Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах

Демкина, Елена Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах"

На правах рукописи

\ I ( I

ДЕМКИНА Елена Витальевна

ВЫЖИВАНИЕ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ВЕЧНОМЕРЗЛЫХ ОСАДОЧНЫХ ПОРОДАХ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре биология почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор ДТ.Звягинцев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.И.Никитан кандидат биологических наук Л.М.Барышникова

Ведущее учреждение: Московская сельскохозяйственная

академия им. КАЛГимирязева

Защита диссертации состоится /г&сЛ^^ 2004 г. в 15 ч. 30 мин. в аудитории М-2 на заседании диссертационного совета К501.001.05 в МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, факультет почвоведения

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке на факультете почвоведения МГУ.

Автореферат разослан г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании диссертационного совета по микробиологии и агрохимии в МГУ им. М.В.Ломоносова или прислать отзыв на автореферат в двух экземплярах, заверенный печатью, по адресу: 119992 Москва, ГСП-2, Ленинские горы, МГУ, факультет почвоведения

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Л.М.Полянская

2 oos^M

I 6 52/2.

Актуальность работы. Высокая степень сохранения жизнеспособности микробных сообществ в вечномерзлых осадках Арктики и Антарктиды позволяет рассматривать мерзлые толщи как естественную среду, где микроорганизмы, прежде всего бактерии, доминирующие в количественном отношении, реализуют потенциальные возможности устойчивости к продолжительному воздействию холода (Zvyagintsev, 1985). В мерзлых осадках химические и физические свойства органоминеральных комплексов существенно зависят от образования льда, который составляет 92-97% от общего объема водной фазы и обеспечивает условия системы, исключающей фильтрацию воды, а также создает стабильные условия низкотемпературного воздействия на микроорганизмы в естественной среде обитания (Vorobyova et al., 1997; Gffichinsky, 2001).

Проведенные исследования арктических и антарктических мерзлых осадков показали, что среди сохранивших жизнеспособность бактерий преобладают неспорообразующие психротрофные формы (Soina, Vorobyova, 1994; Vorobyova et al., 1996, 1997; Demkina, 1997; Gffichinsky, 2001), менее чувствительные к повышению температуры, чем строгие психрофилы, что коррелирует со сравнительно быстрым восстановлением их активности после оттаивания мерзлых пород. Большой интерес вызывает механизм переживания бактерий в условиях стабильных отрицательных температур. Образование специализированных покоящихся клеток - спор или цист - в естественном цикле развития культур известно для ограниченного числа родов бактерий. Это согласуется с наблюдениями бактерий в мерзлых осадках in situ в просвечивающем электронном микроскопе, где редко выявлялись типичные споры или цисты, но были широко представлены коринеформные бактерии, что подтверждается результатами высевов на твердые питательные среды (Soina et al., 1995). Вместе с тем, наблюдаемые in situ клетки бактерий в просвечивающем электронном микроскопе (Soina et al., 1995; Soina et al., 1998) по своему строению - утолщенным клеточным стенкам, внешним капсулярным слоям, неоднородной плотности цитоплазмы - могли быть отнесены к покоящимся формам, отличным от вегетативных клеток и похожих на цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК) (Дуда и др., 1982). Такие клетки были получены в лабораторных условиях при модификации условий культивирования и обладали всеми признаками покоящихся форм, но отличались по устойчивости к внешним факторам от типичных эндоспор бактерий (Эль-Регистан и др., 1979; Мулюкин и др., 1996, 1997; Демкина и др., 2000). Ранее проведенные исследования показали, что переход клеток в покоящееся состояние зависит от активности внеклеточного ауторегуляторного фактора dj с функцией индуктора анабиоза (Эль-Регистан и др., 1983; Осипов, Эль-Регистан и др., 1985; Батраков, Эль-Регистан и др., 1993). Выявление ЦРК не только у неспорообразующих, но и спорообразующих бактерий (Дорошенко и др., 2001) может свидетельствовать о биоразнообразии покоящихся клеток у микроорганизмов и различиях в их способности и формах торможения

метаболической активности в неблагоприятных для роста условиях. В связи с изложенным, актуальным является, с одной стороны, оценка влияния длительного низкотемпературного воздействия в мерзлых осадках на сохранение жизнеспособности бактерий, о чем можно судить по восстановлению пролиферативной активности при оттаивании; с другой, -изучение закономерностей образования и характеристик покоящихся форм у неспорообразующих бактерий, выделенных из мерзлых грунтов. Эти исследования способствуют накоплению методологического опыта в изучении физиологического состояния бактерий в условиях вечной мерзлоты.

Цель работы заключалась в установлении особенностей реактивации жизнеспособности бактерий из многолетнемерзлых осадков и возможности образования покоящихся форм у неспорообразующих бактерий как одного из способов их выживания в вечной мерзлоте.

Задачи исследования:

1. Изучение влияния длительности воздействия отрицательных температур на динамику восстановления активности бактерий при таянии мерзлых осадков разного возраста.

2. Оценка воздействия процессов замораживания и оттаивания на жизнеспособность и ультраструктуру клеток бактерий из мерзлых осадков.

3. Изучение образования и специфических особенностей ауторегуляторного фактора dj - аугоиндуктора анабиоза - у коллекционных и мерзлотных штаммов Arthrobacter globiformis.

4. Изучение условий образования покоящихся форм штаммами Arthrobacter globiformis в естественном цикле развития культур и в автолизирующихся клеточных суспензиях.

5. Изучение ультраструктуры клеток покоящихся форм штаммов Arthrobacter globiformis и выявление общих ультраструктурных особенностей с клетками, наблюдаемыми от situ.

Научная новизна. Показано, что длительное воздействие постоянных отрицательных температур не только не препятствует, но и способствует сохранению субклеточных систем, а также способности бактерий к активному прорастанию при оттаивании мерзлых отложений. Это обеспечивает восстановление жизнеспособности у значительного числа бактерий, большинство из которых представлено неспорообразующими формами. Выявлены галотолерантные свойства бактериальных сообществ из мерзлых осадков, которые сохраняются у клеток после многократных циклов замораживания-оттаивания нативных образцов. Это является дополнительным доказательством адаптации бактерий к условиям повышенного содержания солей, возникающего в процессе образования мерзлых отложений.

Впервые обнаружено, что неспорообразующие бактерии Arthrobacter globiformis продуцируют внеклеточные факторы d\, обуславливающие переход клеток в анабиотическое состояние. Показана видонеспецифичность действия таких соединений, что подтверждает универсальность аугорегуляции этого типа

на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах. Впервые установлено, что в естественном цикле развития погруженных культур в средах с дисбалансом источников питания и/или энергии, а также в условиях спонтанного автолиза плотных клеточных популяций, штаммы АпИгоЬааег gloЫformis образуют клетки, которые обладают всеми свойствами покоящихся форм микроорганизмов: сохранением жизнеспособности в течение длительного времени, термоустойчивостью, отсутствием эндогенного дыхания, характерными особенностями ультраструктурной организации. Показано, что продуктивность внеклеточных факторов ¿\ и терморезистентность покоящихся форм выше у штаммов АнИгоЬасЯег $оЬ$Ьгт15, выделенных из мерзлых осадков, по сравнению с коллекционным штаммом, что может рассматриваться как адаптивное преимущество бактерий в подобных биотопах, обеспечивающее повышение их устойчивости к стрессам. Выявлены ультраструктурные особенности клеток, которые могут рассматриваться как «портретные» характеристики бактерий, пребывающих в анабиотическом состоянии в природных субстратах, в том числе и в мерзлых осадках.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для развития методов обнаружения микроорганизмов в экстремальных земных местообитаниях, в астробиологии для выявления возможных латентных форм жизни на других планетах, в биотехнологии при разработке способов хранения неспорообразующих бактерий.

Апробация работы: Основные положения диссертации доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96, 97», Москва, 1996, 1997; 2-ой международной конференции «Криопедология-91», Сыктывкар, 1997; конференции «Консервация генетических ресурсов», Пущино, 1998; 1-й Международной конференции стран СНГ «Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития», Москва, 1999; конференции «Консервация и трансформация веществ и энергии в криосфере Земли», Пущино, 2001.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 18 работ.

авторов. Текстовая часть работы занимает страниц, иллюстрирована таблицами, рисунками, Ф фотографиями.

Автор глубоко признателен научному руководителю профессору Д.Г.Звягинцеву. Автор выражает благодарность д.б.н. Г.И.Эль-Регистан, к.б.н. В.С.Соиной, к.б.н. Е.А.Воробьевой, к.б.н. А.Л.Мулюкину, к.б.н. А.Н.Козловой за большую помощь в организации научных исследований и в интерпретации полученных данных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В экспериментах использовали образцы тундровой мерзлотной криотурбированной почвы и арктических мерзлых отложений, отобранные на территории Колымской низменности с соблюдением условий стерильности. Средняя температура в пробуренных скважинах колебалась от -9°С до -12°С. Были проанализированы образцы из аласных отложений, сформировавшихся в период голоценового климатического оптимума 6-10 тыс. лет назад, из отложений едомной свиты возрастом 15-40 тыс. лет, из отложений мастахской свиты возрастом 200-600 тыс. лет, из олерских отоложений, возраст которых колеблется в пределах от 0,6 до 1,8 млн. лет, а также из наиболее древних томус-ярских отложений (возраст около 3 млн. лет). В последних четырех типах отложений консервация микроорганизмов происходила, по-видимому, одновременно с формированием осадков и промерзанием. Аласные отложения представляют собой пример воздействия чередующихся процессов промерзания-оттаивания, которые происходят в природе при изменении климатических условий. Возраст 6-10 тыс. лет в данном случае соответствует последнему переходу этих осадков в мерзлое состояние.

Численность бактерий в образцах тундровой почвы и мерзлых отложений определяли чашечным методом, а также методом прямого счета с использованием красителя акридина оранжевого. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) учитывали при высеве бактериальных суспензий на плотные питательные среды (крахмало-аммиачную, минеральную с сахарозой, минеральную с мочевиной и глюкозо-пептонную с дрожжевым экстрактом) с последующей инкубацией от трех до 30 суток при температурах +50, 40, 30, 20 и4°С.

О способности бактерий восстанавливать свою активность судили по динамике численности бактерий в процессе размораживания образцов, определяемой по числу КОЕ при высевах, производимых через каждые 5 часов в процессе таяния образцов в течение суток и инкубации чашек при +20°С. Контролем служило число КОЕ, учитываемое при высеве нативных замороженных образцов.

Изменения инвертазной активности определяли в процессе таяния образцов мерзлых отложений и тундровой почвы. Определение активности проводили по известной методике (Раськова, 1981).

О качественном разнообразии выделенных бактерий и их принадлежности к группам с грамположительным или грамотрицательным типом клеточной стенки судили по тонким срезам клеток, выращенных на агаризованной среде и изученных в просвечивающем электронном микроскопе.

Влияние замораживания-оттаивания на жизнеспособность бактерий in situ определяли по числу КОЕ после оттаивания отобранных образцов тундровой почвы и мерзлых отложений (+20°С, 1 час) и последующего замораживания (-20°С, 3 сут.), всего 30 чередующихся циклов. Контролем служило число КОЕ, полученное после первого оттаивания нативных образцов. Параллельно изучали

ультраструктуру клеток бактерий после 30 циклов замораживания-оттаивания т situ, изолированных из образцов по методу (Bae et al., 1972), а также бактерий, выросших из этих изолятов на среде с 8% NaCl.

Для электронно-микроскопических исследований клетки бактерий фиксировали 2,5%-ным раствором глютаральдегида в какодилатном буфере (рН 7,2) с последующей постфиксацией в 0,5%-ном растворе четырехокиси рутения в том же буфере (Caughey, Miller, 1986). Тонкие срезы после окрашивания цитратом свинца просматривали в электронном микроскопе JEM-1008 (Япония) при инструментальном увеличении 20000-30000

Для изучения тонкого строения бактерий при их замораживании клетки стационарных культур замораживали в ампулах для криоконсервации при температуре -80°С со скоростью замораживания 5°С в мин. Через сутки хранения в замороженном состоянии клетки подвергали процессу замещения льда раствором четырехокиси осмия в безводном ацетоне в течение 2-х суток при -80°С (Grahem, Beveridge, 1990)

В качестве объектов для выявления внеклеточных аутоиндукторов анабиоза (фd{) и покоящихся форм были использованы неспорообразующие бактерии A. globiformis: коллекционный штамм В-1112 (ВКМ), выделенный из почвы, пггамм 245 - из коллекции бактериальных культур кафедры биологии почв, выделенный из образца мерзлой породы олерского отложения возрастом

0.6-1,8 млн лет с глубины 26,0 м; штаммы 235-2 и 348-10 - из коллекции микроорганизмов Центра микробной экологии Мичиганского университета (США), выделенные из образцов олерского отложения того же возраста с глубины соответственно 13,5 и 34,4 м

Бактерии культивировали в МПБ на качалках (140 об/мин) при температуре 28°С. Инокулят (культуры стационарной фазы роста) вносили в количестве, дающем оптическую плотность суспензии 0,2 ("Specord", X = 600 нм, 1=10мм).

Сгущение клеточных суспензий производили центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин.

Культуры бактерий выращивали на жидких средах, различавшихся по содержанию источников С, N, Р. Состав среды 1 (контроль) и ее вариантов (г/л): глюкоза -10, КН2Р04 - 0,1, (NH^SC^ - 0,1, К2НР04 -1, СаС12 - 0,2, MgS04 - ОД, рН 7-8; вариант Г. глюкоза -10, КН2Р04 - 0,1, (NH^SO,, - 0,05, К2НГО4 -

1, СаС12 - 0,2, MgS04 - 0,1, рН 7-8 (лимит N по сравнению с контролем); вариант 2: глюкоза - 20, КН2Р04 - 0,1, (NHL^SOi - 0,05, К2НР04 - 1, СаС12 - 0,2, MgS04- 0,1, рН 7-8 (лимит N, избыток С по сравнению с контролем); вариант 3: глюкоза - 2,0, КН2ГО4 - 0,1, (NH^SO, - 0,05, К2НЮ4 - 1, СаС12 - 0,2, MgS04 -0,1, рН 7-8 (лимит N, лимит С по сравнению с контролем). Состав среды 2 Оконтроль) и ее вариантов (г/л): глюкоза - 10, L-аспарагин - 1,0, К2НЮ4 - 0,5, рН 7,5; вариант 1: глюкоза - 100, L-аспарагин - 0,1, К2НР04 - 0,5, рН 7,5 (избыток С, лимит N по сравнению с контролем); вариант 2: глюкоза - 10, L-аспарагин - 0,1, К2НР04 - 5,0, рН 7,5 (избыток Р, лимит N по сравнению с контролем).

Жизнеспособность вегетативных и покоящихся клеток определяли по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий на МПА.

Эндогенное дыхание клеток определяли на полярографе LP7 в кислородной ячейке с закрытым платиновым электродом объемом 1 мл (Шольц, Островский, 1975).

О терморезистентности клеток судили по сохранению колониеобразующей способности после прогревания клеточных суспензий при 80°С в течение 10 мин.

Препараты фактора di (аутоиндуктора анабиоза) выделяли из культуральной жидкости экстракцией и-бутанолом (Осипов и др., 1985).

Для количественной оценки содержания алкилоксибензолов (АОБ) в биологически активных образцах фактора di применяли колориметрическую реакцию с диазотиевым производным 3,3'-диметоксибензидина (Fast Blue В Salt tetrazotized - FBB, "Sigma"), использованную ранее для определения АОБ типа алкилрезорцинов (Kozubek et al., 1996).

Лабораторные эксперименты проводили в трехкратной повторности при постановке трех независимых серий опытов. Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов (t-тесга Стьюдента) в программе Microsoft ExceI-2000 (критерий вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы групп данных).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Влияние длительного воздействия отрицательных температур на сохранение биологической активности и устойчивости бактерий, выделенных га мерзлых подпочвенных пород

1.1. Динамика восстановления активности бактерий в процессе таяния образцов

Изучено влияние продолжительного пребывания бактерий в условиях природной криоконсервации в образцах тундровой почвы и разных по возрасту мерзлых отложений на восстановление жизнеспособности при выделении бактерий на питательные среды с разными субстратами и культивировании при разных температурах.

Посев из многолетнемерзлых отложений в первые минуты таяния образцов выявил значительное число жизнеспособных бактерий (от 103 до 107 кл/г), дающих колонии как на минеральных средах, так и на богатой глюкозо-пептонной среде, сравнимое с численностью бактерий, выделенных из оттаявшего образца тундровой почвы (105 до 108 кл/г) (рис.1).

Наибольшее количество бактерий из почвы, учитываемых на богатой среде с дрожжевым экстрактом, выявлялось при +30°С и +50°С, также как и бактерий из молодых по длительности нахождения в мерзлом состоянии аласных

отложений (до 10® кл/г). Число активно растущих бактерий из образца аласных отложений на менее богатых минеральных средах при разных температурах культивирования было ниже и колебалось от 104 до 107 кл/г. В образце олерских отложений численность бактерий, учитываемых на разных питательных средах, имела тог же порядок (от 104 до 10б кл/г). Следует отметить, что в наиболее древнем образце томус-ярских песков численность бактерий, учитываемых при температуре культивирования +50°С как на минеральных питательных средах,

Рис 1. Численность микроорганизмов (14, КОЕ/г) из образцов тундровой почвы (А) и мерзлых отложений возрастом. 6-10 тыс. лет (Б), 0,6-1,8 млн лет (В), ~3 млн лет (Г), выделенных на разные среды (1- глюкозо-пептонная с дрожжевым экстрактом; 2 - минеральный агар с сахарозой; 3 - КАА; 4 - минеральный агар с мочевиной) при разных температурах культивирования.

так и на богатой глюкозо-пептонной среде, была сравнима с численностью бактерий из образца тундровой почвы (до 108 кл/г).

По данным прямого счета численность бактерий в исследованных образцах мерзлых отложений и тундровой почвы на порядок превышает данные, полученные чашечным методом при температуре культивирования +20°С, что

свидетельствует о несоответствии потенциальной биологической активности и реально выявляемой на питательных средах по числу КОЕ и может объясняться спецификой физиологического состояния клеток, которые требуют для восстановления своей жизнеспособности дополнительных условий реакгавации (Со1\ге11 й а1., 1985; (Зо1оу1еу, 1998; Ми1икш е! а1., 2002). По данным прямого счета, также как и по количеству КОЕ значительной убыли численности клеток с увеличением возраста замороженных осадков не наблюдается, и составляет 108 кл/г в образце возрастом 0,6-1,8 млн. лет, тогда как в образце наиболее древнего томус-ярского отложения снижается всего лишь на порядок - до 107 кл/г (Оешкта, 1997). Полученные данные позволяют сделать важный вывод о ведущей роли не столько длительности воздействия определенных значений низких температур, сколько постоянства физико-химических условий, создавшихся в мерзлых породах, что обеспечивает сохранность как потенциальной биологической активности, так и способности компонентов бактериальных сообществ быстро восстанавливать рост при наступлении благоприятных условий.

Другой вывод относится к обнаруженным различиям в динамике восстановления колониеобразующей способности бактерий при выделении их из образцов тундровой почвы, аласных и олерских отложений при высеве на минеральную питательную среду в зависимости от степени (времени) таяния нативных образцов (за 100% принято численность КОЕ бактерий на момент начала таяния образца) (рис.2). Так, при таянии образца мёрзлой тундровой почвы численность КОЕ бактерий на минеральной среде с сахарозой, увеличивается на 20% и достигает максимального значения к пяти часам таяния (107 кл/г). В отличие от почвенного, в обоих образцах мерзлых отложений изменения численности КОЕ на минеральной среде не имеют линейного характера - увеличивается на 100%, через три часа таяния достигая 107 кл/г в образце аласного отложения и 103 кл/г в образце олерского отложения. К пяти часам таяния численность бактерий в образце аласного отложения резко снижается, а затем восстанавливается, достигая через сутки таяния 107 кл/г. В образце олерской свиты после периода снижения скорости нарастания КОЕ на 3-5 час таяния идет плавное возрастание численности колоний, достигая максимума к концу суток.

Таким образом, активизация бактерий в процессе оттаивания образцов мерзлых пород при их выделении на минеральную среду выявляется раньше и протекает более интенсивно, чем образца тундровой почвы.

Сравнение приведенных данных с результатами определения инвертазной активности при таянии тех же образцов мерзлых пород и тундровой почвы выявило ту же тенденцию к проявлению более высокой ферментативной активности при таянии мерзлых пород по сравнению с тундровой почвой (рис.3). Вместе с тем, динамика активности инвертазы не совпадала с динамикой восстановления роста бактерий на минеральной среде с сахарозой, что может объясняться проявлением активности не только внутриклеточной инвертазы, но и внеклеточной, иммобилизованной в мерзлых отложениях

Рис.2 Динамика численности

микроорганизмов (выраженная в % от исходной), выделенных на минеральную среду с сахарозой при 20°С в процессе таяния образцов почвы и мерзлых отложений разного возраста: 1 - тундровая почва; 2 - аласные отложения (6-10 тыс лет); 3 - олерские отложения (0,6-1,8 млн лет).

Рис.3 Изменение активности инвертазы при таянии (20°С) в образцах' 1 -тундровой почвы; 2 - мерзлой осадочной породы (~3 млн. лет ) (по данным Миньковской); 3 - мерзлой осадочной породы (6-10 тыс лет)

(Vorobyova et al., 2001), что способствует восстановлению пролиферативной способности бактерий.

Следует отметить, что на спектр бактерий, вырастающих при оттаивании образцов мерзлых отложений и тундровой почвы, влияла температура культивирования. Как показали исследования в фазово-контрастном и электронном микроскопах, при повышении температуры культивирования (+40°...+50°С) среди бактерий, выделенных из мерзлых отложений на разные питательные среды, преобладала доля спорообразующих бактерий. Выявленная зависимость может объясняться эффектом активации высокими температурами покоящихся клеток (спор) спорообразующих бактерий (Калакуцкий, Агре, 1977) (рис.4). При более низких температурах (+4°... t-30°C) среди бактерий, восстановивших свою активность, доминировали неспорообразующие бактерии с грамотрицательным и грамположительными типом клеточной стенки. Таким образом, показано, что при длительном воздействии отрицательных температур

в мерзлых отложениях и в тундровой почве сохраняются бактерии с широким температурным диапазоном роста - психротрофы, мезофилы и термофилы.

4*С

20*С

100%

80% ■

60%

40»/4

20%

I 0 Ш IV

100%-80% ■ 60% 40% 20%-0%

30"С

'III

I П Ш IV

40*С

50®С

Рис 4. Морфологические типы клеток бактерий, выделенные из почвы и мерзлых пород разного возраста при разных температурах на МПА

Возраст образцов. I - томус-ярский, ~3 млн лет; П - олерский, 0,6-1,8 млн лет; ТТТ - гласный, 6-10 тыс лет; IV - современная мерзлотяо-тундровая почва Типы клеток бактерий- 1 -спорообразующие; 2 - неспорообразующие с грамположительным типом клеточной стенки (коринеформные и кокки); 3 - неспорообразующие с грамотрицательным типом клеточной стенки.

Это позволяет рассматривать условия, образующиеся при длительном воздействии постоянных отрицательных температур в таких биотопах как стабилизирующий фактор, который способствует сохранению основных физиологических функций клеток.

1.2. Влияние процессов замораживания и оттаивания на клеточную структуру, жизнеспособность и устойчивость бактерий к NaCl

Устойчивость бактерий в мерзлых осадках обусловлена их специфическими структурными и биохимическими особенностями, позволяющими противостоять разрушительному действию льда и концентрированным солевым растворам вокруг клеток, формирующимся в условиях промерзания. В частности, ранее показано, что микробные сообщества мерзлых осадков обнаруживают высокую устойчивость к многократным циклам промерзания-оттаивания, в ряде случаев, превышающую таковую бактерий в образцах тундровой почвы (Мешкова, 1991; Gilichinsky et al., 1993). Эти результаты коррелируют с полученными нами данными о более активном восстановлении роста бактерий после оттаивания мерзлых осадков по сравнению с образцом мерзлой почвы. Обсуждаемые явления могут быть результатом развития устойчивости бактерий к повышенному содержанию солей при формировании мерзлых осадков и способности синтезировать внутри- и внеклеточные вещества, обеспечивающие клеткам защиту от осмотического стресса и образования внутриклеточного льда. Была изучена жизнеспособность бактериальных сообществ в образцах мерзлых отложений и тундровой почвы после многократных циклов замораживания-оттаивания, а также их последующая чувствительность к повышенному содержанию NaCl. В этих экспериментах была использована трштгиказо-соевая среда, так как для более успешного возобновления роста бактерий после циклов замораживания-оттаивания, рекомендованы богатые среды с дополнительными факторами роста, в том числе триптиказой (Ray, 1984).

Из результатов, представленных на рис.5, следует, что бактериальные сообщества в изученных нами образцах мерзлых пород проявляют достаточно высокую устойчивость к 30 циклам замораживания-оттаивания. Отмечено, что численность бактерий, устойчивых к замораживанию-оттаиванию и одновременно галотолерантных во всех образцах была одинакова, но удельное содержание таких бактерий в мерзлых отложениях доминировало, тогда как в образце современной тундровой почвы составляло около 60%.

Электронно-микроскопическое изучение тонкой структуры клеток бактерий, фракционированных из образцов мерзлых осадков и почвы после 30 циклов замораживания-оттаивания, не выявили каких-либо видимых структурных повреждений клеток. Среди наблюдаемых форм были обнаружены мелкие (0,3-0,8 мкм) клетки как с грамотрицательным, так и грамположительными типом клеточной стенки, одиночные, или в конгломератах, погруженные в электронно-прозрачную капсулу или гель. В целом наблюдаемые нами клетки in situ после 30 циклов замораживания-оттаивания по строению не отличались от описанных ранее после однократного оттаивания образцов вечномерзлых пород (Soina et al., 1992), что может свидетельствовать о специфических структурных особенностях бактериальных клеток т situ.

Изучение тонкого строения клеток бактерий в замороженном состоянии по методу низкотемпературной фиксации с последующим замещением льда показало, что в клетках с грамположительным и с грамотрицательным типом клеточной стенки не выявлялось образования внутриклеточного льда, а клеточные структуры сохранялись без видимых повреждений. На ультраструктурном уровне получено подтверждение высказанного ранее предположения (McGrath, 1994) о возможном сохранении в «незамороженном» (льдо-кристашшческом) состоянии цитоплазмы бактериальных клеток в «мерзлоте», что может быть следствием повышенного содержания в них крио- и осмопротекгоров, обезвоженности протопласта по типу покоящихся форм, состояния воды в витрифицированном состоянии (glass former). Сохранение целостности клеточных структур при замораживании объясняет высокие показатели жизнеспособности бактериальных сообществ в мерзлых породах и тундровой почве сразу после оттаивания и чередующихся циклов замораживания-оттаивания.

Рис 5 Жизнеспособность бактериальных сообществ после 30 циклов замораживания-оттаивания: А - тундровой почвы; образцов мерзлых осадков возрастом: Б - 6-10 тыс. лет, глубина залегания 3,2 м; В - 15-40 тыс. лет, глубина залегания 5,0 м; Г - 0,6-1,8 млн лет, глубина залегания 11,6 м; Д - 0,6-1,8 млн лет, глубина залегания 22 5 м; Е —3 млн лет, глубина залегания 49,4 м, определяемая по числу КОЕ/г (М) на триптиказо-соевой среде' 1 -после первого оттаивания; 2 - после 30 циклов замораживания-оттаивания; на той же среде с 8% ]ЧаС1' 3 - после первого оттаивания; 4 - после 30 циклов замораживания-оттаивания.

Наши эксперименты (рис.5) выявили присутствие как в почве, так и в мерзлых осадках популяций, устойчивых к промерзанию и последующему оттаиванию. Данные о более высокой удельной доли бактерий из мерзлых осадков, устойчивых к №С1 после замораживания-оттаивания, и сохраняющаяся тенденция к более ранней активизации их роста после оттаивания на среде с 8% №С1, свидетельствуют о развитии механизмов устойчивости клеток к условиям повышенного содержания солей в мерзлых осадках.

Изучение в модельных экспериментах улырастругауры клеток неспорообразующих бактерий - штаммов родов Micrococcus и Arthrobacter при хранении в течение 28 суток в жидкой триптиказо-соевой среде с 8% NaCl выявило наличие толстых клеточных стенок, неоднородной по плотности цитоплазмы и внешних капсул. Состояние цитоплазмы имело сходство с цитоплазмой замороженных клеток, которая также характеризовалась повышенной концентрацией веществ и высокой электронной плотностью.

ГЛАВА 2. Образование покоящихся форм неспорообразующими бактериями рода Arthrobacter

Ранее было показано, что неспорообразующие бактерии способны к образованию цистоподобных рефрактерных клеток (ЦРК), обладающих всеми признаками покоящихся форм (Мулюкин и др., 1996). Формирование ЦРК зависит от концентрационного уровня и активности внеклеточных регуляторов с функциями аугоиндукторов анабиоза, названных факторами di (дифференцировки клеток) и относящихся у некоторых микроорганизмов к алкилоксибензолам (АОБ) (Осипов и др., 1985; Батраков и др., 1992). Разработанные методы получения таких форм были применены нами для изучения образования покоящихся клеток у неспорообразующих бактерий -представителей рода Arthrobacter, которые нередко преобладают среди грамположителытах бактерий, выделяемых из мерзлых отложений (Soina, Vorobyova, 1996). При изучении циклов развития артробакгерий отмечалось образование крупных сферических или лимоноподобных клеток - циститов, которые разными авторами рассматривались как инволюционные формы, либо как возможные покоящиеся формы (Квасников, Писарчук, 1980). Однако никаких доказательств наличия признаков покоя у данных форм выявлено не было.

2.1. Выделение и изучение динамики образования аутоиндукторов анабиоза

штаммами A. globiformis

Объектами исследований в этой части работы были бактерии коллекционного штамма A. globiformis В-1112, выделенного из почвы, и А. globiformis 245, выделенного из мерзлых отложений возрастом 0,6-1,8 млн. лет.

При выделении факторов d\ (фг/:) с функциями аутоиндукторов анабиоза из культуральной жидкости обоих штаммов обнаружено, что выделенный из мерзлых отложений штамм A. globiformis 245 в отличие от коллекционного штамма, обладал на порядок большей продуктивностью по синтезу внеклеточного ауторегулятора (табл.1). В реакциях с высокоспецифичиым АОБ (класса алкилрезорцинов) реагентом было показано их наличие во фракциях фd\ обоих штаммов. При этом продуцирование АОБ штаммом 245 была на порядок больше, чем штаммом В-1112. Показана видонеспецифичность действия факторов dx обоих штаммов: препарат, выделенный из культуральной жидкости

изолята A. globiformis 245, проявлял активность в отношениии коллекционного штамма A. globiformis В-1112, а также других бактерий - Micrococcus luteus и Bacillus cereus (табл.2).

Таблица 1. Содержание внеклеточного фактора А и АОБ в расчете на единицу объема и биомассы у изолята А. %1оЫ/(тгтм 245 из образца мерзлой породы и А %1оЫ/огпиз коллекционного штамма В-1112

Культура Содержание внеклеточного ф d\, ед.акт /л Продуктивность по внеклеточному ф.г/i, ед акт/г клеток Содержание АОБ в препарате внеклеточного ф.г/i мг/мл

A. globiformis В-1112 8 3,6 0,07

A. globiformis 245 100 38,5 1

Таблица 2. Чувствительность клеток коллекционных штаммов А. фЪЫ/оптя, М. ¡Шеш, Я сегеиз к действию внеклеточного фактора А. %1оЫ/огпш 245 и его аналога - 4-

гексил резорцина

Тест-культура Количество, подавляющее дыхательную активность клеток на 50% под действием Концентрация аналога фактора, достаточная для образования анабиотических клеток, М

ф d\A. globiformis 245, мг АОБ/мл аналога фД -4-гексилрезорцина, М

A. globiformis В-1112 1,2 - 1,3 2,5xl04- 3,0х10ч 8,0x10"* - 10x10"*

М. luteus 2,0 7,5x10"' - 8,0x10"' 2,5x10"' - 3,0x10"*

В. cereus 1,4 2,0x10-4 - З.ОхЮ"4 10,3x10"*- 25x10"*

Таблица 3. Чувствительность клеток Aglobiformis В-1112 н М. luteus к действию различных химических аналогов фактора dj

Аналог фактора dt Концентрация. достаточная для

образования анабиотических клеток А. globiformis В-1112, М подавления дыхательной активности клеток М. luteus на 50%, М

4-и-гексилрезорцин 10x10"* 8,0х10'5

4-я-децилрезорцин 5,0x10"* 40,0x10"3

5-и-децилрезорцин 5,0x10"4 5,1х10"5

2,5-дибутилрезорцин 10x10"* 13,0х10"5

2-нонил-5-децилрезорцин 2,0x10-4 28,2x10'5

Выявлены количественные различия действия препарата внеклеточного фактора из «мерзлотного» изолята артробактерий и химического аналога этого фактора - 4-н-гексилрезорцина, «гго может объясняться неодинаковой чувствительностью клеток к различным по химической структуре изомерам и гомологам алкилоксибензолов, входящих в состав факторов у разных бактерий (табл.3). Таким образом, получены дополнительные доказательства в пользу существования аугорегуляции роста и развития бактерий на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах. Высокая

продуктивность внеклеточных факторов ^ - аутоиндукторов анабиоза - у изолятов из мерзлых пород, видимо, обусловлена развитием антистрессовых механизмов, обеспечивающих выживание бактерий в экстремальных условиях и подтверждает сделанный нами ранее вывод об отборе высокоустойчивых популяций при формировании бактериальных сообществ в процессе образования вечной мерзлоты.

2.2. Образование покоящихся форм в циклах развития А. в

условиях дисбаланса по источникам питания и/или энергии

Так как уровень ЛОБ в развивающихся микробных культурах определяющим образом влияет на образование покоящихся форм в экспериментах с артробактером модификация состава сред была направлена на усиление липогенеза (ОИ, лимит К), что согласно литературным данным способствует усилению биосинтеза АОБ в бактериальных культурах.

Таблица 4. Число жизнеспособных клеток А. gloЫfornds В-1112 при культивировании и хранении в средах с дисбалансом СЖ, КОЕ/мл (% от исходного)

Время, сутки 1% глюкозы (контроль) 1% глюкозы лимит N (0,05 г/л) 2% глюкозы лимитN (0,05 г/л) 0,2% глюкозы лимит N (0,05 г/л)

2 (6,2±0,3)х108 (100) (5,0±0,2)х108 (100) (5,8±0,2)х108 (100) (5,2+0,2)х108 (100)

30 (3,0+0,1)х108 (48) (2,0±0,1)х108 (40) (3,0+0,1)х10* (52) (2,5±0,2)х108 (48)

60 (1,5±0,1)х108 (24) (2,0±0,1)х108 (40) (2,6±0,2)х108 (45) (2,4±0,2)х108 (46)

120 (2,1±0,1)х106 (0,3) (9,0±0,1)х106 (0,2) (Ьг+о.ОхЮ6 (0,2) (2,4±0,2)х108 (46)

Наиболее высокий процент клеток, сохранивших способность к колониеобразованию, был обнаружен при использовании среды с уменьшенным в пять раз содержанием источника С и сниженным в два раза содержанием источника N по сравнению с контролем. Число жизнеспособных клеток в этом варианте к четвертому месяцу хранения в провокационных условиях - средах, не предназначенных для хранения (0,2% глюкозы, 0,05 г/л источника N и температуре +20°С), было высоким и составило 46% от максимального значения КОЕ в стационарной культуре (табл.4). Микроскопические исследования образовавшейся популяции жизнеспособных клеток в фазовом контрасте выявили их интактность и повышенную степень светопреломления. По этому признаку они были подобны ЦРК, описанных ранее для бактерий других родов (Осипов и др., 1985; Мулюкин и др., 1996).

Переживающие клетки штамма А. gloЫformis В-1112 помимо длительного сохранения жизнеспособности ЦРК в течение 4-6 месяцев обладали и другими

признаками покоящихся форм: отсутствием эндогенного дыхания (полярографические определения) и повышенной терморезистентностью. Хранящиеся клетки были устойчивы к температурному шоку (+80°С, 10 мин.), сохранив жизнеспособность после прогревания на уровне 70% от первоначальной, которая оказалась выше по сравнению с покоящимися клетками других бактерий (табл.5).

Таблица 5. Жизнеспособность покоящихся клеток бактерий после термообработки клеточных суспензий при 80* С в течение 10 минут, КОЕ/мл (•/. от исходного)

Культуры Численность жизнеспособных клеток

до термообработки после термообработки

Вегетативные клетки А. ¡¡¡оЫ/оптх (контроль) (5,2±0,2)х108 (100) <103

Клетки Л. gloЫformis после двух месяцев хранения в среде 1 (вариант 3) (2,№,2)х\(? (100) (1,6±0,2)х108 (67)

Покоящиеся клетки М. Меиз (Мулюкин и др., 1996) (6,0±2,3)х106 (100) (2,0±0,3)х106 (33)

Покоящиеся клетки В. сегеих (Мулюкин и др., 1996) (3,0+0,7)х108 (100) (1,0±0,3)х10* (33)

Таблица 6. Численность жизнеспособных клеток А globifonию, хранившихся в контрольной и модифицированной среде 2 в течение двух месяцев я после их реанимации, КОЕ/мл (% от исходного)

Вариант среды 2 Численность жизнеспособных клеток через

3 суток 2 месяца без реанимации 2 месяца после реанимации

Среда контрольная (1,2±0,1)х108 (100) (3,2+0,3)х106 (3) (3,б±0,3)х10' (3)

Среда вариант 2 (P>N) (з.г+о.г^ю1 (100) (З.Ш.З^Ю6 (1) (3,9±0,3)х107 (12)

Среда вариант 1 (ON) (1,8±0,2)х108 (100) (8,0±0,1)х105 (0,4) (1,4±0,2)х107

В отличие от ЦРК, полученных на модифицированной среде 1, ЦРК, образовавшиеся в среде 2, требовали особых условий реанимации, включавших содержание клеточных суспензий в жидкой среде следующего состава: 0,1 М К2НРО4,0,1% дрожжевой автолизат, pH 8,0.

После применения процедуры реанимации число жизнеспособных ЦРК возросло в 15 раз, в то время как число КОЕ, полученное в контроле при росте бактерий в среде без дисбаланса источников питания, после проведенной реактивации не увеличивалось (табл.6).

Таким образом, нами показано образование покоящихся форм у неспорообразующих коринеформных бактерий А. globiformis в естественном цикле развития их погруженных культур в средах с дисбалансом источников

питания и энергии. Клетки, обладающие всеми необходимыми для покоящихся форм признаками, были получены как у коллекционного штамма А. фоЬ^огтя В-1112, так и у штамма А. 245, выделенного из

вечномерзлых осадков.

2.3. Образование покоящихся форм А. 21оЫ/огтЬ в автолизирующихся

суспензиях

Другой способ получения ЦРК был основан на их образовании в автолизирующихся клеточных суспензиях высокой плотности. При этом в результате автолиза клеток одной части популяции при выходе из них фактора (¡1 (АОБ), его концентрация повышается до уровня, достаточного для индукции формирования ЦРК интактными клетками другой части популяции (Мулюкин, 1998).

Влияние автолиза на интенсивность образования покоящихся форм у артробактерий изучали в вариантах: (1) спонтанного саморастворения клеток и (2) автолиза, индуцированного добавлением в сгущенную суспензию аналога фактора с12 (аутоиндуктора автолиза) - олеиновой кислоты. Клеточные суспензии А. ^1оЫ/огт^ сгущали в 10 и 20 раз в среде роста, воде и буферных растворах.

В условиях спонтанного автолиза число сохранивших жизнеспособность клеток через 45 суток было максимальным в сгущенных в 10 и 20 раз суспензиях в буферных растворах с 0,02% СаС12 и составило 5-12% от числа клеток в фазе максимального накопления биомассы (табл.7).

В автолизирующихся суспензиях контрольной культуры (без сгущения) число жизнеспособных клеток было существенно ниже - до 1%. В экспериментах было отмечено, что у штаммов, выделенных из мерзлых осадков, численность ЦРК, образующихся в автолизирующихся суспензиях, ниже (1% и 0,4%), чем у коллекционного штамма (5%) (табл.8). Этот показатель для всех трех штаммов был выше по сравнению с контролем (без сгущения).

Полученные в результате спонтанного автолиза клетки, сохранившие жизнеспособность при хранении в сгущенных суспензиях в течение 45 суток, обладали повышенной устойчивостью к прогреванию по сравнению с вегетативными клетками (контролем), где прогревание клеточных суспензий при 80°С в течение 10 минут вызывало полную гибель клеток (табл.9). В автолизирующихся клеточных суспензиях было обнаружено высокое число терморезистентных клеток - до 40% в опытах с коллекционным штаммом А. %1оЫ&гт1$ В-1112 и до 75% у штаммов 235-2 и 348-10, выделенных из мерзлых осадков.

Таблица 7. Число жизнеспособных клеток А. gloЫfurmis В-1112 в условиях спонтанного автолиза клеточных суспензий, сгущенных в 10 раз в буфере рН 6,5 н хранившихся при

28°С, кл/мл (•/■ от исходного)

Среда для хранения Число КОЕ в п роцессе хранения

2 суток 3 суток 10 «уток 45 суток

Без отмывки (контроль*) (3,0±1,2)х108 (100) (2,0+1,1)х108 (65) (6,0±1,4)х107 (20) (3,0±1,2)х106 (1)

Среда роста с СаСЬ** (3,1±1,8)х1010 (100) (1,6±0,5)х1010 (51) (5,6±1,2)х109 (18) (3,1±0,7)х106 (0,01)

Вода водопро вода, с СаСЬ (100) О.ЗМ.ЗМО10 (76) (1,1±0,2)х1010 (65) (4,0±1,3)х107 (0,2)

Физраствор с СаСЬ (6,2±1,1)х109 (100) (з^+о.вмо9 (57) (1,1±0,2)к10? (18) (1,9±0,4)х108 (3)

Буфер рН 6.5 с СаСЬ (7,0±1,3)х10? (100) (5,2+0,4)х109 (74) (4,0±1,5)х10® (57) (5)

Буфер рН 7.25 с СаС12 (4,9±1,2)х109 (100) (З^М.б^Ю9 (65) (2,8+0,2)х109 (57) (5,8±1,0)х10® (12)

* Клетки А. %16Ы$оггт$ В-1112, выращенные на среде МПБ (без сгущения) **СаСЬ вносили в количестве 0,02%

Таблица 8. Число жизнеспособных клеток А glob¡formis в условиях спонтанного автолиза, хранившихся при сгущении клеточных суспензий в 20 раз в буфере рН и хранившихся при 28*С, кл/мл (% от исходного)

Культуры бактерий Число КОЕ в процессе хранения через

2 суток 3 суток 10 суток 45 суток

А. gbblformisB-1112 (1,1±0,2)х10п (100) (2,1±0,3)х101С (20) (5,9±0,2)х109 (б) (5,5±0,3)х109 (5)

А. %1оЪ$огпи* 235-2 (7,7±0,5)х10п (100) (2,9+0,4)х1010 (38) (5,3±0,6)х10* (1) (4,2±0,2)х108 (1)

А. £1оЫ/отчз 348-10 (^Ю^^Ю10 (100) (1,3±0,3)хЮ10 (10) (5,9±0,3)х108 (0,4) (5,9±0,5)х108 (0,4)

Таблица 9. Термостабнльность жизнеспособных в течение 45 суток клеток, находящихся в условиях индуцированного автолиза, кл/мл (% от исходного)

Культуры бактерий КОЕ до термообработки КОЕ после термообработки

А. $1оЫ/огт1э В-1112 (5,5±0,3)х109 (100) (2,2±0,1)х109 (40)

А. g¡oblformгs 235-2 (4,2±0,2)х108 (100) (3,2+0,2)х108 (75)

А. ¿Ш/опн^й 348-10 (5,9±0,2)х108 (100) (4,140,г^сЮ1 (70)

Контроль* (3,1±0,2)х108 (100) <103

*Клеггки культуры А. %1оЪ$опт8, выращенные на МПБ и взятые на стационарной фазе роста

Автолиз клеток А. В-1112 индуцировали внесением в

сгущенные в 10 раз клеточные суспензии химического аналога фактора -олеиновой кислоты - с целью интенсификации автолиза и ускорения выхода из лизированных клеток аутоиндукгора анабиоза - фактора <1] (табл.10).

Таблица 10. Число жизнеспособных клеток в клеточных суспензиях А. %1оЫ/огти в условиях автолиза, индуцированного химическим аналогом фактора ¿з, КОЕ/мл (% от исходного)

Концентрация аналога фактора А. фЫ&гтк В-1112*

1000 нмоль/мл (5,840,4) х 10*

(2,64)

Контроль»* (2,2±0,2)хЮ10

(100,00)

Контроль*** (4,0±0,2)х 10"

(0,01)

*Число КОЕ в клеточной суспензии, сгущенной в 10 раз (МПБ,рН 7,25) и хранившейся в течении 1 месяца

**Число КОЕ сразу после сгущения в нативной среде роста (МПБ)

***Число КОЕ в суспензии, сгущенной в 10 раз, без добавления олеиновой кислоты и хранившейся в течение 1 месяца

Интакпше клетки, сохранившие жизнеспособность в течение длительного времени в автолизатах, характеризовались резким снижением уровня метаболической активности, о чем судили по отсутствию эндогенного дыхания. В фазово-контрастном микроскопе интакгные клетки в автолизатах имели однородную кокковидную форму и мелкие размеры (до 0,3 мкм), что не всегда позволяло выявить рефракгерностъ у неавтолизированных клеток.

Сумма выявленных свойств позволяет отнести интакпше клетки штаммов А. образующиеся в автолизирующихся суспензиях, к покоящимся

формам.

2.4. Тонкое строение клеток покоящихся форм А. gloЫfoтmis

Электронно-микроскопическое изучение тонкого строения клеток А. %1оЫ&гт1В, отнесенных к покоящимся типам, выявило сходные черты в строении таких клеток, полученных в естественном цикле развития при несбалансированном питании и в условиях автолиза, а также под действием синтезируемого штаммами артробакгера фактора анабиоза г/у и его химического аналога - АОБ-4-н- гексилрезорцина.

Как показали электронно-микроскопические исследования, у изученных штаммов А. %1оЪфгтг5 в условиях спонтанного и индуцированного автолиза на тонких срезах наряду с типично лизированными клетками наблюдались интакгные клетки с утолщенными клеточными стенками по сравнению с вегетативными клетками (рис.6а,б). Они составляли примерно 15% среди

Рис.6. Ультратонкое строение клеток а) вегетативных клеток бактерии АгЛгоЬас1ег 21оЫ/огт1$ 245 , выделенной из образца мерзлой породы (3-х суточная культура, выращенная на триптиказо-соевой среде), х 60 ООО;

б, в) анабиотических клеток бактерии АпНгоЬас1ег 21оЫА>гтк 235-2, полученных в условиях сгущения суспензии (б), и в условиях хранения на минеральной среде с лимитом С иN (в), х 60 ООО:

г) бактерий с грамположительным типом клеточной стенки, сконцентрированных после 30 циклов замораживания-оттаивания из нативного образца мерзлых осадков возрастом 0.6-1.8 млн. лет, х 40000

лизированных клеток, что коррелирует с данными по КОЕ. Цитоплазма таких клеток характеризовалась гомогенным строением и наличием участков с высокой электронной плотностью рибосом. Зона нуклеоида практически не выявлялась. Сходное строение имели и покоящиеся клетки, полученные в естественном цикле развития при несбалансированном питании (рис.бв). Выявленные нами анабиотические клетки у A. globiformis отличались от описанных ранее у бактерий рода Arthrobacter "циститов" (клеток, образующихся на среде с высоким значением C/N) мелкими размерами и отсутствием запасных питательных веществ типа гликогена. Последние в описанных циститах занимали обширные области, раздувая клетки «циститы» до лимоноподобной формы. Тонкое строение анабиотических клеток А. globiformis 245, полученных под влиянием химического аналога АОБ-4-w-гексилрезорцина или препарата фактора анабиоза dlt выделенного из культуральной жидкости, также характеризовалось снижением электронной плотности цитоплазмы, слабо выраженной зоной нуклеоида и утолщенными клеточными стенками.

Покоящиеся формы изученных штаммов A. globiformis, как коллекционного, так и выделенных из мерзлых пород, по ультратонкому строению были сходны между собой и с цистоподобными рефрактерными клетками других неспорообразующих бактерий (Мулюкин и др., 1996, 1997). Наряду с описанными выше клетками, на срезах выявлялись также «карликовые» клетки диаметром 0.3-0.4 мкм с хорошо выраженными клеточными структурами, а также более мелкие полиморфные клетки диаметром 0.1-0.2 мкм. с хорошо выявляемыми клеточными стенками и непрокрашенным, либо плохо прокрашенным внутренним содержимым. Следует отметить, что оба типа клеток не обнаруживались у пгтаммов А. globiformis в вегетативной стадии роста, однако сходные по морфо-цитологическим особенностям клетки наблюдались ранее in situ (Soina et al., 1995; Vorobyova et al., 1997). Наличие подобных мелких клеток наряду ЦРК в биомассе пгтаммов A. globiformis в условиях, индуцирующих активность внеклеточных метаболитов с функциями ауто индукторов анабиоза, позволяет предположить, что такие клетки являются одной из форм переживания А. globiformis и требуют дальнейших исследований.

В целом изученное нами тонкое строение покоящихся клеток неспорообразующих бактерий A. globiformis было сходно с ультраструктурой покоящихся форм других неспорообразующих бактерий (Мулюкин и др., 1996), а также бактериальных клеток in situ, наблюдаемых ранее и в настоящей работе после однократного и многократных циклов замораживания- оттаивания образцов мерзлых отложений (рис.бг).

Сумма выявленных нами ультрастуюурных особенностей клеток покоящихся форм A. globiformis и покоящихся форм других неспорообразующих бактерий, позволяет составить "портретные" характеристики таких клеток, которые могут быть узнаваемы при наблюдении

in situ и давать представление о физиологическом состоянии бактерий в природных субстратах, в том числе и мерзлых осадках.

Таким образом, получены доказательства быстрого восстановления жизнеспособности бактерий (в том числе и неспорообразующих) на питательных средах при оттаивании мерзлых субстратов, что подтверждается наличием клеток в покоящемся состоянии, которые не требуют специальных условий для возобновления роста в благоприятных условиях. Вместе с тем, более глубокие метаболические перестройки покоящихся клеток требуют применения специальных условий для их оживления.

ВЫВОДЫ

1. Установлены различия в динамике восстановления колониеобразующей способности бактерий при выделении на питательные среды с разными субстратами из образцов мерзлых отложений и тундровой почвы. Активизация их роста в первые часы таяния образцов мерзлых осадков разного возраста в 3-5 раз превышает таковую по сравнению с почвенным образцом. Длительное воздействие постоянных отрицательных температур не только стабилизирует условия дня сохранения функций клеточных систем, но и повышает их активность при оттаивании мерзлых отложений, обеспечивая восстановление жизнеспособности значительному числу бактерий, в том числе неспорообразующим.

2. Выявлены галотолерантные свойства бактериальных сообществ мерзлых осадков, которые сохраняются после многократных циклов замораживания-оттаивания образцов. Это является доказательством в пользу адаптации бактерий к условиям повышенного содержания солей, возникающего при промерзании осадочных пород.

3. Неспорообразующие бактерии рода Arthrobacter продуцируют внеклеточные факторы d\, обуславливающие переход клеток в анабиотическое состояние. Выделенный из образца многолетнемерзлых отложений штамм обладал большей продуктивностью по синтезу внеклеточного фактора d\, что может быть обусловлено развитием антистрессовых механизмов при длительном промерзании в природных условиях. Показана видонеспецифичность действия таких соединений, что служит дополнительным доказательством в пользу существования ауторегуляции роста и развития микроорганизмов на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах, в том числе и в мерзлых осадках.

4. В естественном цикле развития погруженных культур в средах с дисбалансом источников питания и/или энергии, а также в условиях спонтанного автолиза части микробной популяции, штаммы A. globiformis образуют клетки, которые по ряду признаков были отнесены к покоящимся формам. Терморезистентность таких клеток у штаммов A. globiformis, выделенных из вечномерзлых отложений, выше по сравнению с таковой у коллекционного штамма.

5. Выявленные ультрастуктурные особенности клеток покоящихся форм А. globiformis при сопоставлении с ультраструктурными особенностями бактериальных клеток, наблюдаемых in situ, позволяют рассматривать полученные в модельных опытах покоящиеся клетки как реперные формы, дающие представление о физиологическом состоянии бактерий в вечномерзлых осадочных породах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Демкина Е.В. Влияние длительного замораживания на метаболизм и температурные характеристики бактерий из мерзлых подпочвенных осадков // Тез. докл. Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-96». М. 1996. С. 17

2. Soina V.S., J. McGrath, Demkina E. V. Responses of Bacteria from Permafrost on Different Types of Freezing as Additional Argument for Possible Preservation of Microbial Life in Extraterrestrial Space // 31я COSPAR Scientific Assembly. Birmingham, England. 1996. P. 198

3. Демкина Е.В. Влияние процессов замораживания и оттаивания на жизнеспособность бактерий из вечномерзлых подпочвенных слоев // Тез. докл. Междунар. конф. студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-97». М. 1997. С.22

4. Soina V.S., Demkina E.V. Impact of freezing and thawing processes on viability of bacteria from permafrost subsoil layers // In: International Symposium of Physics, Chemistry and Ecology of Seasonally Frozen Soils. Alaska, USA. 1997. P. 175

5. Demkina E.V. Bacteria from Permafrost Sediments: Possible Ways of Adaptation to Temperature Factor // 2nd International Conference «Ciyopedology -97». Syctyvkar, Russia. 1997. P.95

6. Soina V.S., Demkina E.V. Study of Possible Mechanisms of Microbial Survival under Prolong Freezing in Nature // Intern. Conf. Problems of Earth Cryosphere. Pushino, Russia. 1997. P.219

7 Soina V.S., Demkina E.V., Zviagintsev D.G. and El-Registan G.I. Ultrastructure Investigations of Dormant Cells of Non-Spore Forming Bacteria Isolated from Permafrost // 32nd COSPAR Scientific Assembly. Nagoya, Japan. 1998. P.234

8. Соина B.C., Воробьева E.B., Мамукелашвили А.Г., Демкина Е В, Звягинцев Д.Г., Гиличинский ДА Вечная мерзлота как фактор, обеспечивающий сохранение разнообразия микроорганизмов в природе // Консервация генетических ресурсов. Пущино. 1998. С.232-234

9. Беспалов М.М., Лойко Н.Г., Демкина Е.В., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Варламова Е.А., Курганов Б.И., Колпаков А.И., Эль-Регистан Г И. Роль аутоиндуктора анабиоза микроорганизмов в ингибировании ферментов при развитии покоя // Докл. XI Всеросс. конф. «Ферменты микроорганизмов». Казань. 1998. С.191-200

10. Demkina E.V. Deep Cold Subterranean Layers as Stable Environment for Preservation of Microorganisms // European Union of Geosciences (EUG-10). Strasbourg, France. 1999. P.95

11. Дорошенко E.B., Лойко Н.Г., Демкина E.B., Мултокин А.Л. Изучение регуляции диссоциации культур микроорганизмов на колониально-морфологические варианты // Матер. 1-й Междунар. конф. стран СНГ «Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития». М. 1999. Т.2. С.26-27

12. Мулюкин А.Л., Дорошенко Е.В., Демкина Е.В., Лойко Н.Г., Сорокин В.В. Исследование биоразнообразия покоящихся форм микроорганизмов для повышения эффективности экологического мониторинга // Матер 1-й Междунар. конф. стран СНГ «Молодые ученые - науке, технологиям и профессиональному образованию для устойчивого развития». М. 1999. Т.2.

13. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., Звягинцев Д.Г. Репродуктивные и покоящиеся формы Arthrobacter globiformis II Микробиология. 2000. Т.69. №3. С.377-382

14. Демкина Е.В, Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология. 2000. Т.69. №3. С.383-388

15. Соина B.C., Демкина Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль клеточной дифференциации для сохранения жизнеспособных бактерий в условиях вечной мерзлоты // Консервация и трансформация веществ и энергии в криосфере Земли. Пущино. 2001. С.38

16. Мулюкин А.Л., Демкина Е.В., Козлова А.Н., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и подпочвенных осадочных породах //Микробиология. 2001. Т.70. '5. С.620-627

17. Mulyukin A.L., Soina V.S., Demkina E.V. et al. Formation of Resting Cells by Non-forming Microorganisms as a Strategy of Long-Time Survival in the Environment // Proc. of SPIE. Vol.4939 Instruments, Methods and Missions for Astrobiology VI. SPIE. Bellingham. WA. 2003. P.208-218

18. Soina V.S., Demkina E.V. Specific Character of Bacterial Stability in Earth Permafrost as Indicator of Possible Life Preservation on Extraterrestrial Bodies // Abstracts. Third Workshop on EXO/Astrobiology "Mars: the search for life". Madrid (Spain). 2003. P. 120-121

C.48-50

Принято к исполнению 02/08/2004 Исполнено 04/08/2004

Заказ № 275 Тираж. 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat.ru

¿19358

РНБ Русский фонд

2005-4 16542

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Демкина, Елена Витальевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. РАЗНООБРАЗИЕ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ В КРИОГЕННЫХ ПОЧВАХ И ПОДПОЧВЕННЫХ МЕРЗЛЫХ ОТЛОЖЕНИЯХ

1.1. Микроорганизмы в криогенных почвах

1.2. Микроорганизмы в вечномерзлых подпочвенных отложениях

2. ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-ОТТАИВАНИЯ

НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ БАКТЕРИЙ

2.1. Проблемы «физиологической сухости» и осмотического стресса у бактерий при замораживании

2.2. Факторы, влияющие на устойчивость клеток к замораживанию-оттаиванию

2.3. Устойчивость бактерий вечномерзлых осадочных пород к процессам замораживания-оттаивания

3. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛЕТОК ПРИ АДАПТАЦИИ К ИЗМЕНЯЮЩИМСЯ УСЛОВИЯМ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 44 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ 55 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУР НА СОХРАНЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕРЗЛЫХ ПОДПОЧВЕННЫХ ПОРОД

1.1. Динамика восстановления активности бактерий в процессе таяния образцов

2. ОБРАЗОВАНИЕ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ РОДА ARTHROBACTER

2.1. Выделение и изучение динамики образования аутоиндукторов анабиоза штаммами А. globiformis

2.2. Образование покоящихся форм в циклах развития А. globiformis в условиях дисбаланса по источникам питания и/или энергии

2.3. Образование покоящихся форм А. globiformis в автолизирующихся суспензиях

2.4. Тонкое строение клеток покоящихся форм А. globiformis 115 ВЫВОДЫ 123 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах"

Актуальность работы. Высокая степень сохранения жизнеспособности микробных сообществ в вечномерзлых осадках Арктики и Антарктиды позволяет рассматривать мерзлые толщи как естественную среду, где микроорганизмы, прежде всего бактерии, доминирующие в количественном отношении, реализуют потенциальные возможности устойчивости к продолжительному воздействию холода (Zvyagintsev, 1995). В мерзлых осадках химические и физические свойства органоминеральных комплексов существенно зависят от образования льда, который составляет 92-97% от общего объема водной фазы и обеспечивает условия системы, исключающей фильтрацию воды, а также создает стабильные условия низкотемпературного воздействия на микроорганизмы в естественной среде обитания (Vorobyova et al., 1997; Gilichinsky, 2001).

Проведенные исследования арктических и антарктических мерзлых осадков показали, что среди сохранивших жизнеспособность бактерий преобладают неспорообразующие психротрофные формы (Soina, Vorobyova, 1994; Vorobyova et al., 1996, 1997; Demkina, 1997, 1999; Gilichinsky, 2001), менее чувствительные к повышению температуры, чем строгие психрофилы, что коррелирует со сравнительно быстрым восстановлением их активности после оттаивания мерзлых пород. Большой интерес вызывает механизм переживания бактерий в условиях стабильных отрицательных температур. Образование специализированных покоящихся клеток - спор или цист - в естественном цикле развития культур известно для ограниченного числа родов бактерий. Это согласуется с наблюдениями бактерий в мерзлых осадках in situ в просвечивающем электронном микроскопе, где редко выявлялись типичные споры или цисты, но были широко представлены коринеформные бактерии, что подтверждается результатами высевов на твердые питательные среды (Soina et al., 1995). Вместе с тем, наблюдаемые in situ клетки бактерий в просвечивающем электронном микроскопе (Soina et al., 1995; Soina et al., 1998) по своему строению - утолщенным клеточным стенкам, внешним капсулярным слоям, неоднородной плотности цитоплазмы - могли быть отнесены к покоящимся формам, отличным от вегетативных клеток и похожих на цистоподобные рефрактерные клетки (ЦРК). Такие клетки были получены в лабораторных условиях при модификации условий культивирования и обладали всеми признаками покоящихся форм, но отличались по устойчивости к внешним факторам от типичных эндоспор бактерий (Мулюкин и др., 1996, 1997; Демкина и др., 2000). Ранее проведенные исследования показали, что переход клеток в покоящееся состояние зависит от активности внеклеточного ауторегуляторнош фактора dj с функцией индуктора анабиоза (Осипов и др., 1985). Выявление ЦРК не только у неспорообразующих, но и спорообразующих бактерий (Дорошенко и др. 2001) может свидетельствовать о биоразнообразии покоящихся клеток у микроорганизмов и различиях в их способности и формах торможения метаболической активности в неблагоприятных для роста условиях. В связи с изложенным, актуальным является, с одной стороны, оценка влияния длительного низкотемпературного воздействия в мерзлых осадках на сохранение жизнеспособности бактерий, о чем можно судить по восстановлению пролиферативной активности при оттаивании; с другой, -изучение закономерностей образования и характеристик покоящихся форм у неспорообразующих бактерий, выделенных из мерзлых грунтов. Эти исследования способствуют накоплению методологического опыта в изучении физиологического состояния бактерий в условиях вечной мерзлоты.

Целью работы было изучить особенности реактивации жизнеспособности и структурной устойчивости бактерий из многолетнемерзлых осадков разного возраста, а также исследовать условия образования и характеристики покоящихся форм у не исследованных ранее неспорообразующих бактерий рода Arthrobacter, выделенных из мерзлых грунтов и коллекционных штаммов.

Задачи исследования:

3. Изучение образования и специфических особенностей ауторегуляторного фактора di — аутоиндуктора анабиоза у коллекционных штаммов Arthrobacter globiformis и мерзлотных штаммов.

4. Изучение условий образования покоящихся форм штаммами Arthrobacter globiformis в естественном цикле развития культур и в-автолизирующихся клеточных суспензиях.

5. Изучение ультраструктуры клеток покоящихся форм штаммов Arthrobacter globiformis и выявление общих ультраструктурных особенностей с клетками, наблюдаемыми in situ.

Впервые обнаружено, что неспорообразующие бактерии АгИпгоЪааег продуцируют внеклеточные факторы <1\, обуславливающие переход клеток в анабиотическое состояние. Показана видонеспецифичность действия таких соединений, что подтверждает универсальность ауторегуляции этого типа на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах. Впервые установлено, что в естественном цикле развития погруженных культур в средах с дисбалансом источников питания и/или энергии, а также в условиях спонтанного автолиза плотных клеточных популяций, штаммы АпкгоЪасгег globiformis образуют клетки, которые обладают всеми свойствами покоящихся форм микроорганизмов: сохранением жизнеспособности в течение длительного времени, термоустойчивостью, отсутствием эндогенного дыхания, характерными особенностями ультраструктурной организации. Показано, что продуктивность внеклеточных факторов с1\ и терморезистентность покоящихся форм выше у штаммов АпкгоЪа&ег globiformis, выделенных из мерзлых осадков, по сравнению с коллекционным штаммом, что может рассматриваться как адаптивное преимущество бактерий в подобных биотопах, обеспечивающее повышение их устойчивости к стрессам. Выявлены ультраструктурные особенности клеток, которые могут рассматриваться как «портретные» характеристики бактерий, пребывающих в анабиотическом состоянии в природных субстратах, в том числе и в мерзлых осадках.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 18 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, экспериментальной части, включающей две главы с шестью разделами, выводов и списка литературы из 212 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Текстовая часть работы занимает 130 страниц, иллюстрирована 11 таблицами, 10 рисунками, 7 фотографиями.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Демкина, Елена Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Установлены различия в динамике восстановления колониеобразующей способности бактерий при выделении на питательные среды с разными субстратами из образцов мерзлых отложений и тундровой почвы. Активизация их роста в первые часы таяния образцов мерзлых осадков разного возраста в 3-5 раз превышает таковую по сравнению с почвенным образцом. Длительное воздействие постоянных отрицательных температур не только стабилизирует условия для сохранения функций клеточных систем, но и повышает их активность при оттаивании мерзлых отложений, обеспечивая восстановление жизнеспособности значительному числу бактерий, в том числе неспорообразующим.

3. Неспорообразующие бактерии рода АпкгоЪааег продуцируют внеклеточные факторы ¿¡и обуславливающие переход клеток в анабиотическое состояние. Выделенный из образца многолетнемерзлых отложений штамм обладал большей продуктивностью по синтезу внеклеточного фактора с1\, что может быть обусловлено развитием антистрессовых механизмов при длительном промерзании в природных условиях. Показана видонеспецифичность действия таких соединений, что служит дополнительным доказательством в пользу существования ауторегуляции роста и развития микроорганизмов на уровне межклеточных взаимодействий в микробных сообществах, в том числе и в мерзлых осадках.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Демкина, Елена Витальевна, Москва

1. Абызов С.С. и др. Микрофлора ледника Центральной Антарктики и методы контроля стерильного отбора ледяного керна для микробиологических анализов//Изв. АН СССР. Сер. биол. 1982. 4. С.537-548

2. Абызов С.С., Мицкевич И.Н. и др. О количестве клеток микроорганизмов в глубоких горизонтах ледника Центральной Антарктиды // Микробиология. 1993. Т.62. Вып.1. С.181-188

3. Аксенов С.И. О предельной продолжительности анабиоза у микроорганизмов//Микробиология. 1982. Т.51. 51. С.877-879

4. Артамонова О.И., Красильников H.A. О микрофлоре Антарктиды и Арктики // Труды советской антарктической экспедиции. 1972. Т.60. С.302-316

5. Бабусенко Е.С. Ауторегуляция роста и развития метанокисляющих бактерий / Дисс. канд.биол.наук. М. 1992.157 с.

6. Бабьева И.П., Решетова И.С., Азиева Е.Е. Дрожжи в тундровых мерз-лотно-таежных почвах севера Сибири//Микрофлора почв и водных бассейнов Сибири и Дальнего Востока. Томск. 1976. С. 197-202

7. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Дрожжи в тундровых почвах Таймыра // Почвоведение. 1982. №10. С.60-64

8. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина H.H., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тирозол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces serevisiae // Микробиология. 1993. Т. 62. Вып. 4. С. 633 638.

9. Беккер М.Е. Современные представления об анабиозе микроорганизмов // Торможение жизнедеятельности клеток. Рига, Изд-во Зинатне, 1987. С.11-18

10. Ю.Беккер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов // Рига. Зинатне. 1981

11. Белоус A.M. и др. Криоповреждение мембран // Киев: Наукова думка. 1987. 75 с.

12. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И. Сульфатредуцирующие бактерии в вечномерзлых почвах//Криопедология и глобальные изменения. Пущино. 1992. С.202-206

13. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И., Хиппе X. Сульфатвосстаноавливающая бактерия из вечной мерзлоты // Микробиология. 1995. Т.64. Вып.4. С.514-518

14. Вельков В.В. Новые представления о молекулярных механизмах эволюции: стресс повышает генетическое разнообразие // Молекулярная биология. 2002. Т.36. №2. С.277-285

15. Вишнивецкая Т.А. Зеленые водоросли и цианобактерии как компонент микробных сообществ вечномерзлых отложений Арктики и Антарктиды // Автореф. канд. биол. наук. Пущино. 2002. 24 с.

16. Вишневецкая Т.А., Ерохина Л.Г., Гиличинский Д.А., Воробьева Е.А. Синезеленые и зеленые водоросли из вечномерзлых осадочных пород Арктики // Криосфера Земли. 1997. Т.1. №2. С.71-76

17. Воробьева Е.А., Гиличинский Д.А., Соина B.C. Жизнь в криосфере: взгляд на проблему // Криосфера Земли. 1997. Т.1. №2. С.60-67

18. Воробьева Е.А., Соина B.C. и др. Сравнительная оценка биологической активности в тундровых почвах и вечномерзлых породах//Криопедология и глобальные изменения. Пущино. 1992. С.222-225

19. Гиличинский Д.А. Возраст палеомикроорганизмов криобиосферы // Труды 2-го съезда геокриологов России. М. 2001. Т.4. С.27-34

20. Гиличинский Д.А. Криобиосфера позднего кайнозоя: вечная мерзлота как среда сохранения жизнеспособных микроорганизмов // Автореф. . д-ра г.-м. наук. Тюмень. 2002. 59 с.

21. Гиличинский Д. А., Звягинцев Д.Г., Хлебникова Г.М. и др. Микробиологический подход к изучению развития мерзлых толщ // Геокриологические исследования. МГУ. 1989. С.221-231

22. Гиличинский Д.А., Федоров-Давыдов Д.Г. и др. Влияние криогенеза на микробные сообщества почв // Геокриологические исследования. 1991. МГУ. С.158-180

23. Гиличинский Д.А., Воробьева Е.А. и др. Микробиология вечной мерзлоты // Тр. 1-го съезда геокриологов России. МГУ. 1996. 4.1. С.78-93

24. Головлев E.JI. Другое состояние неспорулирующих бактерий // Микробиология. 1998. Том 67. №6. С.725-735

25. Голышин П.Н., Комбарова С.П., Рябченко Н.Ф. и др. Внеклеточные щелочные рибонуклеазы бацилл вечномерзлых грунтов Колымской низменности // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. Т.29. Вып.6. С.844-850

26. Демкина Е.В. Бактерии мерзлых подпочвенных отложений: возможные пути адаптации к температурному фактору.// Тезисы докладов 2ой международной конференции "Криопедология-97", Сыктывкар, 1997. С. 188.

27. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. // Микробиология. 2000. Т.69. Вып. 3. С.383-388.

28. Демкина Е.В., Соина B.C., Звягинцев Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Репродуктивные покоящиеся формы Arthrobacter globiformis I I Микробиология. 2000. Том 69. №3. С.377-382

29. Дмитриев В.В., Гиличинский Д.А., Файзутдинова Р.Н. и др. Дрожжи в вечномерзлых отложениях Сибири // Криосфера Земли. 1997. №2. С.67-71

30. Добровольская Т.Г., Лысак J1.B. Бактериальные сообщества тундровых почв района Диксона/УБиологические проблемы Севера. Сыктывкар. 1981. Ч.1.С.28

31. Добровольская Т.Г. и др. Методы выделения и идентификации почвенных бактерий//МГУ. 1989

32. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н. и др. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. T.70. №6. С.811-819

33. Дуда В.И., Пронин C.B., Эль-Регистан Г.И., Капрельянц A.C., Митюшина Л.Л. Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под воздействием ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1982, Т. 51. Вып.1. С. 77-81.

34. Ермакова М.Т., Шнырова В.А., Головлев Е.А. Взаимосвязь между скоростью роста и дыханием Rhodococcus minimus II Микробиология. 1990. Т.59. Вып.4. С. 558-564

35. Ерохина Л.Г., Вишнивецкая Т.А., Гиличинский Д.А. Состав и содержание фикобилиновых пигментов в клетках древнихжизнеспособных цианобактерий из вечной мерзлоты Арктики // Микробиология. 1998. Т.67. Вып.6. С.682-687

36. Ершов Е.Д. и др. Механизмы криогенных процессов в мерзлых осадках // Микроструктура мерзлых пород. М.: МГУ. 1988. С.6-38

37. Жизнь микробов в экстремальных условиях // Под. ред. Кашнера Д. М.: Мир. 1981.520 с.39.3вягинцев Д.Г. Почва и микроорганизмы. 1987. М.: Изд-во МГУ. 255 с.

38. Звягинцев Д.Г. и др. Методы почвенной микробиологии и биохимии // МГУ. 1991.228 с.

39. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А. и др. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002. Т.71. №1. С.23-29

40. Калакуцкий J1.B. Сохранение жизнеспособности микроорганизмами в природе и основные подходы к консервации лабораторных культур // Торможение жизнедеятельности клеток. Рига, Изд-во Зинатне, 1987. С.19-31

41. Калакуцкий JI.B., Агре Н.С. Развитие актиномицетов. // М. Наука. 1977. 286 с.

42. Каляев A.B. Об анабиозе в условиях вечной мерзлоты//Микробиология. 1947. Т.16. 2. С.121-126

43. Карасев С.Г., Гиличинский Д.А., Евтушенко Л.И. Жизнеспособные актинобактерии из древних вечномерзлых отложений Сибири // Криосфера Земли. 1998. Т.2. №2. С.69-75

44. Квасников Е.И., Писарчук E.H. Артробактер в природе и производстве.// 1980, Киев, "Наукова думка".С. 19-21

45. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир. 1975. С.322.

46. Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е., Карасев С.Г. и др. Микромицеты Арктики и Антарктики в условиях многолетней естественной криокорсервации // Микробиология. 2001. Т.70. №3. С.412-420

47. Крисс А.Е. О микроорганизмах в вечной мерзлоте//Микробиология. 1944. Т. 13. Вып.5. С.789

48. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю. и др. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum II Микробиология. 2003. T.72. №3. C.328-337

49. Лысак Л.В. Психрофильные микробактерии в почвах ТаймыраУ/Вестник МГУ. Сер. почвоведение. 1975. №2. С. 15-21

50. Мешкова Н.В. Микробиологические и биохимические исследования почв и пород зоны вечной мерзлоты // Автореф. . канд. биол. наук. М. 1991. 24 с.

51. Мишустин E.H. Почвенные организмы как компоненты биогеоценоза // М.: Наука. 1984

52. Мишустин E.H., Мирзоева В.А. Микрофлора северных почв//Проблемы Севера. М.-Л. 1964. Вып.8. С.170-199

53. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм неспороообразующими микроорганизмами // Автореф. канд.биол.наук. М. 1998. 26 с.

54. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus // Микробиология. 1996а. Т. 65. Вьш.1. С.20-25.

55. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н. Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus //Микробиология. 19966. Т.65. Вып. 6. С.782-789

56. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Бабусенко Е.С., Козлова

57. A.Н. Дужа М.В., Митюшина Л.Л., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм в автолизирующихся суспензиях микроорганизмов//Микробиология. 1997. Т.66. Вып.1 С.42-49

58. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г. и др. Сравнительное изучение элементного состава вегетативных и покоящихся клеток микроорганизмов // Микробиология. 2002. Т.71. №1. С.37-4862.0сипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда

59. B.И., Капрельянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava.// Микробиология. 1985. Т. 54. Вып.2. С. 186-190.

60. Паников Н.С., Зеленов В.В. Эмиссия СО2 и СН4 из северных болот в атмосферу: динамика, влияние экотопических факторов и возможныемеханизмы регуляции//Матер. 1-й Междунар. конф. по криопедологии. Пущино. 1992. С. 174-181

61. Паринкина О.М. Биологическая актавность почв Западного Таймыра // География, генезис и плодородие почв. JI. 1971. С.58-76

62. Паринкина О.М. Микрофлора почв подзоны арктических тундр Таймыра //Почвоведение. 1984а. №9. С.61-69

63. Паринкина О.М. Адаптивные особенности почвенных микроорганизмов в условиях Арктики//Адаптация организмов к условиям Крайнего Севера. Таллинн. 19846. С.125-129

64. Паринкина О.М. Микрофлора почв Арктики и ее активность/АГеория почвенного криогенеза. Пущино. 1989. С.79-80

65. Пучков Е.О., Говорунов И.Г. Повреждения мембран бактерий при низкотемпературном анабиозе // Торможение жизнедеятельности клеток. Рига, Изд-во Зинатне, 1987. С. 144-155

66. Пучков Е.О., Говорунов И.Г. Проблемы криоконсервации бактериальных культур. Пущино, 1983. С.45

67. Раськова Н.В. Ускоренный метод определения карбогидраз (амилазы и инвертазы) в почве // Вестник Московского университета, сер. 17 почвоведение. 1981. №3. С.41-46

68. Ривкина Е.М., Самаркин В.А., Гиличинский Д.А. Метан в мерзлых образцах Колымской низменности // Доклады АН СССР, 1992. 323, 559562

69. Ривкина У.М., Лауринавичус К.С. Метанообразование в вечной мерзлоте // Тезисы докладов Международной конференции «Консервация и трансформация вещества и энергии в криосфере Земли». 2001. Пущино. С.21

70. Рост П.Е., Хлебникова Г.М. и др. Численность и роль микроорганизмов в грунтах//Инженерная геология. 1982. 6. С.72-78

71. Рубан Е.Л. Хранение культур микроорганизмов//Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т.25. Вып.З. С.291-301

72. Сидякина Г.М. Консервация микроорганизмов//Пущино. 1985. С.32

73. Соина B.C., Воробьева Е.А., Мешкова Н.В. Ультраструктура и выживаемость клеток микроорганизмов после длительной криоконсервации в вечной мерзлоте // Криопедология и глобальные изменения. Пущино. 1992. С.80-81

74. Соина B.C., Дорофеев А. Г., Паников Н.С. Особенности строения клеток почвенных бактерий в условиях лимитированного роста.// Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Цитология микроорганизмов", 1984, Пущино, С.62-63

75. Соина B.C., Лебедева Е.В., Голышина О.В. и др. Нитрифицирующие бактерии из многолетнемерзлых отложений Колымской низменности // Микробиология. 1991. Т.60. Вып.1. С. 187-190

76. Соина B.C., Воробьева Е.А., Мамукелашвили А., Демкина Е.В., Звягинцев Д.Г., Гиличинский Д.А. Вечная мерзлота как фактор, обеспечивающий сохранение разнообразия микроорганизмов в природе //Консервация генетических ресурсов. Пущино. 1999. С.64-72

77. Сушкина H.H. Об особенностях микрофлоры арктических почв // Почвоведение. 1960. №4. С.75-83

78. Торможение жизнедеятельности клеток // Под. ред. Беккера М.Е. Рига: Зинатне. 1987.237 с.

79. Хлебникова Г.М. Сравнительная характеристика биологической активности почв и подпочвенных осадочных пород//Автореф. дисс. . канд. биол. наук. МГУ. 1980.24 с.

80. Хлебникова Г.М., Гиличинский Д.А. и др. Количественная оценка микроорганизмов в многолетнемерзлых отложениях и погребенных почвах//Микробиология. 1990. Т.59. 1. С.148-154

81. Худяков Я.П. Периодичность микробиологических процессов в почве и ее причина // Вопросы численности, биомассы и продуктивности почвенных микроорганизмов. Л.: Наука .1972. С. 89-105.

82. Цуцаева A.A., Сафонова Т.С. и др. Влияние низких температур (-196°С) и криопротекторов на некоторые виды бактерий // Микробиология. 1978. Т.47. №3. С.446-449

83. Шарая Л.С., Турина Л.В. Выделение анаэробных актиномицетов из образцов вечной мерзлоты. // Тезисы докладов 1-ой международной конференции «Криопедология», 1992 , Пущино. С. 77-78

84. Шольц К.Ф., Островский Д.Н. Ячейка для амперометрического определения кислорода.//Методы современной биохимии. М.: Наука, 1975. С.52-58.

85. Шраго М.И. Криоконсервадия особое состояние жизни // Торможение жизнедеятельности клеток. Рига, Изд-во Зинатне, 1987. С.120-128

86. Эль-Регистан Г.И. Роль мембранотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов // Дисс. . д-ра биол.наук. М. 1988. 507 с.

87. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Типисева И.В. Динамика ауторегуляторных факторов d в периодических культурах Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus // Микробиология. 1983. Т. 52. Вып.2. С.238-243

88. Achwood-Smith M.J. Effects of low temperatures on microorganisms, plants and cold-blooded animals // Current trends in cryobiology. 1970. Plenum Press. New-York-London. P.5-43

89. Alur M.D., Grecz N. Mechanism of injury of E.coli by freezing and thawing // Biochem. Biophys. Research Communications. 1975. Vol.62. 1. P.308-312

90. Bae H.S., Cota-Robles E., Casida E.J. Microflora of soil as viewed by transmission electron microscopy //Appl. Microboil. 1972. 23. P.637-648

91. Baker J.H., and Smith D.S. The bacteria in in an Antarctic peat. // J. of Applied Bacteriology, 1972. 35: 589-596

92. Baker J.H. et al. Effect of nutrient deprivation on Vibrio cholerae II Appl. Env. Microbiol. 1983. Vol.46. No.4. P.930-940

93. Bakken, L.R. and Olsen, R.A., The relationship between cell size and viability of soil bacteria // Microb. Ecol. 1987. Vol. 13, No. 2. P.103-114.

94. Baross I.A., Morita R.I. Microbial life at Ion temperatures/ZMicrobial life in extrem environments. Ed. by D.I.Kushner. london New-Iork. 1978. P.21-49

95. Boyd W.L., et al. Ecology of soil microorganism of Antarctica // Antarctic Res. Ser., 1966. 8. P.125-159

96. Boyd W.L., Rothenberg, I., and Boyd J.W. Soil microorganisms at Paradise Harbor//Antarctica Ecology, 1970.51: 1040-1045

97. Cacciari I., Lippi D. Arthrobacters: successful arid soil bacteria. A review .//Arid Soil Research and Rehabilitation, 1986, Vol.1. P.l-30

98. Calcott P.H., Gargett A.M. Mutagenicity of freezing and , thawing // FEMS Microbiol. Lett. 1981. V.10. 2. P.151-155

99. Calcott P.H., MacLeod R.A. The survival of Escherichia coli from freeze-thaw damage: permeability barrier damage and viability // Can. J. Microbiol. 1975.21. P.1724-1732

100. Calcott P.H., Rose A.H. Freeze-thaw and cold shock resistance of saccharomyces cerevisiae as affected by plasma membrane lipid composition // J. Gen. Microbiol. 1982. V.128. No.3. P.549-555

101. Campbell I.B., and Claridge, G.C. Antarctica: Soils, Wearthering processes and Environment. Elsevier Science Publishers, 1987. Amsterdam, 368 p.

102. Cameron, RE., King ,J., and David, C.N. Microbiology, eclogy and microclimatology of soil sites in dry valleys of Southern Victoria Land, Antarctica. In: M. Holgate (ed) Antarctic ecology, 1970a. vol. 2, p.p.702-716

103. Cameron , RE., Hanson, R.B., Lacy, G.N., and Morelli, F.A. Soil microbial and ecological investigations in the Antarctic interior. // Antarctic J. of the United States, 19706. 5: 87-88

104. Cameron, RE. Antarctic soil microbial and ecological investigations. // In: L.O.Quam and H.D.porter 9eds), Research in the Antarctic. American association for the advancement of science, 1971. Washington, D.C., p 137-189

105. Cameron R.F. et al. Bacterial species in soil and air of the Antarctic Continent //Antarctic J.U.S. 1972. 7. P. 187-189

106. Carpenter J.F., Crowe J.H. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes.//Cryabiology. 1988. V.25. 3. P.244-255

107. Carpenter J.F., Crowe J.H. The mechanism of cryoprotection of proteins by solutes.//Cryabiology. 1988. V.25. 3. P.244-255

108. Caughey R.C., Miller M.A. Ruthenium tetroxide fixation comparison of bacteria surface ultrastructure.// Proceedings of the 44th Annual Meeting of the Electron Microscopy Society of America. 1986. P.256-257.

109. Colwell R.R., Brayton P.R. et al. Viable but nonculturable Vibrio choleare and related pathogens in the enviroment // Bio/Technology. 1985. Vol.3.P.817-820

110. Crombach W.H.J. Deep freezing of bacterial DNA for thermal dena-turation and hybridization experements // Antonie van Leeuwehoeck. 1973. V.39. 2. P.249-255

111. Dawid W., Gallikowskii C.A., and Hirsh P. Psychrophilic myxobacteria from Antarctic soils. // Polarforschung, 1988. 58: 271-278

112. Demkina E.V. Bacteria from Permafrost Sediments: Possible Ways of Adaptation to Temperature Factor // 2nd International Conference «Cryopedology-97». Syctyvkar, Russia. 1997. P.95

113. Demkina E.V. Deep Cold Subterranean Layers as Stable Environment for Preservation of Microorganisms // European Union of Geosciences (EUG-10). Strasbourg, France. 1999. P.95

114. Druce R, Thomas S.B. An ecological study of psychrotrophic bacteria of soil, water, grass and hay//J. Appl. Bacteriol. 1970. V.33. P.420-435

115. Ensign, J.C. Long-term starvation survival of rod and spheical cells of Arthrobacter crystallopoietes. //J.Bacteriol., 1970.103, p.p. 569-577.

116. Flanagan P., Bunnell F.L. Microflora activities and decomposition//Antarctic ecosystem. 1980. P.291-334

117. Folk RL., Lynch F.L. Nannobacteria are alive on Earth as well as Mars // Proceedings of SPIE. 1997. Vol.3111. P.406-419

118. Franks F., Mathias S.F., Hatley RV. Water temperature and life // Life of Low Temperatures. 1990. Phil. Trans. R Soc. London. P.517-534

119. FriedmannE.I. Antarctic microbiology. Wiley-Liss. 1993. P.634

120. Friedmann E.I. Permafrost as microbial habitat // Viable microorganisms in permafrost/ Ed. Gilichinsky D.- Отдел научно-технической информации ПНЦ РАН, Пущино. 1994. С.21-26.

121. Friedmann E.I., Gilichinsky D.A et al. Viable bacteria, methane and high ice content in Antarctic permafrost: relevance to Mars //11 Intern. Conf. On the Origin of Life. Orleans. 1996. P.51

122. Gannon I.N. et al. Relationship between cell surface properties and transport of bacteria through soil//Appl. and Environ. Microbial. V.57. 1. P. 190-193

123. Gilichinsky D.A. Permafrost model of extraterrestrial habitat // Astrobiology. 2001. Chapter 9. Springer-Verlag. P.271-295

124. Gilichinsky D.A. Permafrost as microbial habitat // Encyclopedia of Enviromental Microbiology. Willey. 2002. P.932-956

125. Gilichinsky D.A., Soina V.S., Petrova M. Cryoprotective properties of water in the Earth cryolithosphere and its role in exobiology // Origins of life and evolution of the biosphere. 1993. 23.P.65-75

126. Gilichinsky D.A., Vorobyova E.A., Erokhina L.G., Fyodorov-Davydov D.G., Chaikovskaya N.R. Long-term preservation of microbial ecosystems in permafrost.//Adv. Space Res. 1992. Vol.12. No.4. P.255-263

127. Gilichinsky D.A., Wagener S. Microbial life in permafrost./ Ed. Gilichinsky D.- Отдел научно-технической информации ПНЦ РАН, Пущино. 1994. Р.7-20

128. Gilichinsky D.A., Wagener S., Vishnivetskaya Т.A. Permafrost microbiology // Permafrost and Periglacial Processes. 1995. Vol.6. P.281-291

129. Gilichinsky D.A., Shatilovich A., Vishnivetskaya T. et al. How long the life migth be preserved? The terrestrial permafrost model for Astrobiology // The bridge between Big Bang and Biology. 2001. Italy. P.362-369

130. Glauert A.M. Fixation, dehydration and emledding of biological specimens // Bactial Methods in Electron Microscopy. 1980. North Holland Publishing Co. Amsterdam. P.324-350

131. Graham L.L., Beveridge T.J. Evaluation of freeze-substitution and conventional embedding protocols for routine electrone-microscopic processing of eubacteria // J. Bacteriol. 1990. 172. P.2141 -2149

132. Gugi B. et al. Effects of grouth temperature on several exported enzyme activities in the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens // J. Bacteriology. 1991. V.173.12. P.3814-3820

133. Haest C. et al. Fragility of the permeability barrier of Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1972. 208. 1. P.43-53

134. Harris R.F. Effect of water potential on microbial growth and activity // Water Potential Relations in Soil Microbiology. 1981. Magison. Wisconsin. P.31-45

135. Heckly RJ. Preservation of microorganisms // Adv. Appl. Microbiol. Acad. Press. N.-Y. 1978. 24. P. 1-53

136. Jansen H., Bock E. Profiles of ammonium, nitrite and nitrate in the permafrost soils// In: "Viable microorganisms in permafrost" Puschino, 1994, p. 27-36

137. Johnson R.M., Madden J.M., and Swafford J.R. Taxonomy of Antarctic bacteria from soils and air primarily of the McMurdo Station and Victoria Land dry valley region // Antarctic Research Series, 1978. 30: 35-64

138. Kajander E.O. et al. Nanobacteria from blood, the smallest culturable autonomously replicating agent on Earth // Proceedings of SPIE. 1997. Vol.3111. P.420-428

139. Kappen L., and Friedmann E.I. Ecophysiology of lichens in the dry dry valleys of Southern Victoria Land, Antarctica. II C02 gaf exchange in cryptoedjlithic lichens // Polar Biology, 1983. 1, p 227-232

140. Klotz I.M. Comparison of molecular structure of proteins: Helix content, distribution of apolar residues // Arch. Biochem. Biophys. 1970. 138. 4. P.704-706

141. Kocur, M. and Padova, Z. The taxonomic status of Micrococcus roseus Flugge 1886 // Int. J. Syst. Bacteriology. 1970. Vol.20. No.3. P.233-240.

142. Kolbel-Boclke I. et al. Microbial Ecology. 1988. V.16. 1. P. 17-29

143. Kozubek A., Pietr S.P., Czerwonka A. Alkylresorcinols are abundant lipid components in different strains of Azotobacter chroococcum and Pseudomonas spp. // J. Bacteriol. 1996. Vol.178. No.14. P.4027-4031

144. Kjelleberg, S., Hermansson, M., MBrden, P., and Jones, G.W., The transient phase between growth and nongrowth of heterotrophic bacteria, with the emphasis on the marine environment.// Ann. Rev. Microbiol. 1987. Vol.41. P.25-49

145. Larkin J/M, and Stokes J.L., 1968. Growth of psychrophilic organisms at subzero temperatures Canadian // J. of Microbiol., 1968. 14: 97-101

146. MacLeod R., Calcott P.H. Cold shock and freezing damage to microbes // The Survival of Vegetative Microbes. 1976. Cambridge Univ. Press. P.81-110

147. Marxen J. Investigations into the number of respiring bacteria in groundwater from sandy and gravelly deposits//Microbial Ecol. 1988. V.16. 1. P.65-72

148. Mazur P. Limits to life at low temperatures and at reduced water contents and water activities // Origins of life. 1980. 10. 2. P.137-159

149. McDougald, D., Rice, S.A., Weichart, D., and Kjelleberg, S., Nonculpability: adaptation or debilitation? // FEMS Microbiol. Ecol. 1998. Vol.25. P. 1-9

150. McGrath J., Wagner S., Gilichinsky D. Cryobiological studies of ancient microorganisms isolated from the Siberian permafrost // Viable Microorganisms in Permafrost. 1994. Puschino. P.48-67

151. McKay C.P., Friedmann E.I. The cryptoendolythic microbial environment in the antarctic cold desert: temperature variations in nature// Polar Biol. 1985. V.4. P.19-25

152. Moiroud A., Gounot A.-M. Sur une bacterie psychrophilile obligatoire isolee de limons glaciaries // Comp. Rend. Acad. Sci. Paris. 1969. 269. P.2150-2152

153. Morita, R.Y. Bioavailability of energy and its relationship to growth and starvation survival in nature //Can.J.Microbiol. 1988. Vol.34. No. 4. P.436 -441.

154. Morris G.J., Clark A. The cryopreservation of Chlorella. Accumulation of lipid as a protective factor // Arch. Microbiol. 1978. 119.2. P. 153-156

155. Morris G.J., McGrath J.J. Intracellular ice nucleation and gas buble formation in Spirogyra // Cryo-Letters. 1981.2. P.341-352

156. Mulyukin, A., Suzina, N., Sorokin, V., Soina, V., Vorobyova, E., Duda, V., El-Registan, G. Dormant State in Bacteria: Conceptions and Implications for Terrestrial Biogeoscience and Astrobiology. Geophysical Research Abstracts, Vol. 5,2003

157. Naganuma T. et al. Immediate effect of freezing on the viability of a Bacillus strain isolated from deep-sea sediment/ZBull. Jap. Soc. Micribiol. Ecol. 1992. V.7.2. P.63-67

158. Nei T. et al. Freezing injury to aerated and non-aerated cultures of E.coli // Freezing and drying of microorganisms // Tokyo. 1969. P.3-15

159. Nelson L.M., Parkinson D. Effect of freezing and thawing on survival of three bacteria isolated from an Arctic soil // Can. J. Microbiol. 1978. 24. P. 1468-1474

160. Nissenbaum A., Serban A. Enzymatic activity associated with humic substances with humic substances in deep sediments from the Cariaco Trench and Walvis Ridge//Geochim. et comochim acta. 1987. V.51. No.2. P.373-378

161. Ostroumov V.E., Siegert C. Exobiological aspects of masstransfer in micro volumes of permafrost deposits // Advances Space Research. 1996. V.18. No. 12. P.79-86

162. Ostroumov V., Hoover R., Ostroumova N. et al. Redistribution of soluble components during ice segregation in freezing ground // Cold Regions Science and technology. 2001. 32. P. 175-182

163. Robert M., and Chenu C. Interactions between soil minerals and microorganisms // In: Soil Biochemistry. 1992. Ed. by Stozky G. and Bolag J.M., Marcell Dekker Inc., 7, p. 307-404.

164. Ponder M., Vishnivetskaya T et al. Survival of permafrost isolates at cold temperatures // 9 Intern. Symp. On Microbial Ecology. Amsterdam. 2001. P.26

165. Ramsay A.J., and Stannard R.E. Numbers and viability of bacteria in ornithogenic soils of Antarctica. // Polar Biology, 1986. 5: 195-198

166. Ray B. Reversible freeze-injury // Repairable lesions in microorganisms. 1984. Academic Press. London. P.237-270

167. Rivkina E., Friedman I., McKay C., Gilichinsky D. Microbial activity of permafrost bacteria below the freezing point // Applied and Environmental Microbiology. 2000. Vol.66. No. 8. P.3230-3234

168. Rivkina E., Gilichinsky D., Wagner S., Tiedje J., McGrath J. Biogeochemical activity of anaerobic microorganisms from buried permafrost sediments // Geomicrobiology. 1998. No.15. P.187-193

169. Robert M., Chenu С. Interactions between soil minerals and microorganisms // Soil Biochemistry. 1992. Marcel Dekker Inc. New-York. P.307-404

170. Roszak, D.B. and Colwell, R.R., Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol.Rev. 1987. Vol.51. No.3. P.365-379

171. Roszak, D.B. and Colwell, R.R., Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count // Appl. Env. Microbiol. 1987. Vol. 53. No. 12. P.2889-2893

172. Shi Т., Reevs R., Gilichinsky D., Friedmann E.I. Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing // Microbial Ecologe. 1997. No.33. P.169-179

173. Skogland T. et al. Respiratory burst after freezing and thawing of soil: experiments with soil bacteria//Soil Biol, and Biochemistry. 1988. V.20. 6. p.851-856

174. Sidyakina T.M., Lozitskaya N.D., Dobrovolskaya T.G., Kalakoutskii L.V. Cryopreservation of various types of soil bacteria and mixtures thereof// Cryobiology. 1992. V. 29. P.274-280.

175. Soina V.S., Vorobyova E.A. Preservation of microbial cell structures in the permafrost // Viable microorganisms in permafrost.// Ed. Glichinsky D.-Отдел научно-технической информации ПНЦ РАН, Пущино. 1994. Р.37-48

176. Soina V.S., Vorobyova Е.А. et al. Preservation of cells in permafrost: a model for exobiology.//Adv. Space Res. 1995. V.14. No.6. P.138-146

177. Soina V.S., Vorobyova E.A., Zvyagintsev D., Gilichinsky D. Preservation of cells in permafrost a model for exobiology.// Adv. Space Res.1995. V.15. 3. P.237-242

178. Soina V.S., Vorobyova E.A. Role of cell differentiation in high tolerance by procaryotes of long-term preservation in permafrost.// Adv. Space Res.1996. Vol.18. No.12. P.97-101

179. Soina V.S., Demkina E.V., Zvyagintsev D.G., El-Registan G.I. Ultrastructural investigation of dormant cells of non sporeforming bacteria isolated from permafrost // 32 COSPAR. Nagoya. 1998. P.439

180. Soina V.S., Vorobyova E.A. et al. Viable ancient permafrost yeast //10 Intern. Symp. On Yeast. Arnhem. 2000. P. 140

181. Stastna Y., Goodfellow M., Kristufek V. et al. Characteristics Streptomyces globisporus strain 0234 A forming Euclospores in submerged cultures // Folia Microbiology. 1992. V.37. P.l 11-116

182. Stevenson J. L. Some observations on socalled "cystites" of the genus Arthrobacter.// Can. J. Microbiol. 1963. Vol.9. No.4. P.467-472

183. Straka RP., and Stokes J.L. Psychropfilic bacteria from Antarctica. // J. Bacteriology, 1960. 80, p. 622-625.

184. Sundman V. Morphological comparison of some Arthrobacter species.// Can. J. Microbiol. 1958. Vol.4. No.3. P.221-336

185. Tiedje J.M., Smith G. et al. Recovery of DNA, denitrifiers and patterns of antibiotic sensitivity in microorganisms from ancient permafrost soils of Eastern Siberia// Viable Microorganisms in Permafrost. Pushchino. 1994. P.83-98

186. Tiedje J.M., Petrova M.F., Moyer C. Phylogenetic diversity of archaea from ancient Siberian permafrost // 8 International Simposium on Microbiol Ecology. Halifax. Canada. 1998. P.323

187. Tiedje J.M., Vishnivetskaya T. et al. Phylogenetic and phenotypic analysis of microorganisms recovered from ancient Siberian permafrost // Conservation and Transformation of the Matter and Energy in the Earth Cryosphera. Pushchino. 2001. P.39

188. Tluscik, F., Kozubek, A., and Mejbaum-Katzenellenbogen,W. Alkylresorcinols in rye (Secale cereale L.) grains.// Act. Soc. Bot. Pol. 1981. Vol.54. No.7. P.645-651

189. Vestal, J.R. Carbon metabolism of cryptoendolithic microbiota from the Antarctic desert. Appl. Environmental Microbiol., 1988. 54, p. 960-965.

190. Vishniac W.V., and Mainzer S.E. Soil microbiology studied in situ in the dry valleys of Antarctiva. // Antarctic J. of the United States, 1972. 7: 8889

191. Vishniac H.S. The microbiology of Antarctic soils. In: E.J. Friedmann (ed) Antarctic Microbiology, 1993. p.p. 297-341, Wiley-Liss, Inc

192. Vishnivetskaya T., Erokhina L. et al. Ancient viable green algae and cyanobacteria from permafrost // Algae and Extreme Environments. 2001. Nova Hedwigia Beiheft. V.123. P.427-441

193. Vishnivetskaya T., Kathariou S., McGrath J., Gilichinsky D., Tiedje J. Low temperature recovery strategies for isolation of bacteria from ancient permafrost sediments // Extremophiles. 2000. V.4. No.3. P. 165-173

194. Vorobyova E., Soina V., Gorlenko M., Minkovskaya N., Zalinova N., Mamukelashvili A., Gilichinsky D., Rivkina E., Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: facts and hypothesis.// FEMS Microbiology Reviews. 1997. Vol.20. P.277-290

195. Vorobyova E., Soina V., Minkovskaya N. et al. Microorganisms and biomarkers in permafrost // Permafrost response on economic development, environment security and natural potential. NATO-series. 2001. P.527-542

196. Vorobyova E.A., Soina V.S., Mulukin A.L. Microorganisms and enzyme activity in permafrost after removing of long-term cold stress // Advances Space Research. 1996. 18.P.103-108

197. Vorobyova E.A., Gilichinsky D.A., Soina V.S. et al. Deep cold biosphere: facts and hypothesis // FEMS Microbiological Reviews. 1997. Vol.20. 3-4. P.277-290

198. Widden P., and Parkinson D. Populations of fungi in a gigh Arctic system. // Canad. J. of Botany, 1979. 57, p.p. 2408-2417

199. Wilson G.J., Barron A. et al. A repositoiy for Antarctic glacio-climatic history anatomy of the Mounth Feather Dimiction, southern Victoria Land, Antarctica // PALEO. 2001.4. P. 120-131

200. Winn-Williams, D.D. Ecological aspects of Antarctic microbiology. // Advances in microbial Ecology, 1990. 11, p 71-146

201. Zvyagintsev D.G. Microorganisms in permafrost // Phisiology and general biology reviews. Vol.9. 1995. P. 1-40

Информация о работе

Демкина, Елена Витальевна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Выживание неспорообразующих бактерий в вечномерзлых осадочных породах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы