Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf - факторов роста

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf - факторов роста"

На правахрукописи

КАЗАРЬЯН Константин Александрович

БИОХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ СЕМЕЙСТВА Rpf - ФАКТОРОВ РОСТА Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2004

Работа выполнена в лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор Капрельянц А.С.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Воробьева Л.И. кандидат биологических наук Жердев А.В.

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино.

Защита состоится « » мая 2004 г. в '" часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский ир-т., д. 33, корп. .2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский пр-т., д. 33, корп. 2.

Автореферат разослан. апреля 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических

наук

Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям в ряде случаев приводит к образованию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии также могут образовывать подобные покоящиеся (дормантные) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некультивируемостью на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы в лабораторных условиях требуют специальной процедуры —оживления для восстановления способности к делению. В природе при возникновении благоприятных условий восстановление способности к делению может происходить спонтанно.

Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции. Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекции в организме.

Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуралыюй жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что «оживляющей» покоящиеся клерки активностью обладает секретируемый М. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf, обнаружены во многих грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных, гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces и прочих. Предполагается, что все белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис. 1).

Можно предположить, что белки, кодируемые генами, гомологичными rpf, у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из М. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки семейства Rpf из М. tuberculosis (Rv2450c - Rpftl, Rv2389c - Rpft2, Rv1884c - Rpft3, Rv0867 - Rpf t4, Rvl009 - Rpf t5) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной с у б ъ е д рямшны, кптпр^" г у 'ЛГУ* ч н ы м

in и 111111, I ............ни in >1

\ Спет«*!* O/Ö l } О» I

туберкулезом могла бы бьпь прспективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.

(ИуОветф* gJ77H h.....

(ftv23a9c)t2-t_!_£-1-1_I_I_

О 100 ЪО Зсо 4СО 500 600

осгъгоК

1 > Сигнальная последовательность

[//А консервативный rpf-домен

[ I сегмент с высоким содержанием пролина

Рис.1. Белки семейства Rpf из Mycobacterium tuberculosis

На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков (сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf, отсутствовали, так же как и какие-либо сведения об их структуре. Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их структуры, биохимических и иммунологических свойств, так как это поможет разобраться в механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес как для фундаментальной микробиологии, так и для прикладной науки в связи с изучением механизмов ряда инфекционных заболеваний. Цель и задачи исследования

Основной целью настоящего исследования было выявление механизмов, которые лежат в основе действия Rpf на бактериальную клетку. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1) Разработка процедуры выделения и оптимизация условий экспрессии рекомбинантных белков семейства Rpf.

2) Изучение некоторых свойств молекулы Rpf

3) Анализ экспрессии Rpf на разных стадиях роста культуры М. lutens.

4) Исследование предполагаемого механизма действия Rpf на бактериальную клетку.

5) Изучение иммуномодулирующих свойств белков семейства Rpf в качестве компонентов субъединичных вакцин против туберкулеза.

Научная новизна

Разработан метод получения рекомбинантных белков семейства Rpf и впервые полученм рекомбинантные белки семейства Rpf из М. tuberculosis высокой

WW, |<D 36,740 14,775 10,628 11,212 36,873

чистоты. Впервые изучена динамика накопления Rpf в культуральной жидкости М. luleus. Выявлено наличие у Rpf гидролитической активности в отношении компонентов клеточной стенки микрококка, что позволяет отнести белки семейства Rpf к муреин-гидролазам. Впервые получены данные, свидетельствующие о протективных свойствах белков семейства Rpf против туберкулеза в моделях па мышах.

Практическая значимость

Разработаны методики выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. Получены данные, позволяющие рассматривать белки семейства Rpf в качестве потенциальных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Апробация работы.

Результаты исследований были доложены на: конференции «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (Дубна, 2000), конференции «First international conference on bacterial and viral virulence factors» (Смоленица, 2000), 1-м международном конгрессе «Biotechnology: State of art & prospects of development» (Москва, 2002), конгрессе «11 international congress of immunology» (Стокгольм, 2001), конференции «ТВ vaccines for the world» (Монреаль, 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура диссертации

Диссертация • состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Объекты и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Работа изложена на

страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 3 таблицы, список литературы включает в себя 123 наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микрооорганизмы и среды выращивания

В работе использовали Micrococcus lutens NCIMB 13267, Escherichia coli HMS174(DE3), Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Компетентные клетки E.coli готовили по стандартной методике (Janssen & Irvin, 2001, Molecular cloning). Для выделения плазмидной ДНК использовали набор Promega Wizard Plus SV Minipreps (Promega). Для выделения РНК М. luteus использовался набор фирмы Qiagen RNeasy Mini Kit (Qiagen). Для выращивания E.coli и M.luteus использовали богатую среду LabM, BrothE. M.luteus выращивали также на бедной, минимальной среде, содержащей лактат и аммоний (ЛММ). Культуру М.tuberculosis выращивали на жидкой среде Мидельбрука. Все культуры выращивали при 37°С ( кроме M.luteus - при 30°С) в условиях аэрации.

ОТ(обратно-транскрипционный ПЦР(RT-PCR))

Для полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией, использовали набор AMV Reverse Transcriptase (Promega).

Праймеры для обратной транскрипции и амплификации кДНК:

(R) 5'-TTCATGTCCCAGGTGCCGTT~3'

(F) 54JAGGACTCGCCATGGACACC-3'

Выделениерекомбинантного белка Rpf-HisTagMicrococcus luteus (и его аналогов из M.tuberculosis) in штамма E.coli HMS174(DE3). содержащего плазмиду HisTag/pE19b

Трансформированные клетки выращивали в среде Broth E в присутствии ам-пицеллина (100 мкг в мл) до OD600 = 0,7-0,9. Затем к культуре добавляли изоп-ропил p-D-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубировали культуру 3 часа при 370С. Клетки разрушали ультразвуком на ледяной бане 10 раз по 15 секунд.

Хроматография на Ni2+chelation Sepharose 6B column Все этапы проводили при +4 градусах. Полученный лизат клеток центрифугировали на холоду при 13000g 25 минут, супернатант разводили в 4 раза буфером для нанесения (5 тМ имидазола, 0.5 М NaCl, 20 тМ Tris-HCl, pH 8,0, 6 М мочевины) и наносили на аффинную колонку Iminodiacetic acid immobilized on Sepharose (Sigma) с предварительно обработанной NiSO4. После нанесения супер-натанта колонку промывали 20 объемами буфера, с 50 мМ имидазолом. Затем колонку промывали 5 объемами буфера, содержащего 100 мМ имидазола и элюиро-вали 3-мя объемами буфера, содержащего 500 мМ имидазола. Хроматография белков на DEAE-Sepharose

Использовали DEAE-Sepharose Fast Flow DFF-100 (Sigma). Последовательно промывали колонку водой, затем 10 мМ трис-HCI рН 7.4. После нанесения образца промывали колонку 10 мМ трис-HCI рН 7.4 + 100 мМ NaCl. Элюировали 3 мл 10 мМ трис-HCI, рН 7.4 + 330 мМ NaCl.

SDS-мектрофорез белков в полиакриламидном геле (по Лэммли) Электрофорез проводили в приборе BioRad, размер пластин 8x10 см, 12% ак-риламида в геле. Электрофорез проводили на холоду при 30 тА на 1 пластину. 5х электродный буфер: 0,25 М трис, 2 М глицин, 0,5 М SDS рН 8,8. 8х буфер для разделяющего геля:3 М трис-HCI рН 8,8. 4х буфер для концентрирующего геля: 0,5 М трис-HCI рН 6,8.

Градиентный неденатурируюишйэлектрофорез белков в полиакриламидном геле Электрофорез проводили по стандартной методике (J.M.Walker, Methods in Molecular Biology, v.32, 1994).

Иммуноблоттинг рекомбинаптных белков

Иммуноблоттинг рекомбинантных белков осуществляли по стандартной схеме ( Каталог "Sigma 1999*', стр. 1490-1491):

Первичные антитела (AT) (поликлональные кроличьи AT против Rpf:0,5 мкл препарата AT в TBS: 20 мМ трис-HCI рН 8.0, 150 mM NaCl). Вторичные AT (AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma)) использовали в разведении 1:5000. Мембрану промывали TBS+Tween 80 (0,05%) при 37°С, окрашивали SIGMA FAST BC1P/NBT Alcaline Phosphatase Substrate (Sigma) при комнатной температуре.

Пролиферативпып тест

Для постановки пролиферативного теста мышей иммунизировали белками семейства Rpf подкожно в подушечку задней лапы (10 мкг соответствующего белка

в неполном адъюванте Фройнда (НАФ), разведенном в 2 раза физиологическим раствором) и через 2 недели исследовали пролиферацию клеток подколенных лимфоузлов in vitro в присутствии белков семейства Rpf Суспензию клеток лимфоузлов (2x10* клеток/лунку) культивировали в 96-луночном планшете (фирма Costar, CILIA) в присутствии 10 мкг/мл Rpf-белков при 37"С в атмосфере, содержащей 5% СО,, в течение 72 ч. Уровень пролиферативной активности лимфоцитов оценивали по включению 'Н-тимидина. Для этого за 18 ч до окончания инкубации в лунки добавляли по 0,5 |iC¡ 'Н-тимидина. По окончании инкубации клетки переносили на фильтры и определяли уровень включения радиоактивной метки в ДНК с помощью сцинтиляционного счетчика.

Иммунизация

В качестве подопытных животных были использованы мыши обоего пола линии C57BL/6JCit (B6) из питомника ЦНИИ Туберкулеза РАМН, массой 22-24 г.

Мышей иммунизировали 10 мкг белка в НАФ под кожу спины 3-кратно с 2-недельным интервалом. Через 10 суток после последней инъекции у подопытных животных из ретроорбитального синуса брали кровь для определения в сыворотке титра специфических антител класса IgG с помощью иммуноферментного теста ИФА (EL1SA).

Определение количества антител и белков методом ИФА

Количество анжтел к белкам Rpf в сывовротках животных определяли в соответствии с рекомендациями фирмы Pharmingen (США) с использованием меченных пероксидазой анти-IgG антител. Результаты представлены в виде показателей оптической плотности при разведении сывороток 1:500. Количество Rpf в супернатантах M.luteus определяли методом прямого ИФА по стандартной схеме по рекомендациям фирмы Sigma, в качестве вторичных антител использовали AntiRabbit AT conjugate with Alcalic Phosphatase (Sigma) применяли в разведении 1:5000.

Заражение мышей

Через 6 недель после последней иммунизации мышей внутривенно заражали М. tuberculosis H37Rv в летальной дозе 2x107 КОЕ.

Протективный эффект Rpf белков оценивали по высеваемости микобактернй (число КОЕ на среде Мидельбрука) из легких и селезенки зараженных мышей, а также по длительности выживания иммунизированных и контрольных мышей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение рекомбинантных белков

Совместно с британскими коллегами из лаборатории М. Янга (Абериствизс-кий университет, Великобритания) в нашей лаборатории были получены генно-инженерные конструкции, позволяющие экспрессировать все пять микобактери-альных гомологов Rpf в кишечной палочке. Однако для того чтобы получить большие количества рекомбинантных белков высокой чистоты, необходимо было провести оптимизацию методов стимуляции экспрессирующих клонов и выделения рекомбинантных белков семейства Rpf. В качестве основы для выделения рекомбинантных белков мы использовали рекомендации фирмы Novagen,

разработавшей векторы серии рЕТ и соответствующую систему экспрессии, и вносили изменения по ходу работы (Табл. 1). Одновременно с этим мы оптимизировали и процедуры хроматографии на аффинной «никелевой» колонке для того, чтобы выработать оптимальный алгоритм выделения и сделать выход ре-комбинантных белков максимальным при максимальной же чистоте препарата (Рис. 2). В результате этих исследований был разработан протокол, позволяющий получать миллиграммовые количества белков семейства ЯрГ высокой чистоты.

супернатант, разведенный буфером в 4 раза, при +4С наносили на колонку М|2+сЬе1а1юп ЙерИагоэе 6П N.

' последовательные

ЭЛЮЦИЯ

Таблица 1. Схема выделения рекомбинантных белков семейства Яр^

1 2 3 4 5 6 7

Рис.2. SDS-электрофореграмма, характеризующая полученные рекомбинантные белки семейства Rpf 1- маркеры молекулярной массы, 2- Rpf t5, 3 -Rpf 14,4 -Rpf t3, 5 -Rpf t2, 6 - Rpftl, 7 - Rpf^Miuteus)

Динамика изменения количества Rpf в культуре M. luteits

Чтобы ответить на вопрос о биохимических свойствах Rpf и о механизме его действия на бактериальную клетку и культуру в целом, необходимо было решить ряд задач, одной из которых было изучение того, сколько белка и на каких стадиях роста M. luteus продуцируется в среду.

Для оценки количества Rpf в культуралыюй жидкости мы использовали ряд биохимических и молекулярно-биологических методов: иммунофермен-тный анализ с поликлональными антителами против Rpf, иммуноблоттинг с теми же антителами и ОТ-ПЦР (RT-PCR) для оценки наличия в клетках мРНК, специфической для Rpf.

Как видно из Рис. 3, при выращивании М-luteus на богатой среде количество секретируемого Rpf достигает детектируемого уровня через 5 часов после засева инокулята. Максимум количества белка приходится на позднюю логарифмическую фазу роста культуры, в стационарной фазе количество белка быстро падает, приближаясь к нулю в районе 50 часов. В случае выращивания клеток на бедной среде (LMM) количество Rpf начинает расти при переходе культуры от лаг-фазы к логарифмическому делению и так же, как и в случае богатой среды, быстро падает до практически недетекти-руемых значений после наступления стационарной фазы. При этом при росте на богатой среде количество Rpf в максимуме достигает не менее 1-2 MI белка на литр культуры. Однако если оценивать количество Rpf на единицу клеток, выясняется, что на начальных стадиях роста удельный синтез Rpf максимален.

Для подтверждения полученных данных мы использовали метод ЯТ-РСЯ, позволяющий оценивать количество специфической для данного белка мРНК. Для этого выделяли тотальную РНК из выровненных количеств клеток М. Ьиеш, взятых на разных стадиях роста культуры, и при помощи специфических праймеров получали к-ДНК в реакции обратной траскрипции. Полученный фрагмент ДНК в дальнейшем амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции и конечный продукт выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле (Рис. 4).

1 2 3 4 5

Гис.4. Уровень экспрессии Кр1 на разных стадиях

роста культуры М. ЬШеиз методом ЯТ-РСЯ. 1 - СЮШ| = 0, 046 начало логарифмической фазы, 2 - ООыю = 0,82 ранняя логарифмическая фаза, 3 - ООЫК) = 4,4 поздняя логарифмическая фаза, 4 - СЮмю = 3,8 стационарная фаза, 5 -ООН10 - 3,6 поздняя стационарная фаза. Стрелкой указан интересующий нас фрагмент к-ДНК, рядом справа от каждой дорожки присутствует контроль ( система без обратной транскриптазы).

Как видно из представленного рисунка мРНК ЯрГ присутствует на всех стадиях роста культуры за исключением стационарной фазы, когда синтез мРНК полностью прекращается. В поздней логарифмической фазе, когда количество белка существенно в супернатанте, синтез его мРНК уже начинает снижаться. В целом данные ЯТ-РСЯ подтверждают картину, получаемую при помощи других методов.

Наряду с оценкой количества ЯрГ в культуральной жидкости оценивали и то, в каком виде пребывает белок в среде. Для этого супернагант культуры микро-

кокка подвергался ИРЬС (ВЭЖХ) гель-фильтрации на колонке Вюзср 2000. В элюируемых фракциях наличие КрГ выявляли с помощью ИФА. На профиле элю-ции, представленном на рис.5 присутствуют два максимума, соответствующие Кр£ При расчете молекулярной массы можно предположить, что обнаруженные максимумы соответствуют димерной и мономерной формам белка (50 и 22 кДа).

Рис.5. Профиль элюции супернатанта культуры М. luteus, выращенной на диализованной средс Broth Е до OD^ - 2.7. В зоне, обозначенной подчеркиванием, при помощи ИФЛ был выявлен Rpf. HPLC гель-флльтрация на препаративной колонке BioSep 2000.

В целом, этот этап работы позволил установить, что накопление Rpf в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, начиная с самых ранних его стадий. Однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. В свою очередь это может означать, что белок Rpf каким-то образом связан с делением клеток и, возможно, принимает непосредственное участие в этом процессе. Также установлено, что в среде Rpf присутствует в двух формах: мономерной и димерной.

Выявление ферментативной активности Rpf

Данные, приведенные выше, свидетельствуют о том, что количество Rpf в культуральпой жидкости у M.luteus достигает миллиграммов на литр, что скорее характерно для ферментов, а не для белков-регуляторов.

При предсказании третичной структуры консервативного домена Rpf на основании его аминокислотной последовательности при помощи специальных компьютерных программ, можно обнаружить некоторое структурное сходство консервативного домена Rpf с доменом активного центра лизоцима (наличие так называемого лизоцимо-подобного фолда). Это сходство хорошо иллюстрирует компьютерная модель третичной струкруры консервативного домена Rpf, рассчитанная А. Мурзипым (частное сообщение) (Рис. 6).

Рис. 6. Компьютерные модели структур куриного лизоцима (слева) и консервативного домена ЯрГ (предсказание) (справа). В нижней части рисунка, изображающего лизоцим, хорошо видны три а-спирали, являющиеся характерными для этого белка. Справа представлен консервативный домен где также видны три -спирали, взаимное расположение которых напоминает Фоагмент лизоцима.

о -1-1-1---1-1-----1

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45

врем я, ч

Рис. 7. Изменение оптической плотности препарата лиофилизированных клеток в трнс-буфере рН8 под дейстием препарата рскомбинантного Rpf, а также рекомбинан-тных Rpf белков, подвергнутых сайт-направленному мутагенезу. Эл-DEAE -элюат, содержит нативным Rpf, выделенный на колонке DEAE). Эл.рЕТ - контрольное выделение рскомбинантного Rpf из штамма Е. coli, содержащего пустой вектор без гена Rpf. MyT.ES - рекомбинантный Rpf с заменой глутамина в ES- фрагменте на глутаминовую к-ту. Myr.Cys- Rpf с заменой обоих цистеинов в консервативном домене. Rpf рек. 1 -препарат рскомбинантного Rpf. Концентрации рекомбинантного Rpf - 15 мкг/мл. Препараты Rpf с замененными аминокислотами были любезно предоставлены Г.Му-камоловой.

-•-KOHtpOJb

— XI 0Е«£

-■—-м рЕГ

—■—И¥1 ES

— » —nyl 2Oys * Ft.'f.» 1

Наличие этой структуры, а гакже присутствие в структуре белка в вариабельном домене так называемого Lys-M фрагмента, служащего для тесного взаимодействия белков с компонентами клеточной стенки, привело нас к предположению о том, что Rpf может быть ферментом, связанным с гидролитической модификацией клеточной стенки, сходно с лизоцимом, являющимся мурамидазой.

Для проверки этого предположения были проведены эксперименты с целью выясне-неия возможного воздействия Rpf на препарат лиофилизированных клеток микрококка Для этого была измерена во времени оптическая плотность препарата клеток микрококка после добавления к ним Rpf. Результаты этого эксперимента представлены на рис. 7.

Из Рис. 7 видно, что при добавлении рекомбинантного Rpf к препарату клеток микрококка происходит падение оптической плотности, в конечном итоге приводящее к уменьшению оптической плотности примерно до 60% от начальной. Мы предполагаем, что данный эффект является отражением гидролитической активности, присущей Rpf. Столь медленное падение оптической плотности, скорее всего, связано со специфичностью Rpf. Вероятно, он гидролизуст какие-то связи, расщепление которых не приводит к глобальным изменениям в структуре крупных частиц клеточной стенки, ведущим к их полному распаду, что могло бы привести к существенному и быстрому падению оптической плотности, как это происходит под действием лизоцима.

Существует несколько типов ферментов, для которых характерна подобная литическая активность по отношению к бактериальным стенкам: лизо-цимы (мурамидазы), эндопептидазы, амидазы, карбоксипептидазы и лити-ческие трансгликозилазы. На приведенном рисунке представлена схема пеп-тидогликана клеточной стенки Е. coli и ферменты, гидролизуюшие различные связи этого полимера (Рис. 8).

1 2

L-4U

1 \

GleNAe -MorfiJAc-QlcMAc »MlKfiAc-GIcHAc-lftmNAc-iinh

»..«I. L-ЛИ

T' И

* £>-*«# I <

OA« rV^JPH»

n +ЛН $

пл.,, тпшфъх+шг!*** neu*

» •

(je _ I L-W»

-OitNüü-MiiTNAe-GI^^-WutNAtU® V-GleNAc -MurNAc -4

L-Ma <

B-Ql*

I «

О-АЬ

Рис.8. Ферменты клеточной стенки у Е. coli и их действие на мурсим (по Holtje, 1995). GIcNAc - N-ацети л гл ю козам и 1i, MurNAc - N-ацетилмурамовая кислота, MurNAc-anh - (1- 6)ангидромурамовая кислота. Связи, гидрешизуемыс соответствующим (|>срмснтом: 1 - N-ацетилглюкозаминидазы, 2 - литические трансгли-козилазы, 3 - N-auenLUiypaMiüi-L-anaHHif амидаза, 3 - N-a цетилдегидромурам i Li -L-аланин амидаза, 4 - DD эидопептидаза, 5 - LD карбоксипептидаза, 6 - DD карь бокси пептид аза.

На основании полученных данных однозначно определить, к какому типу ферментов относится Ир^ довольно сложно Представляется, что ЯрГ вряд ли можно отнести к лизоцимам, несмотря на его третичную структуру, так как М. Меш - микроорганизм чрезвычайно чувствительный к действию лизоцима и малейшее его добавление в среду приводит к полному лизису клеток. Не существует также каких-либо указаний на то, что ЯрГ является амида -зой, так как анализ его последовательности не выявляет сходства с этим типом ферментов.

В то же время лизоцимоподобный фолд характерен для родственного лизоциму семейства белков, литических трансгликозилаз (Рис.9), ферментов, моделирующих за счет гидролиза клеточную стенку микроорганизмов Эти белки являются бактериальными мурамидазами, задействованными в метаболизме бактериальной клеточной стенки во время роста и деления, а также в процессах связанных с вирулентностью. Под действием литических трансгликозилаз бактериальная клеточная стенка не разрушается полностью (как в случае с лизоцимом), а становится более рыхлой и проницаемой. Вследствие этого кинетика разрушения препаратов стенок под действием литических трансгликозилаз замедленна, что действительно наблюдается в эксперименте, представленном на Рис.7.

Рис.9. Третичная структура литической трансгликозилазы Sit 70 из Е. coli Стрелкой указан лизоцимоподобный фолд. Лизоцимоподобный фолд Rpf приведен для сравнения слева.

В пользу того, что Rpf является литической трансгликозилазой, указывает наличие в его последовательности так называемого ES-фрагмента, который высоко консервативен и у белков семейства Rpf других микроорганизмов и характерен для активного центра литических трансгликозилаз из семейства 1 (Рис. 9А). Также для некоторых литических трансгликозилаз характерно наличие LysM домена, присутствующего и в структуре Rpf.

Действительно, препараты КрГ, в которых были проведены замены в Б8-фрагменте и по двум цистеинам, практически не оказывают литического действия на препараты клеток (Рис. 7).

При выращивании на бедных средах, таких как лактатная, бактерии микрококка склонны образовывать крупные агрегаты, что, скорее всего, является ответом на недостаток питательных веществ. Нами было отмечено, что при добавлении КрГ к культуре, пребывающей в подобном сильно а1ре1 ированном состоянии, происходила частичная дезагрегация клеток, и размеры агрегатов в целом уменьшались, что также может быть интерпретировано в пользу модификации клеточной стенки микрококка под действием КрГ.

В целом, можно предположить, что КрГ является пептидогликангидро-лазой, моделирующей состояние внешней стороны клеточной стенки М. ¡Шеш. По данным С. Фостера, среди белков, участвующих в модификации клеточной стенки спорулирующих бактерий, обязательной для прорастания спор, присутствуют и литические трансгликозилазы, очевидное сходство с которыми наблюдается у КрГ. Возможно, именно эта ферментативная актив-

ность обуславливает способность Rpf реактивировать покоящиеся клетки микрококка, например, способствуя локальному увеличению проницаемости клеточной стенки и приводящему к активации клеточного метаболизма и деления. С другой стороны, роль Rpf в оживлении покоящихся клеток может состоять в диспергировании агрегатов клеток при их реактивации.

Иммунологические свойства белков семейства Rpf

Одной из важных задач настоящего исследования было изучение иммунологических свойств белков семейства Rpf, в том числе аналогов Rpf из М. tubetculosis. Эти исследования были проведены совместно с ЦНИИ Туберкулеза РЛМН. В ходе работы были изучены параметры как гуморального, так и Т-клеточного иммунного ответа при иммунизации животных белками семейства Rpf. Была исследована продукция специфических антител и проли-феративный ответ клеток лимфоузлов на присутствие Rpf-белки в тесте in vitro (поскольку основную роль в прогективном иммунном ответе на М. tuberculosis играют Т-лимфоциты).

В сыворотках с помощью иммуноферментного теста были исследованы уровни специфических антител класса IgG к белкам семейства Rpf (Рис.10). Эти исследования показали высокую иммуногенность всех белков за исключением Rpf t3. Также была обнаружена высокая степень перекрестной реактивности между белками семейс1ва, что очевидно обусловлено частичной гомологичностью их структур.

При изучении пролиферации Т-лимфоцитов иммунизированных мышей при добавлении к ним белков семейства Rpf в качестве антигенов, выяснилось, что иммунизация белками семейства Rpf приводит к появлению не только гуморального, но и Т-клеточного иммунного ответа. Все белки семейства оказались иммуногенны. Как и в случае с антителами, исключением явился белок ТЗ, не обладающий иммуногенностью (Рис.11).

Высокая иммуногенность белков Rpf in vitro указывала на возможность значительного протективного эффекта иммунизации против туберкулеза в модели in vivo. Для этого мышей линии В6 трижды иммунизировали 10 мкг соответствующего белка в неполном адъюванте Фройнда с интервалами в 2 недели, а затем их заражали летальной дозой микобактерий. Протективный эффект иммунизации оценивали по продолжительности жизни иммунизированных животных относительно контроля. Результаты опытов (Рис.12) позволяют сделать вывод о том, что продолжительность жизни иммунизированных животных достоверно превышает таковую в контроле. В случае Rpf t2-t4 у 40% иммунизированных мышей время жизни после заражения увеличивалось более чем в два раза.

Рис.12. Динамика гибели мышей, вакцинированных белками Rpf, после внутривенного заражения Mycobacterium tubeiculosis.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что белки семейства Rpf обладают иммуногеиными свойствами как in vitro, так и in vivo, что позволяет рассматривать эти белки в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны методики очистки рекомбинантных белков семейства Rpf: ^2450, ^2389, Rvl884, RvЮ09, RvO867 (Ы.ШЬвгсиЬзй) и g3559933 (ЫЛМгШ).

2. Экспрессия Rpf в культуре М. ИИвш начинается на ранних стадиях роста и остается высокой на протяжении всего активного роста культуры; в ранней стационарной фазе количество белка существенно уменьшается. В поздней стационарной фазе Rpf не экспрессируется и полностью исчезает из среды.

3. Rpf проявляет литическую активность по отношению к препарату лиофили-зированных клеток М. ИИвш. В то же время замена в белке некоторых аминокислот приводит к потере этой активности. Сходство структуры Rpf с литическими трансгликозилазами и тип воздействия на клеточную стенку позволяет предположить принадлежность Rpf к этому семейству ферментов.

4. Белки семейства Rpf являются индукторами как гуморального, так и клеточного ответов, а иммунизация ими приводит к защите против туберкулеза. Эти данные позволяют рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Ganina E.A., Telkov M. V., Kaprelyants Л. S., Kazarian К. A., Potapov V. D., Biketov S. F. Effect of the bacterial cytocine of Rpf family of M. tuberculosis on morphogenesis of ТВ in mice. First international conference «Bacterial and viral virulence factors», p. 180. Smolenice, Slovakia, 2000.

2. Казарьян К. А., Телков М. В., Кондратьева Т. К., Еремеев В. В. Иммунологические свойства микобактериальных белков семейства Rpf. «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии». Том 2, стр. 62-67, Дубна 2001.

3. Yeremeev V.V., Kondratieva Т.К., Rubakova E.I., Kazarian K.A., Telkov M.V., Kaprelyants A.S. Autocrine growth factors of Mycobactenum tuberculosis as components ofnew vaccine. Scandinavian journal of immunology, vol. 54, p. 134.

4. Kazarian K.A., Telkov M.V., Kondratieva Т.К., Eremeev V.V. Immunological properties of the mycobacterial Rpf-family proteins. First international congress -Biotechnology - state of art & prospects of development, p. 50. Moscow 2002

5. Mukamolova G. V., Turapov O. A., Kazarian K. A., Telkov M.V., Kaprelyants A.S., Kell D.B., Young M. The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential ьесгеЫ growth factor. Molecular Microbiology (2002), vol. 46, №3, p.611-621.

6. Yeremeev V. V., Kondratieva T. K., Rubakova E. I., Petrovskaya S.N., Kazarian K. A., Telkov M.V., Biketov S. F., Kaprelyants A.S., Apt A. S. Proteins of the Rpf family: Immune cell reactivity and vaccination efficacy against tuberculosis in mice. Infection and Immunity, (2003), vol.71, №8, p. 4789-4794.

7. Kazarian K. A., Yeremeev V.V., Kondratieva T. K, Telkov M. V., Kaprelyants A. S., Apt A. S. Proteins о Rpf family as novel ТВ vaccine candidates. The first international conference on ТВ vaccines for the world. Poster session. Montreal 2003.

Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,1

Печатный салон на "Соколе"

Тиражи по требованию от 1 экз.

Ул. Новомсчани, д. 3, кор. 1 Те*: 782-48-34 E-mal: prM94x3.ni

4

¿-7 92 8

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казарьян, Константин Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.:.

1. Социальное поведение бактерий и бактериальные факторы роста.'.

2. Факторы роста при стрессах у бактерий.

2.1. Стресс у бактерий и реакция на него.-.

2.2. «Некультивируемые» клетки бактерий.'.

2.3. Выход бактерий из НК состояния.

2.4. Белки семейства Rpf-факторы роста и оживления «некультивируемых» форм.

3. Ферменты клеточной стенки бактерий, участвующие в реактивации покоящихся форм.

3.1 Спора и ее оболочка.

3.2 Специфические литические ферменты прорастания спор.

4. Реактивация микобактерий, латентная форма туберкулеза и проблема эффективной вакцинации против него.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Биохимические свойства белков семейства Rpf.;.

3.1.1. Оптимизация условий экспрессии и выделения рекомбинантных белков семейства Rpf.

3.1.2. Изучение свойств Rpf Micrococcus luteus.

3.2. Изучение синтеза Rpf и его гомологов М. tuberculosis в растущей культуре.

3.2.1. Синтез Rpf в растущей культуре М. luteus.

3.2.2. Изучение экспрессии генов гомологов Rpf в культуре М. tuberculosis.

3.3 Действие Rpf на клеточную стенку М. luteus.

3.4 Иммунологические свойства белков семейства Rpf.i.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf - факторов роста"

Принято считать, что для культивирования бактерий достаточно обеспечить их нормальной средой роста с необходимым набором питательных веществ, витаминов, микроэлементов, оптимальными физическими условиями. Многие микробиологические методы (высев на плотные среды, метод конечных разведений и т.д.) основаны на постулате, что каждая жизнеспособная клетка в бактериальной культуре обязательно образует популяцию дочерних клеток (колонию или жидкую культуру) в приемлемой для роста среде, и это не требует добавления каких-то специфических факторов, стимулирующих ее деление.

Однако экспериментальная практика показывает, что бактериальная популяция далеко не однородна, часто в ее состав входят клетки, существенно различающиеся как по морфологии, так и физиологически и биохимически (Kell et al., 1-991, Koch et al.i«1987, Davey & Kell, 1996). Таким же вариациям подвержена способность к делению.

Хорошо известно, что адаптация бактерий к неблагоприятным условиям, в ряде случаев приводит к образованию специализированных покоящихся форм, таких как споры или цисты. Однако, как стало ясно в последнее время, некоторые неспорулирующие бактерии так же могут образовывать подобные покоящиеся (дормантные) формы. Это состояние характеризуется резким снижением метаболической активности и полным отсутствием деления. Такие покоящиеся клетки, как правило, характеризуются измененной формой, утолщенной клеточной стенкой и некультивируемостыо на твердых и (или) жидких питательных средах. Такие формы в лабораторных условиях требуют специальной процедуры - оживления для восстановления способности к делению. В природе, при возникновении благоприятных условий, восстановление способности к делению может происходить спонтанно.

Дормантные формы микроорганизмов часто являются причиной реактивации инфекционных заболеваний, таких как туберкулез и некоторые другие тяжелые инфекции. Полагают, что из-за малой метаболической активности покоящаяся форма клеток Mycobacterium tuberculosis устойчива к антибиотикам и может являться резервуаром для хронической туберкулезной инфекции в организме.

Механизмы, позволяющие бактериям переходить в дормантное состояние и выходить из него, пока недостаточно хорошо изучены. При исследовании условий оживления покоящейся культуры Micrococcus luteus было установлено, что компоненты культуральной жидкости активно растущей культуры этого микроорганизма способны стимулировать пробуждение покоящихся клеток. Фракционирование и дальнейшая очистка культуральной жидкости выявили, что "оживляющей" покоящиеся клетки активностью обладает секретируемый М. luteus в среду белок, названный Rpf (от английского - resuscitation promoting factor). Гены, гомологичные rpf, обнаружены во многих I грам-положительных микроорганизмах, объединяемых в группу Г-Ц богатых бактерий. Согласно базам данных гомологичные гены представлены в таких бактериях, как Mycobacterium tuberculosis (пять генов) и Mycobacterium leprae (два гена), а также в некоторых других микроорганизмах, а именно Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium bovis (БЦЖ), Corynobacterium glutamicum, нескольких видах Streptomyces, и прочих. Предполагается, что все белки семейства Rpf в своем составе имеют домен с высокой степенью гомологии, а также вариабельный домен (Рис. 1).

Можно предположить, что белки, кодируемые генами гомологичными rpf у других микроорганизмов, могут иметь схожую с Rpf биологическую активность и обладать пробуждающими свойствами. В связи с этим .большую практическую важность приобретает изучение гомологов Rpf из М. tuberculosis, поскольку латентные микобактерии обнаруживаются у 30 % населения Земли и именно они являются причиной реактивационного туберкулеза. Белки ' семейства Rpf из М. tuberculosis (Rv2450c - Rpf tl, Rv2389c - Rpf t2, Rvl884c - Rpf t3, Rv0867 -Rpf t4, Rvl009 - Rpf t5) могут оказаться перспективными кандидатами для включения в состав комплексной субъединичной вакцины, которая наряду с обычным туберкулезом могла бы быть протективной в случае реактивации этой тяжелой инфекции.

На момент начала данной работы сведения о том, к какому классу белков (сигнальных, структурных или ферментов) относятся белки Rpf, отсутствовали, также как и какие-либо сведения об их структуре. Поэтому чрезвычайно важным представляется изучение белков семейства Rpf, их структуры и свойств: биохимических и иммунологических, так как это поможет разобраться в механизмах образования покоящихся форм, что представляет интерес, как для фундаментальной микробиологии, так и для прикладной науки, в связи с изучением механизмов ряда инфекционных заболеваний.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Казарьян, Константин Александрович

Выводы:

1. Разработаны методики очистки рекомбинантпых белков семейства Rpf: Rv2450, Rv2389, Rvl884, Rvl009, Rv0867 (Mtuberculosis) и g3559933 (.M.luteus).

2. Экспрессия Rpf в культуре M. luteus начинается на ранних стадиях роста и остается высокой на протяжении всего активного роста культуры; в ранней стационарной фазе количество белка существенно уменьшается. В поздней стационарной фазе Rpf не экспрессируется и полностью исчезает из среды.

3. Rpf проявляет литическую активность по отношению к препарату лиофилизированных клеток М. luteus. В то же время замена в белке некоторых аминокислот приводила к потере этой активности. Сходство структуры Rpf с литическими трансгликозилазами и тип воздействия на клеточную стенку позволяет предположить принадлежность Rpf к этому семейству ферментов.

4. Белки семейства Rpf являются индукторами как гуморального, так и клеточного ответов, а иммунизация ими приводит к защите против туберкулеза. Эти данные позволяют рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Заключение

В ходе данной работы был изучен ряд свойств, присущих Rpf и его гомологам из М. tuberculosis. До начала работы над этой диссертацией о белках семейства не было известно практически ничего, за исключением того факта, что Rpf М. luteus оказывает стимулирующее рост действие на покоящиеся клетки этого микроорганизма. Именно в силу этого были проведены исследования в разных направлениях, целью которых являлось получение представлений о механизме воздействия Rpf на клетки микрококка.

На первом этапе работы была разработана методика, позволяющая получать значительные количества рекомбинантных белков семейства Rpf высокой чистоты. Эти белки использовались в дальнейших исследованиях, в частности, для иммунизации животных в защитных экспериментах на модели мышиного туберкулеза.

Также, при помощи нескольких методов, была изучена динамика накопления Rpf в культуре М. luteus при выращивании на различных средах. В целом, в ходе этого этапа работы удалось установить, что накопление Rpf в среде происходит на протяжении всего активного роста культуры, особенно на самых ранних его стадиях, однако в стационарной фазе синтез Rpf полностью прекращается и белок исчезает из среды. Эти данные позволили предположить, что активность изучаемого белка каким-то образом связана с делением клеток и ростом культуры. В то же время, наличие в структуре Rpf lys-M домена указывало на внеклеточный (поверхностный) характер его действия. В совокупности эти особенности организации Rpf привели нас к предположению об участии Rpf в процессах , связанных с метаболизмом клеточной стенки. Действительно, компьютерный анализ последовательности консервативного домена Rpf выявил наличие у него так называемого лизоцимо-подобного фолда, характерного для активного центра лизоцимов и литических трансгликозилаз - ферментов участвующих в гидролизе клеточной стенки бактерий. Обнаруженное разрушение крупных клеточных агрегатов М. luteus in vitro под действием Rpf могло также свидетельствовать в ползу гидролитической активности Rpf. В прямых экспериментах по воздействию Rpf на препарат лиофилизированных клеток М. luteus было получено еще одно доказательство литической активности. Наконец, данные сайт-направленного мутагенеза также подтверждают вывод о ферментативных свойствах изучаемого белка. В тоже время, поскольку замена глутамина- 13, в ES участке Rpf - известном фрагменте являющимся высоко консервативным для ряда трансгликозилаз из других объектов приводит к потере литического действия, можно предположить, что белки семества Rpf относятся именно к этому типу ферментов, осуществляющих процессинг клеточной стенки бактерий. ъ/

Изучение иммунологических свойств белков семейства Rpf в моделях туберкулеза на мышах выявило, что эти белки являются индукторами как гуморального так и клеточного ответов, а иммунизация ими животных приводит к протективному эффекту на модели экспериментального туберкулеза. Это позволяет рассматривать белки семейства Rpf в качестве перспективных кандидатов на включение в состав субъединичных вакцин против туберкулеза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казарьян, Константин Александрович, Москва

1. Atrih, A., Foster S. J. (1999). The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie van Leeuwenhoek, 75: 299-307.

2. Atrih, A., Bacher G., Allmaier G., Foster S. J. (1999). Structural analysis of Bacillus megaterium endospore peptidoglycan and its structural dynamics during germination. Microbiology, 145, 1033-1041.

3. Atrih, A., Zollner P., Allmaier G., Foster S. J. (1996). Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during germination. J. bacterio.l 178, 6173-6183.

4. Barer, M. R. and Harwood, C. R. (1999). Bacterial viability and culturability. Adv Microb Physiol, 41,93-137.

5. Batchelor, S. E., Cooper, M., Chhabra, S. R., Glover, L. A., Stewart, G. S., Williams, P. and Prosser, J. I. (1997). Cell density-regulated recovery of starved biofilm populations of ammonia-oxidizing bacteria. Appl Environ Microbio.l 63, 2281-6.

6. Betts, J. C., Lukey, P. Т., Robb, L. C., McAdam, R. A. and Duncan, K. (2002). Evaluation of a nutrient starvation model of Mycobacterium tuberculosis persistence by gene and protein expression profiling. MolMicrobiol, 43, 717-31.

7. Blackburn N T, Clarke A J. (2001). Identification of four families of peptidoglycan lytic transglycosylases. J Mol Evol, 52,78-84

8. Brosch R, Gordon SV, Brillaut A.(1998). Use of Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial chromosome library for genime mapping, sequencing, and comparative genomics. Infect. Immun., 66, 2221-2229.

9. Boucher, S. N., Slater, E. R., Chamberlain, A. H. and Adams, M. R. (1994). Production and viability of coccoid forms of Campylobacter jejuni. J Appl Bacteriol, 77, 303-7.

10. Bovill, R. A. and Mackey, В. M. (1997). Resuscitation of'non-culturable' cells from aged cultures of Campylobacter jejuni. Microbiology, 143, 1575-81.

11. Brandt L, Elhay M, Rosenkrands I et al.(2000). ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 68,791-795.

12. Bu'lock, J. D. (1961) Adv. Microbial Physiol, 3, 293-333.

13. Chaiyanan, S., Huq, A., Maugel, T. and Colwell, R. R. (2001). Viability of the nonculturable Vibrio cholerae 01 and 0139. Syst Appl Microbiol, 24, 331-41.

14. Chen Y, Miyata S, Makino S & Moriyama R (1997) Molecular characterization of a germination-specific muramidase from Clostridium perfringens S40 spores and nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol., 179, 3181-3187

15. Chmielewski, R. A. and Frank, J. F. (1995). Formation of viable but nonculturable Salmonella during starvation in chemically defined solutions. Lett Appl Microbiol, 20, 380-4.

16. Christensen, S. K., Mikkelsen, M., Pedersen, K. and Gerdes, K. (2001). RelE, a global inhibitor of translation, is activated during nutritional stress. Proc Natl Acad Sci USA, 98, 14328-33.

17. Christensen, S. Т., Leick, V., Rasmussen, L. and Wheatley, D. N. (1998J. Signalling in unicellular eukaryotes. International Review of Cytology, 111, 181-253.

18. Christensen, S. Т., Wheatley, D. N., Rasmussen, M. I. and Rasmussen, L. (1995). Mechanisms controlling death, survival and proliferation in a model unicellular eukaryotae Tetrahymena thermophyla. Cell Death Differential, 2, 301-308.

19. Clewell, D. B. (1993). Bacterial sex pheromone induced plasmid transfer., Cell. 73, 9-12.

20. Cole ST, Brosch R, Parkhill J et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature, 393:537-44.

21. Condos R, Rom WN, Liu YM, Schluger NW. (1998). Local immune responses correlate with presentation and outcome in tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med, 157,729-735

22. Dagley, S., Dawes, E. A. and Morrison, G. A. (1950). Factors influencing the early phases of growth of Aerobacter aerogenes, J. Gen. Microbiol, 4, 437-447.

23. Davey, H. M. and Kell, D. B. (1996). Flow cytometry and cell sorting of heterogeneous microbial populations: the importance of single-cell analyses. Microbiol Rev, 60, 641-96.

24. Dijkstra & Thunnissen. (1994). The soluble lytic transglycosylase. Curr Opin Struc Bio, 4, 810813.

25. Donnelly JJ, Ulmer JB, Shiver JW, Liu MA. (1997) DNA vaccines. Ann. Rev. Immunol., 15, 617648.

26. Dubrow, E. L. (1976). Reactivation of tuberculosis: a problem of aging. J Am Geriatr Soc, 24, 481-7.

27. Dworkin, M. (1996). Recent advances in the social and developmental biology of Mixobacteria. Microbiological Reviews.60, 70-102.

28. Edwards, C. (2000). Problems posed by natural environments for monitoring microorganisms. Mol Biotechno.l 15, 211-23.

29. Eguchi, M., Fujiwara, E. and Miyamoto, N. (2000). Survival of Vibrio anguillaram in freshwater environments: adaptation or debilitation? J Infect Chemother, 6, 126-9.

30. Engel H, Kazemier B, Keck W.(1991). Murein-metabolizlng enzymes from Escherichia coli: sequence analysis and controlled overexpression of the sit gene, which encodes the soluble lytic transglycosylase., J Bacteriol., 173, 6773-6782.

31. Foster SJ & Johnstone K. (1987). Purification and properties of a germination-specific cortex lytic enzyme from spores of Bacillus megaterium KM. Biochem. J., 242, 573-579.

32. Foster SJ & Johnstone К (1990) Pulling the trigger: the mechanism of bacterial spore germination. Mol Microbiol, 4, 137-141.

33. Foster SJ & Johnstone К (1988) Germination-specific corlex-lytic enzyme is activated during triggering of Bacillus megaterium KM spore germination. Mol. Microbiol., 2, 727-733.

34. Flynn, J. L. and Chan, J. (2001). Tuberculosis: latency and reactivation. Infect Immun, 69, 4195201.

35. Fuqua, W. C., Winans, S. C. and Greenberg, E. P. (1994). Quorum sensing in bacteria: the LuxR and Luxl family of cell density responsive transcriptional regulators, J. Bacteriol., 176, 269-275.

36. Garcia-Lara, J., Martinez, J., Vilamu, M. and Vives-Rego, J. (1993). Effect of previous growth conditions on the starvation-survival of Escherichia coli in seawater. J Gen Microbiol, 139, 1425-31.

37. Gerhardt P. & Marquis R.E., (1989) Spore thermoresistance mechanisms. In: Smith I, Slepecky R, Seltow P (eds) Regulation of procaryotic development (pp43-46). American Society for Microbiology, Washington, DC.

38. Gupta, S., Pandit, S. В., Srinivasan, N. and Chatterji, D. (2002). Proteomics analysis of carbon-starved Mycobacterium smegmatis: induction of Dps-like protein. Protein Eng, 15, 503-12.

39. Grossman, A. (1995). Genetic Networks Controlling the Initiation of Sporulation and the Development of Genetic Competence in Bacillus Subtilis. Annu.Rev. Genetics, 29, 477-508.

40. Hengge-Aronis, R. (1993). In "Starvation in bacteria" (S. Kjelleberg, ed.), pp. 171-200. Plenum Press, New York.

41. Hengge-Aronis, R. (1999). Interplay of global regulators and cell physiology in the general stress response of Escherichia coli. Curr Opin Microbiol, 2, 148-52.

42. Hess J and Kaufmann SHE. (1999) Live antigen carriers as tools for improved anti-tuberculosis vaccines. FEMS Immunol. Med. Microbiol., 23,165-173.

43. Hess J. and Kaufmann SHE. (1993) Vaccination strategies against intracellular microbes. FEMS Microbiol. Immunol., 7,95-103.

44. Huygen K, Content J, Denis О et al. (1996) Immunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccine. Nature Medicine., 2, 893-898.

45. Hsieh LK & Vary JC (1975) Germination and peptidoglycan solubilisation in Bacillus megaterium spores. J. Bacteriol., 123,463-470

46. Hinshelwood, C. N. (1946).The chemical kinetics of the bacterial cell.The Clarendon Press. Oxford, England.

47. Hoch, J. A. (2000). Two-component and phosphorelay signal transduction. Curr Opin Microbiol, 3, 165-70.

48. Holtje JV. (1995). From growth to autolysis: the murein hydrolases in Escherihia coli. Arch Microbiol., 164, 243-254.

49. Hosoya, H., Matsuoka, Т., Hosoya, N., Tkahashi, T. and Kosaka, T. (1995). Presence of a Tetrahymena growth promoting activity in fetal bovine serum. Develop.Growth Differ., 37, 347353.

50. Hu, Y. M., Butcher, P. D., Sole, K., Mitchison, D. A. and Coates, A. R. (1998). Protein synthesis is shutdown in dormant Mycobacterium tuberculosis and is reversed by oxygen or heat shock. FEMS Microbiol Lett, 158, 139-45.

51. Kaiser, D. and Losick, R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Cell, 73, 873-85.

52. Kamath AT, Feng CG, Macdonald M et al. (1999) Differential protective efficacy of DNA vaccines expressing secreted proteins of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 67, 17021707.

53. Kim JJ, Bagarazzi ML, Trivedy N et al. (1997) Engineering of in vivo immune responses to DNA immunization via codelivery of costimulatory molecule genes. Nature Biotechnology, 15, 641646.

54. Kaprelyants, A. S., Gottschal, J. C. and Kell, D. B. (1993). Dormancy in non-sporulating bacteria. FEMS Microbiol Rev, 10, 271 -85.

55. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. Journal of Applied Bacteriology, 72, 410-422.

56. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus: flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Appl Environ Microbiol, 59, 3187-3196.

57. Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1996). Do bacteria need to communicate with each other for growth? Trends Microbiol, 4, 237-42.

58. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V. and Kell, D. B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Lett, 115, 347-352.

59. Kaprelyants, A. S., Mukamolova, G. V., Kormer, S. S., Weichart, D. H., Young, M. and Kell, D. B. (1999). Intercellular signalling and the multiplication of prolcaryotes: bacterial cytokines. Symp Soc Gen Microbiol, 57, 33-69.

60. Keer, J., Smeulders, M. J. and Williams, H. D. (2001). A purF mutant of Mycobacterium smegmatis has impaired survival during oxygen-starved stationary phase. Microbiology, 147, 473-81.

61. Kell, D. В., Kaprelyants, A. S., Weichart, D. H., Harwood, C. R. and Barer, M. R. (1998). Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues. Antonie Van Leeuwenhoek,73, 169-87.

62. Kell, D. B. and Young, M. (2000). Bacterial dormancy and culturability: the role of autocrine growth factors. Curr Opin Microbiol 3, 238-243.

63. Makino S, Ito N, Inoue T, Miyata S & Moriyama R (1994) A sporelytic enzyme released from Bacillus cereus during germination. Microbiology, 140, 1403-1410.

64. Moriyama R, Hattori A, Miyata S, Kudoh, S & Makino S (1996b) A gene (sleB) encoding a sporelytic enzyme from Bacillus subtilis and response of the enzyme to L-alanine-meaiated germination.

65. J. Bacteriol., 178,6059-6063.

66. Magarinos, В., Romalde, J. L., Barja, J. L. and Toranzo, A. E. (1994). Evidence of a dormant but infective state of the fish pathogen Pasteurella piscicida in seawater and sediment. Appl Environ Microbiol ,60, 180-6.

67. Mary, P., Chihib, N. E., Charafeddine, O., Defives, C. and Hornez, J. P. (2002). Starvation survival and viable but nonculturable states in Aeromonas hydrophila. Microb Ecol, 43, 250-258.

68. McCune, R. M., Feldmann, F. M., Lambert, H. P. and McDermott, W. (1966a). Microbial persistence. I. The capacity of tubercle bacilli to survive sterilization in mouse tissues. J Exp Med, 123, 445-68.

69. McCune, R. M., Feldmann, F. M. and McDermott, W. (1966b). Microbial persistence. II. Characteristics of the sterile state of tubercle bacilli. J Exp Med, 123, 469-86.

70. Morita, R. Y. (1990). The starvation-survival state of microorganisms in nature and its relationship to bioavailable energy. Experientia, 46, 813-817.

71. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S. and Kell, D. B. (1995a). Secretion of an antibacterial factor during resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in an extendedstationary phase. Antonie Van Leeuwenhoek, 67, 289-95.

72. Mukamolova, G. V., Kaprelyants, A. S., Young, D. I., Young M. and Kell, D. В. (1998a). A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 8916-21.

73. Mukamolova, G. V., Kormer, S. S., Yanopolskaya, N. D. and Kaprelyants, A. S. (1995b). Properties of dormant cells in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus during prolonged incubation. Microbiology, 64, 284-288.

74. Mukamolova, G. V., Yanopolskaya, N. D., Kell, D. В. .and Kaprelyants, A. S. (1998). On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie Van Leeuwenhoek, 73, 23743.

75. Oliver, J. D., Nilsson, L. and Kjelleberg, S. (1991). Formation of nonculturable Vibrio vulnificus cells and its relationship to the starvation state. Appl Environ Microbiol, 57, 2640-4.

76. Ostling, J., McDougald, D., Marouga, R. and Kjelleberg, S. (1997). Global analysis of physiological responses in marine bacteria. Electrophoresis, 18, 1441-50.

77. Penfold, W. J.( 1914) J. Hygiene, 14, 215-241.

78. Postgate, J. R. (1976). Death in macrobes and microbes. Symp Soc Gen Microbiol, 26, 1-18.

79. Popham D. L., Helen J., Costello С. E. & Seltow P. (1996). Analysis of peptidoglycan structure of Bacillus subtilis endospore. J. bacteriol, 178, 6451-6458.

80. Rahman, I., Shahamat, M., Chowdhury, M. A. R. and Col well, R. R. (1996). Potential virulence of viable but nonculturable Shigella dysenteriae Type 1. Applied and Environmental Microbiology, 62, 115-120.

81. Ramaiah, N., Ravel, J., Straube, W. L., Hill, R. T. and Colwell, R. R. (2002). Entry of Vibrio harveyi and Vibrio fischeri into the viable but nonculturable state. JAppl Microbiol, 93, 108-16.

82. Ray, B. and Speck, M. L. (1973). Freeze-injury in bacteria. CRC Crit Rev Clin Lab Sci, 4, 161213.

83. Romalde, J. L., Barja, J. L., Magarinos, B. and and Toranzo, A. E. (1994). Starvation-survival processes of bacterial fish pathogen Yersinia ruckeri. System Appl Microbiol, 17, 161-168.

84. Roszak, D. B. and Colwell, R. R. (1987). Survival strategies of bacteria in the natural environment. Microbiol Rev, 51, 365-79.

85. Schneider SW, Larmer J, Henderson RM, Oberleithner H. (1998). Molecular weights of individual proteins correlate with molecular volumes measured by atomic force microscopy. Pflugers Arch Eur J Physiol, 435, 362-367.

86. Skjot RLV, Oettinger T, Rosenkrands I et al. (2000) Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as immunodominant T-cell antigens. Infect. Immun., 68, 214-220.

87. Sekiguchi J. К., Akeo H., Yamamoto F. K., Khazanov J. C., Alonso & Kudora A. (1995). Nucleotide sequence and regulation of a knew putative cell wall hydrolase gene, cwlD, which affects germination in Bacillus subtilis. J. bacteriol, 111, 5582-5589.

88. Signoretto, C., del Mar Lleo, M. and Canepari, P. (2002). Modification of the peptidoglycan of Escherichia coli in the viable but nonculturable state. Curr Microbiol, 44, 125-31.

89. Signoretto, C., del Mar Lleo, M., Tafi, M. C. and Canepari, P. (2000). Cell wall chemical composition of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. Appl Environ Microbiol, 66, 1953-1959.

90. Shida, Т., Mitsugi, K. and Komagata, K. (1977) J. Gen. Appl. Microbiol., Reduction of lag time of bacterial growth. Effect in inoculum size and growth phases of seed cultures. 23, 187-200.

91. Solomon, J., Magnuson, R., Srivastava, A. and Grossman, A. (1995). Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes & Development, 9, 547-558.

92. Spector, M. P. (1998). The starvation-stress response (SSR) of Salmonella. Adv Microb Physiol, 40, 233-79.

93. Stock, A. M., Robinson, V. L. and Goudreau, P. N. (2000). Two-component signal transduction. Annu Rev Biochem, 69, 183-215.

94. Svensson M, Stockinger В and Wick MJ. (1997) Bone-marrow derived dendritic cells can process bacteria for MHC-I and MHC-II presentation to T cells. J. Immunol., 158:4229-4236.

95. Tanabe, H., Nishi, N., Takagi, Y., Wada, F., Akamatsu, I. and Kaji, K. (1990). Purification and identification of growth factor produced by Paramecium tetraurelia. Biochem. Biophys. Res. Commun., 170, 786-792.

96. Tipper D.J. & Gauthier J. J. (1972). Structure of the bacterial endospore. In: Halvorson H. O., Hanson R., Campbell L. L. (eds) Spores V (pp3-12). American Society for Microbiology,1. Washington, DC.

97. Thunnissen AMWH, Dijkstra AJ, Kalk KH, Rozeboom HJ, Engel H, Keck W, Diikstra BW (1994) Doughnut-shaped structure of a bacterial muramidase revealed by X-ray crystallography .Nature, 367, 750-753.

98. Thunnissen A-MWH, Isaacs NW, Dijkstra BW (1995) The catalytic domain of bacterial lytic transglycosylase defines a novel class of lysozymes. Proteins Struct Fund Genet, 22, 245-258.

99. Turpin, P. E., Maycroft, K. A., Rowlands, C. L. and Wellington, E. M. (1993). Viable but non-culturable salmonellas in soil. JAppl Bacteriol, 74, 421-7.

100. Vallesi, A., Giuli, G., Bradshaw, R. A. and Luporini, P. (1995). Autocrine mitogenic activity of pheromones produced by the protozoan ciliate Euplotes raikovi. Nature, 376, 372-374.

101. Velayati, A. A., Bakayev, V. V. and Bahrmand, A. R. (2002). Use of PCR and culture for detection of Mycobacterium tuberculosis in specimens from patients with normal and slow responses to chemotherapy. Scand J Infect Dis, 34, 163-166.

102. Wai, S. N., Mizunoe, Y., Takade, A. and Yoshida, S. (2000). A comparison of solid and liquid media for resuscitation of starvation- and low-temperature-induced nonculturable cells ol Aeromonas hydrophila. Arch Microbiol, 173, 307-310.

103. Warth, A. D. (1978). Molccular structure ofthc bactcrial spore. Adv. Microb. Physiol., 17, 1-47.

104. Warth A. D. & Stominger J., L. (1972). Structure of the peptidoglycan from spores of Bacillus subtilis. Biochemistry, 11, 1389-1396.

105. Warth A. D. & Stominger J., L. (1971). Structure of the peptidoglycan from vegetative cell wall ol Bacillus subtilis. Biochemistry, 10, 4349-4358.

106. Wayne, L. G. (1960). The bacteriology of resected tuberculosis pulmonary lesions. II. Observation on bacilli which are stainable but which cannot be cultured. Am Rev Respir Dis, 82, 370-377.

107. Wayne, L. G. (1976). Dynamics of submerged growth of Mycobacterium tuberculosis under aerobic and microaerophilic conditions. Am Rev Respir Dis, 114, 807-11.

108. Wayne, L. G. and Sohaskey, C. D. (2001). Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol, 55, 139-63.

109. Wayne, L. G. and Sramek, H. A. (1994). Metronidazole is bactericidal to dormant cells of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother, 38, 2054-8.

110. Weiss, M. S., Anderson, D. H., Raffioni, S., Bradshaw, R. A., Ortenzi, C., Luporini, P. and Eisenberg, D. (1995). Proc Nat Acad of Scie С/Л4., 92, 10172-10176.

111. Yeremeev V.V., Lyadova IV, Nikonenko BV et al. (2000). The 19-kD antigen and protective immunity in a murine model of tuberculosis. Clin. Exp. Immunol, 120,274-279.

112. Zhang, Y., Yang, Y., Woods, A., Cotter, R. J. and Sun, Z. (2001). Resuscitation of dormant Mycobacterium tuberculosis by phospholipids or. specific peptides. Biochem Biophys Res Commun, 284,542-7.

113. Zhu X; Venkataprasad N; Ivanyi J; Vordermeier HM (1997) Vaccination with recombinant vaccinia viruses protects mice against Mycobacterium tuberculosis infection. Immunology, 92, 69.

114. Zhu W, Plikaytis В. В., Shinnick Т. M. (2003). Resuscitation factors from mycobacteria: homologs of Micrococcus luteus proteins. Tuberculosis, 83, 261-269.