Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Значение межклеточных взаимодействий у бактерий Micrococcus luteus и Rhodococcus rhodochrous для инициации роста
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Значение межклеточных взаимодействий у бактерий Micrococcus luteus и Rhodococcus rhodochrous для инициации роста"
На правах рукописи
Волошин Сергей Александрович
ЗНАЧЕНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ У БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS LUTEUS И RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ РОСТА
Специальность 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва-2005
Работа выполнена в лаборатории «Биохимии стрессов микроорганизмов» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН
доктор биологических наук, профессор A.C. Капрельянц
доктор биологических наук, профессор Л.И. Воробьёва кандидат биологических наук А.Б. Шевелёв
Ведущая организация Институт биохимии и физиологии
Микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино
Защита состоится 13 декабря 2005 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по принуждению учёной степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
Научный руководитель
Официальные оппоненты
С диссертацией можно ознакомится в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.
Автореферат разослан
J0»
ноября 2005 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук
А.Ф. Орловский
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
В современной микробиологии интенсивно дебатируется вопрос о роли межклеточных взаимодействий при росте различных видов микроорганизмов. Особое внимание привлекает возможная роль таких взаимодействий в отношении прокариотических организмов, популяции которых до недавнего времени считали простой «смесью» клеток, которые растут независимо друг от друга. Однако за последние десять лет появилось много фактов, свидетельствующих о наличии разнообразных систем межклеточной коммуникации прокариотических клеток. В настоящее время хорошо известен целый ряд бактериальных факторов роста, цитокинов и сигнальных молекул, секретируемых клетками, которые участвуют в таких процессах, как споруляция, конъюгация, биолюминесценция, вирулентность и т.д. Также достигнут значительный прогресс в исследовании такого явления как кворум-сенсинг, имеющий большое значение в развитии микробных популяций, в том числе и патогенных бактерий. Но, несмотря на значительные успехи в области химических факторов коммуникации и роста микроорганизмов, остаётся много вопросов, связанных с возможной ролью физических контактов между бактериальными клетками и образованием бактериями специфических скоплений (агрегатов). Хорошо известно, что некоторые бактерии образуют в процессе роста сложные структуры (например, плодовые тела миксобактерий или стрептомицетов), однако, кроме этого, довольно большое число видов бактерий имеет склонность к агрегации при росте в жидких средах, и значение такого явления остаётся до конца не изученным.
На сегодняшний день одними из самых исследованных бактериальных ассоциатов являются биоплёнки и бактериальные маты. Бактериальные маты являются сложными многовидовыми и многослойными ассоциатами, характерными для различных местообитаний на земле и играют большую роль в экстремальных экосистемах. Биоплёнки часто образуются в естественной среде обитания на границе раздела двух фаз и могут состоять всего из одного вида. В настоящее время г изучены процессы образования биоплёнок, значение биоплёнок для медицины и экологии.
Однако, несмотря на активное исследование матов и биоплёнок, уделяется мало внимания агрегации бактерий в жидкой фазе, которая имеет место при развитии мноргих микроорганизмов, особенно в условиях неблагоприятных для роста данного вида. Практически не исследованы механизмы такой агрегации и её роль в развитии бактериальной популяции в различных условиях окружающей среды.
Дели и задачи исследования.
Цель работы состояла в поиске ответа на вопрос: какое значение для развития популяции имеет агрегация ряда бактерий на жидких средах? И если имеет, то, при каких условиях и какие механизмы могут быть ответственны за это явление.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать, как влияют различные факторы, приводящие к изменению степени агрегированное™ клеток (интенсивность перемешивания, температура) на рост бактерий Л гИодоскгош и М. \uteus на разных средах.
2. Проследить, как изменяется степень агрегации бактерий при росте в жидких средах, и как агрегация зависит от состава среды.
3. Выяснить, как связаны инициация роста бактерий и агрегация; изучить влияние химических факторов, секретируемых клетками, на эти процессы.
4. Исследовать какие механизмы лежат в основе диссоциации клеточных агрегатов. Изучить возможное участие секретируемого бактериями белка в этом процессе.
Научная новизна.
1. Впервые показана роль клеточной агрегации для роста бактерий Л. гкойосЬгош и М. Ыеш в жидких обеднённых питательных средах. Предотвращение образования клеточных ассоциатов приводит к резкому замедлению или даже полной остановке роста.
2. Впервые установлена роль частичного автолиза клеток для роста бактерий Л гЪосЬскгош и М. 1Шеш на обеднённых средах. Предполагается, что в лаг-фазе «микрокриптический» рост в пределах бактериальных агрегатов позволяет под держать деление части клеток и дальнейшую инициацию видимого роста.
3. Впервые приведены убедительные доказательства того, что секретируемый клетками М. ¡Шеш белок ЯрГ обладает ферментативной (мурамидазной) активностью в отношении бактериальной клеточной стенки и участвует в процессе диссоциации клеточных агрегатов и инициации активного роста культуры на ранней стадии развития.
Научно-практическое значение.
Полученные в работе должны учитываться в биотехнологических процессах при оптимизации сред и условий культивирования бактерий для получения биологически активных соединений, а также при создании эффективных биологических плёнок для очистки загрязнённых вод.
Полученные результаты были использованы при выполнении Институтом биохимии
работ по приоритетному направлению "Живые системы"" (тема ЖС-КП.6/003).
Апробация работы.
Основные результаты диссертационной работы докладывались на итоговых научных конференциях: «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2003), The 1-st Congress of European Microbiologist (Slovenia, Liubliana, 2003), «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2004), «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой» (Саратов, 2004), «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2005)
Публикапии.
По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в числе которых 3 статьи в российских научных журналах.
Структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на НГ страницах. Список цитируемой литературы включает /¿Г наименований. Иллюстративный материал содержит рисунков и 2. таблиц.
Сокращения, принятые в тексте. LMM - лактатная минимальная среда (от английского Lactic Minimum Medium), ПААГ - полиакриламидный гель, ДЦС-Na -додецилсульфат натрия, ДЭ - дрожжевой экстракт, AT - антитела, БСА - бычий сывороточный альбумин, СБ - связывающий буфер, Dm - оптическая плотность при длине волны 600 нм, TBS - солевой трис-буфер, ТГЭС - трис глицин этанол ДЦС-Na буфер, Rpf - фактор способствующий оживлению (от английского resuscitation promoting factor).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ г Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов, с Первая глава содержит обзор литературы, посвященный различным аспектам межклеточного взаимодействия у бактерий. Рассматриваются химические факторы коммуникации, колониальная организация бактериальных культур и биоплёнки, также показана связь между межклеточным взаимодействием и «социальным поведением» микроорганизмов. Отдельное внимание уделено строению клеточной стенки и ферментам, связанным с её реорганизацией, показана большая роль клеточной стенки в коммуникации между клетками в развивающейся бактериальной популяции. В последнем разделе собрано множество фактов, описывающих межклеточную агрегацию бактерий, растущих в жидких питательных средах и различные механизмы агрегации и её возможная биологическая роль. Во второй главе представлены материалы и методы исследования
2.1. Выращивание бактериальных культур.
Rhodococcus rhodochrous. штамм NCIMB 13805. Культивирование проводили аэробно при 37°С в колбах на качалке (125 мл среды в колбах объемом 750 мл, 250 об/мин и 70 об/мин) в богатой питательной среде broth Е («Himedia», Индия) или модифицированной среде Сатона (г/л: MgS04'7H20 - 0,5; L-аспарагин - 4; железоаммонийный цитрат - 0,05; трёхзамещённый цитрат натрия - 2; К2НР04'ЗН20 - 7,75; NaH2P042H20 - 4,25; 1% раствор ZnS04'7H20 - 0,1 мл; глицерина - 60 мл).
Micrococcus luteus. штамм NCIMB 13267. Культивирование проводили аэробно при 30°С в колбах на качалке (200 мл среды в колбах объемом 750 мл, 200 об/мин и 70 об/мин) в богатой питательной среде broth Е («Himedia», Индия) или минимальной среде с лактатом лития (LMM) (г/л: КН2Р04 - 8; NH4CI - 4; лактат лития - 5; биотин - 0,005; метионин - 0,02; инозин - 0,04; тиамин - 0,04; мг/мл: ZnS04 - 0,05; Н3В04 - 0,05; CuS04 - 0,024; Na2Mo04 - 0,025; Ca(N03)2"6H20 - 0,05; MnCl2 - 0,5; MgS04 - 7,0; FeS04 - 1,0).
2.2. Общее число клеток (ОЧК) в миллилитре культуры определяли в камере Горяева, по формуле: п/5'108, где п - среднее количество клеток в одном малом квадрате.
23. Микроскопические исследования проводили с помощью микроскопа Eclipse Е4000 («Nikon», Япония), используя приставку для фазового контраста и цифровую камеру Camedia С-4040 («Olympus», Япония). Для определения степени повреждения мембраны клетки окрашивали пропидиум иодидом (4 мкМ в 50 мМ фосфатном буфере, pH 7), который окрашивает клетки только с поврежденной мембраной за счет проникновения внутрь и взаимодействия с нуклеиновыми кислотами.
2.4. Распределение клеток по размеру. Распределение клеток и клеточных агрегатов по размерам регистрировали с помощью дифракции лазерного луча на дифракционном определителе размера частиц "Malvern ЗбООЕс". Для анализа распределений частиц по размерам была использована зависимость: n,-f(rгде n¡ -численная доля размерной группы rt. Для этих целей мы также использовали метод динамического светорассеивания с использованием фотонного спектрометра («PhotoCor Instruments Inc.», США). Данные обрабатывали с помощью коррелирующей программы PhotoCor-FC и DynaLS («Alango», Израиль).
2.5. Получение супернатантов для стимуляции роста бактерий. Культуры R. rhodochrous и М. luteus были выращены на среде Сатона и LMM соответственно. После центрифугирования (12000 g, 20 мин) супернатанты стерилизовали фильтрацией через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Для концентрирования супернатанта использовали роторный испаритель («Labconco», США).
2.6. Анализ компонентов супернатанта. Анализ супернатанта проводили с помощью метода гель-фильтрации на колонке с носителем Sephadex G-10 («Pharmacia», США). На колонку наносили концентрированный супернатант (1% от объёма колонки) и элюировали минимальной средой (LMM), после чего
получившиеся фракции тестировали на биологическую активность в культуральных плашках при 30°С на качалке 200 об/мин. После этого повторно наносили супернатант на колонку, но элюировали водой. Отобранные по биологической активности фракции анализировали с помощью метода хроматомассспектроскопии («SHIMADZU», Япония).
2.7. Электрофорез белков в ПААГ по Лэммли. Денатурирующий электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия проводили по стандартным методикам в электрофоретической камере фирмы («Bio-Rad» США) при 4°С, ток 30 мА на 1 пластину. Для электрофореза использовали 12% ПААГ.
2.8. Иммуноблоттинг рекомбинантных белков.
Электрофорез белков проводили в двух одинаковых пластинах 12% SDS ПААГ, одну из которых затем окрашивали коллоидным Кумасси G-250, а вторую использовали для собственно блоттинга, проводившегося в специальной ячейке («BIORAD», США) в буфере ТГЭС, (г/л трис - 3,2, глицин - 14,4, ДЦС-Na - 1, этанол - 200 мл, довести дистиллированной водой до 1 л). Блоттинг проходил на мембрану Millipore Nitrocellulose HAHY (размер пор 0,45 мкм) в течение 16 часов при 50 мА и 4°С. Снижение неспецифического связывания проводили инкубацией мембраны в буфере TBS+3%BCA при 37°С и 50 об/мин в течение часа. После этого мембрану промывали 3 раза по 10 мл TBS (20 мМ трис-HCl, pH 8,0; 150 шМ NaCl (20 ml 1 М трис-HCl, pH 8,0; 8,7 г NaCl; Н20 до 1 л)). Первичные AT (поликлональные кроличьи AT против Rpf: 100 мкл препарата AT в 8 мл TBS) инкубировали с мембраной в течение 1-2 часов при 37°С и 50 об/мин, после чего мембрану промывали 3 раза по 5 мин (10 мл TBS + твин 80 (0,05%)) при 37°С и 50 об/мин. Вторичные AT (анти-кроличий щелочной фосфатазный коньюгат («Sigma», Германия)) использовали в разведении 1:5000 (2 мкл анти-кроличий щелочной фосфатазный коньюгат / 10 мл TBS + твин 80 (0,05%)). Анализ проводили в течение 40 мин при 37°С и 50 об/мин. Мембрану промывали 3 раза по 5 мин (10 мл TBS + твин 80 (0,05%)) при 37°С, затем аналогично - TBS, после чего окрашивали 3-5 мин специальным красителем («Sigma», Германия) при комнатной температуре.
2.9. Иммуноферментный анализ. Бактериальный супернатант (0.2 мл) был помещен в пластиковые 96-луночные планшеты («Costar», США), которые инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затем лунки промывали 3 раза фосфатным буфером, содержащим 0,05% твина-80. Первичные анти-Rpf антитела кролика добавляли в разведении 1:10000 в каждую лунку, и дальнейшая инкубация проходила при 37°С в течение 45 минут. После 3-х кратной промывки добавляли вторичные антитела (анти-кроличий щелочной фосфатазный коньюгат (Sigma, 1:5000)). Затем после очередного цикла промывки добавляли субстрат щелочной фосфатазы и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Интенсивность окраски определяли сканированием планшетов при длине волны 405 нм («Labsystem optical reader», Финляндия). Для калибровки метода использовали различные концентрации рекомбинантного белка Rpf в соответствующей культуральной среде.
2.10. Получение Rpf н его модификаций. Рекомбинантный Rpf белок из штамма Е. coli LMG194, содержащий плазмиду Rpf-HisTag/pBAD/glll, был получен при выращивании клеток продуцента на RM среде (г/л: казаминовые кислоты - 20, Na2HP04 - 6, КН2Р04 - 3, NaCl - 0,5, NH4CI - 1; мл/л: 1М раствор тиамина - 0,1,1М раствор MgCl2 - 1, рН 7,4 с добавлением 10 мл 20% раствора глюкозы и 1мл 10% раствора ампициллина) при 37°С и 150 об/мин. Индукцию проводили добавлением 0,01% L-арабинозы («ДиаМ», Россия) после того, как плотность культуры достигала 0,5-0,7 единиц оптической плотности (D^oo)- После 4-х часовой инкубации культуру центрифугировали в течение 15 минут при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в буфере, содержащем 50 мМ NaH2P04, 300 мМ NaCl, рН 8,0, 10 мкг/мл РНКазы и 10 мкг/мл ДНКазы. Клеточную суспензию озвучивали на ультразвуке («Soniprep 150», Япония) после центрифугирования (10000 об/мин, 30 минут) супернатант разбавляли в 3 раза и наносили на аффинную колонку Ni-NTA агароза («Qiagen», Германия). Колонку промыли последовательно 10 объемами СБ, 10 объемами СБ с 10 мМ имидазола («Sigma», Германия), 2 объемами СБ с 20 мМ имидазола. Элюцию проводили 20 мМ трис-HCl рН 7,2, со 100 мМ гистидина («Sigma», Германия). Элюат диализовали против 20 мМ трис-HCl рН 7,2 в течение ночи при температуре 4°С. Готовый препарат белка разводили равным объемом глицерина и хранили при -20°С. Количество белка определяли спектрофотометрическим методом. Рекомбинантные белки с аминокислотными заменами получали по той же схеме, что и не модифицированный Rpf.
2.11. Приготовление грубого препарата клеточных стенок М. lute us. Культуру М luteus (Штамм NCIMB 13267) выращивали на богатой среде broth Е («Himedia», Индия) при 30°С на качалке (200 об/мин) до оптической плотности (D6oo) равной 1,5 единицам. После этою клетки осаждали на центрифуге при 10000 об/мин в течение 15 минут. Полученный осадок промывали 0,9% раствором NaCl три раза. Промытый осадок ресуспендировали в 20 мл 4% раствора ДЦС-Na и автоклавировали 20 минут при 121°С. Затем суспензию центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Осадок отмывали от ДЦС-Na три раза 0,1% раствором Тритона Х-100, а затем три раза 10 мМ буфером трис-HCl рН 8,0. После этого суспензию высушивали на роторном испарителе до полного испарения влаги. Высушенную суспензию хранили при -20°С.
2.12. Определение литической активности белка Rpf по отношению к грубому препарату клеточных стенок М. luteus. Высушенный осадок клеток, обработанных ДЦС-Na ресуспендировали в фосфатном буфере рН 7,0 и гомогенизировали полученную суспензию в стеклянном гомогенизаторе. Суспензию добавляли в 96-луночный планшет по 300 мкл в каждую лунку. В лунки добавляли белок Rpf до конечной концентрации 1 мкг/мл. Несколько лунок оставляли в качестве контрольных (добавляли 100 мМ фосфатный буфер рН 7,0). После этого образцы инкубировали 2 часа при 30°С и 900 об/мин. Литическую активность Rpf смотрели по уменьшению оптической плотности суспензии обработанных клеток
(Обоо), которую измеряли на планшетном спектрофотометре Multiscan Ascent («Thermo labsistems», Финляндия)
2.13. Определение мурамидазиой активности белков Rpf и его модификаций.
Для определения мурамидазиой активности рекомбинантного белка использовали субстрат 4-метилумбелиферил-Э-<1-НК',К"триацетилхитотриозид - (MUF-3-NAG) («Sigma», Германия). Субстрат (конечная концентрация 8 мкМ) инкубировали с белком (конечная концентрация 1-10 мкг/мл) в присутствии 5 мМ MgSOi в 50 мМ цитратном буфере (pH 6,0) в течение 3 часов при температуре 37°С. Интенсивность флюоресценции измеряли на спектрофлуориметре RF-5301PC («SHIMADZU», Япония) при длине волны возбуждения 360 нм и эмиссии 450 нм.
2.14. Проточная цитометрия. Проводилась с помощью проточного цитометра («Skatron Ltd», Англия). Для детекции родамина 123 (маркёр мембранного потенциала) был использован флуоресцентный фильтр со следующими характеристиками: длина волны возбуждения 470 - 495 нм, длина волны испускания 520 - 550 нм. Образцы окрашивались с помощью родамина 123 (конечная концентрация 0,3 мкМ) в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, pH 7,4, в течение 1 часа при комнатной температуре.
В третьей главе представлены собственные результаты.
Ингибирующий эффект интенсивного перемешивания на рост культур Rhodococcus rhodochrous и Micrococcus luteus в жидких обеднённых средах.
Было обнаружено, что рост культуры R. rhodochrous в жидкой обеднённой среде (среда Сатана) ингибировался интенсивным перемешиванием (в колбах с отбойниками) (Рис. 1), в то время как на богатой среде этого явления не наблюдалось. Одним из возможных объяснений данного явления могло быть повышенное количество кислорода, наблюдающееся при интенсивном перемешивании. Однако R. rhodochrous является облигатным аэробом, и кислород не должен ингибировать её рост. Для контроля был поставлен эксперимент, в котором в неподвижную колбу стерильный воздух подавался принудительно. Как видно из рис. 1 в этом опыте наблюдался видимый рост культуры, из чего следует, что повышенное содержание кислорода не является причиной остановки роста. Аналогичное явление было обнаружено при исследовании роста другой ГЦ-богатой бактерии - М. luteus: при культивировании в жидкой обеднённой среде (LMM), интенсивное перемешивание ингибировало рост (Рис. 2), в то время как на богатой среде (МПБ) такого эффекта не наблюдалось. В данном случае надо учесть, что температура культивирования была оптимальной для роста бактерий на богатой среде (37°С). Однако при снижении температуры до 30°С, рост культуры в жидкой обеднённой среде становился менее чувствителен к перемешиванию. Надо заметить, что на агаризованных обеднённых средах обе эти культуры росли хорошо и колическтво колоний было близко к таковому на богатой агаризованной среде (МПА). Изучение культуры R. rhodochrous в световом микроскопе обнаружило, что при оптимальных условиях культивирования в жидкой среде в начальных фазах
роста клетки в большинстве своём находятся в агрегатах, тогда как в условиях интенсивного перемешивания культура в основном представлена единичными клетками (Рис. 3). Эти визуальные наблюдения были подтверждены с помощью метода динамического светорассеивания, который позволяет оценивать состояние культуры при малых концентрациях клеток. На рисунке 4 представлены данные распределения частиц в культуре М. 1Шеш при разных режимах культивирования. Видно, что при умеренном перемешивании и пониженной температуре культура представлена в основном довольно крупными агрегатами, в тоже время при повышенной температуре и интенсивном перемешивании культура представлена в основном единичными клетками и небольшими агрегатами. Таким образом, интенсивное перемешивание сильно влияет на степень агрегированное™ этих культур при выращивании в жидких средах и в тоже время ингибирует рост в жидких обеднённых средах.
Однако отсутствие видимого роста не позволяет сделать вывод о том, что реально происходит с культурой, погибают ли клетки или остаются жизнеспособными при интенсивном перемешивании. Для ответа на этот вопрос была прослежена динамика изменения жизнеспособных (колониеобразующих) единиц. На рисунке 5 видно, что при росте в жидкой обеднённой среде и интенсивном перемешивании клетки в культуре Я. гИоск>скгош производят несколько генераций, после чего прекращают делиться, однако остаются жизнеспособными длительное время. Добавление к среде культивирования небольших (0,5%) количеств дрожжевого экстракта (ДЭ) полностью снимало ингибирующий эффект интенсивного перемешивания. Это ещё раз подтверждает, что ингибирование проявляется только на обеднённых средах. Культура М. 1шеия ведёт себя подобным образом в аналогичных условиях.
Если клетки А гкойосНгоиз оставались жизнеспособными после остановки деления, логично было бы предположить, что культура возобновит рост при снижении интенсивности перемешивания. Для проверки этого предположения, был проведен эксперимент, в котором первоначальная скорость качалки (250 об/мин) была снижена через определённое время (100 часов) до 70 об/мин. Как видно из рисунка 6, при уменьшении интенсивности перемешивания культура начинала расти, и вырастала до плотностей, характерных для данной среды. Вышеприведённые данные свидетельствуют о том, что интенсивное перемешивание препятствует агрегации клеток Я. гЪоЛосЪгоиь и М Шеш, которая, по-видимому, необходима для инициации роста на обеднённых питательных средах.
Клеточная агрегация на ранних стадиях развития бактериальных культур и её механизмы.
Было замечено, что чувствительность роста культур к интенсивности перемешивания характерна только для периода лаг-фазы, в фазе логарифмического роста интенсивное перемешивание не ингибирует рост, а даже наоборот способствует ему. Чем же отличаются клетки в разных фазах с точки зрения
образования межклеточных контактов? На рисунке 7 представлены фотографии, на которых показана степень агрегированности культуры Я. гЪосЬскгоиз в разных фазах при росте в условиях умеренного перемешивания. Как видно из рисунка, в инокуляте, в основном, присутствуют единичные клетки. Однако в начале логарифмической фазы роста наблюдается большое количество агрегатов, причём некоторые из них заключены в некие полупрозрачные структуры - «покровы». Агрегаты постепенно распадаются в процессе экспоненциального роста и в стационарной фазе культура представлена в основном единичными клетками.
Для количественной оценки состояния агрегированности клеток был применен метод определения размера частиц с помощью дифракции лазерного луча. Из рисунка 8 видно, что культура в конце лаг-фазы действительно состоит в основном из агрегатов, в то время как к фазе стационарного роста агрегаты практически полностью распадаются на единичные клетки. Такая же картина наблюдается в случае с М. 1и1еш растущем на минимальной среде (в данном опыте был применён метод динамического светорассеивания). Из рисунка 9 видно, что практически сразу после засева происходит уменьшение доли единичных клеток и довольно резкое возрастание доли клеточных агрегатов в культуре. Как только клетки переходят к активному росту, происходит обратный процесс, агрегаты постепенно диссоциируют и в культуре возрастает доля единичных клеток.
О 20 40 ВО 80 100 120 Время/ часы
Рис. 1. Рост культуры £ гкойоекгот при культивировании в жидкой среде Сатова при разных режимах перемешивания. 1-МПБ, интенсивное перемешивание (колба с отбойниками); 2-среда Сатона, умеренное перемешивание (обычная колба); 3-среда Сатона, без перемешивания, принудительная подача воздуха; 4-среда Сатона, интенсивное перемешивание (колба с отбойниками).
Время/чаш
Рис. 2. Рост культуры М. luteus при культивировании в жидкой синтетической синтетической среде (LMM) при разных режимах перемешивания. 1-МПБ, 250 об/мин; 2-LMM, 70 об/мин; 3-LMM, 250 об/мин.
"-Ц aа
W''-М г * Умеренное
' перемешивание
„ 4 (70 об/мин)
¡г- S'-*' '1 ', ri' • "».■>г «•- --
Интенсивное перемешивание
1? * '
^v ' ' tel- - W перемешива!
*V *'#•* Л (250об/мин)
" S*
Рис. 3. Степень агрегированности культуры R. rhodochrous растущей при разных режимах перемешивания в начале фазы логарифмического роста. Увеличение ><1000.
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
Доля частиц
в образце
Крупные I агрегаты]
30°С,
200 об/мин Т
0,01
100
1е+4 гё+6 1сН-8 Размер частиц
1
0,9 0,8 0,7 0,6
0,5 0,4 0,3 ОД 0,1 0)
Доля частиц в образце
единичные клетки
37°С,
250 об/мин
Средние агрегаты
0,01
1
1
100
1<Н-4 1е+6 1Р+-8
Размер частиц
Рис. 4. Распределение клеток и клеточных агрегатов по размерам в культуре М. Шеш, растущей на минимальной среде в разных условиях в начале фазы логарифмического роста (по данным динамического светорассеивания).
(КОЕ,ад/мд)
1,00К+07 •
1,00Е-Н)6 1,0015+05 1.00Е+04 1.00Е+03
0
150
200
50 100
ВпеияАшсы
Рис. 5. Изменение концентрации колониеобразующих единиц при выращивании культуры Я. гкоёоскгош в условиях умеренного перемешивания и в условиях интенсивного перемешивания. 1-среда Сатона+ДЭ, обычная колба; 2-среда Сатона+ДЭ, колба с отбойниками; 3-среда Сатона, обычная колба; 4-среда Сатона, колба с отбойниками.
Бреия/чаеы
Рис. 6. Возобновление роста культуры Л г!кн1оскгош в жидкой среде Сатона после снижения интенсивности перемешивания среды культивирования.
Следует заметить, что на богатых средах поведение культур в целом напоминало таковое на обеднённых. Однако, если на богатых средах время распада а1регатов было небольшим и в начале фазы логарифмического роста крупных агрегатов в культуре уже практически не было, то в случае обеднённой среды распад агрегатов растягивался на всю фазу логарифмического роста.
Так как чувствительность к перемешиванию проявляется только в лаг-фазе, а в фазе логарифмического роста такой чувствительности нет, то нельзя было исключить, что это связано с изменением состава самой среды. Для того чтобы проверить это предположение, был поставлен эксперимент, в котором вместо обеднённой среды использовали супернатант, взятый из фазы логарифмического роста (для каждой бактерии соответственно своя среда). Как видно из рисунка 10 в этих условиях никакого ингибирующего влияния перемешивания не наблюдается, и бактерии растут так же, как и на богатой среде. Кроме того, наблюдалась зависимость стимулирующего эффекта супернатанта от фазы роста культуры, из которой супернатант был получен. На рисунке 11 представлены три кривые роста М. Ыет. Как видно, кривая роста в пермессивных условиях представлена тремя периодами: практически сразу после засева следует активный рост (период I), после которого наступает довольно длительный период «замедленного роста» (период II), затем культура переходит в фазу экспоненциального роста (период 1П). Во время периода П визуальный рост культуры практически не наблюдается, и клетки собраны в агрегаты. Как показали наши эксперименты, супернатант, взятый из периода I или II, не проявляет никаких стимулирующих свойств в непермессивных условиях (повышенная температура и интенсивное перемешивание), а супернатант взятый из периода Ш стимулировал рост клеток в таких условиях. Т.е. супернатант,
12
взятый из этого периода, напоминает полноценную среду, а супернатант, взятый из периода I или П такими свойствами не обладает.
На основании вышеизложенных данных был сделан вывод, что распад агрегатов и приобретение супернатантом стимулирующей активности связаны между собой. Очевидно, что в супернатанте происходит накопление каких-то веществ, способствующих росту клеток. Одним из простых объяснений может быть то, что эти вещества являются продуктами распада части клеток в популяции. И, действительно, с помощью метода проточной цитометрии (который позволяет оценить физиологическое состояние отдельных клеток, в данном случае по величине мембранного потенциала) были получены данные, из которых следует, что в лаг-фазе доля активных клеток представляет собой всего 20% от общего числа клеток в культуре (Рис. 12). Однако эта цифра значительно увеличивается, когда культура переходит к активному росту. Используя флуоресцентный краситель -пропидиум иодид, проникающий в клетки с повреждённой мембраной, было также обнаружено, что в агрегатах очень много таких клеток (Рис. 13). Это даёт возможность предполагать, что повреждённые клетки являются источниками веществ, стимулирующих рост жизнеспособных клеток.
Анализ супернатант с помощью диализа и ультрафильтрации показал, что стимулирующие вещества являются низкомолекулярными и устойчивы к нагреванию (автоклавирование при 121°С). Дальнейший анализ супернатанта с помощью метода гель-фильтрации с последующей хромато-массспектроскопией показал, что стимулирующую активность имеют небольшие по массе вещества, доминирующим из которых является этил-гексановая кислота (Рис. 14). Поскольку в этих экспериментах для выращивания культы использовалась синтетическая среда, то источником этой кислоты могли быть только клетки. Но, очевидно, что в супернатанте присутствуют ещё какие-то низкомолекулярные вещества, пока не идентифицированные, которые также могут стимулировать рост клеток.
Подводя итог, можно сделать следующее промежуточное заключение. Клетки М. 1шеш и Я. гЬос1оскгош в лаг-фазе могут находиться длительное время в агрегатах в жизнеспособном состоянии, возможно, за счет использования питательных веществ, образующихся вследствие лизиса части клеток («микро»криптический рост). Когда концентрация этих веществ достигает определённого размера, достаточного для начала объёмного роста, культура переходит в фазу экспоненциального развития; этот переход связан с постепенным распадом агрегатов.
r -4" 1
О < У
- *
.,->. V) л » -
- •
,»л у« У f'
." v.
"V рт-У < <
. г* -д ' У
'5 f
A - инокулят,
В - начало фазы
логарифмического
роста
С - тоже, что В, но \ " под большим увеличением,
s
■А • D
D - стационарная фаза
Рис. 7. Агрегация клеток Л. гИоЛосЬтот, растущих в жидкой среде Сатана
35 30 25 20 15J 10 5 0J
Поздняя лаг-фаза Стационарная фаза
5 мкм
35 30 25 20 15 10 5
а
%
2 мкм
5 мкм
Размеры частиц, мкм Размеры частиц, мкм
Рис. 8. Процентное содержание частиц различного размера в растущей культуре R. rhodochrous (данные, полученные с помощью дифракционного определителя размера частиц "Malvern ЗбООЕс").
Врсмх/часы
Рис. 9. Численное распределение клеточных агрегатов различного размера н единичных клеток в культуре М. 1Меш, растущей на синтетической среде (по данным динамического светорассеивания). По левой оси ординат отложена доля частиц разного размера в образце, /-средние агрегаты (5-50 мкм), 2-мелкие агрегаты и одиночные клетки (0,5-5 мкм), 5-крупные агрегаты (50-1000 мкм), 4-Т)т растущей культуры. Римскими цифрами обозначены периоды, в которых культура находится в разном агрегированном состоянии.
Рис. 10. Стимуляция роста R. rhodochrous и М. luteus, растущих на бедных средах при интенсивном перемешивании, супернатантами активных культур.
1-М luteus, рост в супернатанте взятом из фазы экспоненциального роста той же бактерии, выращенной на LMM; 2-7?. rhodochrous, рост в супернатанте взятом из фазы экспоненциального роста той же бактерии, выращенной на среде Сатона; 3-М luteus, рост на LMM; 4-Ä. rhodochrous, рост на среде Сатона.
0,25 -0,2 -0,15 -ОД ■ 0,05 -О л»"
О 20 40 <0 80
Воема/ часы
Рис. 11. Стимулирующая активность супернатанта М. luteus, полученного из культуры, находящейся на разных фазах развития на синтетической среде (LMM). 1-М luteus, рост в супернатанте взятом из периода 1П в непермессивных условиях (интенсивное перемешивание); 2-М luteus, рост на среде LMM в пермессивных условиях; 3-М. luteus, рост в супернатанте взятом из периода II в непермессивных условиях. Римскими цифрами обозначены периоды роста на начальных стадиях развития культуры М luteus в среде LMM.
kto
яггапнмт
клеток
40
Время/часы
Рис. 12. Изменение относительного содержания активных клеток М. luteus на начальных стадиях развития культуры, растущей на минимальной среде LMM. 1-кривая роста культуры (D«»), 2-относительное содержание клеток, имеющих выраженный мембранный потенциал, определенный методом проточной цитометрии с помощью флуоресцентного зонда - родамина 123.
. - Клеточные агрегаты в Ä,/ фазово-контрастном микроскопе, увеличение xlOOO.
Эти же агрегаты во флуоресцентном микроскопе, увеличение у1000.
Рис. 13. Обнаружение повреждённых клеток в агрегатах R. rhodococcus в поздней лаг-фазе.
СгНа
с —с— С —С— -с—с(
Этил-гексановая кислота
Рис. 14. Хроматограмма супернатанта полученная с помощью метода хромато-массспектроскопни (супернатант, полученный при выращивании М. luteus на минимальной среде (LMM), фаза логарифмического роста).
Роль белка Rpf в дезагрегации клеточных ассоциатов бактерии М. luteus.
Одной из задач нашего исследования было изучение процесса распада агрегатов и его механизмы. По-видимому, в нём должны участвовать внеклеточные ферменты, проявляющие литическую активность по отношению к клеточной стенке бактерий. Из литературных данных известно, что белок Rpf, ранее открытый и
исследованный в нашей лаборатории, как фактор, стимулирующий активацию покоящихся клеток М. \uteus, имеет структурное сходство с ферментом лизоцимом, известным, как литический фермент бактериальных клеточных стенок. Из рисунка 15 видно, что у лизоцима имеются три альфа-спирали пространственное расположение которых сходно с расположением альфа-спиралей консервативного домена Ир£ согласно предсказанной модели на основе аминокислотной последовательности Яр£
Исходя из этих данных, можно предположить, что ЯрГ также может обладать литической активностью по отношению к клеточным стенкам, и, таким образом, принимать участие в дезагрегации клеточных ассоциатов. Для выявления мурамидазной активности мы использовали специфический субстрат МУФ-З-НАГ, применяемый для измерения активности лизоцима и являющийся линейной цепочкой трех молекул ацетил глюкозамина, входящего в структуру клеточной стенки. Как видно из рисунка 16, рекомбинантная форма белка ЯрГ действительно способна гидролизовать 1-4 связи в молекуле МУФ-З-НАГ. Однако удельная активность ЯрГ в 50 раз меньше, чем таковая у лизоцима. Для того чтобы выяснить, насколько механизм катализа молекулы близок к таковому у лизоцима, были использованы мутантные белки Ир^ у которых в предполагаемом (по аналогии с лизоцимом) активном центре произведены замены важных для катализа аминокислот. Например, замена глутамата Е54 - центральной аминокислоты для катализа у лизоцима - на глутамин приводила лишь к некоторому уменьшению активности. Замены Е54 на аланин и, особенно, лизин вызывали значительно больший эффект подавления литической активности Яр5 (Рис. 16). Были также исследованы и другие замены - например, двух остатков цистеина, которые могли скреплять молекулу ЯрГ в виде дисульфидной связи. Единичные замены С53 и С114 приводили лишь к частичному подавлению активности, а их совместная замена приводила к практически полной инактивации (Рис. 16).
Эти данные позволили нам предположить, что, по-видимому, между лизоцимом и ЯрГ действительно имеется определенное сходство, однако возможно механизм действия ЛрГ все же отличается от такового у лизоцима. В любом случае действие ИрГ приводит не к тотальному лизису всей клеточной стенки, а, по-видимому, к расщеплению определённых В-1-4 связей в структуре муреина, что делает пептидогликановый слой более рыхлым и позволяет проводить с ним различные модификации, которые, в частности, имеют место при распаде клеточных агрегатов.
Для того чтобы выяснить, как продукция 11рГ коррелирует с распадом клеточных агрегатов отбирали супернатант из растущей культуры М. \uteus и исследовали его с помощью иммуноблоттинга специфическими антителами к Лр£ Оказалось, что максимум Rpf образуется в фазе логарифмического роста (Рис. 17), а именно в этот момент происходит активный распад клеточных агрегатов.
На рисунке 18 представлены данные динамического светорассеивания и световой микроскопии культуры М. Ыеш, взятой из середины логарифмической
фазы роста и обработанной рекомбинантным ЯрГ в концентрации 10 мкг/мл. Видно, что до обработки культура представлена двумя популяциями агрегатов размерами несколько десятков и несколько сотен микрон, после обработки Яр£ культура представлена в основном единичными клетками и маленькими агрегатами размером несколько микрон.
Дополнительное свидетельство о роли И-рГ в дезагрегации было получено при исследовании мутантного штамма М. \uteus с инактивированным геном Ир£ Оказалось, что такой мутант растёт практически, как и дикий тип, однако, при росте клетки сильно аггрегируют (Рис. 19), причём агрегаты данного мутантного штамма не распадаются даже в процессе роста культуры.
Эти данные, конечно, не объясняют детали механизма распада клеточных агрегатов, но являются подтверждением того, что участвует в процессе дезагрегации и, таким образом, способствует активному росту клеток при переходе от лаг-фазы к фазе экспоненциального роста.
Лизоцим Консервативный
Домен ЯрГ
Рис. 15. Структура консервативного домена белка 1?р£
Интенсивность флуоресценции
300
Длина волны, нм
Рис. 16. Мурамидазная активность рекомбинантных белков Ир£
Яр1(1), мутантные формы Ирй Е540(2), Е54А(3), Е54К(4), С53К+С114Т(5); контроль-буфер(6). Е - глутамат, С - цистеин, А - аланин, 0 - глутамин, К - лизин, Т - треонин. (Приведены спектры флуоресценции МШ-З-МАО после 3 часового гидролиза при 37°С в присутствии бежов Лр!)
'1-Й?!
Т4>. " г,,д, , -„,,, а»-а--" ¡¡а» •'№»>>»
' - - > • *
25 к Да 12 к Да
Фаза раннего
Фаза Фаза
раннего позднего
логарифм логарифм стадион
ического ического арного
роста роста роста
Метчики
Рис. 17. Секреторные формы КрГ в культуральной жидкости М. 1шеш.
1 <У> 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О
Доля частиц в образце
0,01
Средние агрегаты
1 100 ШТ
Крупные агрегаты
1е+6¡ё+8 Размер частиц
1 о,» 03
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 ОД 0,1 о
Доля частиц в образце
0,01
Единичные клетки и мелкие агрегаты
"ТЯГ
1е+4 ТШ Те+8 Размер частиц
До обработки
18. Влияние 61 логарифмического роста).
После инкубации с 2 часа, 25°С
Рис. 18. Влияние белка 11рГ на клеточные агрегаты М. Шею (фаза
0 10 20 30 40 50 60 Время/ часы
Рис. 19. Количество Ир^ секретируемого в супернатант, двух культур М. 1Шеш\ мутант по гену гр/ и дикий тип. 1-М ¡Шеш дикий тип; 2-М 1меи$ мутант; З-ЯрГ дикий тип; 4- ИрГ мутант.
Обсуждение.
Клеточная агрегация у некоторых видов бактерий является давно известным фактом. Однако исследователи уделяли мало внимания этому явлению, особенно его биологическому смыслу. В нашей работе мы показали значимость этого явления для выживания бактерий Я. гЪосЬсИгош и М. Шею в стрессовых условиях (обеднённая питательная среда, интенсивное перемешивание)
Исходя из данных, полученных в нашей работе, мы предлагаем следующую гипотезу. В условиях обеднённых питательных сред клетки бактерий, возможно, не способны расти независимо, как индивидуальные организмы, так как для роста нужны некие вещества, которые отсутствуют в среде культивирования. В этих условиях, в лаг-фазе, клетки образуют агрегаты, и дальнейшее развитие культуры происходит в пределах агрегатов. При этом некоторая доля клеток лизируется, и часть продуктов этого лизиса может служить источником субстратов для оставшихся клеток. Логично предположить, что определенная часть субстратов попадает в среду культивирования и концентрация их в макрообьеме повышается. В этот период, видимого роста культуры практически не происходит, и деление клеток, в основном, происходит в пределах агрегатов. В это время также идёт незначительный синтез и его накопление в агрегатах и в среде. Увеличение концентрации питательных веществ в макрообьеме до определённого уровня приводит к тому, что среда становится пригодной для автономного роста бактерий. В результате увеличения синтеза агрегаты начинают распадаться на отдельные клетки, и культура переходит в фазу экспоненциального роста. Однако, если условия не позволяют клеткам образовать агрегаты (интенсивное перемешивание), то культура остаётся в лаг-фазе довольно продолжительное время и затем погибает. Конечно, данная схема является гипотетической, однако она достаточно хорошо объясняет экспериментальные данные, полученные в этой работе. Таким образом, мы предполагаем, что агрегация бактерий путем установления межклеточных контактов при росте в жидких средах позволяет данному виду развиваться на бедной среде в условиях, когда рост единичных клеток невозможен. Такой «кооперативный» тип роста бактерий может представлять новый вид стратегии выживания клеток в экстремальных условиях
Выводы.
1) Рост бактерий Я. гкоЛосИгош и М. Меш в жидких средах сопровождается образованием клеточных агрегатов в лаг-фазе и их распадом в фазе экспоненциального роста.
2) Факторы, препятствующие образованию клеточных агрегатов в лаг-фазе, вызывают остановку роста /?. гкойосИгош и М. Ыеи$ в обеднённой жидкой среде.
3) При росте бактерий в обеднённой жидкой среде происходит частичный лизис клеток и выход в культуральную жидкость низкомолекулярных веществ, способных стимулировать рост бактерий.
4) Секретируемый клетками М. Шеиз белок Б5р£ проявляющий мурамидазную активность, участвует в диссоциации клеточных агрегатов.
5) Предложена новая стратегия роста и размножения бактерий в обеднённых питательных средах, включающая образование клеточных агрегатов на начальных стадиях развития и критический рост.
Список публикаций.
1) Волошин С. А.. Капрельянц А.С. (2003) Роль межклеточных взаимодействий в развитии культуры Rhodococcus rhodochrous при росте в жидких питательных средах. 7-ая школа-конференция молодых ученных, Пущино. С. 268.
2) Volosfain S.A.. Kaprelyants A.S. (2003) Cell-cell contacts are essential for the growth of bacterial cultures under poor nutrient conditions. 1-st congress of European Microbiologist, Liubliana. P. 451.
3) Волошин С. А.. Капрельянц А. С. (2004) Клеточная агрегация как стратегия выживания бактериальных популяций в стрессовых условиях на примере бактерии Micrococcus luteus. 8-ая школа-конференция молодых учённых, Пущино, С. 144.
7) Волошин С. А.. Капрельянц А. С. (2004) Адаптация бактериальных популяций к неполноценным питательным средам как пример «социального поведения» микроорганизмов. Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой, материалы второй региональной конференции молодых учённых. Саратов, С. 37-38
4) Волошин С. А.. Капрельянц А.С. (2004) Межклеточные взаимодействия в бактериальных популяциях. // Биохимия. Т. 69. № 11. С. 1555-1564.
5) Волошин С.А.. Шлеева М.О., Сыроешкин А.В., Капрельянц А.С. (2005) Роль межклеточных контактов для инициации роста и образования временно-некультивируемого состояния культурой Rhodococcus rhodochrous при развитии на бедных средах. // Микробиология. Т. 74. № 4. С. 420-427.
6) Волошин С. А.. Капрельянц А.С. (2005) Изучение клеточной агрегации в культурах Micrococcus luteus методом динамического светорассеивания. // Прикладная Биохимия и Микробиология. № 6.Т. 44 с. 647-651.
8) Волошин С.А.. Дёмина Г.Р., Стеханова Т.Н., Дудик Т.В., Телков М.В., Мукамолова Г.В., Капрельянц А.С. (2005) Белок Rpf участвует в ремоделинге клеточной стенки бактерии Micrococcus luteus. 9-ая школа-конференция молодых учённых, Пущино. С. 188
Подписано к печати И Тираж «О экз. Заказ № 195
ООП МГУ
$212 Ii
РНБ Русский фонд
2006-4 21963
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волошин, Сергей Александрович
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Химические факторы коммуникации.
1.1.1. МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОПОСРЕДОВАННЫЕ ХИМИЧЕСКИМИ ФАКТОРАМИ.
1.1.2. СПОРУЛЯЦИЯ И КОМПЕТЕНТНОСТЬ (В. subtilis).
1.1.3. А-ФАКТОР В РЕГУЛЯЦИИ СТРЕПТОМИЦЕТОВ.И
1.1.4. ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК.
1.1.5. БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА RPF- СТИМУЛЯТОРЫ РОСТА БАКТЕРИЙ.
1.2. Межклеточные взаимодействия опосредованные физическими факторами межклеточные контакты).
1.2.1.БИОПЛЁНК И.
1.2.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ КОЛОНИИ.
1.3. апоптоз в микробных сообществах.
1.4. Клеточная стенка и её роль в коммуникации бактерий.
1.5. Агрегация бактерий в жидких средах.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Выращивание бактериальных культур.
2.2. Общее число клеток (ОЧК).
2.3. Микроскопические исследования.
2.4. Распределение клеток.
2.5. Разрушение бактериальных агрегатов исследуемых культур.
2.6. Получение супернатантов для стимуляции роста бактерий.
2.7. Электрофорез белков в ПААГ по Лэммли.
2.8. Иммуноблоттингрекомбинантных белков.
2.9. иммуноферментный анализ.
2.10. Получение белка Rpf и его модифицированных форм.
2.11. Секвенирование белков.
2.12. масспектрометрия.
2.13. приготовление грубого препарата клеточных стенок м. luteus.
2.14. Измерение литической активности белка Rpf в отношении грубого препарата клеточных стенок м. luteus.
2.15. Определение мурамидазной активности белков Rpf и его модификаций.
2.16. Гель - фильтрация СН со стимулирующей активностью.
2.17. Тестирование фракций супернатанта м. luteus на активность стимулирующую рост клеток.
2.18. Ультрафильтрация СН со стимулирующей активностью.
2.19. Хромато-масс-спекгроскопия.
2.20. Проточная цитометрия.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. ингибирующее влияние интенсивного перемешивания на рост культур rhodococcus rhodochrous и micrococcus luteus в жидких обеднённых средах.
3.2. Клеточная агрегация на ранних стадиях развития бактериальных культур R. rhodochrous И м. luteus и её механизмы.
3.3 Роль белка RPF в дезагрегации клеточных ассоциатов м. luteus.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Значение межклеточных взаимодействий у бактерий Micrococcus luteus и Rhodococcus rhodochrous для инициации роста"
Впервые важность межклеточных взаимодействий в биологии была продемонстрирована в середине прошлого века при изучении развития многоклеточных организмов (Евгеньева, 1975; Hausman and Moscona, 1975; Balsamo and Lilien, 1975). С тех пор роль клеточной коммуникации у высших эукариотических организмов хорошо исследована. Найдены специфические химические сигналы взаимодействия, исследованы различные типы контактов между клетками (Frazier et al., 1972; Lim and Mitsunobu, 1974; Savage et al., 1972). Что касается низших организмов, то долгое время исследования в этой области почти не проводились, так как считалось, что такие простейшие организмы как одноклеточные существуют в популяции независимо друг от друга. Особенно это относилось к прокариотическим организмам, которых считали неспособными для специфических межклеточных взаимодействий. Однако со временем стали появляться многочисленные данные о том, что одноклеточные эукариоты также имеют специфический язык межклеточного общения (Tanabe et al., 1990; Christensen et al., 1998), а некоторые из них, например, вольвокс образуют сложные колонии, состоящие из большого количества клеточных субпопуляций, которые могут выполнять различные функции.
Одним из первых исследователей, изучавший межклеточную коммуникацию у прокариотических организмов, был академик И.Д. Иерусалимский. В работах Иерусалимского микробная колония рассматривается как надорганизменная система, для которой характерна фенотипическая гетерогенность и пространственная обособленность в естественной среде обитания (Иерусалимский, 1952). К нашему времени скопилось достаточно много фактов, свидетельствующих о сложных межклеточных взаимодействиях в прокариотических популяциях. Эти факты подчас опровергают основные постулаты Роберта Коха, в том числе о том, что любая прокариотическая клетка может дать популяцию при росте в оптимальных условиях, т. е. бактериальные культуры рассматривались как совокупность клеток, которые могут развиваться и делиться совершенно независимо друг от друга. На сегодняшний день описан целый ряд сигнальных молекул у бактерий и показаны процессы, в которых эти молекулы принимают участие. Было показано, что некоторые процессы в бактериальных популяциях зависят от концентрации клеток и при достижении определённой клеточной плотности скорость этих процессов значительно увеличивается. Это явление, названное «quorum sensing», регулирует многие важные процессы у бактерий, в том числе и у патогенных возбудителей опасных заболеваний. Однако, уделяя так много внимания химическим факторам коммуникации, исследователи очень мало внимания обращают на физические взаимодействия в бактериальных популяциях. Известно, что некоторые виды бактерий (стрептомицеты, цианобактерии) способны образовывать сложные многоклеточные структуры при росте в естественной среде обитания и в лабораторных условиях. Другие виды, например микобактерии и нокардии, также часто образуют различные клеточные скопления. Показано, что многие виды бактерий, ранее считавшиеся исключительно свободноживущими, при определённых условиях образуют биоплёнки - специфические многоклеточные структуры. Биоплёнки на сегодняшний день являются наиболее исследованными бактериальными ассоциатами, так как имеют большое значение в медицине и в экологии.
Однако, несмотря на такой прогресс в исследовании биоплёнок и бактериальных колоний, исследователи практически не изучали другое, более часто встречающееся явление в микробиологии, - частичную, а иногда довольно значительную агрегацию клеток при росте бактериальных культур в жидких средах. Как правило, такая агрегация более характерна в стрессовых условиях роста. Но до сих пор нет ответа на вопрос, в чём биологический смысл такой агрегации и является ли она необходимой для развития клеточных популяций или это просто следствие взаимодействия клеток не как живых организмов, а как взвешенных коллоидных частиц? Ответы на этот и многие другие вопросы, связанные с бактериальной агрегацией остаются на сегодняшний день мало изученными. Цель настоящей работы состоит в том, чтобы выяснить какое значение для развития популяции на жидких средах имеет агрегация клеток на примере двух представителей ГЦ-богатых бактерий, для которых рост с образованием агрегатов является обычным явлением. И если имеет, то, при каких условиях, и какие механизмы могут быть ответственны за это явление.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Волошин, Сергей Александрович
ВЫВОДЫ
1) Рост бактерий R. rhodochrous и М. luteus в жидких средах сопровождается образованием клеточных агрегатов в лаг-фазе и их распадом в фазе экспоненциального роста.
2) Факторы, препятствующие образованию клеточных агрегатов в лаг-фазе, вызывают остановку роста клеток R. rhodochrous и М. luteus в обеднённых жидких средах.
3) При росте бактерий в обеднённой жидкой среде происходит частичный лизис клеток и выход в культуральную жидкость низкомолекулярных веществ, способных стимулировать рост бактерий.
4) Секретируемый клетками М. luteus белок Rpf, проявляющий мурамидазную активность, участвует в диссоциации клеточных агрегатов
5) Предложена новая стратегия роста и размножения бактерий в обеднённых питательных средах, включающая образование клеточных агрегатов на начальных стадиях развития и криптический рост.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волошин, Сергей Александрович, Москва
1. Акайзин Е.О., Воскун С.Е., Панова Л.А., Смирнов С.Г. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза. Микробиология. 1990. Т. 59. С. 283 288.
2. Бабский В.Г. Явление самоорганизации у бактерий на клеточном и популяционном уровнях. Нелинейные волны. Динамика и эволюция. 1989. С. 299-303.
3. Будрене Е.О. Образование пространственно упорядоченных структур в колониях подвижных бактерий на агаре. Докл. АН СССР. 1985. Т. 283. С. 470 473.
4. Воробьева Л.И., Никитенко Г.В., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М. Реактивация инактивированных ультрафиолетовым светом клеток Esherichia coli клеточными экстрактами пропионово-кислых бактерий. Микробиология. 1993. Т. 62. С. 1135-1143.
5. Гельман Н.С., Лукоянова М.А., Островский Д.Н. Мембраны бактерий и дыхательная цепь. «Наука». 1972. С. 25
6. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в аутолизирующихся суспензиях клеток. Микробиология. 2000. Т. 69. С. 383 388.
7. Дуда В.И., Выпов М.Г., Сорокин В.В., Митюшина Л.Л., Лебединский А.В. Образование бактериями экстрацеллюлярных структур, содержащих гемопротеины. Микробиология. 1995. Т. 64. С. 69-73.
8. Дуда В.И., Дмитриев В.В., Сузина Н.Е., Шорохова А.П., Мишина Г.В. Ультраструктурная организация газовых баллонов и поверхностных пленок в колониях у грамотрицательной бактерии Alcaligenes sp., штамм d2. Микробиология. 1996. Т. 65. С. 222-227.
9. Дуда В.И., Ильченко А.П., Дмитриев В.В., Шорохова А.П., Сузина Н.Е. Выделение и характеристика гемофлавопротеина из грамотрицательной бактерии Alcaligenes sp., штамм d2. Микробиология. 1998. Т. 67. С. 12 -18.
10. Ю.Евгеньева Т.П. Межклеточные и межтканевые взаимодействия в эволюционном ряду беспозвоночных и низших хордовых в условиях эксплантации тканей. Журнал общ. Биологии. 1975. Т. 36. С. 26 35.
11. Звягинцев Д.Г. Экологическая роль микробных метаболитов. Москва. Изд-во МГУ. 1986. С. 225.
12. Иерусалимский И.Д. 1952. Физиология развития чистых бактериальных культур. Докторская диссертация. Москва.
13. Казарьян К.А. 2004. Биохимические и иммунологические свойства белков семейства Rpf факторов роста Micrococcus luteus и Mycobacterium tuberculosis. Кандидатская диссертация. Москва.
14. Конев С.В., Мажуль В.М. Межклеточные контакты. Изд-во «Наука и техника». 1977. С. 300.
15. Кузнецов О.Ю. Электронная микроскопия для исследования функциональных изменений структуры клетки при различных воздействиях. 1988. Изд-во МГУ. С. 89 92.
16. Лойко Н.Г., Соина В.С, Сорокин Д.Ю., Митюшина Л.Л., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся клеток у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum. Микробиология. 2003. Т. 72. С. 328 337.
17. Максимов В.И. 1986. Молекулярные механизмы ферментативного гидролиза полисахаридов под действием эндогликаназ. Докторская диссертация. Москва
18. Мартынкина Л.П., Милько Е.С. Ультраструктурные особенности диссоциантов Rhodococcus rubropertinctus и Streptococcus lactis. Микробиология. 1991. Т. 60. С. 334 338.
19. Могильная О.А., Милько Е.С., Медведева С.Е. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение колонии и клеток диссоциантов родококка. Прикл. Биохим. Микробиол. 1994. Т. 30. С. 877 882.
20. Могильная О.А., Кривомазова Е.С., Каргатова Т.В., Лобова Т.И., Попова Л.Ю. Образование структурированных сообществ придонными и трансгенными бактериями, утилизирующими нафталин. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. С. 72 78.
21. Мукамолова Г.В., Янг М, Келл Д.Б., Капрельянц А.С. Бактериальные феромоны и клеточное деление. Успехи биологической химиии. 1999. Т. 39. С. 225 254.
22. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus. Микробиология, 1996, Т. 65. С. 782 789
23. Николаев Ю.А., Воронина Н.А. Перекрёстное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов. Микробиология. 1999. Т. 68. С. 45-50.
24. Николаев Ю.А. Множественный защитный эффект экзометаболита (экзаметаболитов), выделяемого Esherichia coli при обработке тетрациклином. Микробиология. 1996. Т. 65. С. 749-752.
25. Павлова И.Б., Куликовский А.В., Ботвинко И.В., Джентемирова К.М., Дроздова Т.И. Электронно-микроскопическое исследование развития бактерий в колониях, морфология колоний бактерий. Журн. Микробиол. Эпидемиол. Иммунобиол. 1990. № 12. С. 15-20.
26. Прокопова Ж. В., Мажуль В. М. и Конев С. В. Тезисы III Всесоюзного совещания по управляемому биосинтезу и биофизике популяций. Красноярск. 1973. 57 с.
27. Розен В.Б. Основы эндокринологии. Москва. Изд-во МГУ. 1994.
28. Сафронова И.Ю., Ботвинко И.В. Межклеточный матрикс Bacillus subtilis 271: полимерный состав и функции. Микробиология. 1998. Т. 67. С. 55 -60.
29. Смирнов С.Г. Этология бактерий новое направление в исследовании прокариотов. Физико-химические исследования патогенных энтеробактерий в процессе культивирования. Иваново. Изд-во ИвГУ. 1985. С. 5-10.
30. Зб.Сыроешкин А. В., Синюк Т. Ф., Кириянов С. В., Лебедев И. М., Плетенёва Т. В. Изучение комбинированной токсичности меди и цинка в водных растворах. Метерология и гидрология. 1999. Т. 6. С. 51 57.
31. Уголев A.M. Естественные технологии биологических систем. 1987. Ленинград.Изд-во «Наука».
32. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз. Микробиология. 1992. Т. 61. С. 739-753.
33. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. Изд-во «Наука». 1988. С. 270.
34. Шапиро Дж.А. Бактерии как многоклеточные организмы. В мире науки. 1988. № 8. С. 46-54.
35. Шлегель Г. Общая микробиология. «Мир». Москва. 1987.
36. Aizenman, Е„ Engelberg-Kulka, Н. and Glaser, G. (1995). An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3',5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 6059 6063.
37. Allison, С and Hughes, C. (1991). Closely linked genetic loci required for swarm cell differentiation and multicellular migration by Proteus mirabilis. Mol Microbiol. 5, 1975-1982.
38. Ameyama, M., Matsushita, K., Shinagawa, E., Hayashi, M. and Adachi, O. (1988). Pyrroloquinoline quinone: excretion by methylotrophs and growth stimulation for microorganisms. Biofactors. 1, 51 53.
39. Arcus, V.L., Rainey, P.B. and Turner, S.J. (2005). The PIN-domain toxin-antitoxin array in mycobacteria. Trends Microbiol. 13, 360 365.
40. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G. and Foster, S.J. (1996). Structural analysis of Bacillus subtilis 168 endospore peptidoglycan and its role during differentiation. J Bacteriol. 178, 6173-6183.
41. Atrih, A., Zollner, P., Allmaier, G., Williamson, M.P. and Foster, S.J. (1998). Peptidoglycan structural dynamics during germination of Bacillus subtilis 168 endospores. J. Bacteriol. 180,4603-4612.
42. Atrih, A., Foster, S.J. (1999). The role of peptidoglycan structure and structural dynamics during endospore dormancy and germination. Antonie Van Leeuwenhoek. 75, 299 307.
43. Azad, H.S. and Weddle, C.L. (1974). Activated sludge. J Water Pollut Control Fed. 46, 1123-1135.
44. Balsamo, J. and Lilien, J. (1975). The binding of tissue-specific adhesive molecules to the cell surface. A molecular basis for specificity. Biochemistry. 14,167-171.
45. Batchelor, S.E., Cooper, M., Chhabra, S.R., Glover, L.A., Stewart, G.S., Williams, P. and Prosser, J.I. (1997). Cell density-regulated recovery of starved biofilm populations of ammonia-oxidizing bacteria. Appl Environ Microbiol. 63, 2281 -2286.
46. Belas, R., Erskine, D. and Flaherty, D. (1991). Proteus mirabilis mutants defective in swarmer cell differentiation and multicellular behavior. J Bacteriol. 173, 6279-6288.
47. Bell, M. (2001). Biofilms: A Clinical Perspective. Curr Infect Dis Rep. 3, 483 -486.
48. Boonaert, C.J. and Rouxhet, P.G. (2000). Surface of lactic acid bacteria: relationships between chemical composition and physicochemical properties. Appl Environ Microbiol. 66, 2548 2554.
49. Bossier, P. and Verstraete, W. (1996). Comamonas testosteroni colony phenotype influences exopolysaccharide production and coaggregation with yeast cells. Appl Environ Microbiol. 62, 2687 2691.
50. Butterfield, C.T., Wattie, E. and Chambers, C.W. (1950). Bactericidal efficiency of quaternary ammonium compounds. Public Health Rep. 65,1039-1056.
51. Chen, Y., Miyata, S., Makino, S. and Moriyama, R. (1997). Molecular characterization of a germination-specific muramidase from Clostridium perfringens S40 spores and nucleotide sequence of the corresponding gene. J. Bacteriol. 179, 3181 -3187.
52. Christensen, S.T., Leick, V., Rasmussen, L. and Wheatley, D.N. (1998). Signaling in unicellular eukaryotes. Int Rev Cytol. 177,181 -253.
53. Clark, J.B. (1958). Slime as a possible factor in cell clumping in Nocardia corallina. J. Bacteriol. 75, 400-402.
54. Clark, J.B. and Aldridge, C. (1960). Fat bodies in Nocardia corallina. J. Bacteriol. 79, 756 757.
55. Cohen-Gonsaud, M., Keep, N.H., Davies, A.P., Ward, J., Henderson, B. and Labesse, G. (2004). Resuscitation-promoting factors possess a Jysozyme-like domain. Trends Biochem Sci. 29, 7-10.
56. Costerton, J.W., Irvin, R.T. and Cheng, K.J. (1981). The role of bacterial surface structures in pathogenesis. Crit Rev Microbiol. 8, 303 338.
57. Costerton, J.W. (1995). Microbial interactions in biofilms. Beijerinck Centennial. Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications. Book of Abstracts /Ed. W.A. Scheffers, J.P. van Dijken. Delft. Delft. Univ. Press. 20-21.
58. Crabtree, K., McCoy, E., Boyle, W.C. and Rohlich, G.A. (1965). Isolation, Identification, and Metabolic Role of the Sudanophilic Granules of Zoogloea ramigera. Appl Microbiol. 13, 218 226.
59. Crabtree, K., Boyle, W., McCoy, E. and Rohlich, G.A. (1966). A mechanism of floe formation by Zoogloea ramigera. J Water Pollut Control Fed. 38, 1968 -1980.
60. Cripps, R.E and Work, E. (1967). The accumulation of extracellular macromolecules by Staphylococcus aureus grown in the presence of sodium chloride and glucose. J Gen Microbiol. 49, 127 137.
61. Daffe, M. and Etienne, G. (1999). The capsule of Mycobacterium tuberculosis and its implications for pathogenicity. Tuber Lung Dis. 79,153 -169.
62. Dalton, H and Postgate, J.R. (1969). Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture. J Gen Microbiol. 56, 307 319.
63. Devadoss, P., Klegerman, M.E. and Groves, M.J. (1991). Surface morphology of Mycobacterium bovis BCG: relation to mechanisms of cellular aggregation. Microbios. 65,111 -125.
64. Devreotes, P. (1989). Dictyostellium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245,1054 1058.
65. Dong, Y.H., Xu, J.L., Li, X.Z. and Zhang L.H. (2000). AiiA, an enzyme that inactivates the acylhomoserine lactone quorum-sensing signal and attenuates the virulence of Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci. 97, 3526 3531.
66. Donlan, R.M. (2002). Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890.
67. Dunny, G.M., Leonard, B.A. and Hedberg, P.J. (1995). Pheromone-inducible conjugation in Enterococcus faecalis: interbacterial and host-parasite chemical communication. J Bacteriol. 177, 871 876.
68. Eberl, L., Christiansen, G., Molin, S. and Givskov, M. (1996). Differentiation of Serratia liquefaciens into swarm cells is controlled by the expression of the flhD master operon. J Bacteriol. 178, 554 559.
69. Engel, H., Kazemier, B. and Keck, W. (1991). Murein-metabolizing enzymes from Escherichia coli: sequence analysis and controlled overexpression of thesit gene, which encodes the soluble lytic transglycosylase. J Bacteriol. 173, 6773 6782.
70. Finelli, A., Gallant, C.V., Jarvi, K. and Burrows, L.L. (2003). Use of in-biofilm expression technology to identify genes involved in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. J Bacteriol. 185, 2687-2689.
71. Foster, S.J. and Johnstone, K. (1987). Purification and properties of a germination-specific cortex-lytic enzyme from spores of Bacillus megaterium KM. Biochem J. 242, 573 579.
72. Foster, S.J. and Johnstone, K. (1990). Pulling the trigger: the mechanism of bacterial spore germination. Mol Microbiol. 4,137 -141.
73. Frazier, W.A., Angeletti, R.H. and Bradshaw, R.A. (1972). Nerve growth factor and insulin. Science. 176, 482-488.
74. Fuqua, W.C., Winans, S.C. and Greenberg, E.P. (1994). Quorum sensing in bacteria the LuxR-Luxl family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 176, 269-275.
75. Fuqua, C., Winans S.C. and Greenberg, E.P. (1996). Census and consensus in bacterial ecosystems: the LuxR-Luxl family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annu Rev Microbiol. 50, 727-751.
76. Gotfredsen, M. and Gerdes, K. (1998). The Escherichia coli relBE genes belong to a new toxin-antitoxin gene family. Mol Microbiol. 29,1065 -1076.
77. Gray, W.R. (1972) End-group analysis using dansyl chlorid. Methods in Enzymology. 25,121 138.
78. Green, D.R. and Amarante-Mendes, G.P. (1998). The point of no return: mitochondria, caspases, and the commitment to cell death. Results Probl Cell Differ. 24,45-61.
79. Greenberg, E. (1999) in: Microbial signalling and communication (England, R., Hobbs G., Bainton N., Roberts D., Ed.) Cambridge university press, Cambridge, p.70 84
80. Greenberg, E.P. (2003). Bacterial communication and group behavior. J Clin Invest. 112,1288-1290.
81. Greenberg, E.P. (2003). Bacterial communication: tiny teamwork. Nature. 424, 134.
82. Gygi, D., Rahman, M.M., Lai, H.C., Carlson, R., Guard-Petter, J. and Hughes, C. (1995). A cell-surface polysaccharide that facilitates rapid population migration by differentiated swarm cells of Proteus mirabilis. Mol Microbiol. 17, 1167-1175.
83. Halmann, M., Benedict, M. and Mager, J. (1967). Nutritional of Pasteurella tularensis for growth from small inocula. J. Gen. Microbiol. 49, 451 -460.
84. Harris, R.H and Mitchell, R. (1973). The role of polymers in microbial aggregation. Annu Rev Microbiol. 27, 27 50.
85. Harshey, R.M. (1994). Bees aren't the only ones: swarming in Gram-negative bacteria. Mol. Microbiol. 16, 389 394.
86. Hausman, R.E., and Moscona, A.A. (1975). Purification and characterization of the retina-specific cell-aggregating factor. PNAS. 72, 916 920.
87. Hinshelwood, C.N. (1946) The chemical kinetics of the bacterial cell. The Clarendon Press. Oxford, p. 49 53.
88. Houwink, A.L. (1953). A macromolecular mono-layer in the cell wall of Spirillum spec. Biochim Biophys Acta. 10, 360 366.
89. Jankovic, I., Ventura, M., Meylan, V., Rouvet, M., Elli, M. and Zink, R. (2003). Contribution of aggregation-promoting factor to maintenance of cell shape in Lactobacillus gasseri 4B2. J Bacteriol. 185, 3288 3296.
90. Ji, G., Beavis, R.C. and Novick, R.P. (1995). Cell density control of staphylococcal virulence mediated by an octapeptide pheromone. Proc Natl Acad Sci. 92,12055 -12059.
91. Johnstone, K., Simion, F.A. and Ellar, D.J. (1982). Teichoic acid and lipid metabolism during sporulation of Bacillus megaterium KM. Biochem J. 202, 459 467.
92. Juni, E. and Heym, G.A. (1964). Pathways for biosynthesis of a bacterial capsular polysaccharide. IV. capsule resynthesis by decapsulated resting-cell suspensions. J Bacteriol. 87, 461 467.
93. Kaiser, D. and Losick, R. (1993). How and why bacteria talk to each other. Cell 73, 873-885.
94. Kaiser, D. (1999). Cell fate and organogenesis in bacteria. Trends Genet. 15, 273 277.
95. Kaprelyants, A.S. and Kell, D.B. (1992). Rapid assessment of bacterial viability and vitality using rhodamine 123 and flow cytometry. Journal of Applied Bacteriology. 72, 410 422.
96. Kaprelyants, A.S. and Kell, D.B. (1993). Dormancy in stationary-phase cultures of Micrococcus luteus flow cytometric analysis of starvation and resuscitation. Applied and Environmental Microbiology. 59, 3187 - 3196.
97. Kaprelyants, A.S., Mukamolova, G.V. and Kell, D.B. (1994). Estimation of dormant Micrococcus luteus cells by penicillin lysis and by resuscitation in cell-free spent medium at high dilution. FEMS Microbiol Lett 115, 347 352.
98. Kell, D. В., Kaprelyants, A. S. and Grafen, A. (1995). Pheromones, social behaviour and the functions of secondary metabolism in bacteria. Trends Ecol Evol. 10,126-129.
99. Kim, J.E., Kim, S.J., Lee, B.H., Park, R.W., Kim, K.S. and Kim, I.S. (2000). Identification of motifs for cell adhesion within the repeated domains of transforming growth factor-beta-induced gene, betaig-h3. J Biol Chem. 275, 30907-30915.
100. Kjelleberg, S and Molin, S. (2002). Is there a role for quorum sensing signals in bacterial biofilms? Curr Opin Microbiol. 5, 254 258.
101. Kmet, V., Callegari, M.L., Bottazzi, V. and Morelli, L. (1995). Aggregation-promoting factor in pig intestinal Lactobacillus strains. Lett Appl Microbiol. 21, 351 353.
102. Kolenbrander, P.E., Andersen, R.N., Blehert, D.S., Egland, P.G., Foster, J.S. and Palmer, R.J. (2002). Communication among oral bacteria. Microbiol Mol Biol Rev. 66, 486 505.
103. Kopec, L.K., Smith, A.M., Wunder, D., Ng-Evans, L. and Bowen, W.H. (2002) Influence of antibody on the structure of glucans. Caries Res. 36,108 -115.
104. Kos, В., Suskovic, J., Vukovic, S., Simpraga, M., Frece, J. and Matosic, S. (2003). Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. J Appl Microbiol. 94, 981 987.
105. Lazazzera, B.A. and Grossman, A.D. (1998). The ins and outs of peptide signaling antimicrob. Trends Microbiol. 6, 288 294.
106. Lehnherr, H., Hansen, A.M. and llyina, T. (1998). Penetration of the bacterial cell wall: a family of lytic transglycosylases in bacteriophages and conjugative plasmids. Mol Microbiol. 30, 454-457.
107. Lewenza, S., Conway, В., Greenberg, E.P. and Sokol, P.A. (1999). Quorum sensing in Burkholderia cepacia: identification of the LuxRI homologs CepRI. J Bacteriol. 181,748-756.
108. Li, X.Z. and Poole, K. (1999). Organic solvent-tolerant mutants of Pseudomonas aeruginosa display multiple antibiotic resistances. Can J Microbiol. 45,18-22.
109. Lim, R. and Mitsunobu, K. (1974). Brain cells in culture: morphological transformation by a protein. Science. 185, 63 66.
110. Lipkin, R. (1995). Bacterial chatter. How patterns reveal clues about bacteria's chemical communication. Sci. News. 147, 136- 141.
111. Makino, S., Ito, N., Inoue, Т., Miyata, S. and Moriyama, R. (1994). A spore-lytic enzyme released from Bacillus cereus spores during germination. Microbiology. 140, 1403 1410.
112. Matsuyama, Т., Bhasin, A. and Harshey, R.M. (1995). Mutational analysis of flagellum-independent surface spreading of Serratia marcescens 274 on a low-agar medium. J Bacteriol. 177, 987 991.
113. McKinney, R.E. (1953). Staining bacterial polysaccharides. J Bacteriol. 66, 453-454.
114. McKinney, R.E. and Weichlein, R.G. (1953). Isolation of floc-producing bacteria from activated sludge. Appl Microbiol. 1, 259 261.
115. Millsap, K.W., Bos, R., van der Mei, H.C. and Busscher, H.J. (2001). Adhesive interactions between voice prosthetic yeast and bacteria on silicone rubber in the absence and presence of saliva. Antonie Van Leeuwenhoek. 79, 337 -343.
116. Miyake, K., Kuzuyama, Т., Horinouchi, S. and Beppu, T. (1990). The A-factor-binding protein of Streptomyces griseus negatively controls streptomycin production and sporulation. J Bacteriol. 172, 3003 3008.
117. Miyata, S., Moriyama, R., Sugimoto, K. and Makino, S. (1995). Purification and partial characterization of a spore cortex-lytic enzyme of Clostridium perfringens S40 spores. Biosci Biotechnol Biochem. 59, 514 515.
118. Molinari, G. and Chhatwal, G.S. (1999). Streptococcal invasion. Curr. Opin. Microbiol. 2, 56-61.
119. Monodane, Т., Tokunaga, M. and Torii, M. (1990). Cell surface of a tetrads-forming mutant of Micrococcus luteus: chemical treatment of the cells and teichuronic acids on the surface. Microbiol Immunol. 34, 65 72.
120. Moriyama, R., Hattori, A., Miyata, S., Kudoh, S. and Makino, S. (1996). A gene (sleB) encoding a spore cortex-lytic enzyme from Bacillus subtilis and response of the enzyme to L-alanine-mediated germination. J Bacteriol. 178, 6059-6063.
121. Mukamolova, G.V., Kaprelyants, A.S., Young, D.I., Young, M. and Kell, D.B. (1998). A bacterial cytokine. Proc Natl Acad Sci. 95, 8916 8921.
122. Mukamolova, G.V., Turapov, O.A., Kazarian, K.A., Telkov, M.V., Kaprelyants, A.S., Kell, D.B. and Young, M. (2002). The rpf gene of Micrococcus luteus encodes an essential secreted growth factor. Mol. Microbiol., 46, 611 -621.
123. Mukamolova, G.V., Turapov, O.A., Young, D.I., Kaprelyants, A.S., Kell, D.B. and Young, M. (2002). A family of autocrine growth factors in Mycobacterium tuberculosis. Mol. Microbiol., 46, 623-635.
124. Mutzel, R. (1995). Introduction. Molecular biology, growth and development of the cellular slime mold Dictyostellium discoideum. Experientia. 51, 1103 -1110.
125. Navarre, W.W., Ton-That, H., Faull, K.F. and Schneewind, O. (1999). Multiple enzymatic activities of the murein hydrolase from staphylococcal phage phi11. Identification of a D-alanyl-glycine endopeptidase activity. J Biol Chem. 274, 15847-15856.
126. Nistrom, T. (2003). Conditional senescence in bacteria: death of the immortals. Mol. Microbiol. 48,17-23.
127. OToole, G., Kaplan, H.B. and Kolter, R. (2000). Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49 79.
128. Ortalo-Magne, A., Dupont, M.A., Lemassu, A., Andersen, A.B., Gounon, P. and Daffe, M. (1995). Molecular composition of the outermost capsular material of the tubercle bacillus. Microbiology. 141, 1609-1620.
129. Pandey, D.P. and Gerdes, K. (2005). Toxin-antitoxin loci are highly abundant in free-living but lost from host-associated prokaryotes. Nucleic Acids Res. 17, 966 976.
130. Parma, D.H., Snyder, M., Sobolevski, S., Nawroz, M., Brody, E. and Gold, I. (1992). The Rex system of bacteriophage: tolerance and altruistic cell death. Genes Dev. 6, 497 510.
131. Pedersen, K., Christensen, S.K. and Gerdes, K. (2002). Rapid induction and reversal of a bacteriostatic condition by controlled expression of toxins and antitoxins. Mol. Microbiol. 45, 501 510.
132. Pestova, E.V., Havarstein, L.S. and Morrison, D.A. (1996). Regulation of competence for genetic transformation in Streptococcus pneumoniae by an auto-induced peptide pheromone and a two-component regulatory system. Mol Microbiol. 21,853-862.
133. Popham, D.L., Helin, J., Costello, C.E. and Setlow, P. (1996). Muramic lactam in peptidoglycan of Bacillus subtilis spores is required for spore outgrowth but not for spore dehydration or heat resistance. Proc Natl Acad Sci. 93, 15405 -15410.
134. Postgate, J. and Hunter, J. (1964). Accelerated death of Aerobacter aerogenes starved in the presence of growth-limiting substrate. J. Gen. Microbiol. 34,459-473.
135. Postgate, J. (1967) in: Advances in Microbial Physiology, (Rose A.H. and Wilkinson J., Eds.), Vol. 1, Academic Press, London, p. 1 -21.
136. Raff, M. (1998). Cell suicide for beginners. Nature. 396, 119-122.
137. Reniero, R., Cocconcelli, P., Bottazzi, V. and Morelli, L (1992). High frequency of Lactobacillus mediated by an aggregation-promoting factor. Journal Jeneral Microbiol. 138, 763 768.
138. Ross, N., Villemur, RM Marcandella, E. and Deschenes, L. (2001). Assessment of changes in biodiversity when a community of ultramicrobacteria Isolated from groundwater Is stimulated to form a biofilm. Microb Ecol. 42, 56 68.
139. Sager, B. and Kaiser, D. (1993). Two cell-density domains within the Myxococcus xanthus fruiting body. Proc Natl Acad Sci. 90, 3690 3694.
140. Salmond, G.P., Bycroft, B.W., Stewart, G.S. and Williams, P. (1995). The bacterial 'enigma1: cracking the code of cell-cell communication. Mol. Microbiol. 16,615-624.
141. Santos, N.C. and Castanho, A.R.B.M (1996). Teaching light scattering spectroscopy: the dimension and shape of tobacco mosaic virus. Biophysical J. 71,1641-1646.
142. Savage, C.R.Jr., Inagami, Т., and Cohen, S. (1972). The primary structure of epidermal growth factor. J Biol Chem. 247, 7612 7621.
143. Shapiro, J.A. and Trubatch, D. (1991). Sequential events in bacterial colony morphogenesis. Physica. 49, 214 223.
144. Shapiro, J.A. (1992). Differential action and differential expression of DNA polymerase I during Escherichia coli colony development. J. Bacteriol. 174, 7262-7272.
145. Shapiro, J.A. (1995). The significances of bacterial colony patterns. Bio Essays. 17, 597-607.
146. Shapiro, J.A. and Dworkin, M. Bacteria as multicellular organisms. Oxford Univ. Press. Oxford. 1997.
147. Schauder, S. and Bassler, B.L. (2001). The languages of bacteria. Genes Dev. 15, 1468-1480.
148. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. and Mann, M (1996) Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858.
149. Scott, J.E., Thomlinson, A.M. and Prehm, P. (2003). Supramolecular organization in streptococcal pericellular capsules is based on hyaluronan tertiary structures. Exp Cell Res. 285,1-8.
150. Seltman, G. and Hoist, O. The bacterial cell wall. Springer-Verlag. Berlin. 2002.
151. Shub, A.B. (1994). Bacterial altruism? Curr. Biol. 4, 555 556.
152. Singh, P.K., Parsek, M.R., Greenberg, E.P. and Welsh, M.J. (2002). A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development. Nature. 417, 552-555.
153. Smith, C.S., Hinz, A., Bodenmiller, D., Larson, D.E. and Brun, Y.V. (2003). Extracellular control of spore formation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 185, 1432-1442.
154. Smitheis, W.R. and Gibbons, N.E. (1955). The deoxyribose nucleic acid slime layer of some halophilic bacteria. Can J Microbiol. 1, 614 621.
155. Solomon, J.M., Magnuson, R., Srivastava, A. and Grossman, A.D. (1995). Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9, 547 558.
156. Solomon, J.M., Magnuson, R., Srivastava, A. and Grossman, A.D. (1995). Convergent sensing pathways mediate response to two extracellular competence factors in Bacillus subtilis. Genes Dev. 9, 547 558.
157. Spiers, A.J., Bohannon, J., Gehrig, S.M. and Rainey, P.B. (2003). Biofilm formation at the air-liquid interface by the Pseudomonas fluorescens SBW25 wrinkly spreader requires an acetylated form of cellulose. Mol Microbiol. 50, 15 -27.
158. Stahl, S.J., Stewart, K.R. and Williams, F.D. (1993). Extracellular slime associated with Proteus mirabilis during swarming. J Bacteriol. 154, 930 -937.
159. Swift, S., Throup, J.P., Williams, P., Salmond, G.P. and Stewart, G.S. (1996). Quorum sensing: a population-density component in the determination of bacterial phenotype. Trends Biochem Sci. 21, 214 219.
160. Tanabe, H., Nishi, N., Takagi, Y., Wada, F., Akamatsu, I. and Kaji, K. (1990). Purification and identification of a growth factor produced by Paramecium tetraurelia. Biochem Biophys Res Commun. 170, 786-792.
161. Taylor, W.H. and Juni, E. (1961). Pathways for biosynthesis of a bacterial capsular polysaccharide. III. Syntheses from radioactive substrates. J Biol Chem. 236, 1231 -1234.
162. Tenney, M.W. and Stumm, W. (1965). Chemical flocculation of microorganisms in biological waste treatment. J Water Pollut Control Fed. 37, 1370-1388.
163. Tetz, V.V., Rybalchenko, O.V. and Savkova, G.A. (1990) Ultrastructural features of microbial colony organization. Basic Microbiology. 30, 597 607.
164. Tetz, V.V., Rybalchenko, O.V. and Savkova, G.A. (1993) Ultrastructure of the surface film of bacterial colonies. J Gen Microbiol. 139, 855 858.
165. Tetz, V.V. (1994). Colony-like communities of bacteria. Microbios. 80, 63 65.
166. Tetz, V.V. and Rybalchenko, O.V. (1997). Ultrastructure of colony-like communities of bacteria. APMIS. 105, 99 -107.
167. Tezuka, Y. (1967). Magnesium ion as a factor governing bacterial flocculation. Appl Microbiol. 15, 1256.
168. Tezuka, Y. (1969). Cation-dependent flocculation in a Flavobacterium species predominant in activated sludge. Appl Microbiol. 17, 222 226.
169. Todd, W.J., Wray, G.P. and Hitchcock, P.J. (1984). Arrangement of pili in colonies of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. 159, 312 320.
170. Velicer, G.J., and Yu, Y.T. (2003). Evolution of novel cooperative swarming in the bacterium Myxococcus xanthus. Nature. 425, 75 78.
171. Ventura, M., Callegari, M.L. and Morelli, L. (2000). S-layer gene as a molecular marker for identification of Lactobacillus helveticus. FEMS Microbiol Lett. 189, 275-279.
172. Ventura, M., Jankovic, I., Walker, D.C., Pridmore, R.D. and Zink, R. (2002). Identification and characterization of novel surface proteins in Lactobacillus johnsonii and Lactobacillus gasseri. Appl Environ Microbiol. 68, 6172 6181.
173. Votyakova, T.V., Kaprelyants, A.S. and Kell, D.B. (1994). Influence of viable cells on the resuscitation of dormant cells in Micrococcus luteus cultures held in extended stationary phase. The population effect. Appl. Environ. Microbiol. 60, 3284-3291.
174. Warren, G.H. and Gray, J. (1954). The depolymerization of bacterial polysaccharides by hyalyronidase preparations. J Bacteriol. 67,167- 170.
175. Warren, G.H. and Gray, J. (1959). Isolation and purification of streptococcal hyaluronic acid. Proc Soc Exp Biol Med. 102, 125 127.
176. Webb S.J., Thompson S.J., Charlton T, Tolker-Neilsen Т., Koch В., Givskov, M., Kjelleberg, S. (2003). Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. J.Bacteriology. 185, 4585-4592.
177. Webb, J.S., Givskov, M. and Kjelleberg, S. (2003). Bacterial biofilms: prokaryotic adventures in multicellularity. Curr Opin Microbiol. 6, 578 585.
178. Wessman, G.E and Miller, D.J. (1966). Biochemical and physical changes in shaken suspensions of Pasteurella pestis. Appl Microbiol. 14, 636 642.
179. Wessman, G.E. (1966). Cultivation of Pasteurella haemolytica in a chemically defined medium. Appl Microbiol. 14, 597-602.
180. Whiteley, M., Bangera, M.G., Bumgarner, R.E., Parsek, M.R., Teitzel, G.M., Lory, S. and Greenberg, E.P. (2001). Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, 860 864.
181. Williams, F.D. and Schwarzhoff R.H. (1978). Nature of the swarming phenomenon in Proteus. Annu Rev Microbiol. 32,101 -122.
182. Williams P., Baldwin T.J., and Downie, J.A. (1999) in: Microbial signalling and communication, (England R., Hobbs G., Bainton, N., Roberts D., Ed.) Cambridge University Press, Cambridge, p. 1 32.
183. Wu, S.S. and Kaiser, D. (1995). Genetic and functional evidence that Type IV pili are required for social gliding motility in Myxococcus xanthus. Mol Microbiol. 18, 547-558.
184. Yamada, Y. (1999) in: Microbial signalling and communication, (England, R., Hobbs G., Bainton N., Roberts D., Ed.) Cambridge University Press, Cambridge, p. 177 196
185. Yarmolinsky, M.B. (1995). Programmed cell death in bacterial populations. Science. 267, 836 837.
186. Yu, Y.-T.N. and Snyder, L. (1994). Transcription elongation factor Tu cleaved by a phage exclusion system. Proc. Natl. Acad. Sci. 91, 802 806.
187. Zhang, J.P., Chen, Q.X., Wang, Q. and Xie, J.J. (2005). Purification and some properties of p-N-Acetyl-D-glucosaminidase from viscera of Green Crabn (Scylla serrata). Biochemistry. Papers in press.
188. Благодарю всех друзей и коллег, а также свою супругу за поддержку и внимание к моей работе.
-
Волошин, Сергей Александрович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2005
-
ВАК 03.00.04
- Характеристика ответных реакций актинобактерий рода Rhodococcus на воздействие факторов водной среды
- Изучение физиологических свойств бактерии Rhodococcus erythropolis штамм Ас-858 Т для оптимизации условий получения углеводородразрушающего биопрепарата
- Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы
- Изучение субпопуляционной структуры бактериальных культур и способов управления межпопуляционными клеточными переходами
- Антибиотикочувствительность алкантрофных родококков и возможные пути формирования их неспецифической антибиотикорезистентности
