"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика

Салина, Елена Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме ""Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика"

На правах рукописи

САЛИНА Елена Геннадьевна

«некульти в и р/е мы е» формы бактерий MYCOBACTERIUMSMEGMATIS и MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS и их биохимическая характеристика

Специальность 03.00.04 - биохимия

автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории Биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Капрсльянц Арсений Сумбатович

Официальные оппоненты доктор биологических наук

Королева Ольга Владимировна

доктор биологических наук, профессор Эль-Регнстан Галина Ивановна

Ведущая организация Институт биохимии и физиологии

микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАИ, г. Пущино

Защита состоится « » диссертационного совета^К 002.247.01

2006 г. в

часов на заседании

по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «

2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

рул

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Существует предположение, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом клеток возбудителя — неспорулирующей бактерии Mycobacterium tuberculosis — в покоящееся состояние в организме человека, причем такие покоящиеся клетки сохраняют жизнеспособность и могут реактивировать, а значит, представляют угрозу активного развития заболевания. Традиционно покоящееся состояние бактерий связывали с формированием специализированных структур, таких как споры и цисты, однако к настоящему моменту становится очевидным, что многие неспорулирующие бактерии, в том числе патогенные, в определенных условиях способны переходить в состояние покоя без образования специализированных структур.

В связи с этим предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Инкубация микобактерий в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода позволяла наблюдать переход клеток М. tuberculosis в «нерепликативное состояние» (Wayne, 1994), однако такое покоящееся • состояние не сопровождалось снижением культивируемости, что не свойственно клеткам возбудителя, находящимся в организме в латентном состоянии. Недавно в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся клеток М. tuberculosis, сопровождающаяся формированием «некультивируемого» (НК) фенотипа, но такие клетки могли быть получены только в анаэробных условиях (Shleeva et al., 2002). Возможно, данное покоящееся состояние является лишь отражением адаптации клеток микобактерий, являющихся аэробами, к недостатку кислорода. Кроме того, сложно сказать, насколько анаэробные условия отвечают реальным условиям, в которых туберкулезные бактерии находятся в тканях организма-хозяина. Так, из литературных данных известно, что в тканях инфицированных мышей бактерии не испытывают недостатка кислорода (Tsai et al., 2006).

Поэтому разработка модели перехода бактерий М. tuberculosis в НК состояние в аэробных условиях представляет большую важность. Ранее сотрудниками нашей лаборатории была показана возможность перехода бактерии Mycobacterium smegmatis, быстрорастущего непатогенного родственника М. tuberculosis, в покоящееся состояние при культивировании в длительной стационарной фазе в аэробных условиях (Shleeva et al., 2004). При этом такие покоящиеся клетки теряли способность расти на твердых питательных средах, то есть являлись «некультивируемыми». Мы предполагаем, что НК клетки М. smegmatis могут рассматриваться как модель латентной туберкулезной инфекции in vivo.

Однако к моменту начала данной работы было известно только о существовании феномена «некультивируемости» М. smegmatis, сами же клетки в

НК состоянии не были охарактеризованы, неясным было, какие факторы оказывают влияние на процесс перехода бактерий в состояние «некультивируемости» (покоя), и является ли этот процесс генетически программированным, активным, или он связан с деградацией клеток и их последующей гибелью. Кроме того, необходимо было выявить механизмы, лежащие в основе процесса реактивации покоящихся клеток микобактерий.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы заключалась в биохимической характеристике НК форм микобактерий, а также изучении механизмов перехода бактерий в состояние «некультивируемости» и выявлении факторов, обеспечивающих их последующую реактивацию. В соответствии с целью работы были поставлены задачи:

1 .Оптимизация метода получения in vitro «некультивируемых» форм бактерии Mycobacterium smegmatis - быстрорастущего непатогенного родственника Mycobacterium tuberculosis.

2.Разработка метода получения in vitro покоящихся («некультивируемых») форм бактерии М. tuberculosis в аэробных условиях.

3.Биохимическая характеристика клеток М. smegmatis в «пекультивируемом» состоянии.

4.Исследование изменения уровня экспрессии генов (транскриптомный анализ) при переходе М. smegmatis в «некультивируемое» состояние.

5.Изучение механизмов функционирования белков семейства Rpf в процессе реактивации «некультивируемых» форм микобактерий.

Научная новизна

1. Найдены условия для получения «некультивируемых» клеток М. tuberculosis при росте в длительной стационарной фазе в аэробных условиях.

2. Впервые проведена биохимическая характеристика «некультивируемых» форм М. smegmatis, показано, что «некультивируемое» состояние характеризуется повышенным уровнем экспрессии ряда генов, продукты которых принимают участие в анаболических процессах, что позволяет рассматривать переход клеток в данное состояние как активный, генетически программируемый процесс.

3. Впервые показано, что реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их пептидогликангидролазной активностью.

Научно-практнческое значение

Разработанные модели получения НК клеток микобактерий и проведенная биохимическая характеристика НК состояния М. smegmatis in vitro являются важными для дальнейшего понимания явления туберкулезной латентности и

механизмов, посредством которых оно регулируется, а также для выявления факторов, влияющих на переход бактерий в состояние «некультивируемости». Проведенные исследования могут быть использованы для выявления у патогенных бактерий генов, участвующих в процессах персистенции в организме человека, продукты экспрессии которых могут явиться мишенями для создания новых лекарственных препаратов и, в частности, противотуберкулезных средств.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы докладывались на научных конференциях: 8-ой школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), 2-ой региональной конференции «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), 15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Copenhagen, Denmark, 2005), 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006).

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, среди которых 4 статьи в российских и международных научных журналах.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на т страницах. Список цитируемой литературы включает наименований.

Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный покоящемуся («некультивируемому») состоянию неспорулирующих бактерий. Отдельное внимание уделено рассмотрению НК состояния микобактерий в связи с острой проблемой латентного туберкулеза в современном мире. Кратко описаны экспериментальные подходы к изучению НК форм микобактерий. Изложены современные представления о биохимических особенностях и генетической регуляции перехода в состояние «некультивируемости».

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Выращивание бактериальных культур.

Mycobacterium smegmatis. Штамм дикого типа тс2 155 и мутантные штаммы выращивались первоначально при 37°С и 240 об/мин на среде Nutrient Broth ("Himedia", Индия) с добавлением 0,05% твин-80. Затем культуру пересевали на модифицированную среду Hartman's-de Bont (H-dB) и выращивали при 37°С и 240 об/мии. Для получения НК клеток к модифицированной среде H-dB добавляли БСА ("Sigma", США) в количестве 0,5%.

Mycobacterium tuberculosis. Штамм H37Rv и мутантные штаммы первоначально выращивали на среде Sauton в присутствии 0,05% твина-80 с добавлением БСА, глюкозы и NaCl при 37°С и 200 об/мин. Затем для получения НК клеток в аэробных условиях культуру пересевали на модифицированную среду Sauton, не содержащую калия, с добавлением 0,05% твин-80, БСА, глюкозы и NaCl и выращивали при 37°С и 200 об/мин. Для получения НК клеток в условиях недостатка кислорода использовали герметично закрытые колбы со средой Sauton нормального состава и добавлением 0,05% твина-80, БСА, глюкозы и NaCl.

Оценка культивируемости клеток проводилась по их способности образовывать колонии на твердых питательных средах. Разведения суспензии бактериальных клеток высевали на агаризованную (1,5% агара) питательную среду (среда Sauton с добавлением БСА, глюкозы и NaCl для М. tuberculosis; среда Nutrient Broth для M. smegmatis). Инокулированные чашки культивировали при 37"С. Число колониеобразующих единиц (КОЕ) подсчитывали через 5 суток (А/. smegmatis), 3-4 недели (М. tuberculosis) после высева. Предел обнаружения КОЕ составлял 5 клеток в мл среды.

Реактивация НК клеток Л , Для оценки числа реактивировавшихся

клеток использовали метод конечных разведений (МКР), заключающийся в приготовлении серии последовательных 10-кратных разведений. Значение наиболее вероятного числа (НВЧ) реактивированных клеток определяли по стандартным статистическим таблицам (de Man, 1975).

M. smegmatis. Процедуру реактивации проводили в течение 6 суток при 37 °С и 120 об/мин в среде Sauton нормального состава с добавлением 0,05% дрожжевого экстракта. Контрольные лунки содержали дополнительно продуцент белка Rpf -бактерию Micrococcus luteus в концентрации 105 кл/мл.

М. tuberculosis. Процедуру реактивации проводили течение 2-х месяцев при 37°С в статическом режиме на среде Sauton нормального состава с добавлением БСА, глюкозы и NaCl.

Приготовление клеточных экстрактов и выделение мембран клеток. Биомассу клеток М. smegmatis разрушали на дезинтеграторе BeadBeater («BioSpecProducts», США) с циркониевыми бусами, неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3 мин. Супернатант вновь центрифугировали (14000 об/мин, 20 мин), полученный осадок клеточных

мембран промывали трижды 50 мМ фосфатным буфером рН 7,0 в присутствии 1 мМ Mg2+, ресуспендировали в 0,2 М растворе сахарозы и хранили при -20 °С, а супернатант подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 часа при 215000 g и 3 °С, полученный экстракт клеток хранился при —70 °С.

Определение активностей внутриклеточных ферментов.

Активность изоцитратлиазы определяли флюориметрически по изменению уровня флюоресценции НАДН при окислении его в НАД1", при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 им. Глиоксилат, образующийся из изоцитрата под действием изоцитратлиазы, восстанавливался в гликолат при участии лактатдегидрогеназы и сопутствующем окислении НАДН.

Активность изоцитратдегидрогеназы определяли флюориметрически при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм по изменению уровня флюоресценции НАДР+ при восстановлении его в НАДРН, сопровождающем превращение изоцитрата в альфа-кетоглутарат.

Определение оксндазных и дегидрогеназных активностей

Дыхательную активность клеток измеряли по скорости поглощения кислорода в термостатируемой полярографической ячейке.

Активность НАДН- и малатдегидрогеназ определяли спектрофотометрически по изменению оптической плотности искусственного акцептора электронов 2,6-дихлорфенол-индофенола в присутствии менадиона и 5 мкмоль субстрата при 600 нм.

Активность эндогенных ДФИ-редуктаз в клетках измеряли в таких же условиях, исключая добавки субстрата.

Активность НАДН-оксидазы определяли флюориметрически по убыли интенсивности флюоресценции НАДН при окислении его в НАД+ при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм.

Выделение и очистка РНК. Клетки М. smegmatis., осажденные центрифугированием, (10 мин, 5000 об/мин, 25 °С), инкубировали в течение 1 часа в лизирующем растворе гуанидинизоцианата. Полученный осадок лизированных клеток ресуспендировали в тризоле («Invitrogen», Великобритания) и разрушали в присутствии циркониевых бус на дезинтеграторе BeadBeater («BioSpec Products», США). Далее РНК экстрагировали хлороформом, осаждали изопропанолом, отмывали 70% этанолом и растворяли в воде, не содержащей нуклеиновых кислот, с добавлением ингибитора РНКаз («Promega», США). Образцы выделенной РНК дважды обрабатывали ДНКазой («Promega», США) и очищали, используя набор для выделения РНК SV Total RNA Isolation Kit («Promega», США). Концентрацию РНК оценивали спектрофотометрически. Контроль отсутствия ДНК в полученных образцах РНК проводили с помощью ПЦР со специфическими праймерами.

Транскриптомный анализ. Из образцов тотальной РНК М. smegmatis, выделенных в трех независимых экспериментах для каждой временной точки,

была получена флюоресцентно меченная комплиментарная ДНК реакцией обратной транскрипции со случайными праймерами и в присутствии меченного цианином-5 (Су-5) дезоксицитидинтрифосфата. Необходимая для контроля геномная ДНК также была мечена флюоресцентным красителем другой длины волны испускания - цианином-3 (Су-3) с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы, случайных праймеров и меченного Су-3 дезоксицитидинтрифосфата. Смесь флюоресцентно меченных геномной ДНК и кДНК конкурентно гибридизовали в двух повторностях с продуктами ген-специфичной ПЦР-амплификации полного генома М. smegmatis. Качественная и количественная оценка результата для каждого то продуктов гибридизации проводилась по длине волны испускания и ее интенсивности с помощью двулучевого сканирующего ридера Affymetrix («Biotech»), к рассмотрению принимались данные, дающие согласованный результат в двух повторностях.

Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций. Использовали специфический субстрат 4-нетилумбелифсрил-р-с1-К;,Ы',М"-триацетилхитотриозид ((NAG)3-MUF) («Sigma», США). Субстрат (конечная концентрация 8 мкМ) инкубировали с белком (конечная концентрация 1-10 мкг/мл) в присутствии 5 мМ MgSC>4 в 50 мМ натрий-цитратном буфере pH 6,0 в течение 3 часов при температуре 37°С. Интенсивность флуоресценции детектировали на флуориметре RF-5301PC («Shimadzu», Япония), длина волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 нм.

Электрофорез белков Rpf в ПААГ проводили по стандартной методике Лэммли (Laemmli, 1970) в присутствии ДДС-Na в электрофоретической камере («Bio-Rad» США) при 4°С. Концентрация акриламида в разделяющем геле составляла 12%. Окраску белков проводили раствором коллоидного кумасси.

Иммуноблоттинг белков Rpf. Для постановки блотгинга использовали аффинно очищенные кроличьи поликлональные антитела против Rpf, специфичные к нативному белку Rpf, всем формам рекомбинантных белков Rpf (Mukamolova et al., 2002) в разведении 1:3000, а также мышиные моноклональные антитела, специфичные к Rpf С в разведении 1:5000, Rpf D в разведении 1:1000, Rpf Е в разведении 1:5000 и кроличьи поликлональные антитела, специфичные к вариабельному участку Rpf В в разведении 1:50000. В качестве вторичных антител использовали соответственно антикроличьи или антимышиные антитела IgG, коньюгированные щелочной фосфатазой («Sigma», США) в разведении 1:5000. Блоттинг проводили на нитроцеллюлозной мембране Trans-Blot Transfer Medium («Bio-Rad», США), (размер пор 0,45 мкм) по стандартной методике.

В третьей главе представлены собственные результаты.

ПОЛУЧЕНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫХ» ФОРМ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM

Оптимизация модели перехода клеток М. smegmatis в НК состояние при росте в стационарной фазе в аэробных условиях. Ранее было показано, что бактерия М. smegmatis при росте в стационарной фазе на не содержащей калия модифицированной среде Hartman's-de Bont в аэробных условиях обладает способностью переходить в НК состояние (Shleeva et al., 2004). Однако данная модель отличалась большой зависимостью эффективности перехода в НК состояние от возраста инокулята (Рис. 1). Было обнаружено, что добавление к модифицированной среде Hartman's-de-Bont бычьего сывороточного альбумина в количестве 0,5% позволило значительно расширить диапазон возраста инокулята, приводящего к формированию НК фенотипа. Кроме того, в присутствии БСА потеря клетками М. smegmatis способности культивироваться на твердых средах происходила уже после 72 ч роста, а не 96, как это было показано ранее (Рис.2).

10 1 10 10 10 | 10 § юЧ * юЧ 10 юЧ 10°

100

время,часы

Рис. 1. Влияние возраста инокулята на переход клеток М. smegmatis в «НК» состояние. Клетки, инокулированные на модифицированную среду Hartman' s-deBont, выращивались предварительно на среде Nutrient Broth с 0,05% твин-80 в течение различного времени (24, 30, 48ч). 1 - 24 ч, 2 - 30 ч, 3 - 48 ч.

Таким образом, была получена хорошо воспроизводимая модель получения НК форм М. smegmatis при росте в стационарной фазе в аэробных условиях. Функция БСА в данном случае, возможно, заключается в сорбции жирных кислот, накапливающихся в культуральной жидкости, и оказывающих, как предполагается, повреждающее действие на клетки, что может приводить к критическому росту. В присутствии БСА устраняется проблема гетерогенности популяции и происходит некая «синхронизация» культуры, тем самым упрощается переход клеток в НК состояние.

время, часы

Рис. 2. Увеличение эффективности перехода клеток М. smegmatis в НК состояние в присутствии БСА. Клетки, инокулированные на модифицированную среду Hartman's-deBont с добавлением 0,5% БСА, выращивались предварительно на среде Nutrient Broth с 0,05% твин-80 в течение различного времени (20, 32, 35, 48ч). 1 -20 ч, 2-32 ч,3-35 ч,4-48 ч.

Формирование покоящихся клеток культурой М. tuberculosis при инкубировании в стационарной фазе в аэробных условиях. Так как была показана возможность перехода в НК состояние для клеток М. smegmatis -быстрорастущего непатогенного родственника возбудителя туберкулеза М. tuberculosis в аэробных условиях, была поставлена задача разработать модель перехода в НК состояние в аэробных условиях и для клеток М. tuberculosis.

Как и ожидалось, при выращивании М. tuberculosis на среде Sauton с добавлением глюкозы, БСА и хлорида натрия - т.е. в условиях, оптимальных для роста микобактерий, не наблюдалось снижения способности клеток образовывать колонии на твердой среде даже при длительной (более 3-х месяцев) инкубации в стационарной фазе. При росте М. tuberculosis на модифицированной среде Hartman's-de Bont в присутствии 0.5% БСА — т.е. на среде, приводящей к резкому падению культивируемое™ М. smegmatis, заметного падения численности КОЕ также не происходило (Рис. 3).

После проверки нескольких вариантов сред и комбинации различных факторов было выяснено, что культивирование М. tuberculosis на модифицированной (не содержащей калия) среде Sauton с добавлением глюкозы, БСА и хлорида натрия позволило наблюдать снижение способности образовывать колонии на твердой среде при росте в стационарной фазе. Через 60 дней культивирования число КОЕ в мл среды снижалось до 105 (Рис. 3). Такие НК клетки могли быть реактивированы при культивировании на свежей среде роста. Однако при продолжении инкубации клеток в стационарной фазе наблюдался самопроизвольный возврат способности

образовывать колонии на твердых средах, т.е. имело место так называемое «узкое окно некультивируемости» клеток протяженностью несколько суток.

Таким образом, была продемонстрирована возможность формирования НК фенотипа клетками М. tuberculosis в аэробных условиях.

Рис. 3. Образование НК клеток М. tuberculosis в аэробных условиях при длительном культивировании их в стационарной фазе возможно на модифицированной среде Sauton. 1 - среда Sauton нормального состава с добавлением БСА, глюкозы и NaCl, 2 - модифицированная среда Hartman's-deBont с добавлением БСА, 3 - модифицированная среда Sauton, не содержащая калия, с добавлением БСА, глюкозы и NaCl.

ХАРАКТЕРИСТИКА НК ФОРМ М. зтеетай*-. АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕ КЛЕТОК В СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ».

Дыхательная и ДФИ-редуктазная активность клеток. При измерении дыхательной активности клеток М. smegmatis было обнаружено, что уровень эндогенного дыхания НК клеток крайне низок и не превышает 1,5% от уровня дыхания метаболически активных клеток (Рис. 4). В присутствии глюкозы и малата происходила некоторая стимуляция дыхательной активности, хотя в случае НК клеток уровень стимулированного дыхания все равно оставался очень низким.

При измерении удельной величины эндогенных ДФИ-редуктаз клеток в расчете на 1 мг сухого веса биомассы в процессе образования НК форм наблюдалось падение активности одновременно со снижением культивируемости клеток. К моменту полной потери клетками способности культивироваться на твердых средах (72 ч) ДФИ-редуктазная активность снижалась до нуля (Рис. 5). Для

метаболически активных клеток в стационарной фазе при измерении удельной величины метаболически активных клеток наблюдалось постепенное увеличение активности при росте в стационарной фазе.

Подобное снижение ДФИ-редуктазной и дыхательной активности для НК клеток означает, что функционирование дыхательной цепи заторможено, что может быть вызвано, например, ингибированием ферментов дыхательной цепи. В связи с этим было проведено измерение активностей ряда мембранных ферментов М. smegmatis на препаратах изолированных мембран.

Рис. 4. Уровень дыхательной активности клеток М. smegmatis. а -метаболически активные клетки, б - НК клетки.

время, ч

Рис. 5. ДФИ-редуктазная активность клеток М. smegmatis. 1 - метаболически активная культура, 2 - культура, образующая НК клетки.

Измерение активностей мембранных ферментов М. яте^аШ. Можно заметить, что активность НАДН-дегидрогеназы клеточных мембран при переходе в НК состояние практически не отличалась активности метаболически активных клеток, культивирование которых в стационарной фазе происходило без образования НК форм, и даже при полной потере культивируемости активность данного фермента сохранялась (Рис. 6).

Активность малат-дегидрогеназы для клеток, культивирование которых происходит без образования НК форм, находилась приблизительно на одном и том же уровне в продолжение культивирования в стационарной фазе роста. При росте с образованием НК форм активность малат-дегидрогеназы даже возрастала при переходе в НК состояние (Рис. 7).

Также была измерена активность НАДН-оксидазы мембран для метаболически активных клеток и клеток, образующих НК формы. Можно видеть, что ферментативная активность для обеих культур в процессе культивирования изменялась незначительно (Рис. 8).

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что низкая дыхательная активность и достаточно сильное падение ДФИ-редуктазной активности у НК клеток М. хте^таИ.ч вызвано не ингибированием ферментов дыхательной цепи, а, по-видимому, нехваткой внутриклеточных субстратов, что может являться результатом торможения основных метаболических путей и падением метаболической активности.

К*

1СГ;

1С?-

к*

1С?-

53 60

70 80 50 вреьчч

10Ю1

кД

80 г 1С?1

? 1С?,

60 3 с; 1С?!

5 э а 1Е?1

40 * е

1С?1

ю';

80,

60«; 40 • 20

3540 45ЭЭ56 60 65 70 75

врем\ ч

Рис. 6. Ферментативная активность НАДН-дегидрогеназы клеточных мембран М. зтедтсШз. а — метаболически активные клетки: 1 — число КОЕ/мл, 2 -ферментативная активность; б — клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

«И

1С?

1СР'

1СГ-

1СР-

гп 10-

ы 1СС-

1С?-

10'-

1сРч

4) 50 60

50 ю10

40Т ь ■|и 1СРП

я 1С?-)

30"х

2 * 1С?!

20 ? е 10*1

Л 1С?,

10 ш 1С?,

Ю1!

0 1СР-

80 90 100

50 40

зо;

I х 5

20 V £

3540 45 50 55 60 65 70 75 фещч

Рис. 7. Ферментативная активность малат-дегидрогеназ ы клеточных мембран М. зте^тайх. а - метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 -ферментативная активность; б - клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

5Э 60 ТО 80 90 100 35 4045 50 55 60 65 70 75

врем^ч Ч:»™.4

Рис. 8. Ферментативная активность НАДН-оксидазы клеточных мембран М. хтедтаШ. а - метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б - клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 -ферментативная активность.

Измерение активности внутриклеточных ферментов. Для проверки этого предположения была определена активность одного из ферментов цикла Кребса -изоцитратдегидрогеназы. Оказалось, что по мере снижения культивируемости наблюдается также падение ферментативной активности. Так, для НК клеток активность изоцитратдегидрогеназы составляет не более 30% от активности в точке, соответствующей началу стационарной фазы. Для метаболически активных

клеток в стационарной фазе также отмечалось некоторое снижение изоцитратдегидрогеназной активности (Рис. 9).

Активность изоцитратлиазы - фермента глиоксилатного шунта, метаболического пути, альтернативного циклу Кребса, при переходе в стационарную фазу снижалась резко как для метаболически активных клеток, так и для клеток, рост которых происходит с образованием НК форм (Рис. 10).

врада,ч вртцч

Рис. 9. Активность изоцитратдегидрогеназы в клетках М. smegmatis. а — метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б - клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 -ферментативная активность.

врем*ч время, ч

Рис. 10. Активность изоцитратлиазы в клетках М. а -

метаболически активные клетки: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность; б - клетки, переходящие в НК состояние: 1 - число КОЕ/мл, 2 - ферментативная активность.

Таким образом, можно говорить о существенном снижении метаболической активности в случае НК форм М. вте^а^, что является следствием падения активности, по крайней мере, нескольких внутриклеточных ферментов. Достаточно высокая ферментативная активность мембранных белков сохраняется в некультивируемом состоянии, по-видимому, из-за того, что они иммобилизованы в мембранах.

Транскриптомный анализ. С целью выяснить, существуют ли в клетках М какие либо белки (или ферменты), активность которых при переходе в состояние «некультивируемости» возрастала бы вследствие увеличения уровня экспрессии их генов, был проведен глобальный транскриптомный анализ культуры М. вте^аШ при переходе в НК состояние. Если такие белки удастся выявить, то тогда переход клеток в НК состояние логично было бы рассматривать как активный, генетически регулируемый процесс, отражающий определенную стратегию выживания в неблагоприятных условиях.

Интересно, что уровень экспрессии ряда генов бактерии М ате^таИх в НК состоянии оказался повышенным. Так, было выявлено 168 генов, уровень транскрипции которых в состоянии «некультивируемости» (72 ч) превышал уровень транскрипции в клетках, находящихся в начале перехода в НК состояние (56 ч) в 1 и более раза. В целом, в НК состоянии количество положительно регулируемых генов составляет около 2.5% от всего генома М. хте^аШ, насчитывающего 6892 генов (Рис. 11). Падение экспрессии в 2 и более раза в состоянии «некультивируемости» по сравнению с начальной фазой этого процесса — точкой 56 ч отмечалось для 167 генов. Остальные гены не изменяли существенно свой уровень экспрессии или же не давали согласованного результата в двух повторностях.

Гены, уровень транскрипции которых повышен

Рис. 11. По результатам транскриптомного анализа, 2.5% генов М. $те§та1Ь характеризуются повышенным (>2) уровнем экспрессии в НК состоянии.

При рассмотрении генов, характеризующихся повышенным уровнем транскрипции в состоянии «некультивируемости» (72 часа роста) по сравнению с фазой начала перехода в НК состояние, с более жестким критерием - 5, было выявлено 57 таких генов. Поскольку геном М. smegmatis изучен не в достаточной степени, и продукты значительного числа генов не известны, анализировалась степень гомологии интересующих нас генов с генами М. tuberculosis (программа BLAST), по результатам делалось предсказание относительно продукта конкретного гена и его функции. В результате эти 57 генов были распределены в 10 групп в соответствии с функциями белков, кодируемых ими (Таблица 1).

Таблица 1. Распределение белков М. зтедта^, гены которых обнаружили значительно повышенный уровень транскрипции (>5) в НК состоянии в зависимости от функций, выполняемых в клетке.

Rvll58, Rvl821, Rvl859, Rv2377c, Rv3879, Rv3899c Транспортные белки

Rv0845, Rvl009, Rvl267, Rvl884c, Rv3133c, Rv3327 Регуляторные белки

Rv0527, Rv2344c, Rv3777 Энергетический метаболизм

Rv0129c, Rv0341, Rv2934 Белки клеточной стенки

Rv0310, Rv0695,Rvl399c, Rv3813c Гидролазы

Rv0165c, Rvl641, Rv3060c, Rv3246c, Rv3291c, Rv3833 Регуляция транскрипции и трансляции

Rv0435c, Rv2154c Деление клеток

Rv0382c, Rvl381, Rv2139 Биосинтез пиримидинов

Rv0282, Rv0940c, Rvl279, Rvl895, Rv2002, Rv2266, Rv2996c, Rv3774 Различные «неэнергетические» оксидоредуктазы

Rv0048c, Rv0310c, Rv0574c, Rv0735, Rvl491c, Rvl509, Rv2340, Rv2704, Rv3230, Rv3516, Rv3529c, Rv3786c, Rv3810, Rv3879c, Rv3910, Rv3922c Гипотетические белки

В частности, было выявлено, что для клеток, находящихся в состоянии некультивируемости (72 часа роста), повышался уровень экспрессии по сравнению с точкой начала перехода в НК состояние (56 часов) для гена 1^1009, продуктом которого является Яр£ В - в 5,5 раз и для ЯрГ С - продукта 11у1884с - более чем в 11, что может отражать, на наш взгляд, подготовленность НК клеток к процессу реактивации.

Таким образом, по результатам транскриптомного анализа можно сделать заключение о том, что переход клеток М. smegmatis в НК состояние не является недетерминированным процессом деградации клеток, поскольку его сопровождает активация ряда генов, принимающих участие в анаболических процессах, что

позволяет говорить о нем как об активном, генетически программируемом процессе. Поэтому, несмотря на существенное падение уровня метаболической активности клеток, и, в частности активности внутриклеточных ферментов и дыхательной активности в состоянии «некультивируемости», повышение уровня транскрипции ряда генов при этом отражает, как предполагается, потенциальную жизнеспособность клеток и их готовность к последующей реактивации.

РОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА RPF В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕХОДА КЛЕТОК В НК СОСТОЯНИЕ И ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕАКТИВАЦИИ

Взаимосвязь ферментативной активности белков семейства Rpf и их реактивирующей способности в отношении НК клеток. Полученные НК формы М. smegmatis могут быть переведены в активное, культивируемое состояние. Возможность реактивации НК форм является одним из ключевых моментов в изучении явления «некультивируемости», поскольку в этом случае наглядно демонстрируется потенциальная жизнеспособность НК форм и обратимость состояния «некультивируемости». Ранее было показано, что в процессе реактивации (или «оживления») ряда НК форм грамположительных бактерий, в том числе микобактерий, принимают участие белки семейства Rpf (Kaprelyants et al., 1994, Мукамолова и др., 1999, Shleeva et al., 2004).

Первоначально белок Rpf (от английского Resustitation Promoting Factor -фактор, ускоряющий оживление) был обнаружен у бактерии М. luteus как белок с молекулярной массой 19 кДа, секретируемый в культуральную жидкость и стимулирующий рост клеток М. luteus на обедненных средах (Mukamolova et al., 1998). Затем было обнаружено, что он обладал реактивирующей способностью в отношении покоящихся клеток М. luteus и других актиномицетов (Мукамолова и др., 1999; Shleeva et al., 2002; Shleeva et al., 2004). Для ряда организмов были выявлены гены, которые обнаружили гомологию с определенным участком гена rpf М. luteus, получившего название консервативного домена. Таким образом, можно говорить о существовании целого семейства белков Rpf, молекулярная масса которых находится в интервале от 10 до 30 кДа. У М. smegmatis было обнаружено четыре таких /у^-подобных генов, у М. tuberculosis пять. Их схематическое строение представлено на рисунке 12. Можно видеть, что три из 5 белков М. tuberculosis (Rpf А, В, С) обладают значительным сходством с Rpf-подобными белками М. smegmatis (тоже соответственно Rpf А, В, С).

Механизм реактивирующего действия белков Rpf до сих пор остаётся невыясненным окончательно. Однако недавно появились сообщения о возможном сходстве третичной структуры Rpf с таковой для лизоцима, сделанные по результатам исследований методом Я MP (Cohen-Gonsaud et al., 2004) и теоретических предсказаний. В частности, в предсказанной модели

консервативного домена ЯрГ имеются три альфа-спирали, пространственное расположение которых сходно с расположением альфа-спиральных участков лизоцима. Этот фрагмент молекулы Кр^ так называемый «лизоцимовый фолд», характерен и для ряда литических ферментов, участвующих в метаболизме клеточной стенки бактерий (СоЬеп-Оопзаис! ег а!., 2004).

Было обнаружено, что белок КрГ проявляет литическую активность в отношении синтетического субстрата (КАО^-Мир, специфичного для лизоцима и некоторых трансгликозилаз, а также других пептидогликангидролаз, и являющегося модельным аналогом, имитирующим фрагменты полимеров бактериальной клеточной стенки. гидролизует 13-1-4 связи в цепочке из трёх молекул глюкозамина в молекуле (ЫАОХтМир с образованием флуоресцирующего продукта - МОТ, что прямо свидетельствует о наличии у Яр Г р-1-4-гликолитической активности.

М. tuberculosis

М. smegmatis

Rpf А

0 100 200 300 400 500 600 количество аминокислотных остатков

сигнальная последовательность консервативный домен Rpf

сегменте высоким содержанием пролина/аланина

Рис. 12. Схема строения белков семейства Rpf рода Mycobacterium.

Исходя из теоретически предсказанной структуры Rpf и структуры, экспериментально полученной методом ЯМР (Cohen-Gonsaud et al., 2005), а также на основании литической активности, проявляемой в отношении пептидогликана, было сделано предположение о важности консервативного глутамата (Е54), присутствующего у всех гомологов Rpf, для катализа, поскольку он соответствует участвующему в катализе остатку глутамата у лизоцима (Е35) и литических трансгликозилаз Slt35 (Е162) и Slt70 (Е478) (Grutter et al., 1983; Thunnissen et al., 1995). Было также высказано предположение относительно важной стабилизирующей роли двух цистеиновых остатков в положении 53 и 114 в молекуле. Если это предположение верно, то

аминокислотные замены в указанных положениях должны приводить к полной потере активности. Для проверки этого предположения было изучено влияние аминокислотных замен на реактивирующую способность белка ИрГ - так называемую биологическую активность, и ферментативную активность в отношении синтетического субстрата ^АО)з-МиР.

Биологическую активность определяли на модели реактивации НК форм М. зтеяргаШ, разработанной ранее (БЫееуа й а1., 2004). Так, НК клетки могли быть реактивированы, если в них предварительно была введена плазмида, кодирующая синтез секреторной формы Яр£ М /йем. Клетки штамма дикого типа не обладали способностью реактивироваться в отсутствие внешних «оживляющих» факторов. Нашими коллегами (Университет Абериствиза, Великобритания) были получены мутантные штаммы М. srnegmatis, трансформированные плазмидами, кодирующими секреторную форму белка с различными аминокислотными заменами. В качестве контроля использовали реактивацию мутантных штамм М. яте^аИв при сокультивировании с клетками М. \uteus (как было показано ранее, этот прием позволял реактивировать дикий тип (БЫееуа ег а1., 2004)).

Было обнаружено, что изостерическая замена глутамата в положении 54 на глутамин приводила лишь к некоторому уменьшению способности НК клеток к -реактивации (Таблица 2). Замены глутамата на менее структурно сходные аминокислоты, в частности, на аланин и особенно на лизин, вызывали значительно больший эффект подавления реактивирующей способности ЯрЕ Замены Сув53 и Су$114 по отдельности приводили лишь к частичному подавлению активности, в тоже время их совместная замена привела к полной потере белком Яр£ реактивирующей функции. Для определения влияния аминокислотных замен в указанных положениях на ферментативную активность были использованы продуценты рекомбинантных белков Яр^ любезно предоставленные Мукамоловой Г.В. Как видно из рисунка 13, изостерическая замена консервативного глутамата в положении 54 на глутамин не привела к полной потере активности, в то время как замена на аланин и особенно лизин существенно подавляла энзиматическую активность. Максимальное ингибирование ферментативной активности • проявилось у мутантной формы с заменой двух цистеиновых остатков.

Таким образом, гипотеза о пептидогликангидролазной (мурамидазной) активности Яр Г и важности консервативного остатка глутамата для катализа нашла подтверждение в наших экспериментах, хотя данные сайт-направленного мутагенеза и выявили некоторые различия в механизмах катализа белка ЯрГ по сравнению с мурамидазами и литическими трансгликозилазами. Относительно остатков цистеина мы можем предположить, что они вовлечены либо в катализ, либо в поддержание структуры молекулы КрГ. Например, они могут участвовать в поддержании третичной структуры необходимой для каталитической

активности, за счёт дисульфидных связей (СоЬеп-Ооп5аис1 е1 а1., 2005).

Таблица 2. Реактивация «некультивируемых» клеток М. зп^тМЬ, трансформированных плазмидой рАС, несущей ген гр/М. /игеи.ч (штамм АС К) и гены гр/ с мутациями (мутантные штаммы АСХ)

Мутация НВЧ, кл/мл Индекс* оживления

АвХ АО!1 ДОХ + М. 1и/еш-

Пустой вектор <102 1.8-107 ± 1,2-107 3,9105± 1,9-10* <5,5-Ю"6

Е54<3 4,3-104 ± 1,7-104 2,3 ■ 10й + 1,1-Ю6 4,7-106±2,1-106 1,9-10"2

Е54А 1,1-104± 0,9-104 1,8-107 ± 1,2-107 3,0-105 ±2,0-105 6,0-10"4

Е54К. <102 1,8-107± 1,2-107 4,4-106 ± 3,0-10й <5,5-Ю'6

С53К 2,9-104+2, МО4 2,3-106± 1,1-Ю6 3,0-106± 0,410е 1,3-10"2

С114Т 4,0104± 3,5-104 2,3-106± 1,1-Ю6 2,8-106± 1,6-106 1,7-10"2

С53К+ С114Т < 102 1,8-107± 1,2-Ю7 1,6-105 ± 0,9-Ю5 <5,5-10"6

Реактивация «некультивируемых» клеток, секретирующих различные мутированные формы 11рГ (АОХ), была определена метолом конечных разведений (см. «Методы исследования»). Реактивация каждого штамма при сокультивировании с А/, ¡шейх (АОХ + М. 1шеиз) была использована в качестве положительного контроля.

♦Индекс оживления рассчитывался как отношение НВЧ для ЛОХ и ЛОН (дикий тип Яр!) в одном и том же эксперименте.

Рис. 13. Пептидогликангидролазная активность рекомбинантного белка ИрГ и его мутантных форм. 1 - ЯрГ - дикий тип; мутантные формы Яр!": 2 - Е54<3, 3 - Е54А, 4 - Е54К, 5 - С53К+С114Т, 6 - контроль-буфер. Приведены значения интенсивности флюоресценции (ЫАО)з-МиГ при длине волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 им после 3-х часового гидролиза при 37°С в присутствии рекомбинантных белков КрГ.

Кроме того, ярко прослеживающаяся корреляция между биологической и .. ферментативной активностями белка Rpf позволяет говорить о том, что литическая активность в отношении пептидогликана - основного компонента бактериальной клеточной стенки, по-видимому, позволяет ему модифицировать утолщенную клеточную стенку НК клеток, разрыхляя ее и обеспечивая тем самым поступление питательных веществ внутрь клеток и инициируя процесс пробуждения. Несмотря на то, что наиболее вероятная «укладка» молекулы белка Rpf принадлежит к так называемому лизоцимоподобному типу (Cohen-Gonsaud et al., 2004), основная его функция заключается, по-видимому, не в разрушении пептидогликана, а, сходно с литическими трансгликозилазами, в локальном гидролизе для наращивания и встраивания новых молекул, составляющих пептидогликан (Cohen-Gonsaud et al., 2005).

Поскольку белок Rpf, несомненно, играет ведущую роль в процессе реактивации НК клеток, было высказано предположение относительно участия белков семейства Rpf и в процессе перехода клеток в НК состояние. Детекция уровня продукции белков Rpf бактериями М. smegmatis и М. tubercolosis проводилась иммунологическими методами. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) позволил определить, что суммарное содержание белков Rpf М. tuberculosis в активной культуре, находящейся в стационарной фазе, не превышает 100 пг в расчете на 1 мг сухого веса клеток, а содержание их в супернатанте, взятом из культуры, лежит за пределами чувствительности метода. Для активно растущей культуры М smegmatis суммарное содержание белков Rpf в супернатанте тоже очень низко и достигает максимума накопления в логарифмическое фазе роста - около 50 пг/мл, а в стационарной фазе также лежит за пределами детекции метода. Полученные результаты достаточно резко контрастируют с данными, касающимися бактерии М. luteus, уровень продукции белка Rpf для которой в супернатанте культуры, находящейся в поздней логарифмической стадии роста, достигал 1 мкг/мл. В связи с малыми количествами белков Rpf в клетках микобактерий, что, очевидно, указывает на их регуляторную роль, в дальнейших исследованиях применялся подход оценки уровня продукции белков семейства Rpf на уровне транскрипции.

Методом обратной полимеразной цепной реакции проводилась оценка уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства Rpf в процессе перехода М. smegmatis в НК состояние в динамике. Параллельно исследовалась активно растущая культура М. smegmatis (Рис. 14). Для проведения обратной v. полимеразной цепной реакции использовали специфические праймеры для генов rpf А, В, С, F.

Транскрипты всех четырех генов присутствуют в метаболически активной культуре (справа на электрофореграмме), причем для rpf В характерно снижение

уровня транскрипции в стационарной фазе в случае активной культуры. Для культуры, рост которой происходит с образованием некультивируемых форм (на электрофореграмме слева), гр/ В отсутствует даже на ранних стадиях, для остальных белков Яр£ транскрипты в НК клетках обнаруживаются, но наблюдается снижение их количества по мере уменьшения числа КОЕ. Таким образом, наблюдается снижение уровня экспрессии всех четырех ИрГ-подобных генов при переходе клеток М. smegmatis в НК состояние. Однако для гр/А и гр/С при полном падении способности культивироваться - точки 72 часа, или три для -содержалось некоторое количество транскриптов в клетках. Однако по результатам транскриптомного анализа было выявлено, что для клеток, находящихся в НК состоянии повышался уровень экспрессии для 11рГВ - в 5,5 раз и для Яр£ С - более чем в 11 раз. Данный результат, по-видимому, свидетельствует о том, что уровень транскрипции для состояния «некультивируемости» и фазы начала перехода в НК состояние в случае гена гр/А остается на прежнем уровне, а для гена гр/В в НК состоянии наблюдается некоторая активация, не выявляемая методом ОТ-ПЦР. По всей вероятности, продукты генов гр/В, С, и вероятно, гр/А, принимают важное участие в процессе оживления НК клеток М. smegmatis.

гр/А гр/В

12345М6789 10 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10

Рис. 14. ОТ-ПЦР анализ уровня экспрессии генов, кодирующих белки семейства ИрГМ. \megmatis при росте с образованием НК клеток: дорожки 1 - 24 ч, 2 - 48 ч, 3 - 72 ч, 4 - 96 ч, 5 - 120 ч, и в активнорастущей культуре, дорожки 6 - 24 ч, 7 - 48 ч, 8 - 72 ч, 9 - 96 ч, 10 - 120 ч. М - маркеры длины фрагментов ДНК (п.н.).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на многочисленные попытки воспроизвести латентное состояние туберкулезной инфекции in vitro, существует ограниченное число моделей, достаточно адекватно имитирующих явление персистенции в живых организмах. Необходимыми критериями для признания таких моделей адекватными являются: обратимость покоящегося состояния клеток, формирование НК фенотипа в состоянии покоя, сниженный уровень метаболизма. Кроме того, достаточно важным аспектом представляется возможность получения покоящихся клеток М. tuberculosis без ограничения в концентрации кислорода, что более физиологично для микобактерий, являющихся аэробами, а также целесообразно по причине отсутствия убедительных доказательств того, что при попадании в организм хозяина микобактерии туберкулеза испытывают недостаток кислорода.

Разработанная и оптимизированная в ходе данной работы модель получения НК клеток М. smegmatis — быстрорастущего непатогенного родственника М. tuberculosis - при росте в стационарной фазе является достаточно удобной для исследований и хорошо воспроизводимой. Она удовлетворяет всем перечисленным выше критериям и, как предполагается, может рассматриваться как модель персистирующей туберкулезной инфекции in vivo.

Модель получения НК клеток непосредственно с участием возбудителя туберкулеза - бактерии М. tuberculosis, разработанная в ходе настоящего исследования, представляет особый интерес и может считаться уникальной, поскольку в мировой литературе до сих пор не упоминалось о возможности получения НК клеток М. tuberculosis в аэробных условиях в стационарной фазе.

По результатам транскриптомного анализа клеток М. smegmatis в НК состоянии можно сделать вывод, что процесс перехода в состояние «некультивируемости» является не недетерминированным процессом деградации клеток, а особой стратегией существования, сопровождаемой активацией ряда генов, что позволяет рассматривать его как активный, программируемый процесс. Подобный результат согласуется с накопленными на сегодняшний момент данными о механизмах туберкулезной латентности.

На сегодняшний момент можно считать установленной ведущую роль белков Rpf в реактивации НК клеток. Очевидно, реактивирующая роль Rpf, как показано в данном исследовании, обусловлена литической способностью в отношении пептидогликана, приводящей к модификации и разрыхлению утолщенной клеточной стенки НК бактерий и обеспечивающей поступление питательных веществ внутрь клеток с последующей инициацией процесса пробуждения.

выводы

1.Найдены условия для получения «некультивируемых» клеток М. smegmatis и М. tuberculosis при росте в длительной стационарной фазе в аэробных условиях.

2.«Некультивируемые» формы М. smegmatis характеризуются сниженным уровнем дыхательной активности и активности ряда ферментов, что является результатом торможения метаболических процессов и уменьшения концентрации внутриклеточных субстратов.

3.Переход клеток М. smegmatis в «некультивируемое» состояние сопровождается повышенным уровнем экспрессии ряда генов, продукты которых принимают участие в анаболических процессах, что позволяет рассматривать его как активный, генетически программируемый процесс.

4.Реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении .. «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их литической активностью в отношении компонентов бактериальной клеточной стенки, а именно, их способностью гидролизовать p-l-4-гликозидные связи пептидогликана.

5.Уровень продукции белков Rpf у микобактерий очень низок (менее 10 пг/мл супернатанта в стационарной фазе), что подтверждает предположение об их регуляторной роли.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1.Салина Б.Г.. Шлеева М.О., Капрельянц А.С. (2005) Образование покоящихся («некультивируемых») форм Mycobacterium smegmatis и их характеристика. Сборник статей «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, изд-во «Научная книга» с. 156-162.

2.Mukamolova, G.V., Murzin, A.G., Saliria. E.G.. Demina, G.R., Kell, D.B., Kaprelyants, A.S. and Young, M. (2006). Muralytic activity of Micrococcus luteus Rpf and its relationship to physiological activity in promoting bacterial growth and resuscitation. Molecular Microbiology. 59(1), p.84-98.

3.Телков M.B., Демина Г.Р., Волошин C.A., Салина Е.Г.. Дудик Т.В., Стеханова Т.Н., Мукамолова Г.В., Казарьян К.А., Гончаренко А.В., Янг М., Капрельянц А.С. (2006) Белки семейства Rpf (Resuscitation promoting factor) являются пептидогликангидролазами. Биохимия. Т.71 №4. С.514-524.

4.Салина Е.Г.. Вострокнутова Г.Н., Шлеева М.О., Капрельянц А.С. (2006) Роль межклеточных взаимодействий при образовании и реактвации «некультивируемых» микобактерий. Микробиология. Т.75, №4, С.502-508.

1,Шлеева М.О., Салина Е.Г.. Капрельянц A.C. (2004). Рост Mycobacterium smegmatis в неоптимальных условиях приводит к образованию «некультивируемых» (покоящихся) клеток. 8-я школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 мая, с.166

2.Салина Е.Г.. Шлеева М.О., Капрельянц A.C. (2004). Образование покоящихся («некультивируемых») форм Mycobacterium smegmatis и их характеристика. 2-я региональная конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, 26-28 октября,

3.Salma E.G.. Shleeva M.O., Vostroknutova G.N., Kaprelyants A.S. (2005). "Non-culturability" of Mycobacterium smegmatis in stationary phase. 15th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Copenhagen, Denmark, 2-5 April, p. 645

4.Salina E.G.. Demina G.R., Mukamolova G.V., Young M., Kaprelyants A.S. (2006). Peptidoglycan hydrolase activity of proteins of the Rpf family and its relationship to resuscitation of "non-culturable" cells. 2nd FEMS Congress of European Microbiologists, Spain, Madrid, July 4-8, p. 173.

Тезисы конференций

C.51

Принято к исполнению 27/10/2006 Исполнено 30/10/2006

Заказ № 826 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Салина, Елена Геннадьевна

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

11 СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ» - СТРАТЕГИЯ ВЫЖИВАНИЯ

БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК В НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ (СТРЕССОВЫХ) УСЛОВИЯХ?

1 1 1 Явление "некультивируемости" в бактериальных популяциях

1 1 2 Критерии состояния "некультивируемости"

1 1 3 Образование "некультивируемых" форм бактерий в различных условиях

1 2 РЕАКТИВАЦИЯ («ОЖИВЛЕНИЕ») НК ФОРМ БАКТЕРИЙ 21 1 3 «СОЦИАЛЬНОЕ» ПОВЕДЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ И

СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ»

1 4 ЛАТЕНТНОСТЬ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ 29 1 4 1 Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных 30 1 4 2 Модели получения покоящихся («некультивируемых») форм

Mycobacterium tuberculosis in vitro 33 1 5 БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В КЛЕТКАХ МИКОБАКТЕРИЙ

ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ЛАТЕНТНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА

1 б ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ МИКОБАКТЕРИАЛЬНОЙ ПЕРСИСТЕНЦИИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

21 Выращивание бактериальных культур

2 2 Подсчет общего числа клеток . . 49 2 3 Микроскопические исследования . . 49 2 4 Оценка культивируемости клеток 50 2 5 Реактивация «некультивируемых» клеток 50 2 б Приготовление клеточных экстрактов 51 2 7 Выделение мембран . 51 2 8 Определение концентрации белка . 51 2 9 Определение активностей внутриклеточных ферментов 52 2 10 Определение оксидазных и дегидрогеназных активностей . .52 211 Определение плавучей плотности клеток . 53 2 12 Выделение и очистка рнк . .53 2 13 Обратная пцр 54 2 14 Транскриптомный анализ . . . 55 2 15 Получение рекомбинантных белков Rpf . 55 2 16 Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций

2 17 Электрофорез белков Rpf в пааг

218 Иммуноблоттинг белков Rpf.

219Твердофазныйиммуноферментныйанализ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3 1 ПОЛУЧЕНИЕ НК ФОРМ БАКТЕРИЙ Р MYCOBACTERIUM 59 3 2 ХАРАКТЕРИСТИКА НК ФОРМ М SMEGMATIS АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ

И ИССЛЕДОВАНИЕ УРОВНЯ ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ ПРИ ПЕРЕХОДЕ КЛЕТОК В СОСТОЯНИЕ «НЕКУЛЬТИВИРУЕМОСТИ».

3 3 РОЛЬ БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА RPF В ПРОЦЕССАХ ПЕРЕХОДА КЛЕТОК МИКОБАКТЕРИЙ В НК СОСТОЯНИЕ И ПОСЛЕДУЮЩЕЙ РЕАКТИВАЦИИ

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему ""Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика"

Известно, что при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды бактериальные клетки способны переходить в покоящееся состояние, сопровождающееся значительным снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Традиционно покоящееся состояние бактерий связывают с образованием специализированных структур (спор, цист и т.д.) Однако в последние годы была экспериментально установлена возможность перехода в покоящееся состояние и для неспорулирующих бактерий, происходящего без образования специализированных структур.

Особенный интерес представляет образование покоящихся форм неспорулирующими клетками микобактерий, и в частности, возбудителем туберкулеза бактерией Mycobacterium tuberculosis, в связи с предположением о том, что латентная форма туберкулезной инфекции связана с переходом бактерий в организме хозяина в покоящееся состояние. По данным ВОЗ, каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - М. tuberculosis, но до сих пор единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется, не существует. Известно, что микобактерии туберкулеза, находясь в человеческом организме в латентном состоянии, в течение длительного времени сохраняют свою жизнеспособность, и как следствие, опасность развития заболевания, но детектировать их крайне сложно, поскольку они, очевидно, обладают свойством «некультивируемости», то есть неспособностью расти на стандартных лабораторных средах.

Предпринимались многочисленные попытки моделирования латентного состояния туберкулеза in vitro. Достаточно популярной моделью перехода клеток в покоящееся состояние считается так называемая модель Вейна, заключающаяся в длительной инкубации клеток М. tuberculosis в условиях постепенного снижающейся концентрации кислорода (Wayne, 1994), однако в случае такого экспериментального подхода у покоящихся клеток не наблюдается формирования «некультивируемого» (НК) фенотипа. Поэтому степень адекватности такой модели для имитации латентной туберкулезной инфекции остается под вопросом, поскольку латентное состояние клеток М. tuberculosis in vivo в первую очередь характеризуется потерей культивируемое™. Кроме того, данное покоящееся состояние, возможно, является лишь отражением адаптации клеток микобактерий, являющихся аэробами, к недостатку кислорода. Недавно в нашей лаборатории была разработана модель получения покоящихся форм клеток М. tuberculosis, обладающих свойством «некультивируемости» (Shleeva et al., 2002), но этот процесс, также как и в модели Вейна, происходил в анаэробных условиях. Сложно сказать, насколько анаэробные условия отвечают реальным условиям, в которых туберкулезные бактерии находятся в тканях организма-хозяина после инфицирования. В частности, совсем недавно в литературе появилось экспериментальное свидетельство того, что при формировании гранулемы в легких инфицированных мышей бактерии М. tuberculosis не испытывают недостатка кислорода (Tsai et al., 2006). Поэтому разработка модели перехода бактерий М. tuberculosis в НК состояние именно в аэробных условиях, на наш взгляд, представляет большую важность.

Ранее сотрудниками нашей лаборатории была показана возможность перехода бактерии М. smegmatis, быстрорастущего непатогенного родственника М. tuberculosis, в покоящееся состояние при культивировании в длительной стационарной фазе в аэробных условиях (Shleeva et al., 2004). При этом такие покоящиеся клетки теряли способность расти на твердых питательных средах, то есть являлись «некультивируемыми», но могли быть ревертированы в активное состояние при участии белков Rpf (Shleeva et al., 2004). Мы предполагаем, что такие НК клетки М. smegmatis могут рассматриваться как модель латентной туберкулезной инфекции in vivo.

Однако, по существу, к моменту начала настоящего исследования было известно только о существовании самого феномена «некультивируемости» М. smegmatis, но детальная характеристика клеток в НК состоянии не была проведена, также оставалось неясным, какие факторы оказывают влияние на переход М. smegmatis в НК состояние, а также является ли этот процесс генетически программированным, активным, или же он связан с деградацией клеток и их последующей гибелью. Кроме того, необходимо выяснить, какие механизмы лежат в основе процесса реактивации покоящихся клеток микобактерий.

Возможность получения НК клеток М. smegmatis без ограничения концентрации кислорода вселяла надежду на то, что могут быть найдены такие условия культивирования, в которых будет возможно формирование НК фенотипа в аэробных условиях и для клеток М. tuberculosis.

В связи с чем были сформулированы следующие цели и задачи исследования.

Цель данной работы заключалась в биохимической характеристике НК форм микобактерий, а также изучении механизмов перехода бактерий в НК состояние и выявлении факторов, обеспечивающих их последующую реактивацию. В соответствии с целью работы были поставлены задачи:

1.Оптимизация метода получения in vitro «некультивируемых» форм бактерии Mycobacterium smegmatis - быстрорастущего непатогенного родственника Mycobacterium tuberculosis.

2 Разработка метода получения in vitro покоящихся («некультивируемых») форм бактерии М. tuberculosis в аэробных условиях.

3.Биохимическая характеристика клеток М. smegmatis в «некультивируемом» состоянии

4.Исследование изменения уровня экспрессии генов (транскриптомный анализ) при переходе М. smegmatis в «некультивируемое» состояние. б.Изучение механизмов функционирования белков семейства Rpf в процессе реактивации «некультивируемых» форм микобактерий.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Салина, Елена Геннадьевна

ВЫВОДЫ

4.Реактивирующее действие белков семейства Rpf в отношении «некультивируемых» клеток микобактерий связано с их литической активностью в отношении компонентов бактериальной клеточной стенки, а именно, их способностью гидролизовать (5-1-4-гликозидные связи пептидогликана.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Салина, Елена Геннадьевна, Москва

1. Беккер М.Е., Дамберг Б.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига «Зинатне», 1981

2. Волошин С.А. Капрельянц А.С. Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях. Биохимия. 2004. Т. 69, №11, С.1555-1564.

3. Воробьева Л.И., Никитенко Г.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Реактивация инактивированных ультрафиолетовым светом клеток Esherichia coli клеточными экстрактами пропионово-кислых бактерий. Микробиология, 1993, т.62, с.1135-1143

4. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. Микробиология, 2000, Т.69, №3, с. 383-388.

5. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д Ю., Митюшина Л.Л., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum. Микробиология, 2003, Т.72, №3, с. 328-337.

6. Мукамолова Г.В., Кормер С.С., Янопольская Н.Д., Капрельянц А.С. Исследование покоящихся клеток в культуре Micrococcus luteus , пребывающей в длительной стационарной фазе. Микробиология, 1995, Т.63, №3, с.341-346.

7. Мукамолова Г.В., Янг М, Келл Д.Б., Капрельянц А.С. Бактериальные феромоны и клеточное деление. Успехи биологической химиии. 1999. Т. 39. С. 225 254.

8. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Воробьева Е.А., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus. Микробиология, 1996, Т.65, №6, с. 782-789

9. Олескин А.В., Ботвинко И.В., Цавкелова ЕА. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов. Микробиология. 2000. Т. 69. С. 309-327.

10. Ю.Сузина Н.Е., Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Шорохова А.П., Дмитриев В.В., Баринова Е.С., Мохова О.Н., Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И. Тонкое строение покоящихся клеток некоторых неспорообразующих бактерий. Микробиология, 2004, Т. 73, №4, с.516-529.

11. Allen-Austin, D., Austin В., Colwell, R. (1984). Survival of Aeromonas salmonicida in river water. FEMS Microbiol.Lett. 21,143-146.

12. Amann, R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. (1995). Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews. 59, 143-169.

13. Arana I., Muela A., Iriberri J., Egea L., Barcina I. (1992). Role of hydrogen peroxide in loss of culturability mediated by visible light in Escherichia coli in a freshwater ecosystem. Appl. Environ. Microbiol. 58(12): 3903-3907.

14. Atrih A., Foster S.J. (1999). The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie Van Leeuwenhoek. 75,299-307.

15. Barer M.R. and Harwood C.R. (1999) Bacterial viability and culturability. Advances in Microbial Physiology. 41, 93-137.

16. Barer M.R., Gribbon L.T., Harwood C.R., Nwoduh C.E. (1993). The viable but not culturable hypothesis and medical bacteriology. Rev. Med. Microbiol. 4,183-191.

17. Bateman A. and Bycroft M. The structure of a LysM domain from E. coll membrane-bound lytic murein transglycosylase D (MltD). (2000) J. Mot. Biol. 299(4):1113-1119.

18. Betts J. C., Lukey P. Т., Robb L. C., McAdam R. A., and Duncan K. (2002). Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. Mol. Microbiol. 43, 717-731.

19. Binnerup S. J., Jensen D. F., Thordal-Christensen H., Sorensen J. (1993). Detection of viable, but not-culturable Pseudomonas fluorescens DF57 in soil using a microcolony epifluorescence technique. FEMS Microbiol. Ecol. 12: 97-105.

20. Bloch H, Segal W. Biochemical differentiation of Mycobacterium tuberculosis grown in vivo and in vitro. (1956).JBacteriol. 72(2):132-141.

21. Bloomfield S.F., Stewart G.S., Dodd C.E., Booth I.R., Power E.G. (1998). The viable but non-culturable phenomenon explained? Microbiology 144:1-3.

22. Bogosian G., Sammons L.E., Morris P.J., O'Neil J.P., Heitkamp M.A., Weber D.B. (1996). Death of the Escherichia coli K-12 strain W3110 in soil and water. Appl. Environ. Microbiol. 62(11): 4114-4120.

23. Boon C., Dick T. (2002). Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy. J Bactenol. 184(24).6760-6767

24. Bovill R.A. and Mackey B.M. (1997). Resuscitation of 'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology. 143,1575-1581.

25. Bradford M. A rapid sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. (1976). Anal.Biochem, 72, 248-254.

26. Calcott P.H. and Postgate J.R. (1972). On substrate-accelerated death in Klebsiella aerogenes. J. Gen. Microbiol. 70,115-122.

27. Cohen-Gonsaud M.( Barthe P., Bagneris C., Henderson В., Ward J., Roumestand C. and Keep N.H (2005). The structure of a resuscitation-promoting factor domain from Mycobacterium tuberculosis shows homology to lysozymes. Nat Struct Mol Biol. 12, 270-273.

28. Cohen-Gonsaud M., Keep N.H., Davies A.P., Ward J., Henderson B. and Labesse G. (2004). Resuscitation-promoting factors possess a lysozyme-like domain. Trends Biochem Sci. 29, 7-10.

29. Cole S.T., Brosch R., Parkhill J., Gamier Т., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E. (1998). Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393, 537-544.

30. Colwell R.R., Brayton P.,Herrington D., Tall В., Huq A., Levine M.M. (1996). Viable but nonculturable Vibrio cholerae 01 revert to a cultivable state in the human intestine. World J. Microbiol. Biotechnol. 12: 28-31.

31. Cooper A., Callahan J., Griffin J„ Roberts A., Orme I. (1995). Old mice are able to control low-dose aerogenic infections with Mycobacterium tuberculosis, infect.lmmun. 63, 3259-65.

32. Corper, H. J. Cohn, M. L. (1933). The viability and virulence of old cultures of tubercule bacille. Studies on twelve-year broth cultures maintained at incubator temperature. Am. Rev. Tuberc. 28, 856-874.

33. Cunningham A.F., Spreadbury C.L. (1998). Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallinhomolog. J Bacteriol. 180(4), 801-808.

34. Decross A.J. and Marshall B.J. (1993). The role of Helicobacter pylori in acid-peptic disease. Am. J. Med. Sci. 306: 381-392.

35. Dick Т., Lee B.H. Murugasu-Oei B. (1998). Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol Lett 163,159-164.

36. Domingue G.J., and Woody H.B. (1997) Bacterial persistence and expression of disease. Clin. Microbiol. Rev. 10, 320-344.

37. Edwards C. (2000). Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol. Biotechnol. 15, 211-223.

38. Engel H., Kazemier B. and Keck W. (1991). Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli. sequence analysis and controlled overexpression of the sit gene, which encodes the soluble lytic transglycosylase. J Bacteriol. 173, 6773 6782.

39. Ericsson M., Hanstorp D., Hagberg P., Enger J., Nystrom T. (2000). Sorting out bacterial viability with optical tweezers. J Bacteriol. 182: 5551-5555.

40. Evdokimova N.V., Dorofeev A.G., Panikov N.S. (1994). Dynamics of survival and transition to dormant state of nitrogen-starving bacteria Pseudomonas fluorescens. Microbiology (Rus.) 63(2): 195-204.

41. Flynn, J.L. and Chan J. (2001). Immunology of tuberculosis. Annu Rev Immuno 19: 93129

42. Foster S.J. (1992) Analysis of the autolysins of Bacillus subtilis 168 during vegetative growth and differentiation by using renaturing polyacrylamide gel electrophoresis. J Bacteriol. 174(2):464-70.

43. Gangadharam P.R.J. (1995). Mycobacterial dormancy. Tuber. Lung Dis. 76,477-479.

44. Garton N.J., Christensen H., Minnikin D.E., Adegbola R.A., Barer, M.R. (2002) Intracellular lipophilic inclusion in mycobacteria in vitro and in sputum. Microbiology, 148, 2951-2958.

45. Graham J.E., Clark-Curtiss J.E. (1999). Identification of Mycobacterium tuberculosis RNAs synthesized in response to phagocytosis by human macrophages by selectivecapture of transcribed sequences (SCOTS). Proc Natl Acad Sci USA. 96(20):11554-11559.

46. Grey B.E. and Steck T.R. (2001). The viable but nonculturable state of Ralstonia solanacearum may be involved in long-term survival and plant infection. Appl Environ Microbiol 67(9): 3866-72.

47. Grutter M.G., Weaver L.H., Matthews B.W. (1983). Goose lysozyme structure: an evolutionary link between hen and bacteriophage lysozymes? Nature. 303 (5920): 828-31.

48. Gupta S., Pandit S.B., Srinivasan N., Chatterji D. (2002) Proteomics analysis of carbon-starved Mycobacterium smegmatis: induction of Dps-like protein. Protein. Eng. 15(6), 503-512.

49. Hengge-Aronis R. (1993) Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in E coli. Cell. 72,165-168.

50. Hernandez-Pando R., Jeyanathan M., Mengistu G., Aguilar D., Orozco H., Harboe M., Rook G.A., Bjune G. (2000). Persistence of DNA from Mycobacterium tuberculosis in superficially normal lung tissue during latent infection. Lancet 356, 2133-2138.

51. Holtje J.V. From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherichia coli. (1995). Arch Microbiol. 164(4):243-54.

52. Honer zu Bentrup K., Russell D.G. (2001). Mycobacterial persistence: adaptation to a changing environment. Trends Microbiol. 9(12):597-605.

53. Hu J.C., Kornacker M.G., Hochschild A. (2000). Escherichia coli one- and two-hybrid systems for the analysis and identification of protein-protein interactions. Methods 20, 80-94.

54. Hu Y.M., Butcher P.D., Sole K., Mitchison D.A. Coates A.R.M. (1998). Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock. FEMS Microbiology Letters 158,139-145.

55. Hutter В., and Dick T. (1998). Increased alanine dehydrogenase activity during dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol. Lett. 167, 7-11.

56. Hutter В., and Dick T. (1999). Up-regulation of narX, encoding a putative "fused nitrate reductase" in anaerobic dormant Mycobacterium bovis BCG. FEMS Microbiol. Lett. 178, 63-69.

57. Ito S., Karnovsky M. (1969). J. Cell Biol. 39(1), 168-169.

58. Kaiser D. and Losick R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Ceil 73: 873885.

59. Kalmbach S., Manz W., Szewzyk U. (1997). Isolation of new bacterial species from drinking water biofilms and proof of their in situ dominance with highly specific 16S rRNA probes. Appl Environ Microbiol, 63(11), 4164-4170.

60. Kaprelyants A.S. and Kell D.B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. J Appl Bacteriol. 72, 410-422.

61. Kaprelyants A.S. and Kell D.B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol. 59, 3187-3196.

62. Kaprelyants A.S., and Kell D.B. (1996). Do bacteria need to communicate with each other for growth? Trends Microbiol. 4, 237-242.

63. Kaprelyants A.S., Gottschal J.C., Kell D. B. (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 104, 271-286.

64. Kaprelyants A.S., Mukamolova G.V. Kell D.B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Letf115, 347-352.

65. Karakousis P.C., Yoshimatsu Т., Lamichhane G., Woolwine S.C., Nuermberger E.L., Grosset J., Bishai, W.R. (2004). Dormancy phenotype displayed by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in mice. J. Exp. Med. 200, 647657.

66. Kell D.B., Kaprelyants A.S., Weichart D.H., Harwoo C.R., Barer, M.R. (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek 73,169-187.

67. Kell D.B., Mukamolova G.V., Finan C.L., Zhao H., Goodacre R., Kaprelyants A.S., Young M. (2003). Resuscitation of "uncultured" microorganisms. In: Microbal Diversity and Bioprospecting (A.T. Bull, ed.). Am Soc Microbiol, Washington, DC.

68. Kendall S.L., Movahedzadeh F., Rison S.C.G., Wernisch L., Parish Т., Duncan K., Betts J.C., Stoker N.G. (2004). The Mycobacterium tuberculosis dosSR two-component system is induced by multiple stresses. Tuberculosis 84, 247-255.

69. Khomenko A.G., and Golyshevskaya V.I. (1984). Filterable forms of Mycobacterium tuberculosis. Z Erkrank Atm-Org, 162,147-154.

70. Kjelleberg S., Albertson N„ Flardh K., Holmquist L., Jouper-Jaan A., Marouga R., Ostling J., Svenblad В., Weichart, D. (1993). How do non-differentiating bacteria adapt to starvation? Antonie Van Leeuwenhoek 63, 333-341.

71. Kolling G.L., Matthews K.R. (2001). Examination of recovery in vitro and in vivo of nonculturable Escherichia coli0157:H7. Appl Environ Microbiol. 67(9): 3928-33.

72. Kolter R., Siegele D. A., Tormo A. (1993). The stationary phase of the bacterial life cycle. Ann Rev Microbiol 47, 855-874.

73. Laemmli (J. (1970). Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T-4. Nature, 227, 680-683.

74. Lange R. and Hengge-Aronis R. (1991). Identification of a central regulator of stationary phase gene expression in Escherichia coli. Mol Microbiol 5, 49-59.

75. Lee B.H., Murugasu-Oei В., Dick T. (1998). Upregulation of a histone-like protein in dormant Mycobacterium smegmatis. Mol. Gen. Genet. 260,475-479.

76. Lillebaek Т., Dirksen A., Baess I., Strunge В., Thomsen V.O., Andersen A.B. (2002). Molecular evidence of endogenous reactivation of Mycobacterium tuberculosis after 33 years of latent infection. J. Infect. Dis 185(3) 401-404.

77. Lim A., Eleuterio M., Hutter В., Murugasu-Oei В., Dick, T. (1999). Oxygen depletion-induced dormancy in Mycobacterium bovis BCG. J Bacteriol 181, 2252-2256.

78. Lorenz M.C., Fink G.R. (2001). The glyoxylate cycle is required for fungal virulence. Nature. 412(6842):83-6

79. Losick, R. and D. Kaiser (1997). Why and how bacteria communicate. Sci. Am. 276(2), 68-73.

80. MacDonell M.T. and Hood M. (1982). Isolation and characterization of ultramicrobacteria from a gulf coast estuary. Appl. Environ. Microbiol. 43, 566-571.

81. Magarinos В., Romalde J.L., Barja J.L., Toranzo A.E. (1994) Evidence of a dormant but infective state of the fish pathogen Pasteurella piscicida in seawater and sediment. Appl Environ Microbiol. 60(1), 180-6.

82. ЮЗ.Магу P., Chihib N.E., Charafeddine O., Defives C., Hornez J.P. (2002). Starvation survival and viable but nonculturable states in Aeromonas hydrophila. Microb. Ecol. 43(2), 250-258.

83. McCune R.M., Feldmann F.M., Lambert H.P., McDermott W. (1966). Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J. Exp. Med. 123, 445-468.

84. McMurray D.N., Collins F.M., Dannenberg A.M., Smith D.W. (1996). Pathogenesis of experimental tuberculosis in animal models. Curr. Top.Microbiol. Immunol. 215, 157179.

85. Mehta J. and Dutt A. (1995). Tuberculosis in the eldery. Infect.Med. 12,40-46.

86. HO.Moore J.E. (2000). Comparison of basal broth media for the optimal laboratory recovery of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Ir. J. Med. Sci. 169(3), 187189.

87. I.Morgan J.A., Clarke К J., Rhodes G., Pickup R.W. (1992). Non-culturable Aeromonas salmonicida in lake water. Microb Releases 1, 71-78.

88. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young, M. (2003). Adoption of the transiently non-culturable state a bacterial survival strategy? Adv. Microb. Physiol. 47, 65-129.

89. Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S., Young D.I., Young M., Kell, D. В. (1998a). A bacterial cytokine. Proc. Natl. Acad .Sci. USA 95, 8916-8921.

90. Mukamo!ova G.V., Turapov O.A , Kazarian K., Telkov M„ Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. (2002b). The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol Microbiol. 46(3), 611-21.

91. Mukamolova G.V., Turapov O.A., Young D.I., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. (2002a) A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 46(3), 623-35.

92. Mukamolova G.V., Yanopolskaya N.D., Votyakova T.V., Popov V.I., Kaprelyants A.S., Kell D.B. (1995a). Biochemical changes accompanying the long-term starvation of Micrococcus luteus cells in spent growth medium. Arch. Microbiol. 163, 373-379.

93. Mukamolova G.V., Yanopolskaya, N.D., Kell, D.B., and Kaprelyants A.S. (1998b). On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek 73, 237-243.

94. Mukamolova GV, Kaprelyants AS, Kell DB. (1995b). Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek. 67(3):289-95

95. Munoz-Elias E.J., McKinney J.D. (2005) Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence. Nat Med. 11(6), 638-44.

96. Munoz-Elias E.J., McKinney J.D. (2006) Carbon metabolism of intracellular bacteria. Cell Microbiol. 8(1), 10-22.

97. Muttucumaru D.G., Roberts G., Hinds J., Stabler R.A., Parish, T. (2004) Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a non-replicating state. Tuberculosis (Edinb.), 84, 239-246.

98. Newman G.R., Jasani В., Williams E.D. (1983) A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. Histochem J. 15(6), 543-55.

99. Nilsson H.O., Blom J., Abu-AI-Soud W., Ljungh A.A, Andersen L.P., Wadstrom T. (2002) Effect of cold starvation, acid stress, and nutrients on metabolic activity of Helicobacter pylori. Appl. Environ. Microbiol. 68(1), 11-19.

100. Nilsson L., Oliver J. D., Kjelleberg S. (1991). Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state. J Bacteriol. 173, 5054-5059.

101. Nystrom T. (2001). Not quite dead enough: on bacterial life, culturability, senescence, and death. Arch Microbiol 176(3), 159-64.

102. Nystrom Т., Larsson C., Gustafsson L. (1996). Bacterial defense against aging: role of the Escherichia coli ArcA regulator in gene expression, readjusted energy flux and survival during stasis. EMBOJ. 15(13), 3219-3228.

103. Paidhungat M., Setlow P. (2000). Role of Ger proteins in nutrient and non-nutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 182(9), 2513-2519.

104. Parish Т., Smith D.A, Kendall S., Casali N. Bancroft G.J., Stoker N.G. (2003). Deletion of two-component regulatory systems increases the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 71,1134-1140.

105. Park H.D., Guinn K.M., Harrell M.I., Liao R., Voskuil M.I., Tompa M., Schoolnik G.K., Sherman D.R. (2003). Rv3133cIdosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol. 48, 833-843.

106. Parrish N.M., Dick J.D., Bishai W.R. (1998). Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. 6,107-112.

107. Postgate J. and Hunter, J. (1964). Accelerated death of Aerobacter aerogenes starved in the presence of growth-limiting substrate. J. Gen. Microbiol. 34,459-473.

108. Postgate J.R. (1976). Death in macrobes and microbes. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 26,1-18.

109. Primm T.P., Andersen S.J., Mizrahi V., Avarbock D., Rubin H., Barry, C.E., 3rd. (2000). The stringent response of Mycobacterium tuberculosis is required for long-term survival. J. Bacteriol. 182,4889-4898.

110. Rachman H., Strong M., Ulrichs Т., Grode L., Schuchhardt J., Mollenkopf H., Kosmiagi G.A., Eisenberg D., Kaufman S.H.E. (2006) Unique transcriptome signature of Mycobactenum tuberculosis in pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 72(2), 12331242.

111. Ray B. and Speck M. L. (1973). Freeze-injury in bacteria. CRC Crit Rev Clin Lab Sci 4(2), 161-213.

112. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. (1963) J Cell Biol. 17,208-12.

113. Rivers B. and Steck T.R. (2001). Viable but nonculturable uropathogenic bacteria are present in the mouse urinary tract following urinary tract infection and antibiotic therapy. Urol Res 29(1), 60-66.

114. Romalde J.L., Estes M.K., Szucs G., Atmar R.L., Woodley C.M., Metcalf T.G. (1994). In situ detection of hepatitis A virus in cell cultures and shellfish tissues. Appl Environ Microbiol. 60(6), 1921 -1926.

115. Rose A.S., Ellis A.E., Munro A.L. (1990). Evidence against dormancy in the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. FEMS Microbiol Lett 56, 105-7.

116. Roszak D.B., and Colwell, R.R. (1987). Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count. Appl. Environ. Microbiol. 53, 2889-2893.

117. Roszak, D.B., Grimes D.J., Colwell R.R. (1984). Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can. J. Microbiol. 30(3), 334-338.

118. Rothschild L.J. (2006). A microbiologicts explodes the myth of the unculturables. Nature. 443, 249

119. Rowbury R.J. (2001). Extracellular sensing components and extracellular induction component alarmones give early warning against stress in Escherichia coli. Adv. Microb. Physiol. 44, 215-257.

120. Sever J. and Youmans G. (1957). Enumeration of viable tubercle bacilli from the organs of nonimmunized and immunized mice. Am.Rev.Tuberc.Pulm.Dis. 101, 193202.

121. Sherman D.R., Voskuil M., Schnappinger D., Liao R., Harrell M.I., Schoolnik, G.K. (2001). Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding alpha -crystallin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 7534-7539.

122. Siegele D.A. and Kolter R. (1992). Life after log. J Bacteriol 174, 345-348.

123. Smeulders M.J., Keer J., Speight R.A., Williams, H.D. (1999). Adaptation of Mycobacterium smegmatis to stationary phase. J Bacteriol 181, 270-283.

124. Storz G. and Hengge-Aronis R., (2000). Bacterial Stress Responses. Washington, DC, American Society for Microbiology.

125. Sun Z. and Zhang Y. (1999). Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis H37Ra improves viability of aged cultures of this strain and allows small inocula to initiate growth. J Bacteriol 181, 7626-7628.

126. Sussman & Halvorson (1966). Spores, their dormancy and germination. Harper and Row, New York, NY

127. Thunnissen A.M., Isaacs N.W., Dijkstra B.W. (1995). The catalytic domain of a bacterial lytic transglycosylase defines a novel class of lysozymes. Proteins. 22(3), 245-258.

128. Torsvik V., Goksoyr J., Daae F.L. (1990) High diversity in DNA of soil bacteria. Appl Environ Microbiol 56, 782-787.

129. Tufariello J.M., Jacobs W.R.J., Chan J. (2004). Individual Mycobacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo. Infect. Immun. 72, 515-526.

130. Velayati A.A., Bakayev V.V., Bahrmand A.R. (2002). Use of PCR and culture for detection of Mycobacterium tuberculosis in specimens from patients with normal and slow responses to chemotherapy. Scand. J. Infect. Dis. 34(3), 163-166.

131. Voskuil M. (2004). Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency. Tuberculosis 84,138-143.

132. Voskuil M.I., Schnappinger D., Visconti K.C., Harrell M.I., Dolganov G.M., Sherman D.R., and Schoolnik G.K. (2003). Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J. Exp. Med. 198, 705-713.

133. Voskuil M.I., Visconti K.C., Schoolnik G.K. (2004). Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy. Tuberculosis (Edinb.) 84, 218-227.

134. Votyakova T.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B. (1994). Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase: the population effect. Appl Environ Microbiol 60, 3284-3291.

135. Wai S.N., Mizunoe Y., Takade A., Yoshida S. (2000). A comparison of solid and liquid media for resuscitation of starvation- and low-temperature-induced nonculturable cells of Aeromonas hydrophila. Arch Microbiol 173(4): 307-10.

136. Watson S.P., Clements M.O., Foster S.J., (1998). Characterizationof the starvation-survival response of Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 180,1750-1758.

137. Wayne L.G. (1976). Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions. Am. Rev. Respir. Dis. 114, 807-811.

138. Wayne L.G. (1994). Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13, 908-914.

139. Wayne L.G. and Hayes L.G. (1996). An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through 2 stages of nonreplicating persistence. Infect Immun 64, 2062-2069.

140. Wayne L.G. and Hayes L.G. (1998). Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis. Tubercle Lung Dis. 79,127-132.

141. Wayne L.G. and Lin K.-Y. (1982). Glyoxalate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions. Infect. Immun. 37, 1042-1049.

142. Wayne L.G. and Sohaskey C.D. (2001). Nonrepeating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol 55,139-63.

143. Weichart D. and S Kjelleberg (1996). Stress resistance and recovery potential of culturable and viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus. Microbiology 142, 845853.

144. Weichart D., McDougald D., Jacobs D., Kjelleberg S. (1997) In situ analysis of nucleic acids in cold-induced nonculturable Vibrio vulnificus. Appl. Environ. Microbiol. 63(7), 2754-2758.

145. Weichart D., Oliver J.D., Kjelleberg S. (1992). Low temperature induced nonculpability and killing of Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol. Lett. 79(1-3), 205-210.

146. Weichart D.H. and Kell D.B. (2001). Characterization of an autostimulatory substance produced by Escherichia coli. Microbiology 147:1875-1885.

147. Wheeler PR, Ratledge C. (1988). Use of carbon sources for lipid biosynthesis in Mycobacterium leprae: a comparison with other pathogenic mycobacteria. J Gen Microbiol. 134(8):2111-21.

148. Yamamura Y., Walter A., Bloch, H. (1960). Bacterial populations in experimental murine tuberculosis. 1. Studies in normal mice. J. Infect.Dis. 106, 211-222.

149. Young M., Mukamolova G.V., Kaprelyants A.S. (2005) Mycobacterial dormancy and its relation to persistence. Mycobacterium: Molecular Microbiology London. Horizon Bioscience. 352 P.

150. Yuan Y., Crane D.D., and Barrylll C.E. (1996). Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: function of the mycobacterial alpha-crystallin homolog. J. Bacteriol. 178,4484-4492.

151. Yuan Y., Crane D.D., Simpson R.M., Zhu Y.Q., Hickey M.J., Sherman D.R., Barry, C.E. (1998). The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9578-9583.

152. Zhang Y., Yang Y., Woods A., Cotter R.J., Sun Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides. Biochem Biophys Res Commun 284: 542-547.

153. Благодарю всех друзей и коллег за поддержку и внимание к моей работе.

Информация о работе

Салина, Елена Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

"Некультивируемые" формы бактерий Mycobacterium smegmatis и Mycobacterium tuberculosis и их биохимическая характеристика - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы