Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis"

На правах рукописи

Анучин Алексей Максимович

РОЛЬ ГИСТОНОПОДОБНОГО БЕЛКА HLP В ПРОЦЕССЕ ОБРАЗОВАНИЯ И РЕАКТИВАЦИИ ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ MYCOBACTERIUM SMEGMATIS

Специальность 03.01.04 - «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

МОСКВА 2010

004613023

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Учреждения российской академии наук Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор

А. С. Капрельянц

доктор биологических наук,

профессор

Л. И. Воробьева

кандидат биологических наук А. С. Воронина

Ведущая организация: Учреждение российской

академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г. К. Скрябина

Защита состоится « £ » дв£@С$р-сР 2010 г. в «/%> часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33. стр.1. Автореферат разослан « /£» 2010 г.

Г

Ученый секретарь г

диссертационного совета, кандидат биологических наук А. Ф. Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Микобактерии являются значимой группой микроорганизмов, поскольку включают таких возбудителей инфекционных заболеваний как туберкулез и лепра. По данным ВОЗ, каждый третий человек является носителем латентного туберкулеза, который может переходить в активное состояние, вызывая инфекцию. При этом механизмы возникновения таких латентных форм и пути их реактивации остаются неизвестными. И хотя вовлеченность специализированных покоящихся клеток микобактерий в явление латентного туберкулеза интенсивно обсуждается на протяжении многих лет, вопрос существования таких клеток in vivo остается открытым.

Изучение покоящихся форм микобактерий имеет длительную историю. Согласно работам Хоменко [Khomenko, 1984], имеется большая вероятность того, что в тканях и органах инфицированных животных находятся покоящиеся морфологически дифференцированные формы Mycobacterium tuberculosis. Однако, ни в одной из экспериментальных моделей in vitro, существующих на сегодняшний день, не было продемонстрировано образование подобных форм. Это свидетельствует о, возможно, неглубоком уровне покоя, развиваемого в данных моделях, поэтому они вряд ли могут служить адекватным отражением процессов происходящих in vivo в тканях инфицированных людей. Поэтому экспериментальное доказательство возможности образования морфологически дифференцированных покоящихся форм микобактерий in vitro являлось бы существенным вкладом в решение обсуждаемой проблемы.

При изучении существующих на настоящее время моделей покоя был накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что образование покоящихся форм микобактерий, - сложный процесс, включающий множество «игроков», таких, как «гены покоя», соответствующие белки, регуляторные факторы, ферменты, структурные элементы клетки и. т. д. Поскольку, очевидно, переход в покоящееся состояние сопровождается глобальной перестройкой клеточного метаболизма, можно ожидать участие в этом процессе глобальных регуляторов. Одним из таких регуляторов является семейство ДНК-связывающих белков (гистоноподобные белки), вызывающих изменение архитектуры нуклеоида и регулирующие активность тех или иных оперонов. У микобактерий таким гистоноподобным белком является Н1р. Ряд авторов предполагает, что гистоноподобный белок Н1р принимает участие в стрессовом ответе микобактерий [Shires, 2001]. Имеются также данные о том, что при переходе М. smegmatis в покоящееся (нерепликативное) состояние в микроаэрофильных условиях (модель Wayne) происходит пятикратное увеличение концентрации Н1р в клетках [Lee, 1998]. Однако, очень странным оказался факт, что инактивация гена hlp не приводила к каким-либо изменениям в образовании

нерепликативных форм, которые фенотипически не отличались от покоящихся форм дикого типа. Этот факт оставляет открытым вопрос о значимости гистоноподобных белков в образовании покоящихся форм и требует дальнейшего изучения.

На основании изложенных данных были сформулированы следующие цели и задачи.

Цели работы - экспериментально доказать образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro, и изучить роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации полученных покоящихся форм М. smegmatis.

Задачи исследования:

-скрининг условий культивирования М. smegmatis, при которых происходит образование морфологически дифференцированных покоящихся форм.

-сравнительное изучение мутантных клеток М. smegmatis с инактивированным геном hip с клетками дикого типа при переходе в покоящееся состояние и образованных в результате такого перехода покоящихся форм.

-получение рекомбинантного белка Hip и изучение особенностей его взаимодействия

с ДНК.

-изучение продукта немевалонатного пути синтеза изопреноидов (МЭЦ), как возможного регулятора связывания Hip и ДНК.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые обнаружено образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro на примере М. smegmatis при культивировании в неоптимальных условиях (недостаток азота и пониженная температура). Такие формы обладали повышенной устойчивостью к действию стрессовых факторов (антибиотики, нагревание, коротковолновое излучение), а также были способны сохранять жизнеспособность в течение длительного времени (более 5 месяцев), что позволяет отнести их к покоящимся формам. Глубокие морфологические изменения клеточной стенки и реорганизация цитоплазмы, позволяют отнести полученные формы к цистоподобным клеткам, характерных для других неспорообразукмцих бактерий.

Впервые было обнаружено, что гистонопобный белок Hip определяет обратимость перехода клеток М. smegmatis из некультивируемого состояния в активное состояние, что проявляется в неспособности штамма с инактивированным геном hip к реактивации в присутствии белка Rpf (resuscitation promoting factor). Однако Hip не влияет на инициацию перехода клеток в покоящееся состояние.

В ходе настоящей работы впервые была показана значимость гистоноподобного белка Hip для обеспечения устойчивости полученных покоящихся форм М. smegmatis. Гистоноподобный белок Hip участвует в компактизации нуклеоида в процессе перехода М. smegmatis в покоящееся состояние. По-видимому, повышенная устойчивость покоящихся

форм обусловлена такой компактизацией нуклеоида. Одним из регуляторов связывания гистоноподобного белка Hip с ДНК возможно является МЭЦ, который препятствует такому связыванию in vitro.

Практическая значимость работы. В настоящей работе нам впервые удалось продемонстрировать возможность образования морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro. Полученная модель составляет хороший инструмент для изучения механизмов образования покоящихся форм микобактерий, оценки роли генов вовлеченных в процесс перехода микобактерий в латентное состояние С другой стороны, полученные покоящиеся клетки микобактерий могут быть использованы в качестве тест-системы для анализа эффективности потенциальных лекарственных агентор против латентных форм микобактериозов, таких как туберкулез и лепра.

Полученные данные о роли гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации покоящихся форм микобактерий позволяют рассматривать этот белок в качестве потенциальной мишени для лекарственных агентов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: 4 съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; ICOMID, Пермь, 2009; 4 международная конференция молодых ученых «От молекулы до биосферы», Харьков, 2009.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых журналов и изданий ВАК, и 3 тезиса в материалах конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения,

списка цитируемой литературы. Работа изложена на_страницах машинописного текста,

содержит_рисунков и_таблиц.

Список сокращений. МКР - метод конечных разведений МЭЦ -2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат НК - «некультивируемые» формы Hip - histon-like protein MPN - most probable number ROI - reactive oxygen intermediates Rpf - resuscitation promoting factor

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются покоящиеся формы бактерий, их физиологические биохимические и структурные характеристики. Особое внимание уделено покоящимся формам микобактерий, подробно рассмотрены существующие модели покоя микобактерий. Анализируются имеющиеся в литературе данные о структуре и функциях гистоноподобных белков бактерий.

Материалы и методы исследования Штаммы и условия культивирования

Таблица 1. Штаммы Mycobacterium smegmatis, использованные в исследовании.

Wt Штамм MC2 155

Wt-pMind 2 Штамм MC 155 (Wt) трансформированный плазмидой pMind Получен в ходе данной работы

Wt-pAGH 2 Штамм MC 155 (Wt) с плазмидой pAGH ЭЫееуа й а1,2004

Wt-pAGR Wt штамм с плазмидой pAGR, несущей ген rpf ЗЫееуа е1 а1,2004

Hlp-0 Штамм Hlp-0 с инактивированным геном hip путем вставки канамициновой кассеты Leeetal, 1998

Hlp-O-pMind Штамм Н1р-0 с плазмидой pMind Получен в ходе данной работы

Hlp-0-pAGH Штамм Н1р-0 с плазидой pAGH Получен в ходе данной работы

Hlp-0-pAGR Штамм Н1р-0 с плазмидой, несущей ген rpf Получен в ходе данной работы

Hlp-0-pAGRmut Штамм Н1р-0 с плазмидой pAGR, несущей мутантный ген rpf(Cyssj —» Lys, Cysi i4 —> Thr) Получен в ходе данной работы

Hlp-O-pMind-hlp Штамм Hlp-0 с плазмидой, несущей ген hip Получен в ходе данной работы

М. smegmatis штамм тс2155 стандартно поддерживали на чашках Петри с твердой агаризованной средой (1.5% агара) NB (Nutrient Broth, HiMedia Laboratories, India). Клетки выращивали в среде NB или стандартной среде Sauton. Трансформированные штаммы (Wt-pMind, Wt-pAGH, Wt-pAGR, Hlp-O-pMind, Hlp-0-pAGH, Hlp-0-pAGR, Hlp-O-pAGRmut, Hlp-0-pMind-A/p), а также штамм Hlp-0 поддерживали на среде NB с 10 мкг мл"1 канамицина.

Таблица 2. Плазм иды, использованные для трансформации.

pMind Устойчивость к канамицину и Blokpoel et al., 2005

гигромицину

pAGH Устойчивость к канамицину и Mukamolova et al., 2002

гигромицину

pAGR Дериват pAGH, несущий ген rpf Shleeva et al., 2004

pAGRmut Плазмида pAGR, несущая мутантный Mukamolova et al, 2006

mutant rpf (Cys53 —► Lys, Cysiu—» Thr)

pMind-hip Дериват pMind, несущий ген hip. Получен в ходе данной

работы

Клонирование и получение рекомбинантных штаммов.

Клонирование проводили с использованием штамма Е. coli TGI. Амплификацию гена hip М. smegmatis осуществляли с использованием праймеров

5'GTGGATCCTGGAAATCAGTGGTCACAG3'.

5 'ATCTGCAGCCTCCCGACGAGAAGTAACG3' (сайты рестрикции BamHI и Pstl подчеркнуты). Продукт ПЦР первоначально клонировали в вектор pGEM-T (Promega), затем подвергали расщеплению по сайтам BamHI и Pstl, после чего лигировачи в вектор pMind, предварительно обработанный теми же рестриктазами. Правильность клонированных нуклеотидных последовательностей подтверждали секвенированием. Трункированный ген rpf (белок RpfSm) был амплифицирован PCR из pET-19b-Rpf с использованием праймеров GCGAAATTAATACGACTCACTAT и CGACGGATCCTCACTCGGTGGCGTCACGT (сайт рестрикции BamHI подчеркнут). Очищенный ПЦР продукт был обработан рестриктазами Xbal и BamHI, лигирован в рЕТ19Ь вектор и трансформирован в Е. coli DH5a. Ампицилин-устойчивые колонии были проанализированы методом ПЦР на наличие вставки трункированного гена. Конструкция, содержащая трункированный ген rpf (RpfSm), была секвенирована и трансформирована в Е. coli HSM174 (DE3).

Получение покоящихся форм Mycobacterium smegmatis Рекомбинантные штаммы М. smegmatis выращивали в условиях, вызывающих образование покоящегося состояния у штамма дикого типа, а именно: культивирование в модифицированной среде Hartman's-de Bont, лимитированной по К+, при 37°С и постоянном перемешивании, в течение 120 часов [Shleeva., 2004].

В другой модели, культивирование исследуемых штаммов осуществляли в модифицированной среде SR-1, лимитированной по азоту при 30°С и постоянном перемешивании [Anuchin, 2009].

Выделение и очистка рекомбинантных белков Rpf и Hip Трункированную форму белка, вызывающего оживление (resuscitation-promoting factor) Rpf М. luteus, называемый RpfSm, использовали для оживления покоящихся форм М. smegmatis.

Белки RpfSm и Hip были выделены из 350 мл культуры продуцента. Индукцию синтеза продукта осуществляли 1 мМ IPTG, при комнатной температуре. Клетки собирали центрифугированием и замораживали в Tris-HCl буфере (ВВ). После разрушения клеток ультразвуком, остатки разрушенных клеток удаляли центрифугированием. Супернатант помещали на Ni-sepharose колонку (V = 2 мл) («Sigma», Germany), уравновешенную ВВ. Для элюции и рефолдинга белков использовалась Biological LP system («Biorad»).

Мягкое выделение ДНК. Выделение ДНК осуществляли согласно протоколу Genomic DNA Purification Kit, "Fermentas". Спектр поглощения полученного образца измеряли на спектрофотометре Spec-1000.

Оживление НК клеток Mycobacterium smegmatis. Оживление некультивируемых клеток, полученных в модифицированной среде SR-1, осуществляли с использованием метода МКР согласно [Downing, 2005]. Для оживления НК клеток, полученных в модифицированной среде Hartman's-de Bont использовалась модифицированная среда Sauton [Shleeva, 2004] с добавлением RpfSm.

Фракционирование морфологически дистинктных клеток Mycobacterium smegmatis.

Образец культуры покоящихся клеток, полученных в модифицированной среде SR-1, аккуратно наслаивались поверх градиента сахарозы. После центрифугирования полученных образцов фракции со дна пробирок (120 мкл) собирали для последующего определения числа КОЕ и MPN.

Включение радиоактианой метки

3 3

Для включения использовали L- Н аспарагин или 5,6- Н урацил. Включение

осуществляли согласно [Чеканова, 2001]. Число импульсов определяли на LS анализаторе (Beckman Instruments).

Проточная цитофотометрия

Для измерения красной флуоресценции (650 nm) гомогенизированной путем пропускания через тонкую иглу шприца культуры, использовали FACSCalibur system (Beckton Dickinson). Этот параметр был получен как суммарная величина импульса для 20000 событий при 800-1100 событий в секунду. Флуоресценция измерялась до и после обработки клеточных суспензий Nilse red (4 мкг мл'1). Анализ данных и графики были получены с помощью WinMDI 2.8.

Световая и флуоресцентная микроскопия.

Клеточные суспензии исследовали с помощью микроскопа Eclipse Е4000 (Nicon, Japan) в фазовоконтрастном и эпифлуоресцентном режиме после обработки йодидом

пропидиума (PI, 3 мкМ) для определения интактности клеточной стенки; бромидом этидия (EtBr, 5цМ), для определения ДНК содержащих клеток; Nile red (4 мкг мл"1) для визуализации липидных включений; DAPI (2 мкг мл"1) для визуализации двухцепочечной ДНК. Для образцов обработанных PI, EtBr, Nile red возбуждение составляло 510 нм, эмиссия, - >560 нм; для образцов обработанных DAPI возбуждение - 330 нм, эмиссия - >380 нм.

Конфокальная микроскопия.

Клетки инкубировали в течение 15 мин при 37 °С с бромидом этидия (EtBr, 5мкМ) для визуализации нуклеоида и фиксировали парами формалина на покровных стеклах 24 мм 24 мм. Препараты просматривали в конфокально-лазерном микроскопе LSM-510 Meta (Carl Zeiss AG, Германия) с иммерсионным объективом 63 Plan-Apochromat. Флуоресценцию возбуждали He-Ne лазером при X = 543 нм, эмиссию регистрировали с помощью фильтра 650-710 нм; плотность эмиссионной энергии 35 Дж/см2. Изображения регистрировали и обрабатывали с помощью программного обеспечения Zeiss LSM 510Meta Software release 3.2.

Электронная микроскопия

Клетки инкубировались с 1.5% глутаральдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2) при 4°С в течение 1 часа. После трехкратной отмывки этим буфером, материал был фиксирован в 1% 0s04 в 0.05 М какодилатном буфере при 20° С в течение 3 часов. После дегидратации материал был помещен в эпоксидную смолу Ероп 812 и разрезан на секши микротомом LKB 3. Срезы были помещены на медные решетки и контрастированы 3% уранилацетатом в 70% этаноле в течение 30 мин. Срезы просматривали в электронном микроскопе JEM-100В (JEOL), при 60 кВ.

Выделение липидов и их анализ Выделение липидов и их анализ осуществляли согласно [Dobson, 1985]. Хроматограммы были отсканированы и изображения были обработаны с помощью TotalLab 2.01.

Чувствительность клеток к действию стрессовых факторов Образцы клеток, взятые из стационарных культур и культур покоящихся клеток М. smegmatis инкубировали с различными концентрациями антибиотика в течение суток при 37° С и перемешивании или нагревали при 60-80" С в течение 10 мин или помещались на чашки Петри с 4 мл жидкой среды NB с последующей обработкой ультрафиолетовым излучением (лампа БУФ-30, длина волны 254 нм) согласно [Воробьева, 1994]. Для определения числа КОЕ клетки высевались на твердую среду NB. Число PI позитивных и негативных клеток подсчитывалось в камере Хелбера с использованием эпифлуоресцентного микроскопа.

Измерение кругового дихроизма

Спектры регистрировали на дихрографе Mark 5, в интервале 198-320 нм, использовали кюветы с длиной оптического пути 1 мм. Спектры снимали 3 раза, усредняли и вычитали спектр буфера.

Основные результаты и их обсуждение

I. Морфологически дифференцированные покоящиеся клетки микобактерий

1.1. Получение покоящихся форм Mycobacterium smegmatis с использованием модифицированной среды SR-1.

Поскольку образование покоящихся форм является, как полагают, ответом клетки на стрессовую ситуацию для нахождения условий для образования морфологически-дифференцированных покоящихся форм был применен скрининг неоптимальных условий культивирования.

Для скрининга мы выбрали базовую среду SR-1, созданную для культивирования актннобактерий [Красильников. 1950]. В результате скрининга различных модификаций среды SR-1 были подобраны условия, оптимальные для формирования покоящихся форм М. smegmatis. Такими условиями оказались пятикратное уменьшение концентрации азота в среде, культивирование клеток при перемешивании в течение 3 суток при пониженной температуре и последующее хранение при комнатной температуре.

Периодическое изучение такой культуры в фазово-контрастном микроскопе показало постепенное накопление атипичных клеток со значительно измененной морфологией. После 14 сугок инкубирования, 10-20% клеток в популяции имели форму палочек с хорошо выраженными утолщениями на конце клеток. Во время дальнейшей инкубации клетки стали ракеткоподобными, и после 1.5 месяцев 50-70% популяции было представлено овоидными клетками с центральной высоко рефрактерной областью (Рис. 1). Процентное содержание ововдных клеток в популяции не менялось значительно в течение хранения 5 месяцев и более. Отношение длины овоидных клеток к диаметру составляло 1.0-1.4 (средний диаметр клеток 0.8-1.4 мкм), в то время как для стационарных клеток данный показатель составляет 5-7. Оаоидные клетки окрашивались реагентом Циля-Нильсена аналогично палочковидным клеткам стационарной фазы. Образование овоидных клеток очень сильно зависело от условий культивирования: замена N-лимитированной среды SR-1 на среду Sauton в различных модификациях с различными лимитами, или на нормальную нелимитированную среду SR-1 не приводило к формированию овоидных клеток в постстационарной фазе. Количество овоидных клеток в культуре также очень зависело возраста используемого инокулята. Максимальный выход получался при использовании суточного инокулята.

Анализ последовательности 16S rRNA клеток после оживления подтвердил 100% идентичность исходного дикого типа М. smegmatis и клеток в культуре модифицированной SR-1. Таким образом, на основании полученных данных, можно сделать вывод о способности М. smegmatis образовывать необычные морфологически отличные от вегетативных (овоидные) формы in vitro.

Рис. 1. Световая микроскопия овоидных клеток М. smegmatis. Культивирование клеток осуществляли на лимитированной по азоту среде SR-1, после чего клетки хранились при комнатной температуре 2, 3 и 4 недели (фотографии а, Ь, с соответственно). Чистая фракция овоидных клеток (фотография d) была получена путем центрифугирования 5-ти месячной культуры в градиенте сахарозы. Масштаб - 6 микрон.

1.2. Электронная микроскопия овоидных клеток

Электронная микроскопия гонких срезов показала значительные различия между клетками стационарной фазы и овоиднымк клетками, полученными в модифицированной среде SR-1 (Рис. 2). У клеток стационарной фазы, выращенных в сред" Sauton в клеточной стенке виден электронно-плотный слой муреина и нечеткий наружный слой малой электронной плотности (Рис. 2с). Цитоплазма этих клеток электрокно-плотнач, гомогенная и содержит небольшие электрон но-прозрачные тела, а также многочисленные эле!ггронно-плотные включения похожие на полифосфатные гранулы. Нуклеоид с сгтеподобкыми структурированными электронно-плотными нитями легко различим в цитоплазме клеток стационарной фазы (Рис. 2с). Похожие ультраструктурные черты были характерны для клеток стационарной фазы, выращенных в модифицированной ерсде SP.-1.

Ультраструктура овоидных клеток значительно отличалась от таковой клеток стационарной фазы. Клеточная стенка овоидных клеток обладала дополнительным слоем, более нижние слои видоизменены, внутренний слой клеточной стенки электронно-плотный (Рис 2Ь). Некоторые овоидные клетки обладали электронно-плотной похожей на хвост структурой, окруженной наружным слоем клеточной стенки. Цитоплазма овоидных клеток гетерогенна, гранулирована и содержит большие везикулярные и полигональные электронно-прозрачные тела, а также небольшие электронно-плотные гранулы. В некоторых клетках эти гранулы занимали большую часть клеток. В клетках также обнаруживались

длинные фибриллы неизвестного состава (Рис. 2(1). Нуклеоид был слабо заметен в овоидных клетках.

Рис 2. Электронная микроскопия клеток стационарной фазы и овоидных клеток М. smegmatis.

Фотографии а и с, - клетки стационарной фазы, выращенные в стандартной среде Sauton при низком и высоком разрешении; фотографии b и d, - овоидные клетки после 5 месяцев хранения при комнатной температуре при низком и высоком разрешении. OL - наружный слой клеточной стенки, М - муреиновый слой, СМ - цитоплазматическая мембрана. Рр -электронно-плотные гранулы, N - нуклеоид, FT - нити фибриллярной структуры, LB -электронно-плотные липидные тела. Масштаб: a, b - 2 микрона; с, d - 0.1 микрон.

1.3. Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофотометрия

После пяти месяцев хранения клеточная стенка овоидных клеток оставалась интактной (клетки не окрашивались PI), в то время как палочковидные клетки, которые все еще оставались в культуре (<9%) оказались PI положительными. Чтобы выяснить природу рефрактерного центрального региона овоидных клеток, они были обработаны Nilse red, которую широко используют для идентификации липидных включений [Garton, 2002]. Врезка на рисунке 3 демонстрирует, что гранулы в большинстве овоидных клеток, обработанных Nilse red, обладают интенсивной флуоресценцией. Согласно данным проточной цитофотометрии, 45±17% клеток обладают значительно более интенсивно^ флуоресценцией, чем стационарные клетки, выращенные на среде Sauton (Рис. 3). Повышенное содержание триглицеридов в покоящейся культуре было также подтверждено методом тонкослойной хроматографии (См. таблицу 3).

.Reo F иэ'азсеже

Рис. 3. Проточная цитофотометрия клеток стационарной фазы и овоидных клеток М. smegmatis.

Клетки, выращенные на среде Sauton (3 сут), и клетки, выращенные в модифицированной среде SR-1 с последующим хранением 2.5 месяцев, окрашивали Nilse red (4 мкг мл"') н анализировали на проточном цитофотометре согласно «Материалам и методам». Эксперимент повторялся 6 раз, на рисунке представлен типичный результат. 1 - необработанные клетки, 2-клетки стационарной фазы, 3 - овоидные клетки после 2.5 месяцев хранения. На врезке -фазовоконрастная (А) и флуоресцентная микроскопия после окрашивания Nile red (В) овоидных клеток.

Количество клеток, способных образовывать колонии на твердой агаризованной среде, постепенно снижалось с течением времени при хранении культуры, выращенной на лимитированной по азоту среде SR-1, в то время как число MPN было значительно выше, чем КОЕ. Это различие было более выраженным в старых культурах, что свидетельствовало о накоплении в культуре НК1 клеток, характеризующихся неспособностью образовывать колонии на стандартных твердых средах. Для реактивации НК клеток требовалась специальная процедура оживления в жидкой среде.

1.4. Оживление овоидных клеток Mycobacterium smegmatis

Овоидные формы оказались неспособными накапливать радиоактивные предшественники нуклеиновых кислот и белков, что соответствует покоящемуся статусу. Однако, наблюдалось постепенно возрастание включения радиоактивных предшественников в процессе оживления таких клеток в свежей, модифицированной среде Sauton между 0 и 25

1 В случае неспорулирующих бактерий, переход в покоящееся состояние может сопровождаться потерей культивируемости (как полной, так и частичной) - неспособностью бактерий расти в условиях, оптимальных для нормальных, живых клеток («некультивируемость»). Такие клетки получили название «некультивируемые» (НК). Реактивация способности к активному росту («оживление») зачастую сопряжена с необходимостью подбора специальных условий для такой реактивации [КаргЫуаШБ, 1993]

часами, предшествующими восстановлению способности к делению (Рис. 4а). После 25 часов инкубации клетки начинали делиться, возрастало число КОЕ и уровень включения радиоактивных предшественников. Время удвоения, посчитанное по показателям КОЕ в период между 25-32 часами, составляло 1 час, тогда как время удвоения (деления) в данной среде составляет 4±0.4 часа. Эта разница свидетельствует об оживлении клеток, сопровождающемся ростом культуры, связанным непосредственно с делением. Поскольку максимальное восстановление числа КОЕ в результате оживления не может превышать МРЫ (2.0 107 мл"1) для той же культуры, период оживления составляет не более 4 часов. Тем не менее, первые 20 часов инкубации (между 2 и 24) также должны рассматриваться как начальный этап оживления.

СРМ

Рис. 4. Оживление овоидных форм М. smegmatis в модифицированной среде ва^оп. Популяцию овоидных клеток, полученных согласно «Материалам и методам», отмывали и инокулировали в свежую модифицированную среду $аии>п, с последующим перемешиванием

при 37 "С. (а) с. Г. и. (В) и СРМ (® - 5,6-^Н урацил , О - Ь-^Н аспарагин), фиксировали каждые 4 часа. Концентрация клеток (КОЕ) после инокуляции составляла 6*105 мл'1. Этот эксперимент повторялся 3 раза, на рисунке представлены результаты типичного эксперимента. Каждая точка для КОЕ и СРМ представляет значение 5 и 3 повторностей, соответственно, разброс показывает 80. Фотографии (Ь) были сделаны во время оживления, было подсчитано процентное содержание овоидных клеток. Концентрация клеток (КОЕ) после инокуляции

составляла 3.6*10' мл"1. А -0 часов, В - 5 часов, С - 16 часов, D - 20 часов, Е - 24 часа. Процентное содержание овоидных клеток составляло 57±9 */• до 20 часов оживления, оно составляло 44±10 У. в 20 часов, и 21±6 в 24 часа. После 25 часов оживления не было обнаружено ни одной овоидной клетки.

Данные, полученные путем включения радиоактивной метки, полностью соответствовали результатам микроскопии, подтвердившим переход овоидных клеток к нормальному палочковидному состоянию (Рис. 4).

I.5. Чувствительность покоящихся клеток Mycobacterium smegmatis, полученных в модифицированной среде SR-1, к стрессовым воздействиям.

Поскольку, дормантные клетки обладают повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям, была изучена устойчивость вегетативных и овоидных клеток к действию повышенной температуры и антибиотикам. Оказалось, что по сравнению с 48-часовыми стационарными клетками, овоидные клетки были более устойчивыми к повышенной температуре в диапазоне 60-80°С, а также к бактерицидному действию гигромицина и доксициклина (См. таблицу 3, выделено синим). Таким образом, полученные овоидные формы полностью соответствуют всем критериям покоящихся форм.

II. Роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smeematis

Ранее в нашей лаборатории бьио продемонстрировано, что после культивирования в течение 68-70 часов в модифицированной среде Hartman-de-Bont в условиях недостатка К+ клетки М. smegmatis переходят в состояние покоя с потерей культивируемости на твердых средах, но способны к оживлению в жидкой среде, содержащей Rpf (resuscitation growth factor). Аналогично, штамм Wt-pAGR, несущий плазмиду, содержащую ген rpf М. luteus, также образовывал NC формы, однако такие формы были способны к переходу в вегетативное состояние в жидкой среде без добавления белка Rpf [Shleeva, 2004]. Этот подход к получению и оживлению покоящихся форм, а также подход с использованием модифицированной среды SR-1 был применен для изучения штамма М. smegmatis с инактивированным геном hip (Н1р-0).

2.1 Динамика перехода в покоящееся состояние различных штаммов М. smegmatis

Было установлено, что скорость роста клеток данного штамма и клеток штаммов, производных от него, растут в модифицированной среде Hartman-de-Bont или в среде NB с

Таблица 3. Результаты экспериментального изучения физиолого-биохимических свойств овоидных форм, полученных в модифицированной среде 8К-1.

Стационарные клетки Овоидные клетки

Размер 1 х 6 мкм 1.4 х 1.8 мкм

Плавучая плотность (в сахарозе) 1.2 г/см' 1.35 г/см'

Дыхательная активность (восстановление СТС) +

Синтез РНК 31400 СРМ/мл2 50 СРМ/мл

Синтез белка 52000 СРМ/мл 70 СРМ/мл

Содержание григлицеридов 0.05±0.006 мкг/мг сухой биомассы 0.08±0.007 мкг/мг сухой биомассы

Выживаемость после прогрева при 80°С 100 КОЕ/мл 103 КОЕ/мл

Выживаемость под действием антибиотиков 1.2 % (75 мкг/мл гигромицина) 0% (75 мкг/мл доксициклина) 65 % (75 мкг/мл гигромицина) 100% (75 мкг/мл доксициклина)

Сохранение интакности клеток 14 суток Более 5.5 месяцев

той же скоростью, что и штамм дикого типа. Однако, время перехода в NC состояние штамма Н1р-0 (О КОЕ) при культивировании в модифицированной среде Hartman-de-Bont отличается от штамма Wt-pMind (90-96 часов vs 68-70 часов) (Рис.5а) или дикого типа [Shleeva, 2004]. Комплементированный штамм Hlp-0-hlp, несущий ген hip в плазмиде, переходил в некультивируемое состояние на 2 часа позже, чем штамм Wt-pMind. Однако, скорость образования покоящихся форм штаммами HJp-О и Wt-pMind в модифицированной среде SR-1 была одинаковой (данные не представлены).

2 Концентрация клеток в каждом эксперименте составляла 5 107/мл

16

А

Б

х « и

а) ю и м га

Время культивирования)1)

зз « ю аз га ш т ш Время культа вированиЗД

Рис. 5. Переход в некультивируемое состояние штаммов М. $те§тШг5 в модифицированной среде НагЦпап-<1е ВоШ. А- штамм Wt-pMind, ■ (зеленый) - Н1р-0-рМЬн1 (А), ■ - Шр-О-АСИ, в (зеленый) - \Vt-AGR, А- Н1р-0-АС1?ти« (Б). Эксперименты А и В повторяли 11 раз, на рисунке представлен результат типичного эксперимента. Каждая точка КОЕ представляет средний результат 5 повторностей. Разброс показывает $0.

2.2. Способность покоящихся форм штамма Н1р-0 к оживлению.

НК клетки штаммов Н1р-0 и \\Ч-рМщ(1 были протестированы на их способность к оживлению в присутствии рекомбинантного белка М. Ыеш ЯрАЗт, который оказался более активным и стабильным во время хранения, чем полноразмерный белок 11рГ (данные неопубликованы). В противоположность \У1-рМш<1, N0 клетки штамма Н1р-0 оказались неспособными к оживлению в жидкой среде с Яр15т (Рис. 6).

10 -

£

;z:

Q.

Wt-pMind Hlp-0-pMind Hip-0-pMind-Hip

Рис. 6. Оживление N0 клеток М. smegmatis обусловленное . N0 клетки М. smegmatis штаммов \Vt-pMind, Н1р-0-рМш<1 а также комплементированного штамма Н1р-0-рМтй-Н1р были помещены в жидкую среду БаиКт с добавлением НрГ8т (5 ng т|~') (серые колонки) или без него (белые колонки). MPN анализ был выполнен путем последовательного разведения клеточных суспензий в трех повторностях для каждого эксперимента. На рисунке представлен средний результат по 3 независимым экспериментам. Разброс показывает 81). Число КОЕ в культурах перед оживлением составляло 1* 102 - 6.9*103.

Клетки штамма Hlp-0-pMind-Hlp, несущего ген hip в плазмиде, частично оживлялись RpfSm (Рис. 6). Это доказывает, что неспособность штамма с инактивированным геном гистоноподобного белка «оживать» под действием RpfSm связана именно с отсутствием гистоноподобного белка Hip. Таким образом, недостаток Hip проявляется в переходе микобактериальных клеток в необратимо некультивируемое (или умирающее) состояние при данных условиях (недостаток К+), а не в переходе к NC покою. На основании этих данных можно заключить, что Hip не влияет на запуск процесса перехода в некультивируемое состояние, но является необходимым для жизнеспособности клеток на поздних стадиях покоя.

Примечательно, что штамм Hlp-0-pAGR с инактивированным геном hip и несущим плазмиду с геном rpf существенно отличался от Н1р-0 по культивируемости, будучи

культивируемым в модифицированной среде Hartman-de-Bont. В частности, клетки Н1р-0-pAGR оставались способными образовывать колонии даже после 180 часов культивирования - в противоположность штаммам Н1р-0 и Hlp-0-pAGH (Рис. 5в). Таким образом, комбинированное действие понижения уровня Hip и повышение уровня Rpf радикально продлило способность клеток М. smegmatis переживать недостаток питательных веществ в полностью культивируемом состоянии, выявляя противоположных эффект этих двух белков в формировании «некультивируемости». Мы предполагаем, что Rpf как рост-стимулирующий фактор [Mukamolova, 1998] промотировал рост (криптический?) остающихся культивируемыми клеток в умирающей популяции клеток Н1р-0, как уже отмечалось для культур М. smegmatis [Shleeva, 2004]. Аналогично, отсрочка в переходе к NC состоянию у штамма Wt-pAGR, несущего ген rpf (Рис. 5в), может отражать Rpf-обусловленную стимуляцию роста некоторых клеток в общей популяции. Значительные отличия в поведении штаммов HIp-0-pAGR и Н1р-0 может обсуждаться исходя из двойного эффекта действия Rpf: поддержание роста ослабленных популяций (как в случае со штаммом Н1р-0), и, собственно, эффекта оживления покоящихся форм штаммов Wt или Hlp-0-pAGR. Это является еще одним доказательством того, что штаммы Wt и Н1р-0 находятся в разном физиологическом состоянии. Таким образом, данные результаты свидетельствуют о том, что Hip играет роль в адаптации обратимого NC в клетках М. smegmatis на поздних стадиях культивирования в соответствующей среде.

2.3. Устойчивость покоящихся форм штамма Н1р-0 к стрессовым воздействиям.

В следующей группе экспериментов была изучена устойчивость морфологически измененных (овоидных) форм к стрессовым воздействиям. Морфологически измененные формы дикого типа оказались более устойчивы к действию повышенной температуры. Так, например, при прогревании овоидных форм, полученных в модифицированной среде SR-1, 80°С 10 мин, количество живых клеток штамма Н1р-0 было в 100 раз меньше, чем дикого типа. Аналогичные результаты были получены при обработке овоидных форм ультрафиолетовым излучением.

На основании полученных результатов можно заключить, что несмотря на способность микобактерий с инактивированным геном hip продуцировать овоидные формы, Hip обеспечивает их устойчивость к стрессовым условиям. Возможно, что гистоноподобные белки являются общим звеном антистресового механизма. Так, было продемострировано, что концентрация Hip в клетках М. smegmatis значительно возрастает в ответ на холодовой шок (0°С); кроме того, штамм с инактивированным геном hip неспособен к росту при 10°С [Shires, 2001].

2.4. Роль гистонопояобного белка Hip в архитектуре нуклеоида.

Хотя механизм, с помощью которого Hip осуществляет свою антистрессорную функцию, остается неясным, можно было предположить, что Hip функционирует как физический щит против стрессовых факторов, действие которых приводит к повреждению ДНК, аналогично другому гистон-подобному белку Lrs2 М. tuberculosis, который защищает ДНК от ROI in vitro и во время инфекции [Colangeli et al., 2009]. Изучение в эпифлуоресцентном микроскопе овоидных клеток, полученных в модифицированной среде SR-1, обработанных DAPI, выявило четко различимые области компактизованной ДНК в покоящихся клетках штамма Wt-pMind, отсутствующих в штамме Hlp-0-pMind (Рис. 7).

Спектроскопия образцов комлексов ДНК и белка, выделенных из овоидных форм штаммов дикого типа и штамма Н1р-0 показала, что с ДНК овоидных форм штамма дикого типа связано на 34% белка больше, чем с ДНК штамма с инактивированным геном hip (данные не представлены), что может служить косвенным подтверждение возможной роли Hip как протекторного щита.

Рис. 7. Световая микроскопия покоящихся форм М. smegmatis, полученных в модифицированной среде .

Образцы из культур овоидных клеток, полученных после культивирования в модифицированной среде 8К-1 (4.5 мес) штаммов (А, В), Н1р-0 (С, Б) и Н1р-0-Ыр (К,К) обрабатывали БАР1 (2 мкг мл"1) и изучали в фазовоконтрастном (А, С, Е) и эпифлуоресцентном режиме (В, Б, К).

III. Взаимодействие гистоноподобного белка и ДНК in vitro.

3.1. Изменения вторичной структуры ДНК при связывании Hip.

Для изучения характера изменений во вторичной структуре ДНК, вызываемых связыванием с Hip, был использован метод кругового дихроизма. Спектры КД, снятые для отдельно ДНК (плазмиды), белка Hip и их смеси выявили различие во вторичной структуре ДНК при связывании с белком (Рис. 8).

Рис. 8. Изменения в КД спектре ДНК при связывании Hip in vitro Синим цветом показан спетр КД рекомбинантного белка Hip в концентрации 4.5 мкг/мл, розовым цветом, - спектр кольцевой плазмиды в концентрации 1.12 мкг/мл, желтым, - спектр их комплекса. Спектры снимали 3 раза, усредняли и вычитали спектр буфера.

Для более детального изучения изменений вызываемых взаимодействием Hip и ДНК КД спектры были математически обработаны с использованием метода разностных спектров. А именно, были построены спектры разности математической суммы спектров ДНК и белка и спектров их взаимодействия (Рис. 9). Как видно, такая обработка выявила отклонение спектров от нулевой линии в области 270 и 220 нм. Изменения спектра в области 270 нм свидетельствует о связывании рекомбинантного белка Hip с ДНК, изменения в области 220 нм - об образовании областей суперскручивания [Каргов, 2008]. Эти изменения позволяют сделать вывод об индукции суперспирализации ДНК при связывании белка Hip.

Длина волны, нм

Рис. 9. Разностные спектры математической суммы спектров ДНК и гистона минус спектр смеси ДНК и гистона в реакционной среде.

Концентрация ДНК в каждой реакции составляла 1.12 мкг/мкл. Синим цветом показан спектр с участием 1.35 мкг/мкл Hip, розовый - 2.025 мкг/мкл, желтым - 2.475 мкг/мкл, зеленым - 4.5 мкг/мкл. Спектры снимали 3 раза, усредняли и вычитали спектр буфера

3.2. МЭЦ как возможный регулятор связывания Hip с ДНК.

Согласно ранее полученным данным [Grieshaber, 2006], один из компонентов немевалонатного пути синтеза изопреноидов, - МЭЦ препятствует связыванию гистоноподобного белка стафилококка Lsr2 с нуклеоидом. Мы предположили, что связывание Hip с нуклеоидом у микобактерий может регулироваться аналогичным образом. Для проверки данного предположения в реакционную смесь гистон-ДНК был добавлен МЭЦ в концентрации 8.8 мкг/мл (Рис. 10), после чего был записан спектр КД.

Рис. 10. МЭЦ предотвращает связывание ДНК и гистноподобного белка Hip. Синим цветом показан разностный спектр КД математической суммы спектров ДНК и гистона минус спектр смеси ДНК и гистона в реакционной среде, оранжевым - разностный спектр математической суммы спектров (ДНК + гистон + МЭЦ) минус спектр смеси (ДНК + гистон + МЭЦ в реакционной среде), розовым - разностный спектр математической суммы спектров (ДНК + гистон + пирофосфат) минус спектр смеси (ДНК + гистон + пирофосфат в реакционной среде). Спектры снимали 3 раза, усредняли и вычитали спектр буфера.

Как видно из рис.10, МЭЦ препятствует связыванию Hip и ДНК (разностный спектр математической суммы спектров (ДНК + гистон + МЭЦ) минус спектр смеси (ДНК + гистон + МЭЦ в реакционной среде) дают нулевую линию). Такое воздействие очевидно специфично, поскольку введение в реакционную смесь Hip и ДНК другого фосфатсодержащего соединения - пирофосфата не приводило ни к каким изменениям во взаимодействии гистоноподобного белка и ДНК (совпадение с разностным спектром математической суммы спектров (ДНК + гистон) минус спектр смеси (ДНК +■ гистон в реакционной среде) (Рис. 10).

|

Выводы

1. Культивирование М. smegmatis в условиях недостатка азота и пониженной температуры М. smegmatis приводит к формированию морфологически дифференцированных овоидных покоящихся форм.

2. Полученные формы обладают повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям (антибиотики, УФ или повышенная температура).

3. Гистоноподобный белок Hip определяет обратимость перехода клеток из покоящегося и некультивируемого состояния в активное состояние. Инактивация гена hip М. smegmatis приводит к гибели клеток в условиях перехода клеток в покоящееся состояние.

4. Гистоноподобный белок Hip в покоящихся клетках обеспечивает их повышенную устойчивость к стрессовым воздействиям (повышенная температура, УФ, антибиотики), которая, по-видимому, связана с обусловленной Hip компактизацией нуклеоида.

5. Связывание Hip с бактериальной ДНК вызывает суперспирализацию ДНК in vitro. Продукт немевалонатного пути синтеза изопреноидов 2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат (МЭЦ) препятствует взаимодействию Hip с ДНК.

Список публикаций Статьи

1. Anuchin AM. Mulyukin AL, Suzina NE, Duda VI, El-Registan GI, Kaprelyants AS. Dormant forms of Mycobacterium smegmatis with distinct morphology. Microbiology SGM. 2009,155, pp. 1071-1079.

2. Anuchin A. M.. Goncharenko A. V., Demina G. R., Mulyukin A. L. .Ostrovsky D. N., Kaprelyants A. S. The role of histone-like protein, Hip, in Mycobacterium smegmatis dormancy. FEMS Microbiol Lett., 2010, 308, pp. 101-107.

3. A. M. Анучин. А. В. Гончаренко, И. В. Талон, О. И. Демиденок, Ю. К. Кудыкина, М. М. Мойсенович, A. JI. Мулюкин , А. С. Капрельянц. Модель покоящихся форм микобактерий для тестирования химиопрепаратов против латентных форм туберкулеза. Прикладная биохимия и микробиология, 2010,3, стр. 28-34.

4. А.Л. Мулюкин, Ю.К. Кудыкина, МО. Шлеева, A.M. Анучин. Н.Е. Сузина, В.Н. Данилевич, В.И. Дуда, A.C. Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан. Внутривидовое разнообразие покоящихся форм Mycobacterium smegmalis. Микробиология, 2010, 79, стр.486-497.

Тезисы конференций

1. Гончаренко А. В., Галон И. А., Анучин А. М- Островский Д. Н., Капрельянц А. С. Влияние инактивации гена гистон-подобного белка на образование покоящихся «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis. 4й съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008, стр. 162.

2. Анучин А. М.. Гончаренко А. В., Демиденок О. И., Капрельянц А. С. Новая модель образования покоящихся форм Mycobacterium smegmatis. Роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования покоящихся форм. 4я международная конференция молодых ученых «От молекулы до биосферы», Харьков, 2009, стр.163.

3. Gonchrenko А. V., Demidenok О. I., Anuchin А. М.. Galon I. A., Ostrovsky D. N., Kaprelyants A. S. A new toxin-antytoxin gene family (ТА), a global regulator of the physiological state in Mycobacterium: from dormancy to a programmed cell death. ICOMID 2009, p. 151.

ЛР № 063109 от 04.02.1999 г

Формат 60x90/16. Заказ 938. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, ул. Кедрова, д. 15, тел. 774-26-96

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анучин, Алексей Максимович

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Покоящееся состояние микроорганизмов. Определение.

Клетки стационарной фазы. «Пролиферативный покой».

Морфологически дифференцированные покоящиеся формы бактерий

Покоящиеся формы микобактерий.

Факторы, обеспечивающие поддержание покоящегося состояния.

Гистоноподобные белки бактерий.

Глава 2. Материалы и методы.

Штаммы и условия культивирования.

Клонирование.

Получение покоящихся форм Mycobacterium smegmatis.

Выделение и очистка рекомбинантных белков Rpf и Hip.

Мягкое выделение ДНК.

Оживление НК клеток Mycobacterium smegmatis.

Фракционирование морфологически дистинктных клеток Mycobacterium smegmatis.

Включение радиоактивной метки.

Проточная цитофотометрия.

Световая и флуоресцентная микроскопия.

Конфокальная микроскопия.

Электронная микроскопия.

Выделение липидов и их анализ.

Изучение чувствительности клеток к действию стрессовых факторов.

Измерение кругового дихроизма.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Получение покоящихся форм Mycobacterium smegmatis с использованием модифицированной среды 8К-1(Модель 1).

Электронная микроскопия овоидных клеток.

Флуоресцентная микроскопия и проточная цитофотометрия.

Культивируемость голодающих клеток Mycobacterium smegmatis.

Оживление голодающих клеток Mycobacterium smegmatis.

Чувствительность покоящихся клеток Mycobacterium smegmatis, полученных в модифицированной среде SR-1 к стрессовым воздействиям.

Получение покоящихся форм М. smegmatis с использованием супернатанта двухсуточной культуры М. smegmatis, выращенной в среде NB (Модель 2).

Получение покоящихся морфологически дифференцированных форм Mycobacterium smegmatis.

Устойчивость полученных форм к стрессовым воздействиям.

Роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis.

Динамика перехода в покоящееся состояние различных штаммов М smegmatis.

Способность покоящихся форм штамма Н1р-0 к оживлению.

Устойчивость покоящихся форм штамма Н1р-0 к стрессовым воздействиям.

Роль гистоноподобного белка Hip в архитектуре нуклеоида.

Взаимодействие гистоноподобного белка и ДНК in vitro.

Изменения вторичной структуры ДНК при связывании Hip.

МЭЦ как возможный регулятор связывания Hip с ДНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль гистоноподобного белка HLp в процессе образования и реактивации покоящихся форм Mycobacterium smegmatis"

Длительное воздействие стрессовых факторов на бактериальную культуру приводит к существенной модификации клеточного метаболизма. Результатом этих изменений может явиться переход клеток в покоящееся состояние, сопровождающееся глубокими физиологическими структурными и биохимическими изменениями. Покоящиеся клетки полностью перестают делиться, уровень метаболической активности перестает детектироваться инструментальными методами. Ранее покоящиеся состояние ассоциировали только со специализированными формами спорообразующих бактерий, однако, получены многочисленные экспериментальные подтверждения возможности образования покоящихся форм неспорулирующими бактериями [Kaprelyants, 1993].

Неспорулирующие микобактерии являются значимой группой микроорганизмов, поскольку включают таких возбудителей инфекционных заболеваний как туберкулез и лепра. По данным ВОЗ, каждый третий человек является носителем латентного туберкулеза, который может переходить в активное состояние, вызывая инфекцию. При этом механизмы возникновения таких латентных форм и пути их реактивации остаются неизвестными. И хотя вовлеченность специализированных покоящихся клеток микобактерий в явление латентного туберкулеза интенсивно обсуждается на протяжении многих лет, вопрос существования таких клеток in vivo остается открытым.

Изучение покоящихся форм микобактерий имеет длительную историю. Согласно работам Хоменко [Khomenko, 1984], имеется большая вероятность того, что в тканях и органах инфицированных животных находятся покоящиеся морфологически дифференцированные формы Mycobacterium tuberculosis. Предпринимались многочисленные попытки моделирования условий, в которых микобактерии переходят в покоящееся состояние. Однако, ни в одной из экспериментальных моделей in vitro1, существующих на сегодняшний день, не было продемонстрировано образование подобных форм. Это свидетельствует о, возможно, неглубоком, уровне покоя, развиваемого в данных моделях, поэтому они. вряд ли- могут служить, адекватным отражением процессов происходящих in vivo в тканях инфицированных людей. Поэтому экспериментальное доказательство» возможности образования морфологически дифференцированных покоящихся форм микобактерии in vitro являлось бы существенным вкладом в решение обсуждаемой проблемы.

При изучении существующих на настоящее время моделей покоя был накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что образование покоящихся форм микобактерий - сложный процесс, включающий множество «игроков», таких, как «гены покоя», соответствующие белки, регуляторные факторы, ферменты, структурные элементы клетки и т. д. Поскольку, очевидно, переход в покоящееся состояние сопровождается глобальной перестройкой клеточного метаболизма, можно ожидать участие в этом процессе глобальных регуляторов. Одним из таких регуляторов является семейство ДНК-связывающих белков (гистоноподобные белки), вызывающих изменение архитектуры нуклеоида и регулирующие активность тех или иных оперонов. У микобактерий таким гистоноподобным белком является Hip. Ряд авторов предполагает, что гистоноподобный белок Hip принимает участие в стрессовом ответе микобактерий [Shires, 2001]. Имеются также данные о том, что при переходе М. smegmatis в покоящееся (нерепликативное) состояние в микроаэрофильных условиях (модель Wayne) происходит пятикратное увеличение концентрации Hip в клетках [Lee, 1998].

1В данном контексте мы подразумеваеем под in vitro, размножение бактерий вне организма хозяина (в колбах и пробирках), под in vivo следует понимать размножение бактерий в организме хозяина (после инфицирования).

Однако очень странным оказался факт, что инактивация гена hip не приводила к каким-либо изменениям в образовании нерепликативных форм, которые фенотипически не отличались от покоящихся форм дикого типа. Этот факт оставляет открытым вопрос о значимости гистоноподобных белков в образовании покоящихся форм и требует дальнейшего изучения.

На основании изложенных данных были сформулированы следующие цели и задачи данного исследования.

Цели работы - экспериментально доказать образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro и изучить роль гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации полученных покоящихся форм М. smegmatis.

Задачи исследования:

-скрининг условий культивирования М. smegmatis, при которых происходит образование морфологически дифференцированных покоящихся форм

-сравнительное изучение мутантных клеток М. smegmatis с инактивированным геном hip с клетками дикого типа при переходе в покоящееся состояние и образованных в результате такого перехода покоящихся форм

-получение рекомбинантного белка Hip и изучение особенностей его взаимодействия с ДНК

-изучение продукта немевалонатного пути синтеза изопреноидов (МЭЦ) как возможного регулятора связывания Hip и ДНК.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Анучин, Алексей Максимович

Выводы.

1. Культивирование М. smegmatis в условиях недостатка азота и пониженной температуры приводит к формированию морфологически дифференцированных овоидных покоящихся форм.

2. Полученные формы обладают повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям (антибиотики, УФ или повышенная температура).

3. Гистоноподобный белок Hip определяет обратимость перехода клеток из покоящегося и «некультивируемого» состояния в активное состояние. Инактивация гена hip М. smegmatis приводит к гибели клеток в условиях перехода клеток в покоящееся состояние.

4. Гистоноподобный белок Hip в покоящихся клетках обеспечивает их повышенную устойчивость к стрессовым воздействиям (повышенная температура, УФ, антибиотики), которая, по-видимому, связана с обусловленной Hip компактизацией нуклеоида.

5. Связывание Hip с бактериальной ДНК вызывает суперспирализацию ДНК in vitro. Продукт немевалонатного пути синтеза изопреноидов 2-С-метил-В-эритритол-2,4-циклопирофосфат (МЭЦ) препятствует взаимодействию Hip с ДНК.

Заключение.

Способность микобактерий образовывать специализированные покоящиеся формы все еще остается предметом дискуссии в современной микробиологии. И хотя накопленный экспериментальный материал подтверждает способность микобактерий переходить в состояние покоя, данные об образовании микобактериями морфологически дифференцированных специализированных клеток весьма противоречивы. Поиск прямых доказательств существования таких форм представляется особенно важным, поскольку микобактерии включают в себя возбудителей таких опасных заболеваний, как туберкулез и лепра. Время от времени сообщаются данные о нахождении необычных форм микобактерий у больных ТБ, однако систематических работ об обнаружении таких форм in vitro нет.

В настоящей работе впервые обнаружено образование морфологически дифференцированных форм микобактерий in vitro на примере М. smegmatis при культивировании в неоптимальных условиях (недостаток азота и пониженная температура). Такие формы обладали повышенной устойчивостью к действию стрессовых факторов (антибиотики, нагревание, коротковолновое излучение), а также были способны сохранять жизнеспособность в течение длительного времени (более 5 месяцев), что позволяет отнести их к покоящимся формам. Глубокие морфологические изменения клеточной стенки и реорганизация цитоплазмы позволяют отнести полученные формы к цистоподобным формам, характерным для других неспорообразующих бактерий [Головлев, 1998]. Подобные глубокие преобразования подразумевают участие глобальных регуляторов метаболических процессов. Среди них наиболее очевидными являются гистоноподобные белки, ответственные за регуляцию архитектуры нуклеоида. У микобактерий такие белки также принимают участие в стрессовом ответе [Shires, 2001]. В настоящей работе впервые было обнаружено, что гистонопобный белок Hip определяет обратимость перехода клеток М. smegmatis из покоящегося, «некультивируемого» состояния в активное состояние, что проявляется1 в неспособности штамма с инактивированным геном hip к реактивации в присутствии белка Rpf (resuscitation promoting factor). Однако Hip не влияет на инициацию перехода клеток в покоящееся состояние, которое индуцируется рядом стрессорных факторов (недостаток калия в данной модели), и, очевидно, происходит без участия Hip.

В ходе настоящей работы впервые была показана значимость гистоноподобного белка Hip для обеспечения устойчивости полученных покоящихся форм М. smegmatis. Экспериментально было доказано, что гистоноподобный белок Hip участвует в компактизации нуклеоида в процессе перехода М. smegmatis в покоящееся состояние. По-видимому, повышенная устойчивость покоящихся форм обусловлена, в том числе, такой компактизацией нуклеоида. Одним из регуляторов связывания гистоноподобного белка Hip с ДНК, возможно, является МЭЦ (2-С-метил-0-эритритол-2,4-циклопирофосфат) - один из интермедиатов немевалонатного пути синтеза изопреноидов, который препятствует такому связыванию Hip с ДНК in vitro. Ранее были получены данные о способности покоящихся форм штамма-гиперпродуцента МЭЦ М. smegmatis к самореактивации [Гончаренко, 2007]. Разумеется, необходимы дальнейшие исследования для выяснения значимости МЭЦ-зависимого пути реактивации покоящихся форм. На сегодняшний день нам известен лишь первый этап механизма реактивации, связанный с действием белков семейства Rpf [Shleeva, 2004]. Изучение роли МЭЦ в этом сложном процессе являлось бы важным вкладом в решение задачи о выяснении конкретных механизмов, приводящих к реактивации покоящихся форм микобактерий.

Полученная модель образования морфологически дифференцированных покоящихся форм микобактерий in vitro составляет хороший инструмент для изучения механизмов индукции покоя микобактерий, оценки роли генов и механизмов, вовлеченных в процесс перехода микобактерий в латентное состояние. С другой стороны, полученные покоящиеся клетки микобактерий могут быть использованы в качестве тест-системы для анализа эффективности потенциальных лекарственных агентов против латентных форм микобактериозов, таких как туберкулез и лепра.

Полученные данные о роли гистоноподобного белка Hip в процессе образования и реактивации покоящихся форм микобактерий позволяют рассматривать этот белок в качестве потенциальной мишени для лекарственных агентов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анучин, Алексей Максимович, Москва

1. Акименко В. К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. 1989. Москва: Наука.

2. Батраков С. Г., Эль-Регистан Г. И., Придачина Н. Н. 1993. Тирозол -ауторегуляторный фактор dl Sacchromyces serevisiae. Микробиол. 62. 633-638.

3. Бухарин О. В., Гинцбург А. Л., Романова Ю. М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. 2005. Москва: Медицина.

4. Головлев Е. JI. 1998. Другое состояние неспорообразующих бактерий. Микробиол. 67. 525-535.

5. Демкина Е. В., Соина В. С., Эль-Регистан Г. И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis и автолизирующихся суспензиях. Микробиология. 69 (3). 383-388.

6. Дуда В. И., Пронин С. В., Эль-Регистан Г. И. 1982. Образование покоящихся рефрактерных клеток у Bacillus cereus под воздейтствием ауторегуляторного фактора. Микробиол. 51, 77-81

7. Капрельянц А. С., Скрыпин В. И., Эль-Регистан Г. И. 1985. Изменение структурного состояния мембран М. lysodeiktis под влиянием препаратов ауторегуляторных факторов d). Прикл. Биохимия и микробиология. 21. 387-381.

8. Колпаков А. И., Ильинская О. Н., Беспалов М. И. Стабилизация ферментов аутоиндукторами анабиоза как один из механизмов устойчивости покоящихся форм микроорганизмов. 2000. Микробиол., 69, 224-230.

9. Мулюкин A. JL, Демкина Е. В., Козлова А. Н. Синтез аутоиндукторов анабиоза у неспорообразующих бактерий как механизм регуляции их активности в почве и подпочвенных осадочных породах. Микробиол. 70 (5). 620-628.

10. Поляничко А. М, Дрибинский Б.А, Кипенко И.Б, Феофилова М.С.,Чихиржина Е.В. 2010. Взаимодействие между хромосомными белками HMGB1 и HI в растворе. Структура и динамика молекулярных систем, 8, 3-7.

11. Aki Т., Adhya S. 1997. Repressor induced site-specific binding of HU for transcriptional regulation. EMBO journal. 16.3666-3674.

12. Alper S., Dufour A., Garsin D. A. 1996. Role of adenosine nucleotides in the regulation of a strerss-response transcription factor in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 165-177.

13. Alper S., Duncannd L., Losick R. 1994. An adenosine nucleotide swick controlling the activity of a cell type-specific transcription factor in Bacillus subtillis. Cell. 77. 195-206.

14. Alyar S.E., McLeod S.M., Ross W., Hirownen C.A., Thomas M.S., Jonson R.C., Gourse R.L. 2002. Architecture of Fis-activated transcription complexes at the Escherichia coli rrnB PI and rrnE PI promoters. J. Mol. Biol. 316. 501-516.

15. Anuchin A.M., Mulyukin A.L., Suzina N.E., Duda V.l., El-Registan G.I., Kaprelyants A.S. 2009. Dormant forms of Mycobacterium smegmatis with distinct morphology. Microbiol. 155. 1071-1079.

16. Anuchin A. M., Goncharenko A. V., Demina G. R., Mulyukin A. L. Ostrovsky D. N., Kaprelyants A. S. 2010. The role of histone-like protein, Hip, in Mycobacterium smegmatis dormancy. FEMS Microbiol Lett., 308, 101-107

17. Azam T. A., Ishihama A. 1999. Twelve Species of the Nucleoid-associated Protein from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274. 33105-33113.

18. Azam T. A., Iwata A., Nishimura A. 1999. Growth phase dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181. 6361-6370.

19. Ball A., Osuna R., Ferguson K.C., Jonson R.C. 1992. Dramatic changes in FIS levels upon nutrient upsift in Esherichia coli. J. Bacteriol. 174. 8043-8056.

20. Benevides J.M., Danahy J., Kawakami J., Thomas G.J. 2008. Mechanisms of Specific and Nonspecific Binding of Architectural Proteins in Prokaryotic Gene Regulation. Biochem. 47. 3855-3862.

21. Blokpoel M. C, Murphy H. N, O'Toole R., Wiles S., Runn E. S, Stewart G. R, Young D. B. & Robertson B. D. 2005. Tetracycline-inducible gene regulation in mycobacteria. Nucleic Acids Res. 33. 22.

22. Boubrik F. & Rouvierc-Yaniv J. 1995. Increased sensitivity to y irradiation in bacteria lacking protein HU. Proc. Natl.Acad. Sei. USA. 92. 3958-3962

23. Browning D. F., Cole J.A., Busby S. J. 2008. Regulation by Nucleoid-Associated Proteins at the Escherichia coli nir Operon Promoter. J. Bacteriol. 190. 7258-7267.

24. Browning D.F., Cole J.A., Buspy J.W. 2004. Transcription activation by remodeling of a nucleoprotein assembly at a shared regulatory region. Mol. Microbiol. 57. 496510.

25. Cashel M., Rudd K. E. 1996. The stringent response Escherichia coli and Salmonella typhimurinm. Washington D. C: Amer. Soc . Microbiol.

26. Ceschini S., Lupidi G., Coletta M., Pon C.L., Fioretti E., Angeletti M. 2000. Multimeric Self-assembly Equilibria Involving the Histone-like Protein H-NS. J. Biol. Chem. 275. 729-734.

27. Chen J. M., Ren H., Shaw J. E., Wang Y. J., Li M., Leung A. S., Tran V., Berbenetz N. M., Kocincovä D., Yip C. M., Reyrat J. M., Liu J. 2008. Lsr2 of Mycobacterium tuberculosis is a DNA-bridging protein. Nucleic Acids Res. 36. 2123-2135.

28. Cunningham A. F., Spreadbury C. L. 1998. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. JBacteriol. 180. 801-808.

29. Cutting S., Dricks A., Schmidt R. 1991. Forespore-specific transcription of a gene in the signal transduction pathwat that governs pro-s K processing in Bacillus subtillis. Genes Dev. 5. 456-466.

30. Dame R.T., Goosen N. 2002. HU: promoting or counteracting DNA compaction? FEBS Letters. 529.151 -156.

31. Dame R.T., Wymanb C., Goosen N. 2001. Structural basis for preferential binding of H-NS to curved DNA. Biochimie. 83. 231-234.

32. Dorman C.G., Deighan P. 2003. Regulation of gene expression by histone-like proteins in bacteria. Curr. Opin. Genet. Dev. 13. 179-184.

33. Dorman C.J., Hinton J.C., Free A. 1999. Domain organization and oligomerization among H-NS-like nucleoid-associated proteins in bacteria. Trends Microbiol. 7. 124128.

34. Falconi M., Prosseda G., Giangrossi M., Beghetto E., Colonna J. 2001. Involvement of FIS n the H-NS-mediated regulation of virF gene of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli. Mol. Microbiol. 42. №2.439-452.

35. Galan B., Kolb A., Garcia J. L., Prieto M A. 2001. Superimposed levels of regulation of the 4-hydroxyphenylacetate catabolic pathway in Escherchia coli. J. Biol. Chem. 276. 37060-37068.

36. Garton N. J, Waddell S. J, Sherratt A. L, Lee S. M, Smith R. J, Senner C., Hinds J, Rajakumar K., Adegbola R. A., Besra G. S., Butcher P. D., Barer M. R. 2008.

37. Cytological and transcript analyses reveal fat and lazy persister-like bacilli in tuberculous sputum. PLoSMed. 5(4), 75.

38. Garton N. J., Christensen H, Minnikin D. E, Adegbola R. A, Barer M. R. 2002. Intracellular lipophilic inclusions of mycobacteria in vitro and in sputum. Microbiol. 10, 2951-8.

39. Ghosh G., Larsson P., Singh B, Pettersson B. M, Islam N. M, Sarkar S. N, Dasgupta S. & Kirsebom L. A. 2009. Sporulation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 106. 10781-10786.

40. Goodman S.D., Nickolson S.C., Nash H.A. 1992. Deformation of DNA during site-specific recombination of bacteriophage A: Replacement of IHF protein by HU protein or sequence-directed bends. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89. 11910-11914.

41. Gould G. V. 1983. Mechanisms of resistance and dormancy/ The bacterial spore. L., H., Y., Acad Press,. V. 2. P. 173-209.

42. Grieshaber N. A., Sager J. B., Dooley C. A., Hayes S. F., Hackstadt T. 2006. Regulation of the Chlamydia trachomatis Histone HI-Like Protein Hc2 Is IspE Dependent and IhtA Independent. J. Bacteriol. 188. 5289-5292.

43. Grieshaber N., Fisher E., Mead D., Dooley C., Hackstadt T. 2004. Chlamydial histon DNA interactions are disrupted by a metabolite in mathylerythiol pathway of isoprenoid biosynthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. 101. 7451-7456.

44. Hengge-Aronis R., Loewen P. C. 1994. The role of sigma factor os (KatE) in bacterial global regulation. Annu. Rev. Microbiol. 48. 53-80.

45. Hodges-Garcia Y., Hagerman P.J., Pettijohn D.E. 1989. DNA Ring Closure Mediated by Protein HU. J. Biol. Chem. 264. 14621-14623.

46. Hommais F., Krin E., Laurent-Winter C., Soutonina O., Malpertuy A., Le Caer J.P., Danchin A., Bertin P. 2001. Large-scale monitoring of pleiotropic nucleoid-associated protein, H-NS. Mol. Microbiol. 40. 20-36.

47. Huisman G. W., Kolter R. 1994. Sensing starvation: a homoserine lactone -dependent signalling pathway in Escherichia coli. Science. 265. 537-539.

48. Husnain S.I., Thomas M.S. 2008. Downregulation of the Escherichia coli guaB promoter by FIS. Microbiology. 154.1729-1738.

49. Ihihama A. 1997. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria. Curr. Opin. Genet. Develop. 7. 582-588.

50. Inge L. D & Wilson J. W .2008. Update on the treatment of tuberculosis. Am Fam Physician. 78. 457-465.

51. Kamashev D., Balandina A., Rouviere-Yaniv J. 1999. The binding motif recognized by HU on both nicked and cruciform DNA. EMBOJ. 18. 5434-5444.

52. Kaprelyants, A. S., Gottschal, J. C. & Kell, D. B. 1993. Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol Rev 104, 271-286.

53. Karakousis P. C, Yoshimatsu T., Lamichhane G., Woolwine S. C, Nuermberger E. L, Grosset J., Bishai W. R. 2004. Dormancy phenotype displayed by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in mice. J Exp Med. 5, 64757.

54. Khomenko, A. G. & Golyshevskaya, V. I. 1984. Filterable forms of Mycobacterium tuberculosis. Z. Erkrank. Atm.-Org. 162, 147-154.

55. Kjelleberg S., Hermansson M. Starvation-induced effects on bacterial surface characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 48. 497-503.

56. Kostrewa D., Granzin J., Koch C., Choe H.W., Raghunthan S., Wolf W. 1991. Three-dimentional structure of the E. coli DNA-binding protein FIS. Nature. 349. 178-180.

57. Krasilnikov, N. A. 1950. Antagonistic Actinomycetes and Antibiotic Substances. Moscow: USSR Academy of Sciences Publ: Co. p 320.

58. Kunkel B., Losick R., Stragier P. 1990. The Bacillus subtillis gene for the developmental transporulation recombinase gene. Genes. Dev. 4. 525-535.

59. Lange R„ Hengge-Aronis R. 1991. Growth phase-regulated expression of bolA and morphology of Escherichia coli cells is controlled by the novel sigma factor 0s (rpoS). J. Bacteriol. 173. 4474-4481.

60. Lavoie B. D., Chaconas G. 1993. Site-specific HU binding in the MU transpososome: conversion of sequence-independent DNA-binding protein into chemical nuclease. Genes Dev.l. 2510-2519.

61. Lee B.H., Murugasu-Oei B., Dick T. 1998. Upregulation of a histone-like protein in dormant Mycobacterium smegmatis. Mol. Gen. Genet. 260. 475-479.

62. Lewin B. Genes. 1994. Oxford; New York; Tokyo: Oxford University Press.

63. Lewis K. 2007. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol. 5. 48-56.

64. Losick R. 1995. Differentiation and cell fate in a simple organism. Bioscience. 45. 401-406.

65. Losick R., Stragier P. 1992. Crisscross regulation of cell-type-specific gene expression during development in Bacillus subtilis. Nature. 355. 601-604.

66. Luijsterburg M. S., White M. F., Driel R., Dame R. T. 2008. The Major Architects of Chromatin: Architectural Proteins in Bacteria, Archaea and Eukariotes. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 188. 393-418.

67. McCune, R. M., Feldmann, F. M., Lambert, H. P., & McDermott, W. 1966. Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J Exp Med 123, 445-468

68. Medgraw T. T., Kao L.R., Chae C.B. 1994. The mitochondrial histone HM: An evolutionary link between bacterial HU and nuclear HMG1 proteins. Biochimie. 76. 909-916.

69. Medlar, E. M., Bernstein, S. & Steward, D. M. 1952. A bacteriologic study of resected tuberculous lesions. Am Rev Tuberc 66(1), 36-43.

70. Megraw T., Chae C. 1993, Functional Complementarity between the HMGl-like Yeast Mitochondrial Histone HM and the Bacterial Histone-like Protein HU. J. Biol. Chem. 268. 12758-12763.

71. Morales P., Rouviere-Yaniv J., Dreyfus M. 2002. The Histone-Like Protein HU Does Not Obstruct Movement of T7 RNA Polymerase in Escherichia coli Cells but Stimulates Its Activity. J. Bacteriol. 184. 1565-1570.

72. Muffler A., Fisher D., Hengge-Acronis R. 1996. The RNA-bindining protein HF-1, known as a host factor for phage Qß RNA replication, is essential for rpoS translation in Escherichia coli. Genes. Dev. 10. 1143-1151

73. Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Young DI, Young M & Kell DB. 1998. A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sei USA. 95. 8916-8921.

74. Mukamolova G. V, Murzin A. G, Salina E. G, Demina G. R, Kell D. B, Kaprelyants

75. A. S. & Young M. 2006. Muralytic activity of Micrococcus luteus Rpf and its relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation. Mol Microbiol. 59. 84-98.

76. Mukamolova G. V., Turapov O. A, Kazarian K, Telkov M., Kaprelyants A. S, Kell D.

77. B. & Young M. (2002) The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol Microbiol. 46. 611-621.

78. Mukherjee A., Bhattacharyya G., Grove A. 2008. The C-Terminal Domain of HU-Related Histone-like Protein HLP from Mycobacterium smegmatis Mediates DNA End-Joining. Biochem. 47. 8744-8753.

79. Mukherjee A., DiMario P.J., Grove A. 2009. Mycobacterium smegmatis histone-like protein Hip is nucleoid associated. FEMS Microbiol Lett. 291. 232-240.

80. Navarre W.W., McClelland M., Libby S.J., Fang F.C. 2007. Silencing ofxenogenic DNA by H-NS-facilitation of lateral gene transfer in bacteria by defense system that recognizes foreign DNA. Genes Dev. 21. 1456-1471.

81. Nicholson W. L., Fajardo-Cavazos P. 2000. DNA repair and the ultraviolet radiation resistance of bacterial spores: from the laboratory to the environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64. 548-572.

82. Ninnemann O., Koch C., Kahmann R. 1992. The E. coli fis promoter is subject to stringent control and autoregulation. EMBO journal. 11. 1075-1083.

83. Nowak-Tompson В., Hammer P., Hill D. S. 2.5-Dialkylrasorcinol biosynthesys in Pseudomonas aurantiaka: novel head-to-head condensation of two fatty acid-derived precursors. J. Bacteriol. 185 (3). 860-869.

84. Nystrom T. 1998. To be or not to be: the ultimate decision of the growtharrested bacterial cell. FEMS Microbiol. Rev. 21. 283-290.

85. Nystrom Т., Larsson C., Gustaffson L. 1996. Bacterial defence against aging: role of the during stasis. EMBO J. 15. 3219-3228.

86. Ojha, A. K., Mukherjee, Т. K. & Chatterji, D. 2004. High intracellular level of guanosine tetraphosphate in Mycobacterium smegmatis changes the morphology of the bacterium. Infect Immun. 68(7), 4084-91.

87. Оке V., Loisick T. Multilevel regulation of the sporulation transcription factor ak in Bacillus subtillis. J. Bacteriol. 175. 7341-7347.

88. Parish & Stoker. 1998. Electroporation of Mycobacteria. Methods in Molecular biology. Mycobacteria protocols. 101. 129-144. Humana press. Totowa, New Jersey.

89. Pontigga A., Negri A., Beltrame M., Bianchi M. E.1993. Protein HU binds specifically to kincked DNA. Mol. Microbiol. 1. 343-350.

90. Postgate J. R. 1976. Death in macrobes and microbes. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 26. 1-18.

91. Rampioni G., Leoni L., Pietrangeli B., Zennaro E. 2008. The interplay of StyR and IHF regulates substrate-dependent induction and carbon catabolite repression of styrene catabolism genes in Pseudomonas fluorescens ST. BMC Microbiol. 8. 92106.

92. Rice P.A., Yang S., Mizuuchi K., Nash H.A. 1996. Crystal Structure of an 1HF-DNA Complex: A Protein-Induced DNA U-Turn. Cell. 87. 1295-1306.

93. Rimsky S. 2004. Structure of the histone-like protein H-NS and its role in regulation and genome superstructure. Curr. Opin. Microbiol. 7. 109-114.

94. Rouviere-Yaniv J, Gros F. 1975. Characterization of a novel, low-molecular-weight DNA-binding protein from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 72. 3428-3432.

95. Rustad T. R, Harrell M. I, Liao R. & Sherman D. R. 2008. The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS One. 3. 502.

96. Ryan V. T., Grimwade J.E.,. Nievera C. J., Leonard A. C. 2002. IHF and HU stimulate assembly of pre-replication complexes at Escherichia coli oriC by two different mechanisms. Mol. Microbiol. 46. №1. 121-124.

97. Schneider R., Travers A., Kutateladze T., Muskhelishvili G. 1999. A DNA architectural protein couples cellular physiology and DNA topology in Escherichia coli. Molecul. Microbiol. 34. 953-964.

98. Sever JL, Youmans GP. 1957. Enumeration of viable tubercle bacilli from the organs of nonimmunized and immunized mice. Am Rev Tuberc. 76(4), 616-35.

99. Shao Y., Feldman-Cohen L.S., Osuna R. 2008. Biochemical Identification of Base and Phosphate Contacts between Fis and a High-Affinity DNA Binding Site. J. Mol. Biol. 380. 327-339.

100. Shires K., Steyn L. 2001. The cold-shock stress response in Mycobacterium smegmatis induces the expression of histone-like protein. Mol. Microbiol. 39. 9941009.

101. Singh R K., Liburd J., Wardle S.J. Haniford D.B. 2008. The Nucleoid Binding Protein H-NS Acts as an Anti-Channeling Factor to Favor Intermolecular TnlO Transposition and Dissemination. J. Mol. Biol. 376. 950-962.

102. Stinson M.W., McLaughlin R., Choi S.H., Juares Z.E., Barnard J. 1998. Streptococcal Histone-Like Protein: Primary Structure of hlpA and Protein Binding to Lipoteichoic Acid and Epithelial Cells. Infect. Immun. 66. 259-265.

103. Su C. J., Sadoff H. L. 1981. Unique lipids in Azotobacter vinelandii cysts: synthesis, distribution and fate during germination. J. Bacteriol. 147. 80-96.

104. Sun, Z. & Zhang, Y. 1999. Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis strain H37Ra improved the viability of aged cultures and allowed small inocula to initiate growth in liquid culture. J Bacteriol 181, 7626-7628.

105. Sussman A. S., Halvorson H. O. Spores. Their dormancy and germination. 1996. New York.

106. Suzina, N. E., Muliukin, A. L., Kozlova, A. N., Shorokhova, A. P., Dmitriev, V. V., Barinova, E. S., Mokhova, O. N., El'-Registan, G. I. & Duda, V. I. 2004.

107. Ultrastructure of resting cells of some non-spore-forming bacteria, Mikrobiologiya 73(4), 516-29.

108. Swinger K.K., Rice P.A. 2004. IHF and HU: flexible architects of bent DNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 14. 28-35.

109. Swingle B., O'Carrol M., Haniford D., Derbyshire K.M. 2004. The effect of host-encoded nucleoid proteins on transposition: H-NS influences targeting of both IS903 and T10. Mol Microbiol. 52. 1055-1067.

110. Tendeng C., Bertin P.N. 2003. H-NS in Gram-negative bacteria: a family of multifaceted proteins. Trends Microbiol. 11. 511-518.

111. Thanbichler M, Wang SC & Shapiro L. The Bacterial Nucleoid: A Highly Organized and Dynamic Structure. J. Cell. Biochem. 96. 506-521.

112. Thanbichler M., Wang S.C., Shapiro L. 2005. The Bacterial Nucleoid: A Highly Organized and Dynamic Structure. J. Cell. Biochem. 96. 506-521.

113. Travers A., Schneider R., Muskhelishvili G. 2001. DNA supercoiling and transcription in Escherichia coli: the FIS connection. Biochimie. 83. 213-217.

114. Velicer G., Kroos L., Lenski R. E. Devopmental cheating in the social bacterium Myxococcus xantus. Nature. 404. 598-601.

115. Vorobjeva L. I, Khodjaev E. Y & Cherdinceva TA. 1995. Antimutagenic and reactivative activities of dairy propionibacteria. Lait 75.473-487.

116. Wallis, R. S. & Ellner, J. J. 1994. Cytokine and tuberculosis. J Leukocyte Biol. 55, 676-681

117. Wardle S.J., O'Carrol M., Derbyshire, K.M., Haniford D.B. 2005. The global regulator H-NS acts directly on the transpososome to promote TnlO transposition. Genes Dev. 19. 2224-2235.

118. Warner S.O. 2002. The bacterial regulatory protein H-NS a versatile modudator of nucleic acid strucrures. Biol. Chem. 383. 945-960.

119. Wayne LG, Sohaskey CD. 2001. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55, 139-63.

120. Weinstein-Fischer D., Elgrably-Weiss M., Altuvia S. 2000. Escherichia coli response to hydrogen peroxide: a role for DNA supercoiling, Topoisomerase I and Fis. Molecul. Microbiol. 35. 1413-1420.

121. Whitley M., Lee K. M., Greenberg E. P. 1999. Identification of genes controlled by quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Nad. Acad. Sei. USA. 96. 13904-13909.

122. De Wit D, Wootton M, Dhillon J, Mitchison DA. 1995. The bacterial DNA content of mouse organs in the Cornell model of dormant tuberculosis. Tuber Lung Dis. 76(6), 555-62.

123. Young M., Mukamolova G. V & Kaprelyants A. S. 2005. Mycobacterial dormancy and its relation to persistence. Mycobacterial microbiology. Horizon Scientific Press Ltd. 265-320.

124. Young, M., Mukamolova, G.V. & Kaprelyants, A.S. 2005. Mycobacterial dormancy and its relation to persistence. Mycobacterial molecular biology 265-320. Edited by T. Parish, Horizon Scientific Press Ltd.

125. Yu R. R., DiRita V. J. 2002. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation. Molecul. Microbiol. 43. 119-134.

126. Zhang, Y., Yang, Y., Woods, A., Cotter, R. J. & Sun, Z. 2001. Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides. Biochem Biophys Res Commun 284, 542-547.

127. Благодарю всех друзей и коллег за поддержку и внимание к моей работе.