ НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

РЕАКТИВАЦИЯ ГЕТЕРОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ МЁРЗЛЫХ ПОДПОЧВЕННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ И ПОГРЕБЁННЫХ ПОЧВ

Специальность 03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Г.И. Эль-Регистан

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................................9

1. Криопедосфера и мерзлотные подпочвенные отложения...........................9

1.1 Компоненты криосферы Земли и численность бактерий в них.................9

1.2 Параметры окружающей среды...................................................................12

1.2.1 Температурный режим...............................................................................12

1.2.3 Фазовые состояния воды в мерзлоте........................................................14

1.2.3 Окислительно-восстановительный потенциал........................................15

1.2.4 Газы мерзлоты............................................................................................15

1.2.5 Возраст и радиация.....................................................................................15

1.3 Микробиота мерзлотных экосистем...........................................................17

1.3.1 Биоразнообразие выживающих организмов............................................17

1.3.2 Роль микробных сообществ мерзлотных экосистем в циклах С, N и 828

1.4 Ферментативная активность вечномёрзлых отложений...........................31

2. Погребённые почвы..........................................................................................34

2.1 Условия консервации и диагенез погребённых почв................................35

2.2 Микробиота погребённых подкурганных палеопочв...............................37

2.2.1 Биоразнообразие.........................................................................................38

2.2.2 Погребённые микробные сообщества - важный инструмент палеоэкологических реконструкций.................................................................42

2.3 Ферментативная активность подкурганных палеопочв............................43

2.4 Важность изучения древних микробных сообществ, законсервированных в вечномёрзлых отложениях и погребённых почвах.....43

3. Механизмы выживания бактерий в неростовых условиях......................48

3.1 Условия консервации....................................................................................48

3.2 Стрессоустойчивость микроорганизмов, обеспеченная адаптационным потенциалом............................................................................................................50

3.2.1 Альтернативные сигма-факторы..............................................................50

3.2.2 Белки теплового шока................................................................................54

3.2.3 Белки холодового шока.............................................................................54

3.2.4 Редокс контроль..........................................................................................55

3.2.5 БОБ-ответ....................................................................................................57

3.2.6 Роль микробных ауторегуляторных факторов при стрессовом воздействии..........................................................................................................58

3.3 Ультрамелкие клетки....................................................................................60

3.4 Механизмы и формы покоя..........................................................................62

3.4.1 Покоящиеся формы неспорообразующих бактерий...............................64

3.4.2 Регуляция образования ПФ ауторегуляторными факторами................65

3.4.2 Реактивация покоящихся форм.................................................................66

3.5 Диссоциативная активность микроорганизмов.........................................70

3.5.1 Генотипические модификации и фенотипическая диссоциация..........71

3.5.2 Физиолого-биохимические особенности диссоциантов........................74

3.5.3 Влияние внешних условий на процесс диссоциации.............................77

3.5.4 Фенотипическая диссоциация и состояние покоя..................................78

3.5.4 Метод MALDI-TOF MS как инструмент идентификации диссоциантов ...............................................................................................................................80

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.....................................................................84

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................84

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................96

3.1. Реактивация покоящихся и некультивируемых форм бактерий из древних погребённых почв и мёрзлых подпочвенных отложений..................................96

3.1.1 Жизнеспособность бактерий микробных сообществ в образцах мёрзлых отложений, современных и погребённых почв................................97

3.1.2 Реактивация покоящихся и некультивируемых клеток бактерий коллекционных штаммов....................................................................................99

3.1.3 Реактивация клеток аэробной гетеротрофной бактериальной компоненты микробных сообществ мёрзлых подпочвенных отложений и погребённых почв..............................................................................................105

3.1.4 Влияние микробных ауторегуляторов на физиологический статус клеток почвенных бактериальных сообществ................................................109

3.1.5 Оценка разнообразия и численности бактерий в образцах мёрзлых отложений методом FISH.................................................................................111

3.2 Регуляция ферментативной активности мёрзлых отложений, погребённых и современных почв.............................................................................................120

3.2.1 Определение нативной биологической активности палеопочв и современных фоновых почв.............................................................................121

3.2.2 Регуляция активности модельного фермента ß-амилазы.....................122

3.2.3 Регуляция амилолитической активности палеопочв............................125

3.3 Изучение адаптационного потенциала изолятов из вечномёрзлых осадочных пород...................................................................................................136

3.3.1 Идентификация мерзлотных изолятов бактерий..................................137

3.3.2 Ростовые и физиолого-биохимические характеристики изолятов из вечномёрзлых отложений Arthrobacter oxydans и Acinetobacter Iwoffii и их коллекционных аналогов..................................................................................138

3.3.3 Образование покоящихся форм изолятами из вечномёрзлых отложений Arthrobacter oxydans и Acinetobacter Iwoffii и их коллекционными аналогами...........................................................................................................142

3.3.4 Популяционная вариабельность.............................................................148

3.4 Протеомный анализ клеток бактерий методом MALDI-TOF MS для индикации внутрипопуляционных диссоциантов бактерий............................160

ЗАКЛЮЧЕНИЕ......................................................................................................175

ВЫВОДЫ................................................................................................................179

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................................180

ВВЕДЕНИЕ

Вечная мерзлота и погребённые почвы отличаются как генезисом, так и

условиями хранения микробных сообществ [Демкин, 1997; Gilichinsky et al.,

2008], что может сказываться на механизмах и формах выживания, а также на

свойствах выживших организмов. Эти механизмы должны быть связаны со

стрессоустойчивостью клеток; образованием метаболически неактивных

(анабиотических) покоящихся форм; способностью к лабильному изменению

диссоциативного спектра популяции, аккумулирующему ее адаптационный

потенциал [Loewen et al., 1994; Storz et al., 2000; Бухарин с соавт., 2005; Rando

et al., 2007; Zgur-Bertok et al., 2007]. Способность микроорганизмов переходить

в неростовых условиях в покоящееся состояние реализована полиморфизмом

покоящихся форм (ПФ), в том числе дормантных некультивируемых клеток

(НК) [Эль-Регистан с соавт., 1988; 2006; Kaprelyants et al., 1996; Мулюкин с

соавт., 2009 а]. Для природных субстратов это подтверждается расчетами

соотношений активной и суммарной микробной биомассы в палео- и

современных почвах [Хомутова с соавт., 2004], а также данными прямого

электронно-микроскопического анализа образцов вечной мерзлоты,

показавшими, что подавляющая часть бактерий находится в виде

цистоподобных покоящихся клеток (ЦПК) [8о1па е1 а1., 2004; 81шпа е1 а1., 2006; Дмитриев с соавт., 2008]. При этом популяции покоящихся клеток гетерогенны по сохранению ими пролиферативного потенциала и скорости реверсии к росту, что частично объясняет наличие образцов мерзлоты, где не выявляются колониеобразующие единицы, К(ЭЕ=0. Поэтому для реактивации труднопрорастающих покоящихся форм и некультивируемых клеток требуются специально подобранные условия.

Изучение возможных путей реактивации и свойств клеток покоящихся микробных сообществ перспективно для: 1) выявления форм и механизмов покоя; 2) теории стресса; 3) поиска новых стрессопротекторов, адаптагенов, биорегуляторов; 4) выделения новых микроорганизмов, в том числе продуцентов биологически активных веществ; 5) повышения эффективности мониторинговых исследований. Кроме того, большой интерес представляет перспектива ответить на вопрос о существовании временного предела сохранения жизнеспособности организмов. Вышеизложенное мотивирует актуальность изучения древних микробных сообществ вечной мерзлоты и подкурганных палеопочв.

Задачи исследования.

5. Оценить применимость протеомного анализа бактерий методом МАЬ01-ТОБ М8 для детекции диссоциантов.

Научная новизна. 1. Разработаны способы реактивации клеток из

длительно законсервированных микробных сообществ мёрзлых отложений и

погребённых палеопочв, учитывающие механизмы и формы метаболического

покоя (анабиоза) как основного способа выживания микроорганизмов в

неростовых условиях. Приемы реактивации включают: необходимость

пробоподготовки образцов, отмывки от (ауто)ингибиторов роста; потребность в

регуляторах физиологической активности, стрессопротекторах и факторах

межклеточной коммуникации; варьирование условий культивирования. 2.

Обнаружены отличия в чувствительности к процедурам реактивации бактерий

покоящихся сообществ мёрзлых отложений и погребённых почв, что можно

объяснить их разными генезисом и условиями природной консервации. Выявлены различия в отклике покоящихся форм на процедуры реактивации по показателям реверсии к метаболической активности (FISH) и росту (КОЕ). 3. Из образцов реактивированных микробных сообществ мёрзлых отложений выделены 16 бактериальных изолятов родов: Acinetobacter, Arthrobacter, Brevundimonas, Exiquobacterium, Paenibacillus, Promicromonospora, Pseudomonas, Rhodococcus, Sphingomonas; 8 из них определены до вида. Сравнительный анализ свойств бактерий пар сравнения - Arthrobacter oxydans шт. К14 и Acinetobacter bvoffii шт. ЕКЗОА, выделенных из мёрзлых отложений, и их коллекционных аналогов - шт. Ас-1114 и шт. BSW-27, соответственно, выявил у изолятов из мерзлоты более выраженный адаптационный потенциал: повышенную устойчивость к действию физических и биологических стрессоров; более интенсивное образование и полиморфизм покоящихся клеток (ЦПК, НК, ультрамелкие клетки с d<0,22 мкм); более выраженную фенотипическую вариабельность. 4. Предложен алгоритм анализа методом MALDI-TOF MS белковых спектров клеток бактерий, позволяющий выявлять диагностические различия на уровне внутрипопуляционных фенотипических диссоциантов, что может быть использовано для их детекции. 5. Выявлен эффект регуляции ферментативной активности (на примере амилаз) мёрзлых отложений, погребённых и современных почв низкомолекулярными соединениями органического вещества почвы (алкилоксибензолами, аминокислотами и гуминовыми кислотами), обеспечивающий достижение в расконсервированных почвах уровня ферментативной активности, характерного для нативного уровня в фоновых почвах, что может играть существенную роль на этапе восстановления биологической активности палеопочв.

повышения результативности экологического и санитарного мониторинга, а также поиска продуцентов биологически активных веществ, в том числе среди групп микроорганизмов, трудно изолируемых из природных субстратов. 2. Доказательства более выраженного у мерзлотных изолятов адаптационного потенциала являются основанием для скрининга среди них продуцентов метаболитов с адаптогенной и стрессопротекторной активностью. 3. Выявленные различия в белковых спектрах диссоциантов бактерий позволяют рекомендовать протеомный анализ MALDI-TOF MS для разработки методов индикации и отбора внутрипопуляционных вариантов бактерий в целях биотехнологии и медицины. 4. Обнаруженная возможность регуляции ферментативной почвенной активности может быть востребована в агротехнике.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009); 10-ой Юбилейной Международной научно-технической конференции «Оптические методы исследования потоков» (Москва, 2009); 11th Student Conference on Conservation Science (Cambridge, UK, 2010); 10-ой международной конференции «European Workshop on Astrobiology EANA'10» (Пущино, 2010); Всероссийской конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); VI Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010); III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012). По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них 4 статьи и 7 тезисов.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 220 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 395 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 таблицами и 19 рисунками.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Способность микроорганизмов, самых древних организмов на Земле, выживать в широком диапазоне природных условий, постоянно побуждает научное сообщество к пересмотру обозначенных ранее границ существования жизни в биосфере. Микроорганизмы способны адаптироваться и занимать все экологические ниши в условиях, на первый взгляд, абсолютно не подходящих для жизни, формируя при этом многочисленные сообщества с высоким биоразнообразием.

1. Криопедосфера и мерзлотные подпочвенные отложения

Учитывая, что 80% земной биосферы постоянно подвержены холоду, и значительная часть (больше 25%) холодных местообитаний (криосфера) связана с вечной мерзлотой, занимающей в России 60% территории [Ашзтоу е1 а1., 2006], важным и интересным является изучение адаптации микроорганизмов к низким температурам и исследование микробных сообществ вечной мерзлоты для выяснения форм и механизмов длительного выживания микроорганизмов в неростовых условиях [ОШсЫшку, 2002].

1.1 Компоненты криосферы Земли и численность бактерий в них

Земная криосфера включает два компонента, отличающихся материалом сложения: гляциосфера, состоящая из снега и льда, и криолитосфера, включающая мёрзлые грунты, которые содержат длительно (по крайней мере, два последних го�

Информация о работе

Кряжевских, Наталья Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.03

Диссертация

Реактивация гетеротрофных бактерий микробных сообществ мерзлых подпочвенных отложений и погребенных почв - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы