Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот"

На правах рукописи

005011416

ПАВЛОВА Юлия Андреевна

АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА МЮПОСОССШ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ АМИДЫ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

03.02.03 Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пермь - 2012

005011416

Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Максимов Александр Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Смирнова Галина Васильевна

доктор биологических наук, профессор Карпунина Тамара Исаковна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра, Уфа

Защита состоится "Я'"МДРТ/4 2012 г. в'/^часов на заседании Диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адрес)': 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.

Факс: (342) 280 92 11.

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан " ^"ОреЛМАЛ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Амидазы (КФ 3.5.1.4) — ферменты,

катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Амидазы участвуют в метаболизме азота в клетках и широко распространены в природе, обнаружены у про- и эукариот. У бактерий появление амидазной активности часто связано с метаболизмом нитрилов. Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью. Некоторые из них катализируют гидролиз амидов алифатических кислот, другие расщепляют ароматические амидосоединения, третьи гидролизуют амиды аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью. Однако наличие у бактерий ферментов разных видов и их способность трансформировать различные типы субстратов не являются родо- или видоспецифичными признаками [Перцович и др., 2005].

Актуальность изучения амидаз и их продуцентов обусловлена значительной разнородностью структуры этих ферментов, свойств, генетической организации и регуляции активности, интеграции с другими процессами метаболизма, а также широкой субстратной специфичностью данных ферментов и стереоселективностью некоторых из них [Вейко и др., 1995; Foumand, Arnaud,-2001]. Культуры, активно использующие амиды в качестве ростовых субстратов, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium,

RhoJococcus, Brcvibaclenum, Arthrobacter и др. [Cowan, 1998; Максимов и др., 2007]

К настоящему времени амидазы остаются недостаточно изученными на молекулярном уровне, и их классификация окончательно не сформулирована. В классификации, основанной на субстратной специфичности, объединены ферменты, различающиеся по структурной организации, механизму действия и каталитическим свойствам [Foumand, Arnaud, 2001].

В связи с этим большой интерес представляет поиск продуцентов новых амидаз, различающихся каталитическими свойствами, сравнение генов и аминокислотных последовательностей данных ферментов с целью изучения их разнообразия и распространения определённых структурных типов у различных бактерий, эволюционной изменчивости, последующего определения взаимосвязи структуры и функции, механизмов экспрессии белков, уточнения механизмов их действия, структуры фермента и ее роли в катализе [Kotlova et al., 1999].

В последнее время пристальное внимание уделяется исследованиям в области стереоселективной трансформации субстратов клетками. Стереоселективность позволяет использовать биокатализаторы для эффективного синтеза некоторых чистых энантиомеров, фармакологических препаратов, а также для получения и других продуктов, которые трудно синтезировать традиционными химическими способами. Некоторые амидазы проявляют энантиоселективность по отношению, например, к производным арилпропионовой кислоты. Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, аммонийных солей акриловой и никотиновой кислот, нестероидных противовоспалительных препаратов [Song et al., 2007].

Успешное применение микроорганизмов в биокаталитических технологиях зависит от свойств биокатализаторов: скорости гидролиза субстрата, pH- и температурного оптимумов активности ферментов, субстратной избирательности, оптимального состава рабочей среды. Разные ферменты существенно различаются по этим свойствам, поэтому подобная характеристика фермента помогает оценить перспективы использования продуцентов. В связи с вышеизложенным, селекция и изучение бактерий - активных продуцентов амидаз является актуальным направлением микробиологических исследований [Перцович и др., 2005; Syed et al., 2011].

Цель настоящего исследования - выделение, морфологическая и биохимическая характеристика почвенных бактерий, активно метаболизирующих амиды карбоновых кислот, исследование генов амидаз.

Основные задачи исследования

1. Выделить и идентифицировать микроорганизмы, метаболизирутощие амиды и нитрилы, из различных образцов характерных почв Пермского края. Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно-амидазный).

2. Провести ПЦР-анализ генов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз. Получить ПЦР-фрагменты, соответствующие белок-кодирующим последовательностям генов амидаз.

3. Провести ВЬАЗТ'-анализ и сравнение секвенированных

последовательностей с известными генами амидаз разных типов. Определить аминокислотные последовательности амидаз. Провести сравнение с первичной структурой известных ферментов.

4, Охарактеризовать влияние факторов среды (pH, температуры, ингибиторов) гга активность ферментов амидазы и нитрилгидратазы.

Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой амидазной активностью, которые идентифицированы на основании физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как представители 11ко(1ососси$ егу/кгороН-ч. С помощью праймеров к генам, кодирующим амид- и нигрилгадролизующие ферменты, у изолятов подтверждено наличие генов амидазы и Ре-зависимой нитрилгидратазы. Показано, что амидазы катализируют гидролиз как алифатических, так и ароматических амидов, проявляют активность в широком диапазоне температуры и pH. Для экспрессии этих ферментов не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Селекционированы штаммы II. егу11ггороИ$, характеризующиеся высокой активностью амидазы (до 14 мкмоль/мг/мин при 25°), амидазная активность которых ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.

Впервые проведено сравнение нуклеотидных последовательностей ряда энантиоселективных амидаз из разных штаммов КИос1ососсиз, установлены их отличия от ранее известных гомологов. Секвенированы и депонированы в базу данных ОепВапк новые последовательности генов амидаз.

Теоретическое » практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, метаболизирующих амиды до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих амидазы разных структурных групп. Разработаны протоколы полимеразной цепной реакции, позволяющие дифференцировать наличие амидаз различных структурных групп.

Секвенированы гены амидаз из новых штаммов. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами и филогенетический анализ. Показано, что исследованные амидазы могут быть использованы для биокаталитической трансформации амидов, в т.ч. для энантиоселективного синтеза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выделенные и идентифицированные штаммы бактерий эффективно трансформируют алифатические и ароматические амиды в соответствующие карбоновые кислоты и обладают высокой амидазной активностью.

3. Амидазы исследованных штаммов Шюс1ососси.1 активны в широким диапазоне температур, имеют максимумом активности при pH 7 и стабильны при хранении.

2. Штаммы КИисЬкоссш, обладающие высокой амидазной активностью, имеют гены, гомологичные известным последовательностям, кодирующим амидазы сигнатурного типа.

Апробация работы и публикации.

Всего по теме диссертации опубликовано 15 научных работ: 8 статей, четыре из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ. Материалы диссертации доложены на 4 международных 6 всероссийских и 1 межрегиональных конференциях.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 166 наименований работ, в том числе 16 отечественных и 150 зарубежных авторов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная биология» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2010 гг.)» и гранта поддержки молодых ученых УрО РАН.

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования.

Выделение штаммов-продуцентов амидгндролнзующих ферментов, условия их культивирования.

Материалом для выделения микроорганизмов служили образцы почв естественной среды и речного ила, собранных на территории Пермского края. Штаммы выделяли методами накопительной культуры и прямого высева на минеральную среду N следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1,0; К2НР04ХЗН20 - 1,6; NaCl - 0,5; MgS04x7H20 - 0,5; СаС12 - 0,005; СоС12х6Н20 . 0,01; FeS04*7H20 -

0,005; pH 7,2 ± 0,2) с добавлением ацетонитрила, акрилонитрила или изобутиронитрила в качестве единственных источников углерода и азота. Для получения штаммов с нитрилазной активностью в качестве селективного агента дополнительно применяли хлорацетамид в концентрации 10 мМ. В дальнейшем при выращивании чистых культур в зависимости от целей экспериментов в качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1% или другие углеродсодержащие соединения; а в качестве источника азота - NH4CI в концентрации 10 мМ или другие источники.

Методы таксономического анализа. При идентификации выделенных штаммов использовали Определитель бактерий Берджи (1997), а также диагностические таблицы и ключи, предложенные O.A. Нестеренко и др. (1985) и И.Б. Ившиной и др. (1995). Генетический анализ исследуемых штаммов проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот. Трансформацию нитрилов проводили с использованием биомассы исследуемых штаммов, ультразвуковых гомогенатов и/или бесклеточных препаратов в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7,2 при начальной концентрации нитрила 2%; реакцию останавливали добавлением 5 мкл концентрированной НС1 и центрифугировали 5 мин при 12 000 об./мин. Для количественной оценки субстратов и продуктов метаболизма алифатических нитрилов в супернатанте использовали газовый хроматограф «Chrom 5»; анализ ароматических нитрилов и продуктов их трансформации проводили с помощью жидкостного хроматографа высокого разрешения «Shimadzu-ААбЗОО».

Бесклеточный препарат получали путем обработки клеток бактерий ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-4 (22 кГц, 10 мкА, обязательное охлаждение). Супернатант использовали для оценки субстратной специфичности, влияния температуры, pH реакционной среды и ингибиторов на активность ферментов метаболизма нитрилов. Удельная активность фермента выражалась

числом единиц активности (ЕД), приходящихся на 1 мг сухой массы. За единицу активности фермента (амидазы, нитрилазы, нитрилгидратазы) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль продукта (кислоты или амида) в единицу (1 мин) времени.

Выделение ДНК. Препараты хромосомной ДНК бактерий получали фенольным методом [Гловер и др., 1988]. Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом Бирнбойма и Доли. Для элиминации плазмид бактериальные клетки культивировали в течение 48 ч на среде LB с добавлением митомицина С или бромистого этидия. Анализ ДНК проводили методом электрофореза в горизонтальном агарозном геле [Маниагис и др., 1984].

Полимеразная цепная реакция. Реакционная смесь для амплификации ДНК содержала ПЦР-буфер, смесь дезоксинуклеотидфосфатов в концентрации 200 мкМ, праймеры в концентрации 5 мМ и 2,5 ЕД 7яс/-полимеразы. Праймеры конструировали на основе анализа известных последовательностей генов амидаз, железо- и кобальт-зависимых нитрилгидратаз, приведенных в базе данных GenBank. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1% агарозном геле.

Секвенирование ДНК. Для очистки ПЦР-продукта перед секвенированием использовали смесь ферментов Exonuclease I(Exo I)/Shrimp Alkaline Phosphatase при 37°С в течение 40 минут. Секвенирующую реакцию проводили с использованием набора Big Dye Terminator при следующем температурном режиме: 95°С - 1мин, 95°С - 10 сек, 50°С - 5 сек, 60°С - 4 мин, 25 циклов. Для очистки продуктов секвенирующей реакции использовали Big Dye X Terminator Purification Kit.

После секвенирующей реакции образцы переосаждали этанолом и анализировали нуклеотидную последовательность с помощью системы секвенирования ДНК MegaBACElOOO (APBiotech).

Сравнительный анализ последовательностей ДНК. Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью пакета программ MegaBACElOOO и программы Chromas lite 2.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.

Статистическая обработка. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента. Анализ результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statistica 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и селекция штаммов, метаболизирующих амиды и нитрилы. Изучение аэробной гетеротрофной микрофлоры. Проведен скрининг микрофлоры, способной утилизировать амиды карбоновых кислот, в подзолистых, бурых и аллювиальных почвах на суглинистой основе, широко распространенных в Пермском крае (рис. 1).

Рис. 1. Содержание гетеротрофных (а) и нитрилутилизирующих (б) и амидутилизирующих (в) бактерий в образцах почв. Аллювиальная луговая кислая почва: 4 - дернина, 5 — гумусовый горизонт; 6 — поверхностно-подзолистая супесчаная почва, гумусово-элювиальный горизонт; аллювиальная болотная иловато-перегнойно-глеевая почва: 9 - гумусовый горизонт, 10 - переходный горизонт; 11 - иловые речные отложения; бурая лесная кислая тежелосуглинистая почва: 12 - алфегумусовый горизонт, 13 - иллювиальный горизонт; подзолистая лесная почва: 14 - элювиальный горизонт, 15 - иллювиальный горизонт; дерновокарбонатная почва: 16 - элювиальный горизонт, 17 — иллювиальный горизонт; дерново-луговая глеевая почва: 18 - гумусовый горизонт, 19 - переходный горизонт

Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах подзолистой лесной почвы, собранных на территории Пермского края. Показано, что исследуемые почвы содержат значительное количество бактерий, трансформирующих производные карбоновых кислот. Наибольшее их содержание отмечено в верхних горизонтах почв и в ризосферной зоне растений. Аналогичные данные получены при анализе других типов почв. Наибольшее количество активных изолятов было выделено из образцов дерново-луговой почвы.

Наибольшее таксономическое разнообразие отмечено в образцах верхнего слоя гумусового горизонта. Вероятно, это связано с метаболической активностью растений, в экссудате корней которых содержатся амидные и нитрильные соединения. Меньшая численность деструкторов наблюдалась в нижележащих слоях. Бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных почвах в количестве 105-108 КОЕ/г сухой почвы.

Установлено, что изолированные культуры образуют симбиотические сообщества, трудно разделяемые на селективной среде, способные активно метаболизировать нитрилы в качестве основных источников углерода и азота. При прямом высеве на селективную среду из почвенного экстракта такие сообщества, состоящие из 2-5 культур бактерий разных видов, росли совместно в виде гомогенных, либо различающихся в периферической части колоний. Такие ассоциации, составлявшие до 9% колоний, как правило, сохранялись при пересеве на минимальную среду, но легко разделялись на среде LB.

Проведена идентификация бактерий по совокупности культуральноморфологических, биохимических и хемотаксономических свойств. По данным окрашивания по Граму и КОН-теста установлено, что большая часть высеваемых микроорганизмов относится к грамотрицательным бактериям. Идентифицированы представители родов Arthrobacler, Acidovorax, Azomonas, Bacillus, Rhodococcus, Pseudomonas и др. Наибольшее количество изолятов, способных к росту на селективных средах принадлежит к родам Pseudomonas и Rhodococcus.

Таблица 1

Процентное соотношение почвенных бактерий, обладающих системой

метаболизма нитрилов и амидов

Вид, род % Вид, род %

R. erythropolis 15 Agrobacterium sp. 9

R. rhodochrous 5 Alcaligenes sp. 1

R. ruber 7 Acidovorax sp. 6

RAuteus 2 Azomonas sp. 1

Nocardia sp. 3 Azotobacier sp. 1

Arthrobacler sp. 2 P. putida 6

B. subtilis 2 P. fluorescens 9

B. mycoides 2 Pseudomonas sp. 20

Другие грам + 7 Другие грам - 2

Удельная активность грамотрицательных изолятов уступала активности грамположительных культур. В ходе селекционного процесса при постепенном повышении концентрации субстрата (амида) получены культуры 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2, 11-1-3, П-11-8, проявляющие амидазную активность более 10 Ед. Культуры отнесены к роду Rhodococcus на основании следующих признаков: грамположительные клетки с выраженным клеточным циклом, формируют на плотных средах круглые, гладкие или шероховатые, кремовые (11-1-3), молочнобелые (4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2) или желто-оранжевые (11-8, 11-8-5) колонии, в гидролизатах клеток исследуемых штаммов были обнаружены мезо-ДАПК, арабиноза, галактоза, миколовые кислоты, идентичные таковым для представителей рода Rhodococcus.

В разные стадии жизненного цикла клетки выделенных штаммов отличались по морфологии. Клетки 12-часовых культур представляли собой нити, в результате фрагментации распадающиеся на палочковидные формы. К 24 часам роста культуры были представлены палочковидными и кокковидными формами. 1аким образом, выделенные штаммы имели характерный для нокардиоподобных бактерий клеточный цикл развития: кокки-«гифы»-палочки-кокки

Для дальнейших исследований использовали культуры с наибольшей амидазной и нитрилгидратазной активностью (более 10 ЕД), в отношении труднометаболизируемых субстратов - изобутиронитрила, изобутирамида.

Видовая принадлежность представителей рода Rhodococcus была подтверждена методом ПЦР-анализа с видоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК Rhodococcus rhodochrous, R. erylhropolis и R. ruber и секвенирования генов 16S рРНК. В качестве контроля использовали ДНК коллекционных штаммов R. erylhropolis ИЭГМ 62т, R. rhodochrous ИЭГМ 7Т и R. ruber ИЭГМ 70т, полученных из Региональной профилированной коллекции алканогрофных микроорганизмов (WFCC #768).

Рис. 2. ГТЦР-идентификация штаммов рода ЯИос1ососсив с видоспецифичными праймерами, к 168 РНК: А-Л егуМгороПя; Б —Я. гкос1о\1гож

Штаммы 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-1-3, 11-2 отнесены к виду Я. егуЛгороШ, штамм 11-8 идентифицирован как Я. гкоскзсИгош (рис.2).

Зависимость амид ¡иной и нитрилгидратазной активности изолятов от фазы роста. Были исследованы ростовые характеристики и зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности от фазы роста активных штаммов Я. егу1кгороИх 41-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-1-3, 11-2 и 7?. rb.odoch.rous 11-8. Культуры выращивали на минеральной среде N. содержащей 0,1 % глюкозу и 10 мМ ацетонитрил.

Максимальная активность амидазы и нитрилгидратазы штамма Я. егуЛгороШ 6-2-1 наблюдалась в первой половине экспоненциальной фазы и составляла 18,2 и 21,1 мкмоль/мг/мин соответственно. При дальнейшем культивировании плотность культуры увеличивалась, но наблюдалось падение активности обоих ферментов. Аналогичным образом изменялась активность ферментов у штамма Я. егу/кгорокв 4-1-6, однако его амидазная активность, достигавшая 7,7 мкмоль/мг/мин, была значительно ниже нитрилгидратазной, составлявшей в максимуме 18,22 мкмоль/мг/мин. При выходе культуры в стационарную фазу активность обоих ферментов падала до 2,05 ЕД и 8,6 ЕД соответственно (рис. 3).

-амидазная активность,ед -нитрилгидратазная активность,ед -плотность культуры

~ нитрмлгидратазная активность

- амццазная активность

- плотность культуры

Рис. 3. Зависимость активности амидазы и нитрилгидратазы штаммов К. ггуЛгороШ 4-1-6 (А) и Я. ЛодосЬгош 11-8 (Б) от фазы роста при культивировании на среде N с 10 мМ ацетамидом.

Таким образом, можно отметить, что максимальная амидазная активность выделенных штаммов проявляется в начале экспоненциальной фазы, когда бактериальная культура обладает наименьшей плотностью. Нитрилгидратазная активность достигает максимума позднее — к концу экспоненциальной фазы. При последующем культуральном росте стабильно наблюдается снижение активности обоих ферментов.

Трансформация амидов и нитрилов выделенными штаммами.

Активность амидазы клеток у таких культур, как Л егу/кгороПэ 4-1, 6-2-1, 11-2, значительно превышала нитрилгидратазную в широком интервале температур.

Наилучшим субстратом для амидазы был короткоцепочечный ацетамид. Реакция с большей скоростью проходила при высоких значениях температуры (50°С), что соотносится с данными о термостабильности амидазы. Штамм 6-2-1 проявлял более высокую активность по отношению к бензамиду, чем у другие культуры (табл.2).

Таблица 2

________________Активность амидазы почвенных штаммов_________________________

Амидазная активность, БД

Субстрат 11-2 11-8 4-1 6-2-1

25°С 50°С 25°С 50°С 25°С 50°С 25°С 50°С

Ацетамид 23,11 81,45 5,99 11,71 8,44 8,51 18,49 38,26

Акриламид 14,96 30,18 3,46 8,56 4,12 8,21 12,89 16,03

Пропионамид 27,43 58,47 6,01 15,56 5,08 14,07 20,53 35,00

Бутирамид 0,96 1,50 0,65 1,52 1,51 1,94 0,72 1,05

Изобутирамид 1,16 2,31 1,87 3,33 1,38 1,64 1,56 2,61

Бензамид 0,80 2,30 0,30 1,09 0,77 2,70 4,20 9,60

Проведена трансформация 7 нитрилов, включая алифатические, разветвленные, непредельные, гидрокси- и ароматические нитрилы, и соответствующих амидов выделенными штаммами с высокой скоростью роста на изобугиронитриле. Результаты конверсии, осуществляемой наиболее активными штаммами, приведены в табл. 3.

Таблица 3

Активность нитрилгидратазы почвенных штаммов

Нитрилгидратазная активность, ЕД

Субстрат 11-2 11-8 4-1 6-2-1

25°С 50°С 25°С 50°С 25°С 50°С 25"С 50°С

Ацетонитрил 0,27 0,19 0,84 0,08 1,68 0,42 10,00 12,74

Акрилонитрил 3,47 0,64 4,72 2,16 1,61 1,26 6,41 3,95

Пропионитрил 3,66 1,72 18,87 7,40 7,09 3,50 6,53 1,92

Бутиронитрил 2,32 17,90 21,48 12,69 3,48 2,43 6,15 3,71

Изобутироншрил 6,18 3,93 33,30 21,98 8,61 4,83 8,23 4,50

Бензонитрил 3,50 0,80 0,20 0,24 0,10 0,19 0,33 0,58

Известно, что штаммы, выделенные методом накопительной культуры, часто проявляют высокую конвертирующую способность именно к тому субстрату, который использовался для селекции [ЬауЬ е1 а/., 1997]. В нашей работе наилучшими субстратами для нитрилгидратаз большинства штаммов (И егу(Ьгоро1и 4-1, 11-2, И. г1юс1ос11гош 11-8 др.) оказались бутиронитрил и

изобутиронитрил. Так, нитрилгидратаза штамма 11-8 гидратировала ацетонитрил почти в 40 раз медленнее, чем изобутиронитрил. У штамма 11-2 скорость гидратации ароматического бензонитрила была на уровне алифатических нитрилов.

Энантноселективная биотрансформация амида ибупрофена клетками Шюйососсия. Конверсию ибупрофена клетками К егуАпороШ 6-2-1 проводили в калий-фосфатном буфере pH 8. В качестве субстрата использовали рацемический препарат ибупрофеиамида, содержащий равные доли (по 50%) И и Б-энантиомеров в концентрации 2 мг/мл. Биокатализатор добавляли в реакционную среду из расчёта

1 г сухого веса на 100 мл среды. Трансформацию проводили при температуре 30°С и перемешивании 100 об./мин. В результате до 98,7% Б-энантиомера ибупрофеиамида трансформировалось в Б-ибупрофен (рис. 4).

мин.

Рис. 4. Трансформация амида ибупрофена клетками КегуЛгороИз 6-2-1

Влияние температуры и pH на активность амидаз. Удельную амидазную активность клеток и бесклеточных экстрактов штаммов КегуЖгороНя 4-1-6, 4-1-7, 6-2-1, 11-2 и, II гИоЛос/тнк 11-8 измеряли в интервале температур от 5 до 80°С при pH 7,2 по изменению концентрации акриламида в течение 10 минут реакции.

На рис. 5 показано влияние температуры на активность амидазы ЯегуїНгороШ 6-2-1 в составе клеток и ферментного препарата. Подобный температурный профиль наблюдался у всех исследованных нами амидаз.

■с pH

-•-препарат амидазы -»-грепарат амидазы

клетки т- клетки

А Б

Рис. 5. Влияние температуры (А) и pH (Б) на амидазную активность клеток и препарата амидазы Я. егуїкгороііі 6-2-1 по отношению к акриламиду.

Установлено, что амидазная активность ферментного препарата достигала максимума при 50°С и затем быстро снижалась с повышением температуры. При комнатной температуре (25°С) фермент проявлял лишь 50% от максимальной активности. Также было показано, что фермент в составе клеток проявляет максимальную амидазную активность при более высокой температуре - 55-60°С (рис. 5 А).

На каталитическую активность ферментов большое влияние оказывает pH среды. Измерена активность амидазы штаммов КегуіЬгороШ 4-1-7, 4-1-6, 6-2-1, 11-

1-3, 11-2 и К гкосіосіггоиь 11-8 по отношению к акриламиду в интервале pH от 2,0 до 12,0 при 25°С. Показано, что препарат амидазы Я. егуАягориШ 6-2-1 имеет пик активности в диапазоне pH от 6,0 до 7,5, достигающий максимального значения при pH 7,0. За пределами этих значений pH наблюдается резкое снижение активности. Из графика следует, что при pH 5,0 и 9,0 фермент проявляет лишь 50% от максимальной активности (рис. 5 Б ).

Действие ингибиторов ферментов на активность амидаз. Исследовано влияние ряда потенциальных ингибиторов ферментов на активность амидазы. Реакция проводилась в фосфатном буфере с pH 7,2 при температуре 25°С в течение

10 минут (рис. 6).

140 120 100

60

40

20

<*> /Л Л* гО' ^ * 0г ^ ^ # А ^ ^ ^

// * * *////// и Ферментный препарат,% 0 Клетки,%

Рис. 6. Влияние штгибиторов на амидазную активность препарата фермента и целых клеток К егуЛгороШ 6-2-1 по отношению к акрюгамиду (концентрации ингибиторов - 1мМ). 100% - активность клеток и фермента без ингибиторов.

Анализ влияния ингибиторов на активность амидазы Я егуЛгороГи 6-2-1 показал, что активность фермента была практически полностью подавлена

1 мМ растворами нитрата серебра и хлорида ртути, что свидетельствует о наличии сульфгидрильных трупп, играющих большую роль в каталитическом процессе и поддержании активной структуры фермента. Ингибирующее влияние на амидазную активность оказывал йодацетат - реагент, специфически взаимодействующий с сульфгидрильными группами каталитического центра.

Амидазную активность также снижали гидроксиламин, мочевина, семикарбазид и фенилгидразин. Так как в своей структуре данные ингибиторы содержат амидную группу, можно предположить, что они действуют на фермент по типу обратимого конкурентного ингибирования. Более чем на 50% подавлял амидазную активность восстанавливающий агент - меркаптоэтанол. Хелатирующий агент ЭДТА не оказывал существенного влияния на активность фермента, что

свидетельствует о том, что амидаза не является металпозависимым ферментом.

Установлено, что соли тяжелых металлов, а также ряд реагентов (гидроксилами«, йодадетат, семикарбазнд) оказывают незначительное влияние на активность клеток и в то же время существенно ингибируют препарат амидазы R. erythropolis 6-2-1. В целом фермент в составе клеток был менее подвержен ингибирующему влиянию. Это связано, по-видимому, с действием различных стабилизирующих внутриклеточных факторов и с ограниченным проникновением ингибиторов в цитоплазму.

ПЦР-анализ генов амидаз. Для идентификации генов, кодирующих ферменты гидролиза амидов, проведен ПЦР-анализ изолятов с применением набора праймеров, специфичных к генам известных в настоящее время видов этих ферментов.

В геномах 35 изолятов Rhodococcus обнаружены последовательности размером ок. 1566 п.н., родственные ранее известным генам энантиоселективиых амидаз R. erythropolis (GenBank, El2517), R. rhodochrous N-771, N-774 (GenBank, X54074) (рис. 7,A).

Рис. 7. Последовательности ДНК изолятов Rhodococcus, гомологичные: А — гену амидазы R. erythropolis (GenBank, Е12517), 1566 п.н., Б — гену амидазы R. erythropolis (GenBank, М88614), 1038 п.н.

У 9 штаммов амплифицировались последовательности, гомологичные гену

11 егуМгороШ (ОепВапк, М88614), относящемуся к структурному семейству нитрилаз-цианидгидратаз (рис. 7,Б). Гены других видов амидаз встречались со значительно меньшей частотой.

Установлено, что более 94% почвенных изолятов, обладающих нитрилгидратазной активностью, выделенных методом прямого высева, содержат гены железозависимой нитрилгидратазы.

У всех исследованных штаммов обнаружены гены, кодирующие а-субъединицу (ген пЬа) и Р-субъединицу (ген пкЬ) железосодержащей нитрилгидратазы, гомологичные известным у И. гИос/оскгаи.ч N-771, N-774. С помощью комбинирования в ПЦР праймеров к генам субъединиц определено их взаимное расположение в опероне: за геном пИа следует ген гМ>. Размер фрагмента, содержащего обе субъединицы, составил 1,3 т.п.н.

Гены, кодирующие нитрилазу, альдоксимдегидратазу и Со-зависимую нитрилгидратазу, обнаруженные у других почвенных изолятов, у изучаемых высокоактивных штаммов не детектировались.

Таким образом, установлено, что амидазная активность большей части изолятов ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.

Анализ последовательности генов и полипептидных последовательностей амидаз. Проведено секвенирование полных последовательностей ПЦР-фрагментов, соответствующих генам амидаз. Полученные нуклеотидные и аминокислотные последовательности депонированы в базу данных ОепВапк под номерами: Я. егуМггороШ 11-2 - Ж936271, К гкоЛоскгоиэ

11-8 - Ж936272, К. егуЛгороНх 4-1-7 - Ж936273, К. егуЛгороШ 6-2-1 - Ж936274,

II егуЛгороНа 11-1-3-М889708, Я. егуиЪгороИз 4-1-6 - 1Ы889709.

Показано, что нуклеотидные последовательности энантиоселективных амидаз гомологичны генам ферментов из ШгиАососсих ер. N-771 (АВ016078, ОепВапк), N-774 (Х54074, ОепВапк), К егуЛгороШ (АУ026386, ОепВапк) К г!ю<1осЬго11$ (Е12517, ОепВапк). Установлено, что гены амидаз селекционированных штаммов обладают наибольшей гомологией (на 98-99,3%) последовательности Е12517, в то время, как гомология гену фермента Мюс/всосст ер. N-771 составляла от 95,98 до 97% (табл.4)

Последовательности, полученные в ПЦР-реакции с праймерами Агт11с11, на 82-99% гомологичны гену амидазы К. егу^гороШ, приведенному в базе данных ОепВАК'К под номером М88614, относящемуся к структурному семейству ншрилаз-цианидгидратаз [Перцович и др., 2005].

Таблица 4

Гомология генов энантиоселективных амидаз (%)

штамм Е12517 Х54074 4-1-6 4-1-7 11-8 6-2-1 11-1-34 11-2

Е12517 100 95,53 98,40 99,10 99,17 99,23 98,00 99,30

Х54074 100 97,00 95,98 95,98 96,04 96,10 95,91

4-1-6 100 99,29 99,29 99,17 97,83 98,72

4-1-7 100 100 99,90 98,53 99,43

11-8 100 99,87 98,53 99,43

6-2-1 100 98,59 99,43

11-1-34 100 98,72

11-2 100

В результате перевода нуклеотидной последовательности в аминокислотную установлено, что у исследуемых штаммов есть ряд нуклеотидных замен по сравнению с ранее известными последовательностями, что, вероятно, обусловливает установленные различия субстратной специфичности ферментов. При этом сходство соответствующих аминокислотных последовательностей с геном из Я. гУю<1осЪгот (Е12517, ОепВапк) составляло от 98,27 до 98,85%, в то время, как гомология гену из ЯЬо^соссиэ ер. N-774 находилась в интервале от 96,35 до 96,74% (табл. 4).

Проведено сравнение аминокислотных последовательностей, соответствующих секвенированным генам амидаз.

Таблица 5

Г омология аминокислотных последовательностей энантиоселективных амидаз (%)

штамм Е12517 Х54074 4-1-6 4-1-7 11-8 6-2-1 11-1-34 11-2

Е12517 100 95,78 98,27 98,66 98,66 98,85 98,27 98,85

Х54074 100 96,35 96,54 96,54 96,54 96,74 96,74

4-1-6 100 99,62 99,62 99,42 98,66 99,42

4-1-7 100 100 99,80 99,04 99,80

11-8 100 99,80 99,04 99,80

6-2-1 100 99,04 99,62

11-1-34 100 99,23

11-2 100

Установлено, что гомология аминокислотных последовательностей исследуемых амидаз относительно известной последовательности Е12517 из Л егу1ЪгораШ составляет от 98,27 до 98,85% (табл. 5).

Среди почвенных изолятов Шю^сосси.ч, обладающих высокой амидазной активностью, наиболее распространены гены амидаз двух типов, гомологичные последовательностям из И. егуОггороШ, ОепВапк, Е12517 и К. егу1кгороШ, ОепВапк, М88614. Филогенетический анализ секвенированных последовательностей позволяет предположить, что структура вновь выявленных генов ближе к консенсусной, чем последовательности, депонированные в ОепВапк Е12517, М88614.

22

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что бактерии, активно трансформирующие амиды карбоновых кислот, представлены во всех изученных типах почв Пермского края в количестве 105-108 КОЕ/г сухой почвы. Среди культур, обладающих высоким уровнем амидазной активности, преобладают актинобактерии рода ШюАососам.

2. Селекционированы штаммы НЪоЛососсш1 с высокой активностью амидазы (более 5 мкмоль/мг/мин), имеющие нитрилгидратазно-амидазную систему метаболизма нитрилов.

3. Установлено, что высокая активность амидаз исследованных штаммов НИос1ососси$ проявляется в диапазоне 25-60°С с максимумом при 50°С. Оптимальная pH реакционной среды составляет от 5 до 8 с максимумом 7.

4. Показано, что исследованные штаммы Ююс1ососст эффективно трансформируют амиды карбоновых кислот. При трансформации ибупрофенамида продуктом является 8-ибупрофен с энантиомерным избытком 97%.

5. У большинства изолятов НИос/ососсих, обладающих высокой амидазной активностью, обнаружены фрагменты ДНК размером ок. 1566 пн, на 98-99,3% гомологичные гену энантиоселективной амидазы И. егу11ггоро1м, ОепВапк Е12517 и на 96-97% последовательности ЯИо^ососсгм зр. N-774, ОепВапк Х54074. У ряда изолятов обнаружены фрагменты размером 1100 пн, на 95-99,7% совпадающие с последовательностью амидазы Л егуЛиороИз, ОепВапк М88614.

6. Установлено, что гомология аминокислотных последовательностей исследуемых энантиоселективных амидаз относительно известной последовательности Е12517 из Д. епякгороНя составляет от 98,27 до 98,85%.

7. В геноме исследуемых штаммов обнаружены гены а- и (^-субъединиц Ре-зависимых нитрилгидратаз, гомологичные описанным ранее у штаммов Шос1ососсиз ер. N-771, N-774 и 11-312.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н., Максимов А.Ю. Сравнительный анализ последовательностей генов амидаз почвенных актинобактерий рода Rhodococcus И Известия Самарского научного центра РАН. 2011. Т. 13, №5(3). С. 272-276.

2. Павлова ТО.А., Неустроева А.Н. Симбиотические почвенные бактерии, трансформирующие нитрилы и амиды карбоновых кислот. // Вестник Оренбургского университета. 2011. №16. С.38-41.

3. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Исследование влияния температуры, pH и ингибиторов на активность энантиоселективной амидазы Rhodococcus erylhropolis // Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1(38). С.44-45.

4. Максимова A.B., Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Характеристика генов, кодирующих альдоксимдегидратазы нитрилутилизирующих почвенных бактерий И Вестник уральской медицинской академической науки. 2011. №4/1(38). С.39-40.

Публикации в других журналах и сборниках

5. Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю. Распространение нитрилутилизирующих бактерий в почвах Пермского края // Экология: проблемы и пути решения. Пермь. 2007. С.102-106.

6. Павлова Ю.А., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю. Трансформация нитрилов карбоновых кислот штаммами - продуцентами нитрилгидратазы и амидазы // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. Матер. Межрег. науч. конф. Пермь. 2007. С.85-87.

7. Kusnetsova M.V., Pavlova Yu.A., Maksimov A.Yu. Thermostable amidase of soil bacteria // Modem problems of microbiology and biotechnology. Odessa. 2007. P. 122,

8. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Штаммы актинобактерий рода Rhodococcus для биологической очистки вод от нитрильных и амидных загрязнений // VII Междунар. Конф. «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет. Тез. докл. 2008. Пермь-Н.Новгород. С. 22.

9. Максимов АЛО., Павлова Ю.А., Демаков В.А. Молекулярно-генетический анализ амидаз почвенных бактерий // III Междунар. конф. «Микробное разнообразие:

состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». Тез. докл. 2008. Пермь-Н.Новгород. С. 66-67.

10. Демаков В.А., Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В. Почвенные актинобактерии рода Шюс1ососсиз, обладающие высокой амвдазной активностью // Вестник Пермского Университета.. 2009. 10 (36). С.79-83.

11. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Амидазы нитрилтрансформирующих почвенных бактерий // Актуальные аспекты современной микробиологии: Матер. V молодежной школы-конференции с международным участием. Москва. 2009. С. 104-105.

12. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Скрининг и секвенирование генов амидаз из почвенных изолятов Шюдососсих // Симбиоз Россия 2009. Матер. II Всеросс. с междунар. участ. конгресс студ. и аспир.-биол. Пермь. 2009. С. 234-237.

13. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю. Штаммы Екос1<>сосст, обладающие термостабильной амидазной активностью // Симбиоз Россия 2010. Матер. III Всеросс. с междунар. участ. конгресс студ. и аспир.-биол. Нижний Новгород. 2010. С. 65-66.

14. Павлова Ю.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов амидаз // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы VII Международной конференции. Минск. 2010. С. 141-143.

15. Павлова Ю.А., Неустроева А.Н. Амидазы почвенных бактерий рода Я1юс1ососст // Симбиоз Россия 2011. Матер. IV Всеросс. с междунар. участ. контр, студ. и аспир.-биол. Воронеж. 2011. С. 153-156.

Подписано в печать 31.01.2012 г.

Формат 60x84 1/16. БумагаВХИ 80 гр/м2. Уч. п. л. 1,75 Тираж 120 экз. Заказ № 14

ООО «Полиграф Сити» г. Пермь, ул. Ленина, 66, оф. 222

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Павлова, Юлия Андреевна, Пермь

61 12-3/553

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ЭКОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ УРАЛЬСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ПАВЛОВА Юлия Андреевна

АКТИНОБАКТЕРИИ РОДА ЯНОВОСОССШ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИЕ АМИДЫ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

03.02.03 Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель

кандидат биологических наук,

доцент Максимов А.Ю.

Пермь - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................4

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................12

1.1 Организмы - продуценты амидаз....................................................................12

1.3. Ферментативная активность амидаз..............................................................26

1.4. Классификация и характеристика нитрилгидратаз и нитрилаз..................32

1.5. Стереоселективность амидаз..........................................................................36

1.6. Использование штаммов- продуцентов ферментов метаболизма нитрилов и амидов...................................................................................................................38

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................41

2.1. Объекты исследования....................................................................................41

2.2. Среда и условия культивирования бактерий................................................42

2.3. Идентификация выделенных культур...........................................................42

2.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов......................................................................................................................44

2.5. Трансформация нитрилов и амидов карбоновых кислот............................44

2.6. Методы энзиматического анализа.................................................................48

2.7. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция........................................48

2.8 Праймеры и условия ПЦР-анализа................................................................50

2.9. Секвенирование ДНК......................................................................................53

2.10. Статистическая обработка............................................................................54

ГЛАВА 3. СЕЛЕКЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ВЫСОКУЮ ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ...........................................................................................................55

3.1 Отбор и характеристика образцов почв для выделения микроорганизмов

...................................................................................................................................55

3.2. Изучение аэробной гетеротрофной почвенной микрофлоры. Выделение и селекция штаммов, метаболизирующих амиды и нитрилы...............................57

3.3 Селекция штаммов, проявляющих высокую гидролитическую активность ...................................................................................................................................59

3.4. Идентификация почвенных изолятов, проявляющих высокую гидролитическую активность................................................................................59

3.5. Зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности изолятов от фазы роста на среде с ацетонитрилом..................................................................67

3.6. Оценка минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов ...................................................................................................................................69

3.7. Трансформация амидов и нитрилов выделенными штаммами..................71

ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ ШТАММОВ ШОООСОССиБ..........................................................75

4.1. Влияние температуры на активность амидаз................................................75

4.2. Влияние рН на активность амидаз.................................................................76

4.3. Действие ряда ингибиторов на активность амидаз......................................77

4.4. Субстратная специфичность амидаз..............................................................78

4.5. Стабильность препарата амидазы после замораживания............................79

4.6. Свойства ферментов метаболизма нитрилов................................................80

ГЛАВА 5. ПЦР-ДЕТЕКЦИЯ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ.........................82

5.1. ПЦР-анализ генов амидаз..............................................................................82

5.2. ПЦР-детекция генов нитрилгидратаз и нитрилаз........................................84

5.3. Анализ последовательности нуклеотидов, гомологичных генам амидаз

Я. егуЖгороШ, ОепВапк, М88614..........................................................................88

5.4. Анализ последовательности нуклеотидов генов энантиоселективных амидаз, гомологичных ферментам из Шюйососст ер. N-774, Я. егуЖгороНя АУ026386, Е12517 вепВапк..................................................................................93

5.5. Сравнение аминокислотных последовательностей амидаз.......................103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................................106

ВЫВОДЫ..................................................................................................................112

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................113

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Амидазы (КФ 3.5.1.4) - ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Амидазы участвуют в метаболизме азота в клетках и широко распространены в природе, обнаружены у про- и эукариот. У бактерий появление амидазной активности часто связано с метаболизмом нитрилов. Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью. Некоторые из них катализируют гидролиз амидов алифатических кислот, другие расщепляют ароматические амидосоединения, третьи гидролизуют амиды аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью. Однако наличие у бактерий ферментов разных видов и их способность трансформировать различные типы субстратов не являются родо- или видоспецифичными признаками [15]. Амидазную активность часто обнаруживают у протеобактерий, а также у актинобактерий (Nocardia, Rhodococcus, Arthrobacter).

Актуальность изучения амидаз и их продуцентов обусловлена значительной разнородностью структуры этих ферментов, свойств, генетической организации и регуляции активности, интеграции с другими процессами метаболизма, а также широкой субстратной специфичностью данных ферментов и стереоселективностью некоторых из них [4, 33, 43, 55]. Культуры, активно использующие амиды в качестве ростовых субстратов, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. [9, 10, 43,55].

К настоящему времени амидазы остаются недостаточно изученными на молекулярном уровне, и их классификация окончательно не сформулирована. В классификации, основанной на субстратной

специфичности, объединены ферменты, различающиеся по структурной организации, механизму действия и каталитическим свойствам [55].

В связи с этим большой интерес представляет поиск продуцентов новых амидаз, различающихся каталитическими свойствами, сравнение генов и аминокислотных последовательностей данных ферментов с целью изучения их разнообразия и распространения определённых структурных типов у различных бактерий, эволюционной изменчивости, последующего определения взаимосвязи структуры и функции, механизмов экспрессии белков, уточнения механизмов их действия, структуры фермента и ее роли в катализе [93].

В последнее время пристальное внимание уделяется исследованиям в области стереоселективной трансформации субстратов клетками. Стереоселективность позволяет использовать биокатализаторы для эффективного синтеза некоторых чистых энантиомеров, фармакологических препаратов, а также для получения и других продуктов, которые трудно синтезировать традиционными химическими способами. Некоторые амидазы проявляют энантиоселективность по отношению, например, к производным арилпропионовых кислот. Бактерии, обладающие высокой амидазной активностью, представляют интерес для биокаталитического получения различных карбоновых кислот, в частности, аммонииных солеи акриловои и никотиновой кислот, нестероидных противовоспалительных препаратов [24].

Успешное применение микроорганизмов в биокаталитических технологиях зависит от свойств биокатализаторов: скорости гидролиза субстрата, рН- и температурного оптимумов активности ферментов, субстратной избирательности, оптимального состава рабочей среды. Разные ферменты существенно различаются по этим свойствам, поэтому подобная характеристика фермента помогает оценить перспективы использования продуцентов. В связи с вышеизложенным, селекция и изучение бактерий -активных продуцентов амидаз является актуальным направлением микробиологических исследований [2, 15, 146].

Цель настоящего исследования - выделение, морфологическая и биохимическая характеристика почвенных бактерий, активно метаболизирующих амиды карбоновых кислот, исследование генов амидаз.

Основные задачи исследования:

1) Выделить и идентифицировать микроорганизмы, метаболизирующие амиды и нитрилы, из различных образцов характерных почв Пермского края. Выявить тип метаболизма нитрилов (нитрилазный и/или нитрилгидратазно-амидазный).

2) Провести ПЦР-анализ генов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз. Получить ПЦР-фрагменты, соответствующие белок-кодирующим последовательностям генов амидаз.

3) Провести BLAST-шалш и сравнение секвенированных последовательностей с известными генами амидаз разных типов. Определить аминокислотные последовательности амидаз. Провести сравнение с первичной структурой известных ферментов.

4) Охарактеризовать влияние факторов среды (pH, температуры, ингибиторов) на активность ферментов амидазы и нитрилгидратазы.

Состояние вопроса.

В последние годы возрос научный интерес к изучению микроорганизмов, конвертирующих амиды и нитрилы карбоновых кислот, что обусловлено успешным опытом их применения в производстве акрилатов и акриламида, а также возможностью использования в качестве биокатализаторов для получения других полезных химических продуктов.

По первичной структуре амидазы подразделяются на четыре семейства:

I. Ферменты, содержащие в первичной структуре GGSS -мотив (глицин-глицин-серин-серин);

II. Нитрилазы/цианидгидратазы;

III. Ацилтрансферазы;

IV. Уреазы [15,55].

Среди амидутилизуирущих микроорганизмов известны бактерии, принадлежащие к родам Rhodococcus, Corynebacterium [17, 148], Mycobacterium [94], Pseudomonas [36, 111], Bacillus, Micrococcus, Brevibacterium [73, 100, 110], Nocardia [42, 46, 76, 77], Streptomyces, Blastobacter, Arthrobacter, Achromobacter [35], Alcaligenes, Helicobacter, Lactobacillus, и Methylophilus [21].

Амидазы обладают амидгидролазной и ацилтрансферазной активностями. Разные амидазы проявляют различную субстратную специфичность. Например, была выделена никотинамидаза Mycobacterium avium, которая проявляла специфичность к никотинамиду. А амидаза Rhodococcus rhodochrous J1 [83] обладала широким спектром действия. Важно отметить то, что один микроорганизм может содержать несколько структурно не родственных амидаз. Например, штамм Rhodococcus sp. R312, описанный Arnaud и коллегами, содержит L-альфа-аминоамидазу, энантиоселективную амидазу, алифатическую амидазу и несколько абсолютно специфичных амидаз для никотинамида, формамида или мочевины [18].

Существует предположение, что наличие амидаз у бактерий связано с метаболизмом нитрилов. В природе реализуются различные пути метаболизма нитрилов, распространенные как у бактерий, так и у эукариот: 1) гидролиз в котором участвуют ферменты - нитрилаза или нитрилгидратаза и амидаза; 2) окисление, катализируемое оксигеназой, с последующим гидролизом оксинитрилазой; 3) восстановление с участием нитрогеназы.

В последние годы бактерии, трансформирующие амиды и нитрилы, привлекают внимание возможностью применения в производстве различных фармацевтических препаратов, что обусловлено регио- и стереоселектив-ностью биотрансформации [108, 130, 137, 162].

Наиболее часто способность к утилизации нитрилов обнаруживают среди бактерий. У бактерий существует два альтернативных пути метаболизма нитрилов [22, 52, 97]:

1) гидролиз до соответствующей карбоновой кислоты и аммония, катализируемый одним ферментом - нитрилазой (КФ 3.5.5.1);

2) катализируемая нитрилгидратазой (КФ 4.2.1.84) гидратация нитрила до амида, с последующим гидролизом до кислоты и аммония под действием амидазы (КФ 3.5.1.4).

Охарактеризовано несколько типов амидаз, нитрилаз и нитрилгидратаз [79, 81, 89, 95, 157]. Установлено, что нитрилазы и амидазы являются гомомультимерными тиольными ферментами, обычно содержащими от 2 до 16 субъединиц [55]. Нитрилгидратазы относятся к металлоферментам и различаются простетическими группами (ионы железа или кобальта) [25, 84]. Практически все известные нитрилгидратазы являются гетеромультимерами, состоящими из двух субъединиц аир, соединенных в эквимолярном соотношении [43]. На основании биофизических исследований предложены модели механизмов ферментативной трансформации амидов [22].

Интенсивный поиск позволил выделить новые штаммы бактерий, обладающие уникальными ферментами, способными к региоспецифичному и высокоселективному гидролизу нитрилов [143, 156, 159]. Применение таких биокатализаторов позволяет получать химические соединения, которые невозможно синтезировать традиционными химическими способами [2, 5, 22, 23, 24, 45, 55, 130].

До настоящего времени мало изучены структурные варианты амидаз известных видов. Описаны лишь отдельные представители амидаз различных структурных групп.

Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой амидазной активностью, которые идентифицированы на основании

физиолого-биохимических, хемо- и генотаксономических характеристик как представители Якойососст егуЧкгороШ. С помощью праймеров к генам, кодирующим амид- и нитрилгидролизующие ферменты, у изолятов подтверждено наличие генов амидазы и Ре-зависимой нитрилгидратазы. Показано, что амидазы катализируют гидролиз как алифатических, так и ароматических амидов, проявляют активность в широком диапазоне температуры и рН. Для экспрессии этих ферментов не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Селекционированы штаммы Я. егу^гороШ, характеризующиеся высокой активностью амидазы (до 14 мкмоль/мг/мин при 25°), амидазная активность которых ассоциирована со способностью трансформировать нитрилы.

Впервые проведено сравнение нуклеотидных последовательностей ряда энантиоселективных амидаз из разных штаммов Ккойососсш, установлены их отличия от ранее известных гомологов. Секвенированы и депонированы в базу данных ОепВапк новые последовательности генов амидаз.

Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, метаболизирующих амиды до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих амидазы разных структурных групп. Разработаны протоколы полимеразной цепной реакции, позволяющие дифференцировать наличие амидаз различных структурных групп.

Секвенированы гены амидаз из новых штаммов. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами и филогенетический анализ. Показано, что исследованные амидазы могут быть использованы для биокаталитической трансформации амидов, в т.ч. для энантиоселективного синтеза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные и идентифицированные штаммы бактерий эффективно трансформируют алифатические и ароматические амиды в соответствующие карбоновые кислоты и обладают высокой амидазной активностью.

2. Амидазы исследованных штаммов Rhodococcus активны в широким диапазоне температур, имеют максимумом активности при рН 7 и стабильны при хранении.

3. Штаммы Rhodococcus, обладающие высокой амидазной активностью, имеют гены, гомологичные известным последовательностям, кодирующим амидазы сигнатурного типа.

Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Межрегиональной научной конференции "Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии" (Пермь, 2007), VII Международной конференции "Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет" (Н. Новгород, 2008), III Международой конференции "Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал" (Н. Новгород, 2008), V молодежной школе-конференции с международным участием "Актуальные аспекты современной микробиологии" (Москва, 2009), II Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2009" (Пермь, 2009), III Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2010" (Н. Новгород, 2010), VII Международной конференции "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии" (Минск, 2010), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов: "Симбиоз Россия 2011" (Воронеж, 2011), I молодёжной научной школе-конференции "Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах" (Оренбург, 2011), Всероссийской научной конференции с международным участием "ЭКОБИОТЕХ-2011" (Уфа, 2011).

Результаты проведенных исследований опубликованы в 15 научных работах: 8 статей, 4 из которых в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 7 тезисов.

Объем и структура диссертации. Р