Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы

Кузнецова, Марина Валентиновна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы"

На правах рукописи

¿гг

КУЗНЕЦОВА Марина Валентиновна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ РОДА ЛНОООСОССШ - ПРОДУЦЕНТОВ НИТРИЛГИДРАТАЗЫ

03.00.07 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь-2004

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Демаков В.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

Октябрьский О.Н. Карпунина Т.И.

Ведущая организация: Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, г. Оренбург

Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс:(3422)44 67 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита состоится "¿Г" 2004 г. в /О

часов на заседании

чл.-корр. РАН

Ившиня И.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время во многих отраслях промышленности, а также для очистки питьевой воды и промышленных стоков широко используют полимеры и сополимеры акриламида. Мировая потребность в этих продуктах удовлетворена не полностью и ежегодно увеличивается на 4-5 %. В отличие от традиционных способов каталитической конверсии акрилонитрила в акриламид на неорганических катализаторах, биокаталитический способ производства акриламида имеет ряд важных в экономическом и экологическом отношении преимуществ: высокую специфичность и селективность, одностадийность, малую энергоемкость, отсутствие побочных продуктов синтеза, технологических стоков и вредных отходов. В настоящее время широко внедряется метод промышленного производства акриламида с использованием биокатализаторов на основе биомассы штаммов-продуцентов фермента нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous J1 и ряда других бактерий (Kobayashi et al, 1992). Это первый успешный опыт применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза. Расширение исследований бактерий, метаболизирующих нитрилы, обусловлено необходимостью улучшения способа производства акриламида, а также перспективой применения микроорганизмов для получения ряда других коммерчески значимых соединений (Kobayashi et al, 1992; Miller, Nagarajan, 2000). Несмотря на значительные успехи в области селекции продуцентов ферментов, потребность промышленности в новых штаммах непрерывно возрастает. Большое значение в последнее время приобретает также возможность использования микроорганизмов в процессах биоремедиации почв и сточных вод, загрязненных нитрилами (McBride et al, 1986; Mylerova, Martinkova, 2003).

Конверсия нитрильных соединений до метаболитов основного обмена изучена у ряда штаммов бактерий рода Rhodococcus: Rhodococcus sp. R312 (Nagasawa et al, 1986; Duran et al, 1998), R. rhodochrous Jl (Kobayashi et al, 1989), R. rhodochrous M8 (Астаурова и др., 1991), Rhodococcus sp. N-771 (Odaka et al, 1997); а также у представителей родов Artrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Agrobacterium, Rhizobium (Asano et al, 1982; Cramp et al, 1997; Nawas et al, 1991, Kobayashi et al, 1995). Известно, что бактерии утилизируют нитрилы посредством двух альтернативных путей метаболизма: нитрилазного и нитрилгидратазно-амидазного (Asano et al, 1980,1982; Kobayashi et al, 1994). Нитрилгидратазный путь метаболизма нитрилов широко распространен у бактерий. В настоящее время идентифицировано два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами: железозависимые и кобальтзависимые. Железосодержащие нитрилгидратазы встречаются чаще и были

РОС. НАЦИОНАЛЬНА* СИМ МОТЬКА

описаны первыми. Ионы кобальта обнаружены в активных центрах нитрилгидратаз штаммов R. rhodochrous Л, М8, P. putida 5B и В. smithli SC-JO5-1 (Bunch etal., 1998;

Kobayashi et al., 1999; Pogorelova et al, 1996). Биохимическая регуляция активности, генетическая организация и энзиматические свойства нитрилгидратаз разных штаммов различаются в значительной степени. Опубликованные данные исследований не дают полного представления о разнообразии и механизмах регуляции метаболизма нитрилов у бактерий.

Таким образом, актуальными задачами микробиологии, имеющими фундаментальное и практическое значение, являются выделение из природных сообществ и селекция новых штаммов, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот, исследование процессов конверсии нитрилов, биохимической и генетической регуляции метаболизма этих соединений.

Цель настоящего исследования - Изучение физиолого-биохимических свойств новых селектированных штаммов бактерий-продуцентов нитрилгидратазы.

Основные задачи исследования:

1. Выделить микроорганизмы, способные утилизировать нитрилы карбоновых кислот путем двустадийного гидролиза. Отобрать и идентифицировать штаммы с высокой нитрилгидратазной активностью.

2. Определить локализацию генов нитрилгидратаз селектированных штаммов.

3. Исследовать влияние различных факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммов-продуцентов.

4. Охарактеризовать нитрилгидратазы: определить субстратную специфичность ферментов, рН- и температурную зависимость, действие ингибиторов на ферментатив1гую активность.

5. Дать сравнительный анализ выделенных культур по каталитическим свойствам и оценить возможность их применения в технологии синтеза акриламида.

Научная новизна. Селектированы и исследованы новые высокоактивные штаммы-продуценты нитрилгидратазы Rhodococcus erythropolis 84 и

RhodococcusrubergLl. Разработан оригинальный спектрофотометрический метод измерения нитрилгидратазной активности. Показана хромосомная локализация генов нитрилгидратаз данных штаммов. Установлено, что нитрилгидратазная активность изученных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а биосинтез железозависимой нитрилгидратазы R. erythropolis 84 - при увеличении концентрации аммония. Установлено, что присутствие индуктора, нитрила или амида, не

является обязательным для проявления нитрилгидратазной активности у обоих штаммов. Выявлены существенные различия влияния факторов среды на нитрилгидратазную активность R. erythropolis 84, R. ruber gtl и ранее известных штаммов - продуцентов нитрилгидратазы. Показано, что нитрилгидратазы выделенных штаммов обладают широкой субстратной специфичностью и гидратируют бензонитрил и 3-цианопиридин с более высокой скоростью, чем известные промышленные штаммы. Обнаружено, что нитрилгидратаза R. ruber gtl имеет более широкий диапазон термо- и рН- устойчивости, чем фермент R. erythropolis 84.

Теоретическое и практическое значение работы. Создана лабораторная коллекция бактерий, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот. Выполненные исследования расширяют представления о разнообразии бактерий, экспрсссирующих нитрилгидратазы, регуляции метаболизма нитрилов, возможности использования новых штаммов для синтеза амидов. Выделенные штаммы и полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования технологии синтеза акриламида, для получения других химических соединений, а также для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Селектированные штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl метаболизируют алифатические и ароматические нитрилы, динитрилы и амиды нитрилгидратазно -амидазным путем.

2. Гены а- и (J-субъединиц нитрилгдратаз имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратаза R. erythropolis 84 является железозависимым, а нитрилгидратаза R. ruber gtl - кобальтзависимым ферментом.

3. Нитрилгидратазная активность исследованных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а у R erythropolis 84 - также при увеличении содержания аммония. Присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления активности фермента.

4. Нитрилгидратазы штаммов Я erythropolis 84 и R. ruber gtl обладают широкой субстратной специфичностью. Наилучшими субстратами являются ацетонитрил и акрилонитрил. Кобальтзависимая нитрилгидратаза имеет более широкий диапазон термо- и рН-устойчивости.

студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология: проблемы и пути решения», г. Пермь, 2001,2002; Международном семинаре МНТЦ "Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса" г. Пермь, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград - Пермь, 2001; Конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002, 6-ой и 7-ой Путинских конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века», г. Пущино, 2002, 2003. По теме диссертации опубликовано 24 научные работы.

Объем и структура- диссертации. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 15 таблиц; состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 174 наименования работ отечественных (22) и зарубежных (152) авторов.

Связь работы с научными программами. Исследования выполнены. при поддержке гранта РФФИ № 01-04-96465, ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», программы Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» и программы Отделения биологических паук РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами».

Список принятых сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ- газовая хроматография; МИК - минимальная. ингибирующая концентрация; МПА - мясо-пептонный агар; МННГ - Ы-метил-К-ШГГро-Ы-нитрозогуанидин; ОП - оптическая плотность; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СЕ -субъединица; LB - среда Луриа-Бертани.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериальные штаммы. Объектами исследования являлись полученные в результате селекции штаммы R. вгуШгороШ 84 и Я.гиЬвг обладающие высокой нитрилгидратазной активностью. Исследуемые бактериальные штаммы были селектированы из образцов почв, отобранных в местах загрязнения акрилонитрилом и акриламидом (ФГУП «Пермский завод им. СМ. Кирова», г. Пермь и ОАО «Бератон», г. Березники, Пермская обл.).

Среды и условия культивирования. Для выделения и выращивания нитрил-утилизирующих микроорганизмов была разработана синтетическая среда N (солевая основа), следующего состава (г/л):

MgS04x7H20 - 0,5; CaCI2 - 0,005; CoCl2*6H20 - 0,01; FeS<V7H20 - 0,005; pH 7Д ± 0,2.

В качестве источников углерода и азота использовали глюкозу при концентрации в среде 0,1 % и NH4CI в концентрации 10 мМ, соответственно, либо другие источники углерода и азота в соответствии с условиями эксперимента.

Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл при постоянном перемешивании со скоростью вращения 120 об/мин и температуре 28°С, либо в ферментёре «Фермус-4» в периодическом режиме. Рост культуры бактерий оценивали по оптической плотности суспензии клеток при нм

с учетом разведения. Одна единица ОПмо соответствует 0,42 мг сухого веса клеток. Минимальные ингибирующие концентрации нитрилов и амидов измеряли в суспензионном тесте в 96-луночных планшетах методом последовательных двукратных разведений.

Селекция штаммов-продуцентов нитрилгидратаз. Штаммы бактерии-продуценты нитрилгидратаз выделяли методами накопительной культуры и прямого высева на среде N с добавлением ацетонитрила, акрилонитрила или изобутиронитрила в качестве селективных субстратов. Для повышения- генетической гетерогенности культуры в ходе селекции в жидкую среду добавляли мутаген МННГ до концентрации 10,0 мкг/мл (Методы общей микробиологии, 1983). Для получения штаммов с пониженной амидазной активностью в качестве селективного агента применяли хлорацетамид (Clarke, Tata, 1973;.Yanenko et al., 1995). Чистые культуры получали путем рассева на агаризованной среде LB.

Идентификация штаммов проводилась на основании культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик согласно «Определителю бактерий Берджи» (под ред. Хоулт, 1997) и работам (Ившина и др., 1987; Нестеренко и др., 1995).

Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот, субстратов и продуктов биотрансформации.

Трансформацию нитрилов с использованием биомассы выделенных штаммов проводили при 25°С в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, рН 7,2 и останавливали добавлением концентрированной HCl. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин, 5 мин. Концентрации алифатических амидов определяли по разности оптической плотности реакционной среды при или 260 нм на спектрофотометре

СФ-46 ("ЛОМО", СССР) в начале и в конце реакции. Супернатант анализировали с помощью методов ГХ на хроматографе Chrom 5d ("LP", Чехославакия) и ВЭЖХ на хроматографе "LKB Bromma" (Швеция).

Нитрилгидратазную активность измеряли оригинальным методом по изменению концентрации нитрила и амида в реакционной среде за 10 минут трансформации. Удельную активность фермента определяли как количество амида в мкмоль, образуемое за 1 минуту количеством клеток, соответствующим 1 мг сухого веса. Единица нитрилгидратазной активности (1 ЕД) соответствует 1 мкМ амида/мг сухих клеток/мин.

Бесклеточный экстракт получали путем ультразвуковой дезинтеграции клеток на установке УЗДН-4 и последующего центрифугирования. Надосадочную жидкость использовали для энзиматических исследований.

Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция. Хромосомную ДНК выделяли фенольным методом в модификации Хантера (Клонирование ДНК, 1988). Амплификацию ДНК проводили с применением Taq- и Tth - ДНК-полимераз на термоциклере ТЗ (Biometra, Германия). Олигонуклеотидные праймеры, специфичные к последовательностям ДНК 5'- и 3'- концов генов а- и р-субъединиц Со-зависимой нитрилгидратазы R. rhodochrous Л (Kobayashietal., 1991) и Fe-зависимой нитрилгидратазы Rhodococcus sp. N-774 (Ikehata et al., 1989) были разработаны с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей GENBANK. Электрофорез ДНК в агарозном геле проводили стандартным методом (Маниатис и др., 1984).

Статистическая обработка. Все опыты повторяли не менее трех раз. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы, достоверность различий определяли с использованием критерия Стыодента и непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни (U). Анализ результатов проводили с помощью стандартных пакетов программ MS Excel 2000 и Statistica.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Идентификация бактерий, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот. В

результате изучения культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических признаков селектированные нами штаммы, обладающие высокой нитрилгидратазной активностью, определены как R. erythropolis 84 и R. rubergtl.

Выделение ДНК и ПЦР-амплификация генов нитрилгидратаз. Известно, что у описанных в литературе штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы, гены, контролирующие гидролиз нитрилов, имеют хромосомную локализацию (Kobayashi et ai, 1992). В результате генетических исследований установлено, что

штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl не несут плазмид. Путем амплификации на матрице хромосомной ДНК R erythropolis 84 с праймерами, специфичными к генам а- и Р" субъединиц железосодержащей нитрилгидратазы, получены фрагменты ДНК (рис. 1), соответствующие по размеру аналогичным генам из других объектов (Nagasawa et al, 1987; Nishiyama et al, 1991). На матрице ДНК R ruber gtl с праймерами к генам а- и Р* субъединиц кобальтсодержащего фермента амшшфицированы фрагменты (рис. 2), соответствующие по размеру (680 пн - а-СЕ и 720 пн -$-£Е)н а м нитрилгидратазы штамма R rhodochrous Jl (Kobayashi et al, 1991)

Оцепка зависимости иитрилгидратазной активности клеток от фазы роста культуры. Проведенные эксперименты показали, что максимальная нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 проявляется в первой трети фазы активного роста, а при выходе культуры в стационарную фазу падает до нуля (рис. 3). Важно отметить, что максимум активности фермента R ruber gtl соответствует моменту перехода в

стационарную фазу - периоду наибольшего накопления биомассы (рис.4). Высокая активность нитрилгидратазы R. ruber gtl сохраняется в стационарной фазе без добавления стабилизаторов, необходимых для поддержания активности нитрилгидратазы P. chlororaphisB23 и R. rhodochrous J1(Nagasawa etal., 1987,1991).

Рис.3. Зависимость активности нитрилгидратазы Е. егуМгврвШ 84 от фазы роста культуры

7- нитрилгидратазная активность; 1 -2- плотность культуры.

Рис.4 Зависимость активности нитрилгидратазы R. ruber gtl от фазы роста культуры

нитрилгидратазная активность; 2- плотность культуры.

Нитрилы и амиды как ростовые субстраты. На следующем этапе работы изучали способность R. erythropolis 84 и R. ruber gtl использовать алифатические и ароматические нитрилы, динитрилы и амиды в качестве источника углерода и азота.

Как видно из табл. 1, предельные алифатические нитрилы и амиды являются хорошими источниками' углерода и азота для обоих штаммов. Наиболее легко утилизировались неразветвленные соединения с короткой цепью. Изобутиронитрил также поддерживал рост в качестве источника углерода или азота, но скорость роста на нем была ниже. Ненасыщенные алифатические нитрилы и амиды использовались только как источник азота. Особо следует подчеркнуть, что оба штамма были способны использовать акрилонитрил в качестве единственного источника азота, однако ни один из штаммов не утилизировал лактонитрил.

Таблица 1.

Рост Л erythropolis 84 и R. ruber gtl на нитрилах и амидах

Нитрил мМ Источник углерода и азота' Источник азота2 Источник углерода3

84 gtl 84 gtl 84 gtl

Ацетонитрил 10 ++ ++ ++ -н- ++ ++

Пропионитрил 10

Бутиронитрил 10 ++ ++ ++ ++ ++ +

Изобутиронитрил 10 + + ++ ++ + ++

2-Цианопиридин 10 - - ± ± - -

3 -ОН-пропионитрил 10 ± - ++ ++ + -

Лакгонитрил 5 - - - - - -

Лкрилонитрил 5 - - ++ ++ - -

Адипонитрил 5 - - ++ + - -

Малононитрил 5 + - ++ + ++ -

Бензонитрил 5 - ± - + - -

Ацетамид 10 ++ ++ ++ ++ ++ ++

Пропионамид 10 ++ ++ -Н- ++ -и- -н-

Бутирамид 10 ++ + ++ -н- ++ +

Изобутирамид 10 ++ + ++ ++ ++ +

Лактамид 10 ++ ++ ++ -н- ++ ++

Акр ил амид 10 - - ++ ++ - -

Метилацетамид 10 - + ± ++ ++ +

Бензамид 10 - - ++ ++ ± -

Примечание, ^среда N

ОП54о> 0,5 через 48 часов

2 среда N. 0,1 % глюкоза + ОП34о > 0,5 на 5 сутки

3 среда N. 5 мМ ЫН4С1 ± 0п54о>0,5 на 8 сутки

- отсутствие роста на 10 сутки,

Влияние факторов среды на рост бактерий и нитрилгидратазную активность.

Ранее было показано, что добавление нитрила или амида необходимо для индукции процесса транскрипции генов нитрилгидратаз штаммов Шоёосоееш sp. N774, Вкойососст rhodochrous Л и КИойососст rhodochrous M8 (Komeda & а1., 1996; Nagasawa & а1, 1991; Астаурова и др., 1991). Нами установлено, что незамещенные алифатические нитрилы и амиды являются индукторами нитрилгидратаз штаммов

R. eryihropolis 84 и R. rubergtl, при этом активность фермента J1 erythropolis 84 более чувствительна к присутствию амидов в среде. Следует отметить, что активность ферментов была достаточно высокой без добавления индукторов в среду, и их присутствие не является обязательным для проявления активности фермента. Напротив, акрилонитрил, акриламид, бензонитрил, бензамид, 3-гидроксипропионитрил и динитрилы снижали нитрилгидратазную активность.

Исследован рост и нитрилгидратазная активность клеток R. erythropolis 84 и R. ruber gtl на минеральной среде с различными источниками углерода в концентрации 20 мМ (рис. 5).

Рис. 5. Максимальная плотность культуры (а) и относительная активность нитрилгидратаз (б) R. erythropolis 84 и R. ruber gtl при культивировании в присутствии различных источников углерода

7- глюкоза; 2- сахароза; 3- лактоза; 4- ацетонитрил; 5- ацетамид; 6- ацетат натрия; 7-пируват натрия; 8- лактат натрия; 9- цитрат натрия; 10- глицерин; 11- сорбит; 12- маннит.

Установлено, что оптимальным субстратом для роста и проявления питрилгидратазной активности R. erythropolis 84 является цитрат. В то же время штамм R. ruber gtl проявляет высокую общую активность при использовании многоатомных спиртов сорбита и маннита. Оба штамма использовали глюкозу в качестве источника углерода, при этом активность нитрилгидратазного фермента была заметно ниже

активности, зарегистрированной при росте бактерий на ряде других источников углерода. У обоих штаммов значительное подавление активности зарегистрировано при концентрации глюкозы 0,3 % (табл. 2). Дальнейшее увеличение количества глюкозы в среде не приводило к заметному снижению активности нитрилгидратазы. В то же время было показано, что глюкоза не снижает нитрилгидратазную активность отмытых от среды клеток и бесклеточных экстрактов штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl. Это позволило нам предположить, что нитрилгидратазная активность подвержена катаболитной репрессии глюкозой, описанной ранее у грамотрицательных бактерий (Magasanik, 1970).

Таблица 2.

Активность нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis 84 н R. ruber gtl при разной концентрации глюкозы в среде

Глюкоза, % Удельная активность нитрилгидратазы, ЕД

R. erythropolis 84 R. ruber gtl

0 4б,4±3,6 139,2±б,7

0,1 35,0±2,5* 124,3±6,3

0,3 5,6±0,8* 60,0±4Д»

1 3,0±0,7* 59,3±4,1*

Примечание. Источник азота - 5 мМ хлорид аммония; источник углерода - 10 мМ ацетамид, * - Р<0,05.

Нами исследовано влияние ряда альтернативных источников азота на рост и нитрилгидратазную активность (рис.6) штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl. Нитрит натрия, в присутствии которого наблюдался максимальный рост клеток R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, не обеспечивал высокой ферментативной активности R. erythropolis 84. Глицин, метиламин, диметиламин усваивались обоими штаммами в меньшей степени по сравнению с другими источниками азота, но обеспечивали достаточно высокий уровень ферментативной активности. Высокая активность нитрилгидратазы наблюдалась также в присутствии ацетонитрила и ацетамида.

Рис. 6. Максимальная плотность культуры (а) и относительная активность нитрилгидратаз (б) штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl при культивировании на минеральной среде с различными источниками азота (источник углерода -0.1 % глюкоза)

1- аммоний; 2- ацетонитрил; 3- ацетамид; 4- пропионамид; 5- мочевина; б- нитрат натрия; 7- нитрит натрия; 8- р-аланин; 9- глицин; 10- метиламин; 11- диметиламин.

В последующих экспериментах по влиянию аммония на активность нитрилгидратазы штамма R. erythropolis 84 установлено, что ацетонитрил и ацетамид в качестве единственного источника азота обеспечивали более высокий уровень активности, чем при их сочетании с аммонием (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние сульфата аммония на активность нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl

Источник азота Удельная активность нитрилгидратазы, ЕД

R. erythropolis 84 R. ruber gtl

ЮмМЛцетамид 46 75

ЮмМ Ацетамид + 5 мМ NH* 34* 123 *

ЮмМ Ацетонитрил 71 72

ЮмМ Ацетонитрил + 5 мМ NH< 56« 124*

Примечание. Источник углерода - 0,1 % глюкоза, * - Р < 0,05 по критерию U.

В связи с этим было изучено влияние различных концентраций аммония на ферментативную активность штамма R. erythropoUs 84. Для этого сравнивали активность нитрилгидратазы клеток, выращенных без аммония и с аммонием в различных концентрациях (табл. 4). Ферментативная активность штамма R. erythropoUs 84 находилась в обратной зависимости от содержания аммония в среде: чем больше концентрация аммония, тем меньшую нитрилгидратазную активность проявляли клетки.

Таблица 4.

Влияние аммония на активность нитрилгидратазы Е. ету^гороШ 84

Примечание. Источник углерода - 0,1 % глюкоза, * - Р < 0,05 по критерию U.

Таким образом, установлено, что добавление аммония в среду при культивировании R. erythropolis 84 на ацетамиде обеспечивает быстрый рост клеток, но снижает нитрилгидратазную активность. В то же время, активность нитрилгидратазы R. ruber gtl зависит в большей степени от общей концентрации азота, чем от концентрации нитрила или амида.

В настоящее время известно два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами: железо- и кобальтзависимые (Kobayashi, Shimizu, 2000).

Таблица 5.

Зависимость нитрилгидратазной активности и плотности культуры R. erythropolis 84 и R. ruber gtl от содержания ионов железа и кобальта в среде

Штамм- Параметр Без Fe и Со Fe Со

R. erythropolis 84 Активность, БД 24 121* 20

ОП540 1.1 1,6 U

R. ruber gtl Активность, ЕД 22,4 23,2 164*

ОПмо 0,9 1,5 1,3

Примечание. ♦ - Р < 0,05 по критерию U.

Из данных, представленных в табл. 5, видно, что уровень нитрилгидратазной активности изучаемых штаммов зависит от присутствия ионов железа или кобальта в ростовой среде. Высокая нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 проявляется при росте клеток на средах, содержащих ионы железа, и практически не изменяется при добавлении солей кобальта. Это подтверждает данные ПЦР-анализа генов нитрилгидратаз о том, что культура R. erythropolis 84 является продуцентом железозависимой нитрилгидратазы. Штамм R. ruber gtl проявляет максимальную активность нитрилгидратазы при росте на средах, содержащих ионы кобальта. Таким образом, штамм R. ruber gtl образует кобальтзависимую нитрилгидратазу.

Характеристика нитрилгидратаз.

Субстратная специфичность нитрилгидратаз. В качестве субстратов нитрилгидратаз исследуемых штаммов были проверены предельные и непредельные алифатические нитрилы, в том числе гидрокси- и динитрилы, гетероциклические, ароматические нитрилы. Результаты представлены в табл. 6 в виде относительной активности, выраженной в процентах.

Таблица 6.

Субстратная специфичность нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl

Субстрат Относительная нитрилгидратазная активность, %

R. erythropolis 84 R ruber gtl

Ацетонитрил 100 100

Пропионитрил 34,1 55,9

Бутирошприл 50,4 52,1

Изобутиронитрил 17,5 5,6

Акрилонитрил 26,3 62,0

Лактонитрил 6,3 5,0

Адипонитрил 48,5 13,0

Малонодинитрил 8,3 11,7

Бензонитрил 0,8 18,6

3-цианопиридин 1,6 10,0

Примечание. За 100% принята скорость гидролиза ацетонитрила.

Как видно из табл. 6, наилучшим субстратом для нитрилгидратаз обоих штаммов был ацетонитрил, имеющий самую короткую углеродную цепь. Хорошо гидратировались предельные алифатические нитрилы пропионитрил и бутиронитрил.

Длинноцепочечный динитрил - адипонитрил конвертировался клетками Я erythropolis 84 в 6 раз быстрее короткоцепочечного малонодинитрила. Нитрилгидратаза R. ruber gtl показала высокое сродство к акрилонитрилу, в отличие от фермента R. erythropolis 84. Наоборот, изобутиронитрил трансформировался клетками R. ruber gtl в три раза медленнее, чем R. erythropolis 84. Присутствие гидроксильной или метальной групп в молекулах нитрилов в значительной степени снижало скорость гидратации. Например, гидратация лактонитрила и изобутиронитрила штаммом R. ruber gtl составляла только 5 % от скорости конверсии ацетонитрила. В качестве субстратов для нитрилгидратазы штамма R. ruber gtl были эффективны бензонитрил и, в меньшей степени, 3-цианопиридин.

Температурная и рН зависимость нитрилгидратаз. Как видно из рис.7, нитрилгидратаза R. erythropolis 84 имеет низкую термостабильность. При оптимальной температуре (ЗО°С) активность фермента составляла 70 ЕД, а при 40°С снижалась в 2 раза. Максимальная активность фермента R. ruber gtl была зарегистрирована при температуре 55°С. Нитрилгидратаза R. ruber gtl сохраняла не менее 75 % от максимальной активности в интервале 40-55°С в течение 10-минутной реакции.

s 80 -I г 800

«t 00 70- -700

.2 60- J \ -600

I 50- Ä. \ -500

£ ^^^ / X. \

t 40 ■ J \ \ -400

«i 30- / \ \ ' -300

20 - -200

10 - ' \ \ • 100

0- -1-1-1—■ •! --- i b -0

-о-2

10 20 30 40 50 60 70

Рис. 7. Зависимость активности нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 (/) и R. ruber gtl (2) от температуры.

Важно подчеркнуть, что штамм R. ruber gtl сопоставим по термостабильности нитрилгидратазы со штаммом R. rhodochrous Л (Nagasawa etai, 1991).

Влияние рН среды на активность нитрилгидратаз. Из данных, представленных на рис. 8, штамм R. erythropolis 84 имеет узкий пик нитрилгидратазной активности при рН от 6,0 до 8,0, достигающий максимального значения при рН 7,0. Нитрилгидратаза R ruber gtl проявляла высокую активность (более 30 % от максимальной) в диапазоне рН от 5,0 до 9,5. Активность фермента, близкая к максимальной, зарегистрирована в широком интервале рН от 6 до 8. Оба фермента были неактивны при рН 2,0 и 12,0.

Рис. 8. Зависимость активности нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 (7) и R. ruber gtl (2) от рН среды.

Таким образом, нитрилгидратаза R. ruber gtl была высокоактивна как в слабокислой, так и в слабощелочной среде, тогда как активность нитрилгидратазы R. erythropolis 84 проявлялась в узком интервале нейтральных значений рН.

Анализ влияния ингибиторов на активность ферментов показал, что карбонильные реагенты - гидроксиламин и фенилгидразин - снижают каталитическую активность нитрилгидратазы у обоих штаммов. Фермент R. erythropolis 84 сильно ингибируется перекисью водорода, 2-меркаптоэтанолом и FCCI3 в концентрации 1 мМ. Нитрат серебра, связывающий тиоловые группы, полностью подавляет активность нитрилгидратазы штамма R ruber gtl.

ВЫВОДЫ

1. В процессе селекции получены новые высокоактивные штаммы рода Rhodococcus - продуценты нитрилгидратазы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl с

максимальной ферментативной активностью, зарегистрированной при 25°С, 270 и 634 ЕД, соответственно.

2. Штаммы R. erythropolis 84 и R.rubergtl метаболизируют алифатические предельные и непредельные нитрилы, ароматические нитрилы и динитрилы нитрилгидратазно-амидазным путем.

3. Показано, что гены а- и ß-субъединиц нитрилгдратаз изученных штаммов имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратазы данных штаммов являются металлозависимыми ферментами: железозависимым - R. erythropolis 84 и кобальтзависимым - R. ruber gtl.

4. Нитрилгидратазная активность изученных штаммов снижается при повышении концентрации в среде глюкозы, а у R. erythropolis 84 также при увеличении содержания аммония. Присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления активности фермента.

5. Кобальтзависимая нитрилгидратаза R. ruber gtl, имеет широкий диапазон оптимальных значений температуры (37-55°С) и рН (6-8).

6. Нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl обладают широкой субстратной специфичностью, в том числе к ароматическим и циклическим нитрилам. Наилучшими субстратами являются ацетонитрил и акрилонитрил.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., ДемаковВ.А. Селекция штаммов-продуцентов акриламида//Проблемы химии и экологии: Матер. Обл. научно-технической конф. молодых ученых и студентов. - Пермь: ГОТУ, 2000. - С. 3-4.

2. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Влияние различных источников азота на рост штамма Arthrobacter sp. gbll, конвертирующего нитрил акриловой кислоты в акриламид//Биотехнология-2000. Тез. докл. Научно-практического семинара. - Пущино, 2000. - С. 84.

3. Патент на изобретение РФ № 2196822. ДемаковВ.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis - продуцент нитрилгидратазы. Заявка №2001120750. Приоритет от 25.07.2001. Зарегистрир. в Госреестре изобр. 20.01.2003

4. Кузнецова М.В. Утилизация нитрилов штаммами Rhodococcus//Экология: проблемы и пути решения. Матер. IX межвуз. коиф. - Пермь, 2001. - 4.2. - С35-38.

5. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Максимова Ю.Г., ДемаковВА. Утилизация нитрилов штаммами-продуцентами нитрилгидратазы//Проблемы загрязнения окружающей среды-2001. Матер. V Междунар. конф. -Пермь, 2001. - С. 30.

6. ДемаковВА., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Кузнецова М.В., Козлов СВ. Микробная конверсия нитрилов карбоновых кислот//Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса. Докл. междунар. семинара МНТЦ. - Пермь, 2001. - С.63-66

7. ДемаковВА., Козлов СВ., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В, Ремезовская Н.Б. Получение акриловой кислоты биотехнологическим путем//Биосферосовместимые и средозащитные технологии при взаимодействии человека с окружающей природой. Матер. 6-й междунар. научно-практической конф. -Пенза,2001.-С. 74-76.

8. Кузнецова М.В. Влияние температуры и рН среды на активность нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl//B кн.: Экология: проблемы и пути решения. - Пермь, 2002. - 4.2. - С. 110-113.

9. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Кохчов С.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Демаков В А., Максимова Ю.Г. Исследование каталитических свойств и регуляции активности нитрилгидратазы штамма, конвертирующего акрилонитрил в

акриламид//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2001 г. Пермь. - 2002. - С.96-99.

10. Козлов СВ., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Демахов ВЛ. Выделение штаммов, обладающих термостабильной нитрилазной и нтрилгидратазной активностью//Биология - наука XXI века Матер. 6-й Путинской конф. молодых ученых. - Пущино, 2002. - Т.З. - С.29.

И. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Кохтов С.В., Овечкина Г.В., Демаков В.Л. Конверсия нитрилов штаммом Rhodococcus ер. gtl//Taм же. - С.32.

12. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г., Гусев ВА. Новый штамм нокардиоподобных бактерий, обладающий термостабильной нитрилазной активностью//Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Матер. Межрегион, конф. молодых ученых. - Пермь, 2002. - С 43-44.

13. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов СВ., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Сравнительная характеристика субстратной специфичности нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus 8р. gtl и R. erythropolis 84//Там же. -С. 48-49.

14. Демаков ВА., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов СВ., Овечкина ГЗ. рН-зависимость нитрилазной и нитрилгидратазной активности штаммов Rhodococcusl/Мгпер. Ш-го съезда Биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002. -С 50-52.

15. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов СВ., Максимова Ю.Г., ДемаковВЛ. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus ер. ^(//Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, N. 1. - С 63-68.

16. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов СВ., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Демаков ВА., Максимова Ю.Г. Исследование каталитических свойств и регуляции активности нитрилгидратазы штамма, конвертирующего акрилонитрил в акриламид//В кн.: Региональный конкурс РФФИ-Урал. Результаты научпых исследований, полученные за 2002 г. -Пермь, 2003. - С.212-215.

17. Демаков ВЛ., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов СВ., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Исследование каталитических свойств и регуляции

нитрилазной активности штаммов, конвертирующих акрилонитрил в акриловую кислоту//Там же. - С. 186-189.

18. Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимова Ю.Г., Гусев В.А., Демаков ВА. Влияние различных источников углерода на рост и ферментативную активность штаммов-продуцентов нитрилгидратаз Rhodococcus sp. gtl и R. erythropolis 84//B кн.: Экология: проблемы и пути решения: матер. XI межвуз. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. - Пермь: ПТУ, 2003. - С. 111.

19. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Влияние иммобилизации клеток штамма Rhodococcus sp. gtl на активность нитрилгидратазы//Там же. - С. 115.

20. Козлов СВ., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Гусев В.А., Демаков ВА. Особенности роста и активности нитрилгидролизующего штамма на средах с различным содержанием глюкозы и ацетонитрила//В кн.: Проблемы химии и экологии: матер, обл. конф. молодых ученых и студентов. - Пермь, 2003. - С. 30.

21. Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Гусев В.А., Демаков В.А. Влияние различных источников азота на рост и ферментативную активность штаммов-продуцентов нитрилгидратаз Rhodococcus sp. gtl и R. erythropolis 84//Там же. - С. 31.

22. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В А., Олонцев В.Ф. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации клеток штамма Rhodococcus sp. gtl, обладающего нитрилгидратазной активностью//Там же. - С. 35-36.

23. Демаков ВА., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов СВ., Овечкина Г.В., Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Гусев В.А. Биоконверсия нитрилов штаммами-продуцентами нитрилгидролизующих ферментов//В кн.: Биотехнология: состояние и перспективы развития: матер. II Московского междунар. конгресса. - М., 2003. - С. 279280.

24. Патент на изобретение РФ № 2223316. Демаков ВА., Максимов А.Ю., АликинВ.Н., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Будников В.И., Федчеико В.Н., Кузьмицкий Г.Э., ЧерешневВ.А. Штамм бактерий Rhodococcus ruber - продуцент нитрилгидратазы. Заявка №2001133204. Приоритет от 06.12.2001. Зарегистрир. в Госресстре изобр. 10.02.2004.

Лицензия ПД-11-0002 от 15.12.99

Подписано в печать 14.05.2004. Формат 60X90/16. Набор компьютерный. Тираж 100 экз. Усл. печ. л. 1,0. Заказ № 393/2004.

Отпечатано на ризографе в отделе Электронных издательских систем ОЦНИТ Пермского государственного технического университета 614600, г. Пермь, Комсомольский пр., 29а, к.113, т.(3422) 198-033

"150 19

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кузнецова, Марина Валентиновна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Бактерии-продуценты нитрилгидратазы

1.1. Пути метаболизма нитрилов карбоновых кислот у бактерий

1.2. Бактерии, утилизирующие нитрилы карбоновых кислот

1.3. Классификация и характеристика нитрилгидратаз

1.4. Механизм нитрилгидратазнои реакции

1.5. Биохимическая регуляция активности нитрилгидратаз

1.6. Механизмы генетической организации и регуляции синтеза нитрилгидратаз

1.7. Перспективы использования штаммов-продуцентов нитрилгидратазы

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Среды и субстраты

2.3. Селекция штаммов-продуцентов нитрилгидратазы

2.4. Методы таксономического анализа

2.5. Условия культивирования бактерий и определение ростовых характеристик

2.6. Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот, субстратов и продуктов биотрансформации

2.7. Методы энзиматического анализа

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция

2.9. Статистическая обработка

Глава 3. Выделение и характеристика, штаммов - продуцентов нитрилгидратазы

3.1. Выделение культур, утилизирующих нитрилы карбоновых кислот

3.2. Идентификация штаммов-продуцентов нитрилгидратазы 55 3.3 Выделение ДНК и ПЦР-амплификация генов нитрилгидратаз

Глава 4. Исследование влияния факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl

4.1. Зависимость нитрилгидратазной активности клеток от фазы роста культуры

4.2. Нитрилы и амиды как ростовые субстраты

4.3. Оценка токсичности нитрилов и амидов

4.4. Утилизация ацетонитрила

4.5. Зависимость роста клеток и нитрилгидратазной активности от концентрации ацетонитрила

4.6. Индукция ферментов нитрилами и амидами

4.7. Влияние источника углерода на рост и нитрилгидратазную активность бактерий

4.8. Влияние источника азота на рост и нитрилгидратазную активность бактерий

4.9. Влияние ионов металлов на рост и нитрилгидратазную активность бактерий

Глава 5. Характеристика нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis и R. ruber gtl

5.1. Субстратная специфичность нитрилгидратаз

5.2. Влияние температуры на активность нитрилгидратаз

5.3. Влияние рН среды на активность нитрилгидратаз

5.4. Действие ряда ингибиторов на активность нитрилгидратаз

5.5. Конверсия акрилонитрила биомассой R. ruber gtl

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы"

Актуальность проблемы

В настоящее время во многих отраслях народного хозяйства, а также для очистки питьевой воды и промышленных стоков широко используют полимеры и сополимеры акриламида. Мировая потребность в этих продуктах удовлетворена не полностью и ежегодно увеличивается на 4-5 %. В отличие от традиционных способов каталитической конверсии акрилонитрила в акриламид на неорганических катализаторах, биокаталитический способ производства акриламида имеет ряд важных в экономическом и экологическом отношении преимуществ: высокую специфичность и селективность, одностадийность, малую энергоемкость, отсутствие побочных продуктов синтеза, технологических стоков и вредных отходов. В настоящее время широко внедряется метод промышленного производства акриламида с использованием биокатализаторов на основе биомассы штаммов-продуцентов фермента нитрилгидратазы Шюс1ососст гЪойосНгош и ряда других бактерий [127]. Это первый успешный опыт применения биокатализа в области крупнотоннажного химического синтеза. Расширение исследований бактерий, метаболизирующих нитрилы, обусловлено необходимостью улучшения способа производства акриламида, а также перспективой применения микроорганизмов для получения ряда других коммерчески значимых соединений [7, 22, 117].

Несмотря на значительные успехи в области селекции продуцентов ферментов, потребность промышленности в новых штаммах непрерывно возрастает. Большое значение в последнее время приобретает также возможность использования микроорганизмов в процессах биоремедиации почв и сточных вод, загрязненных нитрилами [10, 16,114].

Состояние вопроса. Изучение биотрансформации нитрилов началось с исследования растительных ферментов [146, 149, 157]. Впоследствии было установлено, что способность утилизировать нитрилы широко распространена и среди микроорганизмов [39, 74].

Известно, что бактерии утилизируют нитрилы посредством двух основных альтернативных путей метаболизма: нитрилазного и нитрилгидратазно-амидазного [29, 30, 90].

Нитрилгидратазно-амидазная система обнаружена у ряда почвенных бактерий рода Rhodococcus, в частности, у Rhodococcus sp. R312 [126], Rhodococcus rhodochrous N-77\ [137], J1 [87, 130], R. rhodochrous M8 [6], a также у представителей родов Agrobacterium, Arthrobacter, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Nocardia, Rhizobium [27, 51, 93, 95, 124, 134]. Штаммы-суперпродуценты нитрилгидратазы P. chlororophis B23, Rhodococcus sp. R312, R. rhodochrous N-774, Ли M8 нашли применение в биотехнологии синтеза акриламида [3, 86, 89]. Однако, несмотря на значительные успехи в области селекции продуцентов ферментов, потребность промышленности в новых штаммах непрерывно возрастает.

Долгое время считалось, что ароматические нитрилы конвертируются преимущественно посредством фермента нитрилазы [32, 49, 67]. В настоящее время известны нитрилгидратазы, катализирующие гидролиз как алифатических, так и ароматических нитрилов [8, 24, 92, 115, 154].

В настоящее время у микроорганизмов идентифицировано два типа нитрилгидратаз, различающихся простетическими группами (ионы железа или кобальта). Железосодержащие нитрилгидратазы встречаются чаще и были описаны первыми [34,60,124,126,144,155,170]. Ионы кобальта обнаружены в активных центрах нитрилгидратаз штаммов R. rhodochrous J1

130], М8 [174], Pseudomonas putida B5 [143] и Bacillus smithii SC-J05-1 [154].

До недавнего времени в литературе были описаны только нитрилгидратазы мезофильных бактерий. R.A. Cramp и R.A. Pereira выделили несколько умеренно термофильных видов Bacillus, имеющих двухступенчатую ферментативную систему метаболизма нитрилов [51, 144].

Нитрилгидратазы различных видов бактерий выделены и исследованы [27, 41, 50, 60, 73, 92]. Показано, что активные формы этих ферментов состоят из 2 неидентичных субъединиц: а и ß, соединенных в эквимолярном соотношении. За исключением гомотетрамерного фермента Agrobacterium tumefaciens d3 [34], все известные нитрилгидратазы являются aß-гетеромультимерами, как правило, димерами или тетрамерами. У R. rhodochrous J1 было обнаружено образование двух видов нитрилгидратаз: высокомолекулярной (520 кДа) и низкомолекулярной (130 кДа) [128, 160]. Известна кристаллическая структура железосодержащих нитрилгидратаз из Rhodococcus sp. R312 и R. rhodochrous N-771 и строение каталитического центра фермента [25, 70]. Менее подробно изучена кристаллическая структура Со-содержащих нитрилгидратаз [41, 46]. Описан эффект фотоактивации нитрилгидратаз у R. rhodochrous N-771 и N-774 [123,132].

Большинство нитрилгидратазных ферментов, известных по литературе, подвержены индукции различными нитрилами, амидами или карбоновыми кислотами [6, 60, 80]. Высокомолекулярная нитрилгидратаза R. rhodochrous J1 индуцируется амидами — продуктами реакции, но не нитрилами [99]. Мочевина, мощный индуктор нитрилгидратазы для R. rhodochrous J1 и R. rhodochrous М8, незначительно повышет активность фермента у Agrobacterium tumefaciens В-261 [80, 121,174].

Влияние аммония на активность ферментов биотрансформации нитрилов изучено только у штамма R. rhodochrous М8 [4, 5]. Показано, что нитрилгидратаза и амидаза R. rhodochrous М8 коиндуцируются рядом алифатических нитрилов и амидов, а избыток аммония подавляет индукцию. Адаптация клеток R. rhodochrous М8 к изменению природы и концентрации источника азота происходит с помощью механизма, известного у грамотрицательных микроорганизмов как азотный контроль [108].

В настоящее время опубликованы немногочисленные данные о влиянии глюкозы на метаболизм нитрилов. Глюкоза подавляет индуцированную амидами активность нитрилгидратазы и амидазы у R. rhodochrous М8 [6], угнетает образование нитрилгидратазы у Pseudomonas chlororaphis В23 [125], но не влияет на экспрессию фермента у А. tumefaciens В-261 [80].

Для штамма R. rhodochrous М8 показана кобальтзависимая транскрипция генов, кодирующих нитрилгидратазу [145]. Это редкий пример специфической регуляции внутриклеточных ферментов на уровне транскрипции ионами металла, которые являются простетическими группами энзима. Ионы кобальта индуцируют нитрилгидратазу R. rhodochrous J1, а также необходимы для формирования активного центра белка, его вторичной структуры, стабилизации, и соответственно, уровня активности фермента [91,128].

В литературе представлена информация по генетическому контролю конверсии нитрилов карбоновых кислот у некоторых штаммов бактерий. В штаммах почвенных бактерий обнаружены хромосомные гены нитрилгидратазы и амидазы, контролирующие гидролиз нитрилов до соответствующей кислоты и аммония [86]. Клонированы и секвенированы гены высоко- и низкомолекулярной нитрилгидратазы R. rhodochrous J1 [88], гены нитрилгидратазы Rhodococcus erythropolis BL-1 [56], R. rhodochrous N-774 [69] и M8 [8]. Структурные гены а- и ß-субъединиц нитрилгидратаз находятся в одном локусе ДНК, но порядок расположения их кодирующих последовательностей у разных штаммов различен [85, 86]. Показано, что гены нитрилгидратазы и амидазы у ряда штаммов Rhodococcus тесно связаны и, по-видимому, организованы как оперон. Гены, ответственные за метаболизм нитрилов у кобальтсодержащего штамма R. rhodochrous М8, имеют другую организацию и составляют регул он [174].

Таким образом, нитрилгидратазный путь метаболизма нитрилов широко распространен у бактерий. Биохимическая регуляция активности, генетическая организация и энзиматические свойства нитрилгидратаз разных штаммов различаются в значительной степени. Опубликованные данные исследований не дают полного представления о разнообразии и механизмах регуляции метаболизма нитрилов у бактерий.

Цель настоящего исследования — Изучение физиолого-биохимических свойств новых селектированных штаммов бактерий-продуцентов нитрилгидратазы.

Основные задачи исследования:

2. Определить локализацию генов нитрилгидратаз селектированных штаммов.

3. Исследовать влияние различных факторов среды на рост и нитрилгидратазную активность штаммов-продуцентов.

4. Охарактеризовать нитрилгидратазы: определить субстратную специфичность ферментов, рН- и температурную зависимость, действие ингибиторов на ферментативную активность.

Научная новизна. Селектированы и исследованы новые высокоактивные штаммы-продуценты нитрилгидратазы

Rhodococcus erythropolis 84 и Rhodococcus ruber gtl. Разработан оригинальный спектрофотометрический метод измерения нитрилгидратазной активности. Показана хромосомная локализация генов нитрилгидратаз данных штаммов. Установлено, что нитрилгидратазная активность изученных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а биосинтез железозависимой нитрилгидратазы R. erythropolis 84 - при увеличении концентрации аммония. Установлено, что присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления нитрилгидратазной активности у обоих штаммов. Выявлены существенные различия влияния факторов среды на нитрилгидратазную активность R. erythropolis 84, R. ruber gtl и ранее известных штаммов - продуцентов нитрилгидратазы. Показано, что нитрилгидратазы выделенных штаммов обладают широкой субстратной специфичностью и гидратируют бензонитрил и 3-цианопиридин с более высокой скоростью, чем известные промышленные штаммы. Обнаружено, что нитрилгидратаза R. ruber gtl имеет более широкий диапазон термо- и рН-устойчивости, чем фермент R. erythropolis 84.

Теоретическое и практическое значение работы. Создана лабораторная коллекция бактерий, конвертирующих нитрилы карбоновых кислот. Выполненные исследования расширяют представления о разнообразии бактерий, экспрессирующих нитрилгидратазы, регуляции метаболизма нитрилов, возможности использования новых штаммов для синтеза амидов. Выделенные штаммы и полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования технологии синтеза акриламида, для получения других химических соединений, а также для разработки биотехнологических методов очистки окружающей среды.

Основные положения, выносимые на защиту

2. Гены а- и р-субъединиц нитрилгидратаз имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратаза R. erythropolis 84 является железозависимым, а нитрилгидратаза R. ruber gtl — кобальтзависимым ферментом.

3. Нитрилгидратазная активность исследованных штаммов снижается при повышении концентрации глюкозы в среде, а у R. erythropolis 84 - также при увеличении содержания аммония. Присутствие индуктора, нитрила или амида, не является обязательным для проявления активности фермента.

4. Нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl обладают широкой субстратной специфичностью. Наилучшими субстратами являются ацетонитрил и акрилонитрил. Кобальтзависимая нитрилгидратаза имеет более широкий диапазон термо- и рН-устойчивости.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на областных конференциях молодых ученых и студентов «Проблемы химии и экологии», г. Пермь, 2000, 2003; Научно-практическом семинаре «Биотехнология-2000», г. Пущино, 2000, 2003; IX и X Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология: проблемы и пути решения», г.Пермь, 2001, 2002; Международном семинаре МНТЦ "Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса" г. Пермь, 2001; V Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды», Волгоград - Пермь, 2001; Конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002, 6-ой и 7-ой Пущинских конференциях молодых ученых «Биология -наука 21-го века», г. Пущино, 2002,2003.

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в т.ч. статья в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», 2003, №1, с.63-68. Получены патенты Российской Федерации: №2196822 «Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis — продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 25.07.2001, и №2223316 «Штамм бактерий Rhodococcus ruber — продуцент нитрилгидратазы», дата приоритета 06.12.2001.

Связь работы с научными программами. Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 01-04-96465, ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 гг.», программы Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» и программы

Отделения биологических наук РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами».

Список принятых сокращений: ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ГХ - газовая хроматография;

ДАГПС - диаминопимелиновая кислота; МИК - минимальная ингибирующая концентрация; МПА - мясопептонный агар; МННГ - Ы-метил-И'-нитро-К-нитрозогуанидин; НГ - нитрилгидратаза; ОП - оптическая плотность; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СЕ - субъединица; ЬВ - среда Луриа-Бертани.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кузнецова, Марина Валентиновна

выводы

1. В процессе селекции получены новые высокоактивные штаммы рода Rhodococcus — продуценты нитрилгидратазы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl с максимальной ферментативной активностью, зарегистрированной при 25°С, 270 и 634 ЕД, соответственно.

2. Штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl метаболизируют алифатические предельные и непредельные нитрилы, ароматические нитрилы и динитрилы нитрилгидратазно-амидазным путем.

3. Показано, что гены а- и р-субъединиц нитрилгидратаз изученных штаммов имеют хромосомную локализацию. Нитрилгидратазы данных штаммов являются металлозависимыми ферментами: железозависимым -R. erythropolis 84 и кобальтзависимым - R. ruber gtl.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние двадцать лет опубликовано большое количество работ, посвященных исследованию бактериальных культур, способных утилизировать нитрилы карбоновых кислот. Данной способностью обладают микроорганизмы из различных таксономических групп, в особенности, представители рода Rhodococcus [6, 40, 48, 54, 86, 118, 165]. Бактерии этого рода отличаются высокой активностью нитрилгидратазы [42,71, 162]. При оптимальных условиях культивирования бактерий количество этого фермента может достигать 50 % от общего растворимого белка клетки [128]. По-видимому, такая сверхпродукция связана с особенностями регуляции и организации генов, контролирующих утилизацию нитрилов.

Из почвы, загрязненной акрилонитрилом, с помощью метода накопительной культуры нами были изолированы штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, способные к росту на нитрилах и амидах. Показано, что утилизация этих субстратов обеспечивается присутствием двух клеточных ферментов - нитрилгидратазы и амидазы.

Известно, что у описанных в литературе штаммов рода Rhodococcus -продуцентов нитрилгидратазы, гены, контролирующие гидролиз нитрилов, имеют хромосомную локализацию [86]. В результате выделения ДНК и электрофоретического анализа установлено, что штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl не несут плазмид.

В результате амплификации на матрице хромосомной ДНК R. erythropolis 84 с праймерами, специфичными к генам а- и ß- субъединиц железосодержащей нитрилгидратазы, получены фрагменты ДНК, размеры которых сопоставимы с аналогичными генами из других объектов [89]. На матрице ДНК R. ruber gtl с праймерами к генам а- и ß- субъединиц кобальтсодержащего фермента амплифицированы фрагменты, соответствующие по размеру (а-СЕ 680 п.н. и ß-CE 720 п.н.) генам нитрилгидратазы штамма R. rhodochrous J1 [99].

В экспериментах было выявлено, что максимальная нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 проявляется в первой трети фазы активного роста, а при выходе культуры в стационарную фазу падает до нуля. Максимум активности фермента R. ruber gtl соответствует выходу культуры в стационарную фазу - периоду наибольшего накопления биомассы. Установлено, что у этого штамма высокая активность нитрилгидратазы сохраняется в течение продолжительного периода после перехода в стационарную фазу. Полученные результаты позволяют предположить, что синтез фермента R. erythropolis 84 подвержен более жесткой метаболической регуляции, чем продукция нитрилгидратазы штамма R. ruber gtl.

Как показали исследования, оба штамма способны к утилизации алифатических и ароматических нитрилов и амидов в качестве источника углерода и/или азота. Несмотря на то, что акрилонитрил является хорошим субстратом для нитрилгидратазы, исследуемые штаммы используют его только в качестве источника азота. Вероятными причинами этого могут быть высокая токсичность акрилонитрила и продуктов его биотрансформации, отсутствие механизма утилизации низкомолекулярных а-ненасыщенных алифатических соединений и низкая амидазная активность по отношению к данному нитрилу. Обнаружено, что амидазная активность штамма R. ruber gtl по крайней мере в 20 раз ниже, чем активность нитрилгидратазы. Подобный эффект известен у штаммов R. rhodochrous J1 и R. rhodochrous М8, нитрилгидратазная активность которых также превышала амидазную в несколько раз [86, 174], а активность амидазы штамма В. imper ialis CSB 489-74 по отношению к акрил амиду была равна нулю [44]. Низкая активность амидазы штамма R. ruber gtl может иметь большое значение для его использования в биотехнологическом производстве амидов.

Ранее было показано, что добавление нитрила или амида необходимо для транскрипции генов нитрилгидратаз штаммов Rhodococcus sp. N774, R. rhodochrous Ли/?, rhodochrous M8 [6, 99, 124]. Более того, показано, что их присутствие является обязательным для формирования четвертичной структуры активной формы фермента. Присутствие в среде культивирования Б-капролактамида повышало активность нитрилгидратазы

A. tumefaciens В-261 в 13 тысяч раз [80]. Нами установлено, что незамещенные алифатические нитрилы и амиды являются индукторами нитрилгидратаз штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl. Напротив, акрилонитрил, акриламид, бензонитрил, бензамид, 3-гидроксипропионитрил и динитрилы снижали нитрилгидратазную активность. Показано, что нитрилгидратазная активность R. erythropolis 84 более чувствительна к присутствию амидов в среде. Например, уровень ферментативной активности при росте клеток с ацетамидом был в 25 раз выше, чем в контроле.

При культивировании штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl на среде без нитрилов или амидов уровень активности нитрилгидратазы был также достаточно высок. В то же время показано, что на степень индукции фермента влияют и другие факторы среды (источники углерода и азота, ионы железа и кобальта и др.). Таким образом, присутствие нитрилов или амидов в среде не является обязательным для экспрессии нитрилгидратаз R. erythropolis 84 и R. ruber gtl.

Известно, что многие индуцибельные ферменты подвержены катаболитной репрессии легкометаболизируемыми источниками углерода, такими, как глюкоза. Снижение индукции нитрилгидратазы при внесении в среду глюкозы может быть связано с нарушением проникновения индуктора в клетку, ретроингибированием уже синтезированного фермента или с подавлением его биосинтеза на уровне транскрипции [109]. Данные о влиянии глюкозы на активность ферментов гидролиза нитрилов немногочисленны. Глюкоза, фруктоза и сукцинат подавляют индуцированную амидами активность нитрилгидратазы и амидазы R. rhodochrous М8 [174]. Образование нитрилгидратазы у P. chlororaphis В23 также сильно угнетается при добавлении глюкозы в среду [170]. В то же время, активность нитрилгидратазы A. tumefaciens В-261 не репрессируется глюкозой [80], а нитрилгидратаза штамма Rhodococcus sp. CGMCC 0497 проявляет максимальную активность на среде, содержащей 1 % глюкозу или сахарозу [167]. Штамм В. imperialis CBS 498-74 показал максимальную нитрилгидратазную активность при росте на среде с начальным содержанием глюкозы 5 %, но максимум ферментативной продукции приходился на период снижения ее концентрации до 0,5 % [45].

Нами показано, что нитрилгидратазная активность R. erythropolis 84 и R. ruber gtl снижается при добавлении глюкозы в среду культивирования. У обоих штаммов значительное подавление активности зарегистрировано при концентрации глюкозы 0,3 %. Дальнейшее увеличение количества глюкозы в среде приводило к постепенному снижению активности нитрилгидратазы. Также было установлено, что глюкоза не снижает нитрилгидратазную активность отмытых от среды клеток и бесклеточных экстрактов штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, следовательно, ее угнетающее действие не может быть объяснено ретроингибированием. Исходя из полученных результатов, снижение активности нитрилгидратазы в ответ на добавление в среду глюкозы может быть рассмотрено как доказательство катаболитной репрессии у штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, аналогично тому, как это установлено для штамма R. rhodochrous М8 [174].

Нами исследовано влияние альтернативных источников углерода на рост и ферментативную активность штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl. Показано, что оба штамма хорошо растут на ряде естественных субстратов, таких как глюкоза, ацетат, цитрат, сорбит, маннит. Высокая скорость роста наблюдается также в присутствии ацетонитрила и ацетамида, однако они не являются наилучшими источниками углерода для роста клеток штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl, как это было показано для штамма R. rhodochrous МО [6]. Установлено, что оптимальным субстратом для роста и проявления нитрилгидратазной активности R. erythropolis 84 является цитрат. В то же время штамм R. ruber gtl проявляет высокую общую активность при использовании многоатомных спиртов сорбита и маннита.

Установлено, что исследуемые штаммы хорошо растут на низкомолекулярных алифатических нитрилах и амидах в качестве единственного источника питания. Высокая активность нитрилгидратазы у штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl проявлялась при росте в присутствии аммония. При добавлении аммония (до концентрации 5 мМ) в среду с ацетонитрилом или ацетамидом в концентрации 10 мМ скорость роста возрастала для обоих штаммов. При этом нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 снижалась, а активность фермента R. ruber gtl повышалась. Очевидно, что активность нитрилгидратазы R. ruber gtl зависит в большей степени от общей концентрации азота, чем от концентрации нитрила или амида. При культивировании клеток R. erythropolis 84 в среде, содержащей 10 мМ ацетамид, нитрилгидратазная активность снижалась пропорционально концентрации вносимого аммония. Возможно, это связано с тем, что синтез нитрилгидратазы подчинен азотному контролю подобно тому, как это было показано для R. rhodochrous МО и М8 [5, 6].

Среди альтернативных источников аммония для штамма R. ruber gtl предпочтительным является нитрит натрия, при росте на котором наблюдалась максимальная плотность культуры и высокая активность нитрилгидратазы.

Известно, что уровень нитрилгидратазной активности большинства известных штаммов зависит от присутствия ионов железа или кобальта в ростовой среде [59, 130, 146]. Высокая нитрилгидратазная активность штамма R. erythropolis 84 проявляется при росте клеток на средах, в состав которых было внесено железо, и практически не изменяется при добавлении солей кобальта. С учетом результатов ПЦР-анализа генов нитрилгидратаз, это свидетельствует о том, что культура R. erythropolis 84 является продуцентом железосодержащей нитрилгидратазы. Штамм R. ruber gtl проявляет максимальную активность нитрилгидратазы при росте на средах, содержащих ионы кобальта. Таким образом, штамм R. ruber gtl образует кобальтзависимую нитрил гидратазу аналогично бактериям-суперпродуцентам нитрилгидратазы R. rhodochrous J1 и R. rhodochrous М8. Показано, что нитрилгидратазная активность клеток R. erythropolis 84 составляет 64 % от исходной после инкубации в течение суток с 10 мМ ЭДТА. Нитрилгидратаза штамма/?, ruber gtl в аналогичных условиях сохраняет 96 % ферментативной активности. Это согласуется с литературными данными о том, что кобальтзависимые нитрилгидратазы более устойчивы к хелатирующим агентам, что предполагает прочную связь ионов кобальта с ферментом [9, 92].

Установлено, что нитрилгидратазы штаммов R. erythropolis 84 и R. ruber gtl заметно различаются по своим каталитическим свойствам.

Многие известные по литературе нитрилгидратазы имеют низкий уровень термостабильности. Так, для штаммов P. chlororaphis В23 и Rhodococcus sp. R312 температурный оптимум работы ферментов составляет 20°С и 35°С, соответственно [125, 126]. Нами показано, что фермент из штамма R. erythropolis 84 менее термостабилен, чем нитрилгидратаза R. ruber gtl. Максимальная активность фермента R. erythropolis 84 проявляется при температуре около 37°С, а при 45-50°С детектируется лишь в следовых количествах. В то же время нитрилгидратаза штамма R. ruber gtl проявляет наибольшую активность при 55°С. Таким образом, нитрилгидратаза штамма R. ruber gtl сопоставима по термостабильности с ферментом/?, rhodochrous J1 [129].

Профиль зависимости активности большинства известных по литературе нитрилгидратаз от рН среды достаточно сходен. Оптимум рН для них находится в пределах 6,0-8,0 [49]. Нитрилгидратазная активность исследованных ферментов проявляется различным образом в зависимости от рН реакционной среды. Нитрилгидратаза штамма R. erythropolis 84 имеет выраженный максимум при рН 7,0, в то же время фермент R. ruber gtl проявляет высокую активность в широком интервале рН, от 5,0 до 9,5. Таким образом, нитрилгидратаза штамма R. ruber gtl высокоактивна как в слабокислой, так и в слабощелочной среде.

Так как нитрилгидратазы изученных штаммов родококков в значительной степени различаются по своим свойствам, можно было ожидать заметных различий и в их субстратной специфичности. Показано, что нитрилгидратаза штамма R. erythropolis 84 с низкой скоростью гидратирует бензонитрил и 3-цианопиридин, тогда как фермент R. ruber gtl обладает широкой субстратной специфичностью, в том числе к ароматическим нитрилам. Долгое время считалось, что нитрилгидратазы участвуют только в гидролизе алифатических нитрилов, а ароматические соединения конвертируются с участием фермента нитрилазы [49]. Полученные нами результаты соотносятся с данными литературы о способности кобальтзависимых нитрилгидратаз гидратировать ароматические нитрилы наряду с алифатическими [129].

Наилучшими субстратами для нитрилгидратаз обоих штаммов являются ацетонитрил и акрилонитрил. Относительная активность нитрилгидратазы R. ruber gtl по отношению к акрил амиду (62 %) сопоставима с активностью ферментов штаммов R. rhodochrous J1 (78,67 %) и R. rhodochrous М8 (68 %), используемых в промышленном синтезе акриламида [8, 128,129].

Анализ влияния ингибиторов на активность ферментов показал, что карбонильные реагенты - гидроксиламин и фенилгидразин снижают каталитическую активность нитрилгидратазы у обоих штаммов. Фермент R. erythropolis 84 сильно ингибируется перекисью водорода, 2-меркаптоэтанолом и FeCb в концентрации 1 мМ. Добавление хлорида железа (III) до 1 мМ снижает на 63 % активность нитрилгидратазы R. ruber gtl. Нитрат серебра (1 мМ), связывающий тиоловые группы, полностью подавляет активность нитрилгидратазы штамма R. ruber gtl.

Подобное действие соли серебра продемонстрировано на штаммах R. rhodochrous Jl, P. chlororaphis В23, ' С. nitrilophilus АТСС21419, В. smithii SC-J05-1 [24, 126, 129, 154]. Вероятно, это связано с присутствием тиоловых групп в составе каталитического центра нитрилгидратаз [41]. Добавление в реакционную среду ЭДТА незначительно снижало активность нитрилгидратазы R. erythropolis 84 и не влияло на работу фермента R. ruber gtl. Это соответствует данным литературы об устойчивости нитрилгидратаз к действию этого комплексона [129].

В реакции трансформации акрилонитрила с использованием биомассы штамма R. erythropolis 84 нами получены растворы акриламида с концентрацией выше 14 %. В экспериментах с использованием клеток R. ruber gtl синтезированы более концентрированные (48-52 %) растворы акриламида, по сравнению с получаемыми промышленным биокаталитическим способом (30-45 %) [3]. Показано, что акрилонитрил, 3-цианопиридин и бензонитрил количественно конвертируются клетками R. ruber gtl до соответствующих амидов при отсутствии побочных продуктов реакции. Биомасса штамма R. ruber gtl сохраняет высокую активность в течение длительного времени при температуре 5-8°С без добавления стабилизаторов - бутирата или валерата, которые используются для поддержания активности нитрилгидратазы P. chlororaphis В23 [124] и R. rhodochrous Jl [128].

Таким образом, по каталитическим свойствам штаммы R. erythropolis 84 и R. ruber gtl соответствуют зарубежным и отечественным аналогам, используемым в качестве биокатализаторов, и могут быть рекомендованы к применению в биотехнологических процессах синтеза акриламида, никотинамида и других амидов карбоновых кислот. Оптимальными для культивирования бактерий являются следующие условия: минеральная солевая основа N, глюкоза в концентрации 0,1 %, 10 мМ ацетамид, 10 мМ аммоний, pH 7,0-7,5,128-3 0°С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кузнецова, Марина Валентиновна, Пермь

1. Акриламид. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. -Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1989. Вып. 49.- 109 с.

2. Акрилонитрил. Гигиенические критерии состояния окружающей среды. -Женева: Всемирная организация здравоохранения, 1987. -Вып. 28. 114 с.

3. АликинВ.Н. Конверсия специальной технической химии/ В.Н. Аликин, Т.Э. Кузьмицкий, Л.В. Забелин и др. М., 1999. - 176 с.

4. Астаурова О.Б. Ассимиляция аммония у продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 / О.Б. Астаурова, Г.А. Ларикова, И.Н. Полякова, A.C. Яненко // Микробиология. 1993. - № 11-12.- С. 6-8.

5. Астаурова О.Б. Адаптация продуцента акриламида Rhodococcus rhodochrous М8 к изменению концентрации аммония в среде / О.Б. Астаурова, Т.Е. Леонова, И.Н. Полякова и др. // Прикл. биохим. микробиол. 2000. - Т. 36, № 1. - С. 21-25.

6. Астаурова О.Б. Регуляция биосинтеза ферментов биодеградации нитрилов у Rhodococcus rhodochrous МО / О.Б. Астаурова, Т.Е. Погорелова, O.P. Фомина и др. // Биотехнология. 1991. - № 5. -1991.-С. 10-14.

7. Безбородое А.М. Биотехнология продуктов микробного синтеза.- М.: Агромиздат, 1991. С. 1391-1399.

8. Вейко В.П. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности гена Rhodococcus rhodochrous М8 / В.П. Вейко, A.C. Яненко, М.Г. Алексеева и др. // Биотехнология. 1995. - № 5-6. -С. 3-5.

9. Досон Р. Константы устойчивости комплексов металлов / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс // Справочник биохимика. М.: Мир, 1991.-С. 334-340.

10. Забазная Е.Б. Отбор штаммов, трансформирующих акрилонитрил и акриламид в акриловую кислоту / Е.Б. Забазная, C.B. Козулин, С.П.Воронин // Прикл. биохим. микробиол. 1998. - Т. 34, №4.- С. 377-384.

11. Ившина И.Б. Пропанокисляющие родококки / И.Б. Ившина, P.A. Пшеничнов, A.A. Оборин. Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987.- 126 с.

12. Клонирование ДНК. Методы / Пер. с англ.; под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988.-538 с.

13. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. Пер. с англ.- М.: Мир, 1984.- 480с.

14. Методы общей бактериологии / Пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. -М.: Мир, 1983.-Том 1,2,3.

15. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. ДГ. Звягинцева М.: МГУ, 1991. - 304 с.

16. Моисеева Т.Н. Скрининг штаммов-деструкторов акриловой кислоты и ее производных / Т.Н. Моисеева, C.B. Козулин, JI.K. Куликова, С.П. Воронин // Биотехнология. 1991. - № 6. - С. 79-83.

17. Нестеренко O.A., Нокардиоподобные нокардиоформные бактерии / O.A. Нестеренко, Е.И. Красников, Т.М. Ногина. Киев: Наукова думка, 1985.-С. 336.

18. Определитель бактерий Берджи / Пер. с англ.; под ред. Дж. Хоулта и др.-М.: Мир, 1997.-Т. 1,2.

19. Ремезовская Н.Б. Микрометод определения бактериостатического действия антибиотиков // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии» Томск, 1991. - 4.1. - С. 46.

20. Рогачева С.М. Респираторная активность микробных клеток Rhodococcus rhodochrous М8, продуцирующего акрилонитрилгидролизующие ферменты / С.М. Рогачева, О.В. Игнатов // Прикл. биохим. микробиол. 2001. - Т. 37, № 3. - С. 326-331.

21. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии. СПб: ГТУ. - 2002.- 522 с.

22. Халгаш Я. Биокатализаторы в органическом синтезе. М.: Мир, 1991.- 204 с.

23. Ahmed А.Е. Aliphatic nitriles; metabolism and toxicity / A.E. Ahmed, N.M. Trieff// In: Progress in Drug Metabolism. 1983. - V. 7. - P. 230-294.

24. Amarant T. Substrates and inhibitors of the nitrile hydratase and amidase of Corynebacterium nitrilophilus / T. Amarant, Y. Vered, Z. Bohak // J. Biotechnol. Appl. Biochem. 1989. - V. 11. - P. 49-59.

25. Artaud I. Nitrile hydratase and related non-heme iron sulfur complexes / I. Artaud, S. Chatel, A.S. Chauvin et al. // Coordination Chemistry Reviews.- 1999. V. 190.-P. 577-586.

26. Asano Y. Overview of screening for new microbial catalysts and their uses in organic synthesis selection and optimization of biocatalysts// J. Biotechnol. - 2002. - V. 94. - P. 65-72.

27. Asano Y. Aliphatic nitrile hydratase from Arthrobacter sp. J-l. Purification and characterization / Y. Asano, K. Fujishiro, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. 1982. - V. 46. - P. 1165-1181.

28. Asano Y. Z-Phenylacetaldoxime degradation by a novel aldoxime degradatase from Bacillus sp. OxB-1 / Y. Asano, Y. Kato // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 158. - P. 185-190.

29. Asano Y. Purification and characterization of amidase which participates in nitrile hydradation / Y. Asano, M. Tachibana, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. 1982. - V. 46. - P. 1175-1181.

30. Asano Y. A new enzyme "nitrile hydratase" which degrades acetonitrile in combination with amidase / Y. Asano, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. 1980. - V. 44, N. 9. - P. 2251-2252.

31. Asano Y. A new enzymatic method of acrylomide production / Y. Asano, T. Yasuda, Y. Tani, H. Yamada // Agric. Biol. Chem. 1982. - V. 46. -P. 1183-1189.

32. Bandyopadhyay A.K. Purification and characterization of benzonitrilases from Arthrobacter sp. J-l / A.K. Bandyopadhyay, T. Nagasawa, Y. Asano et al. //Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 51. - P. 302-306.

33. Banerjee A. The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects / A. Banerjee, R. Sharma, U.C. Banerjee // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60. - P. 33-44.

34. Bauer R. Enantioselective hydration of 2-arylpropionitriles by a nitrile hydratase from Agrobacterium tumefaciens strain d3 / R. Bauer, H.-J. Knackmuss, A. Stolz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. - V. 49. -P. 89-95.

35. Beard T.M. Enantioselective biotransformations using rhodococci / T.M. Beard, M.I. Page // Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74, N. 1-3. -P. 99-106.

36. Bestwick L.A. Purification and characterization of nitrilase from Brassica nupus / L.A. Bestwick, L.M. Gronning, D.C. James et al. // Phisiol. Plant. 1993. - V. 89.-P. 611-816.

37. Blakey AJ. Regio- and stereo-spesific nitrile hydrolysis by the hydratase from Rhodococcus sp. AJ270 / A.J. Blakey, J. Colby, E. Williams, C. O'Reilly//FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 129.-P. 57-62.

38. Brandao P.F.B. Diversity of nitrile hydratase and amidase enzyme genes in Rhodococcus erythropolis recovered from geographically distinct habitats / P.F.B. Brandao, J.P. Clapp, A.T. Bull II Appl. Environ. Microbiol. 2003. -V. 69,N. 10.-P. 5754-5766.

39. Brennan B.A. Nitrile hydratase from Rhodococcus rhodochrous J1 contains a non-corrinoid cobalt with two sulphur ligands / B.A. Brennan, G. Alms, M. J. Nelson et al. // J. Am. Chem. Soc. 1996. - V. 118. - P. 9194-9195.

40. Bunch A.W. Biotransformation of nitriles by rhodococci II Antonie van Leeuwenhoek. 1998. - V. 74, N. 1-3. - P. 89-97.

41. Caldwell J. The metabolic chiral inversion and dispositional enantioselectivity of the 2-arilpropionic acid and thear biological consequences / J. Caldwell, A.J. Hutt, S. Fournel-Gigleux // Biochem. Pharmacol. 1988. -V. 37. - P. 105-114.

42. Cantarella M. Opertional stability of Brevibacterium imperialis CBS 498-74 nitrile hydratase / M. Cantarella, A. Spera, F. Alfani, P. Viparelli // J. Mol. Catalysis. 2001. - V. 11. - P. 687-697.

43. Cantarella M. Influence of initial glucose concentration on nitrile hydratase production in Brevibacterium imperialis CBS 498-74 / M. Cantarella, A. Spera, P. Leonetti, F. Alfani // J. Mol. Catalysis. 2002. - V. 19-20. - P. 405-414.

44. Clarke P. Isolation of amidase-negative mutants of Pseudomonas aeruginosa by a positive selection method using an acetamide analogue / P. Clarke, R. Tata // J. Gen. Microbiol. 1973. - V. 73. - P.231-234.

45. Collins P.A. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochorus / P.A. Collins, C.J. Knowles // J. Gen. Microbiol. 1983. - V. 129. - P. 711718.

46. Cowan D. Biochemistry and biotechnology of mesophilic and thermophilic nitrile metabolizing enzymes / D.Cowan, R. Cramp, R. Pereira et al. // Extremophiles. 1998. - V. 2, N. 3. - P. 207-216.

47. Cramp R.A. Molecular characterization of a novel thermophilic nitrile hydratase / R.A. Cramp, D.A. Cowan // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1431.-P. 249-260.

48. Cramp R.A. Novel thermophilic bacteria producing nitrile-degrading enzymes / RA. Cramp, M. Gilmour, D.A. Cowan // Microbiology. 1997. -V. 143.-P. 2313-2320.

49. Croll B.T. Residues of acrylamide in water / B.T. Croll, G.M. Arkell, R.P.J. Hodge // Water. Res. 1974. - V. 8. - P. 989-993.

50. Crosby J. Regioselective hydrolysis of aromatic dinitriles using a whole cell catalyst / J. Crosby, J. Moilliet, J.S. Parratt, N.J. Turner // J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1994. - V. 1. - P. 1679-1687.

51. DiGeronimo M.J. Metabolism of acetonitrile and propionitrile by Nocardia rhodochrous LL100-21 / M.J. DiGeronimo, A.D. Antoine // Appl. Environ. Microbiol. 1976. - V. 31. - P. 900-906.

52. DuranR. New shuttle vectors for Rhodococcus sp. R312 (formerly Brevibacterium sp. R312), a nitrile hydratase producing strain // J. Basic Microbiol. 1998. - V. 38. - P. 101-106.

53. DuranR. Characterisation of nitrile hydratase genes cloned by DNA screening from Rhodococcus erythropolis / R. Duran, M. Nishiyama, S. Horinouchi, T. Beppu // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1993. - V. 57. -P. 1323-1328.

54. Effenberger F. Enzyme-catalysed enantioselective hydrolysis of racemic naproxen nitrile / F. Effenberger, J. Bohme // Bioorg. Med. Chem. 1994. -V. 2,N. 7.-P. 715-721.

55. Endo I. An enzyme controlled by light: the molecular mechanism of photoreactivity in nitrile hydratase /1. Endo, M. Odaka, M. Yohda // Trends Biotechnol. 1999. - V. 17, N. 6. - P. 244-248.

56. Endo I. Nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-774- purification and amino acid sequences / I. Endo, I. Watanabe // FEBS Lett. 1989. - V. 243. -P. 6461-6497.

57. Fager S.K. 5-Cyanovaleramide production using immobilized Pseudomonas chlororaphis B23 / S.K. Fager, A. Eisenberg, S.M. Cooper et al. // Bioorgan. Med. Chem. -1999. V. 7, N. 10. - P. 2239-2245.

58. Fallon R.D. A Pseudomonas putida capable of stereoselective hydrolysis of nitriles / R.D. Fallon, B. Stieglitz, I.J. Turner // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1997.-V. 47,N. 2.-P. 156-161.

59. Firmin J.L. The biochemical pathway for breakdown of methyl cyanide (acetonitrile) in bacteria / J.L. Firmin, D.O. Gray // J. Biochem. 1976. -V. 158.-P.223-229.

60. Gabriel J. High-perfomance liquid chromatographic study of the aromatic nitril metabolism in soil bacteria / J. Gabriel, J. Vekova, J. Vosahlo // J. Chromatography. 1996. - V. 681. - P. 191-195.

61. Graham D. Nitrile biotransformations using free and immobilized cells of a thermophilic Bacillus sp. / D. Graham, R. Pereira, D. Barfield, D. Cowan // Enzyme Microbiol Technol. 2000. - V. 26, N. 5-6. - P. 368-373.

62. Harper D.B. Characterisation of a nitrilase from Nocardia sp. (rhodochrous group) NCIB 11215, using p-hydroxybenzonitrile as sole carbon source / D.B. Harper // Int. J. Biochem. 1985. - V. 17. - P. 677-683.

63. Harper D.B. Microbial metabolism of aromatic nitriles: enzymology of C-N cleavage by Nocardia sp. NCIB 11216/ D.B. Harper // J. Biochem. 1977. -V. 165.-P. 309-319.

64. Hashimoto Y. Development of a host-vector system in a Rhodococcus strain and its use for expression of the cloned nitrile hydratase gene cluster / Y. Hashimoto, M. Nishiyama, F. Yu et al. // J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-P. 1003-1010.

65. Huang W. Crystal structure of nitrile hydratase reveals a novel iron centre in a novel fold / W. Huang, J. Jia, J. Cummings et al. // Structure. 1997. - V 5. -P. 691-699.

66. Hughes J. Application of whole cell rhodococcal biocatalysts in acrylic polymer manufacture / J. Hughes, Y.C. Armitage, K.C. Symes // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. -V. 74, N. 1-3. - P. 107-18.

67. Hwang J.S. Biotransformations of acrylonitrile to acrylamide using immobilisized whole cells of Brevibacterium CHI in recycle fed-batch reactor / J.S. Hwang, H.N. Chang // Biotechnol. Bioeng. 1989. - V. 34. - P. 380-386.

68. Ikehata O. Primary structure of nitrile hydratase deduced from the nucleotide sequence Rhodococcus species and its expression in Esherichia coli / O. Ikehata, M. Nishiyama, S. Horinouchi, T. Berru // Biochem. 1989. -V. 181.-P. 563-570.

69. Ingvorsen K. Microbial hydrolysis of organic nitriles and amides / K. Ingvorsen, B. Yde, S.B. Godtfredsen, R.T. Tsuchiya // CIBA Found. Symp. 1988.-V. 140.-P. 16-31.

70. Kato Y. Distribution of aldoxime degradatase in microorganisms / Y. Kato, R. Ooi, Y. Asano // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - P. 22902296.

71. Kato Y. Nitrile hydratase involved in aldoxime metabolism from Rhodococcus sp. strain YH3-3 / Y. Kato, T. Tsuda, Y. Asano // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 263. - P. 662-670.

72. Kim S. Cloning and expression of the nitrile hydratase and amidase genes from Bacillus sp. BR449 into Escherichia coli / S. Kim, P. Oriel // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 27, N. 7. - P. 492-501.

73. Knowles C.J. The utilisation nitriles and amides by Nocardia rhodochrous LL 100-121/C.J. Knowles, E.A. Linton // J. Gen. Microbil. 1983. -V. 129.-P. 711-718.

74. Knowles C.J. Utilisation of aliphatic amides and nitriles by Nocardia rhodochrous LL 100-21 / C.J. Knowles, E.A. Linton // J. Gen. Microbil.- 1986.-V. 132.-P. 1493-1501.

75. Kobayashi M. Hyperinduction of nitrile hydratase acting on indol-3-acetonitrile in Agrobacterium tumefaciens / M. Kobayashi, T. Fujita, S. Shimizu // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 45. - P. 176-181.

76. Kobayashi M. The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis / M. Kobayashi, M. Goda, S. Shimizu // FEBS Lett. 1998.- V 439, N.3.-P. 325-328.

77. Kobayashi M. Biochemical and genetic analysis of nitrile metabolism in Rhodococcus strains / M. Kobayashi, S. Horinouchi, T. Beppu, S. Shimizu // Biotechnology. 1995. - V. 7-8. - P. 136-138.

78. Kobayashi M. Nitrilase from Rhodococcus rhodochrous Jl. Sequencing and overexpression of the gene and identification of an essential cysteine residue / M. Kobayashi, H. Komeda, N. Yanaka et al. // J. Biol. Chem. 1992.- V. 267, N. 29. P. 20746-20751.

79. Kobayashi M. Enzymatic synthesis of acrylamide: a success story not yet over. / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Trends Bioechnol.- 1992. V. 10. - P. 402-408.

80. Kobayashi M. Nitrilase of Rhodococcus rhodochrous Jl. Purification and characterization / M. Kobayashi, T. Nagasawa, H. Yamada // Eur. J. Biochem. 1989. - V. 182, N. 2. - P. 349-356.

81. Kobayashi M. Nitrile hydralases / M. Kobayashi, S. Shimizu // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - V. 4. - P. 95-102.

82. Kobayashi M. Versatile nitrilase: nitrile-hydrolyzing enzymes / M. Kobayashi, S. Shimizu // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - 120. - P. 217224.

83. Kobayashi M. Cobalt proteins / M. Kobayashi, S. Shimizu // Eur. J. Biochem. 1999. - V. 261. - P. 1-9.

84. Kobayashi M. Metalloenzyme nitrile hydratase: structure, regulation, and application to biotechnology / M. Kobayashi, S. Shimizu // Nat. Biotechnol.- 1998.-V. 16.-P. 733-736.

85. Kobayashi M. Purification and characterization of a novel nitrilase of Rhodococcus rhodochrous K22 that acts on aliphatic nitriles / M. Kobayashi,

86. N. Yanaka, T. Nagasawa, H. Yamada // J. Bacterid. 1990. - V. 172, N. 9. -P. 4807-4815.

87. Kobayashi M. Monohydrolysis of an aliphatic dinitrile compound by nitrilase from Rhodococcus rhodochrous K22 / M. Kobayashi, N. Yanaka, T. Nagasawa, H. Yamada // Tetrahedron. 1990. - V. 46. - P. 5587-5590.

88. KomedaH. Transcriptional regulation of the Rhodococcus rhodochrous J1 nitA gene encoding a nitrilase / H. Komeda, Y. Hori, M. Kobayashi, S. Shimizu // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93, N. 20. - P. 1057210577.

89. Komeda H. A novel transporter involved in cobalt uptake / H. Komeda, Kobayashi M., Shimizu S. // Appl. Biol. Sci. 1997. - V. 94. - P. 36-41.

90. Komeda H. Characterisation of the gene cluster of high-molecular-masse nitrile hydratase induced by its reaction product in Rhodococcus rhodochrous J1 / H. Komeda, M. Kobayashi, S. Shimizu // Appl. Biol. Sci. 1996. - V. 93. - P. 4267-4272.

91. Langdahl B.R. Nitrile hydrolysis by Rhodococcus erythropolis BL1, an acetonitrile-tolerant strain isolated from a marine sediment / B.R. Langdahl, P. Bisp, K. Ingvorsen // Microbiology. 1996. - V. 142. - P. 145-154.

92. LayhN. Enantioselective nitrile hydratases and amidases from different bacterial isolates / N. Layh, R. Bauer, S. Trott et al. // J. Mol. Catal. Enzymat. 1998. - V. B5. - P. 137-141.

93. LayhN. Enrichment strategies for nitrile-hydrolysing bacteria / N. Layh, B. Hirringer, A. Stolz, H.-J. Knackmuss II Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1997. V. 47.-P. 668-674.

94. LayhN. Enzymatic nitrile hydrolysis in low water systems / N. Layh, A. Willetts // Biotechnol. Lett. 1998. - V. 20, N. 4. - P. 329-331.

95. LiW.Z. Formation and purification of nitrile hydratase from Corynebacterium nitrilophilus ZBB-41 / W.Z. Li, Y.Q. Zhang, H.F. Yang // Appl. Biochem. Biotechnol. 1992. - V. 36. - P. 171-181.

96. Liu J. The role of nitrogenase in a cyanide degrading Klebsiella oxytoca strain / J. Liu, C. Liu, C. Lin // Proc. Natl. Sci. Count. Repub. China. 1997. -V.21.-P. 37-42.

97. Liu T.Z. Determination of aromatic nitriles using enzyme-based selectivity mechanisms: 1 an ammonia GSE based sensor for benzonitrile / T.Z. Liu, Y. Wang, S.P. Kounaves, E.J. Brush 11 Anal.Chem. - 1993. - V.65. - P. 31343136.

98. Magasanik B. Esherichia coli and Salmonella cellular and molecular biology // Eds Neidhardt F.C., Curtiss III R., Inghman J.L., Lin E.C. Washington: Amer. Soc. Microbiol. 1996. - V. 1. - P. 1344-1356.

99. Magasanik B. Glucose effects: inducer exclusion and repression / In J.R.Beekwth, D.Zipser, The Lactose Operon. N.Y. Spring Harbor, 1970. -P. 189-219.

100. Mascharak P.K. Structural and functional models of nitrile hydratases // Coordination Chemistry Reviews. 2002. - V. 225. - P. 201-214.

101. MathewC.D. Nitrilase-catalysed production of nicotinic acid from 3-cyanopyridine in Rhodococcus rhodochrous J1 / C.D. Mathew,

102. T. Nagasawa, M. Kobayashi, H. Yamada // Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V. 54.-P. 1030-1032.

103. McBride K.E. Metabolism of the herbicide bromoxynil by Klebsiella pneumoniae subsp. Ozaenae / K.E. McBride, J.W. Kenny, D.M. Stalker // Appl. Environ. Microbiol. 1986. - V. 56. - P. 325-330.

104. Meth-Cohn O. An in-depth study of the biotransformation of nitriles into amides and/or acids using Rhodococcus rhodochorus AJ270 / O. Meth-Cohn, W. Mei-Xiang // Chem. Soc. Perkin Trans. 1997. - V. 1. -P. 1099-1104.

105. MillaisA.J. The biotransformation of f-butylacetonitrile and its boron-containing analogue trimethylamine cyanoborane by Brevibacterium R312 / A.J. Millais, D. Casson, C.J. Knowles // Arch. Microbil. 1997. - V. 168. -P. 164-168.

106. Miller J. A. The impact of biotechnology on the chemical industry in the 21st century / J.A. Miller, V. Nagarajan // Trends in Biotechnology. 2000. -V. 18,N5.-P. 190-191.

107. Miller J.M. The utilization of nitriles and amides by Rhodococcus species / J.M. Miller, D.O. Gray // J. Gen. Microbiol. 1982. - V. 128. - P. 18031809.

108. MimuraA. Application of microorganisms to petrochemical industry / A. Mimura, T. Kawano, K. Yamaga // J. Ferment. Technol. 1969. - V. 47. -P. 631-638.

109. MiyanagaA. Crystal structure of cobalt containing nitrile hydratase / A. Miyanaga, S. Fushinobu, K. Ito, T. Wakagi // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 288. - P. 1169-1174.

110. MylerovaV. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes/ V. Mylerova, L. Martinkova // Curr. Organic Chem. 2003. - V. 7. - P. 1-17.

111. Nagamune T. Photosensitive phenomena of nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-771 / T. Nagamune, H. Kurata, M. Hirata, I. Endo // Photochem. Photobiol. 1990 - V. 51. - P. 87-90.

112. Nagasawa T. Caprolactam, a new powerful inducer for the formation of Rhodococcus rhodochrous J1 nitrilase / T. Nagasawa, T. Nakamura, H. Yamada//Arch. Microbiol. 1990. - V. 155. - P. 13-17.

113. Nagasawa T. Nitrile hydratase of Pseudomonas chlororaphis B23 / T. Nagasawa, H. Nanba, K. Ryuno et al. // Eur. J. Biochem. 1987. - V. 162. -P. 691-698.

114. Nagasawa T. Nitrile hydratase of Brevibacterium R312 purification and characterization / T. Nagasawa, K. Ryuno, H. Yamada // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1986. - V. 139. - P. 1305-1312.

115. Nagasawa T. The superiority of the 3rd generation catalyst, Rhodococcus rhodochrous J1 nitrile hydratase, for industrial production of acrylamide / T. Nagasawa, T.S. Shimizu, S.H. Yamada // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1993. V. 40.-P. 189-195.

116. Nagasawa T. Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, K. Takeuchi, V. Nardi-Dei et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991.- V. 34. P. 783-788.

117. Nagasawa T. Characterisation of a new cobalt-containing nitrile hydratase purified from urea-induced cells of Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, K. Takeuchi, H. Yamada // Eur. J. Biochem. 1991. - V. 196. -P. 581-589.

118. NagasawaT. Occurrence of a cobalt-induced and cobalt containing nitrile hydratase in Rhodococcus rhodochrous J1 / T. Nagasawa, K. Takeuchi, H. Yamada//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. -V. 155. - P. 10081016.

119. NagashimaS. X-ray crystallographic analysis of photoreactive nitrile hydratase / S. Nagashima, M. Nakasako, N. Kamiya, et al. // J. Inorgan. Biochem. 1997. - V. 67, N. 1-4. - P. 334.

120. NakajimaY. A photoresponsive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771 / Y. Nakajima, T. Doi, Y. Satoh, I. Watanabe // Chem. Letters. 1987 -V. 9.-P. 1767-1779.

121. Narayanasamy K. Utilization of acrylonitrile by bacteria isolated from petrochemical wastewaters / K. Narayanasamy, S. Shukla, L.J. Parekh // Indian J. Exp. Biol. 2000. - V. 28. - P. 968-971.

122. Nawas M.S. Metabolism of acrylonitrile by Klebsiella pneumoniae / M.S. Nawas, W. Franklin, W.L. Campbell et al. // Arch. Microbiol. 1991. -V. 156.-P. 231-238.

123. Nishiyama T. Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomonas chlororaphis B23 / T. Nishiyama, S. Horinouchi, M. Kobayashi // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. -P. 2465-2472.

124. Nojiri M. Cobalt-substituted Fe-type nitrile hydratase of Rhodococcus sp. N-771 / M. Nojiri, H. Nakayama, M. Odaka et al. // FEBS Letters. 2000. - N. 465, N. 2-3.-P. 173-177.

125. Odaka M. Activity regulation of photoreactive nitrile hydratase from Rhodococcus sp. N-771 by nitric oxide / M. Odaka, K. Fujii, M. Hoshino et al. // J. Inorgan. Biochem. 1997. - V. 67, N. 1-4. - P. 333.

126. Odaka M. An enzyme controlled by light: the molecular mechanism of photoreactivity in nitrile hydratase / M. Odaka, M. Yohda, I. Endo // Trends Biotechnol. 1999. - V. 17, N. 6. - P. 244-248.

127. Ogawa J. Microbial enzymes: new industrial applications from traditional screening methods / J. Ogawa, S. Shimizu // Trends Biotechnol. 1999. -V. 171. - P.13-20.

128. O'Halloran T.V. Transition metals in control of gene expression // Science. -V. 261.-P. 715-725.

129. Osprianl. Large-scale preparation of a nitrile-hydrolysing biocatalyst: Rhodococcus R312 (CBS 717.73) /1. Osprian, C. Jarret, U. Strauss // J. Mol. Catalysis B: Enzymatic. 1999. - V. 6, N. 6. - P. 555-560.

130. Padmakumar R. Bioconversion of acrylonitrile to acrylamide using a thermostable nitrile hydratase / R. Padmakumar, P. Oriel // Appl. Biochem. Biotechnol. 1999. - V. 77. - P. 671-679.

131. Payne M.S. A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase/ M.S. Payne, S.J. Wu, R.D. Fallon et al. // Biochemistry. 1997. - V. 36.- P. 5447-5454.

132. Pereira R.A. A novel thermostable nitrile hydratase / R.A. Pereira, D. Graham, F.A. Rainey, D.A. Cowan // Extremophiles. 1998. - V. 2, N. 3.- P. 347-357.

133. Pogorelova T.E., Ryabchenko L.E., Sunzov N.I., Yanenko A.S. Cobalt-dependent transcription of the nitrile hydratase gene in Rhodococcus rhodochrous M8 // FEMS Microbiol. Lett. 1996. - V. 144. - P. 191-195.

134. Pollmann S. Occurrence and formation of indole-3-acetamide in Arabidopsis thaliana / S. Pollmann, A. Muller, M. Piotrowski et al. // Planta. 2002. -V.216.-P. 155-161.

135. RimmingtonA. Russian biotechnologists target chemical industry // Microbiol. Europe. 1994. - V. 2. - P. 18.

136. Robinson W.G. Ricine nitrilase / W.G. Robinson, R.H. Hook // J. Biol. Chem. 1964. - V. 239. - P. 4257-4267.

137. Sugai T. Biocatalysis in organic synthesis: the use of nitrile- and amide-hydrolyzing optimization of microorganisms / T. Sugai, T. Yamakaki, M. Yokoyama, H. Ohta // Biocsi. Biotechnol. Biochem. 1997. - V. 61. -P. 1419-1427.

138. TakashimaY. Nitrile hydratase from a thermophilic Bacillus smithii / Y. Takashima, Y. Yamaga, S. Mitsuda // J. Industrial Microbiol. Biotechnol.- 1998.-V. 20.-P. 220-226.

139. Tani Y. Characterisation of nitrile hydratase and amidase, which responsible for conversion of dinitriles to mononitriles, from Corinebacterium sp. / Y. Tani, M. Kurihara, H. Nishise // Agric. Biol. Chem. 1989. - V. 53. -P. 3151-3158.

140. Tauber M.M. Nitril hydratase and amidase from Rhodococcus rhodochrous hydrolyse acrylic fibers and granular polyacrylonitriles / M.M. Tauber, A. Cavaco-Paulo, K.-H. Robra, G.M. Gubitz // J. Appl. Environ. Microbiol.- 2000. N. 4.-P. 1634-1638.

141. Thimann K.V. Nitrilase I. Occurrence preparation and general properties of the enzyme / K.V. Thimann, S. Mahadevan // Arch. Biochem. Biophys.- 1964.-V. 105.-P. 133-141.

142. Tsujimura M. Photoreactive nitrile hydratase: posttranslational modification of photoreactive site / M. Tsujimura, N. Dohmae, M. Chijimatsu et al. // J. Inorgan. Biochem. 1997b. - V. 67, N. 1-4. - P. 335.

143. Wang M.-X. Enantioselective biotransformations of racemic a-substituted phenylacetonitriles and phenylacetamides using Rhodococcus sp. AJ270 / M.-X. Wang, G. Lu, G.-J. Ji et al. // Tetrahedron: Asymmetry. 1999. -V. 11,N. 5. - P. 1123-1135.

144. Warhurst A.M. Biotransformations catalysed by the genus Rhodococcus / A.M. Warhurst, C.A. Fewson // Crit. Rev. Biotech. 1994. - V. 14. - P. 2973.

145. Watanabe I. Optimal conditions for cultivation of Rhodococcus sp. N-774 and for conversion of acrylonitrile to acrylamide by resting cells / I. Watanabe, Y. Satoh, K. Enomoto et al. // Agric. Biol.Chem. 1987. -V. 51.-P. 3201-3206.

146. Watanabel. Screening, isolation and taxonomical properties of microorganisms having acrylonitrile-hydrating activity / I. Watanabe, Y. Satoh, K. Enomoto // Agric. Biol. Chem. 1987. - V. 51. - P. 3193-3199.

147. Webster N. A. Comparative characterisation of two Rhodococcus species as potential biocatalysts for ammonium acrylate production / N.A. Webster, D.K. Ramsden, J. Hughes // Biotechnol. Lett. 2001. - V. 23. - P. 95-101.

148. WuS. Over-production of stereoselective nitrile hydratase from Pseudomonas putida 5B in Escherichia coli: activity requires a novel downstream protein / S. Wu, R.D. Fallon, M.S. Payne // J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 48. - P. 704-708.

149. WuZ.-L. Enhancement of enzyme activity and enantioselectivity via cultivation in nitrile metabolism by Rhodococcus sp. CGMCC 0497 / Z.-L. Wu, Z.-Y. Li // Biotechnol. Appl. Biochem. 2002. - V. 35. - P. 6167.

150. Yamada H. Microbial utilization of acrylonitrile / H. Yamada, Y. Asano, T. Hino, Y. Tani // J. Ferment. Technol. 1979. - V. 57. - P. 8-14.

151. Yamada H. Microbial utilisation of glutaronitrile / H. Yamada, Y. Asano, Y. Tani // J. Ferment. Technol. 1980. - V. 58. - P. 495-500.

152. Yamada H. Nitrile hydratase and its application to industrial production of acrylamide / H. Yamada, M. Kobayashi // Biosci. Biotech. Biochem. 1996. -V. 60.-P. 1391-1400.

153. YamakiT. Cloning and sequencing of a nitrile hydratase gene from Pseudonocardia thermophila JCM3095 / T. Yamaki, T. Oikawa, K. Ito, T. Nakamura // J. Ferment Bioeng. 1997. - V. 5. - P. 474-477.

154. YamamotoK. Purification and characterization of nitrilase responsible for the enantioselective hydrolysis from Acinetobacter sp. AK 226 / K. Yamamoto, K. Komatsu // Agric. Biol. Chem. 1991. -V. 55, N. 6. -P. 1459-1466.

155. YamamotoK. Production of S-(+)-ibuprofen from a nitrile compound by Acinetobacter sp. strain AK 226 / K. Yamamoto, Y. Ueno, K. Otsubo // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, N. 10. - P. 3125-3129.

156. YanenkoA.S. Regulation of nitrile utilization in Rhodococcus / A.S. Yanenko, O.B. Astaurova, T.V. Gerasimova et al. // Biotechnologia. 1995.-N. 7-8.-P. 139-144.

Информация о работе

Кузнецова, Марина Валентиновна
кандидата биологических наук
Пермь, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Физиолого-биохимическая характеристика штаммов рода Rhodococcus - продуцентов нитрилгидратазы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы