Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Наноформы бактерий в некоторых почвах России

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Наноформы бактерий в некоторых почвах России"

На правах рукописи

Конова Ирина Александровна

НАНОФОРМЫ БАКТЕРИЙ В НЕКОТОРЫХ ПОЧВАХ РОССИИ

Специальность 03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

14 моя ш

005538292

Москва-2013

005538292

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

Лысак Людмила Вячеславовна, доктор биологических наук, доцент, Московский государственный университет имени

М.В.Ломоносова, факультет почвоведения, кафедра биологии почв

Васильева Лина Васильевна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, старший научный сотрудник; Барышникова Лидия Михайловна, кандидат биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, старший научный сотрудник Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита диссертации состоится «3» декабря 2013 г. в 15 часов 30 минут в аудитории М-2 на заседании Диссертационного совета Д 501.002.13 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, г. Москва. Ленинские горы, д. 1, строение 12, МГУ имени М.В.Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета почвоведения МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан «"/ »<&2^.р2013 г.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Диссертационного совета. Отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по вышеуказанному адресу.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор ¿¡-СМ-РТА- Галина Михайловна Зенова

Общая характеристика работы

Актуальность

В последнее время в связи с развитием электронно-микроскопических и молекулярно-биологических методов исследования стало ясно, что мелкие бактерии с размером клеток около 200-300 им, описываемые терминами «ультрамикробактерии», «нанобактерии», «наноформы», «фильтрующиеся формы», «ультрамикроклетки», широко распространены в природных средах, гораздо шире, чем это представляется с первого взгляда (Дуда и др., 2007, 2012; Дмитриев и др., 2008; Panikov, 2005).

Впервые микроскопические живые объекты размером менее 300 нм, выделенные из морской воды, описал микробиолог Р. Морита в 1981 г. под названием «ультрамикробактерии», или «наннобактерии». Современное понятие о нанобактериях ввел в научный оборот Р. Фолк, обнаруживший в 1988 г. в итальянских травертинах округлые и овальные тельца размером менее 200 мкм. Фолк полагал, что эти образования представляют собой доселе неизвестную форму жизни, и высказал мнение, что они участвуют в процессах образования вторичных минералов (Folk, 1996; 1999). В конце 90х гг. прошлого века группа финских микробиологов под руководством Олави Каяндера сообщила об обнаружении в организме человека живых размножающихся микрообъекгов размером около 200 нм (Kajander, Ciftcioglu, 1998).

В нашей стране один из первых обзоров о «невидимых формах видимых бактерий» был дан Д.М. Новогрудским (1933 г.). С развитием электронно-микроскопических методов интерес к наноформам бактерий возрос, и было показано, что клетки в почвах имеют меньшие размеры, чем на лабораторных питательных средах; примерно 40% почвенных бактерий в природе имеют размеры, лежащие за пределами видимости светового микроскопа (Ананьева, Никитин, 1979).

Проблема выделения и исследования наноформ бактерий (ультрамикробактерий) привлекла особо пристальное внимание

3

исследователей в последнее время связи с возросшим интересом к развитию нанотехнологий. Высказывается предположение, что наноформы бактерий могут рассматриваться как составная часть «скрытого» разнообразия почвенных бактерий, функции которых в биосфере практически не исследованы и которые могут играть значительную роль в процессах, происходящих в почвах (Чернов и др., 2012).

Предположение об участии микроорганизмов в формировании железомарганцевых конкреций (микробиологическая концепция) высказывалось еще в прошлом веке (Перфильев, Габе, 1961; Аристовская, 1965). Однако, несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие микроорганизмов в процессах образования почвенных конкреций изучено явно недостаточно. Вне поля зрения ученых остается изучение наноформ бактерий в почвенных конкрециях.

Целью данной работы была оценка численности, изучение потенциальной жизнеспособности, таксономического состава и морфологии наноформ бактерий в некоторых почвах России и отдельных почвенных локусах для получения представления об их роли в почве.

Задачи исследования: О определение численности наноформ бактерий в различных природных и городских почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях методом люминесцентной микроскопии (окраска акридином оранжевым и L7012 (LIVE/DEAD)); О определение потенциальной жизнеспособности наноформ бактерий в почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях; О исследование таксономического разнообразия наноформ бактерий на уровне филумов с помощью метода FISH (fluorescence in situ hybridization);

О изучение морфологического разнообразия наноформ методами

сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.

Научная новизна

Впервые установлено, что численность наноформ бактерий в образцах различных природных почв велика и составляет от десятков до сотен миллионов клеток в 1 г почвы, при этом в городских загрязненных почвах доля наноформ бактерий выше, чем в природных ненарушенных почвах. Впервые показано, что в почвенных новообразованиях (железо-марганцевые конкреции и карбонатные новообразования) значительная часть бактерий представлена наноформами бактерий. При помощи метода FISH среди наноформ бактерий были обнаружены представители основных доменов прокариот: Archaea и Bacteria (филумы Actinobacteria, Proteobacteria, Acidobacteria и Planctomycetes). Впервые в образцах почвенных конкреций были обнаружены представители малоизученных филумов Acidobacteria и Planctomycetes. Электронно-микроскопические исследования

продемонстрировали большое морфологическое разнообразие клеток наноформ бактерий в почвах и конкрециях.

Практическая значимость

Проведенные исследования позволяют предположить, что именно наноформы бактерий служат тем «пулом» бактерий, который обеспечивает сохранение биоразнообразия почвенных бактерий в неблагоприятных условиях, способных переходить в активное состояние при изменении условий в сторону, благоприятную для развития этих бактерий. Наноформы бактерий являются перспективным компонентом для создания бактериальных удобрений, поскольку их высокая потенциальная жизнеспособность обеспечивает высокую устойчивость при хранении. Высокую доля и значительная жизнеспособность наноформ бактерий, в том числе грамотрицательных, среди которых много патогенных форм, в городских почвах необходимо принимать во внимание при проведении

санитарно-эпидемиологических исследований.

5

Результаты проведенных исследований используются при чтении лекций по курсам «Общая экология» и «Экология бактерий» для студентов факультета почвоведения МГУ

Публикации

По результатам исследования опубликовано 13 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных работ.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на международных конференциях: XV Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Международный научно-технический конгресс ELPIT-2011 (Тольятти, 2011), XVI Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2011), Международная конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013).

Объем и структура работы

Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, выводы и список упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на ¡/О страницах текста, иллюстрирована рисунками, содержит Jj таблиц. Список литературы состоит из '/С? наименований, в том численна иностранном языке.

Работа выполнена при финансовой поддержке проектов: ГК № 02.740.11.0283, НШ-2227.2008.4.

Благодарности

Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю и неизменному наставнику д.б.н. Л.В. Лысак. Также

6

благодарю д.б.н. Д.Г. Звягинцева за особое внимание к моей работе и мудрые советы; к.б.н. Е.В. Лапыгину за содействие в люминесцентно-микроскопических исследованиях и моральную поддержку; д.б.н. H.A. Манучарову за помощь в освоении метода FISH; к.б.н. B.C. Соину за то, что была моим проводником в мир электронной микроскопии; к.б.н. А. Качалкина за помощь в обработке фотографий; коллектив Межкафедральной лаборатории электронной микроскопии за предоставление приборной базы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Объекты исследования

Для изучения численности, потенциальной жизнеспособности, филогенетического разнообразия и электронно-микроскопического анализов наноформ бактерий в природных ненарушенных почвах были использованы образцы следующих почв России: дерново-подзолистая легкосуглинистая (Брянская обл.), чернозем выщелоченный (Предбайкальская впадина), аллювиальная луговая кислая (Московская обл., пос. Луговая), торфяная верховая болотная (Тверская область), горно-луговая суглинистая (плато Лагонаки), дерново-карбонатная выщелоченная (Азишский хребет, респ. Адыгея), бурая лесная ненасыщенная (Краснодарский край).

Использовали также образцы городских почв, загрязненных углеводородами нефти и тяжелыми металлами, и образцы почвоподобных техногенных образований (ПТО) города Москвы. Исследовали наноформы бактерий в железо-марганцевых почвенных конкрециях и карбонатных новообразованиях в дерново-луговой, дерново-подзолистой (Московская обл., УОПЭЦ Чашниково), погребенной каштановой солонцеватой (Волгоградская обл.) и светло-каштановой почвах (Ростовская обл.).

Подробная характеристика почв приведена в тексте диссертации.

Методы исследования

Выделение наноформ бактерий из почвенных образцов проводили методом фильтрации нативного бактериального комплекса через мембранные фильтры «Sarstedt» с размером пор 200 нм.

Определение численности и потенциальной жизнеспособности бактериальных клеток проводили прямым люминесцентно-микроскопическим методом с применением флюоресцентных красителей акридина оранжевого и L7012 (LIVE/DEAD).

Разнообразие и численность отдельных филогенетических групп прокариотов оценивали с помощью метода FISH (fluorescence in situ hibridisation), который предоставляет возможность анализировать таксономическую структуру метаболически активной части микробных сообществ. Были использованы зонды для обнаружения филогенетических групп: Archaea и Bacteria (филумы Acidobacteria, Actinobacteria, Cytophaga, Planctomycetes, Proteobacteria\ Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria).

Для детального изучения морфологии клеток наноформ бактерий были применены методы сканирующей электронной микроскопии и просвечивающей электронной микроскопии (микроскопы JSM-6380 LA, JEM-1011 и JEM-100В фирмы JEOL). Детальное описание методик постановки экспериментов представлено в тексте диссертации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в разных типах почв.

Численность бактериальных клеток оценивали с помощью красителей акридина оранжевого и L7012. Общая численность бактерий в образцах природных ненарушенных почв составляла от 1300 до 12900 млн. клеток в 1 г почвы. Наноформы бактерий были обнаружены во всех исследованных нами образцах почв. Численность наноформ бактерий в образцах верхних

горизонтов равнинных и горных почв России, определенная методом люминесцентной микроскопии, варьировала от 10 до 300 млн клеток в 1 г почвы. Максимальные показатели были зарегистрированы в торфяной верховой болотной почве (300 млн. клеток в 1 г) и черноземе выщелоченном (100 млн. клеток в 1 г). Доля наноформ бактерий от общего числа бактериальных клеток составила от 0,5 до 7% (табл. 1).

Изучение потенциальной жизнеспособности клеток наноформ с помощью красителя L7012 показало, что доля жизнеспособных клеток достигала 89-97%, что было значительно выше, чем доля потенциально жизнеспособных клеток среди бактерий обычного размера - 50-65% (рис. 1).

Полученные результаты, демонстрирующие высокую долю потенциально жизнеспособных клеток среди наноформ бактерий, позволяют предположить их повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов в почве, по сравнению с бактериями более крупного размера.

Проведенный филогенетический анализ прокариот, обитающих в профиле торфяной верховой болотной почвы и горно-луговой почвы, проведенный при помощи метода FISH, показал, что во всех образцах присутствуют представители доменов Archaea и Bacteria. Среди домена Bacteria присутствуют филумы Actinobacteria, Cytophaga, Proteobacteria (альфа-, бета- и гамма- протеобактерии). Во всех исследованных слоях торфяника было выявлено доминирование грамотрицательных бактерий {Cytophaga, Proteobacteria) и снижение доли актинобактерий, что согласуется с результатами исследований, проведенных при помощи традиционных методов посева (Добровольская и др., 2007), и при помощи метода FISH (Панкратов и др., 2005).

Таблица 1.

Общая численность бактерий и численность наноформ бактерий в

Почва, горизонт Общая численность, млн. клеток/г Численность наноформ, млн. клеток/г Доля наноформ, %

Дерново-подзолистая (Брянская область), А 1300±65 12±0,6 1

Чернозем выщелоченный (Предбайкальская впадина), Ас1 3000±150 100±5 3,3

Чернозем обыкновенный (станица Кущевская), Апах 2400±120 40±2 1,7

Аллювиальная луговая кислая (Московская область), А 1400±70 80±4 5,7

Торфяная верховая болотная (Тверская область), ТО 4300±215 300±15 7

Горно-луговая (плато Лагонаки), Ай 12900±645 70±3,5 0,5

Дерново-карбонатная (Азишский хребет), А 3600±180 30±1,5 0,8

Бурая лесная (Краснодарский край), А 4800±240 60±3 1,3

Серая лесная (станица Даховская), А 1700±85 20±1 1,4

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

% Бактерии обычного размера

Наноформы

11111

111111

щмрвр шин

О Клетки с поврежденной

мембраной ш Потенциально жизнеспособные клетки

1 2

4 5

Рис. 1. Доля потенциально жизнеспособных клеток среди бактерий обычных размеров и наноформ бактерий (окраска Ь7012) в почвенных образцах: 1 - дерново-подзолистая; 2 - чернозем выщелоченный; 3 -аллювиальная луговая; 4 - верховой торфяник; 5 - горно-луговая; 6 -дерново-карбонатная; 7 - бурая лесная.

Таксономический состав наноформ бактерий и бактерий обьганого размера имеет черты сходства: доминирующей группировкой являются грамотрицательные бактерии (Cytophaga и РШеоЬаМепа), ниже доля актинобактерий (12-29%) и домена АгсНаеа (13-29%), доля протеобактерий по всему профилю была выше, чем доля цитофаг, вниз по профилю увеличивалась доля архей. Были выявлены также и некоторые отличия. Среди наноформ по сравнению с бактериями обычного размера была несколько выше доля архей и ниже доля актинобактерий (рис. 2).

Бактерии обычного размера

Наноформы

ШАгсЪаеа а Су1ор}ища

В Неидентифицированные клоны

Рис. 2. Таксономический состав торфяной верховой болотной почвы.

\aActimbacteria \nProteobacteria

бактерий и наноформ в образцах

2. Численность и потенциальная жизнеспособность наноформ бактерий в городских почвах.

Помимо природных ненарушенных почв были исследованы образцы городских загрязненных почв (загрязнение углеводородами нефти, тяжелыми металлами) и почвоподобные техногенные образования города Москвы.

В городских загрязненных почвах общая численность бактерий составляла 200-400 млн. клеток в 1 г почвы. Численность наноформ бактерий варьировала от 28 до 44 клеток в 1 г. Доля наноформ от общего числа клеток при этом составляла от 12,1 до 14,4%, что в два и более раз выше, чем в природных незагрязненных почвах (табл. 2). Это позволяет предположить, что формирование наноформ бактерий представляет собой универсальную ответную реакцию организмов на неблагоприятные условия и стрессовые факторы (Roszak, Colwell, 1987).

Изучение потенциальной жизнеспособности бактерий и наноформ бактерий из образцов городских почв, проведенное при помощи красителя L7012, показало высокую жизнеспособность наноформ бактерий. В загрязненных почвах доля жизнеспособных клеток среди наноформ составляла 85-90%. Среди клеток обычного размера эта величина не превышала 55-62%.

Общая численность бактерий в почвоподобных техногенных образованиях в среднем была выше, чем в городских загрязненных почвах и составила 1100-3000 млн. клеток в 1 г почвы. Максимальное значение было зафиксировано в серогумусовой почве (3000 млн. клеток в 1 г), минимальное - в реплантоземе (1100 млн.). Численность бактерий в образцах урбанозема составила 2500 млн. клеток в 1 г почвы. Численность наноформ бактерий в образцах почвоподобных техногенных образрваний была практически одинаковой для всех образцов и составила 150-170 млн. клеток. Доля наноформ бактерий варьировала от 5 до 15,5% и в среднем была выше, чем доля наноформ в природных ненарушенных почвах, но ниже аналогичного показателя для городских загрязненных почв (табл. 2).

13

Таблица 2.

Общая численность бактерий, численность наноформ бактерий и доля наноформ в городских загрязненных почвах и почвоподобных техногенных __образованиях.

Почва Общая численность бактерий, млн. кл./г Численность наноформ бактерий, млн. кл./г Доля наноформ, %

Городские загрязненные почвы

Урбанозем (придорожная полоса) 194±10 28±1 14,4

Урбанозем (тяжелые металлы) 300±15 38±2 14,0

Интрузем (нефтезагрязнение) 430±22 44±2 12,1

Почвоподобные техногенные образования

Реплантозем 1100±55 170±8,5 15,5

Серогумусовая 3000±150 150±7,5 5

Урбанозем 2500±125 160±8 6,4

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в природных почвах численность наноформ бактерий весьма велика и может составлять от десятков миллионов до сотен миллионов клеток в 1 г почвы. При этом доля потенциально жизнеспособных клеток среди наноформ значительно выше, чем среди клеток обычного размера. Филогенетическое разнообразие наноформ весьма велико, среди них обнаружены представители основных таксонов, широко представленных в почве. Обращает на себя внимание высокая доля неидентифицированных клеток, выявленная среди наноформ бактерий с помощью метода FISH, что может быть связано как с физиологическим состоянием клеток, так и набором использованных зондов.

Доля наноформ бактерий в городских почвах значительно выше доли наноформ в природных ненарушенных почвах, что позволяет предположить,

что высокая степень загрязнения городских почв тяжелыми металлами и нефтепродуктами приводит к нанотрансформации бактериальных клеток.

3. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в почвенных новообразованиях.

В настоящее время значительная роль микроорганизмов в образовании почвенных конкреций является общепризнанной. Согласно литературным данным, наноформы бактерий могут принимать участие в процессах образования минералов (Folk, 1996, 1999; Panikov, 2005). Почвенными локусами, где происходит активное минералообразование, являются железистые и железо-марганцевые конкреции, а также карбонатные новообразования.

Нами были исследованы образцы карбонатных новообразований и вмещающего горизонта АВ светло-каштановой почвы. Общая численность бактерий в образцах горизонта АВ составила 1000 млн. клеток в 1 г почвы. Численность наноформ бактерий была довольно велика - 300 млн. что составило 30% общей численности. Общая численность бактерий обычного размера в образцах карбонатных новообразований была выше - 1600 млн. клеток в 1 г, при этом доля наноформ составила 19% (300 млн.) (табл. 3). Численность бактерий в исследуемых образцах дерново-подзолистой почвы изменялась от 4100 до 1070 млн. клеток в 1 г и была максимальной в горизонте В. Показатели численности бактерий в образцах конкреций из горизонта ЕВ были ниже, чем во вмещающем горизонте, и составляли 1800 и 2200 млн. соответственно.

Наноформы бактерий были обнаружены во всех исследованных образцах дерново-подзолистой почвы. Численность их снижалась вниз по профилю от 800 до 500 млн. клеток в 1 г почвы; при этом происходило возрастание их доли с 29 до 46%. Доля наноформ была выше почти в 2 раза в конкрециях, чем во вмещающем горизонте ЕВ (табл. 3).

Анализ потенциальной жизнеспособности бактерий (окраска красителем 1,7012) показал, что доля жизнеспособных клеток снижалась вниз по профилю с 80 до 47%. При этом в образцах конкреций этих клеток было в полтора раза больше, чем во вмещающем горизонте (80 и 54% соответственно).Среди наноформ бактерий доля жизнеспособных клеток очень высока: 90% и выше. Эти результаты совпадают с ранее полученными данными о жизнеспособности наноформ бактерий в природных и городских почвах России.

Оценка численности бактерий в магнитных и немагнитных конкрециях и вмещающем горизонте А' дерново-луговой почвы показала, что олбщая численность бактерий во вмещающем горизонте была максимальна - 2800 млн. клеток в 1 г. Этот показатель в немагнитных и магнитных конкрециях был ниже и составлял 1800 и 1400 млн. клеток соответственно (табл. 3).

Наноформы бактерий обнаружены во всех образцах дерново-луговой почвы. Их численность была выше в немагнитных (600 млн. клеток в 1 г) и ниже в магнитных конкрециях (300 млн. клеток). При этом доля наноформ бактерий была выше в конкрециях и ниже во вмещающем горизонте (табл. 3).

Были исследованы также образцы горизонта В' погребенной каштановой солонцеватой почвы, содержащие марганцевые новообразования. Общая численность бактерий в горизонте В' была невысока - 400 млн. клеток в 1 г, при этом численность наноформ бактерий составила 380 млн. (95% от общей численности) (табл. 3). Доля потенциально жизнеспособных клеток среди наноформ бактерий составила 98%, что подчиняется закономерности, наблюдаемой в ранее изученных почвенных образцах.

Таблица 3.

Общая численность бактерий, численность наноформ бактерий и доля _наноформ бактерий в исследованных почвах

Вариант Общая численность бактерий, млн. клеток/г Наноформы бактерий, млн. клеток/г Доля наноформ от общего числа клеток, %

Светло-каштановая почва Вмещающий горизонт АВ 1000±50 300±15 30

Карбонатное новообразование 1600±80 300±15 19

Дерново-подзолистая почва ЕВ 2240±112 660±33 29

Конкреции 1790±90 730±36 41

Дерново-луговая почва Вмещающая почва (горизонт А') 2800±140 600±30 21

Немагнитные конкреции 1800±90 600±30 33

Сильномагнитны е конкреции 1400±70 300±15 21

Погребенная каштановая солонцеватая почва Горизонт В1 (марганцевые новообразования) 400±20 380±1б 95

В процессах превращения железа и марганца в почвах по литературным источникам участвуют представители разных таксономических групп прокариот (Аристовская, 1980; Пиневич, 2005; Водяницкий, 2010). Большинство из них принадлежат к филумам Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria,

Deltaproteobacteria, Acidobacteria и Planctomycetes. Поэтому нами была предпринята попытка обнаружить именно эти филумы как среди наноформ бактерий, так и среди бактерий обычного размера в образцах конкреций исследуемых почв, при помощи метода FISH.

В образцах конкреций как среди наноформ, так и среди бактерий обычного размера, были обнаружены вышеперечисленные таксоны

17

(филумы). Однако доля их во вмещающем горизонте и конкрециях исследованных почв была различна.

Гор. ЕВ Конкреции из гор. ЕВ

10%

14%

15%

10%

19%

17%

13%

16%

а л ¡ркарго геоЪат па □ Ве гаргохеоЪасш 1а а ОаттаргоЫоЪасхегга зОгиаргсЛеоЪааепа

оАШоЬаЯепа

0 Рктаотусегез

Рис. 3. Таксономический состав наноформ бактерий в образцах дерново-подзолистой почвы.

В дерново-подзолистой почве среди наноформ бактерий во вмещающем горизонте и в конкрециях доминировали протеобактерии (75% и 81% соответствено); соотношение различных классов протеобактерий практически не различалось (рис.3). Большую часть в обоих случаях занимали СаттарШеоЬасгепа (29% во вмещающем горизонте, 37% в конкрециях), чуть меньше было обнаружено бета- (19% и 17%), дельта- (13% и 16%) и альфапротеобактерий (14 и 11%). Доля АЫс1оЬас1епа во вмещающем горизонте составила 15% при 10% в конкрециях; процент представителей Р1апс1отусе1ез почти не различался: 10% и 9% во вмещающем горизонте и конкрециях соответственно. Можно предположить, что именно представители класса СаттарШеоЬааепа играют важную роль в процессах превращения железа в этом почвенном локусе, поскольку по литературным данным представители многих родов, входящих в этот класс способны участвовать в превращениях железа и марганца в окислительных и восстановительных условиях (Пиневич, 2005).

В дерново-луговой почве среди наноформ бактерий в конкрециях и вмещающем горизонте также доминировали протеобактерии, однако доля представителей различных классов была различной. В магнитных и немагнитных конкрециях преобладали ОеНарго1еоЬас1епа (24% и 35% соответственно). Меньше была доля Ве1аргогеоЪаШпа (21% и 18%), АфИарМеоЬаМепа (11% и 10%) и ОаттарШеоЬа&епа (8% и 10%). Соотношение АайоЪас1епа и Planctomycet.es в конкрециях различалось: ацидобактерии преобладали в немагнитных конкрециях (18%), их доля в немагнитных конкрециях составила 14%. Доля Р1апсЮтусеге8 в магнитных конкрециях составила 22%, в немагнитных же - всего 9%.

Интересно, что во вмещающем горизонте преобладали А1рИарго1еоЬас1епа и Р1ап&отусе1ез (29% и 26% соответственно (рис. 4).

Гор. А' 11%

26%,

_29%

10%

Немагнитные конкреции

9%_¡гггя Käfe» 10%

18%

%

14% 10%

ш Alphapro teobacteria

а Gammaproieobacteria OAcidobactena

.18% '10%

Магнитные конкреции

14%

24%

11%

21%

8%

35% .

□ Ве1аргогеоЬасгег1а а Оекарго{еоЬааепа 0 Р1 тсютусегеа

Рис. 4. Таксономический состав наноформ бактерий в образцах дерново-луговой почвы.

В образцах горизонта В' погребенной каштановой солонцеватой почвы также преобладали филума Proteobacteria, однако была выявлена заметная разница в соотношении различных классов: среди бактерий обычного размера преобладали Alphaproteobacteria (31%), доля Deltaproteobacteria составила 17%, на Gamma- и Betaproteobacteria приходится 9% и 8% соответственно. Среди наноформ же доля Alphaproteobacteria составила

всего 12%, преобладали Delta- и Betaproteobacteria (24% и 22% соответственно). Соотношения Acidobacteria и Planctomycetes также различались: среди бактерий обычного размера представители филума Acidobacteria составили 29%, при этом доля Planctomycetes была равна всего 6%. Обратная ситуация была выявлена для наноформ: среди обнаруженных филумов представители Planctomycetes составили 22%. Доля Acidobacteria была равна 13% (рис. 5).

Бактерии обычного размера

6%

-31%

29%

Наноформы бактерий .11%

22%

13%

8%

17%

22%

8%

aAlphaproteobaeteria a Gammaproteobacteria QAcidobacteria

ш Betaproteobacteria в Deltaproteobacteria

mPlanctomycetes

Рис. 5. Таксономический состав бактерий и наноформ в горизонте В' погребенной каштановой почвы.

Таким образом, можно заключить, что почвенные конкреции представляют собой особый почвенный локус, где показатели общей численности бактерий сравнимы с показателями общей численности во вмещающих горизонтах, высока доля жизнеспособных клеток. Значительная часть бактерий (до 40%) в почвенных новообразованиях представлена наноформами. При этом доля жизнеспособных клеток среди наноформ бактерий в конкрециях очень высока (88-99%).

При помощи метода FISH было показано, что в конкрециях обнаруживались одни и те же филогенетические группы как среди наноформ

бактерий, так и среди бактерий более крупного размера. Однако среди бактерий обычного размера в качестве доминантов выступают иные таксоны, чем во вмещающем горизонте.

4. Изучение морфологии наноформ бактерий при помощи электронной микроскопии

Морфологию клеток бактерий, полученных методом фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 200 нм, изучали в сканирующем и просвечивающем электронном микроскопах.

При просмотре препаратов в сканирующем электронном микроскопе было видно, что клетки имели круглую или овальную форму, диаметр клеток не превышал 200 нм, что позволяет отнести исследуемые объекты к наноформам. Обращает на себя внимание, что клетки присутствуют как в виде конгломератов, состоящих из 2-5 клеток, так и в виде единичных объектов. Рядом с некоторыми клетками обнаруживаются более мелкие клетки, напоминающие почки.

Более четко морфология и размеры клеток из фильтратов выявлялись в просвечивающем электронном микроскопе на препаратах целых клеток бактерий, контрастированных 1%-ным раствором молибденово-кислого аммония (рис. 6). Данный метод не требует фиксации клеток и позволяет изучить прижизненную форму и размеры клеток, сконцентрированных из естественных субстратов. Контрастирование препаратов 1%-ным раствором молибденово-кислого аммония способствует выявлению структуры поверхности клеток и, в ряде случаев внутреннего содержимого, включая мембранные структуры.

Рис. 6. Наноформы бактерий в просвечивающем электронном микроскопе. Размер масштабной метки 200 нм; КС - клеточная стенка; белая стрелка указывает на капсулу, черная - на место деления клетки.

В препаратах выявлялись клетки диаметром от 120 до 200 нм, которые по своим размерам следует отнести к наноформам. Среди них наблюдались клетки кокковидные, овальные, палочковидные. Кокковидные клетки формируют конгломераты, в то время как овальные и палочковидные клетки на препаратах, как правило, выявляются в виде одиночных клеток.

На фотографиях хорошо видны мощные внешние покровы клеток, которые характерны для бактерий с грамположительным типом клеточной стенки.

Также в препаратах были обнаружены клетки, толщина покрова которых невелика, а внешние контуры клеточной стенки имеют неровные края, что характерно для бактерий с грамотрицательным типом клеточной стенки. Палочковидные клетки выявлялись 3-х типов: короткие диаметром 150-160 нм и длиной 500-600 нм с толстыми внешними покровами, длинные тонкие палочки, диаметром около 100 нм и длиной более 600 нм и

почкующиеся палочки длиной 500-600 нм, диаметром 180-200 нм. В ряде случаев применяемый метод контрастирования препаратов целых клеток позволяет также выявить деление клеток (рис. 6, черная стрелка).

Исследования, проведенные при помощи СЭМ и ПЭМ, свидетельствуют о том, что клетки наноформ бактерий имеют ряд морфологических особенностей: толстую клеточную стенку, капсулу, S-слои, что позволяет провести аналогию с цистоподобными клетками.

Заключение

Использование современных методов почвенной микробиологии (окраска флуоресцентными красителями L7012, фильтрация через мембранные фильтры, электронно-микроскопические методы) позволило определить численность и охарактеризовать жизнеспособность наноформ бактерий в образцах различных природных и городских загрязненных почв. Эти результаты еще раз подтверждают ранее высказанное предположение (Красильников, 1953; Новогрудский, 1935), что бактерии в почве имеют более мелкие размеры, то есть переходят в состояние наноформ. Выявлен почвенный локус (железо-марганцевые конкреции и карбонатные новообразования), где значительная часть бактерий (до 40%) представлена наноформами. При помощи метода FISH показано, что в железо-марганцевых конкрециях в качестве доминантов среди бактерий выступают иные таксономические группы, чем во вмещающем горизонте. В почвенных новообразованиях среди наноформ выявлено доминирование в дерново-подзолистой почве филума Gammaproteobacteria, в дерновой луговой -Deltaproteobacteria, в аллювиальной луговой в значительных количествах обнаружены филумы Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria и Acidobacteria. Эти результаты позволяют предположить, что в процессах образования железо-марганцевых конкреций участвует не один вид бактерий, например Galionella, Pedomicrobium (превращение железа) или Metallogenium (превращение марганца), как на это указывала Аристовская (1965), а группа

родов бактерий, способных трансформировать соединения металлов при помощи разных механизмов.

В настоящее время нет единого мнения о процессе нанотрасформации у бактерий. Это явление рассматривается рядом авторов как ответная реакция прокариот на внешние стрессорные воздействия и неблагоприятные условия внешней среды (Головлев, 1998; Чернов,2004; Вае Н.С., Casida, 1992). Нельзя также исключить присутствия в естественных субстратах истинных наноформ бактерий - представителей малоизученного филума архей Nanoarchaeota, о чем косвенно свидетельствует более высокая доля неидентифицированных клеток среди наноформ бактерий. Однако несомненно, что именно наноформы бактерий, участвующие в процессах превращения железа в почвах, как, видимо, и в других процесса, не изучавшихся в рамках настоящей работы, представляют собой значительную часть «молчаливого сообщества почвенных бактерий», находясь в жизнеспособном некультивируемом (или трудно культивируемом) состоянии.

Экологический смысл перехода прокариот в состояние наноформ может, видимо, рассматриваться как проявление жизненной стратегии микроорганизмов при наступлении неблагоприятных условий (температура, влажность, нехватка жизненного пространства в почвенных новообразованиях) сходное, до определенной степени с «нанизмом», наблюдаемым у растений в условиях Севера. Это явление следует учитывать в медицинской и санитарной микробиологии при изучении сохранения патогенных и потенциально-патогенных грамотрицательных бактерий в природных средах (почва, вода). Высокая потенциальная жизнеспособность наноформ бактерий позволяет рассматривать их как перспективный компонент бактериальных удобрений, что, несомненно, требует дальнейших исследований.

Выводы:

1. Численность наноформ бактерий в исследованных почвах довольно велика и составляет десятки и сотни миллионов клеток в 1 г почвы. Доля наноформ в природных ненарушенных почвах составила 0,5-7%, в городских почвах, загрязненных нефтью и тяжелыми металлами доходила до 15,5%.

2. Впервые выявлен локус (железисто-марганцевые конкреции), где значительная часть бактерий (до 40%) представлена наноформами бактерий, а показатели численности наноформ бактерий достигают 700 млн. клеток в 1 г почвы.

3. Доля жизнеспособных клеток среди наноформ во всех исследованных образцах почв составляет более 90%, тогда как среди бактерий обычного размера не превышает 70%. В почвенных новообразованиях доля потенциально жизнеспособных клеток достигает 98%.

4. Филогенетический анализ прокариотных сообществ (метод FISH) показал, что наноформы бактерий в почвах представлены теми же таксонами, что и бактерии обычного размера. Однако высокая доля неидентифицированных клонов среди наноформ (больше 50%) может свидетельствовать как об их особом покоящемся состоянии в почве, так и наличии новых таксонов.

5. Впервые в образцах почвенных конкреций были обнаружены представители филумов Acidobacteria и Planctomycetes. Среди изученных филумов во всех образцах преобладали протеобактерии, при этом соотношение ацидобактерий и планктомицетов варьировало.

6. Исследования, проведенные с помощью сканирующего и просвечивающего электронного микроскопа подтвердили малые размеры изучаемых бактериальных клеток, а также выявили значительное морфологическое разнообразие клеток среди наноформ бактерий. Почкование и деление клеток наноформ свидетельствуют об активности и жизнеспособности наноформ почвенных бактерий.

25

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Конова И.А. Об обнаружении нанобактерий в почвах. XV Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008». Секция «Почвоведение».Тезисы докладов. М.: МАКС-пресс. 2008. С. 68-69.

2. Лысак Л.В., Лапшина Е.В., Конова И.А., Звягинцев Д.Г. Определение физиологического состояния бактерий в почве с помощью люминесцентного красителя L7012 Известия РАН. Серия биологическая. 2009. № 6. С. 750-754.

3. Конова И.А., Лысак Л.В., Звягинцев Д.Г. Изменение размеров бактериальных клеток при контакте с монтмориллонитом и каолинитом (тезисы). Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». М.: МАКС-пресс. 2009. С. 88.

4. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А., Звягинцев Д.Г. Численность и таксономический состав ультрамикробактерий в почвах. Микробиология. 2010. Том 79. № 3. С. 408-412.

5. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А., Звягинцев Д.Г. Численность и таксономический состав наноформ бактерий в некоторых почвах России. Почвоведение. 2010. № 7. С. 819-824.

6. Конова И.А., Лысак Л.В., Лапыгина Е.В. Ультрамикробактерии (наноформы) — составная часть бактериального разнообразия почв. Экология России: на пути к инновациям. Сост. Н.В. Качалина. Издательский дом «Астраханский университет». 2010. Вып. 2. С. 50-56.

7. Газимуллина А.Г., Конова И.А. Изучение бактериальных сообществ городских загрязненных почв. Материалы XVI Международной экологической студенческой конференции «Экология России и сопредельных территорий». Новосибирский Гос. Ун-т. Новосибирск. 2011. С. 101-102.

8. Конова И.А., Кадулин М.С., Лысак Л.В. Численность и разнообразие наноформ бактерий в почвенных конкрециях. Сборник «Экология и безопасность жизнедеятельности промышленно-транспортных комплексов».

26

Материалы Международного научно-технического конгресса ELPIT-2011. Тольятти. С. 212-215.

9. Кадулин М.С., Конова И.А., Лысак JI.B., Соина B.C., Лапыгина Е.В., Звягинцев Д.Г. Наноформы бактерий в некоторых почвенных конкрециях. Вести. Моск. Ун-та, Сер.17. Почвоведение. 2012. № 1. С. 43-

10. Соина B.C., Лысак Л.В., Конова И.А., Лапыгина Е.В., Звягинцев Д.Г. Электронно-микроскопическое исследование наноформ бактерий в почвах и подпочвенных отложениях// Почвоведение. 2012. №11. С. 1188— 1198.

11. Лысак Л.В., Кадулин М.С., Конова И.А., Лапыгина Е.В., A.B. Иванов, Д.Г. Звягинцев. Численность, жизнеспособность и таксономический состав наноформ бактерий в железо-марганцевых конкрециях//Почвоведение. 2013. №6. С. 707-714.

12. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А. Характеристика бактериальных сообществ городских загрязненных почв. Тезисы докладов Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред». М.:БИНОМ. Лаборатория знаний и биоиндикация». 2013. С. 129.

13. Лысак Л.В., Лапыгина Е.В., Конова И.А. Характеристика бактериальных сообществ городских загрязненных почв. Доклады по экологическому почвоведению. 2013. Вып. 18. №1. С. 202-213.

50.

Напечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 28.10.2013 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 338.

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 527 к. Тел. 8(495)939-3890/91. Тел./факс 8(495)939-3891.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Конова, Ирина Александровна, Москва

Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова

Факультет почвоведения

На правах рукописи

04201365486

Конова Ирина Александровна

НАНОФОРМЫ БАКТЕРИЙ В НЕКОТОРЫХ ПОЧВАХ РОССИИ

Специальность 03.02.03 - микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н., доц. Л.В. Лысак

Москва-2013

Содержание

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................. 3

Глава 1. Обзор литературы............................................................................ 9

1.1. История открытия и исследования наноформ бактерий................... 9

1.2. Методы выделения наноформ бактерий...................................... 18

1.3 Особенности морфологии, физиологии и биохимии наноформ бактерий................................................................................... 19

1.4 Таксономическая принадлежность наиболее изученных наноформ

бактерий.................................................................................. 24

1.5. Наноформы бактерий в биосфере и их экологическая роль............... 26

Глава 2. Объекты и методы исследования...................................... 41

2.1. Объекты исследования............................................................ 41

2.2. Методы исследования............................................................ 48

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в природных

почвах.................................................................................... 61

Глава 4. Численность и потенциальная жизнеспособность

наноформ бактерий в городских почвах.................................................... 72

Глава 5. Численность, потенциальная жизнеспособность и таксономическое разнообразие наноформ бактерий в почвенных

новообразованиях..................................................................... 76

Глава 6. Изучение морфологии наноформ бактерий при помощи

электронной микроскопии......................................................... 92

Заключение............................................................................ 99

ВЫВОДЫ............................................................................... 102

Список литературы........................................................................................ 105

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время в связи с развитием электронно-микроскопических и молекулярно-биологических методов исследования стало ясно, что мелкие бактерии с размером клеток около 200—300 нм, описываемые терминами «ультрамикробактерии», «нанобактерии», «наноформы», «фильтрующиеся формы», «ультрамикроклетки», широко распространены в природных средах, гораздо шире, чем это представляется с первого взгляда (Дуда и др., 2007, 2012; Дмитриев и др., 2008; Panikov, 2005).

Впервые микроскопические живые объекты размером менее 300 нм, выделенные из морской воды, описал микробиолог Р. Морита в 1981 г, под названием «ультрамикробактерии», или «наннобактерии». Современное понятие о нанобактериях ввел в научный оборот Р. Фолк, обнаруживший в 1988 г. в итальянских травертинах округлые и овальные тельца размером менее 200 мкм. Фолк полагал, что эти образования представляют собой доселе неизвестную форму жизни, и высказал мнение, что они участвуют в процессах образования вторичных минералов (Folk, 1996; 1999). В конце 90х гг. прошлого века группа финских микробиологов под руководством Олави Каяндера сообщила об обнаружении в организме человека живых размножающихся микрообъектов размером около 200 нм (Kajander, Ciftcioglu, 1998).

В нашей стране один из первых обзоров о «невидимых формах видимых бактерий» был дан Д.М. Новогрудским (1933 г.). С развитием

электронно-микроскопических методов интерес к наноформам бактерий возрос, и было показано, что клетки в почвах имеют меньшие размеры, чем на лабораторных питательных средах; примерно 40% почвенных бактерий в природе имеют размеры, лежащие за пределами видимости светового микроскопа (Ананьева, Никитин, 1979).

Проблема выделения и исследования наноформ бактерий (ультрамикробактерий) привлекла особо пристальное внимание исследователей в последнее время связи с возросшим интересом к развитию нанотехнологий. Высказывается предположение, что наноформы бактерий могут рассматриваться как составная часть «скрытого» разнообразия почвенных бактерий, функции которых в биосфере практически не исследованы и которые могут играть значительную роль в процессах, происходящих в почвах (Чернов и др., 2012).

Предположение об участии микроорганизмов в формировании железомарганцевых конкреций (микробиологическая концепция) высказывалось еще в прошлом веке (Перфильев, Габе, 1961; Аристовская, 1965). Однако, несмотря на имеющиеся в литературе сведения, участие микроорганизмов в процессах образования почвенных конкреций изучено явно недостаточно. Вне поля зрения ученых остается изучение наноформ бактерий в почвенных конкрециях.

Под наноформами бактерий мы понимали бактериальные клетки, прошедшие через фильтр с размером пор 200 нм, при этом их форма и таксономическая принадлежность не играют роли.

Целью данной работы была оценка численности, изучение потенциальной жизнеспособности, таксономического состава и морфологии наноформ бактерий в некоторых почвах России и отдельных почвенных локусах для получения представления об их роли в почве.

Задачи исследования:

1. определение численности наноформ бактерий в различных природных и городских почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях методом люминесцентной микроскопии (окраска акридином оранжевым и L7012 (LIVE/DEAD));

2. определение потенциальной жизнеспособности наноформ бактерий в почвах и почвенных железо-марганцевых и карбонатных новообразованиях;

3. исследование таксономического разнообразия наноформ бактерий на уровне филумов с помощью метода FISH (fluorescence in situ hybridization);

4. изучение морфологического разнообразия наноформ методами сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии.

Научная новизна. Впервые установлено, что численность наноформ бактерий в образцах различных природных почв велика и составляет от десятков до сотен миллионов клеток в 1 г почвы, при этом в городских загрязненных почвах доля наноформ бактерий выше, чем в природных ненарушенных почвах. Впервые показано, что в почвенных новообразованиях (железо-марганцевые конкреции и карбонатные новообразования) значительная часть бактерий представлена наноформами бактерий. При помощи метода FISH среди наноформ бактерий были обнаружены представители основных доменов прокариот: Archaea и Bacteria (филумы Actinobacteria, Proteobacteria, Acidobacteria и Planctomycetes). Впервые в образцах почвенных конкреций были обнаружены представители малоизученных филумов Acidobacteria и Planctomycetes. Электронно-микроскопические исследования продемонстрировали большое морфологическое разнообразие клеток наноформ бактерий в почвах и конкрециях.

Практическая значимость. Проведенные исследования позволяют предположить, что именно наноформы бактерий служат тем «пулом» бактерий, который обеспечивает сохранение биоразнообразия почвенных бактерий в неблагоприятных условиях, способных переходить в активное состояние при изменении условий в сторону, благоприятную для развития этих бактерий. Наноформы бактерий являются перспективным компонентом

для создания бактериальных удобрений, поскольку их высокая потенциальная жизнеспособность обеспечивает высокую устойчивость при хранении. Высокую доля и значительная жизнеспособность наноформ бактерий, в том числе грамотрицательных, среди которых много патогенных форм, в городских почвах необходимо принимать во внимание при проведении санитарно-эпидемиологических исследований.

Результаты проведенных исследований используются при чтении лекций по курсам «Общая экология» и «Экология бактерий» для студентов факультета почвоведения МГУ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных конференциях: XV Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), Всероссийский симпозиум с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Международный научно-технический конгресс ЕЬР1Т-2011 (Тольятти, 2011), XVI Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий» (Новосибирск, 2011), Международная конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013).

Публикации. По результатам исследования опубликовано 13 печатных работ, из них 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных работ.

Объем и структура работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, изложение результатов экспериментов и их обсуждение, выводы и список упоминаемых в тексте литературных источников. Работа изложена на 119 страницах текста, иллюстрирована 19 рисунками, содержит 11 таблиц. Список литературы состоит из 110 наименований, из них 59 на иностранном языке. Работа выполнена при финансовой поддержке проектов: ГК № 02.740.11.0283, НШ-2227.2008.4.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. История открытия и исследования наноформ бактерий.

Подавляющее большинство бактерий, изучаемых и используемых микробиологией, имеет линейные размеры примерно 2-5 мкм и диаметр 0,61,0 мкм. В почвах же средние размеры бактериальных клеток меньше: биометрический анализ, проведенный микроскопическими методами, показал, что средний диаметр клеток составляет 0,8 мкм, длина - 1,4 мкм (Гузев, Звягинцев, 2003; Гузев, Вызов, 2006). Мелкие бактериальные формы, диаметром менее 0,2-0,3 мкм, исследованы значительно меньше. Развитие современных методов: применение ядерных мембранных фильтров, флуоресцентного микроскопа, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии для исследования почвенных препаратов и ультратонких срезов бактерий, внедрение молекулярно-биологических методов, позволило по-иному взглянуть на мельчайших представителей мира прокариот.

Мельчайшие формы у представителей рода АгоШЬа^ег впервые были обнаружены Денисом и Смитом в 1916 г. Позже Д.М. Новогрудский показал наличие фильтрующихся форм AzotoЪacteт в чистой культуре, при этом отмечалось, что «невидимые формы» прорастают гораздо медленнее, чем исходные культуры. В дальнейшем Д.М. Новогрудский показал, что и в почве имеются фильтрующиеся формы азотобактера, сильно адсорбированные на почвенных частицах (Новогрудский, 1933, 1956).

H.A. Красильников наблюдал образование ультрамикроформ (регенеративные тельца) в гигантских клетках Azotobacter croococcum на сусло-агаре и в МПБ (Красильников, 1954). Образование таких телец, по его мнению, следует рассматривать как биологический процесс, направленный на выживание и сохранение вида.

В ЗОх годах XX века были получены фильтрующиеся формы бактерий рода Rhizobium (Almon, Baldwin, 1933, цит. по Мишустина, Калюжная, 1987). Образование фильтрующихся форм клубеньковых бактерий проходит через потерю клеточной стенки и образование протопластов (бактероидов), как у некоторых патогенных и близких им форм при L-трансформации. Было показано, что образование фильтрующихся форм клубеньковых бактерий непосредственно связано с таким важным их свойством, как инфекционность (Мишустина, Калюжная, 1987).

В 1996 году наноформы бактерий обратили на себя особое внимание общественности и прессы, когда учёные объявили о находке ископаемых организмов (окаменелостей) в марсианском метеорите. Это событие вызвало предположение о том, что на Марсе некогда существовали, а может, существуют и сейчас примитивные формы жизни (Golden et al., 1997; Folk, Taylor, 2002; Багатурова, 2005).

С 1988 года исследованием нанобактерий активно занялись медицинские микробиологи. Группа финских исследователей опубликовала материалы, в которых сообщалось, что им удалось выделить и

культивировать in vitro нанобактерии из почечных камней. Сообщалось об успешном выделении и анализе ДНК. Эти же авторы впервые возложили на нанобактерии ответственность за процессы патологической кальцификации в человеческом организме (Kajander et ah, 1997).

Вместе с тем, судя по микробиологической литературе, интерес к жизнеспособным мелким формам появился ранее, возрастая периодически в связи с теми или иными важными для медицины открытиями: в конце 1920-х годов при описании формирования наноклеток внутри туберкулезной палочки. В 1930-1950-хгодах при обнаружении образования «элементарных тел» в результате обработки бактерий антибиотиками, затем при обсуждении механизма переноса инфекционных заболеваний соответствующими фильтрующимися формами (Вайнштейн, Сузина, Абашина, 2007).

У микоплазм феномен нанотрансформации был описан в ходе опытов с культурой Acholeplasma laidlawii, т. н. «вездесущей» микоплазмы, обнаруживаемой в почве, компосте, сточных водах, клеточных культурах, тканях человека, животных и растений (Чернов и др., 2004, 2005). В ходе эксперимента клетки Acholeplasma laidlawii подвергались различным стрессам, после чего в культуре обнаруживались наноформы клеток размером менее 200 нм. Позже этой же группой исследователей была выявлена способность к нанотрансформации у другой микоплазмы — Mycoplasma gallisepticum (Чернов и др., 2008). Клетки этого микроорганизма, выращенные в условиях ограничения по субстрату, характеризовались

малыми размерами (150-200 нм), причем при отмене неблагоприятных условий клетки ревертировали, превращаясь в вегетативные формы М ЗаШяерИсит обычного размера.

Известно, что бактерии в почве имеют гораздо меньшие размеры, чем на питательных средах (Никитин, 1964; Ананьева, Никитин, 1979; Гузев, Звягинцев, 2003; Гузев, Вызов, 2006). Однако к данным о размерах бактериальных клеток, полученным с использованием флуоресцентного и электронного микроскопа, следует относиться с большой осторожностью, поскольку они не дают точного представления о величине объекта. Считается, что размеры клеток в сканирующем электронном микроскопе завышены вследствие напыления металла. При наблюдении клеток бактерий под люминесцентным микроскопом размер клеток занижен, поскольку светится, в основном, нуклеоид клетки (Гузев, Звягинцев, 2003).

Изучение бактерий, обитающих в вечномерзлых грунтах, методом дифференциального центрифугирования с последующим получением срезов клеток сконцентрированной биомассы, свидетельствует о малом размере клеток бактерий, обитающих в этом биотопе (ОШсЫпБку а1., 1993; Бота е1 а1., 1994; 1995, 2004; Дмитриев и др., 2001). Так, доля ультрамелких клеток, обнаруженных в образцах почв и мерзлых грунтов Арктики и Антарктики была довольно значительной и составляла более половины от числа всех выявляемых клеток. Малые размеры клеток рассматриваются авторами

публикаций как один из возможных механизмов, предотвращающих механические повреждения бактерий кристаллами льда.

Позже в печати появилось сообщение об открытии нового царства архей, обитающих при высокой температуре в анаэробных условиях и представляющих собой мини-клетки, способные к росту только в кокультуре с хемолитотрофным кренархеотным организмом рода ^тсоссш. Игникоккус и его симбионт выделены из Срединно-Атлантического хребта на глубине около 160 м. К настоящему времени новое царство, названное 1Яапоагскаео1а, имеет только один род — Иапоагскаеит с одним видом N. едиИат (НиЬег а1., 2003, 2006).

Изучению наноформ бактерий, обитающих в морях и внутриконтинентальных водоемах, посвящены работы многих исследователей (Оюуаппоги ег а1., 1990; 8сЬШ е1 а1., 1993).

После обнаружения нанобактерий в организме человека, появились публикации, согласно которым нанобактерии ответственны за широкий спектр заболеваний: от простатита до рака (Рашкоу, 2005), однако четкие доказательства этой теории отсутствуют.

Так как было констатировано широкое распространение нанобактерий в различных средах обитания, некоторые ученые (\Vickramasinghe, \У1скгата8т§11е, 2006) считают, что это может быть ключом к разгадке начала жизни на Земле. Во всех моделях панспермии высушенные бактериальные клетки и бактериальные споры считаются основными

агентами. Нанобактерии по организации еще проще, они устойчивы ко многим неблагоприятным воздействиям, в том числе к ионизирующей радиации, поэтому они могли доминировать в этом процессе (Wickramasinghe, Wickramasinghe, 2006).

Термин «нанобактерии» впервые употребил Р. Морита (Morita, 1988), однако широко использоваться он начал в работах финского микробиолога О. Каяндера, обнаружившего такие клетки внутри песчинок при мочекаменной болезни, и в работах американского геолога Р. Фолка, описавшего подобные микроорганизмы в пробах осадочных пород (Folk, 1996, 1997, 1999, 2002). В настоящее время к нанобактериям относят мелкие прокариотные организмы с линейными размерами менее 200 нм (по мнению некоторых авторов — менее 400 нм). В научной литературе помимо термина «нанобактерии» используют другие названия: ультрамикробактерии, наноформы, наннобактерии, карликовые клетки, фильтрующиеся клетки, /формы и некоторые другие (Литвин и др., 2000; Casida, 1969; Вае, Casida, 1973; Morita, 1988).

Надо отметить, что выбор точного термина для мелких бактериальных клеток оказался поводом для отдельных дискуссий.

Сл�