Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем

Печерицына, Светлана Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем"

□ОЗ164164

На правах рукописи

ПЕЧЕРИЦЫНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

МИКРООРГАНИЗМЫ ИЗ ПЕРЕОХЛАЖДЕННЫХ ВЫСОКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ.

03 00 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2007

003164164

Работа выполнена в лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН и в Путинском государственном университете, г Пущино

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор В К Акименко

Официальные оппоненты

доктор биологических наук ВН Хмеленина

доктор биологических наук ЕА Бонч-Осмоловская

Ведущая организация Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Защита состоится <&£ » октября 2007 г вс£^час на заседании

Диссертационного совета Д 002 121 01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН по адресу 142290, г Пущино Московской области, проспект Науки, д 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им Г К Скрябина РАН

Автореферат размещен на сайте http //www lbpm ru

Автореферат разослан <c?y»£6t*r-iftJ007 г

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

Вагабов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Микробиологические исследования последних лет убедительно показали, что в вечной мерзлоте содержатся жизнеспособные микроорганизмы, и об этой части литосферы правомерно говорить как о «криобиосфере» (Vorobyova et al, 1997) Численность микроорганизмов в вечномерзлых породах Арктики и Антарктики составила 103-10s кл/г (Rivkina et al, 1998, Cowan et al, 2002, Gxlichmsky et al, 2002, Steven et al, 2004, Gilichinsky et al, 2007) Из проб вечномерзлых грунтов были выделены чистые культуры актиномицетов ( Gavnsh et al, 2003), нитрифицирующих бактерий (Соина и др, 1991), метанотрофов (Хмеленина и др, 2002), сульфатредукторов (Вайнштейн и др , 1995), зеленых одноклеточных водорослей и цианобактерий (Vishmvetskaya et al, 2001), меганогенных архей (Rivkma et al, 2007) Многие изоляты и смешанные популяции проявляли метаболическую активность при отрицательных температурах (Ривкина и др, 2002, Хмеленина и др, 2002, Bakermans et al, 2003, Gilichmsky et al, 2003) Исходя из того, что в вечной мерзлоте находится огромное количество микробной биомассы, вклад микроорганизмов криобиосферы может быть очень значительным для глобального круговорота веществ, и все еще остается неучтенным (Rivkma et al, 2004) Кроме того, выживание микроорганизмов в условиях вечной мерзлоты поднимает вопрос о механизмах адаптации клетки к условиям местообитания, а также о существовании временного предела сохранения жизни Решить последнюю проблему экспериментально или при помощи моделирования невозможно С этой точки зрения многолетнемерзлые отложения являются уникальным объектом, позволяющим наблюдать результат криоконсервации в течение геологического времени Большинство планет Солнечной системы имеет криогенный характер, то есть физико-химические условия на них наиболее близки к условиям криосферы Земли Поэтому вечномерзлые грунты представляют собой модель такого внеземного местообитания для живых организмов (Гиличинский, 2002)

Криопэги (отрицательнотемпературные рассолы внутри вечной мерзлоты) являются водными системами морского происхождения Было показано, что микробное сообщество криопэгов Колымской низменности способно окислять 14С-глюкозу при отрицательных температурах вплоть до -15°С (Gilichinsky et al, 2003) К началу нашей работы состав микробных сообществ, населяющих криопэги и способных проявлять метаболическую активность при столь низких температурах, оставались неизвестными

Цель и задачи исследования В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было исследование состава микробных сообществ и особенностей биологии изолятов, связанных с адаптацией к условиям криопэгов

Для достижения цели решались следующие задачи

1 Определение численности микроорганизмов в образцах криопэгов Колымской низменности и Варандейского полуострова

2 Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий, изучение их физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения изолятов

3 Изучение особенностей роста изолятов при отрицательных температурах и высокой солености

4 Изучение изменения биохимического состава клеток в ответ на действие отрицательных температур

Научная новизна работы. Впервые дана микробиологическая характеристика отрицательнотемпературных рассолов в вечной мерзлоте Выделены и описаны чистые культуры адаптированных к холоду аэробных и анаэробных бактерий, представляющих новые виды родов Clostridium, Desulfovibrio и Psychrobacter Рост изолятов при температурах ниже нуля сопровождался значительными изменениями физиологии и биохимического состава клеток Полученные результаты расширяют представления о микробном разнообразии вечной мерзлоты и биологии психрофильных и психротрофных бактерий

Практическое значение Изоляты адаптированных к холоду бактерий представляют интерес как компоненты искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в холодном климате, а также как источники холодоактивных ферментов, используемых в пищевой промышленности, при очистке сточных вод, в молекулярной биологии

Апробация работы Основные положения работы доложены на 7-ой, 8-ой, 9-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология-наука 21-го века» (2003 - 2005), Международной конференция по арктической микробиологии (Рованьеми, Финляндия, 2005), 2-й европейской конференции по вечной мерзлоте «EUCOP 2005» (Потсдам, Германия, 2005), 9-м симпозиуме по водной микробной экологии (Хельсинки, Финляндия, 2005), Всероссийских Молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2006), а также на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН им Г К Скрябина (2003 - 2006)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 14 работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 211 ссылок, содержит 30 таблиц и 30 рисунков

Благодарности. Автор искренне благодарен сотрудникам, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы д б н Гиличинскому ДА, к б н Ривкиной ЕМ за предоставленные пробы криопэгов (ИФХиБПП РАН), кбн Лысенко AM за определение уровня ДНК-ДНК гибридизации и ГЦ-состава (ИНМИ им С Н Виноградского РАН), дбн Осипову ГА за анализ жирнокислотного состава клеток (Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им АН Бакулева), кбн Сузиной НЕ за помощь при выполнении электронномикроскопических исследований, кбн Гавриш ЕЮ, кбн Акимову В Н за филогенетический анализ, Лысанской В И за анализ мономерного состава

полисахарида, а также к б н Архиповой О В , к б н Лауринавичюсу К С , к б н Трутко С М, к б н Чувильской НА и всем сотрудникам лаборатории анаэробного метаболизма микроорганизмов (ИБФМ им Г К Скрябина РАН)

Автор благодарит профессора Марбургского университета М А Марахила (Германия) за руководство при выполнении протеомного анализа

Особую признательность автор выражает к б н Щербаковой В А за всестороннюю помощь на всех этапах исследований

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили образцы криопэгов, отобранные в результате экспедиции 1999 года в тундровую зону Колымской низменности, район озера Якутское (69°50'с ш , 159°30'в д) и в 2004 году к побережью Баренцева моря на полуострове Варандей (68°50'с ш , 58°15'в д ), а также чистые культуры бактерий, выделенные из этих образцов

Морфологию клеток и контроль чистоты культур изучали с использованием светового микроскопа с фазовым контрастом Люмам И-2 , а также электронного микроскопа (JEM 100), используя ультратонкие срезы Препараты для электронно-микроскопических исследований готовили по Рейнольдсу (Reynolds, 1963)

Культуральные свойства и физиологические особенности новых изолятов изучали по общепринятым методикам (Powell, 1983, Герхард и др ,1984, Boone, 1988)

Определение десульфовиридина проводили по методике Постгейта (Postgate, 1959)

Содержание жирных кислот, спиртов в среде культивирования и метана

определяли на газовом хроматографе Pye-Unicam 304 (Великобритания) с пламенно-ионизационным детектором

Содержание глюкозы определяли по методу Шомодьи-Нельсона (1944) Лактат в среде определяли ферментативным способом (Hohorst, 1970) Концентрацию S2" и Ге2+ в культуральных средах определяли колориметрически (Cime, 1969, Lovley et al, 1986)

Содержание белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976) Анализ жирных кислот клеток проводили как описано ранее (Shcheibakova et al, 2005)

Внутриклеточное содержание полисахарида определяли антроновым методом (Herbert et al, 1971) Чистый полисахарид получали из клеточного гомогената по методу Стамса (Stams et al, 1983) С, Н, N определяли на приборе для элементного анализа модель 1106 (Carlo Erba Strumentazione, Италия) Состав мономеров определяли на анализаторе углеводов "Btotronic LC 2000" (Германия) после кислотного или ферментативного гидролиза полисахарида

Выделение ДНК из биомассы было проведено по методу Мармура (Marmur, 1961) Амплификацию генов 16S рРНК осуществляли с универсальными праймерами 27f и 1492г на приборе GeneAmp PCR System 2700 (Applied Biosystems) Секвенирование амплифицированного фрагмента 16S рДНК проводили на автоматическом секвенаторе ДНК CEQ2000XL (Beckman Coulter)

Филогенетический анализ. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК использовали программу ClustalX, (Thompson et al, 1994) Построение бескорневого филогенетического древа производили с помощью алгоритмов, реализованных в программе TREECON (Van de Peer, and De Wächter, 1997)

Нуклеотидный состав исследовали методом термической денатурации ДНК на спектрофотометре Pye Unicam SP1800 (Великобритания)

Гибридизацию проводили методом реассоциации по ДеЛею (DeLey et al, 1970) Протеомный анализ холодовой адаптации проводили на примере "Р muriicola" 2ps Суммарные белки клетки разделяли при помощи двухмерного электрофореза, окрашивали кумасси бриллиантовым синим R-250 Гели сканировали, используя прибор Phosho-/Fluoro-Imager (Amersham Strom 860, Германия) Электрофореграммы сравнивали и вычисляли статистически достоверные отличия в уровнях экспрессии аналогичных белков из разных серий экспериментов при помощи программы Decodon Delta2D V3 1 Идентифицировали холодоиндуцибельные белки методом LC MS/MS масс-спектрометрии (масс-спектрометр Thermo Fmmgan, Германия)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1 Микробиологическая характеристика криопэгов. 1.1 Микробиологический анализ криопэгов Колымской низменности.

Общая численность микроорганизмов в криопэгах, определенная путем прямого счета, составила 2 3-6 6x107 кл/мл Численность жизнеспособных аэробных бактерий колебалась от О до сотен тысяч клеток в 1 мл рассола (табл 1) Количество анаэробных прокариот различных физиологических групп составило от десятков (ацетогены) до нескольких миллионов (сульфатредукторы) клеток в мл Максимальная численность отмечалась при температуре культивирования 5°С, а при 18-20°С она падала на 1-3 порядка Галофильные гетеротрофы, ацетогены и метаногены обнаружены не были

Таблица 1. Численность жизнеспособных прокариот различных физиологических групп в образцах криопэгов Колымской низменности.

.г , Жизнеспособные микроорганизмы, кл/мл

№ скважины/

температура,"С Аэробные* Анаэробные Сульфат- Ацетогены Метаногены гетеротрофы гетеротрофы редукторы

14/99

5 6x10' 2х102 2x10® 10 lxio2

5* Но 0 2x106 0 0

18-20 2x10б 2х102 2x102 0 0

18-20* Но 0 2x10' 10 0

15/99

5 6x104 2x102 2x10' lxlO2 0

5* Но 0 2*106 0 0

18-20 8x10' 0 2x10' 0 0

18-20* Но 0 0 0 0

*-использовали среды с повышенной соленостью

1.2 Микробиологический анализ криопэгов Варандейского полуострова.

Численность микроорганизмов, определенная путем прямого счета, составила 3 5*108 кл/мл, и это значение на порядок выше, чем для криопэгов Колымской низменности

Численность жизнеспособных аэробных бактерий, определенная при 37°С, на 1-3 порядка меньше, чем при 5 и 20°С, а при температуре, близкой к естественной температуре местообитания (-2°С), составила 6.3x105 кл./мл. Количество жизнеспособных анаэробных бактерий, определенное при 5°С, практически не отличалось от количества, определенного при 20°С (табл. 2). Сульфатредукторы были представлены сотнями клеток в 1 мл образца, метаногены - десятками.

Таким образом, микробиологический анализ высокоминерализованых криопэгов Колымской низменности и распресненных криопэгов Варандейского полуострова показал, что обитателями этих экосистем являются психрофильные галотолерантные сообщества. Таблица 2. Численность жизнеспособных прокариот различных физиологических групп в образцах криопэгов Варандейского полуострова (21-я скважина).

Жизнеспособные микроорганизмы, кл/мл

температура,°С Аэробные гетеротрофы Анаэробные Сульфат-гетеротрофы редукторы Ацетогены Метаногены

-2 6.3x105 Н.о. Н.о. Н.о. Н.о.

5 3.5х107 10' 102 10 10

5* И.о. 0.5x10" 10 0 0

18 -20 4x10' 10? ю2 0 10

18-20* Н.о. ю2 50 10 0

37 5.5x10' Н.о. Н.о. Н.о. Н.о.

* -использовали среды с повышенной соленостью

2 Новые психрофильные и психротолерантные бактерии из арктических

криопэгов.

2.1 Анаэробные психрофильные спорообразующие палочки штаммы 14Ш и 14К.

Морфология клеток. Клетки штамма 14Ш представляли собой грамположительные прямые палочки размером 1.2-1.5x3-7 мкм (рис. 1, а). Сферические эндоспоры (рис. 1, а) образовывались обычно в центре клетки или субтерминально. Клетки штамма 14И представляли собой прямые палочки размером 1-1.2х2-4 мкм (рис. 1, в). Исследования ультратонких срезов показали наличие клеточной стенки грамположительного типа, но снаружи помимо муреинового находился еще один электронплотный слой, по-видимому, микрокапсула (рис. 1, д). Эндоспоры сферические (рис. 1, в), субтерминальные или терминальные.

Чч

Рис. 1. Микрофотографии клеток нзолятов 141) I (а,б), 141 (в-д): (а) фазовый контраст, длина масштабной метки 10 мкм; (б) негативное окрашивание, длина масштабной метки 1 мкм; (в) фазовый контраст, длина масштабной метки 10 мкм; г), д) ультратонкий срез, длина масштабной метки 0.5 мкм. КС - клеточная стенка; С - спора; МК-микрокапсула, ЦМ-цитоплаз.матическая мембрана, Н - нуклеоид.

Параметры роста изолятов. Штаммы росли в диапазоне температур от -5 до 18°С, оптимальной для роста обоих штаммов была температура 5°С Следовательно, штаммы 1401 и 14Р являются облигатными психрофилами Рост обоих штаммов отмечен в интервале солености от 0 до 20 г/л №С1 с оптимумом при 1-5 г/л для штамма 14Р и 5 г/л для штамма 1401 При 30 г/л роста не наблюдалось Штамм 14Б1 рос в диапазоне рН от 4 5 до 8 5 Оптимальное значение рН для роста штамма составляло б 5-7 2 Штамм НИ имел более узкий диапазон (5 5-8 0) и оптимум (6 8-7 0) рН для роста

Изоляты использовали в качестве источников углерода и энергия широкий спектр углеводов, а также некоторые спирты, органические кислоты и сложные органические субстраты Рост штамма 1401 на глюкозе при оптимальной температуре роста (5°С) приводил к образованию в жидкой фазе бутирата и лактата. Кроме того, образовывались небольшие количества ацетата, изобутирата, формиата и этанола В газовой фазе накапливался Нд и СОг Среди негазообразных продуктов метаболизма глюкозы штамма 14Р основным был бутират, минорным - лактат В газовой фазе также накапливался Нг и СОг

Спорообразование происходило при помещении вегетативных клеток в воду криопэга Споры обоих штаммов не обладали терморезистентностью

Нуклеотидный состав ДНК. Содержание ГЦ пар в ДНК штамма 1401 составило 314 мол %, штамма 14Р - 32 0 мол %

Филогенетический анализ. Филогенетическая дендрограмма (рис 2), показала, что новые арктические изоляты объединяются в единый кластер с антарктическими видами (С /гщоги, С \acusfryxellense, С Ьоктапи, С риускгоркйит) и С еИеПЪеНсит со сходством от 98 8 до 99 6 %

0 02

100

С estertheticum subsp. estertheticum NCIMB 12511 (X68181)

С. estertheticum subsp. laramiense ATCC 51254 (AJ506115)

82 L С lacusfrixellense DSM 14205 (AJ506118 )

14F

С fngoris DSM 14204 (AJ506116)

-С. psychrophilum DSM 14207 (AJ297443)

14D1

— С bowmamt DSM 14206 (AJ506120)

-С subterminale NCIMB 10746 (X68451)

С. pascut DSM 10365 (X96736)

С butyrtcum ATCC 19398 (M59085)

Рис. 2. Филогенетическое дерево на основе анализа генов 16S рРНК, показывающее положение штаммов 14D1 и 14F среди представителей близкородственных видов рода Clostridium Цифрами показаны значения bootstrap-анализа.

Предложение новых видов рода Clostridium. Род Clostridium объединяет грамположительные спорообразующие строго анаэробные бактерии, не способные к сульфатредукции, и является к настоящему времени одним из самых больших по количеству видов прокариот Выделенные из криопэгов Колымской низменности штаммы 14D1 и 14F обладают характерными признаками рода Clostridium Штаммы являются строгими психрофилами Согласно данным филогенетического анализа, изоляты наиболее близки к кластеру психрофильных клостридий, и имеют 97-99 6% сходства с С frigoris DSM 14204т, С bowmanii DSM 14206т С eitertheticum DSM 8809т и С lacusfryxellense DSM 14205т Данные ДНК-ДНК гибридизации штаммов между собой и с близкородственными кпостридиями показали низкий процент сходства - от 27 до 50% Характеристики, дифференцирующие изоляты друг от друга и от близкородственных клостридий, включали морфологию и расположение спор, спектр утилизируемых Сахаров и продуктов метаболизма (табл 3 ) На основании этих отличий мы считаем правомерным отнесение штаммов 14D1 и 14F к новым видам рода Clostridium С algoriphilum sp nov и "С frigoriphilum " sp nov

Краткое описание новых видов клостридий.

Clostridium algoriphilum sp nov (al go ri'phi lum L mase n algor-oris, холод, N L neut adj Phylum-любящий, N L neut adj algoriphilum, холодолюбивый) Клетки - палочки с закругленными концами (12-1 5x3-7 мкм) одиночные или в парах Подвижные с перитрихиально расположенными жгутиками Эндоспоры сферические, центральные По Граму окрашиваются положительно Колонии достигают 1-2 мм в диаметре, круглые выпуклые кремового цвета Строгий психрофил Температурный оптимум роста 5-6°С pH диапазон роста 4 5-8 0 с оптимумом 6 8-7 2 Оптимум солености 5 г/л, диапазон 0-20 г/л Строгай анаэроб Утилизирует ксилозу, инозит, сорбит, галактозу, мальтозу, глюкозу, арабинозу, маннозу, сахарозу, рибозу, манит, фруктозу, раффинозу, мелобиозу, целлобиозу, пептон, дрожжевой экстракт, фумарат, малат, лактозу, триптиказу, трегалозу, ксилан, бетаин, холин Желатин и крахмал не гидролизует При сбраживании Сахаров образует бутират, формиат, лактат, ацетат, этанол, Нг и СОг Содержание ГЦ пар в ДНК составляет 314 мол % Типовой штамм 14D1 помещен в ВКМ В-2271т и DSMZ 16153т Последовательность гена 16S рРНК помещена в GenBank (AY 117755)

Clostridium frigoriphilum sp nov (fn go ri phi'lum L n fngus -oris, холод, Gr adj philos, любящий, N L neut adj frigoriphilum, холодолюбивый) Клетки - палочки с закругленными концами 1-1 2 X 2-4 мкм, одиночные или в парах, неподвижные, жгутики отсутствуют По Граму окрашиваются положительно Эндоспоры сферические, терминальные Жгутиков нет Колонии достигают 1 -2 мм в диаметре, круглые выпуклые кремового цвета Температурный оптимум роста 5-6°С, верхний предел роста 20°С pH диапазон роста 5 5-8 0 с оптимумом 6 7-7 0 Оптимум солености 1-5 г/л, диапазон 0-20 г/л Строгий анаэроб Утилизирует глюкозу, ксилозу, инозит, сорбит, галактозу, мальтозу, арабинозу, маннозу, сахарозу, рибозу, маннит, фруктозу, раффинозу, мелобиозу, трегалозу, крахмал, ксилан, целлобиозу, пептон, дрожжевой экстракт, фумарат, малат, лактозу, триптиказу, бетаин, холин При сбраживании Сахаров образует бутират, лактат, Hj и СОг Содержание ГЦ пар в ДНК составляет 32 мол % Типовой штамм 14F помещен в ВКМ В-23687 и DSMZ 17763т Последовательность гена 16S рРНК помешена в GenBank (EF570920)

Таблица 3. Сравнительные характеристики новых изолятов и близкородственных клостридий.

1401 14Р С fugoris С ¡асш/гухеИепзе С bowmami С psychrophilum С estertheticum

Характеристики DSM 14204т Б8М 14205 т DSM 14206 т DSM 14207 T DSM 8809т

Форма и положение сферические, сферические, сферические, сферические, сферические, эллипсоидальные, Эллипсоидные,

спор центральное терминальное терминальное терминальное и терминальное и терминальное и терминальные,

субтерминалыгое субтерминальное субтерми нальное центральные

Оптимум 5-6°С 5-6°С 5-7°С 8-12°С 12-16°С 4°С 6-8°С

температуры

Оптимум рН 6 5-7 2 6 7-7 0 6 8-7 2 6 5-7 1 6 6-7 2 6 5-7 0 6 5-7 2

Субстраты

арабиноза + + + - - + +

целлобиоза + + + + - + +

галактоза + + 4- + + - +

инозитол + + + - - +

лактоза + + + + - - -

мальтоза + + + - + + +

маннитол + + - + - - +

манноза + + + - + + +

мелицитоза + + - + - - -

мелибиоза + + + + - - +

раффиноза + + + - - +

рамноза - + 4- - - - +

рибоза + + + + + - +

салицин н 0 + + + + - +

крахмал - + + + - - -

трегалоза + + + + + + +

ксилан + + НО н О н о н о +

Гидролиз крахмала - н 0 - - - - -

негазообразные В, и а, 1; 2 В, 1 В, f, 1, а, 2 В, Р, 1, а, 2 В,А, f, 1, 2,4 L, 2, 4, b В, A, f, 1, 2,4

продукты брожения

ГЦ-состав, мол % 31 4 32 0 31 9 32 1 32 0 31 8 33 9

Ссылки данное данное Sprmg et al, 2003 Брпгщ е1 а!, 2003 Sprmg et al, 2003 Spnngetal ,2003 Collins etal, 1992

исследование исследование

Продукты брожения, выделяемые в количестве < 1 мМ не принимали в рассмотрение Заглавные буквы означают концентрацию свыше 10 мМ Сокращения а - ацетат, Ь — бутират, f - формиат, V — валерат, 1 - латах, 2 - этанол, 4 — 1-бутанол

2.2 Психротолерантные штаммы I р8 и 2 рЯ.

Из образцов воды криопэга, вскрытого скажнной 14/99 на Колымской низменности, при посеве на агаризованную среду Я2А были выделены два аэробных штамма 1 рБ и 2рБ.

Морфология и ультраструктура. Клетки штамма 1 р Э представляли собой грамотрицательные кокки диаметром 1.0-1.5 мкм (рис. 3, г), а клетки штамма 2р5 -коккобациллы размером 0.5-1.0 мкм * 0.5-2.0 мкм (рис. 3, а, б, в).

«V * '**

/ ^ »»• «■ о - *

/ . .4*1 1

* V ц'

■м»

Параметры роста. Оба изолята росли в температурных границах от 2 до 37°С, при оптимуме 18-20°С. Проверка возможности роста штаммов при отрицательных температурах показала, что штамм 2рБ был способен расти при -2°С со временем удвоения 50 ч. Добавление ЫаС1 в среду культивирования стимулировало рост штаммов 1 рБ и 2р5. Оптимальный рост наблюдался при концентрации 4 и 8 г/л КаС1, соответственно. Штамм 2рБ был толерантен к содержанию до 60 г/л №С1 в среде культивирования, а штамм 1 рБ - до 40 г/л. Рнс. 3. Микрофотографии клеток штаммов 1р5 и 2р8: а) штамм фазовый контраст, длина масштабной метки 5 мкм; б) клетка штамма 2р5, негатнвное окрашивание, длина масштабной метки 1 мкм; в) ультратонкнй срез клеток штамма 2р8 г) штамма 1р8, длина масштабной метки 0.5 мкм.

Спектр утилизируемых субстратов. Из протестированных соединений рост наблюдался на дрожжевом экстракте, ряде органических кислот (пируват, глутарат, фумарат, капроат, гептаноат, бутират, мапат, ЭЬ-лактат, цитрате), а также некоторых аминокислотах (Ь-пролин, Ь-тирозин) и спиртах (метанол, бутанол, дульцит). Изоляты не росли на гистидине, аспарагине, Ь-глутамине, Ь-фенилаланине, Ь-валине, Ь-цистеине, Ь-лейцине, глицине, ОЬ-метпонине, ЭЬ-триптофане, ОЬ-серине, сукцинате, лактате, формиате, сорбите, инозите, этаноле, пропаноле, глицерине.

Спектр ферментативных активностей. Положительный результат дали тесты на фенилаланиндезаминазу, нитратредуктазу и уреазу, щелочную и кислую фосфатазу, лейцинариламидазу, эстеразу (С<), липазу (Са) и нафтол-АЭ-ЕЯ-фосфогидролазу. Отрицательные результаты дали тесты на аргининдезаминазу, лизиндекарбоксидазу, орнмтиндекарбоксилазу, гидролиз крахмала, образование индола и Н^Э, липазу (Си), валинариламидазу, иистеинариламидазу, трипсин, Р-химотрипсин, Р-галактозидазу, (3~ глюкуронидазу, р-глюкозидазу, а-глюкозидазу, М-ацетил-р-галактозидазу, р-маннозидазу и Р-фукозидазу.

Содержание ГЦ-пар в ДНК штаммов 1 рЭ и 2рБ 46.4 и 46.0 мол.%, соответственно. Уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммами 1 рЭ и 2рЭ составил 89%. На основании этого, а также значительного фенотипического сходства, они могут быть отнесены к одному виду. Филогенетический анализ последовательности гена 165 рРНК штамма 2рБ показал, что изолят наиболее близок (97% сходства) к Р. %1астсо!а (Ш5879).

1 гС

Р giici/ieoti (tltSSW) 2pS (AFS177SS7)

r "P glacíalls"(AJ S391Ú2) L S(AYt600SS)

■ P immobtlla (изаШ)

L Я ПпЦАЛШИ) ,P submarlmK(AJ304940f . jjJp narincob (ñJJOO'MI)

J|- P salsiis'(AJ 5S9KM)

P haíophllus (AJS39103) — P phenylpyriivica (AF 0051Q2) M lacunata (AF00H60)

M. cunlcall (AF00S1Í9) -E cotí 1775 (X8072S}

Рис 4 Филогенетическая дендрограмма последовательностей гена 16S рРНК, показывающая положение арктического нзолята 2pS Данные «bootstrapv-анализа указаны в точках ветвления. Масштаб. О 1 замены на один нуклеотид

Уровень ДНК-ДНК гибридизации штаммов IpS и 2pS с Р glacincola DSM121941 составил 26 и 25% , а с типовым видом рода Р immobilis DSM7229 т - 55 и 57%, соответственно Анализ фенотипических признаков штаммов указывает на их принадлежность к роду Psychrobacter Выделенные нами изоляты IpS и 2pS оказались филогенетически наиболее близки к Р glacincola Однако, учитывая низкий уровень ДНК-ДНК гибридизации с близкородственным видом и значительные отличия фенотипа (табл 4), мы предлагаем новый вид рода "Psychrobacter mumcola "sp nov с типовым штаммом 2pS

Краткое описание нового вида "Psychrobacter muriicola" sp nov. [mu n i co'la L n muría, рассол, L suf -cola (from L n mcola), обитатель, N L n murncola, обитатель рассола] Клетки представляют собой грамотрицательные кокки или коккобациллы, одиночные, в парах или коротких цепочках, диаметр 1-15 мкм х 0 5-18 мкм, неподвижны Образуют белые плоские колонии диаметром 2-3 мм Строгий аэроб Оксидазо- и каталазоположителен Оптимальная температура 18-20°С, температурный диапазон -2 - 37"С Диапазон рН от 5 8 до 8 5, оптимум 6 5-7 5, солености от 0 до 100 г/л, оптимум 3-8 г/л NaCl Не образует кислоту из углеводов, не гидролизует крахмала Не образует индол и H2S Положительный результат дают тесты на щелочную и кислую фосфатазу, лейцинариламидазу, эстеразу (Gt), эстеразу липазу (Са), нафтол-AS-Bl-фосфогидролазу, отрицательный - на липазу (Си), валинариламидазу, цистинариламидазу, трипсин, а-химотрипсин, а-галактозидазу, Р-галактозидазу, p-глюкуронидазу, а-глюкозидазу, р-глюкозидазу, N-ацетил-Р-глюкозаминидазу, а-маннозидазу, а-фукозидазу, фенилаланиндезаминазу, нитратредуктазу, уреазу, аргининдезаминазу, лизиндекарбоксидазу, орнитиндекарбоксилазую Растет на дрожжевом экстракте, пирувате, глутарате, фумарате,

капроате, гептаноате, бутирате, малате, DL-лактате, цитрате, L-пролине, L-тирозине, бутаноле, дульците Факторов роста не требовалось Доминирующая жирная кислота клеточной стенки при оптимальной температуре роста Cis i Г+Ц содержание в ДНК составляет 46 0 мол %

Выделен из низкотемпературных рассолов в вечной мерзлоте Арктики, Колымская низменность, Северо-Восточная Сибирь Типовой штамм 2pS помещен во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов под номером ВКМ В-2270т и в Украинскую коллекцию микроорганизмов под номером 1MB В-7124т

Таблица 4, Фенотипнческие характеристики штамма 2pS и близкородственных видов рода Psychrobacíer, выделенных из Арктики и Антарктики.

Виды / штаммы 1, 2pST ВКМ В-2270, 2, Р cryohalolentis DSM 17306т (Bakermans et al, 2006), 3, Р arcticum DSM 17307T (Bakermans ct al, 2006), 4, P glacincola (Bowman et al, 1997), 5, P luti LGM 21276 T (Bozal et al, 2003), 6, P frtgidicola DSM 12411T (Bowman et al, 1996), 7, P valhs DSM 15337T

Характеристика 1 2 3 4 5 6 7 8

Температура роста

Диапазон -2-35 -10-30 -10-28 0-22 0-20 4-25 4-30 4-30

Оптимум 16-18 22 22 13-15 15 14-16 22 22

Толерантность к 100 г/л +■ + + + + + +

№С1

Образование кислоты из +

углеводов3

Восстановление нитратов V V V - + - + +

Гидролиз

Желатины - - - н о н о НО - -

Тугееп 80 + - + + + + + +

Ферментативные

активности

Кислая фосфатаза + - + - - - - -

Щелочная фосфатаза + + + + + - + +

Уреаза V - + - - - - +

Эстераза (С4) + + - H О + + н о н о

Липаза (Си) + + - + + - + +

Утилизируемые

субстраты

Цитрат + + - + - - -

Ацетат + + + + + + - -

Глицерин - - + +

Ь-малат + - - + + H О Н О

Ь-гистидин - + + + - - - -

Ь-пролин + + + + - + - -

1,-аланин - + + - - - - -

Ь-гидроксипролин - V- + + - - н О н О

ГЦ состав, мол % 46 0 42 3 42 7 440 45 0 41-42 46 1 43 6

"Все таксоны были оксидазо- и каталазоположительными, не образовывали индол и Н25, не гидролизовали крахмал, не содержали лизиндекарбоксилазу, орнятандекарбоксилазу и аргининдигидрояазу "Сокращения + реакция положительная, У+ реакция положительная для 1189% штаммов, но реакция типового штамма положительная, V- реакция отрицательная для 11-89% штаммов, но реакция типового штамма отрицательная, - реакция отрицательная, н о — не определяли

2.3 Сульфатредуцирующая бактерия штамм В15.

Накопительная культура штамма В15 была получена путем инокуляции пробы криопэга, вскрытого скважиной 21 на Варандейском полуострове, и инкубации при

б _ ляли собой грамотрицательные вибрионы (рис. 5,

а) размером 3-4х0.4-0.5 мкм, подвижные за счет одного жгутика (рис. 5, б). Параметры роста. Штамм рос в диапазоне температур от 5 до 28°С. Оптимальной была температура 24°С. Рост отмечен в интервале солености от 0 до 10 г/л NaCl с оптимумом при 2 г/л. Оптимум рН-б. 7-7.0.

Рис. 5. Клетки штамма В15: а) ультратонкие срезы, длина масштабной метки 0.5 мкм; б) негативное окрашивание, длина масштабной метки 1 мкм.

-I

В качестве конечных акцепторов электронов штамм использовал сульфат, сульфит, тиосульфат, элементную серу. Штамм был способен восстанавливать трехвалентное железо, но роста при этом не наблюдалось. В бесклеточных экстрактах был обнаружен десульфовиридин.

Филогенетический анализ последовательности гена 16S рРНК штамма В15 показал близкое родство штамма В15 к представителям рода Desulfovibrio (рис.6). Штамм В15 объединяется в единый кластер с типовыми штаммами видов D. mexicanus и D. aminophilus с уровнем сходства нуклеотидных последовательностей 96.5 и 92.0%, соответственно. 0.02 — клон PL-14В8 (AY570583)

Desulfovibrio sp. Mlhm (AFI93026) - сульфатредуктор R-LacAl(AJ012593) — клон HDBW-WB25 (AB237688) штамм В15

■ Desulfovibrio mexicanus (AF227984)

— Desulfovibrio aminophilus (AF067964)

— Desulfovibrio profundus (U90726) -Desulfovibrio halophilus (U48243)

V-

10Ü

1Ш1

Lai

-1M

ta.

Desulfovibrio salexigens (M34401) ~ Desulfovibrio hydrothermalis (AF458778) ■ Desulfovibrio zosierae (Y18049)

- Desulfovibrio gracilis (U53464)

Рис. 6. Бескорневое филогенетическое древо представителен рода Desulfovibrio, показывающее положение штамма В15. Цифрами показаны значения "bootstrap''-анализа. Для филогенетического анализа использованы типовые штаммы рода Desulfovibrio.

Род Desulfovibrio, к представителям которого оказался близок выделенный нами штамм, объединяет сульфатредуцирующих бактерий преимущественно вибриоидной морфологии, содержащих пигмент десулъфовиридин и окисляющих субстраты до ацетата Штамм В15 удовлетворяет всем перечисленным выше требованиям Однако представленные в таблице 5 характеристики указывают на значительные отличия, как от ближайшего вида, так и от типового Поэтому мы считаем, что выделенная нами бактерия представляет новый вид рода Desulfovibrio

Таблица 5. Сравнительная характеристика нового изолята и близкородственных видов._

Свойство Штамм В15* D mexicamis LuplT** D desulfitncans Essex б1***

Морфология вибрионы вибрионы вибрионы

Размеры клеток 3-4*0,4-0,5 мкм 1,7-2,5x0,5 мкм 3-5x0,5-1 мкм

подвижность + - +

Оптимум температуры 24°С 37°С 37°С

Диапазон температуры 5-37°С 20-40°С 28-44°С

Оптимум солености 2 г/л Ог/л

Оптимум рН 6 7-7 0 72 72

Доноры электронов

Серин - + -

Цистеин - + -

Казаминовые кислоты - + Но

Бутанол - - +

Холин + Но +

фумарат + - +

малат - - +

пропанол - Но +

Сбраживаемые субстраты

Пируват - + +

Цистеин - + Но

Серин - + Но

Казаминовые кислоты - + Но

Акцепторы электронов

Фумарат

Ке3+ + Но +

N03 - - +

Содержание Г+Ц (мол %) 38 2 66 59

Н о- не определяли, *-данные наших исследований, """-данные G Hemandez-Eugemo et al, 2000, ***-данные Devereux et al, 1990, Bale et al, 1997 Доноры электронов, используемые тремя штаммами, включали Н2 формиат, лактат, этанол, пируват, доноры электронов, не используемые штаммами ацетат, сукцинат, пропионат, бутират, валерат, глицерин, аланин, валин, лейцин, метионин, аргинин, маннитол и пептон Акцепторы электронов, используемые тремя штаммами сульфат, сульфит, тиосульфат и элементная сера

Описание "Desulfovibrio arcticus" sp.nov. (arc'ti cus L mase adj arclicus,

арктический) Клетки представляют собой вибрионы размером 3-4 мкмхО 4-0 5 мкм, подвижные за счет одного полярно расположенного жгутика, одиночные или в коротких цепочках Клеточная стенка грамотрицательного типа В качестве доноров электронов использует водород, формиат, лактат, пируват, этанол Сульфат, сульфит, тиосульфат, молекулярная сера служат в качестве конечных акцепторов электронов Восстанавливает трехвалентное железо, но роста при этом не наблюдается Оптимум температуры 24°С, диапазон 5-28°С Оптимум солености 0 2%, от 0 до 2% Оптимум рН 6 7-7 0, диапазон 5 98 1 Содержание ГЦ - пар 38 2 мол %

Типовой штамм В15 помешен в ВКМ под номером ВКМ В-2367 и DSMZ под номером DSMZ 17759 Последовательность гена 16S рРНК помещена в GenBank (DQ296030)

3 Адаптация изолятов к отрицательной температуре. 3 1 Особенности роста выделенных бактерий при отрицательных температурах

Изоляты из криопэгов Колымской низменности С algoriphilum и С frigonphilum оказались способны к росту при температурах ниже нуля Экономический коэффициент существенно не менялся при оптимальной и отрицательных температурах культивирования, а у С algoriphilum даже возрастал при -2°С, что согласуется с литературными данными (Knoblauch and Jorgensen, 1999, Tarpgaard et al, 2005) Особенностью роста обоих штаммов было также то, что к началу стационара они достигали большей оптической плотности при отрицательных температурах культивирования, чем при оптимальных (табл б) Таблица б. Параметры роста изолятов при периодическом культивировании.

показатель С algoriphilum Сfrigonphilum

5°С -2°С -5°С 5°С -2°С -5°С

Время удвоения, ч 21 125 6 147 28 5 131 1 151 5

ООма« 0 65 0 86 0 86 0 47 0 68 0 61

Экономический коэффициент, % 37 43 35 19 18 16

Длительность лаг-фазы, ч 48 162 192 72 240 360

Результаты исследований одновременного влияния температуры и солености на скорость роста С а^опрЬйит и Р тигпсо1а (рис 7) показали, что для роста изолятов при отрицательной температуре было характерно увеличение галотолерантности Так, при 5°С рост С а^опрЫЫт при 4 5% прекращался, а при -5°С продолжался даже при 10% №С1 Р титсо1а 2рЭ при -2°С рос даже при солености 10% Кроме того, у С а^опр/иЬт происходил сдвиг оптимума солености с 5 г/л до - 10 г/л (рис 7, а)

а м*а * б Ыаа %

Рис 7 Влияние температуры культивирования и солености среды на удельную скорость роста а) С а^опрМит 14Ш; б) "Р. тигисо1а" 2р8

Проверка способности новых изолятов утилизировать органические соединения при различных температурах показала, что способность утилизировать то или иное соединение в качестве единственного источника углерода и энергии зависит от температуры культивирования Так, штамм 14Б1 не был способен расти на ксилане и целлобиозе при 18°С, но рос на этих соединениях при 5 и -2°С, не использовал глутамат при 5 и 18°С, но рос на этом субстрате при -2°С Штаммы и 2рЭ не использовали в качестве субстратов,

сахарозу, трегалозу, Ь-глутамат и Ь-аланин в оптимальных для роста температурных условиях (18°С), но росли на этих соединениях при пониженных температурах (табл 7)

Таблица 7. Использование некоторых органических соединений в качестве источников

Субстраты Температура,°С С algoriphilum Р murncola IpS Р murncola 2pS

I4D1

ксилан 18 - - -

5 + - -

-2 + - -

целлобиоза 18 - - -

5 + - -

-2 + - -

D-глюкоза 18 + ■ -

5 + + +

-2 + н о +

сахароза 18 + - -

5 + - -г

-2 + н о +

трегалоза 18 + - -

5 + + +

-2 + Н 0 +

L-глутамат 18 - - -

5 - + +

-2 + но +

L-аланин 18 - - -

5 - + +

-2 - н о +

Подобные результаты были получены Ругером (Ruger, 1988) для глубоководных бактерий родов Alteromonas, Bacillus и Vibrio Другими авторами (Ponder et al, 2005) для бактерий из вечной мерзлоты Psvchrobacíer sp 273-4 и Exiguobacíerium sp 255-15 также были показаны зависимые от температуры различия в спектре потребляемых субстратов Так, Psychrobacter sp 273-4 утилизировал 32 различных источника углерода при 24 и 4°С, шесть из которых использовались исключительно при 4°С, а двенадцать - только при 24°С Штамм Exigitobacterium sp 255-15 был способен утилизировать 42 источника углерода при 24°С и только 36 при 4"С Семь соединений использовались исключительно при 4°С и тринадцать - только при 24°С

3 2 Состав жирных кислот клеток нзолятов при различных условиях культивирования.

Для жирнокислотного состава клеток С algoriphilum характерно преобладание тетрадекановой и омега7-цис-гексадеценовой кислот Содержание непредельных соединений в клетках при оптимальной температуре составляло 57% Клетки, выращенные при отрицательной температуре, содержали 68 8% ненасыщенных соединений При этом уменьшалось процентное содержание тетрадекановой, пентадекановой, гексадекановой и октадекановой кислот и значительно увеличивалось содержание омега7-цис-гексадеценовой кислоты

Жирнокислотный состав клеток "Р murncola" 2pS характеризовался высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, сумма которых при оптимальной температуре

и солености составляла 79 8% Культивирование при температуре, ниже оптимальной (-2°С) или выше (28°С) не приводило к значительным сдвигам в соотношении сумм насыщенных и ненасыщенных жирных кислот (табл 9) Культивирование при повышенной солености приводило к небольшому увеличению доли ненасыщенных жирных кислот при оптимальной и отрицательной температурах Интересным результатом эксперимента оказалось появление некоторых соединений, не характерных для бактерий рода РзусЬгоЪааег, при -2°С и повышенной солености (50 г/л) кислоты Си 1дб, Сп о ю ме, Си о ю ме, Сго |д!м и насыщенный альдегид Сц о

Таблица 8. Влияние условий культивирования на состав жирных кислот клеток Р. титсо1а 2р5.__

Соленость, г/л

Соединение, 50 1 50 0

% Температура,"С

-2 18-20 1 28 | -2 1 18-20 | 28

90 0 26 0 32 0 66 0 72

10 0 3 94 3 61 4 54 2 59 4 74 4 29

íll 0 06 0 12 0 17 0 27

allO 0 17

11 0 016 0 36 0 23 0 23 040

12 0 0 11 0 13 0 15 0 11 0 15 0 10

3hl2 0 72 0 96 1 03 051 0 84 1 10

3hl3 0 16

15 1ш6 016

16 1ш7с 9 48 6 54 4 49 7 89 8 94 4 37

16 lto7t 3 64 1 47 0 46 0 97 0 76 0 62

16 0 1 49 2 28 1 86 0 74 2 22 1 60

3hil5 044 0 36 0 22 0 15 0 35

il7 0 69 0 72 0 85 1 01 0 46 1 27

17 1<о8 4 88 5 27 9 43 8 76 5 50 9 20

17 1со6 231 1 81 1 38 1 70 061 1 72

17 0 0 49 0 66 1 32 0 24 0 38 0 67

17 0 10 Me 0.25

18 lco9 42 04 45 76 56 98 53 00 57 30 49 61

18 1ш7 18 13 15 94 7 98 12 78 11 46 И 75

18 0 2 45 3 02 4 89 1 55 3 36 2 87

18 Icol 1 Me 1 30 2 78 1 57 2 71 3 79

3hil7 0 50 1 56 0 80 2 29

18 0 10 Me 0.27

il9 0 14 0 25 0 42 0 18

20 lco9t 0 58

20 0 5 99 5 63 0 53 2 22 2 83 2 72

Насыщенные жирные кислоты, % от общей суммы Ненасыщенные жирные кислоты, % от общей суммы 16 9 82 4 182 79 8 16 6 82 5 91 88 3 15 2 84 6 160 81 3

3.3 Внутриклеточный полисахарид С а^опрЫЫт

Одним из важных способов выживания микроорганизмов является образование внутриклеточных полимерных веществ (полисахаридов, липидов, полифосфатов), которые могут быть источниками углерода и (или) энергии в стрессовых условиях

При исследовании ультратонких срезов клеток С а^опрШЬт 140!, выращенных при оптимальной и отрицательной температурах, обнаружился различный характер заполнения

цитоплазмы. Цитоплазма клеток, выращенных при оптимальной температуре, была заполнена электронпрозрачным веществом. Клетки, выращенные при -5°С имели совершенно другой характер заполнения цитоплазмы: электронпозрачного вещества было значительно меньше. Это навело нас на мысль о том, что, возможно, накопление данного вещества является температурозависимым процессом.

Гомогенаты клеток окрашивались раствором Люголя в темно-коричневый цвет, поэтому мы предположили, что в цитоплазме содержится полисахарид. Используя метод Стамса (1983), полисахарид был получен в чистом виде и проанализирован. В препарате полисахарида отсутствовал белок и нуклеиновые кислоты. Элементарный анализ не обнаружил М, в то время как количество С составило 41%, а Н - 6.6%, количество Р04 -0.27%. Среди продуктов полного кислотного гидролиза была обнаружена только глюкоза. После энзиматического гидролиза полисахарида с помощью амилоглюкозидазы (1,4-а-О-глюканглюкогидролаза, К.Ф.3.2.1.3) в среде инкубации также выявлялась глюкоза (93%), с помощью р-амилазы (1,4-а-0-глкжан-мальтогидролаза, К.Ф. 3.2.1.2)-только мальтоза.

Таким образом, в клетках С. а1%ог1рЫ1ит 1401 накапливается гликогенподобное соединение, состоящее из остатков О-глюкозы, соединенных преимущественно а-1-4 связями. Исследование динамики накопления полисахарида клетками С а1^опрЫ1ит в процессе роста культуры (рис. 8) показало, что отношение полисахарид/сухой вес оставалось относительно постоянным на протяжении роста культуры и составляло 25-28% при

начальной концентрации | глюкозы 2 г/л. Количество I полисахарида в клетках

'о

I зависело от начальной

• концентрации глюкозы в

1 среде культивирования. По

5 мере возрастания

| концентрации глюкозы

I содержание полисахарида в клетках увеличивалось.

Рис. 8. Изменение содержания внутриклеточного полисахарида С. а^опрЫЫт в процессе роста. 1 - оптическая плотность; 2 - содержание полисахарида в единице объема культуры, мг глюк, экв./мл; 3 - относительное содержание полисахарида в клетке, мг глюк, экв./мг сухой биомассы.

Тип субстрата также оказывал влияние на содержание полисахарида в клетках. Наибольшее количество полисахарида образовывалось на глюкозе - 29 %, на трегалозе -20%. Клетки, выращенные на пептоне, содержали не более 5% полисахарида от сухого веса клетки. Рост в лимитирующих условиях (по азоту) сопровождался образованием полисахарида, который составлял около 50% веса сухих клеток при концентрации глюкозы 2 г/л. Помещение клеток, выращенных при концентрации глюкозы 2 г/л и содержащих 27%

полисахарида, в среду без субстрата приводило к снижению количества внутриклеточного полисахарида до 17% за 7 суток

Полученные нами данные по составу и структуре внутриклеточного полисахарида показали, что внутриклеточный полисахарид С algonphilum не отличается существенно от таковых мезофильных и термофильных клостридий (Strasdme, 1971, Головченко и др , 1986)

Нам представляется очевидным, что внутриклеточный полисахарид С algonphilum играет роль резервного вещества Полученные данные не позволяют утверждать, что внутриклеточный полисахарид непосредственно участвует в адаптации С algonphilum к условиям криопэга Возможно, он является веществом, из которого могут образовываться криопротекторы клетки

3.4 Протеомный анализ холодовой адаптации"Р murucola"2pS.

Мы использовали двумерный электрофорез, чтобы обнаружить изменения, которые происходят в клетках, исходно растущих при отрицательной температуре и подвергавшихся кратковременному воздействию отрицательной температуры

Наилучшее разрешение и воспроизводимость были достигнуты на гелях с диапазоном рН 4-5 для первого разделения В этом диапазоне при анализе белковых профилей культур, подвергавшихся кратковременному воздействию отрицательной температуры, мы определили 11 пятен, соответствующих белкам, экспрессия которых стабильно увеличивалалсь под воздействием отрицательной температуры Пятно №1 было выбрано нами для анализа в качестве стандарта, пятна № 2-12 - как соответствующие индуцибельным белкам На электрофореграмме белков клеток, исходно растущих при двух температурах (оптимальной и отрицательной), мы обнаружили три пятна, соответствующих индуцибельным белкам Они соответствуют пятнам №10, 11 и 12 на электрофореграмме культуры, подвергшейся холодовому шоку

Как видно из таблицы 9, уровень индукции большинства белков был невысоким Сравнение уровней индукции белков в клетках, подвергавшихся кратковременному воздействию отрицательной температуры с таковыми клеток, исходно растущих при -2°С, показало, что из 12 индуцибельных белков только у трех (пятна №10, 11 и 12) индукция является постоянной Таким образом, повышение уровня экспрессии большей части холодоиндуцибельных белков является временным

Среди индуцибельных белков обнаружен белок холодового шока (пятно №3) Это CspA-подобный белок, относящийся к мажорным белкам холодового шока Данный факт не удивителен, поскольку одной из проблем, возникающих в клетке при снижении температуры, является образование шпилечных структур на матричной РНК, что препятствует нормальной трансляции Известно, что мажорные белки холодового шока функционируют в качестве РНК-шаперонов Они связываются с одноцепочечной РНК, препятствуют образованию шпилечных структур, таким образом устраняя проблемы при синтезе белка (Hunger et al, 2006)

Таблица 9. Белки Р muriicolan2pS, индуцируемые при отрицательной температуре

№ Уровень индукции*

Кратковременное Длительное — Гомологичные белки

пятна (источник)

воздействие воздействие

1 1 1 Рибосомальный белок L7/L12 (Psychrobacter arcticus

273-4)

2 25 07 Консервативный гипотетический белок (Psychrobacter

sp PRwf-1)

з 1 8 1 1 Белок холодового шока (Psychrobacter cryohalolentis

К5)

4 2 1 06 Ни*

5 22 0 95 Гипотетический белок BURPS668_A1825

(Burkholderia pseudomaJlei 668)

6 23 1 1 Ни

7 80 09 Uup, АТФазныс компоненты ABC

/ транспортеров (Psychrobacter cryohalolentts К5)

8 10 1 09 Ни

9 25 1 1 Электронтранспортный фтавопротеин (Psychrobacter

arcticus 273-4)

10 24 37 Ни

11 3 8 4 I Супероксиддисмутаза (Psychrobacter cryohalolentts

К5)

12 42 39 пептидилпролил-цис-транс-изомераза (Burkholdena

psendomattei К96243)

* - Уровень индукции был вычислен как соотношение процентного объема пятна на белковом профиле кучьтуры, подвергавшейся воздействию отрицательной температуры к процентному объему пятна на белковом профиле культуры, растущей при оптимальной температуре

Н и* - не удалось идентифицировать

Белок Uup (АТФзный компонент ABC транспортеров) относится к транспортным системам клетки, но субстратная специфичность его неизвестна Экспрессия этого белка у Psychrobacter cryohalolentis К5 также повышалась при росте при отрицательной температуре (Backermans et al, 2006)

Индукция электронтранспортного флавинсодержащего белка (пятно №9), вероятно, свидетельствует о повышенных энергетических потребностях клетки в условиях отрицательной температуры

Пятно №11 было идентифицировано как супероксиддисмутаза Роль фермента состоит в нейтрализации супероксидных радикалов, образующихся в результате взаимодействия кислорода с восстановленными флавинами, катехоламинами, хинонами и Fe-S-протеинами (Fridovich, 1995) При низких температурах увеличивается время жизни свободных радикалов, для обезвреживания которых, по-видимому, и необходимо увеличить количество супероксиддисмутазы В клетках Psychrobacter arcticus, растущих при 4°С, экспрессия этого белка увеличивалась в 2 раза по сравнению с клетками, растущими при оптимальной температуре (22°С) (Zheng et al, 2006)

Пятно №12 было идентифицировано как пептидилпролил-цис-транс-изомераза Известно, что этот фермент ускоряет фолдинг белков путем цис-транс-изомеризации имидных связей пролина в полипептидах (Goodchild et al, 2004) Некоторые пептидилпролил-цис-транс-изомеразы (ППИаза) способствуют рефолдингу денатурированных белков (Ideno et al, 2001) Ясно, что фолдинг белков имеет решающее значение для адаптации как к низкой, так и к высокой температуре

Таким образом, адаптация "Р mumcola" 2pS к отрицательной температуре основывается на контроле фолдинга РНК (CspA) и белков (пептидилпролил-цис-транс-изомераза), в ней также участвуют ферментные системы транспорта (Uup, АТФзный компонент ABC транспортеров), компоненты электронтранспортных цепей (электронтранспортный фловопротеин) и обезвреживания супероксид-анионов (супероксидцисмутаза)

Заключение.

Выделенные нами в чистую культуру бактерии из арктических криопэгов представляют новые таксоны адаптированных к холоду бактерий видового ранга Представители рода Clostridium имели тесное филогенетическое родство с психрофильными клостридиями из антарктического микробного мата, однако по фенотипическим и хемотаксономическим свойствам штаммы четко дифференцировались друг от друга и от близкородственных клостридий Дифференциация подтвердилась также данными ДНК-ДНК гибридизации

Представители рода Psychrobacter обычны в холодных морских экосистемах Обнаруженная липазная активность у штамма 2pS делает его привлекательным объектом для получения ферментов, расщепляющих жир в холодной воде

Штамм В15, идентифицированный нами как новый вид рода Desulfovibrio, учитывая большую гетерогенность рода и значительные фенотипические и генотипические отличия от ближайшего родственного вида D mexicanus, возможно, представляет новый род семейства Desulfovibrionaceae Необходим поиск дополнительных критериев для того, чтобы четко очертить рамки рода

Обнаруженные нами особенности физиологии роста изолятов при отрицательных температурах - сдвиг оптимума солености и расширение пределов толерантности к солености, расширение спектра утилизируемых субстратов, изменение состава продуктов метаболизма при снижении температуры культивирования, несомненно, являются следствием изменений метаболизма, за которыми, в свою очередь стоят молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов, понять сущность которых и есть конечная цель исследований механизмов адаптации к отрицательной температуре

Адаптация мембраны к низкой температуре являлась предметом изучения многих исследователей С algoriphilum использует стратегию увеличения доли ненасыщенных жирных кислот для роста при отрицательной температуре, хотя уже при оптимальной их уровень достаточно высок (57%) Несмотря на то, что сдвиг в температуре культивирования "Р mumcola" 2pS был очень значительным (28 и -2°С), сумма ненасыщенных жирных кислот мембран этого штамма почти не менялась, однако, в спектре жирных кислот появлялись метилированные соединения и изменялось соотношение цис- и транс-изомеров гексадеценовой кислоты

Способность синтезировать резервные соединения является большим преимуществом в борьбе за существование Внутриклеточное накопление полимерных соединений (полисахаридов) является типичным для клостридий О накоплении, структуре и функции внутриклеточных полисахаридов психрофильных клостридий пока данные в литературе отсутствуют Мы показали, что С algoriphilum образует внутриклеточный полисахарид Его накопление зависело от температуры культивирования, типа и концентрации субстрата Результаты проведенных экспериментов не позволили сделать выводов об участии полисахарида в адаптации к условиям криопэга Возможно, на этот вопрос помогут ответить эксперименты с мутантами, лишенными способности синтезировать полисахарид

Протеомный анализ холодовой адаптации "Р murucola" 2pS выявил изменения в количественном соотношении белков клетки в ответ на воздействие отрицательной температуры Отсутствие секвенированного генома этой бактерии не позволило идентифицировать все холодоиндуцибельные белки Поэтому список белков, участвующих в адаптации к отрицательной температуре, далеко не полный Расширить его также помогут исследования в других диапазонах рН для первого разделения

ВЫВОДЫ

1 Впервые дана микробиологическая характеристика арктических криопэгов Обшее количество микроорганизмов в криопэгах Колымской низменности составило 2 2-6 3х107 кл/мл рассола, в пробах криопэгов Варандейского полуострова 3 5*К)8 кл/мл Сообщество представлено преимущественно психрофнльными и психротолерантными формами

2 Из образцов криопэгов Колымской низменности (скважина 14/99) выделены 2 чистые культуры анаэробных спорообразующих и 2 - аэробных бактерий На основанин физиолого-биохимических и генотипических особенностей показано, что анаэробные бактерии представляют новые виды рода Clostridium - С algoriphilum spnov и "С frigoi iphilum" sp nov, аэробные бактерии - новый вид рода Psychrobacter - "Р murucola" sp nov Сульфатредуцирующая бактерия, выделенная из криопэгов Варандейского полуострова (скважина 21), отнесена к роду Desulfovibrio и представляет новый вид - "D arcticas " sp nov

3 Выделенные из криопэгов Колымской низменности бактерии способны к росту при отрицательных температурах Рост С algoriphilum при -5°С и "Р murucola"2pS при -2°С характеризуется повышением галотолерантности и расширением спектра используемых субстратов Кроме того, у С algoriphilum повышаетсч оптимум солености с 1 г/л до 10 г/л и меняется количественное соотношение продуктов брожения

5 Клетки С algoriphilum, выращенные при -2°С, содержат приблизительно на 10% больше

ненасыщенных жирных кислот, чем выращенные при оптимальной температуре Увеличение

количества непредельных соединений происходит в основном за счет омега-7-цис-

гексадеценовой кислоты Результаты исследования одновременного влияния отрицательной температуры и солености на состав ЖК "Р murucola" 2pS позволили предположить, что адаптация бактерии к отрицательной температуре и высокой солености происходит за счет увеличения ненасыщенных ЖК, а также появлением в составе мембран их метилированных производных.

6 Показано, что полисахарид С algoriphilum является гликогенподобным соединением, состоящим из глюкозных остатков, соединенных преимущественно а-1-4 связями Содержание полисахарида в клетках не зависист от фазы роста культуры, но зависит от температуры культивирования, типа и концентрации углеродного субстрата

7 Изучено изменение протеома "Р murucola " 2pS в ответ на кратковременное и длительное воздействие отрицательных температур Идентифицированы некоторые холодоиндуцибельные белки АТФазные компоненты ABC транспортеров, белок холодового шока (CspA-подобный белок), электронтранспортный флавопротеин, супероксиддисмутаза и пептидилпролил-цис-транс-изомераза, а также два гипотетических белка с неизвестной функцией

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи-

1 Shcherbakova V, N Chuvilskaya, Е Rivkina, S Pechentsyna, К Launnavichuis, Physiological characteristics of bactena isolated from water brines within permafrost // Int J Astrobiol 2004 V 3 N 1 P 37-43

2 Shcheibakova V А , Rivkina E M, Launnavichuis К S , Pechentsma S A Suzma N E , Osipov Yu А, Lysenko А M, Gilichinsky D А, Akimenko V К Novel psychrophilic anaerobic spore forming bacterium from overcooled water brrne within permafrost descnption Clostridium algoriphilum sp nov // Exlremophiles 2005 V 9 N3 P 239-246

3 D Gilichinsky, E Rivkina, С Bakermans, V Shcherbakova, L Petrovskaya, S Ozerskaya, N Ivanushkma, G Kochkina, К Launnavichuis, S Pechentsyna, R Fattakhova, J Tiedje Biodiversity of cryopegs in permafrost //FEMS Microbiol Ecol 2005 V 53 P 117-128

4 Печерицына С А , Щербакова В А, Холодов А Л, Акимов В Н , Абашина Т Н , Сузина Н Е, Ривкина Е М Микробиологический анализ криопэгов Варандейского полуострова на побережье Баренцева моря // Микробиология 2007 Т 76 №5 С 694-701

Тезисы:

1 Печерицына С А, Щербакова В А , Чувильская Н А , Сузина Н Е , Ривкина Е М, Лауринавичюс К С Бактерии-обитатели высокоминерализованных вод в вечной мерзлоте «Биология-наука 21-го века» Сб тезисов 8-й Путинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 20-24 мая 2004 С 157

2 Архипова О В , Печерицына С А , Щербакова В А, Сузина Н Е , Лысанская В Я , Лауринавичюс К С Стратегии выживания микроорганизмов в экстремальных

условиях резервные вещества клетки «Биология-наука 21-го века» Сб тезисов 8-й Путинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 17-21 мая 2004 С 158

3 Печерицына С А , Архипова О В , Лауринавичюс К С , Щербакова В А Адаптация микроорганизмов из криопэга к условиям местообитания «Биология-наука 21-го века» Сб тезисов 9-й Пущинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 18-22 апреля 2005 С 207

4 Суетин С В , Печерицына С А, Лаурннавичюс К С, Щербакова В А Новая психротолерантная бактерия из арктических криопэгов «Биология-наука 21-го века» Сб тезисов 9-й Пущинской школы-конференции молодых ученых Пущино, 18-22 апреля 2005 С 213

5 Печерицына С А, Суетин С В , Лауринавичюс К С , Щербакова В А Адаптация бактерий из арктических криопэгов к отрицательной температуре и высокой солености «Актуальные аспекты современной микробиологии» Сб тезисов Всероссийской молодежной школы-конференции, 1-3 ноября 2005 г С 42

6 V Shcherbakova, Е Rivkma, N Chuvilskaya, S Pechentsina, К Launnavichuis and D Gihchinsky New psychrophilic bacteria from water brines within Arctic permafrost International conference on arctic microbiology, Rovaniemi, Finland, 2004 P 25

7 Pechentsyna S , Arkhipova О , Suetin S , Launnavichuis К, Shcherbakova V Bacteria from supercooled water brine within permafrost and their adaptation to environment 2"J European Conference On Permafrost, Potsdam, Germany, 2005 P 48

8 Pechentsyna S , Shcherbakova V , Arkhipova О , Rivkma E, Launnavichuis К Adaptation of the arctic cryopeg bacteria to the environment The 9,h Symposium on Aquatic Microbial Ecology, Helsinki, 2005 P 82

9 Shcherbakova V , Rivkma E , Chuvilskaya, N , Pechentsyna S , Suetm S , Launnavichuis, К and Gihchinsky D Psychrophilic and psychrotrophic microorganisms from water bnnes withm permafrost The 9th Symposium on Aquatic Microbial Ecology, Helsinki, 2005 P 81

10 Суетин С В , Печерицына С А , Лауринавичюс К С , Щербакова В А Психрофильные бактерии рода Clostridium, выделенные из вечной мерзлоты Арктики «Актуальные аспекты современной микробиологии» 1-3 ноября, 2006 С 33

Подписано в печать 19 09 2007 г Исполнено 20 09 2007 г г Печать трафаретная

Заказ № 742 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Печерицына, Светлана Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. КРИОБИОСФЕРА КАК СРЕДА ОБИТАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ.

1.1 Вечная мерзлота: определение, строение, физико-химические условия.

1.2 Криопэги как часть криосферы Земли и модель для астробиологии. ^

Глава 2. МИКРОБНОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВЕЧНОМЕРЗЛЫХ ПОРОД.

2.1 Численность бактерии в вечномерзлых грунтах.

2.2 Разнообразие культивируемых микроорганизмов.

2.2.1 Прокариоты. 12 2.2.1.1 Характеристика рода Psychrobacter

2.2.2 Эукариоты.

2.3 Изучение микробного разнообразия вечномерзлых грунтов методами молекулярной экологии.

2.4 Метаболическая активность in situ.

Глава 3. АДАПТАЦИЯ ПРОКАРИОТ К ЖИЗНИ ПРИ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ.

3.1 Физиологические группы бактерии по отношению к температуре.

3.2 Кинетика роста при низких температурах.

3.3 Ответ на холодовой шок как начальный этап адаптации клетки к низкой температуре.

3.3.1 Сенсорные системы клетки.

3.3.1.1 Мембрана.

3.3.1.2 Трансляционный аппарат.

3.3.1.3 ДНК и структурирующие ее белки.

3.3.1 Трехстадийная модель ответа на холодовой шок.

3.3.2 Белки холодового шока: структура и функция.

3.3.3 Холодовой шок психрофильных и психротрофиых бактерий.

3.4 Роль компонентов клетки при адаптации к низкой температуре.

3.4.1 Механизмы адаптации мембраны прокариотической клетки к низкой температуре.

3.4.1.1 Стратегии изменения жирнокислотного состава.

3.4.1.2 Состав полярных групп липидов.

3.4.1.3 Состав белков мембраны.

3.4.1.4 Состав каротиноидов.

3.4.2 Холодоактнвные ферменты.

3.4.3 Крпопротекторы: белки и органические осмолнты.

3.5 Геномы иснхрофпльных и иснхротрофных бактерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем"

Актуальность проблемы. Микробиологические исследования последних лет убедительно показали, что в вечной мерзлоте содержатся жизнеспособные микроорганизмы, и об этой части литосферы правомерно говорить как о части биосферы, для которой был предложен термин «криобиосфера» (Vorobyova et al., 1997). Численность микроорганизмов в вечномерзлых породах Арктики и Антарктики составила 103-108 кл/г (Rivkina et al., 1998; Cowan et al., 2002; Gilichinsky et al., 2002; Steven et al., 2004; Gilichinsky et al., 2007). Из проб вечномерзлых грунтов были выделены чистые культуры актиномицетов (Карасев и др., 1998; Gavrish et al., 2003), нитрифицирующих бактерий (Соина и др., 1991), метанотрофов (Хмеленина и др., 2002), сульфатредукторов (Вайнштейн и др., 1995), зеленых одноклеточных водорослей и цианобактерий (Vishnivetskaya et al., 2001), метаногенных архей (Rivkina et al., 2007). Многие изоляты и смешанные популяции проявляли метаболическую активность при отрицательных температурах (Ривкина и др., 2002; Хмеленина и др., 2002; Bakermans et al, 2003; Gilichisky et al., 2003). Исходя из того, что в вечной мерзлоте находится огромное количество микробной биомассы, вклад микроорганизмов криобиосферы может быть очень значительным для глобального круговорота веществ и биогеохимических процессов, и все еще остается неучтенным (Rivkina et al., 2004).

Кроме того, выживание микроорганизмов в условиях вечной мерзлоты поднимает вопрос о механизмах адаптации клетки к условиям местообитания, а также о существовании временного предела сохранения жизни. Решить последнюю проблему экспериментально или при помощи моделирования невозможно. С этой точки зрения многолетнемерзлые отложения являются уникальным объектом, позволяющим наблюдать результат криоконсервации в течение геологического времени.

Большинство планет Солнечной системы имеет криогенный характер, то есть физико-химические условия на них наиболее близки к условиям криосферы Земли. Поэтому вечномерзлые грунты являются уникальной моделью такого внеземного местообитания для живых организмов (Гиличинский, 2002). Кроме того, исследования биоразнообразия вечной мерзлоты дают возможность приобрести ценный опыт отработки методик стерильного отбора и хранения проб для исключения контаминации образцов с одной стороны, и методик обеспечения биологической безопасности с другой.

Криопэги (отрицательнотемпературные рассолы внутри вечной мерзлоты) являются водными системами морского происхождения. Было показано, что микробное сообщество криопэгов Колымской низменности способно окислять 14С-глюкозу при отрицательных температурах вплоть до -15°С (Gilichisky et al., 2003).

К началу нашей работы состав микробных сообществ, населяющих криопэги и способных проявлять метаболическую активность при столь низких температурах, оставались неизвестными.

Цель н задачи исследования. В связи с вышеизложенным, целью нашей работы было исследование состава микробных сообществ и особенностей биологии изолятов, связанных с адаптацией к условиям криопэгов.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Определение численности микроорганизмов в образцах криопэгов Колымской низменности и Варандейского полуострова.

2. Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий, изучение их физиолого-биохимических свойств, определение таксономического положения изолятов.

3. Изучение особенностей роста изолятов при отрицательных температурах и высокой солености.

4. Изучение изменения биохимического состава клеток в ответ на действие отрицательных температур.

Научная повпзиа работы. Впервые дана микробиологическая характеристика отрицательнотемпературных рассолов в вечной мерзлоте. Выделены и описаны чистые культуры адаптированных к холоду аэробных и анаэробных бактерий, представляющих новые виды родов Clostridium, Desulfovibrio, Psychrobacter. Показано, что выделенные бактерии способны к росту при отрицательных температурах. Рост при температурах ниже нуля сопровождался значительными изменениями физиологии и биохимического состава клеток.

Полученные результаты расширяют представления о микробном разнообразии вечной мерзлоты и биологии психрофильных и психротрофных бактерий.

Практическое значение. Изоляты адаптированных к холоду бактерий представляют интерес как компоненты искусственно создаваемых сообществ, способных к биодеградации загрязняющих природу веществ в холодном климате, а также как источники холодоактивных ферментов, используемых в пищевой промышленности, при очистке сточных вод, в молекулярной биологии.

Апробация работы. Основные положения работы доложены на 7-ой, 8-ой, 9-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология-наука 21-го века» (2003 - 2005),

Международной конференция по арктической микробиологии (Рованьеми, Финляндия, 2005), второй европейской конференции по вечной мерзлоте «EUCOP 2005» (Потсдам, Германия, 2005), 9-м симпозиуме по водной микробной экологии (Хельсинки, Финляндия, 2005), Всероссийских Молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005, 2006), а также на ежегодных сессиях научных работ ИБФМ РАН им. Г.К.Скрябина (2003 - 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Печерицына, Светлана Александровна

выводы

1. Впервые дана микробиологическая характеристика арктических криопэгов. Общее количество микроорганизмов в криопэгах Колымской низменности составило 2.2-6.3х107 кл/мл рассола, в пробах криопэгов Варандейского полуострова 3.5х108 кл/мл. Сообщество представлено преимущественно психрофильными и психротолерантными формами.

2. Из образцов криопэгов Колымской низменности (скважина 14/99) выделены 2 чистые культуры анаэробных спорообразующих и 2 - аэробных бактерий. На основании физиолого-биохимических и генотипических особенностей показано, что анаэробные бактерии представляют новые виды рода Clostridium - С. algoriphilum sp.nov. и "С. frigoriphilum" sp.nov; аэробные бактерии - новый вид рода Psychrobacter - "P. muriicola" sp.nov. Сульфатредуцирующая бактерия, выделенная из криопэгов Варандейского полуострова (скважина 21), отнесена к роду Desulfovibrio и представляет новый вид - "D. arcticus" sp.nov.

3. Выделенные из криопэгов Колымской низменности бактерии способны к росту при отрицательных температурах. Рост С. algoriphilum при -5°С и "P. muriicola "2pS при -2°С характеризуется повышением галотолерантности и расширением спектра используемых субстратов. Кроме того, у С. algoriphilum повышается оптимум солености с 1 г/л до 10 г/л и меняется количественное соотношение продуктов брожения.

5. Клетки С. algoriphilum, выращенные при -2°С, содержат приблизительно на 10% больше ненасыщенных жирных кислот, чем выращенные при оптимальной температуре. Увеличение количества непредельных соединений происходит в основном за счет омега-7-цис-гексадеценовой кислоты. Результаты исследования одновременного влияния отрицательной температуры и солености на состав ЖК "P. muriicola" 2pS позволили предположить, что адаптация бактерии к отрицательной температруе и высокой солености происходит за счет увеличения ненасыщенных ЖК, а также появлением в составе мембран их метилированных производных.

6. Показано, что внутриклеточный полисахарид С. algoriphilum является гликогенподобным соединением, состоящим из глюкозных остатков, соединенных преимущественно а-1-4 связями. Содержание полисахарида в клетках не зависит от фазы роста культуры, но зависит от температуры культивирования, типа и концентрации углеродного субстрата.

7. Изучено изменение протеома "Р. muriicola" 2pS в ответ на кратковременное и длительное воздействие отрицательных температур. Идентифицированы некоторые холодоиндуцибельные белки: АТФазные компоненты ABC транспортеров, белок холодового шока (CspA-подобный белок), электронтранспортный флавопротеин, супероксиддисмутаза и пептидилпролил-цис-транс-изомераза, а также два гипотетических белка с неизвестной функцией.

Заключение.

Нами впервые дана микробиологическая характеристика переохлажденных высокоминерализованных вод в толще вечной мерзлоты (криопэгов) Колымской низменности и Варандейского полуострова. Показано, что криопэги являются местообитанием адаптированных к холоду микробных сообществ, среди членов которого были обнаружены жизнеспособные аэробные и анаэробные гетеротрофные бактерии, сульфатредукторы, адетогены и метанобразующие археи. Другими исследователями в пробах криопэгов обнаружены эукариотические организмы - мицелиальные грибы и дрожжи, которые также приспособились к условиям криопэга (Кочкина и др., 2007). Таким образом, в криопэгах присутствуют представители всех трех доменов - Bacteria, Archaea и Eukarya.

Выделенные нами в чистую культуру бактерии из арктических криопэгов представляют новые таксоны адаптированных к холоду бактерий видового ранга. Представители рода Clostridium имели тесное филогенетическое родство с психрофильными клостридиями из антарктического микробного мата. Уровень сходства по последовательностям гена 16S рРНК достигал 99.6%, однако по фенотипическим и хемотаксонсмическим свойствам штаммы четко дифференцировались друг от друга и от близкородственных клостридий. Дифференциация подтвердилась также данными ДНК-ДНК гибридизации.

Представители рода обычны в холодных морских экосистемах. Обнаруженная липазная активность у штамма 2pS делает его привлекательным объектом для получения ферментов, расщепляющих жир в холодной воде.

Штамм В15, идентифицированный нами как новый вид рода Desulfovibrio, учитывая большую гетерогенность рода и значительные фенотипические и генотипические отличия от ближайшего родственного вида D.mexicanus, возможно, представляет новый род семейства Desulfovibrionaceae. Необходим поиск дополнительных критериев для того, чтобы четко очертить рамки рода.

Некоторые установленные нами факты, такие как способность психрофильных клостридий достигать большей плотности к началу стационарной фазы при отрицательной температуре, чем при оптимальной и увеличение экономического коэффициента позволяют предположить, что то, что мы считаем оптимальной для выделенных бактерий температурой, на самом деле таковой не является. Это наводит нас, как и многих других исследователей (Tarpgaard et al., 2005), на мысль о том, что удельная скорость роста не может использоваться как единственный критерий для определения оптимальных условий.

Адаптация мембраны к низкой температуре являлась предметом изучения многих исследователей. С. algoriphilutn использует стратегию увеличения доли ненасыщенных жирных кислот для роста при отрицательной температуре, хотя уже при оптимальной их уровень достаточно высок (57%). Несмотря на то, что сдвиг в температуре культивирования "Р. muriicola" 2pS был очень значительным (28, и -2°С), сумма ненасыщенных жирных кислот мембран этого штамма почти не менялась, однако, в спектре жирных кислот появлялись метилированные соединения и изменялось соотношение цис- и транс-изомеров гексадеценовой кислоты.

Способность синтезировать резервные соединения является большим преимуществом в борьбе за существование. Внутриклеточное накопление полимерных соединений (полисахаридов) является типичным для клостридий. О накоплении, структуре и функции внутриклеточных полисахаридов психрофильных клостридий пока данные в литературе отсутствуют. Мы показали, что C.algoriphilum образует внутриклеточный полисахарид. Его накопление зависело от температуры культивирования, типа и концентрации субстрата. Рост в лимитирующих (по азоту) условиях сопровождался повышенным накоплением полисахарида. Эти факты свидетельствуют в пользу его резервной функции. Результаты проведенных экспериментов не позволили сделать выводов об участии полисахарида в адаптации к условиям криопэга. Возможно, на этот вопрос помогут ответить эксперименты с мутантами, лишенными способности синтезировать полисахарид.

Протеомный анализ холодовой адаптации "Р. muriicola" 2pS выявил изменения в количественном соотношении белков клетки в ответ на воздействие отрицательной температуры. Отсутствие секвенированного генома этой бактерии не позволило идентифицировать все холодоиндуцибельные белки. Поэтому список белков, участвующих в адаптации к отрицательной температуре, далеко не полный. Расширить его также помогут исследования в других диапазонах рН для первого разделения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Печерицына, Светлана Александровна, Пущино

1. Баросс Д., Морита Р. Жизнь микроорганизмов при низких температурах: экологические аспекты. В сборнике статей: Жизнь микробов в экстремальных условиях, под ред. Д. Кашнера. Пер. с англ. Изд. «Мир», М., 1981.

2. Бурашникова Е.Н., Гоготов И.Н. Пурпурная несерная бактерия, выделенная из древней вечной мерзлоты на Колымской низменности// Микробиология. 1994. Т. 63: 868-875.

3. Вайнштейн, М.Б., Гоготова, Г.И. и Хиппе, X. Сульфатредуцирующая бактерия из вечной мерзлоты // Микробиология. 1995. Т. 64. С. 514-518.

4. Гиличинский Д.А., Ривкина Е.М., Щербакова В.А., Лауринавичюс К.С., Комаров И.А., Волков Н.Г. Криопэги и их обитатели модель для астробиологии // Криосфера Земли. 2003. Т. VII. № 3. С. 73-84.

5. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны // Изв. АН СССР, Сер. геолог. 1989. № 6. С. 103-115.

6. Гиличинский Д.А., Хлебникова Г.М., Звягинцев Д.Г., Федоров-Давыдов Д.Г., Кудрявцева Н.Н. Микробиологические характеристики при изучении осадочных пород криолитозоны II Изв. АН СССР. Сер. Геол. 1989. № 6, С. 103-115.

7. Головченко Н.П., Чувильская Н.А., Акименко В.К. Внутриклеточный полисахарид Clostridium thermocellum // Микробиология. 1986. Т.55. Вып. 3. стр.461-464.

8. Голубев В.И. Rhodotorula creatinovora и R. yakutica-новые виды базидиомицетных дрожжей, выделенных из вечномерзлых почв Восточной Сибири // Микология и Фитопатология. 1998 Т.32. С. 8-13.

9. Дмитриев В.В., Гиличинский Д.А., Фазутдинова Р.Н., Шершунов И.Н., Голубев В.И., Дуда В.И. Обнаружение жизнеспособных дрожжей в вечномерзлых почвах Сибири возрастом 3 миллиона лет //Микробиология. 1997. Т. 66. С. 655-660.

10. Карасев С.Г., Турина Л.В., Гавриш Е.Ю., Аданин В.М., Гиличинский Д.А., Евтушенко Л.И. Жизнеспособные актинобактерии из древних вечномерзлых отложений Сибири // Криосфера Земли. 1998. Т.П. №.2. С. 69-75.

11. Кочкина Г.А., Иванушкина Н.Е., Акимов В.Н., Гиличинский Д.А., Озерская С.М. Галопсихроттолерантные грибы рода Geomyces из криопэгов и морских отложений Арктики // Микробиология. 2007. Т. 76. №1. С. 39-48.

12. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам. Изд. «Наука». М., 1976.159 с.

13. Методы общей бактериологии, под ред. Герхардта Ф. и др. Пер. с англ. Т.З. 1984. -М.: 536 с.

14. Новиков Ю.В., Ласточкина К.О., Болдина З.Н. Методы исследования качества воды водоемов. Москва. Медицина. 1990.стр. 116-120.

15. Разумов A.C. Микробиальный планктон воды // Труды Всесоюзного гидробиологического общества. 1962. Т. 12. С. 60-181.

16. Ривкина Е.М., Лауринавичюс К.С., Гиличинский Д.А., Щербакова В.А. Метанобразование в вечномерзлых отложениях Ц Докл. РАН. 2002. Т. 383, № 6, С. 830-833.

17. Соина B.C., Лебедева Е.В., Голышина О.В., Федородов-Давыдов Д.Г., Гиличинский Д.А. Нитрифицирующие бактерии из многолетнемерзлых отложений Колымской низменности //Микробиология. 1991. Т. 60. №.1. С. 187-190.

18. Фотиев С.М. Гидрохимический метод оценки палеотемпературы пород на Арктическом побережье // Криосфера Земли, 1997. Т.1. № 2. С.29-35.

19. Хлебникова Г.М., Гиличинский Д.А., Федоров-Давыдов Д.Г., Воробьева Е.А. Количественное определение микроорганизмов в вечномерзлых отложениях и погребенных почвах. II Микробиология. 1990.59:148-155.

20. Хмеленина В. Н., Макутина В.А., Калюжная М.Г., Ривкина Е.М., Гиличинский Д.А., Троценко Ю.А. Обнаружение жизнеспособных метанотрофных бактерий в вечномерзлых отложениях Северо-Восточной Сибири // Доклады РАН. 2002. Т. 384. С. 235-237.

21. Adamberg, K., S. Kask, T.-M. Laht, and T. Paalme. The effect of temperature and pH on the growth of lactic acid bacteria: a pH-auxostat study II Int. J. Food Microbiol. 2003. V. 85. P.171-183.

22. Aghajari, N. Van Petegem, F.Villeret, V. Chessa, J. P. Gerday, C. Haser, R. Van Beeumen, J.Crystal structures of a psychrophilic metalloprotease reveal new insights into catalysis by cold adapted proteases // Proteins. 2003. V. 50. P. 636-647.

23. Annous, B. A., L. A. Becker, D. O. Bayles, D. P. Labeda, and B. J. Wilkinson. Critical role of anteiso-C(15:0) fatty acid in the growth of Listeria monocytogenes at low temperatures II Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3887-3894.

24. Anonymous. DSMZ catalogue of strains. 2001. 7th ed-n. Braunschweig, Germany: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen.

25. Bae, W., Xia, B., Inouye, M. and Severinov, K. Escherichia coli CspA family RNA chaperones are transcription antiterminators II Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. P. 7784-7789.

26. Bai, Y., D. Yang, Wang, J.Xu, S.Wang, X.An, L. Phylogenetic diversity of culturable bacteria from alpine permafrost in the Tianshan Mountains, northwestern China // Res Microbiol. 2006. V. 157. N.8. P. 741-51.

27. Bakermans C, Tsapin AI, Souza-Egipsy V, Gilichinsky DA, Nealson KH. Reproduction and metabolism at -10°C of bacteria isolated from Siberian permafrost // Environ Microbiol. 2003. V. 5. P. 321-326.

28. Bakermans C. and Nealson K.H. Relationship of critical temperature to macromolecular synthesis and growth yield in Psychrobacter cryopegella H J Bact. 2004. V. 186. N. 8. P. 2340-2345.

29. Bakermans, C., S. L. Tollaksen, Wilkerson G.C., Tiedje J.M. and Thomashow M.F. Proteomic analysis of Psychrobacter cryohalolentis K5 during growth at subzero temperatures // Extremophiles. 2006. P.123-135.

30. Becker, Reece and Poenie. The World of the Cell 3rd Edition. 1996.The Benjamin Cummings Publishing Company. Menlo Park CA.

31. Belanger, A. E., and G. F. Hatfull. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis.ll J. Bacteriol. 1999. V.181. P. 6670-6678.

32. Bell, G. S. et al. Stepwise adaptations of citrate synthase to survival at life's extremes. From psychrophile to hyperthermophile //Eur. J. Biochem. 2002. V.269. P. 6250-6260.

33. Berger, F., N. Morellet, F. Menu, and P. Potier. Cold shock and cold acclimation proteins in the psychrotrophic bacterium Arthrobacter globiformis SI55 // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 2999-3007.

34. Bhakoo M., and A.Herbert. The effects of temperature on the fatty acid and phospholipid composition of four obligately psychrophilic Vibrio spp. // Arch.Microbiol. 1979. V.121. P. 121-127.

35. Bonafonte, M. A., C. Solano, B. Sesma, M. Alvarez, L. Montuenga, D Garcia-Ros, and C. Gamazo. The relationship between glycogen synthesis, biofilm formation and virulence in Salmonella enteritidis // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V. 191. P. 31-36.

36. Bowman J.P., Cavanagh J., Austin J.J. and Sanderson K. Novel Psychrobacter species from Antarctic ornithogenic soils //Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. V. 46. P. 841-848.

37. Bowman J.P., Nichols S.S. and McMeekin T.A. Psychrobacter glacincola sp.nov., a halotolerant, psychrophilic bacterium isolated from Antarctic sea ice // System. Appl. Microbiol. 1997. V. 20. P. 209-215.

38. Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. V.72. P.248-254.

39. Chintalapati S, Kiran M D and Shivaji S Role of membrane lipid fatty acids in cold adaptation // Cell. Mol. Biol. 2004.V. 50. P. 631-642.

40. Choma, C., T. Clavel, H. Domínguez, N. Razafindramboa, H. Soumille, C. Nguyen-the, and P. Schmitt. Effect of temperature on growth characteristics of Bacillus cereus TZ415 11 Int. J. Food Microbiol. 2000. V. 55. P. 73-77.

41. Cline J. D. Spectrophotometry determination of hydrogen sulfide in natural waters // Limnol. Oceanogr. 1969. V.14. P. 444-458.

42. Cloutier, J., D. Prevost, P. Nadeau, and H. Antoun. Heat and cold shock protein synthesis in Arctic and temperate strains of Rhizobia // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 2846-2853.

43. Collins, T., Meuwis, M. A., Gerday, C. and Feller, G. Activity, stability and flexibility in glycosidases adapted to extreme thermal environments // J. Mol. Biol. 2003. V. 328. P. 419-428.

44. Cowan DA, Russell N, Mamais A, Sheppard DM. Antarctic Dry Valley mineral soils contain unexpectedly high levels of microbial biomass // Extremophiles.2002. V. 6. P. 431-436.

45. D'Amico, S., Marx, J. C., Gerday, C. and Feller, G. Activity-stability relationships in extremophilic enzymes II J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 7891-7896.

46. De E., Orange N., Saint N., Guerillon J., De Mot R. and Molle G. Growth temperature dependence of channel size of the major outer membrane protein (Oprf) in psychrotrophic Pseudomonas fluorescens strains // Microbiology. 2007. V. 143. P. 10291035.

47. DeLey J., Catloir H., Reynarts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates II Eur J.Biochem. 1970. V.12. P.133-142.

48. Dersch, P., Kneip, S. & Bremer, E. The nucleoid-associated DNA-binding protein H-NS is required for the efficient adaptation of Escherichia coli K-12 to a cold environment // Mol Gen Gene. 1994. V. 245. P. 255-259.

49. Devereux, R., S. H. He, Doyle, C. L. Orkland, S. Stahl, D. A. LeGall, J. Whitman, W. B. Diversity and origin of Desulfovibrio species: phylogenetic definition of a family // J Bacteriol. 1990. V. 172 N. 7. P. 3609-19.

50. Duman, J. G. and Olsen, T. M. Thermal hysteresis protein activity in bacteria, fungi, and phylogenetically diverse plants // Cryobiology. 1993. V. 30. P. 322-328.

51. Eriksson, S., Hurme, R. and Rhen, M. Low-temperature sensors in bacteria // Philos Trans RSocLondB Biol Sci. 2002. V. 357. P. 887-893.

52. Farewell, A., and F. C. Neidhardt. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity mEscherichia coli/lJ. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 4704-4710.

53. Farrell, J., and A. H. Rose. Temperature effects on microorganisms. In A. H. Rose (ed.), Thermobiology. Academic Press, Inc., Ltd., London, United Kingdom. 1967. p. 147-218.

54. Feller G., Narinx E., Arpigny J. L., Zekhnini Z., Swings J. and Gerday C. Temperaturedependence of growth, enzyme secretion and activity of psychrophilic antarctic bacteria

55. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 41. P. 477-479.

56. Feller, G. and C. Gerday. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation // Nat Rev Microbiol. 2003. V. 1. N. 3. P. 200-208.

57. Fields, P. A. and Somero, G. N. Hot spots in cold adaptation: localized increases in conformational flexibility in lactate dehydrogenase A4 orthologs of Antarctic notothenioid fishes // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 11476-11481.

58. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide dismutases. // Annu Rev Biochem. 1995. V. 64. P. 97-112.

59. Friedmann E.I. Permafrost as microbial habitat. In: Gilichinsky DA (ed) Viable microorganisms in permafrost. Russian Academy of Sciences. 1994. P. 21-26.

60. Gianese, G., Argos, P. and Pascarella, S. Structural adaptation of enzymes to low temperatures H Protein Eng. 2001. V. 14. P. 141-148.

61. Gianese, G., Bossa, F. and Pascarella, S. Comparative structural analysis of psychrophilic and meso- and thermophilic enzymes // Proteins. 2002. V. 47. P. 236-249.

62. Giangrossi, M., Giuliodori, A. M., Gualerzi, C. O. and Pon, C. L. Selective expression of the beta-subunit of nucleoid-associated protein HU during cold shock in Escherichia coli // Mol Microbiol. 2002. V. 44. P. 205-216.

63. Gilbert J.A., Hill P.J., Dodd C.E.R., and Laybourn-Parry J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria II Microbiology. 2004. V. 150. P. 171-180.

64. Gilichinsky D Permafrost. In: Bitton G (ed) Encyclopedia of environmental microbiology. Wiley, New York. 2002. P. 2367-2385.

65. Gilichinsky DA, Rivkina E, Shcherbakova V, Laurinavichuis K, Tiedje JM. Supercooled water brines within permafrost —an unknown ecological niche for microoganisms: a model for astrobiology // Astrobiology. 2003. P.3. P.331-341.

66. Gilichinsky DA, Vorobyova E, Erokhina LG, Fyordorov-Dayvdov DG, Chaikovskaya NR. Long-term preservation of microbial ecosystems in permafrost // Adv Space Res. 1992. V. 12. P. 255-263.

67. Gilichinsky DA. Permafrost model of extraterrestrial habitats. In: Horneck G, BaumstarkKhan C (eds) Astrobiology: the quest for the conditions of life. Springer, Berlin Heidelberg New York. 2002. P. 125-142.

68. Gilichinsky, D., Rivkina, E., Shcherbakova, V., Laurinavichius, K. and Tiedje, J Supercooled Water Brines Within Permafrost -An Unknown Ecological Niche for Microorganisms: A Model for Astrobiology II Astrobiology. 2003. V. 3. N.2. P. 331-341.

69. Goodchild A., Saunders N., Ertan H., Raftery M.,Guilhaus M.,Curmi P., Cavicchioli R. A proteomic determination of cold adaptation in the Antarctic archaeon, Methanococcoides burtonii II Molecular Microbiology. 2004. V. 53. N.l. P. 309-321.

70. Gounot, A. M., and N. J. Russell. Physiology of cold-adapted microorganisms In: R. Margesin and F. Schinner (Ed.) Cold-adapted Organisms: Ecology, Physiology, Enzymology and Molecular Biology. Berlin, Germany. 1999, P. 33-55.

71. Graumann, P. L. and Marahiel, M. A. A superfamily of proteins that contain the cold-shock domain // Trends Biochem Sci. 1998. V. 23. V. 286-290.

72. Guillou, C., and J. F. Guespin-Michel. Evidence for two domains of growth temperature for the psychrotrophic bacterium Pseudomonas fluorescens MFO // Appl. Environ. Microbiol. 1996. V. 62. P. 3319-3324.

73. Harder, W., and H. Veldkamp. Physiology of an obligately psychrophilic marine Pseudomonas species II J. Appl. Bacteriol. 1968. V. 31. P. 12-23.

74. Hasegawa, Y., Kawada, N. and Nosho, Y. Change in chemical composition of membrane of Bacillus caldotenax after shifting the growth temperature II Arch. Microbiol. 1980. V. 126. P. 103-108.

75. Hazel J.R. Thermal adaptation in biological membranes: Is homeoviscous adaptation the explanation? IIAnnu. Rev. Physiol. 1995. V. 57. P. 19-42.

76. Hebraud M.and Potier P. Cold shcock response and low temperature adaptation in psychrotrophic bacteria II J.Mol.Biotechnol. 1999. V.1.N.2.P.211-219.

77. Hébraud, M., E. Dubois, P. Potier, and J. Labadie; Effect of growth temperatures on the protein levels in a psychrotrophic bacterium, Pseudomonas fragi II J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 4017-4024.

78. Herbert D., Phipps P.J. and Strange R.E. Chemical Analysis of Microbial Cells // in Methods of Microbiology. N.Y.-L.: Acad.Press. 1971. V 5B.P.209.

79. Heuchert A., Gluckner F.O., Amann R. and Fischer U. Psychrobacter nivimaris sp. nov., a heterotrophic bacterium attached to organic particles isolated from the south Atlantic (Antarctica) // Syst. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P. 399-406.

80. Hippe, H., Andreesen J. R., and Gottschalk G. The Genus Clostridium-nonmedical. In: A. Balows, H. G. Trüper, M. Dworkin, W., Harder, and K.-H. Schleifer (Eds.) The Prokaryotes, 2nd ed. Springer-Verlag, New York. 1992. P. 1800-1866.

81. Hohorst H. J. Bestimmung mit Lactat-Dehydrogenase und NAD+ // In Methods of enzymatic Analysis. Edited by H. Y. Bergmeyer. Weinhein: Verlag Chemie. 1970. P. 1425.

82. Isaksen, M. F., and B. B. Jorgensen. Adaptation of psychrophilic and psychrotrophic sulfate-reducing bacteria to permanently cold marine environments // Appl. Environ. Microbiol. 1996. 62:408-414.

83. Ivanushkina, N.E., Kochkina, G.A. and Ozerskaya, S.V. (in press) Fungi in ancient permafrost sediments of the Arctic and Antarctic regions In: Life In Ancient Ice (Rogers, S. and Castello, J., Eds.), Princeton Press, Princeton, NJ.

84. Jagannadham, M.V., Rao, V.J. and Shivaji, S., The major carotenoid pigment of a psychrotrophic Micrococcus roseus strain: purification, structure and interaction with synthetic membranes // J.Bacteriol. 1991. V. 173. P. 7911-7917.

85. Jia, Z. and Davies, P. L. Antifreeze proteins: an unusual receptor-ligand interaction // Trends Biochem Sci. 2002. V. 27. P. 101-106.

86. Jiang, W., Hou, Y. and Inouye, M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone //J Biol Chem. 1997. V. 272. P. 196-202.

87. Jones, C. E., G. Shama, D. Jones, I. S. Roberts, and P. W. Andrew. Physiological and biochemical studies on psychrotolerance in Listeria monocytogenes //J. Appl. Microbiol. 1997. V. 83. P. 31-35.

88. Jones, P. G., Krah, R., Tafuri, S. R. and Wolffe, A. P. DNA gyrase, CS7.4, and the cold shock response in Escherichia coli // J Bacteriol. 1992. V. 174. P. 5798-5802.

89. Jung S.Y., Lee M.H., Oh T.K., Park Y.H. and Yoon J.H. Psychrobacter cibarius sp. nov., isolated from jeotgal, a traditional Korean fermented seafood // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. 2005. V. 55. P. 577-582.

90. Juni, E., Heym, G.A. Psychrobacter immobilis gen. nov., sp. nov.: genomospecies composed of gram-negative, aerobic oxidase positive coccobacilli // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 388-392.

91. Kaempfer P., Albrecht A., Buczolitz S. and Busse H.J. Psychrobacter faecalis sp. nov., a new species from a bioaerosol originating from pigeon faeces I I Syst. Appl. Microbiol. 2002. V. 25. P. 31-36.

92. Katayama, T., M. Tanaka, et al. Phylogenetic Analysis of Bacteria Preserved in a Permafrost Ice Wedge for 25,000 Years I I Appl Environ Microbiol. 2007 (in press).

93. Kawahara, H., Li, J., Griffith, M. and Glick, B. R. Relationship between antifreeze protein and freezing resistance in Pseudomonas putida GR12-2 // Curr Microbiol. 2001. V. 43. P. 365-370.

94. Knoblauch, C. and B. B. Jorgensen. Effect of temperature on sulphate reduction, growth rate and growth yield in five psychrophilic sulphate-reducing bacteria from Arctic sediments I I Environ Microbiol. 1999. V. 1. N. 5. P. 457-67.

95. Kropinski, A.M.B., Lewis, V. and Berry, D. Effect of growth temperature on the lipids, outer membrane proteins and lipopolysaccharides of Pseudomonas aeruginosa PAO I I J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 1960-1966.

96. Leiros, H. K., Willassen, N. P. and Smalas, A. O. Residue determinants and sequence analysis of cold-adapted trypsins // Extremophiles. 1999. V. 3. P. 205-219.

97. Lonhienne, T., Gerday, C. and Feller, G. Psychrophilic enzymes: revisiting the thermodynamic parameters of activation may explain local flexibility // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1543. P. 1-10.

98. Los, D., Horvath, I., Vigh, L. and Murata, N. The temperature-dependent expression of the desaturase gene desA in Synechocystis PCC6803 // FEBS Lett. 1993. V. 318. P. 5760.

99. Lovley, D.R., and E.J.P. Phillips. Availability of ferric iron for microbial reduction in bottom sediments of the freshwater tidal Potomac River // Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 52. P.751-757.

100. M.Bhakoo and A.Herbert. The effects of temperature on the fatty acid and phospholipid composition of four obligately psychrophilic Vibrio spp H Arch.Microbiol. 1979. V.121, P. 121-127.

101. Ma, Y., and R. E. Marquis. Thermophysiology of Streptococcus mutans and related lactic-acid bacteria // Antonie Leeuwenhoek. 1997. V. 72. P. 91-100.

102. Mackey, B. M. and J. G. Morris. Ultrastructural changes during sporulation in Clostridium pasteurianum H J Gen Microbiol. 1970. V.63. N. 3. P: 13.

103. Margesin R., G. Neuner and K. B. Storey. Cold-loving microbes, plants, and animals— fundamental and applied aspects // Naturwissenschaften. 2007. V. 94. P. 77-99.

104. Marmur J. and Doty P. Determination of the base composition of deoxyribonucleic acid from its thermal denaturation temperature f/JMolBiol. 1962. V.5. P. 109-118.

105. Mayr, B., Kaplan, T., Lechner, S. and Scherer, S. Identification and purification of a family of dimeric major cold shock protein homologs from the psychrotrophic Bacillus cereus WSBC 10201 // J Bacteriol. 1996. V. 178. P. 2916-2925.

106. Miteva VI, Sheridan PP, Brenchley JE. Phylogenetic and physiological diversity of microorganisms isolated from a deep Greenland ice core // Appl Environ Microbiol. 2004. V. 70. P.202-213.

107. Mohr, P. W., and S. Krawiec. Temperature characteristics and Arrhenius plots for nominal psychrophiles, mesophiles, and thermophiles II J. Gen. Microbiol. 1980. V. 121. P. 311-318.

108. Moore E. R. B., Tindall B. J., Martins Dos Santos V. A. P., Pieper D. H., Ramos J.-L., Palleroni N. J. Pseudomonas: Nonmedical. http://141.150.157.117:8080/ prokPUB/chaprender/jsp/showchap.jsp?chapnum=392&initsec=0400, release 3.0.

109. Morita R.Y. Psychrophilic bacteria // Bacteriol. Rev. 1975. V.39. P. 144-167.

110. Nelson N. A Photometric adaptation of the Somogyi method for determination of glucose IIJ Biol Chem. 1944. V.153. P.375.

111. Nichols D.S,. Miller M.R,. Davies N.W, Goodchild A., Raftery M., and Cavicchioli R. Cold Adaptation in the Antarctic Archaeon Methanococcoides burtonii Involves membrane lipid unsaturation II J. Bacteriol. 2004. V. 186. N. 24. P. 8508-8515.

112. Orange, N. Growth temperature regulates the induction of p-lactamase in Pseudomonas fluorescens through modulation of the outer membrane permeation of a P-lactam-inducing antibiotic I I Microbiology. 1994. V. 140. P. 3125-3130.

113. Ozerskaya, S., Ivanushkina, N., Kochkina, G., Fattakhova, R. and Gilichinsky D. Mycelial fungi from cryopegs II Int. J. Astrobilogy. 2004. V. 3. N.2. P. 27-34.

114. Palleroni N. J. Pseudomonas In: D. J. Brenner, N. R. Krieg, J. T. Staley, and G. M. Garrity (Eds.) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd ed. 2005. SpringerVerlag New York, NY. V. 2, P. 323-379.

115. Panikov N.S. and Sizova M.V. Growth kinetics of microorganisms isolated from Alaskan soil and permafrost in solid media frozen down to -35 °C // FEMS Microbiol Ecol. 2007. V. 59. P. 500-512.

116. Panikov NS, Flanagan PW, Oechel WC, Mastepanov MA and Christensen TR Microbial activity in soils frozen to below -39 °C // Soil Biol Biochem. 2006. V. 38. P. 785-794.

117. Permafrost Subcommittee Glossary of permafrost and related ground-ice terms. Associate Committee on Geotechnical Research, National Research Council of Canada, Ottawa. 1988.

118. Phadtare, S. and Inouye, M. Role of CspC and CspE in regulation of expression of RpoS and UspA, the stress response proteins in Escherichia coli // J Bacteriol. 2001. V. 183. 1205-1214.

119. Powell G.E. Interpretation of gas kinetics of batch cultures // Biotech. Lett. 1983. V.5. N. 7. P. 437-440.

120. Ray M K, Sitaramamma T, Gandhi S and Shivaji S. Occurrence and expression of cspA a cold shock gene in Antarctic psychrotrophic bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1994. V.116. P. 55-60.

121. Reynolds E. The use of leadcitrate at high pH as an electron opague stain in electron microscopy///. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

122. Rivkina E, Gilichinsky D, Wagener S, Tiedje JM, McGrath J Biogeochemical activity of anaerobic microorganisms from buried permafrost sediments // GeomicrobiolJ. 1998. V. 15. P. 187-193.

123. Rivkina E, Laurinavichuis K, McGrath J, Tiedje JM, Shcherbakova V, Gilichinsky D Microbial life in permafrost // Adv Space Res. 2004. V. 33. P. 1215-1221.

124. Rivkina EM, Friedmann EI, McKay CP, Gilichinsky D. Metabolic activity of permafrost bacteria below the freezing point // Appl Environ Microbiol. 2000. V. 66. P. 3230-3233.

125. Rivkina E., Shcherbakova V., Laurinavichuis K., Petrovskaya L., Krivushin K., Kraev G., Pecheritsina S., and Gilichinsky D. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost //FEMS Microbiol Ecol. 2007. V.371. P. 371-384.

126. Rodrigues, D. F. and J. M. Tiedje. Multi-locus real-time PCR for quantitation of bacteria in the environment reveals Exiguobacterium to be prevalent in permafrost // FEMS Microbiol Ecol. 2006. V.59. P. 489-499.

127. Ruger Hans-Jurgen. Substrate-dependent cold adaptations in some deep-sea sediment bacteria // System. Appl. Microbiol. 1988.№ 11. pp. 90-93.

128. Russel N.J. and Hamamoto T. Psychrophiles. In: Horikoshi, K. and Grant, W.D., eds: Extremophiles: Microbial life in extreme environments, Wiley. 1998. P. 25-45.

129. Russell, R. J., Gerike, U., Danson, M. J., Hough, D. W. and Taylor, G. L. Structural adaptations of the cold-active citrate synthase from an Antarctic bacterium // Structure. 1998. V. 6.351-361.

130. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 1989. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

131. Sanchez, E.R. Hsp56: a novel heat shock protein associated with untransformed steroid receptor complexes //J Biol Chem. 1990. V. 265. P. 22067-22070.

132. Saruyama, H., A. Oshima, and S. Sasaki. Changes of viability and protein-synthesizing activity in psychrotrophic and mesophilic bacteria by chilling at 0 degrees C // J. Gen. Appl. Microbiol. 1979. V. 25. P. 247-254.

133. Saruyama, H., and S. Sasaki. Protein synthesis in psychrotrophic and psychrophilic bacteria at various temperatures // J. Fac. Sci. Hokkaido Univ. Ser. 1980. V. 12. P. 107110.

134. Saunders, N. F. et al. Mechanisms of thermal adaptation revealed from the genomes of the Antarctic Archaea Methanogenium frigidum and Methanococcoides burtonii II Genome Res. 2003. V. 13. P. 1580-1588.

135. Schroeder-Leiros, H. K., Willassen, N. P. and Smalas, A. O. Structural comparison of psychrophilic and mesophilic trypsins. Elucidating the molecular basis of cold-adaptation II Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 1039-1049.

136. Shi T, Reeves RH, Gilichinsky DA, Friedmann EI Characterization of viable bacteria from Siberian permafrost by 16S rDNA sequencing. // Microb Ecol. 1997. V.33. P.169-179.

137. Shivaji S., Reddy G.S.N., Raghawan P.U.M., Sarita N.B. and Delille D. Psychrobacter salsus sp. nov. and Psychrobacter adeliensis sp. nov. isolated from fast ice from Adelie Land, Antarctica // Syst. Appl. Microbiol. 2004. V. 27. P. 628-635.

138. Slock J.A., and Stahly D.P. Polysaccharide that may serve as a carbon and energy storage compound for sporulation in Bacillus cereus// J.Bacteriol. 1974. V.120. N.l. P.399.

139. Somero, G. N. Proteins and temperature l/Annu. Rev. Physiol. 1995. V.57. P. 43-68.

140. Spatafora, G., K. Rohrer, D. Barnard, and S. Michalek. A Streptococcus mutans mutant that synthesizes elevated levels of intracellular polysaccharide is hypercariogenic in vivo // Infect. Immun. 1995. V. 63. P. 2556-2563.

141. Spirina, E., J. Cole, B. Chai, J. Tiedje, D. Gilichinsky. New high through put approach to study ancient microbial phyligenetic diversity in permafrost // Cryospheric Sciences Programme. 2003. Vol. 5. Abstract EAE03-A-01243.

142. Stams F.J.M., M. Veenhuis, G.H. Weenk, and T.A. Hansen . Occurrence of polyglucose as a storage polymer in Desulfovibrio species and Desulfobulbus propionicus // Arch. Microbiol. 1983. V.136. N.l. P.54-59.

143. Steven B, Pollard W, McKay CP, Greer CW, Whyte LG. Diversity of culturable bacteria isolated from permafrost and ground ice from the Canadian High Arctic. In: 10th International symposium on microbial ecology. 2004. P.123-134.

144. Steven B., Le' veille'R., Pollard W., Whyte L. Microbial ecology and biodiversity in permafrost // Extremophiles. 2006. V.10. P. 259-267.

145. Strasdine G.A. The role of intracellular glucan in endogenous fermentation and spore maturation in Clostridium botulinum type E // CanJ. Microbiol. 1972. V.18. P.211-217.

146. Suutari, M. and Laakso, S. Microbial fatty acids and thermal adaptation // Crit. Rev. Microbiol. 1994. V. 20. P. 285-328.

147. Suzuki, I., Kanesaki, Y., Mikami, K., Kanehisa, M. & Murata, N. Cold regulated genes under control of the cold sensor Hik33 in Synechocystis // Mol Microbiol. 2001. V. 40. P. 235-244.

148. Suzuki, I., Los, D. A., Kanesaki, Y., Mikami, K. and Murata, N. The pathway for perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis // EMBO J. 2000. V. 19. P. 1327-1334.

149. Thieringer, H. A., P. G. Jones, and M. Inouye. Cold shock and adaptation // Bioessays. 1998. V. 20. P. 49-57.

150. Tiedje, J. M. Bacterial community in ancient Siberian permafrost as characterized by culture and culture-independent methods // Astrobiology. 2006. V. 6. N. 3. P. 400-414.

151. Van de Peer, Y., De Wachter, R. Construction of evolutionary distance trees with TREECON for Windows: accounting for variation in nucleotide substitution rate among sites // Comput. Applic. Biosci. 1997. V.13. P. 227-230.

152. VanBogelen, R. A. and Neidhardt, F. C. Ribosomes as sensors of heat and cold shock in Escherichia colli. Proc Natl Acad Sci USA. 1990. V. 87. P. 5589-5593.

153. Vela A.I., Collins M.D., Latre M.V., Mateos A., Moreno M.A., Hutson R., Domingez L. and Fernandez-Garayzibal J.F. Psychrobacter pulmonis sp. nov., isolated from the lungs of lambs Hint. J. Syst. Evol Bacteriol. 2003. V. 53. P. 415-419.

154. Vishnivetskaya T, Kathariou S, McGrath J, Gilichinsky DA, Tiedje JM. Low-temperature recovery strategies for the isolation of bacteria from ancient permafrost sediments // Extremophiles. 2000. V.4. P.165-173.

155. Vorobyova E, Soina V, Gorlenko M, Minkovskaya N, Zalinova N, Mamukelashvili A, Gilichinsky DA, Rivkina E, Vishnivetskaya T. The deep cold biosphere: facts and hypothesis II FEMS Microbiol Rev. 1997. V.20. P. 277-290.

156. Wada, M., Fukunaga, N. and Sasaki, S. Effect of growth temperature on phospholipid and fatty acid composition in a psychrotrophic bacterium, Pseudomonas sp. strain E-3 I I Plant Cell Physiol. 1987. P. 28. P. 1209-1214.

157. Weber, M. H. W. and Marahiel, M. A. Coping with the cold: the cold shock response in the Gram-positive soil bacterium Bacillus subtilis I I Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2002. V. 357. P. 895-907.

158. Weber, M. H. W., Beckering, C. L. and Marahiel, M. A. Complementation of cold shock proteins by translation initiation factor IF1 in vivo II J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 73817386.

159. Widdel, F. and Bak, F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. In The Prokaryotes, pp. 3352-3378. Edited by A. Balows, H. G. Triiper, M. Dworkin, W. Harder & K. H. Schleifer. 1992. Berlin: Springer Verlag.

160. Wilkinson, J.F. The problem of energy-storage compounds in bacteria // Exp. Cell Res. Suppl. 1959. V. 7. P.lll-130.

161. Woldringh, C. L., Jensen, P. R. and Westerhoff, H. V. Structure and partitioning of bacterial DNA: determined by a balance of compaction and expansion forces // FEMS Microbiol Lett. 1995. V. 131. P. 235-242.

162. Wolin, E. A., M. J. Wolin, and R. S. Wolfe. Formation of methane by bacterial extracts // J. Biol. Chem. 1963. V. 238. P. 2882-2886.

163. Yamanaka, K., Zheng, W., Crooke, E., Wang, Y. H. and Inouye, MCspD, a novel DNA replication inhibitor induced during the stationary phase in Escherichia coli // Mol Microbiol. II2001. V. 39. P. 1572-1584.

164. Yamashita, Y., Nakamura, N., Omiya, K., Nishikawa, J., Kawahara, H. and Obata, H. Identification of an antifreeze lipoprotein from Moraxella sp. of Antarctic origin 11 Biosci Biotechnol Biochem. 2002. V.66. P. 239-247.

165. Yoon J.H., Lee C.H., Kang S.J. and Oh T.K. Psychrobacter celer sp. nov., isolated from sea water of the South Sea in Korea // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. 2005. V. 55. P. 18851890.

166. Yoon J.H., Lee C.H., Yeo S.H. and Oh T.K. Psychrobacter aquimaris sp. nov. and Psychrobacter namhaensis sp. nov., isolated from sea water of the South Sea in Korea // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. 2005. V. 55. P. 1007-1013.

167. Yoon J.H., Yeo S.H., Oh T.K. and Park Y.H. Psychrobacter alimentarius sp. nov., isolated from squid jeotgal, a traditional Korean fermented seafood // Int. J. Syst. Evol Bacteriol. 2005. V. 55. P. 171-176.

168. Zheng S., Ponder M., Shih J., Tiedje J., Thomashow M., Lubman D. A proteomic analysis of Psychrobacter articus 273-4 adaptation to low temperature and salinity using a 2-D liquid mapping approach II Electrophoresis. 2006. V.27. P.157-169.

169. Zvyagintsev D.G. Microorganisms in permafrost. Phisiol. Gen. Biol. Rev. Russ. Sci. Rev. / Ed. T.M. Turpaev. Harwood Academic Publishers GmbH. 1995. 325.

Информация о работе

Печерицына, Светлана Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Микроорганизмы из переохлажденных высокоминерализованных водных экосистем - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы