Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Покоящиеся формы бактерий рода Mycobacterium: получение, биохимические факторы реактивации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Покоящиеся формы бактерий рода Mycobacterium: получение, биохимические факторы реактивации"

Шлеева Маргарита Олеговна

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM: ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕАКТИВАЦИИ.

Специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в лаборатории «биохимии стрессов микроорганизмов» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Озерецковская Ольга Леонидовна доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится <

часов на заседании

диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект д 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

933 5lf

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В научной среде давно существует предположение о том, что латентная форма туберкулеза связана с особым состоянием клеток возбудителя М. tuberculosis в организме, при котором они могут сохраняться много лет в хозяине с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было экспериментально установлено. Эта проблема является общей для микробиологии, т.к. ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными.

Ранее было показано, что культура М. luteus способна образовывать покоящиеся формы в длительной постстационарной фазе. Характерной особенностью таких форм является их «некультивирумость», т.е. неспособность образовывать колонии на твердых средах или размножаться в жидкой среде. Было также обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок М. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation protein factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf тлеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты /pf-подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции у микрококка. В частности у М. tuberculosis имеется 5 генов и, возможно, они контролируют вход\выход клеток из покоящегося состояния.

Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель получения покоящихся клеток М. tuberculosis не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе. Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось создание экспериментальной модели образования покоящихся клеток микобактерий, в том числе Mycobacterium tuberculosis и их реактивация. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода получения покоящихся форм микроорганизмов рода Mycobacterium, в том числе Mycobacterium tuberculosis.

2. Исследование механизмов образования «некультивируемы L

гльнА*,

С. Петср< О» МО

fStfj

3. Разработка метода реактивации покоящихся форм

4. Исследование роли белков RpfB процессе реактивации покоящихся клеток бактерий. Научная новизна.

1. Впервые найдены условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus rhodochrous и Mycobacterium smegmatis переходят в длительной постстационарной фазе в «некультивируемое» состояние, которое по своим параметрам соответствует покоящемуся.

2. Впервые установлено, что появление покоящихся форм сопровождается накоплением в культуральной жидкости смеси жирных кислот, основной частью которых является олеиновая кислота, в концентрациях, подавляющих размножение активных клеток.

3. Впервые установлена зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток М. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf Научно-практическое значение.

Созданные экспериментальные модели получения покоящихся форм микобактерий, в частности М. tuberculosis, могут быть использованы для изучения механизмов латентности туберкулеза и перехода этих бактерий к активному состоянию in vivo. Белки семейства Rpf могут быть в дальнейшем использованы в качестве новых мишеней для создания противотуберкулезных средств и разработки новых методов профилактики заболевания. Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на итоговых научных конференциях' International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (Пущино, 2000), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. (University ofEast Anglia, Norwich, 2001), 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology 'The World of Microbes'( Paris, 2002), 153rd meeting Society for General Microbiology (Anglia, 2003) Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в числе которых 5 статей в российских и международных научных журналах. Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает

наименований. Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении д ана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный характеристикам различных физиологических состояний бактерий, поведению микробных популяций в стационарной фазе. Отдельное внимание уделено стрессу бактерий и реакции на него, факторам, определяющим поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ, биохимическим изменениям бактериальной клетки в условиях голодания, выходу бактерий из покоящегося состояния, социальному поведению бактерий. Кратко описано экспериментальное изучение туберкулеза и латентности инфекции Изложены современные представления о генетической регуляции переживания бактериальными клетками неблагоприятных условий.

Во второй главе представлены методы и материалы исследования. Выращивание бактериальных культур

Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия» выращивали при 37°С в стеклянных пробирках, содержащих 2 мл среды Сатона, к которой был добавлен БСА (бычий сывороточный альбумин, 5 фракция), глюкоза и NaCl. Культуры выдерживали в постстационарной фазе при 37°С в течение 8-ми месяцев.

Rhodococcus rhodochrous, штамм NCIMB 13805, выращивали аэробно при 37 °С в колбах при перемешивании (125 мл среды в колбах объемом 750 мл, скорость перемешивания 200 rpm) в богатой питательной среде broth Б (Lab M) или модифицированной среде Сатона. Mycobacterium smegmatis (штамм mc155) выращивали первоначально в течение 30 ч при 37 °С на орбитальной качалке (250 rpm) в 150 мл богатой среды Broth E (LabM), к которой был добавлен 0 05% (v/v) твин-80. Затем бактерии были пересеяны в модифицированную среду Hartman's-de Bont (mHdeB).

Оценка жизнеспособности клеток. Суспензию бактериальных клеток последовательно разводили в свежей среде и затем 100 мкл из каждого разведения высевали на агаризованную среду Сатона. Предел обнаружения колониеобразующих единиц (КОЕ) составлял 510° мл"1.

Общее число клеток в миллилитре культуры оценивали при помощи камеры Helber по формуле n/5' 108, где п - среднее количество клеток в одном малом квадрате. Сканирующая электронная микроскопия.

Клетки были зафиксированы в 3% глутаровом альдегиде с последующей обработкой 0.1 М Na-какодилатном буфере (рН 7.2). Пробы были высушены на воздухе, после чего

производили напыление Аи частицами размером 20 нм. Микроскопия осуществлялась при использовании сканирующего электронного микроскопа GSM-840A (Япония). Иммуноферментный анализ.

Бактериальный супернатант (0.2 мл) был помещен в пластиковые планшеты (Costar). Затем лунки промывали PBS-T (фосфатный буфер, содержащий 0.05% твина-80). Первичные анти-Rpf антитела кролика были добавлены в разведении 1:10 000 . После промывки PBS-T были добавлены вторичные антитела (анти-кроличий алкалин-фосфатазный коньюгат (Sigma, 1:5.000). Затем, после очередного цикла промывки PBS-T был добавлен субстрат щелочной фосфатазы (таблетка п-нитрофенилфосфата - Sigma). Интенсивность окраски определяли сканированием планшетов при 405 нм (Labsystem optical reader). Для калибровки метода использовали различные концентрации рекомбинантного белка Rpf в соответствующей культуральной среде. Гель - фильтрация сунернатанта с ингибирующей активностью.

Гель-фильтрацию проводили при низком давлении на носителе с

областью фракционирования 0.1 - 1.8 кДа. Общий объем колонки составил 175 мл, нулевой объем - 65 мл. Скорость эллюции = 25 мл\ч. Объем пробы (лиофильно сконцентрированный в 8 раз СП с ингибирующей активностью) = 3.5 мл. Объем каждой фракции составил 5 мл. Для калибровки колонки использовали миоглобин, НАДФ, ФМН, триптофан.

Гидрофобная хроматография.

Распределительную хроматографию ингибирующих СН-в проводили на модифицированной агарозе «Octyl-Sepharose CL-4B» (Pharmacia). Перед использованием колонку (объемом 5 мл) промывали последовательно водой (один объем колонки), таким же объемом этанола, двумя объемами бутанола, затем в обратном порядке этанолом и водой. После этого колонку уравновешивали 0.025 М Na-фосфат-цитратным буфером. Скорость промывки составила 25 мл\см2 ч. Ступенчатую элюцию вели с помощью воды, этанола и ацетонитрила. Колонку предварительно уравновешивали водой. Затем начали подавать этанол (один объем колонки), затем колонку снова уравновешивали водой, после чего элюцию вели ацетонитрилом (один объем). Тонкослойная хроматография (ТСХ).

ТСХ фракции с ингибирующей активностью, полученной после гидрофобной хроматографии, проводили на силикагеле 6OF254 (Merk, Германия) в системе: хлороформ-метанол-конц.аммиак (65:35:5) в течение часа при температуре 20-25°С.

Двумерная хроматография ингибирующей фракции после очистки на октил-сефарозе супернатанта М. smegmatis в системах - хлороформ:метанол:аммиак = 65:35:5 и хлороформ:метанол: ацетон:уксусная кислота:вода = 5:1:2:1:0,5.

Хроматограммы проявляли опрыскиванием водой. В результате получали индивидуальное пятно, которое экстрагировали из силикагеля ацетонитрилом. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Спектры ЯМР в препаратах ИВ, предварительно очищенного при ТСХ и затем растворенного в дейтерированном метаноле, регистрировали на спектрометре Varian HA-100 D (рабочая частота спектрометра 100 мгГц). Для повышения отношения сигнал\шум использовали накопитель спектров С-1024. Все спектры ЯМР снимали при температуре образцов 34°С. Стабилизация резонансных условий осуществляли по сигналу Н2О, присутствующей в небольшом количестве в дейтерированном метаноле. Для калибровки амплитудных интенсивностей пиков в спектрах ЯМР различных образцов использовали один и тот же внешний эталонный образец раствора гексаметилдисилоксана (ГМДС) в четыреххлористом углероде в отношении Химические сдвиги в спектрах ЯМР

измеряли от линии и пересчитывали на ГМДС. В третьей главе представлены собственные результаты.

Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae. Был проведен скрининг сред и условий культивирования для получения покоящихся форм микобактерий. В результате нами были подобраны условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis (рис.1), Rhodococcus rhodochrous (рис.2) и Mycobacterium smegmatis (рис.3) могли переходить в покоящееся состояние.

В качестве критерия образования покоящихся клеток была выбрана способность культивирования бактерий на твердых средах. Ранее на М. luteus было обнаружено, что появление покоящихся форм коррелирует с резким снижением способности образовывать колонии на твердых средах при снижении уровня метаболизма, сохранении общего числа клеток (ОЧК) и целостности мембраны.

В результате срининга различных условий было найдено, что образование «некультивируемых» форм исследуемых бактерий наблюдается в стационарной фазе, если до этого клетки росли длительное время при неблагоприятных условиях выращивания в логарифмической фазе. К таким условиям относятся: неоптимальный состав среды роста, сниженный кислородный режим.

Переход клеток в «некультивируемое» состояние зависит от совокупности факторов, таких как возраст инокулята, постоянства различные типы голодания, состав среды

роста, кислородный режим Даже небольшие изменения в условиях культивирования приводят к очень значительным изменениям в поведении культуры в стационарной фазе Например, для образования «некультивируемых» клеток Мsmegmatis возраст инокулята, как оказалось, должен быть около 30 Ч, инокуляты в возрасте 24, 72 ч практически никакого изменения в КОЕ в постстационарной фазе не обнаруживали (рис 4) Критичным фактором для формирования «некультивируемых» клеток М smegmatis оказался также состав среды роста Так, оптимальной оказалась t-реда с Na-фосфат-цитратным буфером, обеспечивающая «калиевое» голодание бактерий При использовании полной среды значительного снижения КОЕ не наблюдалось (рис 5) Для перехода клеток непатогенного штамма М tuberculosis (штамм «Академия») в покоящееся состояние культуру продолжали инкубировали в стационарной фазе при 37° С в течение 8 месяцев без доступа кислорода При этих условиях после 3,5-4 месяцев культивирования наблюдалось появление покоящихся форм, некультивируемых на плотных средах (рис 1) Было установлено, что "некультивируемые" клетки представлены небольшими овоидными и коккоидными формами (0,6-0,8 мкм)( рис 6) с неповрежденной клеточной стенкой и с дыхательной активностью близкой к нулю

РисЛ.Образование «некультивируемых» клеток РИС 2.Измененне числа колониеобразующих единиц Mycobacterium tuberculosis в длительной при инкубировании клеток Rhodococcus rhodochrous

в стационарной фазе.

стационарной фазе.

Рис.3. Образование покоящихся форм Mycobacterium Рисб. Сканирующая микроскопия покоящихся smegmatis в стационарной фазе клеток Mycobacterium tuberculosis

Рис.4. Влияние возраста инокулятов на изменение числа колониеобразующих единиц в стационарной Mycobacterium smegmatis

Рис5. Влияние состава среды на образование «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis

М W* t

Щ UF

10= г

10' Г

10F г

10' Г

__________

О г 4 б 8 10 12 14

время\дни

буф«»

буфер

0

2

4

б

8

время\дни

Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток M.smesmatis.

Из выше приведенных данных можно предположить, что при субоптимальных условиях роста клетки переходят в некое определенное состояние, в котором они как бы синхронизируются с кажущейся потерей культивируемости. Если это предположение верно, то и другие комбинации неблагоприятных для развития популяции условий могут привести к образованию покоящихся форм. Мы исследовали некоторые мутантные штаммы Mycobacterium smegmatis, в которых методом транспозонного мутагенеза были заблокированы гены пуринового метаболизма (purF) или двухкомпонентной регуляторной системы (devR), что приводило к уменьшению выхода биомассы. Эти мутанты показали значительное временное снижение КОЕ в процессе роста на немодифицированной HdeB среде в анаэробных условиях. Общее количество клеток не менялось в культурах мутантов, что позволяет отнести эти бактерии со сниженным количеством КОЕ к «некультивируемым». Через некоторое время КОЕ восстанавливалось до исходного уровня. В присутствии кислорода подобного поведения мутантных клеток не наблюдали (рис.7 А, Б). При этом дикий тип, растущий в анаэробных и аэробных условиях? не проявил подобного фенотипа, т.е. уменьшения КОЕ не наблюдалось (рис.7 В). В данном случае для получения «некультивируемых» форм необходимо сочетание анаэробиоза и повреждение функционирования некоторых генов.

Таким образом, для образования «некультивируемых», покоящихся форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae в стационарной фазе общим является необходимость культивирования клеток при сочетании неоптимальных условий роста, например, разных типов голодания, определенного кислородного режима. При этом, переход в «некультивируемое» состояние чувствителен ко многим факторам, таким как

возраст инокулята, постоянство рН, различные типы голодания, состав среды роста, кислородный режим, некоторые мутации.

Рис.7. Поведение мутантов М smegmatis (DevRupurF) в стационарной фазе

Время\дви

—•— анаэробные условия -О- аэробные условия

Изучение ингибипующего вещества, накапливающемся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние.

При изучении процесса образования покоящихся форм М. smegmatis и R. rhodochrous было обнаружено низкомолекулярное вещество (ИВ), обладающее ингибиторным действием на рост активных бактериальных клеток. Накопление этого вещества в среде выращивания сопутствует снижению способности клеток образовывать колонии В активных культурах оно практически не обнаруживается. Можно было предположить, что это вещество каким-то образом участвует в образовании «некультивируемых» клеток. При тестировании активности выяснилось, что как у родококка, так и у М. smegmatis, наблюдается постепенное накопление этого агента в процессе перехода к неактивному состоянию, а затем его распад после наступления фазы с минимальным КОЕ. Методом ультрафильтрации было установлено, что масса ИВ находится в районе 500 - 1000 Да. Гель-фильтрация на Bio-Gel P-2 показала, что масса этого вещества составляет 450-700 Да (рис.8).

Рис.8. Гель фильтрация (BioGel P-2) концентрированного супернатанта Кко^еоееш rhodochrous с имитирующей активностью

Объем, мл

Хранение супернатантов, содержащих ингибирующее вещество, при +4°С показало, что активность сохраняется долгое время (примерно 1 месяц)

Данное вещество обладает гидрофобными свойствами При тестировании его активности необходимо рассчитывать его концентрацию не на единицу объема, а на единицу клеток Первый этап очистки - пропускание супернатанта через октил-сефарозу (снимаем этанолом), затем используем метод тонкослойной хроматографии в системе хлороформ-метанол-конц аммиак (65 35 5) Хроматограммы проявлялись опрыскиванием водой В результате мы получаем индивидуальное пятно (рис 9), которое экстрагируем из силикагеля ацетонитрилом

Рис.9.Тонкослойная хроматография фракции с имитирующей активностью на силикагеле

Небольшая масса исследуемого вещества и наличие гидрофобных свойств позволило предположить, что оно может относиться к классу липидов Для проверки этого предположения была проделана серия анализов по выявлению структуры этого вещества

Анализ ЯМР и ИК спектров показало, что алифатические соединения неизопреноидной природы, обладающие карбониловой группой и 1-2 ненасыщенными связями, являются основными веществами препарата

Анализ двумерных Н-Н (рис 10А) и Н-С (рис 10Б) спектров ЯМР показал наличие в препарате определенных последовательностей, характерных для мононенасыщенных жирных кислот

Цифрами обозначены химические сдвиги

Рис. 10. Двумерные спектры ЯМР ингибитора, выделенного из супернатанта М.

smegmatis

А) протон-протонный Б) протон-углеродный

По результатам масс-спектрометрии было получено, что изучаемый препарат является смесью жирных кислот, при этом доминирующей ЖК у М smegmatis является олеиновая (рис 11)

Рис.11. Масс-спектроскопия ингибитора, выделенного из супернатанта М smegmatis

2* »03

При сравнительном анализе спектров ЯМР ИВ из М smegmatis и олеиновой кислоты (оба вещества были предварительно пропущены через колонку с октил-сефарозой, а затем очищены при помощи ТСХ на силикагеле-60) было обнаружено, что оба соединения имеют похожие спектры (рис 12)

Рис12.Спектры ЯМР олеиновой кислоты и ингибитора из М. smegmatis

По результатам биологического тестирования ингибирующей активности этих веществ было получено, что оба соединения замедляют рост клеток при одних и тех же концентрациях (действующая концентрация на 105 клеток = 5 мкг\мл).

При добавлении в супернатант БСА, который как известно, эффективно связывает ЖК, ингибирующая активность исчезала. Таким образом, ИВ, появляющееся в супернатантах культур при переходе клеток в «некультивируемое» состояние, относится к жирным кислотам.

Восстановление покоящихся ФОРМ.

Для доказательства способности клеток образовывать покоящиеся формы абсолютно необходимым является демонстрация способности таких клеток к восстановлению метаболизма и способности к делению. Ранее нами было установлено, что реактивация покоящихся клеток M.luteus было успешной, если ее проводить в жидкой среде. Для этого мы использовали метод конечных разведений (МКР), который позволяет одновременно проводить реактивацию в жидкой среде и оценивать количество жизнеспособных бактерий в исходной культуре. Это помогало при определении численного значения реактивированных клеток и в решении проблемы остаточной выживаемости при проведении реактивации. Было выяснено, что, как и в случае с M.luteus, восстановление жизнеспособности исследуемых в данной работе клеток происходит, если в качестве жидкой среды для реактивации использовали супернатанты, полученные при фильтровании культур Rhodococcus rhodochrous, M. tuberculosis и M.smegmatis в логарифмической фазе. Супернатанты применяли в качестве среды для определения жизнеспособности методом конечных разведений. В этом случае число жизнеспособных бактерий увеличивалось на 4-7 порядков, приближаясь к общему числу клеток, подсчитанному микроскопически (рис.13).

Рис.13. Количественная оценка оживления некультивируемых форм методом МКР

Х1\1ч1чи.А'Г1ш11 шЬегс «/о ил

ОЧК - общее количество клеток: КОС -колониеобраз}юшме единицы: Контроль - среда Сатона

Анализируя супернатант активно растущих клеток было обнаружено, что пропускание его через аффинную колонку, содержащую антитела, выработанные против Rpf, его оживляющая активность заметно снижалась, что указывает на природу активного вещества, имеющую сходство с Другие свойства активного начала в супернатанте также свидетельствовали в пользу белковой природы стимулятора (табл!)

Таблица 1. Влияние различных обработок на оживляющую активность супернатанта,

полученного из логарифмической культуры Я. гИоиосНгош

Для доказательства того, что определяющим в восстановлении клеток у микобактерий являются Rpf-подобные факторы, были исследованы специфические трансформанты М. smegmatis. Эти трансформанты (рАОЯ И рАОМо) содержали плазмиду с включенным геном Rpf M. luteus под контролем собственного промотора (рАОН) или ацетамидного промотора (рАвМо) В обычных аэробных условиях при росте на полной среде Сатона поведение трансформированных культур не отличалось от дикого типа. В аэробных условиях на модифицированной среде эти трансформанты, так же как и дикий тип, показали значительное снижение КОЕ. Однако при оживлении наблюдались отличия от дикого типа. Для рАСТ^. И рАОМо было характерно самооживление на 4-6 день (увеличение в то время как (трансформант с контрольной плазмидой) и дикий

тип никакого увеличения OD не показали.

Рис.14. Спонтанное оживление «некультивируемых» клеток М. яте^иШ, содержащих плазмиды, и дикого типа, культивированного совместно с М. 1Меш

Рис.15. Иммуноферментный анализ супернатантов М. smegmatis и штаммов, содержащих плазмиды.

Иммуноферментный анализ, определяющий наличие Rpf-подобных белков в супернатантах культур различных штаммов, показал, что имеется максимум накопления этих белков в логарифмической фазе (рис.15). В то время как концентрации Rpf-подобных белков для штаммов, содержащих плазмиды pAGMo и pAGH (контрольный вектор), были равны, в супернатанте штамма, содержащего плазмиду pAGR, образовывалось больше этих белков, что, вероятно, отражается на процессе активации покоящихся форм. Для «некультивируемых» форм М. tuberculosis, в отличие от дикого штамма быстрорастущих микобактерий, было характерно наличие самооживления в жидкой среде, т.е. активация клеток проходила в жидкой среде без каких-либо добавок (рис.16). Для изучения роли белков Rpf в процессе самовосстановления М. tuberculosis были исследованы мутанты М. tuberculosis, у которых были заблокированы путем аллельного обмена по три Rpf-подобных гена. Эти мутанты, так же как и дикий тип образовали «некультивируемые» формы. Однако, они оказались не способны к самовосстановлению, в отличие от дикого типа (рис.16), что подтверждает роль белков Rpf в реактивации покоящихся клеток М. tuberculosis.

Рис.16. Поведение мутантов М. tuberculosis по генам Rpf при оживлении из «некультивируемого» состояния.

Дикийтип

мутант по Rpf там Rv08«7+Rvl884+Rvl009

штамм КОЕ\мл MKF тймл Дикийтип <5 5,4.105

Таким образом, нам впервые удалось установить зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток М. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на довольно большое количество экспериментально зарегистрированных «некультивируемых» форм бактерий, практически во всех случаях не была продемонстрирована обратимость этого процесса, т. е. способность «некультивируемых» форм к переходу в активное, делящееся состояние. Однако, если такая обратимость не доказана, подобные клетки должны рассматриваться как нежизнеспособные. При отсутствии оживления ставится под сомнение микробиологическое и медицинское значение таких форм.

В нашей работе мы разработали методы для получения и оживления «некультивируемых» клеток М. tuberculosis, R rhodochrous и М. smegmatis, относящихся к Г-Ц - богатым бактериям. Однако имеется существенное различие между «некультивируемыми» клетками R rhodochrous, M. smegmatis и М. tuberculosis в их способности к реактивации.

Для первых двух культур необходимым условием реактивации «некультивируемых» клеток являлось добавление в среду восстановления супернатанта, полученного из активно растущих клеток, или белка Rpf В то время как в случае с М tuberculosis происходило существенное увеличение числа жизнеспособных клеток (до 5 порядков) при культивировании клеток на свежей среде Сатона без специальных добавок (рис 13) Возможно, это свойство возбудителя туберкулеза как-то связано с его способностью к длительной персистенци в организме хозяина и реактивации туберкулеза Очевидно, действующим началом, способствующим реактивации микобактерий, является белок, сходный с ранее обнаруженным в супернатанте Mluteus, белком Rpf Об этом свидетельствуют результаты экспериментов с клетками М tuberculosis с нокаутированными генами Rpf Этот вывод представляется существенным для понимания механизмов персистенции возбудителя туберкулеза и патогенеза латентных форм туберкулеза

Выводы:

1) Впервые обнаружено, что при культивировании в длительной стационарной фазе клетки М. tuberculosis, M. smegmatis и R. rhodochrous образуют «некультивируемые» формы, которые по своим характеристикам могут быть отнесены к покоящимся Необходимым фактором перехода клеток в неактивное состояние является рост бактерий в условиях сочетания нескольких неблагоприятных факторов (различные типы голодания, недостаток кислорода)

2) При образовании «некультивируемых» форм в среде выращивания обнаружено появление смеси свободных жирных кислот, среди которых преобладает олеиновая кислота Возможно, что накопление жирных кислот является одним из факторов образования покоящихся клеток при адаптации микобактерий к субоптимальным условиям роста.

3) «Некультивируемые» клетки М. smegmatis и R. rhodochrous могут быть реактивированы в жидкой среде в присутствии белка Rpf или веществ(а) содержащихся в супернатанте активно растущих клеток, близких к Rpf.

4) «Некультивируемые клетки» трансформанта М. smegmatis, продуцирующего секретируемую форму Rpf способны к самовосстановлению.

5) «Некультивируемые» клетки дикого типа способны к самовосстановлению в жидкой среде. Клетки, содержащие по три одновременно инактивированных гена

теряют способность к самовосстановлению, что подтверждает роль белков в оживлении покоящихся клеток

Список публикаций

Список статей

1. М О. Shleeva. К. Bagramyan, М. V. Telkov, G. V. Mukamolova, M. Young, D В. Kell and A. S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of "non-culturable" cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase (2002). Microbiology UK, 148,1581-1591.

2. M О. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков, Т.Л. Березинская, А.В. Сыроешкин, С.Ф. Бикетов, А.С. Капрельянц. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление.(2003) .Микробиология Т.72, стр 76-83.

3. Матвеева И С, Плетенева Т.В., Березинская Т.Л, Аветисян А., Шлеева М О Капрельянц А.С., Лебедев И.М., Колесников М Н., Бикетов С.Ф., Фролов В А., Сыроешкин А В. (2003).Элементные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния. Микроэлементы в медицине. Т.4 (3), стр. 6-12.

4. Kuznetsov BA, Davydova ME, Shleeva МО, Shleev SV, Kaprelyants AS, Yaropolov AI (2004) Electrochemical investigation of the dynamics of Mycobacterium smegmatis cells' transformation to dormant, nonculturable form Bioelectrochemistry. Sep;64(2): 125-31.

5. Shleeva M. Mukamolova GV, Young M, Williams HD, Kaprelyants AS. Formation of 'non-culturable' cells of Mycobacterium smegmatis in stationary phase in response to growth under suboptimal conditions and their Rpf-mediated resuscitation. Microbiology. Jun;150(Pt 6): 1687-97.

Тезисы конференций

1. A.Kaprelyants, GMukamolova, M Shleeva. D.Kell, M.Young."Non-culturable" bacteria.

The role of bacterial cytokines in resuscitation( 2000) Abstracts of International symposium

"Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p.53.

2. M.Telkov. M Shleeva, K.Bagramyan et al. In vitro model of "nonculturable" Mycobacteria and their resuscitation with bacterial cytokines of Rpf family.

(2000)Abstracts of International symposium "Modem problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p. 126.

3. М.О.Шлеева. К.Баграмян, М.В.Телков, А.С.Капрельянц. Образование некультивируемых (покоящихся) форм микроорганизмов рода Микобактерии. (2000). Материалы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии". Пущино, стр.215.

4. МО. Shleeva, G.V. Mukamolova, К. Bagramyan, M.V. Telkov, D.B. Kell, M.Young, A.S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of "non-culturable" mycobacteria in stationary phase.(2001). Abstracts of Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. University of East Anglia, Norwich, p.44.

5. M. Shleeva. Cultivation of Mycobacteria under non-optimum conditions in logarithmic phase results in formation of 'non-culturable'(dormant) cells in stationary phase.(2002).Abstracts of 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology 'The World of Microbes', Paris, p. 233.

6. Obolbek A. Turapov, Margarita O. Shleeva. Galina V. Mukamolova, Danielle I. Young, Arseny S. Kaprelyants, Michael Young, PBMG 27 Rpf-mediated resuscitation of stressed mycobacteria. Abstracts of 153rd meeting Society for General Microbiology. (2003).p.

68.

Принято к исполнению 17/11/2004 Исполнено 18/11/2004

Заказ № 480 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095) 318-40-68 www.autoreferat.ru

Р23 4 Û 3

РНБ Русский фонд

2005-4 23117

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шлеева, Маргарита Олеговна

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Анабиоз как явление природы.

1.2. Стресс у бактерий и реакция на него.

1.2.1. Выживание бактерий в процессе длительного голодания.

1.2.2. Стационарная фаза развития культуры.

1.2.3. Факторы, определяющие поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ.

1.2.4. Биохимические изменения бактериальной клетки в условиях голодания.

1.2.5. Генетическая регуляция переживания бактериальными клетками неблагоприятных условий.

1.3. Покоящиеся формы неспорулирующих бактерий.

1 А. Выход бактерий из покоящегося состояния.

1.5. Социальное поведение бактерий.

1.6. Туберкулез и латентность инфекции.

1.6.1. Получение латентных форм Mycobacterium tuberculosis на экспериментальных животных.

1.6.2. Модели покоящихся форм М. tuberculosis in vitro.

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Выращивание бактериальных культур

2.2. Оценка жизнеспособности клеток.

2.3.Определение общего числа клеток (ОЧК)

2.4. Получение супернатантов для восстановления «некультивируемых» форм.

2:5. Получение рекомбинантного фактора Rpf.

2.6. Аффинная хроматография с использованием антител.

2.7. Реактивация «некультивируемых» форм.

2.8. Измерение численного распределения клеток.

2.9. Флуоресцентная микроскопия.

2.10. Сканирующая электронная микроскопия.

2.11. Измерение окислительно-восстановительного потенциала.

2.12. Трансформация культуры М. smegmatis.

2.13. Процедура со-культивирования.

2.14. Иммуноферментный анализ.

2.15. Получение СН, обладающего ингибиторным действием на рост клеток.

2.16. Тестирование активности ингибирующих супернатантов.

2.17. Гель - фильтрация СН с ингибирующей активностью.

2.18. Ультрафильтрация СН с ингибирующей активностью.

2.19. Гидрофобная хроматография.

2.20. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

2.21. Получение фракции липидов из супернатанта с ингибирующей активностью.

2.22. Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

2.23. Инфракрасная спектроскопия ингибирующего вещества (ИВ).

2.24. Включение радиоактивной метки.

2.25. Хромато-масс-спектроскопия.

Глава 3. Результаты.

3.1. Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.—

3.1.1. Поведение культуры Rhodococcus rhodochrous в условиях недостатка питательных. веществ.

3.1.2. Образование «некультивируемых» форм культурой Mycobacterium smegmatis, как результат действия многих факторов.

3.1.3. Формирование покоящихся клеток культурой Mycobacterium tuberculosis при длительном инкубировании в стационарной фазе.

3.1.4. Микроскопия клеток, проявляющих способность образовывать покоящиеся формы,—

3.1.5. Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis.

3.2. Изучение вещества, накапливающееся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние.

3.2.1. Тестирование активности и физико-биологические характеристики ИВ.

3.2.2. Метод очистки.

3.2.3. Исследование структуры.

3.3. Восстановление покоящихся форм.

3.3.1. Разработка процедуры реактивации «некультивируемых» клеток.

3.3.2. Биохимический анализ супернатантов, проявляющих активирующую активность.

3.3.3: Исследование трансформантов М. smegmatis, содержащих плазмиду со встроенным белком Rpf.

Глава 4. Обсуждение. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Покоящиеся формы бактерий рода Mycobacterium: получение, биохимические факторы реактивации"

Хорошо известно, что при попадании в неблагоприятные условия, многие бактерии способны переходить, в покоящееся состояние. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической ; активности и полным отсутствием деления. Ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие: бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными. Под . покоящимся состоянием- мы понимаем такое, обратимое состояние бактериальной клетки, при котором уровень метаболической активности значительно снижен, а клетка может существовать в таком состоянии без деления длительное время > [Kaprelyants, 1993].Такие покоящиеся клетки, как правило, изменяют свою форму, утолщают клеточную стенку и становятся менее чувствительными:к агрессивным внешним воздействиям. И, хотя обычные микробиологические: методы зачастую не могут выявить микроорганизмы, находящиеся в покоящемся состоянии, такие бактерии при наступлении благоприятных условий способны продолжить рост.

До недавнего времени существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было установлено, хотя для ряда других неспорулирующих бактерий переход в покоящееся состояние экспериментально установлен.

Известно, что каждый третий человек на Земле латентно инфицирован возбудителем туберкулеза - Mycobacterium tuberculosis, живя: с постоянным риском перехода в активную форму болезни. До сих пор нет единого понимания природы латентного состояния и механизмов, посредством которых оно регулируется. Существует распространенная точка зрения, что патогенные, медленно растущие микобактерии Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium leprae могут сохраняться в течение длительного времени in vivo после начала инфекции, переходя в покоящееся состояние [Gangadharam, 1995] [Parrish, 1998]. Предполагается, что такие покоящиеся, клетки М tuberculosis могут сохраняться много лет в хозяине (латентная инфекция) с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако экспериментальные доказательства такого предположения практически не получены.

Ранее в нашей лаборатории было • обнаружено, что клетки неспорулирующей бактерии: Micrococcus luteus в стационарной фазе при определенных условиях переходят в состояние, которое характеризуется низким уровнем метаболизма и потерей культивируемости клеток на твердых и жидких средах [Kaprelyants, 1993]. Для реактивации таких клеток необходимо было проведение процедуры, «оживления»- культивирование покоящихся клеток с добавлением в жидкие среды ростовых факторов. Было обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок М. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf имеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты rpf подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции. В частности, в М. tuberculosis имеется 5 генов и, может быть, они контролируют вход\выход из покоящегося состояния.

Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель покоя клеток возбудителя не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ЖНК - жизнеспособные, но «некультивируемые» клетки

НК - «некультивируемость»

КОЕ - колониеобразующие единицы

МКР — метод конечных разведений

ОЧК - общее число клеток

СН - супернатант, полученный центрифугированием и фильтрованием через 0.2 мкм фильтр бактериальных культур

ИВ - ингибирующее вещество, образующееся в результате получения «некультивируемых» форм бактерий

СССР- карбонилцианид-м-хлорфенилгидразон

СУС - смерть, ускоряемая субстратом

УМБ - ультрамикробактерии

МПБ — мясо-пептонный бульон

Сатон - синтетическая среда Сатона мСатон - модифицированная синтетическая среда Сатона

HdeB -синтетическая среда Hartmans de Bont мШеВ - модифицированная синтетическая среда HdeB

МТБ - Mycobacterium tuberculosis

СТС - 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шлеева, Маргарита Олеговна

ВЫВОДЫ:

1) Впервые обнаружено, что при культивировании в длительной стационарной фазе клетки М. tuberculosis, М. smegmatis и R. rhodochrous образуют «некультивируемые» формы, которые по своим характеристикам могут быть отнесены к покоящимся. Необходимым фактором перехода клеток в неактивное состояние является рост бактерий в условиях сочетания нескольких неблагоприятных факторов (различные типы голодания, недостаток кислорода).

2) При образовании «некультивируемых» форм в среде выращивания обнаружено появление смеси свободных жирных кислот, среди которых преобладает олеиновая кислота. Возможно, что накопление жирных кислот является одним из факторов образования покоящихся клеток при адаптации микобактерий к субоптимальным условиям роста.

3) «Некультивируемые» клетки М. smegmatis и R. rhodochrous могут быть реактивированы в жидкой среде в присутствии белка Rpf или веществ(а) содержащихся в супернатанте активно растущих клеток, близких к Rpf.

4) «Некультивируемые клетки» трансформанта М. smegmatis, продуцирующего секретируемую форму Rpf, способны к самовосстановлению.

5) «Некультивируемые» клетки М. tuberculosis дикого типа способны к самовосстановлению в жидкой среде. Клетки, содержащие по три одновременно инактивированных гена Rpf (Rv0867+Rvl884+Rvl009 и Rv0867+Rvl884+Rv2389) теряют способность к самовосстановлению, что подтверждает роль белков Rpf в оживлении покоящихся клеток М. tuberculosis .

106

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шлеева, Маргарита Олеговна, Москва

1. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашев В:А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тиразол ауторегуляторный фактор di Saccharomyces cerevisiae, Микробиология. 1993. 62 (4). С. 633-638.,

2. Беккер М.Е., ДамбергБ.Э., Рапопорт А.И. Анабиоз микроорганизмов. Рига «Зинатне», 1981

3. Воробьева Л.И;, Никитенко Г.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Реактивация инактивированных ультрафиолетовым светом клеток Esherichia coli клеточными экстрактами пропионово-кислых бактерий. Микробиология, 1993, т.62, с. 1135-1143

4. Демкина Е.В., СоинаВ.С., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в аутолизирующихся суспензиях клеток. Микробиология. 2000. т.69,№3, с.383-388

5. Дорофеев А.Г., Панников Н.С. Динамика отмирания голодающих микроорганизмов в зависимости от предшествующей скорости роста. Микробиология. 1991, т.60,№5, с. 814-820

6. Имшенецкий А.А., Солнцева Л.И. О фильтрующихся формах бактерий. Микробиология, 1958, т.27, №3, с. 276-282

7. Купрейчик М. А. О фильтрующихся формах желтой сарцины. Микробиология. 1953, т.22, №5, с.535-538

8. Мулюкин А.Л., Сорокин В.В., Лойко Н.Г., Сузина Н.Е., Дуда В.И., Воробьева Е.А., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus. Микробиология, 1996, Т.65, №6, с. 782-789

9. Allen-Austin, D;, Austin В & Colwell, R. (1984). Survival of A eromonas salmonicida in river water. FEMS MicrobioLLett. 21, 143-146.

10. Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D. & Kolter, R. (1992). A novel DNA-binding protein with ' regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-54.

11. Artzatbanov, Sheiko, Lukoyanova & Kaprelyants (1991). The increase of KCN-sensitive electron flow in the branched respiratory chain of Micrococcus luteus grown slowly in carbon-limited culture. J. Gen. Microbiol. 137,1485-1490:

12. Baker, R., Singleton, F. & Hood, M. (1983). Effect of nutrient deprivation on Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 46, 930-940.

13. Barer, M. R. (1997). Viable but non-culturable and dormant bacteria: time to resolve an oxymoron and. a misnomer? J Med Microbiol 46, 629-31.

14. Barer, M. R., Gribbon, L. Т., Harwood, C. R. & Nwoguh, С. E. (1993). The viable but not culturable. hypothesis and medical bacteriology. Rev. Med; Microbiol. 4, 183-191.

15. Beck, F. & Yegian, D. (1952). A study of the tubercle bacillus in resected pulmonary lesions. Am.Rev.Tuberc. 66, 44-51.

16. Betts, J; C., Lukey, P. Т., Robb, L. C., McAdam, R. A. & Duncan, K. (2002). Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. Mol. Microbiol. 43, 717-731.

17. Binnerup, S. J., Jensen, D. F., Thordal-Christensen, H., and & Sorensen, J. (1993). Detection of viable, but not-culturable Pseudomonas fluorescens DF57 in soil using a microcolony epifluorescence technique. FEMS Microbiol. Ecol. 12, 97-105.

18. Boaretti M, Del Mar Lleo M, Bonato B, S. C. & Canepari (2003). Involvement of rpoS in the survival of Escherichia coli in the viable but non-culturable state. Environ Microbiol.: 5, 986-996.

19. Bohanon, D., E.„ Connel, M., Keener J, Tormo, A., Espinosa-Urgel, M., Zambrano, M., M, & Kolter, R. (1991). Stationary-phase-inducible "gearbox" promoters: differential effects of katF mutations and role of sigma. J. Bacteriol. 173, 4482-4492.

20. Boucher, S. N., Slater, E. R, Chamberlain, A. H. & Adams, M. R. (1994). Production and viability of coccoid forms of Campylobacter jejuni. J. Appl. Bacteriol. 77, 303-307.

21. Bovill, R. A. & Mackey, B. M. (1997). Resuscitation of'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology 143 ( Pt 5), 1575-81.

22. Boyaval, P., Boyaval, E. & Desmezeaud (1985). Survival of Brevibocterium linens during nutrient. Arch. Microbiol. 141, 128-132.

23. Brauns, L. A., Hudson, M. C. & Oliver, J. D. (1991). Use of the polymerase chain reaction in detection of culturable and nonculturable Vibrio vulnificus cells. Appl Environ Microbiol 57, 2651-5.

24. Brooks, J. V., Furney, S. K & Orme, I. M. (1999). Metronidazole therapy in mice infected with tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 1285-1288.

25. Calcott, P. H. & Postgate, J; R (1972). On substrate-accelerated death in Klebsiella aerogenes. J. Gen; Microbiol. 70, 115-122.

26. Chaiyanan, S., Huq, A., Maugel, T. & Colwell, R. R. (2001). Viability of the nonculturable Vibrio cholerae Ol and 0139. Syst Appl Microbiol 24, 331-41.

27. Clewell, D. B. (1993). Bacterial sex pheromone-induced plasmid transfer. Cell 73, 9-12.

28. Comstock, G., Livesay, V. & Woolpert, S. (1974). The prognosis of a positive tuberculin reaction in childhood and adolescence. Am. J.Epidemiol. 99, 131-138.

29. Connell, N. D. (1994). Mycobacterium: isolation, maintenance, transformation,- and mutant selection. Methods Cell Biol 45, 107-125.

30. Cooper, A., Callahan, J., Griffin, J., Roberts, A. & Orme, I. (1995). Old mice are able to control low-dose aerogenic infections with Mycobacterium tuberculosis. Infect.Immun. 63, 3259-65.

31. Corper, H. J. & Cohn, M. L. (1933). The viability and virulence of old cultures of tubercule bacille. Studies on twelve-year broth cultures maintained at incubator temperature. Am. Rev. Tuberc. 28, 856874.

32. Dhillon, J., Lowrie, D. & Mitchison, D. (2004). Mycobacterium tuberculosis,from chronic murine infections that grows in liquid but not on solid medium. BMC Infect. Dis. 4, 51-59.

33. Diaper & Edwards (1994). Survival of Staphylococcus in lake water monitored by flow cytometry. Microbiology 140, 35-42.

34. Dick, T., Lee, B. H. & Murugasu-Oei, B. (1998): Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium smegmatis. FEMS Microbiol Lett 163, 159-164.

35. Edwards, C. (2000). Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol Biotechnol 15, 211-23:

36. Effendi, I. & Austin, B. (1991). Survival of fish pathogen Aeromonas salmonicida in sea. FEMS MicrobioLLett. 84, 103-106.

37. Firth, J., Diaper, J. & Edwards, C. (1994). Survival and viability of Vibrio vulnificus in seawater monitored by flow cytometry. Lett.Appl.Microbiol; 18,268-271.

38. Fuqua, W. C., Winans, S. C. & Greenberg, E. P. (1994).: Quorum sensing in bacteria the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 176, 269-275.

39. Gallant (1979). Stringent control in E. coli. Ann. Rev. Genet. 13, 393-415.

40. Gangadharam, P. R. J. (1995). Mycobacterial dormancy. Tuber. Lung Dis. 76, 477-479.

41. Gauthier, Flatau, Clement & Munro (1992). Sensitivity of Esherichia coli cells to seawater closely depends on their growth stage. J. Appl. Bacteriol. 73, 257-262.

42. Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Nguyen, L. H., Jensen, D. B. & Cashel, M. (1993). Synthesis of the stationary-phase sigma-factor sS is positively regulated by ppGpp. Journal of Bacteriology 175, 79827989.

43. Ghezzi, J. I. & Steck, T. R. (1999). Induction of the viable but non-culturable condition in Xanthomonas campestris pv. campestris in liquid microcosms and sterile soil. FEMS Microbiol Ecol 30, 203-208.

44. Gould, G W. & Hurst, A. (1969). The Bacterial Spore., pp. 215. London, New York: Academic Press.

45. Gray, T. (1976). Survival of vegetative microbes in soil. In Vegetative microbes 91, 327-358.

46. Grossman & Losick (1988). Extracellular control of spore formation in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4369-4373.

47. Grossman, A. D. (1995). Genetic networks controlling the initiation of sporulation and the development of genetic competence in Bacillus subtilis. Annu Rev Genet 29, 477-508.

48. Gupta, S., Pandit, S. B., Srinivasan, N. & Chatteiji, D: (2002). Proteomics analysis of carbon-starved Mycobacterium smegmatis: induction of Dps-like protein. Protein. Eng. 15, 503-512.

49. Gurkert, Hood & White (1986). Phospholipids esterlinked fatty acid profile changes during deprivation of Vibrio cholerae: increases in trans/cis ratio and proportions of eyelopropyl fatty acids. Appl. Environ. Microbiol. 52, 794-801.

50. Haeker, G. & Vaux, D. (1994). Viral, worm and radical implications for apoptosis. TIBS 19, 99-100.

51. Harder & Dijkhuizen (1983). Physiological responses to nutrient limitation. Ann. Rev. Microbiol. 37, 1-23.

52. Harshey, R. & Ramakrishnan, T. (1976). Purification and properties of DNA-dependent RNA polymerase fromM tuberculosis H37Rv. Biochim.Biophys. Acta 432, 49-59.

53. Heinments, F., Lehman, J., Tailor, W. & RH, K. (1954). The study of factors which influence metabolic reactivation of the ultraviolet inactivated Esherichia coli/. J.Bacteriol. 67, 511-522.

54. Hengartner, M., Ellis, R: & Horvitz, R. (1992). Caenorhabtis elegans gene ced-9 protect cells from programmed cell death. Nature 356, 494-499.

55. Hengge-Aronis, R. (1993). Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in E coli. Cell 72, 165-168.

56. Hengge-Aronis, R. (1999). Interplay of global regulators and cell physiology in the general stress response of Escherichia coli. Curr. Opin. Microbiol. 2, 148-152.

57. Hobby, G. L., Auerbach, O., Lenert, T. F., Small, M. J. & Comer, J. V. (1954). The late emergence of M. tuberculosis in liquid cultures of pulmonary lesions resected from humans. Am Rev Tuberc .70, 191-218.

58. Hoch, J. A. (2000). Two-component and phosphorelay signal transduction. Curr Opin Microbiol 3, 165-70.

59. Holmquist & Kjelleberg (1993). Changes in viability, respiration activity and morphology of the marine Vibrio sp. strain S14 during starvation of individual nutrients and subsequent recovery. FEMS Microbiol: EcoL 12,215-224:

60. Hood, M. A., Guckert, J. B., White, D. C. & Deck, F. (1986). Effect of nutrient deprivation on lipid, carbohydrate, DNA, RNA, and protein levels in Vibrio cholerae. Appl. Environ. Microbiol. 52, 788793.

61. Hu, J. C., Kornacker, M. G. & Hochschild, A. (2000). Escherichia coli one- and two-hybrid systems for the analysis and identification of protein-protein interactions. Methods 20, 80-94.

62. Hu, Y., Butcher, P. D., Mangan, J. A., Rajandream, M. A. & Coates, A. R; (1999). Regulation of hmp gene transcription in Mycobacterium tuberculosis: effects of oxygen limitation and nitrosative and oxidative stress. J. Bacteriol. 181, 3486-3493.

63. Hu, Y. M.', Butcher, P. D., Sole, K., Mitchison, D. A. & Coates, A. R. M. (1998). Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock. FEMS Microbiology Letters 158, 139-145.

64. Huisman, G. W. & Kolter, R. (1994). Sensing starvation: a homoserine lactone-dependent signaling pathway in Escherichia coli. Science 265, 537-539.

65. Hutter, B. & Dick, T. (1999). Up-regulation of narX, encoding a putative "fused nitrate reductase" in anaerobic dormant Mycobacterium bovis BCG. FEMS Microbiol Lett 178, 63-69.

66. Johnstone, B. & Jouns, R. (1988). Recovery of a marine chemolithotrophic ammonium-oxidazing bacterium from long-term energy-source deprivation. Can.J.Microbiol. 34, 1347-1350.

67. Jones, D. M., Sutcliffe, E. M. & Curry, A. (1991). Recovery of.viable but non-culturable Campylobacter jejuni. J Gen Microbiol 137 ( Pt 10), 2477-82.

68. Jouper-Jaan, Goodman & Kjelleberg (1992). Bacteria starved for prolonged periods develop increased protections against lethal temperatures. FEMS Microbiol. Ecol. 101, 229-236.

69. Kaiser, D. & Losick, R: (1993). How and why bacteria talk to each other. Cell 73, 873-885.

70. Kaprelyants, A. S., Gottschal, J. C. & Kell, D. B. (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol Rev 104,271-286.

71. Kaprelyants, A. S. & Kell, D. B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. Journal of Applied Bacteriology 72, 410-422.

72. Kaprelyants, A. S. & Kell, D. B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol 59, 3187-3196.

73. Kaprelyants, A. S. & Kell, D. B. (1993). The use of 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride and flow-cytometry for the visualization of respiratory activity in individual cells of Micrococcus luteus. J Microbiol Meth 17, 115-122.

74. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V. & Kell, D. B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Lett 115, 347-352.

75. Keer, J. , Smeulders, M. J. , Gray, K. M. & Williams, H. D. (2000): Mutants of Mycobacterium smegmatis impaired in stationary-phase survival. Microbiology 146, 2209-2217.

76. Keer, J., Smeulders, M. J. & Williams, H. D. (2001). A purF mutant of Mycobacterium smegmatis has impaired survival during oxygen-starved stationary phase. Microbiology 147, 473-481.

77. Keilin (1959). The problem of anabiosis or latent life: history and current concept. Proc. R. Soc. Biol. 150, 149-191.

78. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S. & Grafen, A. (1995). Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria. Trends Ecol Evol 10, 126-129.

79. Kell, D. B., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R. & Barer, M. Ri (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek 73, 169-187.

80. Khomenko, A. G., and Golyshevskaya, V. I. (1984). Filterable forms of Mycobacterium tuberculosis. Z Erkrank Atm-Org, 162,147-154.

81. Kjelleberg, S., Albertson, N., Flardh, K., Holmquist, L., Jouper-Jaan, A., Marouga, R., Ostling, J., Svenblad, B. & Weichart, D. (1993). How do non-differentiating bacteria adapt to starvation? Antonie Van Leeuwenhoek 63, 333-341.

82. Klieneberg-Nobel, E. (1951). Filterable forms of bacteria. Bacterid. Rev. 15, 77-103.

83. Koch, A. L. (1993). Biomass growth rate during the prokaryote cell cycle. Critical Reviews in Microbiology 19, 17-42.

84. Kogure, K., Simidu, U. & Taga, N. (1979). A tentative direct method for counting living marine bacteria. Can. J. Microbiol. 25, 415-420.

85. Kolter, R. (1992). Life and death in stationary phase. Features 58, 75-79.

86. MacDonell, M. T. & Hood, M. (1982). Isolation and characterization of ultramicrobacteria from a gulf coast estuary. Appl. Environ. Microbiol. 43, 566-571.

87. Marshall (1988). Adhesion and growth of bacteria at surfaces in oligotrophic habitats. Can. J. Microbiol. 34, 503-506.

88. Marthi, B., Shaffer, B., Lighthart B & Ganio, L. (1991). Resuscitation effect of catalase on airborne bacteria. Appl.Environ.Microbiol. 57, 2775-2776.

89. Martin, S. J., Green, DR. & Cotter, T. G. (1994). Dicing with death: dissecting the components of the apoptosis machinery. Trends in Biochemical Sciences 19, 26-30.

90. Mason, Bryers & Hamer (1986). Activity, death and lysis during microbial growth in a chemostat. Chem. Eng. Commun. 45, 163-176.

91. Massa, Vinals & Farias (1988). Influence of unsaturated fatty acids membrane components on sensitivity of an Esherichia coli fatty acid auxotroph to conditions of nutrient depletion. Appl. Environ. Microbiol. 54, 674-684.

92. Matin (1992). Physiology, molecular biology and applications of the bacterial starvation response. J. Appl. Bacterid. 73, 49-57.

93. Matin, A. (1990). Molecular analysis of the starvation stress in Escherichia coli. FEMS Microbiology Ecology 74, 185-195.

94. McCune, R: M., Feldmann, F. M., Lambert, H. P. & McDermott, W. (1966). Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J. Exp. Med. 123, 445-468.

95. McKay, A. (1993). The effect of temperature on culturability and detection Listeria innocua in water. Lett. Appl. Microbiol. 17, 185-187.

96. Medlar, E M. (1952). Survival of bacilli in tuberculous lesions. Am Rev Tuberc 66, 381-2.

97. Mehta, J. & Dutt, A. (1995). Tuberculosis in the eldery. Infect.Med. 12, 40-46.

98. Mink, Patterson & Hespell (1982). Changes in viability, cell composition and enzyme levels during starvation of continuously cultured (ammonia limited) Selemonas ruminantium. Appl. Environ. Microbiol. 10, 913-922.

99. Morgan, J. A., Clarke, K. J., Rhodes, G. & Pickup, R. W. (1992). Non-culturable Aeromonas salmonicida in lake water. Microb Releases 1, 71-8.

100. Morita (1982). Starvation-survival of heterotrophs in the marine environment. Adv. Microb. Ecol. 6, 117-198.

101. Morita, R. Y. (1990). The starvation-survival state of microorganisms in nature and its relationship to bioavailable energy. Experientia 46, 813-817.

102. Morris, J. G. (1993). Bacterial shock responses. Endeavour 17, 2-6.

103. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S. & Kell, D. B. (1995). Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek 67, 289-95.

104. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A: S., Kell, D; B: & Young, M. (2003). Adoption of the transiently non-culturable state a bacterial survival strategy? Adv Microb Physiol 47, 65-129.

105. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S., Young, D. I., Young, M; & Kell, D B. (1998). A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sci USA 95, 8916-8921.

106. Mukamolova, G. V., Kormer, S. S., Yanopolskaya, N. D. & Kaprelyants, A. S. (1995). Properties of dormant cells in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus during prolonged incubation. Microbiology 64, 284-288.

107. Mukamolova, G. V., Turapov, O. A., Kazaryan, K., Telkov, M/, Kaprelyants, A. S., Kell, D. B. & Young, M. (2002). The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol Microbiol 46, 611-621.

108. Mukamolova, G. V., Yanopolskaya, N. D., Kell, D. B. & Kaprelyants, A. S. (1998). On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie van Leeuwenhoek 73, 237-243.

109. Mulvey, M. R. , Switala, J. , Borys, A. & Loewen, P. C. (1990). Regulation of transcription of katE and katF in Escherichia coli. Journal of Bacteriology 172, 6713-6720.

110. Munro, P., Gauthier, M., Breittmayer, V. & Bongiovanni, J. (1989). Influence of osmoregulatiopn processes on starvation survival of Esherichia coli in seawater. Appl. Environ.Microbiol. 55, 20172024.

111. Nguyen, L., Jensen, D., Thompson, N., Gentry, D. & Burgess, R. (1993). In vitro functional characterization of overproduced Esherichia coli katF/rpoS gene product. Biochemistry 32, 1111211117.

112. Nilsson, L., Oliver, J. D. & Kjelleberg, S. (1991). Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state. Journal of Bacteriologyl73, 5054-5059.

113. Nystrom, Albertson, Flard & Kjelleberg (1990). Physiological and molecular adaptation to starvation andrecovary from starvation by marine Vibrio sp.\A. FEMS Microbiol. EcoL 74, 129-140.

114. Nystrom, T. & Neidhardt, F. C. (1994). Expression and role of the universal stress protein, UspA, of Escherichia coli during growth arrest. Mol. Microbiol. 11, 537-544.

115. Oliver, J. D. (1995). The viable but non-culturable state in the human pathogen Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol Lett 133, 203-8.

116. Oliver, J. D., Nilsson, L. & Kjelleberg, S. (1991). Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2640-2644.

117. Orme, I. (1988). A mouse model of the recrudescence of latent tuberculosis in the elderly. Am.Rev.Respir.Dis. 137, 716-718.

118. Orme, I. (1995). Mechanisms underlying the increased susceptibility of aged mice to tuberculosis. Nutr.Rev. 53(Suppl.), S35-S40.

119. Osterman, I: (1985). Chromatography of proteins and nucleic acids. Moscow: Nauka.

120. Ostling, J., McDougald, D., Marouga, R. & Kjelleberg, S. (1997). Global analysis of physiological responses in marine bacteria. Electrophoresis 18, 1441-1450.

121. O'Toole, R;, Smeulders, M. J., Blokpoel, M. C., Kay, E. J., Lougheed, K. & Williams, H. D. (2003). A two-component regulator of universal stress protein expression and adaptation to oxygen starvation in Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 185, 1543-54.

122. Parrish, N. M. , Dick, J. D. & Bishai, W: R. (1998); Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol 6, 107-112.

123. Paszko-Kolva, C., Shahamat; M. & Colwell, R. (1992). Long-term survival of Legionella pneumophila serogroup 1 under low-nutrient conditions and associated morphological changes. FEMS Microbiol.Ecology 102, 45-55.

124. Poolman, Smid, Veldkamp & Konings (1987). Bioenergetic consequences of lactose starvation for continuously cultured Streptococcus cremoris. J. Bacteriol. 169, 1460-1468.

125. Postgate, J. & Hunter, J. (1964). Accelerated death of Aerobacter aerogenes starved in the presence of growth-limiting substrate. J.Gen.Microbiol. 34, 459-473.

126. Postgate, J. R., and Hunter, J.R. (1962). The survival of starved bacteria. J. Gen. Microbiol. 29, 233267.

127. Postgate, J. R. (1967). Viability measurements and the survival of microbes under minimum stress. Advances in Microbial Physiology 1, 1-23.

128. Postgate, J. R. (1976). Death in macrobes and microbes. Symp. Soc. Gen. Microbiol. 26, 1-18.

129. Ramaiah, N., Ravel, J., Straube, W. L., Hill, R. T. & Colwell, R. R. (2002). Entiy of Vibrio harveyi and Vibrio fischeri into the viable but nonculturable state. J .Appl; Microbiol. 93, 108-116.

130. Ray, B. (1979). Methods to detect stressed microorganisms. J.Food Prot. 42, 346-355.

131. Reeve, Amy & Matin (1984). Role of protein synthesis in the survival of carbon starved Esherichia coli K-12. J. Bacterid. 160, 1041-1046.

132. Rollins, D. M. & Colwell, R. R. (1986). Viable but nonculturable stage of Campylobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment. Appl. Environ. Microbiol. 52, 531-538.

133. Rose, A. S., Ellis, A. E. & Munro, A. L. (1990). Evidence against dormancy in the bacterial fish pathogen Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida. FEMS Microbiol Lett 56, 105-7.

134. Roszak, D. B. & Colwell, R. R; (1987). Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count. Appl Environ Microbiol 53, 2889-93.

135. Roszak, D.'B: & Colwell, R. R. (1987). Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol. Rev. 51, 365-379.

136. Roszak, D. B. , Grimes, D. J. & Colwell, R. R. (1984); Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems. Can. J. Microbiol. 30, 334-338.

137. Sak, B., Eisenstark, A: & Touati; D. (1989); Exonuclease 3 and the catalase hydroperoxidase 2 in Esherichia coli are both regylatedby katF gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3271-3275.

138. Schultz, Latter & Matin (1988). Differential regulation of cyclic AMP of starvation protein synthesis in Esherichia coli. J. Bacterid. 170, 3903-3909.

139. Sever, J. & Youmans, G. (1957). Enumeration of viable tubercle bacilli from the organs of nonimmunized and immunized mice. AmRev.Tuberc.Pulm.Dis. 101, 193-202.

140. Shahamat, M., Mai, U., Paszko-Kolva, C., Kessel, M. & Colwell, R. R. (1993). Use of autoradiography to assess viability of Helicobacter pylori in water. Appl. Environ. Microbiol. 59, 1231-1235.

141. Shi, Y., Glynn,- J., Guilbert, L., Cotter, T., Bissnette, R. & Green, D. (1992). Role for c-myc in activation-induced apoptotic cell death in T-cell hybridomas. Science 257, 212-214.

142. Siegele, D. A. & Kolter, R. (1992). Life after log. Journal of Bacteriology 174, 345-348.

143. Signoretto, C., del Mar Lleo, M. & Canepari, P. (2002). Modification of the peptidoglycan of Escherichia coli in the viable but nonculturable state. Curr Microbiol 44, 125-31.

144. Signoretto, C., del Mar Lleo, M., Tafi, M. C. & Canepari, P. (2000). Cell wall chemical composition of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. Appl Environ Microbiol 66, 1953-9.

145. Singh, A. & McFeters, G. (1990). Injury of enteropathogenic bacteria in drinking water. In Drinking water microbiology, pp. 368-379. Edited by M. G. A. New York: John Wiley.

146. Smeulders, M. J., Keer, J., Speight, R. A. & Williams, H. D. (1999). Adaptation of Mycobacterium smegmatis to stationary phase. Journal of Bacteriology 181, 270-283.

147. Snapper, S., Melton, R., Kieser, T. & Jacobs, W. R. (1990). Isolation and characterisation of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis. Mol. Microbiol. 4, 1911-1919.

148. Solomon, J. M., Magnuson, R., Srivastava, A. & Grossman, A. D. (1995). Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes & Development 9, 547-558.

149. Spector, M. (1990). Gene expression in response to multiple nutrient starvation conditions in• Salmonella typhimurium. FEMS Microbiol. Ecol.74, 175-184.

150. Spector, M. & Cubitt, C. (1992). Starvation-inducible loci in Salmonella typhimurium: Mol, Microbiol. 6, 1467-1476.

151. Spector, M. P. (1998). The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv. Microb. Physiol. 40, 233-279.

152. Stevenson, L. (1978). A case of bacterial dormancy in aquatic systems. Microbiol. Ecol. 4, 127-133.

153. Stock, A. M., Robinson, V. L. & Goudreau, P. N. (2000). Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem 69, 183-215.

154. Strom & KaasenI (1993). Trehalose metabolism in Escherichia coli: stress protection and stress regulation of gene expression. Mol Microbiol 8, 205-210.

155. Sun, Z. & Zhang, Y. (1999). Spent culture supernatant of Mycobacterium tuberculosis H37Ra improves viability of aged cultures of this strain and allows small inocula to initiate growth. J Bacteriol 181,7626-7628.

156. Sussman & Halvorson (1966). Spores, their dormancy and germination. Harper and Row, New York, NY.

157. Tkachenko & Nesterova (2003). Polyamines as modulators of gene expression under oxidative stress in Escherichia coli: Biochemistry (Mose) 68, 850-856.

158. Tormo, A., Almiron, M. & Kolter, R. (1990). surA, an Escherichia coli gene essential for survival in stationary phase. J Bacteriol 172, 4339-47.

159. Torrella, F. & Morita, R. (1981). Microcultural study of bacterial size changes and microcolony and ; ultramicrocolony formation by heterotrophic bacteria in seawater. Appl. Environ. Microbiol. 41, 518527.

160. Tsai, Aladegbami & Vela (1979). Phosphate-limited culture of Azotobactervinelandii. J. Bacteriology 139,639-645.

161. Turpin, P. E!, Maycroft, K. A., Rowlands, C. L. & Wellington, E. M.' (1993). Viable but non-culturable salmonellas in soil. J Appl Bacteriol 74, 421-7.

162. Wayne, L. G. (1976). Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions. Am Rev. Respir. Dis. 114, 807-811.

163. Wayne, L. G. (1994): Dormancy of Mycobacterium tuberculosis and latency of disease. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 13, 908-914:

164. Wayne, L. G. & Hayes, L. G. (1996). An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium; tuberculosis through 2 stages of nonreplicating persistence: Infect Immun 64, 20622069.

165. Wayne, L. G. & Salkin, D. (1956). The bacteriology of resected tuberculous pulmonary lesions. I: The effect of interval between reversal of infectiousness and subsequent surgery. American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases 74, 376-387.

166. Wayne, L. G. & Sohaskey, C. D. (2001). Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol 55, 139-63.

167. Wayne, L. G. & Sramek, H. A. (1994). Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob. Agents Chemother. 38, 2054-2058.

168. Weichart, D., Oliver, J; D. & Kjelleberg, S. (1992). Low temperature induced non-culturability and killing of Vibrio vulnificus. FEMS Microbiol. Lett. 79, 205-210.

169. Wilson, M. & Lindow, S. E. (1992). Relationship of total viable and culturable cells in epiphytic populations of Pseudomonas syringae. Appl Environ Microbiol 58, 3908-13.

170. Winding, A., Binnerup, S. & Sorensen, J. (1994). Viability of indigenous soil bacteria assayed by respiratory activity and growth. Appl.Environ.Micribiol. 60, 2869-2875.

171. Wyllie, A. (1992). Apoptosis and the regulation of cell numbers in normal and neoplastic tissues: an overview. Cancer and Metastasis 11, 95-103.

172. Yamamura, Y., Walter, A: & Bloch, H: (1960); Bacterial populations in experimental murine tuberculosis. 1. Studies in normal mice. J: Infect.Dis. 106, 211-222.

173. Yuan, Y., Crane, D. D. & Barry III, C. E. (1996). Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: function of the mycobacterial alpha-crystallin homolog. J Bacteriol 178, 4484-4492.

174. Zhang, Y:, Yang, Y., Woods, A;, Cotter, R. J. & Sun, Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides. Biochem Biophys Res Commun 284, 542-547.

175. Zimmerman, R., Itturriaga, R. & Becker-Birck, J. (1978). Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number there of involved in respiration. Appl. Environ. Microbiol. 36, 926-935.

176. Благодарю всех друзей и коллег за поддержку и внимание к моей работе.