Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментативная активность мерзлых осадочных пород

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ферментативная активность мерзлых осадочных пород"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ни. М.В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На правах рукописи

Миньховская Наталья Евгеньевна

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕРЗЛЫХ ОСАДОЧНЫХ ПОЮД

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учеяон степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1995

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ вы. М.В. ЛОМОНОСОВА

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На прааах рукописи

Мавьховсхая Наталья Евгеньевна

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕРЗЛЫХ ОСАДОЧНЫХ ПОРОД

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации яа соиасаняе учеаоа степени кандидата бнологачесхих наук

МОСКВА- 1995

Работа выполнена на кафедре биологии почв фаиультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М.В Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Д .Г.Звягинцев Официальные оппоненты: доктор биологических наук

С.В Лстунова

кандидат биологических наух Е.М. Тульская

Ведущее учреждение - Институт почвоведения и фотосинтеза РАН

Защита состоятся рв-ст^/^ ¡995 г „ 15 час 30 ынв. в ауд.

М-2 на заседания специализированного совета К.053.05.86 МГУ им. МЛ Ломоносова.

Адрес специализированного совета: 119899, Москва, ГСП, Ленгоры, МГУ, факультет почвоведения, Учений совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан Ученый секретарь

» Зи^г^^Л 1995 г_

специализированного совета - ^ И.П. Бабьева

Актуальность работы.

Среди природных местообитаний вечная мерзлота представляет собой уникальную естественную среду, которая обеспечивает максимальную. длительность выживания микроорганизмов. Микробиологические и биохимические исследования мерзлых осадков целесообразны для решения наиболее существенных биологических проблем - длительности сохранения

жизни, проблем эволюции живых опгяпвчмо; я ттх_^¿САоЛздаоаи------

«пгягя гр-пнц биосферы в др.

Из образцов мерзлоты, отобранных в разных точках Евразии, Америки я Антарктиды, выделены различные морфологические и физиологические группы микроорганизмов, представителей около .30 родов. При этом до настоящего времени не выявлено специфических признаков метаболической адаптации клеток к длительному низкотемпературному стрессу. Прямые доказательства роста и метаболической активности клеток в мерзлоте отсутствуют.

Прн изменении климата активизация микробных сообществ мерзлоты и увеличение активно функционирующего слоя криогенных почв могут вызвать существенное изменение газового баланса атмосферы. Необходимы комплексные исследования реакции микробных экосистем на температурные изменения. Жизнеспособность комплексов микроорганизмов в естественных гетерогенных средах обитания поддерживается .благодаря активности внеклеточных иммобилизованных ферментов. Максимальная длительность сохранения бнологичесхи активных молекул в настоящий момент оценена лишь теоретически, имеются только отдельные свидетельства их высокой устойчивости. Мерзлые осадки, возраст которых составляет от 5 тыс до 5 млн лет, предоставляют уникальную возможность для исследования стабильности "почвенных" и микробных ферментов и изучения воздействия на них криогенного фактора.

Таким образом, настоящие исследования актуальны с точки зрения фундаментальных общебиологических, микробиологических, я почвенно-бнохжмичеоснх проблем.

руКот^ - определение степени сохранены ферментативной активности • мерзлых осадках, выявление особенностей активности почасных ферментов ■ биохимической активности микробных сообществ, связанных с длительным воздействием низких температур.

Псягищые •ину.дя »угттстп^и^я

1. Оценха сохранения активности различных ферментов в мерзлоте.

2. Оценка зависимости ферментативной активности от физихо-хиичеасих факторов среды в длительности воздействия низких температур.

3. Сравнительное исследование термоегабильностн ферментов в мерзлых осадочных породах ■ выявление их специфических особенностей в сопоставлении с аналогичными ферментами соврем еяных почв.

4. Изучение длительного мдии низких температур ва фнзнолого-биохимичесжувэ деятельность микроорганизмов.

Изучение динамики активизации ферментативных процессов в тающей мерзлоте и современных тундровых почвах.

Научная номячиа. Впервые достоверно установлен факт сохранения ряда гидролитических ■ ох»сиятельно-восстановительных ферментов в мерзлых осадочных породах различного возраста н генезиса. Активность ферментов мерзлых отложений в максимальных значениях сравнима с показателями современных тундровых почв района исследования, в средних значениях соответствует показателям актива ости ферментов в непромерзающих подпочвенных осадочных слоях. Сформулирован тезис о возможности более > длительного сохранения активных ферментов но сравнению с жизнеспособными клетками в условиях д лительного воздействия криогенного фактора. I

Установлена повышенная термостабидьность ннвертазы, амилазы н катализы а мерзлоте но сравнению с современными почвами.

Выявлена первичная роль внеклеточных ферментов в процессах активизации мерзлоты яри таяния, а также впервые показаны существенные различия в активизация микробных сообществ в мерзлоте н современных почвах и осадках.

Практическая ценность. Полученные даяние иогут быть использованы для оценки потенциального изменения биологической ахтиввости при потеплении климата, разработай методов хранения в истодов стабилизации иммобилизованных ферментов, а также методов криоконсервации микроорганизмов. Результаты работы могут быть полезны при выборе приоритетных биомаркеров в экзобиологическнх исследованиях.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены иа конферендии ^<>™^гт-.-г .... у.-.^ил. -.- факультет*-" ••'"Гте-.-дслги "'МГУ* "Совренеппмс проблемы почвоведеяяя я экологии" (Москва, 1994), на 111 Форуме почвоведов Россия (Пущвно,1994), а также на 30-й научной ассамблее COSPAR (Hamburg, 1994).

Публнкапрц. По теме диссертация опубликована 1 печатная работа, 3 находятся в печати.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х частей, выводов, списка литературы, включающего отечественных и иностранных работ. Работа изложена на машинописных страницах и

включает таблиц и рисунков.

ОБЪЕКТЫ и методы ИССЛЕДОВАНИЯ

Для микробиологических и биохимических исследований образцы современных тундровых почв и мерзлых осадочных пород отбирали в тундровой зоне восточного сектора Арктики (Колымская низменность), где многолетнемерзлые породы характеризуются сплошным распространением по площади и непрерывным по вертикали. Наибольшая глубина оттаивания в местах отбора образцов достигает 0,5 и в суглинистых грунтах и 0,8 и в песчаных. Среднегодовая температура пород 7-10°С, льдистость - 20-60%. Климатические условия даже в межледниковые периоды не допускали оттаивания мерзлоты и проникновения посторонних мядооорганизмов.

Исследования проводили на образцах тундровых глеевых, глееватых и торфяно-глеевых почв, а также сингенетически я эпигенетически промерзавших осадочных пород, ве таявших в течение 5 тысяч - 5 миллионов лет: голоценовых озер но-болотиых аласяых отложений (Q1V) возрастом 5-10

\

тыс лет; сяльнольдистых оэерно-аллювиальных пьшеватых супсссй к суглинков позднеолейстоценового ледового комплекса (едомная сжита) (Q111), а также позднеплейстоценовых песков (хаоарчннская свита) возрастом 15-50 тыс лет; аллювиальных песков и супесей среднешюйстоценового ледового комплекса (мастахская свита) (Q11) возрастом 200-600 тыс лет; поздвешшоцен-раинеплейстоценовых озерно-аллювиальных легких суглинков и супесей (опережая свита) (N2-Q1) возрастом 0,6-3,0 млн лет; позднешсиоцеаовых песков ( томус-яросая сайта) (N2 tj) возрастом 3,0-5,0 млн лет. Исследованные образцы мерзлых осадочных пород были получены методом сухого бурения, исключающим возможность заражения посторонней микрофлорой (Звягинцев и др., 1985), и были доставлены в лабораторию в замороженном состоянии.

Биохимические анализы проводили в только что оттаявших образцах.' Активность различных ферментов проанализирована на 60-100 образцах. Активность инвертазы я амилазы определяли методом Сомоджя-Нельсона в модификации Раськовой (1982), активность каталазы, дегядрогевазы и урсазы - по методам в модификации Галстяна (1979). Содержание в образцах органического углерода определяли методом Никитина (Практикум по агрохимии, 1989).

Влияние температуры на активность ферментов исследовали в диапазоне от 0 до 100°С. Для изучения температурной стабильности ферментов образцы выдерживали в течение 3-х часов при температурах от -18до'+180°С, а затем в них определяли остаточную активность фермента в стандартных условиях.

Результаты всех определений расчитывали на абсолютно сухую навеску образца, повторность 3-5-кратная.

Для исследования температурных характеристик ферментов, синтезируемых микроорганизмами мерзлых осадочных' пород, использовали накопительные культуры на жидких средах: а) глюкозо-пелтонной с дрожжевым экстрактом (Добровольская, Лысах, 1989); б) минеральной, среде с мочевиной: 75 мл среды (КНгРОч- 9,1 г/л, Na2HP04- 9,5 г/л, глюхоза - 5 г/л, дрожжевой экстракт - 0,1 г/л) смешивали с 10 ил 15%-ного раствора мочевины, простернлизоваяного

фильтровавшем ("Sinpor", 023 мк); в) минеральной среде с сахарозой (Методы почвенной микробиологии и биохимики, 1991). '

Для' получения жидких накопительных культур на 100 мл жидкой среды вносили 2 г почвы или мерзлого образца из внутренней области керна и инкубировали 2-3 недели на качалке. Для получения иммобилизованной биомассы алнквоту накопительной культуры вносили в стерилизованные навески почв или осадочных поплптпгптгггт.по.Еср^с^агаяя ехершплютг^--шиатеяем.

При определении численности микроорганизмов суспензию, приготовленную из центральной части образца, высевали на агаризовавные среды: мясо-пептонный агар, крахмало-аммиачный агар, сусло-агар.

Функциональную активность микроорганизмов в мерзлоте оценивали . методом гидролиза диацетата фпуоресцеина (Swisher, Carroll, 1980). Кинетику образования колоний жизнеспособными бактериями мерзлоты исследовали по методу Хатторн (Hattori, 1985).

Статистическую обработку результатов поводили на IBM PC с использованием пакета программ STATORAPHICS.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Активность гидролитических и окислитстр,дп-цосстановитслъвых ферментов в тундровых почвах и многолетнемерзлых отложениях.

Потенциальную гидролитическую_____активность мерзлых осадков

исследовали по реакциям гидролиза сахарозы (инвертаза), полясзхгрлдов (амилаза) и расщеплению амидов (уреаза).

Определение ннвертазной активности мерзлых пород различного возраста и генезиса показало наличие значимого уровня активности в 95% исследованных образцов, частота обнаружения активного фермента в образцах не зависит от возраста отложений (табл. 1). Например, во всех семя исследованных образцах наиболее древних томус-ярских отложений, возрастом 3-5 млн лет, была обнаружена активность нивертазы, при этом ее уровень был сравнительно высок. В целом активность нивертазы в мерзлоте-варьирует в пределах от 0,04 до 0,39 иг глюкозы на 1 г породы в час ) (табл. 3), что в максимальных

Таблица 1. Вероятность обнаружения ферментов в образцах мерзлых осадочных пород различного возраста

Иквертаза Амилаза Каталаза Дегипрогеназа Уреаза

Воз- Коли- Об- Час- Коли- Об- Час- Коли- Об- Час- Коли- Об- Час- Коли- Об- Час-

раст чест- щее тип чест- щее тот» чест- щее тона чест- щее тща чество щее тота

отложе- во коли- обна- во коли- обна- во коли- обяа- во коли- обна- актив- коли- обна-

ний испо- чест- руже- актив- чест- руже- актив- чест- р»же- актив- чест- руже- ных чест- руже-

ных во ния ных во ния (а ных во ни« ных во ния образ- во ния

образ- образ- (в%) образ- образ- %) образ- образ- (»"/■) образ- образ- (в%) цов образ- (в%)

цов цов цов цов цов цов цов цов цов

5-10 15 15 100 18 18 100 17 17 100 16 17 94 0 16 0

тыелет

15-50 16 16 100 8 8 100 6 14 43 7 16 44 0 14 0

тыс лет

0,6-1,8 10 10 100 10 10 100 9 9 100 7 9 78 0 9 0

нян лег

1,8-3,0 11 II 100 4 8 50 5 12 42 2 10 20 0 12 0

или лег

3,0-4,0 7 7 100 2 5 40 2 5 40 3 7 43 0 5 0

пли лет

Таблица 2. Оценка зависимости ферментативной активности от физико-химических свойств мерзлых осадочных

пород.

Содержание фракции

%с >0,001 >0,01 С»2+ N8 + А1201 Ре20.1

ИНВЕРГАЗА 0,14* 0,23 0,04 0,44 0,05 -0,44 -0,59 0.46

(72)** (28) (25) (3«) (36) (36) (29) (19)

0,22*** 0,24 0,85 0,01 0,78 0,01 0,02 0,05

АМИЛАЗА 0,47 0,41 0,50 0,67 0,23 -0,51 -о.и -0,19

(43) (16) (16) (21) (21) (21) (16) (16)

0,14 0.11 0,05 0,01 0,31 0,02 0,68 0,47

КАТАЛАЗА 0,52 0,09 0,03 0,59 0,04 -0.06 -0,31 0,27

(76) (26) (23) (34) (34) (34) (28) (18)

0,00 0,67 0,88 0,01 0,79 0,73 0,11 0,29

ДВГИДРОГЕНАЗА 0,15 0,42 0,08 0,39 0,02 -0,21 -0,38 0.25

(65) (19) (16) (29) (29) ап (22) (16)

0,22 0,07 0,78 0.03 0,89 0,26 0,08 0,35

• - Коэффициент корреляция ** - Количество образцов »•• - Уровень значимости

Таблица 3. Средняя ферментативная активность мерзлых осадочных пород различного воздета н генезиса.

1 I Лсгвпгют

Отло- Воз- Коли- Интер- Средняя Коли- Интер- Средняя Коли- Инну- Сред* 4 Коли- Интер- Средняя

жения раст чест- вал вели- чество вал величина чест- вал няя ', чест- вал веяичи-

во актив- чина иссле- актив- актив- , во актив- веяич» во ахгиг- на актив-

иссле- ности актив- дован- ности ности иссле- ности на - ¡3 иссле- носги ности

дован- (иг ности ных нг (ыкг дован- (ил актив- t дован- (иг (ыг

ных ЩЮКО- (иг. образ- маль- мальто- ных ОУ1 г носта ' ных ТФФ/ ТФФ/

образ- зы глюкозы цов тозы зы образ- в ини) (ил >' образ- 10 г за 10 г за 24

цов /1гв /1 г в /1 г за /1 г за цов oyim; цов 24 ч) ч)

час) час)- 21час) 21 час) НИИ)

1 5-10 15 0.18- 0.32± 18 0.14- 0.32t 17 0-260 0.70= 17 0-59.5 12.4± 6.3

.тыс лег 0.60 - 0.06 1.81 0.21 0.30

2 15-50 16 0.04- 0.09± 8 0.13- 0.19± 14 0-0.44 O.Iii 16 0-34.5 9.1± 1.7

тыс лег 0.43 0.04 0.33 0.05 0.07

3 15-50 6 0.04- 0.06± 7 0-0.13 0.09t 0 . - 0 ; - -

тыс лег 0.11 0.03 0.04

( 4 до 150 , 9 0.01- 0.06± 0 - - 10 0-2.90 0.60± ¡5 0-0.9 0.2± 0.1

тыс лег 0.12 0.03 0.50

5 200-600 4 О.ЗО- 0,39± 0 - - 4 0.50- I.I5± о -

тыс лет 0.52 0.17 2.00 0.70

6 0.6-1.8 10 0.04- 0.05± 10 0-0.27 0.15± 9 0-2.90 0.701 9 0-36.2 3.7± 3.0

или лег 0.09 0.02 0.04 0.20

6 1.8-3.0 11 0.09- 0.11±0.03 8 0-0.12 0.05± 12 0-0.9 0.401 1 Ю' 0-12.3 1.2t 0.3

или лет 0.22 1 0.01 0.10 * ■

7 3.0-5.0 7 0.05- 0.09± 5 0-0.21 0.04± 5 0-0.50 0.16± ' 7 0-0.4 0.2t 0.1

или лег 0.19 0.05 0.02 0.10 «

8 ? 11 0-0.12 0.04± 0 - - 11 0-1.70 0.20± ? о ^ - -

0.03 0.15 1, :

1) Голоцемовые озерно-болотные аласные отложения 1 .

2) Сшхьиольдистые озерно-атповнальные пылеватые супеси и суглинки позднеллейстоценового ледового кс«;'хэсса (едоынал свита).

3) Позднеплейсгоценоаые пески (халарчинекая евнта) ' ,] '

4) Морские отложения. 1

5) Аллювиальные песка н супеси среднеплейсгоценового ледового хонплсхса (ыасгахская свята). '

6) Позднеплноцен-раниеплейсгоцеиовые от ер но-аллювналъные легкие супеси и суглинки (олерская свита). 1

7) Поздиеплновеновые пески (тоиус-ярасая сайта).

8) Континентальные осадки. I '

значениях (осадки возрастом S-10 и 200-600 тыс дет) сопоставимо с активностью оргаво-минерадьиых горизонтов современных тундровых почв района исследования1 (рис.1 А) или, например, дерново-подаолистых почв (Раськова, 1981). 6 среднем активность этого фермента в мерзлых осадках соответствует уровню активности непромерзающих подпочвенных осадочных слоев, т.е. примерно на порядок ниже активности органических горизонтов современных почв.

Иивертазная активность мерзлых отложений не зависела от времени )фиогенеза. Статистический анализ коррелятивных связей показателей активности с физико-химическими свойствами образцов мерзлоты выявил слабую положительную связь активности фермента с содержанием Fc203 и обменного Са2+, а также отрицательную - с содержанием AljO; и Na+ (табл. 2). В некоторых скважинах отмечена- достоверная связь (г=0,87-0,88) активности с содержанием органического углерода в рН (скважина 7/92, 10-40 тыедет, г=0,95; скважина 15/91,1,8-5,0 млн лет, г=0,77).

Активность амилазы обнаружена в 87% исследованных образцов (табл. 1). Активными были все образцы возрастом до 2 млн лет, в более древних породах встречаемость амилазы снижается до 40-50%. Максимальная активность фермента отмечена в аяасных отложениях (5-10 тыс лет). Активность в этих осадках достигала значений 1.8 мг мальтозы на 1г породы, что было выше средней величины активности исследованных вышележащих тундровых почв (табл. 3). однако, в среднем активность была заметно меньше, чем в почвах. С увеличением возраста осадков, а, следовательно, длительности воздействия низких температур амилолитическая активность имела тенденцию снижения (рис. 1Б). Численность жизнеспособных анилолитических микроорганизмов, выявляемых посевом ва крахмало-аммиачный агар не коррелировало с активностью амилазы. Обнаружена слабая положительная корреляция активности амилазы с содержанием в образцах органического углерода,

1 В тундровых гясстых, гяееаатых и торфяно-глсеяьгс почвах Колымской низменности активность инвертазы варьировала от 0,1 мг глюкозы ва 1 г порош в час в минеральных горизонтах (G, Bg) до 0,5 мг пнзкозы на 1 г пор оды в час в органических и органо-минеральных горизонтах (Аперегн-торф, Ад).

А Б

123456789 123456789

Рисунок 1. Средняя активность инвертазы (А), амилазы (Б), катал азы (В) и дегидрогеназы (Г) в образцах тундровых почв (1) и'мерзлых осадочных пород разного возраста: 5-10 тыс лег (2), 15-50 тыс лет (3,4), до 150 тыс лет (5), 200-600 тыс лет (6), 0.6-1.8 млн лет (7), 1.8-3.0 ылн лег (S), 3.0:5.0 млн лет (9).

фражцвн >0,01 ми, обменного кальция в отрицательная - с содержанием обменного натрия (табл. 2). В ряде случаев (скважина 4/90, 5-10 тыс лет) отиечалась достоверная связь показателей активности и ветчины pH (г=0,79) или содержания окислов алюминия и железа (г=0,75-0,85)

Активность уреазы не обнаружена ни в одной из исследованных вами 60 образцов (табл. 1). Это может быть следствием высокой концентрации иона аммония в мерзлых осадках и, соответственно, торможением ферментативной реакции, однако, возможна н полная инактивация фермента в процессе длительного "хранения" в мерзлоте. В современных тундровых почвах, исследованных в эксперименте, не отмечено столь существенного накопления аммония и фиксировалось ферментативное разложение мочевины. Охнаштельно-восстановительные процессы в мерзлоте исследовали по ферментативному разложению перекиси водорода и дегидрогеназной активности.

В 63% образцов обнаружена активность каталаэы (табл. 1). Необходимо отметить довольно низкий уровень активности фермента практически во всех исследованных образцах. Наиболее высокая активность (1,15 мл Oj/r в мин) обнаружена в осадках среднеплейстоценового ледового комплекса, возрастом 200-600 тыс лет (рис. 1В). Как уровень активности фермента, так н частота его обнаружения не зависели от возраста мерзлоты.

Анализ коррелятивных связей активности фермента с физико-химическими факторами среды выявил слабую положительную связь активности каталазы с содержанием органического углерода и обменного Са2+ (табл. 2). В отдельных скважинах (осадки возрастом S-10 тыс лет, скважина 4/90 и 15-50 тыс лет, скважина 7/92) скорость реакции ферментативного разложения перекиси водорода положительно коррелировала с содержанием обменных Са2+ и Mg2+. В морских отложениях (скважина 4/91) отмечена достоверная положительная связь между активностью каталазы и численностью жизнеспособных бактерий. Однако, в большинстве случаев не проявилось достоверной зависимости активности каталазы от содержания органического углерода и других физико-химических факторов среды. В некоторых осадках

процесс разложения перекиси в значительной степени (до 60%) осуществлялся за счет абиотической активности. В ряде случаев эта химическая активность обеспечивалась повышенным содержанием соединений железа, в других образцах существенную роль играли иные химические компоненты среды.

Частота обнаружения дегидрогеназы в среднем ниже, чем других исследованных ферментов (57%). В молодых мерзлых отложениях отмечен высокий процент обнаружения дегидрогеназы. в ммпттлт»; --гг--—12 т*"? ггг снижается бояеечез ядгС'С. Следует отметить, что по

раяеее полученным данным (Звягинцев в др., 1990) частота обнаружения жизнеспособных микроорганизмов в мерзлых осадочных породах падает с увеличением возраста пород, н в осадках возрастом 1-3 млн лет в среднем составляет 50% . В толще осадков возрастом (-3 млн лет можно выделить 2 слоя (возрастом 0,6-1,8 н 1,8-3,0 млн лет), существенно различные по частоте обнаружения дегидрогеназной активности (также как и активности каталазы). Среди проанализированных причин можно назвать лишь значительно более высокое содержание органического углерода в более древних мерзлых отложениях. Таким образом, частота обнаружения активности дегидрогеназы в образцах коррелирует с вероятностью обнаружения в них микробных клеток, что соответствует известным представлениям о внутриклеточной природе дегидрогеназной активности. Показатели активности фермента сильно варьируют по глубине скважин, в молодых осадках достигая весьма, высоких величин п<э сравнению с современнными почвами (60 мг ТФФ на 1 г скважина 4/50, 7-10 тыс лет). Активность дегидрогеназы практически отсутствует в морских осадках, что, по-видимому связано-с их химическим составом, и, прежде всего, с высоким содержанием натрия. Очень небольшая активность фермента (0,9 мг ТФФ\г породы) обнаружена лишь в одном образце, отличающемся высоким (4,36%) содержанием органического углерода и большой (5х108 кл\г породы) численностью жизнеспособных микроорганизмов (МПА). В отдельных скважинах (15/91, 1,8-5,0 млн лет) прослеживалась положительная корреляция активности дегидрогеназы с ' содержанием органического углерода (г=0,91) и отрицательная (г=-0,78) с рН водной

вытяжки. Однако связь между активностью дегидрогеназы в образцах разного возраста н генезиса и всеми исследованными физико-хямнчесзсими факторами среды обнаружена не была.

Среди исследованных образцов мерзлых отложений различного возраста и генезиса но ферментативной активности выделяются молодые осадки, показатели активности в которых близки к показателям современных тундровых почв. В мерзлых осадках возрастом более 10 тыс лет активность всех исследованных ферментов -ниже. Среди изученных мерзлых отложений можно выделять 2 специфические по ферментативной активности группы. Осадки мастахской свиты (возраст 200-600 тыс лет) характеризуются повышенной активностью инвертазы н каталазы. Причиной, по-видимому, является повышенное содержание органического углерода. Для другой группы отложений - морских осадков - характерна низкая ферментативная активность при высоком содержании микроорганизмов. Это вероятно можно объяснить неблагоприятным влиянием высокого содержания натрия на активность внеклеточных иммобилизованных ферментов(Галстян,1978). Хотя валовый статистический анализ зависимости ферментативных показателей от физических и химических свойств мерзлых осадков не выявил четких корреляций, следует отметить, что отложения с заметно более высоким содержанием органического углерода проявляют в среднем более высокую активность, равно как суглинистые осадки более активны по сравнению с песчаными.

Из исследованных ферментов амилаза и особенно инвертаза проявили очень высокую устойчивость к воздействию времени н низкотемпературного фактора. Активность амилазы обнаруживается повсеместно до 2 млн лет, а инвертазы - до 5 млн лет. Тогда как активность уреазы в мерзлоте не обнаруживается. Окислительно-восстановительные ферменты тоже сохраняются в мерзлых осадках. В наиболее .древних породах вероятность обнаружения активности этих ферментов примерно такая же. как и вероятность обнаружения жизнеспособных клеток.

Тага и образок, в осадках, подвергшихся длительному воздействию низкотемпературного фактора, достоверно обнаружена активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов, уровень которой на порядок ниже средних показателей ферментативной активности почв, а в максимальных значениях достигает величин активности почвенных ферментов. Во многих случаях обнаруживается активность ферментов' в

образцах, не содержащих жизнеспособных imerrnv -——_____.

-i I i ..>>•' ирсшможення, отп -rr.—"—!; ^.i^üUiiCb когут /v1"'-"-

сохраняться при длительном воздействии низкотенперзтурпого фактора по сравнению с жизнеспособными клетками микроорганизмов.

Тенпературные характеристики ферментов тундровых почв н нерзлых осадочных пород различного возраста и генезиса.

С целью выявления специфических особенностей ферментов нерзлых осадков были исследованы их температурные, характеристики в сравнения с — аналогичными показателями современных тундровых почв. На рис. 2 представлены интегральные кривые, полученные наложением серий аналогичных кривых для осадков разного возраста и генезиса и для разных образцов тундровых почв.

Температурный оптимум инвертазы в современных тундровых почвах (рис.

2А) несколько ниже по сравнепню с известными показателями температурных

оптимумов этого фермента для других зональных почв (Галстяп, ,1974; .

Воробьева, Гвнниашвили, 1990). Характер температурных кривых инвертазы

мерзлых осадочных пород различного возраста и генезиса существенно

отличен от почвенных. Температурный максимум фермента лежит в области "

очень высоких температур (70-80°), прячем при 100°С сохраняется до 80% t,

максимальной активности.

Каталаза в исследованных тундровых почвах имела температурный оптимум около 40°С, а при 80° полностью анактипировалась. В мерзлых осадках происходило постепенное нарастание активности каталазы вплоть до 90°С (рис. 2Б). В интервале температур от 10 до 30°С в образцах разного

I

20 40 60 № 100

40 60 Температура, С

Рисунок 2. Влияние тенперапуры на активность ферментов инвертазы (А), каталазы (Б) и уреазы (В) в образцах тундровых почв (1) и мерзлых осадочных пород различного возраста и генезиса (2).

возраст« ■ генезиса каталазная активность нарастала с одинаковой скоростью, орд более высоких температурах проявлялись различия (рнс. ЗА).

В области высоких температур (80-90°С) наибольшую активность проявляли самые древние осадки (0,6-1,8 млн лет). Минимальная активность каталазы во всем интервале температур отмечается для песчаных осадков неопределенного возраста. Вероятно можно говорить о большей устойчивости к высоким температурам каталазы в осадках более древнего возраста, однако

•ЧИ-

сбрпзцоз НС ьцзадястса.

А

I Я

|в

О

яаяног возраст* шпготт

Б

140

120

жч

«Л

60 ' \ \

<0 Ч'Ч2

20

■-0- —

100"

-100

100

гыР

Рисунок 3. Влияние температуры на активность (А) н температурная стабильность (Б) каталазы в образцах мерзлых осадочных пород возрастом: 510 тыс лет 2(1), 0,6-1,8 млн лет (2), неизвестного возраста (3); стерильный образец возрастом 5-10 тыс лет(4). (За 100% принята исходная активность ферментов при стандартной температуре ее определения).

Контролем абиотической активности при определения хаталазной

гггпвпоста служили дважды автокяавированвые образцы. Прн высоких температурах (70-80°С) абиотическая активность составляла 60-70% от общей каталитической активности, а ее зависимость от температуры имена линейный характер, что характерно для нефермеятативного катализа.

Зависимость активности уреазы от температуры в мерзлых осадках различного возраста и генезиса исследовали после длительного (в течение 2-х недель) выдерживания образцов при комнатной температуре для активизации

2На рисунке представлено изменение активности калатиы в образцах мерзлоты разного возраста (6а нефермеятатявной активности).

микробного сообщества, поскольку в натнвных мерзлых отложениях активность уреазы не проявлялась. Максимум активности фермента как доя тундровых почв, так и для осадочных пород приходится на 40°С. При дальнейшей повышения температуры фермент быстро инакгнвнровался, активность его исчезала при 30°, т.е. синтезированный de novo после оттаивания образцов фермент обладает слабой температурной устойчивостью. В тундровых почвах уреаза ннактивировалась при 70s, что .по-видимому обеспечивается за счет внеклеточной иммобилизованной уреазы.

Таким образом, из исследованных ферментов иивертаза н хаталаза проявили повышенный температурный оптимум по сравнению с почвенным ферментом, что может свидетельствовать о возрастании стабильности этих ферментов в длительно мерзлых осадках, в то время как устойчивость уреазы в мерзлоте очевидно ниже, чем в почвах.

Для оценки термостабильности ферментов образцы почв и мерзлых пород прогревали в течение 3-х часов при разных температурах. На рисунке 4 представлены интегральные кривые для мерзлых пород различного возраста и генезиса, а также для разных образцов тундровых почв. Исследование показало, что в мерзлоте остаточная активность инвертазы, амилазы в каталазы выше, чем в почве практически во всем диапазоне температур от 18 до +180°С. По мере увеличения температуры нагревания происходит снижение ^статочной активности фермента. Необходимо отметить, что более высокую стабильность в области высоких температур проявляли образцы более древнего возраста.что можно наиболее четко проследить на примере каталазы (рисЛБ), во отмечено для всех ферментов

Возникает вопрос, чем обеспечивается изменение температурных характеристик исследованных ферментов, свойствами ферментов синтезируемых de novo микроорганизмами или изменением стабильности иммобилизованных ферментов в мерзлоте под влиянием длительного воздействия низких температур. Поскольку невозможно раздельно оценить непосредственно в естественных образцах составляющие ферментативной активности, были исследованы температурные характеристики микробных

Температура прогревания,°С

Рисунок 4. Стабильность инвертазы (А), амилазы (Б) и каталазы (В) посте прогревания в течение 3-х часов в образцах современных тундровых почв (1) и мерзлых осадочных пород различного возраста (2).

иввертаз ■ уреаз в накопительных культурах на жидких средах, содержащих сахарозу в качестве единственного источника углерода (иивертаза) и мочевину в качестве единственного источника азота (уреаза) из мерзлых осадочных пород я тундровой почвы, а тахже после иммобилизации накопительных культур микроорганизмов в стерильных образцах соответственно осадочных пород или почв, поскольку известно, что процессы иммобилизации могут существенно влиять как на физиолого-биохимичесжую активность микробных клеток, так и на активность ферментов. Сообщества, выделенные на средах из мерзлоты были бактернальнымя. ограннченнымн по разнообразию. В среде с сахарозой преобладали бациллы и коринеподобные бактерии, в среде с мочевиной - неспоровые грампояожитедьные и грамотрицательные, бактерии. Следует отметить, что уровень' инвертазной активности повышался при иммобилизации накопительных культур в почве а осадочных, породах, но на характер температурных кривых процессы иммобилизации не влияли (рис.5).

А Б

Рисунок 5. Влияние температуры на активность иивертазы накопительной культуры (1) и культуры, иммобилизованной в стерильном образце (2), выделенной из тундровой почвы (А) и мерзлых осадочных пород различного возраста (В).(За 100% принята активность ферментов при стандартной температуре ее определения).

В накопительной культуре из мерзлоты температурный оптимум активности иивертазы был более выражен, чем в культуре из почвы и сдвинут в область более высоких температур. В почвенной культуре до. 40° активность удерживалась на постоянном уровне, затем начиналась инактивация, и при 70° фермент был неактивен. В накопительной культуре из мерзлоты наибольшая активность отмечена при температуре от 40 до 60°, затем иивертаза

постепенно теряла активность, но даже при 100° оставалось до 25% активности в жидкон накопительной культуре н до 40% в иммобилизованной.

Жидкие накопительные культуры из почвы н мерзлоты на среде с мочевиной не различались по температурным характеристикам (рис.6) (оптимум при 30°, полная инактивация при 50°). Однако после иммобилизации культуры из почвы температурный,оптвнум уреазы сдвигался в область более" высоких температур, а в варианте из медаллтн -

омйать- более яжж>» тснперахураого оптимума уреазы а

накопительных культурах (как в жидкой, так н иммобилизованной) по сравнению с почвенной уреазой и уреазой мерзлых осадков (после активизации). Т. е. и почва, н осадки предохраняют микробный фермент от инахтивацни, однако уреаза микроорганизмов нз мерзлоты обнаруживает большую термолабильность по сравнение с микробным ферментом почв. Это может быть одной нз причин отсутствия активности уреазы в мерзлых осадках, тогда как в почвах этот фермент постоянно присутствует.

А Б

Рисунок 6. Влияние температуры на активность уреазы накопительной культуры (1)и культуры, »(мобилизованной в стерильном образце (2), выделенной из тундровой почвы (Л) н мерзлых осадочных пород различного возраста (Б). (За 100% принята активность ферментов при стандартной температуре ее определения). .

Таким образом, мы можем констатировать повышенную стабильность ннаертази, амилазы и каталазы в мерзлых осадочных породах, которая обеспечивается как свойствами ферментов, синтезируемых де пою нихробпыми клетками, так я высокой степенью стабилизации внеклеточных ферментов в полиднсперсвой среде осадочных пород при длительном

воздействии низких температур. С другой стороны в мерзлых осадках мы не обнаруживаем исходной активности уреазы, что очевидно сказано с понижением термостабильности фермента, синтезируемого микроорганизмами в мерзлых осадках н инактивацией либо подавлением активности уреазы, аккумулированной вне клеток. Известно, что - повышенная устойчивость почвенных ферментов х воздействию температуры обычно коррелирует с их устойчивостью к другим инактивирующим факторам: высушиванию, протеолизу и др., что обычно объясняют иммобилизованным состоянием ферментов, образованием стабильных модификаций белковых молекул, таким образом возрастание термостабильности ферментов в длительно мерзлых осадках свидетельствует об общей стабилизации молекул ферментов к неблагоприятным условиям.

' Динамика активизации феррертдв и и?м?нснрс численности микроорганизмов в процессах первичного таяния мерзлых осалхов.

Активизацию ферментов исследовали в процессе размораживания образцов при 4° я 20°.

Анализ кривых активизации иивертазы и уреазы (рис. 7,8) позволяет отметить наличие резких флуктуаций активности ферментов в первые часы после оттаивания образцов, что, по-видимому связано с изменением активности внеклеточных аккумулированных ферментов под влиянием фазовых переходов в системе лед-вода, а также процессов адсорбции-десорбции. Дальнейшее нарастание активности ферментов идет параллельно нарастанию числа клеток (рис. 9), т.е. последующее увеличение активности происходит за счет новых поступлений микробного фермента в внешнюю среду.

В почве система быстро стабилизируется и активность возвращается х исходному уровню. В мерзлоте продолжается интенсивное размножение кпетох, активность ферментов либо увеличивается, либо стабилизируется на уровне, заметно превышающем исходный. При 20° происходит быстрое насыщение уровня активности несмотря на продолжающийся рост клеток,

с

А

Б

Время, ч

Рисунок 7. Изменение активности нивёртазы тундровых почв (1) и мерзлых осадочных пород различного возраста и генезиса (2) в процессе оттаивания при температурах: +20°С (А) и +4°С (Б).

Следует отметить, что при 4° не происходит синтеза новой микробной уреазы ни 1 почве, ни в мерзлоте.

Функциональную активность микроорганизмов в мерзлоте оценявали методом гидролиза диацетата флуоресценна. В всходиых образцах получены -предельно вязкие величины индекса обилия функционально активной биомассы, менее 5 нМ флуоресцеина/мл. Это означает, что, несмотря на высокие показатели численности бактерий в нерзлых осадках, они находятся в состоянии глубокого покоя. Признаки появлеаия активности регистрируются только через 8 часов после размораживания.

А

Б

Время, ч

Рисунок 8.Изменение активности уреазы тундровых почв (1) н мерзлых осадочных пород различного возраста я генезиса (2) в процессе оттаивания при температуре: +20°С (А) я +4°С (Б).

О 50 100 150 100

Время, ч

Рисунок 9. Изменение численности жизнеспособных микроорганизмов (МПА) в процессе таяния образцов тундровой почвы (1) и мерзлых осадочных пород (2) при + 20°С (а) и+4«С (б).

Авалю расписання появления колоний по ноделн Хаттори (На^п, 1985) обнаружил закономерности, отличающиеся от имеющихся в литературе данных для разных почв, грунтов или рнзсферы растений. В тающих мерзлых осадках учитывалась однородная группа с выраженной К-стратегней, пролонгированным показателем времени появления колоний (1^=40-50 час) н парадоксально высокими показателями вероятности размнорження X (0,10-0,15

0 512СиЗй2^£иним1 В естественно«-

среде. Учитывая наличие высокой численности микроорганизмов в мерзлых образцах, отсутствие признаков функциональной активности в ФДА-тесте н, вместе с тем, высокие значения Я. можно предположить для обсуждения две модели: 1) осадки промерзали очень быстро в в момент промораживания в системе имелось достаточное холшчоство органического вещества, доступного К-стратегам; 2) в покоящихся клетках, находящихся в состоянии криоконсервации, происходят существенные адаптивные метаболические перестройки, обеспечивающие интенсивные репарационные процессы и быстрый переход к активному состоянию. Учитывая данные по возрастанию термостабильности микробных ферментов, а также известные данные (УогоЫоуа, Зоша, 1994) о более быстрой активизации РНК-синтеза в тающей мерзлоте по сравнению с почвой, второе предположение представляется более обоснованным.

ВЫВОДЫ:

1. Впервые на статистически достоверном материале доказано повсеместное проявление активности гидролитических и окислительно-восстановительных ферментов в длительно мерзлых осадочных породах различного генезиса возрастом от 5 тыс до 5 нлн лет. Уровень активности в средних значениях на порядок ниже, чем в современных почвах средиеобогащенных ферментами, максимальные показатели достигают уровня ферментативной активности почв. Активность иивертазы обнаружена в 95% исследованных образцов,

амилазы- в 87%, жаталаэы - в 63%, дегндрогеаазы - а 57%. Активность уреазы в мерзлых осадочных породах не проявляется.

2. Результаты исследования позволяют сформулировать тезис о возможности более длительного сохранения активных ферментов в мерзлых осадках по сравнению с жизнеспособными клетками микроорганизмов.

3. Уровень энзиматическоЙ активности не зависит от возраста и генезиса осадков, однако из исследованных ферментов лишь иивертаза обнаруживается практически во всех образцах, независимо от длительности воздействия низких температур. Частота обнаружения активности амилазы, жатадазы и дегидрогеназы снижается более чем вдвое при возрасте мерзлоты более 2 млн лет. Сохранение активности ферментов является результатом комбинации физико-химических свойств осадков, среди которых доминируют содержание органического вещества и гранулометрический состав.

4. При длительном воздействии криогенного фахтора возрастает термостабильность инвертазы, амилазы а катадазы, что является показателем общей стабилизации этих ферментов в мерзлоте. Напротив, термическая неустойчивость является одной из существенных причин полного отсутствия активности уреазы в мерзлоте и показателем снижения ее стабильности в условиях криогенеза.

5. Инвертазы и каталазы микроорганизмов, выделенных из мерзлых осадочных пород, также обладают повышенной термостабильностью, что косвенно свидетельствует о внутриклеточных процессах адаптации к длнтельному низкотемпературному стрессу.

6. Быстрый и интенсивный рост ферментативной активности при таянии мерзлых осадков свидетельствует о сохранении в них механизмов активизации микробных сообществ и отсутствии механизмов регулирования, приводящих систему в равновесное сотояние.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Специфические особенности ферментативной - активности мерзлых осадочных пород. В сб.: Современные проблемы почвоведения н зхологнн. Тез. дохл, конференции молодых ученых факультета почвоведения МГУ. Мосэсва, 1994.

2. Активность гидролитических н окислительно-восстановительных ферментов в мерзлых осадочных породах, (в соатт. п Р.А it ri-i..«™«——

1995, з нгак.

3. Стабилизация фернентов в мерзлоте (в соавт. с ЕА.Воробьсвой, Я.Ю.Зельцер). Почвоведение, I99S, в печати.

4. Viable microorganisms is permafrost: theories and models on the cell biology on planets and space bodies of cryogenic type. ( в соавт. с ДА.Гиличинскин, ЕАЛоробьевой). Adv. Space Research, 1995, m press.