Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов действия белка Rpf - фактора реактивации покоящихся форм актинобактерий

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов действия белка Rpf - фактора реактивации покоящихся форм актинобактерий"

На правах рукописи

Никитушкин Вадим Дмитриевич

механизмов действия белка [^-фактора реактивации покоящихся форм актинобактерий

специальность: 03.01.04 - биохимия

2 С ОКТ 2011

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2011

4857555

4857555

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук,

профессор

А.С. Капрельянц

доктор биологических наук,

профессор

Д.И.Левицкий

доктор биологических наук С. Г. Игнатов

Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН

Защита состоится «17» ноября 2011 г. в 14 часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан «07» октября 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Способность бактерий переживать неблагоприятные условия среды является важным фактором в организации их устойчивости и патогенности. Бактерии, находящиеся в состоянии покоя, характеризуются низкой метаболической активностью, морфологическими изменениями формы, утолщением клеточной стенки, а также отсутствием роста на типичных питательных средах и неспособностью формировать колонии. Поскольку клетки в данном состоянии проявляют низкую метаболическую активность, покоящиеся формы М.tuberculosis устойчивы к антибиотикам, что является предпосылкой развития хронической туберкулезной инфекции в организме хозяина. Согласно распространенной точке зрения, латентная форма туберкулеза связана со способностью бактерии-возбудителя Mycobaterium tuberculosis (МТБ) переходить в особое физиологическое состояние - состояние покоя, сходное со спорообразованием. Предполагается, что покоящиеся формы МТБ могут реактивироваться в тканях хозяина, с образованием активно делящихся клеток. Ранее в нашей лаборатории были обнаружены секретируемые бактериями белки (семейство Rpf - resuscitation promoting factor), которые способствовали выходу ряда актинобактерий, в том числе МТБ, из состояния покоя. Ген гр/секвенирован и клонирован, рекомбинантный белок экспрессирован в E.coli. Изучение структуры одного из пяти Rpf Mycobacterium tuberculosis (RpfB) методами ЯМР высокого разрешения и рентгеноструктурного анализа [Ruggiero et al., 2009], а также ее сопоставление с рядом известных структур показало, что консервативный домен Rpf имеет лизоцимо-подобный фолд, что было подтверждено экспериментально [Cohen-Consaund et al., 2004]. С другой стороны, RpfB также проявляет гомологию по отношению к ряду литических трансгликозилаз Е. coli (Slt35, Slt70). Действительно, экспериментально было доказано, что Rpf является ферментом, проявляющим литическую активность по отношению к препарату клеточных стенок M.luteus. Однако, несмотря на длительное изучение этих белков, механизмы, лежащие в основе реактивирующего действия Rpf, до сих пор остаются неясными.

Имеющиеся данные позволяют предположить, что экспериментально обнаруженный ферментативный гидролиз пептидогликана под действием Rpf является важным звеном в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий. Но возникает вопрос, каким образом связаны оба процесса -гидролиз пептидогликана клеточной стенки и реактивация. На момент начала исследования не существовало четкой гипотезы, объясняющей механизм действия Rpf. Мы предположили, что, во-первых, Rpf может способствовать изменениям в структуре клеточной стенки, предположительно, преодолевая механические затруднения, препятствующие клеточному делению. Альтернативная гипотеза заключается в том, что в процессе гидролиза пептидогликана, Rpf высвобождает низкомолекулярные сигнальные молекулы, передающие сигнал как на саму

з

клетку, так и на соседние клетки, действуя на поверхностный клеточный рецептор. В ходе данной работы были проведены исследования для проверки обеих гипотез.

Одним из эффективных подходов к изучению ферментативной активности является ингибиторный анализ, посредствам которого возможно изучение механизма действия и, соответственно, изучение механизмов реактивации микобактерий. Однако до последнего времени не сообщалось о существовании химических соединений - ингибиторов Яр^ В ходе данной работы был изучен ряд химических соединений, проявляющих ингибирующую активность по отношению к Ир^' подобные соединения могли бы стать основой для создания лекарственных препаратов нового поколения с антитуберкулёзной активностью.

Цели и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе ферментативной и биологической активностей в частности - роли в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Поиск низкомолекулярных соединений с потенциальной ингибирующей активностью относительно Яр^ Изучение механизма взаимодействия со специфическими ингибиторами.

2. Изучение влияния белка на агрегационную способность клеток актинобактерий.

3. Изучение пептидогликангидролазной активности по отношению к микобактериям.

4. Определение роли продуктов (^-опосредованного гидролиза микобактериального пептидогликана в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

Научная новизна. Разработаны модели для скрининга низкомолекулярных соединений - потенциальных ингибиторов молекулы Яр^ Впервые найден класс соединений - нитрофенилтиоцианатов (НФТ), способных ингибировать как энзиматическую, так и биологическую активность Яр^ Изучено взаимодействие НФТ с белком-мишенью Яр^ определены кинетические параметры ингибирования. Установлена зависимость влияния структуры НФТ на оказываемый ими ингибирующий эффект. Доказана роль белка в процессе дезагрегации крупных бактериальных агрегатов, образуемых в состоянии покоя. Показана гидролитическая активность Яр^ на препаратах пептидогликана клеточных стенок микобактерий. Впервые обнаружен стимулирующий эффект фрагментов пептидогликана (ФПГ), образуемых в процессе гидролиза под действием (^ на процесс реактивации покоящихся клеток микобактерий. Сформулирована гипотеза о возможном молекулярном механизме действия белков семейства Яр^

Практическая значимость. Обнаружение ингибиторов класса НФТ, эффективных по отношению к ферментативной и биологической активности белка Rpf, позволяют рассматривать НФТ в качестве перспективных антитуберкулёзных препаратов, направленных на подавление реактивации латентных форм туберкулёза. Установленные эффекты влияния Rpf на бактериальную агрегацию в условиях покоя, а также доказанная роль ФПГ в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий важны в понимании механизмов, лежащих в основе перехода латентных форм туберкулеза в активные формы, что, в конечном итоге, позволит разработать новые эффективные методы борьбы с этим заболеванием.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (185 ссылок). Диссертация содержит 155 страниц печатного текста, включает 66 рисунков иЭтаблиц.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих российских и международных конференциях: III научно-практическая конференция «Перспективы развития инноваций в биологии», 11 - 13 ноября 2009 года, Москва, биологический факультет МГУ; Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnostics, May 24-25, 2010 Moscow (NIAID, ISTC); European Student Conference on Microbial Communication, September 28th - October 1st; Jena, Germany;

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.1. Объект исследований

В качестве объекта исследований использовали рекомбинантную трункированную форму белка Rpf (М.1и1еи$) - Rpfl-9з. Белок хранился при 4°С в течение месяца без потери активности. В случае длительного хранения наблюдалось образование агрегатов, линейные размеры которых превышают 50 нм, что соответствует образованию высокомолекулярных агрегационных белковых комплексов с молекулярной массой более 100 кДа (Рис. 1). При этом препарат терял активность, поэтому в работе использовали Кр^ хранившийся при 4°С не более одной недели

а)

б)

РисЛ.Микрофотографии, рекомбинантного белка Rpfl g3 (М. luteus), полученные методом атомно-силовой микроскопии, а) исходный препарат; б) препарат белка - хранение месяц.

1.2. Скрининг веществ - ингибиторов ферментативной активности Rpf.

В подборе возможных ингибиторов ферментативной активности Rpf мы руководствовались совокупностью знаний о природе белка. Как известно, гидролитические ферменты вовлечены в процесс прорастания спор; так, литические трансгликозилазы (класс ферментов, структурно сходных с Rpf) активируют прорастание эндоспор. Недавно синтезирован новый класс химических соединений - нитрофенилтиоцианатов (НФТ), ингибирующих процесс прорастания грибных спор (в частности, гриба Aspergillus), что дало возможность предположить существование вероятного ингибирующего действия этих веществ по отношению к гидролазам клеточной стенки, в частности к Rpf. Известно, что НФТ являются производными орто-нитродиалкилдитиокарбаматов - соединений, с доказанной антимикробной активностью.

Для первичного скрининга низкомолекулярных соединений использовали два экспериментальных подхода.

Первый подход основан на ранее обнаруженной способности рекомбинантного белка Rpf гидролизовать искусственный субстрат 4-метилумбеллиферил^-0,1\|,1М',М"-триацетилглюкозамин (4-MUF-3NAG) с высвобождением флюорогенного продукта реакции 4-метилумбеллиферона.

Второй подход основан на необходимости гена rpf у М.luteus для роста культуры. Оценивали способность НФТ подавлять рост культуры М.luteus. Эти два подхода позволили отобрать ряд соединений с максимальным ингибирующим эффектом по отношению к Rpf (Таблица 1).

Таблица 1. Влияние НФТ на муралитическую активность Rpfu на рост

культуры М. luteus

Соединение Название 1С50 реакции гидролиза субстрата 4- миг-зыла, цМ Минимальная концентрация подавления роста М. 1и1еи$, цМ

1 4-мето кси-5-н итро-6-тиоцианатопиримидин 25.0 + 8.0 Не ингибирует

2 4-изопропиламино-5-нитро-6-тиоцианатопиримидин Не ингибирует Не ингибирует

3 <¿c¿> 1,5-динитро-2,4-дитиоцианатобензол 4,2 + 2.8 17.7

4 >lc¿> 2-нитро-1-тиоцианато-4-трифторметилбензол 21,3 + 5,6 20,2

5 З-нитро-4-тиоцианатобензонитрил 25,4 + 5,4 4,9-24,4

6 4-ацетил-2-нитрофенилтиоцианат 9,9 + 5,8 22,5

7 аЧх> 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианат 6,6 + 3,1 3,5-17,6

8 <03^ З-нитро-4-тиоцианатобензойная кислота Не ингибирует Не ингибирует

9 Метиловый эфир З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты 23,5 + 6,3 21,0-42,0

10 Этиловый эфир З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты 10,3 + 4,4 39,8

1.3. Кинетика ингибирования нитрофенилтиоцианатами

Построение кинетических кривых ингибирования ферментативной реакции гидролиза 4-М11Р-3-МА6 в присутствии в координатах Лайнуивера - Берка позволило установить неконкурентный тип ингибирования муралитической активности (Рис. 2).

ЗЕ+11

2Е+11 -

^ 1Е+11

¿И

-8.Е+05 -4.Е+05 0.Е+00 4.Е+05

х/^ьм-1

8.Е+05

Рис.2. Ингибирование 4-бензоил-2-нитрофенил тиоцианатом ферментативной реакции гидролиза искусственного субстрата 4-МиР-3-ЫАв белком Яр/. Реакция проводилась в отсутствие [О), и в присутствии ингибитора: П-1,76цМ; - 3,52 цМ; X - 17,в цМ;

Для того, чтобы исключить неспецифичность действия НФТ (деградация, денатурация белка), изучали спектры кругового дихроизма Rpf в присутствии ингибиторов. Характер полученных кривых показал отсутствие влияния ингибитора на организацию элементов вторичной структуры белка (Рис. 3)

£ Б

* I

ь о

I ?

т о

ГО СГ

5 ™

л о.

с; >-

ш """

£

60 у

50 4 40 4 30 -г, 20 -10 -0

-20 --30 ■■ -40 --50 ■■

4-

10 И в ( 205 215 225/''235 24^м

Рис.3. Влияние 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианата на вторичную структуру белка /?р/. Приведены спектры КД Яр/ в отсутствие НФТ (О) и в присутствии НФТ: 7,0 цМ и -14,0 цМ

1.4. Изучение взаимодействия нитрофенилтиоцианатов с методом тушения собственной флуоресценции белка

Присутствие в молекуле аминокислотных остатков триптофана позволило провести анализ взаимодействия нитрофенилтиоцианатов с белком методом тушения собственной флуоресценции белка. Добавление одного из эффективных ингибиторов 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианата привело к значительному тушению собственной флуоресценции Характер кривой указывает на

гетерогенный тип тушения, с различной степенью доступности остатков триптофана по отношению к ингибитору (Рис.4а). Тушение нескольких типов флуорофоров, один из которых недоступен для тушителя, можно проанализировать, используя модифицированную форму уравнения Штерн -Фольмера

_ 1 1 /.ВД] /а

гдеРоИР - относительные величины интенсивности флуоресценции, соответственно, в отсутствие и в присутствии молекулы - тушителя; [0]-концентрация тушителя флуоресценции и К,- константа тушения Штерн-Фольмера; /„ - доля начальной флуоресценции, доступная для тушения. Построение графической зависимости в модифицированных координатах Штерн-Фольмера (Рис.46) позволило нам рассчитать доступную для тушения фракцию триптофанов. Анализ полученной зависимости показал, что доступная фракция (/о) триптофанов молекулы для 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианата

составляет около 65 %. Эти данные сравнили с результатами эксперимента по тушению йодидом калия, который тушит только экспонированные остатки триптофанов (Рис. 4в,г). Аналогично НФТ, тип тушения оказался гетерогенным. Однако расчеты показали, что доступная фракция (/„) триптофанов в данном случае составляет 40 %. Поскольку известно, что молекула содержит пять остатков Тгр, то 65% доступности для 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианата соответствует трем остаткам Тгр. 40% доступности для йодида калия соответствует двум экспонированным остаткам Тгр, расположенным на поверхности белка. Результаты обоих экспериментов позволяют предположить, что молекула ингибитора взаимодействует с двумя поверхностными остатками Тгр и одним, расположенным внутри молекулы. Следует также отметить, что эксперименты, проведенные по тушению флуоресценции белка в присутствии 3-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты показали доступность лишь двух остатков Тгр для взаимодействия с этим соединением. Полученные результаты однозначно свидетельствуют о наличии взаимодействия нитрофенилтиоцианатов с белком-мишенью Лр^

Анализ опубликованной кристаллической структуры белка (РОВ ЗЕ05) позволяет предположить, что нитрофенилтиоцианаты, не имеющие

отрицательного заряда, взаимодействуют с остатками Тгр 349 и 285, которые располагаются на поверхности белковой молекулы, и с одним из «погруженных остатков» - 297, 316 или 352. Поскольку остатки Тгр-316 и Тгр-297 располагаются близко, то их доступность для взаимодействие с молекулой тушителя будет аналогична, соответственно мы предполагаем, что с молекулой НФТ взаимодействуют не эти два остатка, а остаток Тгр-352, который располагается в каталитическом центре В пользу этого предположения также свидетельствует высокая степень гидрофобности каталитического сайта, что и объясняет способность гидрофобных нитрофенилтиоцианатов взаимодействовать с каталитическим центром и ингибировать каталитическую функцию Данное предположение также объясняет причину малой эффективности З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты как ингибитора

6)

2.6

О.ООЕ+ОО 1.00Е-05 2.00С-05 3.00Е-05

ОООЕчОО 4.00Е+05 8.00С-»05 1.20Еч06

[НФТ], м

1/[НФТ], М'1

В)

Г)

1.5 т

14 -г

1 -1-1-1

О.ОЕ+ОО 5.0Е-02 1.0Е-01 1.5Е-01

О 40

50

100

[юьм

1Ш, м-1

Рис.4. Тушение собственной флуоресценции белка Яр/, \)овбУждения=280 нм; А„спускания=340 нм а), б) 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианатом; в), г) раствором йодида калия;

Испускания'

Поскольку активный центр Rpf несет отрицательный заряд, отрицательно заряженная кислота не способна взаимодействовать с активным центром белка. Согласно опубликованным данным [Ruggíero et al., 2007], каталитический домен Rpf также заряжен отрицательно, что является существенным препятствием для связывания ингибитора с каталитическим сайтом белка.

1.5. Способность НФТ ингибировать процесс реактивации покоящихся

форм микобактерий

Поскольку известно, что основная функция Rpf заключается в реактивации покоящихся форм микобактерий, был проверен эффект влияния НФТ на этот процесс. Большинство НФТ в разной степени проявили ингибирующий эффект по отношению к реактивации покоящихся форм М. smegmatis (за исключением нитрофенилтиоцианатов пиримидинового ряда и З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты) (Рис.5).

1.Е+08 -

s

5

ra 1.Е+06 -m s Е

5 1.Е+04 -а» а.

i 1.Е+02 -J

s 1 £+00 -/

Рис.5. Влияние НФТ на процесс реактивации покоящихся форм М. smegmatis. (1) - 4-метокси-5-нитро-б-тиоцианатопиримидин; (2) - 4-изопропиламино-5-нитро-6-тиоцианатопиримидин; (3) - 1,5-динитро-2,4-дитиоцианатобензол; (4)- 2-нитро-тиоцианато-4-трифторметилбензол; (5) -З-нитро-4-тиоцианато-бензонитрил; (6) - 4-ацетил-2-нитрофенол тиоцианат; (7) - 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианат; (8) - З-нитро-4-тиоцианатобензойная кислота; (9) - метиловый эфир З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты; (10) - этиловый эфир З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты. Индекс реактивации - соотношение количества реактивирующихся клеток, измеренных методом НВЧ, к общему количеству засеянных клеток (КОЕ).

Наблюдаемый эффект ингибирования реактивации является концентрационно-зависимым (Рис.6)

1.Е+08 1

5 5

Рис. 6. Влияние метилового эфира З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты на процесс реактивации М. БтедтаНь из состояния покоя. Концентрационная зависимость.

1.Е+06 -

г Е

* ^ 1.Е+02 -

1.Е+04 -

I

1.Е+00

контроль 0.5 2 4 20 [1],цМ

Наиболее эффективные соединения - 1,5-динитро-2,4-бис-тиоцианатобензол, 2-нитро-тиоцианато-4-трифторметилбензол, 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианат и метиловый эфир З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты проявляли свою активность в диапазоне концентраций 4,0-20 цМ.

Таким образом, продемонстрирована корреляция между ингибированием ферментативной активности и подавлением его биологической активности. Уникальная способность НФТ подавлять, или, по меньшей мере, замедлять процесс реактивации, позволяет считать данные соединения перспективными для создания лекарственных веществ нового поколения, направленных на подавление реактивации латентных форм туберкулёза.

2. Изучение механизмов действия белка в процессе реактивации

2.1. Гипотеза 1. Роль Rpf в разрушении клеточных агрегатов покоящихся форм актинобактерий

Несмотря на десятилетнее изучение белка Яр^ механизм его действия остается неизвестным. Обнаружение ферментативной (пептидогликангидролазной активности) дает основание для формулирования гипотез, которые можно проверить экспериментально. Было замечено, что при переходе активных культур актинобактерий в состояние покоя происходит агрегация клеток. Очевидно, в фазе реактивации такие агрегаты распадаются. Предположительно, именно секреция ответственна за распад агрегатов, что необходимо для

стимулирования роста культуры. Экспериментальная проверка данного предположения с использованием метода динамического светорассеяния (01_Б) подтвердила непосредственное участие в разрушении межклеточных

контактов агрегированных культур М.БтедтаИв и М.Ыеиз. Известно, что покоящиеся клетки М^тедтаНв в постстационарной фазе представлены протяженными агрегатами, что отличает их от клеток экспоненциальной фазы

покоящихся форм микобактерий

роста. На Рис. 7а. представлена гистограмма распределения клеток М. хшедто?« по размерам в условиях покоя, полученная методом 01_Б. Из приведенной гистограммы видно, что исходная культура состоит из различных по размеру агрегатов, большинство из которых представляют частицы с гидродинамическим радиусом 105 - 104 нм (средний радиус - 7.3-104нм). Введение в культуру рекомбинантного белка приводило к уменьшению содержания крупных

частиц и появлению частиц двух субпопуляций с радиусами 5.5-102 и 2.4-103 нм (0.55 и 2.4 мкм). Очевидно, частицы одной из субпопуляций соответствуют индивидуальным клеткам М^тедтаИэ (усредненный радиус около 2 мкм). Другая субпопуляция, содержащая мелкие частицы (0.5 мкм), возможно, содержит фрагменты клеточной стенки, образующиеся в процессе их частичного гидролиза под действием (Рис. 76).

б)

73 ткт 0.9-

0.8-

0.7-

0.6-

0.5-

0.4-

03-

02-

1 0.1-

1е+4 1е+6 1е+6

1п:егв £у СЯйлЬ (пт)

А ткт

1в+6 164-3

1ггетг^ О.хспЬ (пт)

Рис.7. Гистограмма распределения клеточных агрегатов М.зтедтайз в состоянии покоя до (а) и после добавления Яр/ (15 мкг/мл) (б). Приведен типичный результат измерения из 3 опытов

Обнаруженное диспергирующее действие является концентрационно-зависимым (Рис. 8)

Рис.8. Влияние экзогенного Ир/на содержание различных по размеру частиц в культуре М. БтедтаИБ: (♦) - частицы с радиусом порядка 10 мкм и больше; (■) - частицы с радиусом 1 -10 мкм; ( )- частицы менее 1 мкм.

Аналогичный эффект действия наблюдался для культуры М.Ыеиэ,

выращенной на богатой питательной среде (Рис. 9). Культура была представлена крупными клеточными агрегатами со средним гидродинамическим радиусом

о 5 10 15

Концентрация мкг/мл

3-Ю5 нм (300 мкм). При обработке белком Rpf происходило их разрушение до образования частиц с радиусами 0.7мкм (соответствуют единичным бактериям) и частиц с радиусом 8-10 мкм, что соответствует олигомерным агрегатам, содержащим до 10 клеток.

б)

1е+4 1ё+6 1е*8

1п1е»в11у Кйг^нйюп (пгп)

10 ткт

~1ткт 1 1

1е+6 1е+8

1тегиИу №№Ь (пт)

Рис.8. Гистограмма распределения клеточных агрегатов М. ЫеиБ до (а), и после добавления Ир} (15 мкг/мл) (б). Приведен типичный результат измерения из 3 опытов.

100

15

Рис.9. Влияние йр/ на содержание различных по размеру частиц в культуре М. ЫеиБ. (♦) - частицы с радиусом порядка 10 мкм и больше; (■) - частицы радиусом 1-10 мкм; ( ) - частицы менее 1 мкм.

о 5 ю

Концентрация ИрГ, мкг/мл

Полученные данные по влиянию на процесс дезагрегации были

подтверждены для обеих культур методом световой микроскопии, которая выявила способность в тех же условиях, что и в экспериментах методом 0Ц>, полностью разрушать протяженные клеточные агрегаты до образования единичных клеток (Рис. 10). Для проверки специфичности наблюдаемых эффектов под действием рекомбинантного белка были проведены

эксперименты с НФТ. Для этого к бактериальной культуре добавляли белок Яр? (15 мкг/мл) и ингибитор в концентрации 25 цМ. Клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°С. В качестве ингибитора использовали 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианат и З-нитро-4-тиоцианатобензойную кислоту в качестве отрицательного контроля.

Рис.Ю.Световая микроскопия агрегированных клеток

М. зтедта^Б (I) и М. /Меив (II) в состоянии покоя (а) и после инкубации с Йр/ (15 мкг/мл) в течение 36 часов (Ь). Увеличение в 1000 раз.

Присутствие 4-бензоил-2~нитрофенилтиоцианата ингибировало

дезагрегацию бактериальных агрегатов под действием Ир^ в то время как 3-нитро-4-тиоцианато бензойная кислота не влияла на этот процесс (Рис. 11). Отсутствие ингибирующего эффекта в случае применения З-нитро-4-тиоцианатобензойной кислоты объясняется наличием отрицательного заряда в его молекуле и ее неспособностью взаимодействовать с активным центром белка.

le+6 let-8

Intensity Oistrib Inm]

let-6 le+S

Intensity Distrlb (nm)

Intensity Distrlb (nm) Intensity Oistrib (nm)

Puc 11. Влияние нитрофенилтиоцианатов на эффект разрушения бактериальных агрегатов под действием белка Rpf (15 мкг/мл): влияние 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианата на агрегаты покоящихся форм M.smegmatis (А) и M.luteus (В); эффект З-нитро-4-тиоцианато бензойной кислоты на агрегаты M.smegmatis (Б) и M.luteus (Г). Концентрация ингибиторов-25 рМ.

Можно предположить, что агрегация клеток М. luteus важна для инициации роста бактериальной культуры в неоптимальных условиях роста. Клетки образуют агрегаты, которые позволяют им начать деление, возможно, за счет криптического роста в микрообъеме. В начале экспоненциального роста такие агрегаты распадаются и клетки размножаются в автономном режиме (Волошин с соавт., 2004]. Настоящее исследование позволяет предположить молекулярный механизм этапа распада агрегатов, связанного с действием белков семейства Rpf. Как известно, Rpf обладает активностью, стимулирующей рост бактерий. Отметим, что применяемые в данном исследовании концентрации Rpf для разрушения агрегатов на несколько порядков превышают таковые для активации покоящихся клеток и обнаруживаемые в культуральной жидкости при секреции их бактериями. Однако, если учесть микрообъемы в пределах агрегатов в лаг-фазе, то такие величины локальных концентраций могут быть достигнуты при обычной секреции белков Rpf в среду роста. Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют в пользу участия белков семейства Rpf в контроле межклеточных контактов у двух грамположительных бактерий и в процессе их реактивации из покоящегося состояния.

2.2. Гипотеза 2. Роль продуктов гидролиза пептидогликана под действием Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий

Поскольку Rpf является пептидогликангидролазой, то в процессе действия Rpf на клеточную стенку образуются низкомолекулярные фрагменты пептидогликана. Продукты гидролиза пептидогликана могут проявлять биологическую активность в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий. Для проверки этой гипотезы были проведены следующие эксперименты.

2.2.1. Действие Rpf на клеточную стенку микобактерий

Наблюдаемые явления разрушения клеточных агрегатов культур микобактерий могут свидетельствовать в пользу гидролитической активности белка Rpf. Однако непосредственное действие Rpf на пептидогликан (ПГ) микобактерий ранее не было исследовано. Была проверена возможность влияния экзогенно-добавляемого Rpf на препараты пептидогликана микобактерий - М. smegmatis и М. tuberculosis.

Гидролиз микобактериального пептидогликана под влиянием Rpf изучали флуориметрическим методом. С этой целью, препарат пептидогликана метили флюорогенным красителем флуоресцеинизотиоцанатом, инкубировали в присутствии Rpf, после центрифугирования определяли выход в супернатант флуоресцентно-меченых фрагментов ПГ (Рис. 12).

350 -i

Рис. 12. Влияние

рекомбинантного

белка Rpf на процесс гидролиза препарата микобактериального

пептидогликана (■) -М. smegmatis; (♦) -М. tuberculosis

о ю 20 30 40 Концентрация Rpf, мкг/мл

Увеличение концентрации рекомбинантного белка Rpf приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, причем интенсивность гидролиза клеточных стенок М. smegmatis в 3-4 раза выше, чем интенсивность гидролиза клеточных стенок М. tuberculosis, что можно объяснить более сложным строением пептидогликана клеточной стенки М. tuberculosis по сравнению с М. smegmatis (наличием большего числа ковалентных "сшивок" в матриксе пептидогликана и, следовательно, меньшей способностью к гидролизу). В связи с вышесказанным, очевидно, что белки семейства Rpf являются ферментами, участвующими в процессе гидролитической модификации клеточной стенки. Структурная аналогия Rpf по отношению к мурамидазам позволяет предположить, что в процессе гидролиза образуются фрагменты пептидогликана (ФПГ), которые проявляют биологический эффект в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий. В связи с этим, представляло интерес выделить смесь ФПГ и отдельные ФПГ для их проверки на биологическую активность.

2.2.2. Роль фрагментов пептидогликана (ФПГ) в процессе реактивации

Была разработана общая схема выделения и получения ФПГ. Микобактериальный пептидогликан гомогенизировали, инкубировали в присутствии Rpf сутки при 37°С и отделяли негидролизовавшийся пептидогликан центрифугированием, затем проводили тестирование как смеси ФПГК|Л так и отдельных фрагментов, выделенных методами хроматографии, на предмет стимуляции реактивации покоящихся клеток микобактерий в жидкой среде. В другом подходе ФПГУЗ получали неферментативно за счет разрушения пептидогликана ультразвуком. В этом случае отсутствуют этапы инкубации в течение 20 часов, и соответственно, необходимость удаления Rpf на афинной №-1МТА колонке.

Было установлено, что смесь продуктов ферментативного Rpf-гидpoлизa микобактериального пептидогликана (ФПГ) приводила к реактивации покоящихся клеток М. 5тедтаИ5. Причем, количество клеток, реактивирующихся под влиянием гидролизата пептидогликана, было сравнимо с количеством клеток,

покоящихся форм микобактерий

реактивирующихся под действием Rpf (Рис. 13а). Следует отметить, что ФПГ, полученные обработкой ультразвуком, также проявляют биологическую активность (вероятно, процесс разрушения приводит к формированию активных по отношению к культуре фрагментов). Но именно ФПГ, полученные после обработки Rpf, обладают максимальной реактивирующей активностью. Поскольку в состав клеточной стенки микобактерий входит арабиногалактан, действие этого компонента также было проверено на реактивирующую способность. Арабиногалактан не проявил биологического эффекта. Установленный эффект реактивации покоящейся культуры М. smegmatis оказался концентрационно-зависимым (Рис. 136). При исследовании концентрационной зависимости эффекта реактивации, был обнаружен, нелинейный характер зависимости (колоколообразный) с оптимумом реактивации -100 нг/мл. Природа такой зависимости до конца не ясна, но может быть объяснена эффектом ингибирования под действием избытка субстрата. Аналогичный эффект реактивации наблюдался при действии на культуру М. tuberculosis, находящуюся в состоянии покоя (Рис. 14а). В отличие от экспериментов, проводимых с М. smegmatis, оптимум реактивирующей активности, в этом случае, соответствует 200 нг/мл (Рис. 146)

s* 1.Е+04 s а-

f g 1.E+Q3 -i- ас

8 5 1.Е+02

X м 01 ■

5 X X

1.Е+01

1.Е+00

б)

S S я g ш s О £ í l.E+04 "

ra X w "rs l.E+02 -

X ш ai -1 Ч X

s 1.E+00 -

мкг/мл

Рис.13, а) Реактивация покоящихся клеток М^тедта^5 под действием: микобактериального супернатанта; йр/; смеси ФПГ, полученной гидролизом микобактериального пептидогликана под действием Яр/; пептидогликана, разрушенного ультразвуком (ФПГуз); арабиногалактана. б) Концентрационная зависимость степени реактивации культуры М^тедто?« в состоянии покоя от концентрации смеси ФПГЯр/.

а)

l.E+04

l.E+02

л*

6)

l.E+05

мкг/мл

Рис.14, а) Реактивация покоящихся клеток МЛиЬегсиЬзЫ под действием: микобактериального супернатанта; Ир/; смеси ФПГ, полученной гидролизом микобактериального пептидогликана под действием Яр/; арабиногалактана. 6) Концентрационная зависимость степени реактивации культуры МЛиЬегси/оБ/Б в состоянии покоя от концентрации смеси ФПГКр/.

ФПГ не только увеличивал число реактивирующихся клеток, но и стимулировал их рост в процессе реактивации (Рис. 15).

Рис.15. Стимуляция роста покоящихся клеток

М. tuberculosis в присутствии ФПГЯр/: ♦ - контроль (культура М. tuberculosis), ■ -200 нг/мл; - 2 мкг/мл; X -10 мкг/мл; >|< - 20 мкг/мл.

Для оценки состава ФПГ использовали метод гель-фильтрации на сефадексе G ISO. Данный метод позволил выделить два основных пика, составляющих смесь фрагментов клеточной стенки, полученных действием ультразвука, аналогичная картина разделения наблюдается для препарата ФПГУЗ (Рис. 16)

л

~70 кДа

5.03.5-

А

э 3.0 « 2.5-

2.0

1.0; 0.5: о;

Рис.16. Разделение смеси ФПГю на сефадексе в 150.

о

50

106 150 200 "250

Время выходя, мин

300

Тестирование биологической активности показало, что обе фракции - как высокомолекулярная (первый пик - 69-100 кДа), так и низкомолекулярная (0,9 - 3 кДа), проявляли способность реактивировать культуру М. втедтаИэ с максимумом индекса реактивации 9,1-Ю1 и 4,3-Ю2 соответственно. Этот вывод был подтвержден данными, полученными на диализованных препаратах ФПГ (>10 кДа). Диализ значительно не повлиял на максимальную реактивирующую способность исходного препарата по сравнению со смесью ФПГ, однако максимальный эффект реактивации достигался при концентрациях «диализного препарата» в 10 раз выше исходного. Это может означать то, что реактивация происходит как под действием высокомолекулярных, так и низкомолекулярных фрагментов -Рис.17.

Очевидно, что низкомолекулярные фрагменты более эффективны, чем высокомолекулярные. Нельзя исключить, что механизм действия этих фрагментов может различаться. Предположительно, высокомолекулярные фрагменты пептидогликана могут либо непосредственно взаимодействовать с рецепторами клеточной стенки, либо данные фрагменты могут являться субстратом для эндогенного Ир^ которой образует низкомолекулярные фрагменты в процессе инкубации. Первое предположение выглядит правдоподобным, если не принимать во внимание чрезвычайно низкую

х

Рис.17.Сравнение биологичекого эффекта реактивации покоящихся клеток М. зтедтай5 под влиянием ♦ - смеси ФПГуз, до диализа; ■ -диализованная смесь ФПГуз.

0.01 0.1 1 ю юо

Концентрация ФПГуз, мкг/мл

проницаемость клеточной стенки микобактерий, обусловленную плотным слоем миколовых кислот. Для проверки возможности второй гипотезы была проведена серия экспериментов, в которых использовался специфический ингибитор - 4-бензоил-2-нитрофенилтиоцианат, представитель класса нитрофенилтиоцианатов. Действием ультразвука получали смесь ФПГ и проверяли ее реактивирующую способность в присутствии и в отсутствие ингибитора (Рис. 18).

1.Е+03

5 г:

■з

ш 1.Е+02 -

II

го у

Ш т ?!

* 1.Е+01 =1

1.Е+00

контроль 0.01

Рис.18. Реактивация покоящихся клеток М-этедта^Б смесью ФПГуз Ш - в отсутствие ингибитора; Ш - в присутствии 4-бензоил-2-нитрофенил-тиоцианата.

0.1 0.5 ФПГуз,мкг/мл

Поскольку пептидогликан заранее был деструктурирован ультразвуком, то в смеси присутствовали как высокомолекулярные, так и низкомолекулярные ФПГ. Присутствие ингибитора не подавляло процесс реактивации. Однако если методом диализа выделить «высокомолекулярную фракцию», то эта фракция проявляет реактивирующую способность (Рис. 19). Присутствие специфического ингибитора Ир! полностью подавляет процесс реактивации (Рис. 19), что свидетельствует о том, что в эффекте реактивации под действием крупных фрагментов ФПГ участвует эндогенный Яр^ 1.Е+03

5 3"

з й

х О

I*

го у ш т

?!

X Й)

1.Е+02 -

1.Е+01

1.Е+00

контроль 0.075 0.37

ФПГу^мкг/мл

Рис.19. Реактивация

покоящихся клеток

М.зтедтаНь при добавлении диализованной смеси ФПГ (полученной действием ультразвука) ■ - в отсутствие ингибитора; ■ - в присутствии 4-бензоил-2-нитрофенил-тиоцианата.

Таким образом, высокомолекулярные ФПГ микобактерий являются, очевидно, субстратом для Яр^ а низкомолекулярные продукты гидролиза являются непосредственными сигнальными молекулами, запускающими процесс

реактивации. Смесь ФПГ, полученная воздействием Яр^ была разделена методом ВЭЖХ (Рис. 20).

N

10 20 30 18 «1 60 ~70 SO ЗД 100 110 "ТиП» МО ISO 160 170 fSU |90

Va

i

Рис.20. Рразделения смеси продуктов Rpf-гидролиза пептидогликана на обратно-фазовой колонке С18 (Luna, Phenomenex) методом ВЭЖХ. Звездочками отмечены пики, проявляющие эффект

реактивации покоящихся форм микобактерий

Как оказалось, максимальная реактивирующая активность связана с веществом, имеющим время выхода 60 мин. Анализ продуктов солянокислого гидролиза этого вещества (методом газовой хроматографии с масс селективным детектором) позволил установить его качественный состав. Как оказалось, данное соединение можно отнести к классу муропептидов. Анализ молекулярной массы данного вещества проводили методом гель-фильтрации. Эти результаты позволили заключить, что молекулярная масса выделенного соединения лежит в пределах от 0.9 до 3 кДа (Рис. 21), что соотвествует от 1 до 3 элементарных единиц пептидогликана.

Полученные результаты, наряду с имеющимися литературными данными позволяют предположить, что роль белков семейства в процессе реактивации покоящихся клеток микобактерий может быть двоякой. С одной стороны, как пептидогликангидролаза может приводить к распаду агрегатов покоящихся клеток, что приводит к большей доступности клеток для субстрата и для факторов реактивации. С другой стороны, под действием ЯрГ образуются низкомолекулярные фрагменты пептидогликана, которые являются сигнальными

СО—NH—С-CONH,

Рис. 21. Предполагаемая структура, проявляющая активность в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

молекулами для индукции реактивации. Вследствие малой доступности микобактериального пептидогликана для действия экзогенного Rpf, в качестве субстрата могут выступать фрагменты стенки, либо разрушенные клетки, которые всегда присутствуют в культуральной среде. Таким образом, в настоящем исследовании впервые получены доказательства того, что реактивирующее действие Rpf является не прямым, а опосредованным - через образование низкомолекулярных продуктов гидролиза пептидогликана клеточной стенки -муропептидов.

Непосредственный сигнальный механизм действия ФПГ, пока остается невыясненным. Однако недавно появилось сообщение, где была показана стимулирующая активность муропептидов при прорастании спор В. subtillis, в котором также доказано взаимодействие муропептидов с мембранно-связванной протеинкиназой PrkC [Dworkin & Shah, 2008]. В геноме M. smegmatis и M. tuberculosis имеется аналог PrkC - протеинкиназа PknB. Возможно именно эта протеинкиназа является сенсором для образованных под действием Rpf ФПГ (муропептидов) [Капа & Mizrahí, 2010]. Образующиеся ФПГ, взаимодействуя с PASTA доменом PknB, могут вызывать его димеризацию, активируя, тем самым PknB и запуская реакцию автофосфорилирования с последующей активацией ряда процессов, приводящих в итоге к стимуляции клеточного деления [Barthe et al., 2010] (Рис. 22).

Рис.22. Гипотетическая схема реактивации микобактерий под действием ФПГ 1-Нр} вызывает распад клеточных агрегатов;

действует на микобактериальный пептидогликан, высвобождая ФПГ; 3-ФПГ связываются со специфическим рецептором, запуская процесс реактивации

выводы

1. Обнаружен новый класс соединений нитрофенилтиоцианатов, обладающих ингибирующим эффектом по отношению к ферментативной активности белков семейства Rpf.

2. Нитрофенилтиоцианаты подавляют реактивацию микобактерий из покоящегося состояния in vitro и in vivo.

3. Белок Rpf вызывает дезагрегацию ассоциатов покоящихся форм микобактерий.

4. Белок Rpf гидролизует пептидогликан клеточных стенок микобактерий с образованием как высокомолекулярных фрагментов пептидогликана (ФПГ) - 71 кДа, так и низкомолекулярных с молекулярной массой от 0.9 до 3 кДа.

5. Фрагменты пептидогликана, образующиеся под действием Rpf, обладают реактивирующей активностью по отношению к покоящимся формам микобактерий.

6. Предполагается, что в процессе реактивации покоящихся форм Rpf может оказывать как непосредственное действие, приводящее к диссоциации клеточных агрегатов, так и опосредованное - приводящее к образованию ФПГ. В последнем случае, ФПГ могут связываться со специфическим рецептором на поверхности мембраны микобактерий, с последующей передачей сигнала, приводящего к инициации деления клеток.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Rpf - Resuscitation promoting factor-фактор реактивации покоящихся форм

актинобактерий;

НФТ- нитрофенилтиоцианат;

DLS - метод динамического светорассеяния;

ФПГВрГ фрагменты пептидогликана, полученные действием Rpf-гидролиза;

ФПГуз- фрагменты пептидогликана, полученные методом механического разрушения под действием ультразвука.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах

1. Demina G., Makarov V., Nikitushkin V., Ryabova О., Vostroknutova G., Salina E., Shleeva M., Goncharenko A., Kaprelyants A. (2009) Finding of the low molecular weight inhibitors of Resuscitation Promoting Factor enzymatic and resuscitation activity. PLOS One, V. 12. No 4.

2. Никитушкин В .Д., Демина Г.Р., Капрельянц А.С. (2011) Влияние секретируемого белка Rpf на межклеточные контакты в культурах Micrococcus luteus и Mycobacterium smegmatis. Микробиология, том 80, No 2, с. 155-161.

Тезисы конференций

1. Никитушкин В.Д., Демина Г.Р., Капрельянц А.С. (2009) "Поиск новых антитуберкулезных препаратов, направленных против реактивации латентных форм туберкулеза» III научно-практическая конференция «Перспективы развития инноваций в биологии». Москва, МГУ. С. 119-121.

2. Nikitushkin V., Demina G., Makarov V., Ryabova О., Shleeva M., Salina E., Kaprelyants A. (2010) Finding of New Inhibitors of mycobacterial Resuscitation Promoting Factor. NIAID/ISTC Workshop on "Research Opportunities in ТВ Drug Discovery and Diagnostics" Moscow, May 24-25. C. 37.

3. Nikitushkin V.D., Demina G.R., Kaprelyants A.S. (2010) Role of Rpf in the intercellular interactions in cultures of Mycobacteria. Jena School for Microbial Communication, Jena, Germany Sep.28th - Oct.l5®. P. 22.

Работа поддержана грантом ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной

России на 2011-2013 годы" (N9 контракта 14.740.11.1056), Российским фондом фундаментальных исследований, грант № 11-04-00713-а, программой РАН «Молекулярная и

клеточная биология»

Подписано в печать 05 октября 2011 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 398 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитушкин, Вадим Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. Обзор литературы.

1. Пути развития туберкулезной инфекции. Латентное течение заболевания.

1.1. Микобактерии и латентность туберкулёзной инфекции.

2. Реактивация покоящихся форм микобактерии.

3. Особенности строения клеточной стенки покоящихся форм бактерий.

3.1 Строение клеточной стенки микобактерий.

4. Роль бактериальных гидролаз в регуляции клеточного цикла микобактерий.

4.1. Ферменты гидролиза клеточной стенки.

4.2. Белки семейства Rpf- пептидогликангидролазы.

4.3. Белок Rip - эндопептидаза.

5. Молекулярные факторы реактивации покоящихся форм микобактерий. Роль муропептидов в процессе реактивации покоящихся форм бактерий.

5.1.Роль бактериальных серин/треонин протеинкиназ в процессе реактивации из покоящегося состояния.

6. Современные подходы поиска лекарственных препаратов, направленных против реактивации латентных форм туберкулёза.

Глава Ш Материалы и методы.

Глава III. Результаты и обсуждение.

1. Объект исследования - Resuscitation promoting factor.

1.2. Изучение структуры белка Rpf методом кругового дихроизма.

2. Поиск веществ - ингибиторов ферментативной активности Rpf.

Нитрофенилтиоцианаты.

2.1. Влияние структуры НФТ на их ингибирующию способность.

2.2. Кинетика ингибирования Rpf нитрофенилтиоцианатами.

2.3. Изучение взаимодействия нитрофенилтиоцианатов с Rpf методом тушения собственной флуоресценции белка.

2.3.1. Определение поверхностной доступности триптофановых остатков.

2.4. Специфичность действия НФТ.

2.5. Способность НФТ ингибировать процесс реактивации покоящихся форм микобактерий.

3. Изучение механизмов действия белка в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

3.1. Гипотеза 1. Роль Rpf в разрушении клеточных агрегатов покоящихся форм актинобактерий.

3.2. Гипотеза 2. Роль продуктов гидролиза пептидогликана под действием Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

3.2.1. Действие Rpf на клеточную стенку микобактерий.

3.2.2. Роль фрагментов пептидогликана (ФПГ) в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов действия белка Rpf - фактора реактивации покоящихся форм актинобактерий"

Способность бактерий переживать неблагоприятные условия среды является важным фактором в организации их устойчивости и патогенности. При этом существуют различные пути устойчивости, например, некоторые бактерии образуют споры [Piggot et al. 2004], в то время как другие переходят в состояние низкой метаболической активности - в состояние жизнеспособности, но «некультивируемости» ("Viable but Non-Cuiturable state") [Oliver JD, 2005].

Бактерии, находящиеся в состоянии покоя (англ. dormancy) характеризуются морфологическими изменениями формы, утолщением клеточной стенки, а' также отсутствием роста на типичных питательных средах и способности формировать колонии, поскольку клетки в данном состоянии проявляют низкую метаболическую активность. В частности, клетки, находящиеся в данном состоянии, способны восстанавливать красители, что указывает на проявление их метаболической активности. В некоторых случаях такие бактерии могут быть культивированы в специальных условиях, т.е. может быть проведена процедура реактивации (resuscitation process). Реактивация — это процесс перехода «некультивируемых» клеток в состояние высокой метаболической'активности. Хотя известно, что в природе при наступлении благоприятных условий, процесс перехода в метаболически активное состояние может происходить спонтанно.

Способность микроорганизмов длительное время находиться в метаболически неактивном сосотоянии свойственна более чем шестидесяти* видам бактерий, включая многие патогены человека, такие как Campylobacter sp. - бактерии, которые провоцируют развитие инфекционного заболевания, поражающего желудочно-кишечный тракт; Helicobacter pylori - микроорганизмы, инфецирующие различные отделы желудка; Legionella pneumophila — возбудитель, вызывающий легионеллез, заболевание, поражающее органы дыхания, ЦНС; Salmonella typhimurium — бактерии, которые вызывают сальмонеллез и др.

Mycobacterium tuberculosis, в частности, способен находиться в состоянии покоя десятилетиями. По данным ВОЗ, одна треть населения планеты заражена латентным туберкулезом. Латентная форма туберкулёза может сохраняться на протяжении всей жизни инфицированного индивида, но при ослаблении иммунитета или под действием ряда других, в том числе и неизученных факторов, может переходить в активное состояние, вызывая развитие заболевания.

Считается, что покоящиеся формы M.tuberculosis из-за низкой метаболической активности устойчивы к антибиотикам, что является предпосылкой развития хронической туберкулезной инфекции в организме хозяина. Биохимические механизмы, контролирующие процесс образования «некультивируемых» форм, а также процесс перехода этих форм в активное состояние до сих пор окончательно не изучены. Важные шаги по направлению к пониманию данных процессов у актинобактерий, включая Mycobacterium tuberculosis, были сделаны в нашей лаборатории [Mukamolova et al., 1998, 2002]. В нашей лаборатории впервые был обнаружен секретируемый бактериями белок Rpf (Resuscitation promoting factor), стимулирующий реактивацию покоящихся форм Micrococcus luteus [Mukamolova et al., 1998]. Проведенный анализ банка генов Genbank показал наличие гомологов гена rpf среди целого ряда грамположительных Г-Ц богатых бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis (МТБ). Экспериментальные данные показали, что белки > Rpf проявляют эффект реактивации в чрезвычайно низких (пикомолярных) концентрациях, что изначально позволило рассматривать белок как бактериальный цитокин, связывающийся с неким рецептором на поверхности клеток и запускающий процесс реактивации. Однако подобный рецептор обнаружить не удалось. Детальное изучение аминокислотной последовательности консервативного домена белка-Rpf, а также сопоставление его с рядом известных структур показало, что консервативный домен белка Rpf по своей структуре аналогичен ферменту, гидролизующиму бактериальный пептидогликан, а именно, лизоциму [Cohen-Gonsaudetal., 2004]. Но с другой стороны, белок Rpf также проявляет гомологию и по отношению к ряду литических трансгликозилаз Е. coli (Slt35, Slt70). Несмотря на важную роль белка Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий in vitro и in vivo, механизм его реактивирующего действия остается невыясненным. Имеющиеся экспериментальные данные позволяют предположить, что ферментативный гидролиз пептидогликана под действием Rpf является важным звеном в процессе реактивации «некультивируемых» бактерий. Но возникает вопрос, каким образом связаны процесс гидролиза пептидогликана клеточной стенки и процесс реактивации покоящихся клеток. В связи сэтим, изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе биологической активности белка Rpf, в частности — роли Rpf в процессе реактивации покоящихся форм микобактерий является актуальной задачей.

Одним из эффективных подходов для изучения ферментативной активности является ингибиторный анализ, с приминением которого возможно изучение механизма действия Rpf, и соответсвенно, изучение механизмов реактивации микобактерий.

Однако, до последнего времени не сообщалось о существовании химических соединений - ингибиторов Rpf. В ходе данной работы был изучен ряд химических соединений - нитрофенилтиоцианатов (НФТ), проявляющих ингибирующую активность как на моделях in vitro, так и in vivo, что позволяет рассматривать данные соединения, как л % перспективные предшественники для создания лекарственных препаратов нового

1 » поколения, направленных на предотвращение реактивации латентных форм туберкулеза^ Поскольку на сегодняшний день повсеместно отмечается значительный рост как заболеваемости, так и смертности от туберкулезной инфекции, то изучение туберкулеза,, его активной и латентной форм, а также создание препаратов с антитуберкулезной активностью, является одной из самых важных проблем здравоохранения. Известные лекарственные препараты с антитуберкулезной активностью, в основном, направлены на лечение активной формы туберкулеза, тогда как практически нет лекарств, направленных против латентной формы туберкулеза. Но латентная форма туберкулеза при ослаблении иммунитета (прием иммуносупрессоров), ВИЧ инфекции, диабете может трансформироваться в активную форму. Для успешного решения проблемы, связанной с переходом клеток в активное состояние, и, как следствие, проявление туберкулезной инфекции, необходимо создать эффективные лекарственные препараты, предотвращающие реактивацию покоящихся форм микобактерий. В качестве молекулярной мишени можно использовать Rpf, так как поиск соединений, способных ингибировать данный белок, позволил бы предотвратить реактивацию латентного туберкулёза. г

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Никитушкин, Вадим Дмитриевич

выводы

1. Обнаружен новый класс соединений нитрофенилтиоцианатов, обладающих ингибирующим эффектом по отношению к ферментативной активности белков семейства Rpf.

2. Нитрофенилтиоцианаты подавляют реактивацию микобактерий из покоящегося состояния in vitro и in vivo.

3. Белок Rpf вызывает дезагрегацию ассоциатов покоящихся форм микобактерий.

4. Белок Rpf гидролизует пептидогликан клеточных стенок микобактерий с образованием как высокомолекулярных фрагментов пептидогликана (ФПГ) — 71 кДа, так и низкомолекулярных с молекулярной массой от 0.9 до 3 кДа.

5. Фрагменты пептидогликана, образующиеся под действием Rpf, обладают реактивирующей активностью по отношению к покоящимся формам микобактерий.

6. Предполагается, что в процессе реактивации покоящихся форм Rpf может оказывать как непосредственное действие, приводящее к диссоциации клеточных агрегатов, так и опосредованное, приводящее к образованию ФПГ. В последнем случае, ФПГ могут связываться со специфическим рецептором на поверхности мембраны микобактерий, с последующей передачей сигнала, приводящего к инициации деления клеток.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитушкин, Вадим Дмитриевич, Москва

1. Anderson, R.G., Hussey, H., and Baddiley, J. (1972) The mechanism of wall synthesis in bacteria. The organization of enzymes and isoprenoid phosphates in the membrane. Biochem. J., 127, 11-25.

2. Atrih A, Zollner P, Allmaier G, Williamson MP, Foster SJ. (1998) Peptidoglycan structural dynamics during germination of Bacillus. J Bacteriol. V. 180 Nol7. P. 4603

3. Atrih, A., and Foster, S.J. (1999) The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek, No 75, P. 299-307.

4. Av-Gay Y, Everett M. (2000) The eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases of Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. V. 8 No5 P.238-44.

5. Bald D, Koul A. (2010) Respiratory ATP synthesis: the new generation of mycobacterial drug targets. FEMS Microbiol Lett. V.308, Nol, P.l-7.

6. Barer MR, Harwood CR. (1999) Bacterial viability and culturability. Adv Microb Physiol., №41 P.93-137.12.

7. Barford, D., Das, A.K., andEgloff, M.P. (1998) The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into catalysis and regulation. Annu Rev Biophys Biomol Struct 27: 133-164.

8. Barry C.E., 3d & Cheung M.S. (2009) New Tactics in the Fight against Tuberculosis Scientific American. Feb, 23. online edition

9. Barry, C.E. Ill, Lee, R.E., Mdluli, K., Sampson, A.E., Schroeder, B.G., Slayden, R.A., and Yuan, Y. (1998) Mycolic acids: structure, biosynthesis and physiological functions.Prog. Lipid Res., 37, P. 143-179.

10. Barthe, P. Mukamolova, G.V, Roumestand, C, Cohen-Gonsaud, M (2010) The structure of PknB extracellular PASTA domain from mycobacterium tuberculosis suggests a ligand-dependent kinase activation/ Structure. V. 18. №5. P.606-615.

11. Bateman A, Holden MT, Yeats C. (2005) The G5 domain: a potential N-acetylglucosamine recognition domain involved in biofilm formation.Bioinformatics. V21.No8. P.1301-3.

12. Besra GS, Brennan PJ. (1997) The mycobacterial cell wall: biosynthesis of arabinogalactan and lipoarabinomannan. Biochem Soc Trans. V.25 No3. P. 845-50.

13. Darouiche R.O., Mansouri M.D., Gawande P.V., Ma-dhyastha S. (2009) Antimicrobial and antibiofilm efficacy of triclosan and DispersinB combinatiomo J. Antimicrob Chemother. V. 64. No 1. P. 88-93.

14. Dasgupta A, Datta P, Kundu M, Basu J. (2006) The serine/threonine kinase PknB of Mycobacterium tuberculosis phosphorylates PBPA, a penicillin-binding protein required for cell division. Microbiology. No 152. P. 493-504.

15. DeMaio J, Zhang Y, Ko C, Young DB, Bishai WR. (1996) A stationary-phase stress-response sigma factor from Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA. № 93 Vol.7, P. 2790-4.

16. Dessen A, Mouz N, Gordon E, Hopkins J, Dideberg O. (2001) Crystal structure of PBP2x from a highly penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae clinical isolate: a mosaic framework containing 83 mutations. J Biol Chem. V.276, No48, P.45106-12.

17. Dhople AM (1983). Effect of lysozyme on Mycobacterium leprae. Lepr India. V.55, No3, P. 455-64.

18. Dmitriev, B.A., Ehlers, S., and Rietschel, E.T. (1999) Layered murein revisited: a fundamentally new concept of bacterial cell wall structure, biogenesis and fiinction.Med. Microbiol. Immunol. (Berlin;, No 187, P.173-181.

19. Dmitriev, B.A., Ehlers, S., Rietschel, E.T., and Brennan, P.J. (2000) Molecular mechanics of the mycobacterial cell wall: from horizontal layers to vertical scaffolds. Int. J. Med.Microbiol., No290, P. 251-258.

20. Domingue, G.J. Woody, H.B. (1997) Bacterial persistence and expression of disease / Clin Microbiol Rev. V.10. №2, P.320-344.

21. Doyle RJ, Koch AL. (1987) The functions of autolysins in the growth and division of Bacillus subtilis. Crit Rev Microbiol. V.15, No2, P. 169-222.

22. Draper P. (1998) The outer parts of the mycobacterial envelope as permeability barriers.Front. Biosci., No3, P. 1253-1261.

23. Draper, P. (1982) The anatomy of mycobacteria. In Ratledge, C., and Stanford, J. (eds.), The biology of the mycobacteria vol. 1. Academic Press, London, pp. 9-52.

24. DuBois M, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers P.A, Smith F (1956) Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Analytical Chemistry No 28, P.350-356,

25. Durocher D, Jackson SP(2002). The FHA domain. FEBS Lett. V. 513, Nol P. 5866.

26. Dye C, Williams BG. (2010) The population dynamics and control oftuberculosis. Science. V. 328, No5980, P.856-61.

27. Fernandez P, Saint-Joanis B, Barilone N, Jackson M, Gicquel B, Cole ST, Alzari PM. (2006) The Ser/Thr protein kinase PknB is essential for sustaining mycobacterial growth. J Bacteriol. V. 188., No22.,P. 7778-84.

28. Foster SJ, Johnstone K. (1987) Purification and properties of a germination-specific cortex-lytic enzyme from spores of Bacillus megaterium KM. Biochem J. V. 242, No2, P.573-9.

29. Gaidenko TA, Kim TJ, Price CW. (2002) The PrpC serine-threonine phosphatase and PrkC kinase have opposing physiological roles in stationary-phase Bacillus subtilis cells. J Bacteriol. V.184, No22, P. 6109-14.

30. Ghuysen, J.M. (1998) Use of bacteriolytic enzymes in determination of wall structure and their role in cell metabolism. Bacteriol. Rev., No 32, P. 425-464.

31. Girardin, S.E. Bonega, I.G., Carneiro, L.A (2003). Nodi detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan/ Science V.300. №5625. P.1584-1587.

32. Girardin, S.E. Travassos, L.H., Herve, M (2003) Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nodi and Nod2/ J.* Biol. Chem. V.278. №43. P.41702-41708.

33. Goffin C, Ghuysen JM (1998). Multimodular penicillin-binding proteins: an enigmatic family of orthologs and paralogs. Microbiol Mol Biol Rev V. 62, No4., P. 1079-93.

34. Goren M.B., Hart P.D., Young M.R., Armstrong J.A. (1976) Prevention of phagosome lysosome fusion in cultured macrophages by sulfatides of Mycobacterium tuberculosis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA.Vol. 73, No 7, P. 2510-2514, 1976

35. Hanks, S.K., and Hunter, T. (1995) Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J 9: 576-596.

36. Hayes, C.S. Sauer, R.T (2003) Cell Toxin-antitoxin pairs in bacteria: killers or stress regulators? Cell. 2003. V.l 12. №1. P.2-4.

37. Hett E., Rubin E (2008). Bacterial growth and cell division: a mycobacterial perspective. Microbiology and molecular biology reviews. V. 72, №1., P. 126-156

38. Hett, E.C. Chao M.C., Deng L.L., Rubin EJ (2008). A Mycobacterial enzyme essential for cell division synergizes with resuscitation-promoting factors/ Plos pathogens. V.4. No2.

39. Hett, E.C. Chao M.C., Steyn A.J., Fortune S.M., Deng L.L., Rubin E. J (2007) A partner for the resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis/ Mol Microbiol. V66.№3. P.658-668.

40. Hett, E.C. Chao, MC, Rubin, EJ. (2010) Interaction and modulation of two antagonistic cell wall enzymes of mycobacteria/ PLoS Pathog. V.6. №7.

41. Hett, E.C. Hung, D. Targeting multiple biofilm pathways. T Chem Biol. V.16., №12., P.1216-1218.

42. Heidrich C, Hôltje JV. (2001) Enzymology of elongation and constriction of the murein sacculus of Escherichia coli. V. 83, Nol, P. 103-8.

43. Higashi, Y., Siewert, G., and Strominger, J.L. (1970) Biosynthesis of the peptidoglycan of bacterial cell walls. XIX. Isoprenoid alcohol phosphokinase. J. Biol. Chem., No245, P. 3683-3690.

44. Hoeltje JV, Mirelman D., Sharon N., Schwarz U. (2009) Novel type of murein transglycosylase in Escherichia coli. Journal of bacteriology. V. 124. № 3., P. 1067-1076

45. Hugonnet, J.E. Tremblay, L.W., Boshoff, H.I., Barry, C.E3rd, Blanchard, J.S. (2009) Meropenem-clavulanate is effective against extensively drug-resistant Mycobacterium tuberculosis. Science 2009. V.323. № 5918. P.1215-1218.

46. Hunter, T. (1995) Protein kinases and phosphatases: the yin and yang of protein phosphorylation and signaling. Cell No 80, P. 225-236.

47. Jollès P. (1996) From the discovery of lysozyme to the characterization of several Iysozyme families. No75, P. 3-5.

48. Kana B., Mizrahi V. (2010) Resuscitation-promoting factors as lytic enzymes for bacterial growth and signaling. FEMS Immunol Med Microbiol. V.58. №1. P.39-50.

49. Kang CM, Abbott DW, Park ST, Dascher CC, Cantley LC, Husson RN. (2005) The Mycobacterium tuberculosis serine/threonine kinases PknA and PknB: substrate identification and regulation of cell shape. Genes Dev. V.19, Nol4, P. 1692-704.

50. Kaprelyants A.S. & Kell D.B (1993). Appl Environ Microbiol. V.59, P.3187

51. Kaprelyants, A.S. Gottschal, J.C. & Kell D.B (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria FEMS Microbiol Rev. V. 104. P. 271.

52. Karakousis, P.C. Lamichhane, G., Woolwine, S.C., Nuermberger, E.L., Grosset, J., Bishai, W.R. (2004). Dormancy phenotype displayed by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in mice J Exp Med. V.200. №5. P.647-657.

53. Karamanos Y. (1997). Endo-N-acetyl-beta-D-glucosaminidases and their potential substrates: structure/function relationships. Res Microbiol. V.148, No8, P.661-71. Review

54. Keep, N.H., Ward, JM, Cohen-Gonsaud, M, Henderson, B. (2006) Wake up! Peptidoglycan lysis and bacterial non-growth states/ Trends Microbiol. V.14., №6. P. 271-276.

55. Kennelly, P.J. (2002) Protein kinases and protein phosphatases in prokaryotes: a genomic perspective. FEMS Microbiol Lett, No 206, P. 1-8.

56. Kjelleberg, S., Albertson, N., Flardh, K., Holmquist, L., Jouper-Jaan, A., Marouga, R., Ostling, J., Svenblad, B., Weichart, D (1993) How do non-differentiating bacteria adapt to starvation? Antonie Van Leeuwenhoek. V.63. №3-4. P.333-341.

57. Khomenko AG, Averbach MM, Litvinov VI, Gergert VJ, Chukanov VI (1984) Effects of chemotherapy on the immunological characteristics of patients with primary destructive pulmonary tuberculosis. Bull World Health Organ. V.62, No5, P.763-71.

58. Mauck J, Chan L, Glaser L. (1971) Turnover of the cell wall of Gram-positive bacteria. J Biol Chem. V. 246, N06, P. 1820-7.

59. Miyata M, Biro S, Kaieda H, Tanaka H. Lipoprotein(a) stimulates the proliferation of cultured human arterial smooth muscle cells through two pathways. FEBS Lett. V. 377, No3, P.493-6.

60. Mahapatra, S., Crick, D.C., and Brennan, P.J. (2000) Comparison of the UDP-vV-acetylmuramate:L-alanine ligase enzymes from Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae. J. Bacteriol. V.182, P. 6827-6830.

61. McMurray DN (1996) Mycobacteria and Nocardia. Baron S, editor. Medical Microbiology. 4th edition. Galveston (TX): University of Texas Medical Branch at Galveston; Chapter 33

62. McNeil, M. (1999) Arabinogalactan in mycobacteria: structure, biosynthesis, and genetics. In Goldberg, J.B. (ed.), Genetics of bacterial polysaccharides. CRC Press, Washington, D.C., P. 207-223.

63. McMurray, D.N., Collins, F.M., Dannenberg, A.M., Smith, D.W (1996). Pathogenesis of Pathogenesis of experimental tuberculosis in animal models. Curr Top Microbiol Immunol. -V.215., P. 157-179.

64. McNeil, M., Besra, G.S., and Brennan, P.J. (1996) Chemistry of the mycobacterial cell wall. In Rom, W.N., and Garay, S.M. (eds.), Tuberculosis. Little, Brown and Company, Boston, P. 171-185.

65. McNeil, M., Daffe, M., and Brennan, P.J. (1990) Evidence for the nature of the link between the arabinogalactan and peptidoglycan of mycobacterial cell walls. J. Biol. Chem., No 265, P. 18200-18206

66. McNeil, M.R., Robuck, K.G., Harter, M., and Brennan, P.J. (1994) Enzymatic evidence for the presence of a critical terminal hexa- arabinoside in the cell walls ofMycobacterium tuberculosis. Glycobiology, No4, P. 165-173

67. Medlar EM (1952) Survival of bacilli in tuberculosis. Am Rev Tuberc. V. 66, No3, P. 381-2.

68. Molle, V., Kremer, L (2010) Division and cell envelope regulation by Ser/Thr phosphorylation: Mycobacterium shows the way. Mol Microbiol. V.75.,№5., P. 10641077.

69. Mukamolova, G.V., Kaprelyants, A.S., Young, D.I., Young, M„ Kell, D.B (1998) A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sci USA. V.95. №15. P. 8916-8921.

70. Mukamolova, G.V. Kaprelyants, A.S., Kell, D.B. (1995) Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extended stationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek. V.67. №3. P289-295.

71. Mukamolova, G.V., Kaprelyants, A.S., Kell, D.B., Young, M (2003) Adoption of the transiently non-culturable state a bacterial survival strategy/ Adv Microb Physiol. V.47., P.65-129.

72. Mukamolova, G.V., Kormer, S.S., Kell, D.B., Kaprelyants, A.S. (1999). Stimulation of the multiplication of Micrococcus luteus by an autocrine growth factor/ Arch Microbiol. V.172. №1. P 9-14.

73. Mukamolova, G.V., Turapov, O.A, Young, D.I, Kaprelyants, A.S, Kell, DB, Young, M. (2002) A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis/ Mol Microbiol. V.46. №3. P. 623-635.

74. Mukamolova, G.V.,Turapov, O.A., Kazarian, K, Telkov, M, Kaprelyants, AS, Kell, DB, Young, M. (2002). The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor/ Mol Microbiol. V.46. №3. P.611-621.

75. Muñoz-Dorado, J., Inouye, S., andlnouye, M. (1991) A gene encoding a protein serine-threonine kinase is required for normal development of Myxococcus xanthus a Gram-negative bacterium. Cell No 67., P. 995-1006.

76. Mattucumaru D.G., Roberts G., Hinds J., Stabler R.A., Parish, T (2004). Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a non-replicating state. Tuberculosis (Edinb). V.84. №3-4., P.239-246.

77. Meroueh SO, Bencze KZ, Hesek D, Lee M, Fisher JF, Stemmler TL, Mobashery S. (2006). Three-dimensional structure of the bacterial cell wall peptidoglycan. V. 103, No 12, P. 4404-9.

78. O'shera, R. & Moser, H.E. (2008) Physicochemical properties of antibacterial compounds: implications for drug discovery J Med Chem. V.51. №10, P.2871-2878.

79. Ortiz-Lombardia M, Pompeo F, Boitel B, Alzari PM. (2003) Crystal structure of the catalytic domain of the PknB serine/threonine kinase from Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem. 2003 V. 278. No 15, P. 13094-100.

80. Paidhungat M, Setlow P. (2001) Localization of a germinant receptor protein (GerBA) to the inner membrane of Bacillus subtilis spores. J Bacteriol. V.183, Nol3, P. 3982-90.

81. Pang, X., Vu, P., Byrd, T.F (2007) Evidence for complex interactions of stress-associated regulons in an mprAB deletion mutant of Mycobacterium tuberculosis. Microbiol. V.153. PI229-1242.

82. Parrish, N.M., Dick, J.D., Bishai, W.R. (1998) Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol. V.6., №3., P.107-12.

83. Pei J, Grishin NV. (2005) COG3926 and COG5526: a tale of two new lysozyme-like protein families. V.14, NolO, P.2574-81.

84. Piggot P, Hilbert D. (2004) Sporulation in Bacillus subtilis. Curr Opin Microbiol. N06, P. 579-586.

85. Pignolo, R.J. Rotenberg, M.O., Cristofalo, V.J. (1994) Alterations in contact and density-dependent arrest state in senescent WI-38 cells/ In Vitro Cell Dev Biol Anim. V. 30. № 7. P471-476.

86. Popham DL, Helin J, Costello CE, Setlow P (1996). Analysis of the peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospores. J Bacteriol. V.178, No22, P. 6451-8.

87. Postgate JR. Soil bacteria parasitic on Azotobacteriaceae. (1967) Antonie Van Leeuwenhoek. V.33, Nol, P. 113-20.

88. Rachman, H., Strong, M., Ulrichs, T., Grode, L., Schuchhardt, J., Mollenkopf, H., Kosmiadi, G., Eisenberg, D. Kaufmann (2006) Unique transcriptome signature of Mycobacterium tuberculosis. S. Infect Immun. V.74. P.1233-1242.

89. Rahman I, Shahamat M, Chowdhury MA, Colwell RR. (1996) Potential virulence of viable but nonculturable Shigella dysenteriae type 1. Appl Environ Microbiol. №62, P.l 15-20.

90. Raman, S., Hazra R., Dascher, C.C. Husson, R.N (2004). Transcription regulation by the Mycobacterium tuberculosis alternative sigma factor SigD and its role in virulence/ J Bacteriol. -V., 186. №19, P. 6605-6616.

91. Roszak DB, Colwell RR. (1987) Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count. Appl Environ Microbiol. V.53, Nol2, P. 2889-93.

92. Romeis T, Vollmer W, Höltje JV. (1993) Characterization of three different lytic transglycosylases in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. V.l 11, No2-3, P.141-6.

93. Ruggiero, A., Tizzano B., Pedone E., Pedone C., Wilmanns M., Berisio R. (2009) Crystal structure of the resuscitation-promoting factor ADUFRpfB from Mycobacterium tuberculosis. J Mol Biol. V.385. №1. P. 153-162.

94. Rustad TR., Harrell MI., Liao R., Sherman DR.The Enduring Hypoxic Response of Mycobacterium tuberculosis. PLoS ONE. 2008; 3(1): el502.

95. Scheuerwater E., Reid C., Clarke A (2008). Lytic transglycosylases: bacterial space-making autolysins. Int. Journal of Biochemistry and Cell Biology, .№40, P. 586591

96. Schleifer K.H, Kandler O. (1972) Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol. Rev., V.36, P. 407-477.

97. Shah I & Dworkin J. (2010) Induction and regulation of a secreted peptidoglycan hydrolase by a membrane Ser/Thr kinase that detects muropeptides. Mol Microbiol, V.75, No5, P. 1232-1244.

98. Shah I, Laaberki M, Popham D. L., Dworkin J. (2008). A eukaryotic-like Ser/Thr kinase signals bacteria to exit dormancy in response to peptidoglycan fragments. Cell. V.135.,№3, P.486-496.

99. Shubin, V.V., Khazin, M.L., Efimovskaia T.V (1990). Determination of secondary structure of globular proteins using circular dichroism spectra/ Mol Biol (Mosk). V.24. -P. 189-201.

100. Shockman GD, Daneo-Moore L, Kariyama R, Massidda O. (1996). Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. V.2, Nol, P.95-8

101. Singh R, Manjunatha U, Boshoff HI, Ha YH, Niyomrattanakit P, Ledwidge R, Dowd CS, Lee IY, Kim P, Zhang L, Kang S, Keller TH, Jiricek J, Barry CE 3rd. (2008) PA-824 kills nonreplicating Mycobacterium tuberculosis by intracellular NO release.

102. Stephenson K„ Hoch J. (2002). Two-component and phosphorelay signal-transduction system as therapeutic targets. Curr Opin Pharmacol. V 2., No 5., P. 507-12.

103. Stephenson, K., Lewis, R.J. (2005). Molecular insights into the initiation of sporulation in Gram-positive bacteria: new technologies for an old phenomenon. FEMS Microbiol Rev.- V. 29. №2. P.281-301.

104. Strynadka NC, James MN. (1996) Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. No75, P. 185-222.

105. Stock A.M., Robinson V.L., Goudreau, P.N. (2000) Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem No 69, P. 183-215.

106. Templin MF, Ursinus A, Höltje JV(1999). A defect in cell wall recycling triggers autolysis during the stationary growth phase of Escherichia coli. EMBO J. V.18, Nol5, P. 4108-17.

107. Tufariello, J.M., Jacobs, W.R., & Chan, J. (2004) Individual Mycobacterium tuberculosis resuscitation-promoting factor homologues are dispensable for growth in vitro and in vivo. Infect. Immun. V72, P515-526.

108. Thunnissen AM., Dijkstra BW. (1994) 'Holy' proteins. II: The soluble lytic transglycosylase. Curr Opin Struct Biol V.4, No6, P.810-3. Review.

109. Vollmer W, Höltje JV. (2004). The architecture of the murein (peptidoglycan) in gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). J Bacteriol. V. 186, No 18, P.5978-87.

110. Vollmer W., Joris B., Charlier P., Foster S.(2008) Bacterial peptidoglycan (murein) hydrolases. FEMS Microbiol Rev №32. P. 259 286.

111. Voskuil MI, Schnappinger D, Visconti KC, Harreil MI, Dolganov GM, Sherman DR, Schoolnik GK (2003). Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program. J Exp Med. V. 198 No 5, P. 705-13.

112. Voskuil MI. (2004) Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency. Tuberculosis (Edinb). V.84, No 3-4, P. 138-43

113. Voskuil, M.I., Schnappinger, D., Visconti, K.C., Harrell, M.I.,,Dolganov, G.M., Sherman, D.R., Schoolnik, G.K. (2003) Inhibition of respiration by nitric oxide induces a Mycobacterium tuberculosis dormancy program/ J Exp Med V.198. №5. P705-713.

114. Voskuil, M.I., Visconti, K.C., Schoolnik, G.K (2004). Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy/ Tuberculosis (Edinb). V.84. №3-4, P218-227.

115. Warth AD, Strominger JL. (1969) Structure of the peptidoglycan of bacterial spores: occurrence of the lactam of muramic acid. Microbiology Vol. 64, P. 528-535

116. Wayne LG, Lin KY (1982) Glyoxylate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions. Infect Immun. V37, No3, P. 1042-9

117. Wayne, L.G. (1976) Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions Am Rev Respir Dis. V.114., №4., P. 807-811.

118. Wayne, L.G. (1977) Synchronized replication of Mycobacterium tuberculosis Infect Immun. V.17. №3. P.528-530.

119. Wayne, L.G., Sramek, H.A. (1994). Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis/ Antimicrob Agents Chemother. V38. №9. P2054-2058.

120. Williams KN, Brickner SJ, Stover CK, Zhu T, Ogden A, Tasneen R, Tyagi S, Grosset JH, Nuermberger EL. (2009) Addition of PNU-100480 to first-line drugs shortens the time needed to cure murine tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. V.180, No4, P.371-6.

121. Wurgler-Murphy, S.M., and Saito, H. (1997) Two-component signal transducers and MAPK cascades. TIBS. No22, P 172-176.

122. Yeats C, Finn RD, Bateman A. (2002) The PASTA domain: a beta-lactam-binding domain. Trends Biochem Sei. V. 27 No9, P. 438.

123. Young, D.B., Gideon, H.P. & Wilkinson, R.J (2009) Eliminating latent tuberculosis/Trends Microbiol. V.17. №5. P.183-188.

124. Zhang, C.C. (1996) Bacterial signalling involving eukaryotic-type protein kinases. Mol Microbiol 20, P. 9-15.

125. Zhang, Y., Yang, Y., Woods, A., Cotter, R. J. & Sun, Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or specific peptides/ Biochem Biophys Res Commun. Vol. 284., P. 542-547.

126. Волошин C.A., Капрельянц A.C. (2005) Изучение клеточной агрегации в культурах Mocrococcus luteus методом динамического светорассеивания. Прикладная Биохимия и Микробиология. № 6.Т. 44, Стр. 647-651.

127. Мукамолова Г.В, Янг М., Келл Д., Капрельянц A.C. Бактериальные феромоны и клеточное деление // Успехи биологической химии. 1999. Т. 39. С. 225-254

128. Олескин A.B. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях // Микробиология. 1993. Т. 62. С. 389-403.

129. Перельман М. И., Корякин В. А., Богадельникова И. В. Фтизиатрия. ОАО Издательство «Медицина», 2004.

130. Салина Е.Г, Жогина Ю.А., Шлеева М.О., Сорокоумова Г.М., Селищева A.A., Капрельянц A.C. Биохимические и морфологические изменения в покоящихся («некультивируемых») клетках M.smegmatis/ Биохимия. 2010. Т.75, No 1, С. 72 -80.

131. Шебанов Ф.В. Туберкулез. М., «Медицина», 1976, 464 с.

132. Шлеева М.О, Салина Е.Г., Капрельянц A.C. Покоящиеся формы микобактерий/ Микробиология. 2010. № 1. Стр. 3-15.