Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий

Васильев, Дмитрий Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий"

На правах рукописи

ВАСИЛЬЕВ Дмитрий Михайлович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ЦИАНОИИРИДИНОВ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ ШИРИЛ УТИЛИЗИРУЮЩИХ

БАКТЕРИЙ

03.02.03. Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 МАР 2014

Пермь-2014

005546454

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета и в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь. Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор, член-корреспондент РАН Демаков Виталий Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, начальник

отделения препаратов бактериотерапии филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Пермское НПО «Биомед» Несчисляев Валерий Александрович

кандидат биологических наук, начальник отдела учебно-методического и научного обеспечения ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Чемурзиева Наталья Вадимовна

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Уфимского научного центра РАН (450054 г. Уфа, проспект Октября, 69)

Защита состоится "/7" Л 2014 г. в /¿Змсов на заседании Диссертационного

совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 280 92 11

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru). Автореферат разослан "¿2" ^еу^тсл 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук ' Максимова Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время большое внимание уделяется разработке и внедрению биотехнологических методов синтеза разнообразных химических соединений. Способность ферментов трансформировать органические вещества в более мягких по сравнению с химическими процессами условиях (невысокие температура и давление) позволяет выделить биокаталитические технологии в число приоритетных направлений (Vejvoda, et al., 2006, Cantarella, et al., 2010, Яненко, 2006). В биотехнологических производствах чаще всего используют целые микробные клетки, т.к. в этом случае не требуется проведение дорогостоящего процесса выделения и очистки фермента (Халгаш, 1991).

Цианопиридины - это ароматические нитрилы, в составе которых цианогруппа связана с пиридиновым кольцом. В результате гидролиза цианопиридинов образуются пиридинзамещенные амиды и карбоновые кислоты, которые являются витаминами, предшественниками фармацевтических препаратов и различных химических соединений.

Витамины группы РР (никотинамид и никотиновая кислота) являются необходимым элементом питания и распространенным лекарственным средством. Изоникотиновая кислота - промежуточный продукт в синтезе ряда противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты (изониазид, фтивазид, метазид и др.), антидепрессантов - ингибиторов моноаминооксидазы, хинуклидиновых лекарственных средств (фенкарол, оксилидин, ацеклидин); пиколиновая кислота - предшественник 6-метилпиколиновой кислоты, промежуточного продукта синтеза димеколина.

Основным природным источником пиридиновых соединений являются продукты коксования каменного угля. В химико-фармацевтическом производстве Р-пиколиновую фракцию (предшественник никотинамида и никотиновой кислоты), содержащуюся в коксовом газе, подвергают конденсации в жестких условиях под давлением с формалином. Присутствующую в ней у-пиколиновую фракцию (предшественник изоникотиновой кислоты) отделяют формалином с последующей отгонкой и окислением азотной кислотой (Патент РФ № 2175968) Также возможно прямое окисление Р-пиколина кислородом воздуха на ванадий-титановом катализаторе в температурном диапазоне 250-480°С, при этом в настоящее время чаще используют синтетический р-пиколин (Bhalla, et al., 2009, Патент РФ № 2371247). Известен также химический гидролиз цианопиридинов, который инициируется повышенной температурой и характеризуется неконтролируемой экзотермичностью (Патент РФ № 2175968, Натрадзе, 1983). Кроме того, никотиновую кислоту получают химическим синтезом, включающим стадию окисления 2-метил-5-этилпиридина, или гидролизом 3-цианопиридина при высоких температурах (330°С) и давлении (290 атм.) (Almatawah, et al., 1999). Биологический способ получения ароматических амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, основанный на ферментативном гидролизе, выгодно отличается от химического мягкими условиями проведения процесса, экологической безопасностью и высокой степенью конверсии.

Cantarella, et al., 2012, Забазная, и др., 1998), так и среди грибов родов Fusarium, Giberella, Aspergillus, Pinicillum, Talaromyces и др. (Bhalla, et al., 2009, Kaplan, et al., 2006). Известны биотехнологические процессы, основанные на гидролизе алифатических нитрилов. Так, компанией «Биоамид» (г. Саратов, Россия) был внедрен процесс, заключающийся в биокаталитическом производстве акрилата аммония из нитрила акриловой кислоты штаммом Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцентом нитрилазы (КФ 3.5.5.1) (Глинский, и др., 2010). Крупнотоннажное производство акриламида основано на гидратации акрилонитрила клетками штамма R. rhodochrous J1 (Япония) (Asano, 2002) и штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Россия) (Астаурова, и др., 1993), обладающими высокой нитрилгидратазной активностью. Промышленно значимый штамм R. rhodochrous J1 также применяется в биокаталитическом производстве никотинамида, тогда как в научной литературе не содержится сведений о биокаталитическом синтезе изоникотиновой и пиколиновой кислот с выходом на промышленный уровень.

Использование иммобилизованных нерастущих каталитически активных клеток бактерий обеспечивает возможность перехода к гетерогенному биотехнологическому процессу. Преимущество гетерогенного биокатализа заключается в стабилизации активности ферментов, упрощении технологической схемы синтеза, более легком отделении и очистке образующихся продуктов, а также в возможности многократного или непрерывного использования биокатализатора в колоночном биореакторе, что позволит удешевить производство и снизить количество отходов. В связи с этим остается актуальным как поиск и изучение биологических свойств новых штаммов бактерий, осуществляющих трансформацию цианопиридинов, так и разработка гетерогенного процесса получения коммерчески значимых пиридинзамещенных амидов и карбоновых кислот.

Цель настоящего исследования - изучение процесса трансформации цианопиридинов свободными и адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий и оценка биотехнологического потенциала грамотрицательных цианопиридин-утилизирующих бактерий активного ила биологических очистных сооружений.

Основные задачи исследования:

1) Из активного ила биологических очистных сооружений (БОС) г. Перми выделить и идентифицировать микроорганизмы, способные метаболизировать цианопиридины.

2) Провести ПЦР-анализ и секвенирование генов ферментов метаболизма нитрилов (амидаз, нитрилаз).

3) Оптимизировать среды и условия культивирования выделенных изолятов, проявляющих наибольшую нитрилгидролизующую активность.

4) Изучить динамику трансформации ароматических нитрилов свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад.

5) Провести скрининг носителей для адсорбционной иммобилизации цианопиридин-трансформирующих бактерий с целью создания эффективного гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов.

Научная новизна. Впервые изучено биоразнообразие нитрилутилизирующих грамотрицательных бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений. На основании параметров, характеризующих процессы роста, оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecalis. Секвенированы гены нитрилаз изолятов грамотрицательных бактерий, способных к утилизации цианопиридинов. Оптимизированы условия реакции трансформации

цианопиридинов штаммами родококков и псевдомонад, обладающими высокой нитрилгидролизующей активностью. Проведена совместная трансформация 4-цианопиридина до изоникотиновой кислоты разными видами родококков, проявляющими нитрилгидратазную и амидазную активности. Выявлены основные особенности носителей для адсорбционной иммобилизации клеток, позволяющие получить гетерогенный биокатализатор для эффективного гидролиза ароматических нитрилов.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о процессах трансформации цианопиридинов у бактерий. Изучено биоразнообразие грамотрицательных бактерий активного ила и осадков БОС, использующих цианопиридины как единственный источник углерода и азота. Секвенированы гены нитрилаз новых штаммов нитрилутилизирующих бактерий, выделенных из активного ила и осадков БОС. Проведено их сравнение с ранее известными гомологичными генами, на основании этого сравнения выделены гены нитрилаз двух типов. Обоснована предпочтительность использования неактивированных носителей для создания гетерогенных биокатализаторов гидролиза ароматических нитрилов.

Показана возможность получения никотинамида, никотиновой, изоникотиновой и пиколиновой кислот при конверсии соответствующих цианопиридинов целыми клетками родококков и псевдомонад, обладающими нитрилгидролизующей активностью. Получены гетерогенные биокатализаторы гидролиза цианопиридинов на основе клеток R. ruber gtl и P. fluoresceins С2, адгезированных на неактивированных носителях. Оптимизирована среда культивирования наиболее активного изолята A. faecalis, выделенного из активного ила БОС, с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза ароматических амидов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Грамотрицательные бактерии активного ила и осадков БОС, выделенные на 3-цианопиридине как единственном источнике углерода и азота, содержат гены нитрилаз двух типов и обладают амидазной активностью по отношению к ароматическим амидам.

2. Оптимальной средой культивирования выделенного из проб активного ила изолята A. faecalis является синтетическая минеральная среда с ацетамидом в концентрации 5,9 г/л как единственным источником углерода и азота. При этом наблюдается максимальный урожай, равный 1,56 мг сухих клеток/мл и экономический коэффициент использования субстрата 26,54%.

3. Наиболее эффективный гидролиз цианопиридинов осуществляется свободными и адгезированными клетками родококков и псевдомонад при концентрации субстрата 200 мМ. В качестве носителей для создания гетерогенного биокатализатора гидролиза ароматических нитрилов предпочтительно использование неактивированных адсорбентов.

Апробация работы и публикации

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011» (Воронеж. 2011), I Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011), Международной научной Интернет - конференции: "Биотехнология. Взгляд в будущее" (Казань, 2012), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ

студентов и аспирантов в области биологических наук (Ульяновск, 2012), Международной конференции «Биология - наука XXI века» (Москва, 2012), VIII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва. 2012), V Всероссийском с международным участием медико-биологическом Конгрессе "Симбиоз-Россия 2012" (Тверь, 2012), VI Всероссийском с международным участием Конгрессе молодых учёных-биологов «Симбиоз-Россия 2013» (Иркутск, 2013), V Конгрессе европейских микробиологов «FEMS 2013» (Лейпциг, 2013).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 9 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, двух глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 108 наименований, в том числе 39 на русском и 69 на английском языках.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Работа выполнена на базе кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета Пермского государственного национального исследовательского университета и Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования

Бактериальные штаммы. Объектами исследования являлись штаммы R. ruber gtl, R. erythropolis 11-2, Rhodococcus sp. AO и Pseudomonas fluorescens C2. Данные штаммы были изолированы из антропогенно-згрязненных почв и селекционированы в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Штамм R. ruber gtl и Rhodococcus sp. АО обладают высокой нитрилгидратазаной активностью, R. eritropolis 11-2 проявляет амидазную, P. fluorescens С2 - нитрилазную активность.

Также объектом исследования явился штамм A. faecalis 2, изолированный нами из активного ила биологических очистных сооружений г. Перми.

Выделение и идентификация иитрилутилизирующих бактерий. Штаммы нитрилутилизирующих бактерий выделяли из образцов активного ила и осадков БОС г. Перми (ООО «Новогор-Прикамье»), отобранных в июне 2011 г. При необходимости образцы хранили при +4°С в течение 1-3 суток.

Селекцию проводили на минеральной среде N с добавлением 3-цианопиридина до конечной концентрации 50 мМ в качестве единственного источника азота и углерода. Колонии многократно пересевали на минеральную среду с 3-цианопиридином в качестве единственного источника углерода и азота. Изоляты поддерживали на среде N с добавлением 50 мМ 3-цианопиридина и на среде LB. Идентификацию проводили

методом 16S РНК и по физиолого-биохимическим тестам (Вейант и др., 1999, Хоулт, и др., 1997).

Среды культивирования. Бактериальные штаммы культивировали на синтетической среде N следующего состава (г/л): КН2РО4 - 1,0; КгНРСМЗНгО - 1,6; NaCl - 0,5; СаСЬ - 0,005; СоС12х6Н20 - 0,01; FeS04x7H20 - 0,005; pH ± 0,2. При добавлении агара до концентрации 1,5% получали агаризованную среду, которую использовали для хранения штаммов.

В качестве источника углерода для штаммов R. ruber gtl, R. erythropolis 11-2, Rhodococcus sp. AO и P. fluorescens C2 использовали глюкозу в конечной концентрации 0,1%. В качестве источника азота для штаммов R. ruber gtl и Rhodococcus sp. АО использовали ЮмМ NH4CI, для штамма R. erythropolis 11-2 и Р. fluorescens С2 - ацетонитрил в концентрации 0,05 и 0,5% соответственно. Источники углерода и азота для штамма A.faecalis 2 варьировали.

Чистоту культур отслеживали высевом на среду LB (Луриа - Бертани) состава (г/л): триптон - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; NaCl - 10,0; агар - 15,0.

Условия культивирования и определение ростовых характеристик. Клетки бактерий выращивали в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл, либо в 40 мл среды N в конических колбах объемом 100 мл на орбитальном шейкере при 120 об./мин и температуре 30°С. Бактериальный рост измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 с использованием 0,5 см кюветы. Рост культур бактерий оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при л=540 нм. Соответствие единицы ОП весу сухих клеток определяли для каждого штамма взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной биомассы из 1 мл суспензии известной ОП.

Определение активности нитригидратазы, амидазы и нитрилазы. Удельную активность фермента определяли как количество амида в мкмоль, образуемое за 1 минуту биомассой бактерий, соответствующей 1мг сухого веса. Единица нитрилгидратазной (нитрилазной) активности соответствует 1 мкмоль амида (карбоновой кислоты)/мг сухих клеток/мин, либо ммоль/г/ч.

Трансформацию нитрилов с использованием биомассы выделенных штаммов проводили в 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7.2, при начальной концентрации цианопиридина 50-800 мМ. Реакцию проводили при 30°С в течение 10 мин и останавливали добавлением концентрированной HCl до концентрации 2%. Пробы центрифугировали при 12 тыс. об/мин в течение 5 мин. Продукты реакции анализировали спектрофотометрически (>.=240 нм), методами газовой хроматографии и ВЭЖХ.

Газовую хроматографию продуктов трансформации алифатических нитрилов проводили на хроматографе Shimadzu GC-2014 (Япония), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм ("Реахим", Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата 190±3°С, температура испарителя 220±10°С. В качестве стандартов использовали растворы чистых нитрилов, амидов и карбоновых кислот.

Количественный анализ субстратов и продуктов реакции трансформации цианопиридинов проводили методом ВЭЖХ при использовании жидкостного хроматографа "Shimadzu LC-10A" (Япония), оснащенного диодной матрицей при длине волны 200 нм. Хроматографическая колонка Luna 5u С 18(2) 100А длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм была заполнена силикагелем (99% чистоты, диаметр 5 мкм). Условия проведения анализа: подвижная фаза 10 мМ раствор КН2РО4

и 25% ацетонитрила , скорость потока 1,25 мл/мин, давление 12 МРа, температура 25°С. Количественные данные были получены при сравнении со стандартной кривой известных концентраций исследуемых соединений.

Иммобилизация. В качестве носителей использовали активный уголь БАУ (ООО «Сорбент», Россия), карбонизированную углеродную ткань Урал ТМ-4 и активированный волокнистый углеродный материал Карбопон-В-актив (Светлогорское «Химволокно», Беларусь), носитель «Сапропель» активированный (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск; Институт проблем переработки углеводородов, Омск), уголь-сырец (Россия), каолин (Merck).

Иммобилизацию проводили путем инкубации носителей с клетками бактерий, находящимися в стационарной фазе роста. Инкубацию проводили в течение 30 - 120 минут на качалке со скоростью перемешивания 100 об/мин. Сорбенты отмывали 0,1 М фосфатным буфером (pH 7,2). Количество адсорбированных клеток определяли по разности оптической плотности (ОП540) культуральной среды до и после сорбции. Сорбционную емкость выражали в мг сухого веса клеток на г сорбента.

Определение величины адсорбции субстратов и продуктов реакции трансформации ароматических нитрилов. Носители инкубировали в 100 мМ растворе 3-цианопириднина и никотинамида и 10 мМ растворе никотиновой кислоты в течение 60-120 минут. Раствор отфильтровывали через фильтр «синяя лента» и центрифугировали при 13 тыс. об/мин в течение 7 мин на центрифуге 5415 D (Eppendorf). Концентрацию 3-цианопиридина, никотинамида и никотиновой кислоты определяли на жидкостном хроматографе "Shimadzu LC-10A" (Япония), величину адсорбции определяли по разности концентрации органических веществ до и после адсорбции и выражали в %.

Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция. Препараты хромосомной ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов (Гловера, 1988). Для этого колонии бактерий переносили в пробирки для микроцентрифугирования типа "эппендорф", ресуспендировали в 0,5 мл раствора SSC (NaCl 0,15 М, цитрат натрия 0,015 М, лизоцим 5 мг), выдерживали при 37°С в течение 30 мин. Добавляли 50 мкл 20 % раствора SDS, перемешивали и выдерживали в течение 10 мин при 65°С в твердотельном термостате "Термит" (Россия). Добавляли 0,5 мл фенола и центрифугировали при 13 тыс. об./мин в течение 10 мин. Супернатант (водную фазу) переносили в чистую микропробирку, добавляли равный объем (0,5 мл) хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 13 тыс. об./мин 3 мин. Водную фазу переносили в чистую микропробирку и добавляли равный объем изопропанола (0,5 мл), центрифугировали при 13 тыс. об./мин 3 мин. Полученную смесь выдерживали при -18°С в течение 1 ч и центрифугировали в течение 5 мин при 13ттыс.тоб./мин. Полученный осадок высушивали и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0).

ДНК грамотрицательных микроорганизмов получали следующим образом: полную петлю биомассы бактериальной культуры инокулировали в 100 мкл стерильной Н2О, выдерживали при 95°С в течение 15 минут в твердотельном термостате «Термит» (Россия).

Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Га^-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере ТЗ (Biometra, Германия). Олигонуклеотидные праймеры, разработанные с использованием баз данных GenBank по заданным последовательностям были синтезированы ООО «Евроген», Москва.

Олигонуклеотидные праймеры, специфичные к генам известных 16S рРНК, нитрилаз и амидаз были разработаны в соответствии с последовательностями 5' и 3'-концов генов амидаз, нитрилгидратаз и нитрилаз имеющихся в базе данных GenBank (таблица 1, 2) (Kim, et al., 2009, Kiziak, et al., 2005).

Режим амплификации для праймеров 16S рРНК Rhodococcus начальный цикл денатурации включал 1 минуту при 95°С и следующие 33 цикла: для Rhl/Rh2 - 95°С -30 с; 60°С - 30 с; 72°С - 70 с; для Rubl/Rub2 - 94°С - 20 с; 65°С - 30 с; 72°С - 60 с; для Rel/Re2 - 94°С - 30 с; 57°С - 60 с; 72°С - 60 с. Для праймеров Ps-for/Ps-rev: начальный цикл денатурации 5 минут при 95°С, следующие 40 циклов: 94°С - 30 с; 65°С - 60 с; 72°С - 70 с, завершающий цикл 10 мин при 72°С. Завершающий цикл для всех праймеров составлял 2 мин при 72°С.

Для универсальной 16S рРНК: начальный цикл денатурации 1 минута 10 с при 94°С, следующие 33 цикла: 94°С - 20 с; 62°С - 20 с; 72°С - 60 с, завершающий цикл 1 мин при 72°С.

Режим амплификации для праймеров Comt включал: начальный этап денатурации

- при 94°С 60 с; отжиг при 50°С - 60 с; элонгацию при 72°С - 80 с; (35 циклов) и завершающий этап 60 с при 72°С. Для праймеров NK22, AlcJM3 и Acidv режим амплификации состоял из начального этапа денатурации - 60 с при 94°С; отжига при 58°С - 60 с; элонгации при 72°С - 80 с; (35 циклов) и завершающего этапа - 60 с при 72°С.

Амплификацию с праймерами к генам амидаз AmiRhd проводили в следующем режиме: начальный этап денатурации - 1 мин при 94°С; денатурация, 94°С - 20 с; 54°С

- 30 с; 72°С - 60 с (33 цикла)

Для праймеров NPF ЕВС и NPF 5 режим амплификации был следующим: этапа денатурации - 60 с при 94°С; отжига при 62°С - 20 с; элонгации при 72°С - 60 с; и завершающего этапа - 60 с при 72°С. (24 цикла)

Для обнаружения ДНК использовали электрофорез в горизонтальном 0,8 % агарозном геле в трис-боратном буфере (89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, pH 8,0) при напряженности поля 5 В/см. Агарозные гели окрашивали раствором бромистого этидия (1-2 мкг/мл) в течение 15-20 мин и анализировали с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия). Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры lkb и 100 b (ООО «СибЭнзим»).

Секвенирование ДНК. Очистку ПЦР-продукта перед секвенированием осуществляли двумя способами:

1) с использованием смеси ферментов ExoSAPMix (Fermentas Life Sciences): Exonuclease I(Exo I) -1мкл, Shrimp Alkaline Phosphatase- 10 мкл, деионизованная вода-89 мкл. Обработка ПЦР-продуктов: 2 мкл ExoSAPMix на 25 мкл ПЦР-продукта. Инкубация при 37°С 40 минут, 85°С-15 минут;

2) путем гель-электрофореза с помощью аппарата E-Gel (Invitrogen) согласно инструкции фирмы-производителя.

Секвенирующую реакцию проводили в следующей реакционной среде: Big Dye Terminator (Applied Biosystems, США) -8 мкл, очищенный ПЦР продукт -1мкл, праймер-1мкл, деионизованная вода-10 мкл. Температурный режим секвенирующей ракции: 95°С- 1мин, 95°С-10 сек, 50°С-5 сек, 60°С-4 мин, 25 циклов.

После секвенирующей реакции проводили чистку и переосаждение образцов двумя методами:

1) с использованием Big Dye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США): 90 мкл SAM Solution+ 20 мкл Terminator на 20 мкл продукта. Полученную

смесь встряхивали на вортексе при 1200 об./мин в течение 30 мин., после чего осаждали центрифугированием;

2) к образцу (20 мкл) добавляли 2 мкл 7.5М ацетата аммония и 60 мкл 96% этанола. Выдерживали смесь в течение 20 мин при -18°С и центрифугировали 15 мин при 16000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 100 мкл 70% этанола, выдерживали в течение 2 мин. при комнатной температуре и центрифугировали 15 мин при 16000 об./мин. После переосаждения сливали надосадочную жидкость, осадок высушивали при 50°С, растворяли в 10 мкл смеси MegaBACE Loading Solution (70% формамид, 1% ЭДТА, 29% Н20) и анализировали нуклеотидную последовательность с помощью системы секвенирования ДНК MegaBACE 1000 (APBiotech).

Сравнительный анализ последовательностей ДНК. Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью пакета программ MegaBACElOOO и программы Chromas lite 2.1.

Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2.

Нуклеотидные последовательности гена 16S рРНК изучаемых изолятов сравнивали с нуклеотидными последовательностями типовых штамммов близкородственных видов из баз данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) и EzTaxon (http://www.eztaxon.org).

Определение параметров, характеризующих процессы роста бактериальных штаммов. Суспензию A. faecalis 2 выращивали в лунках 96-луночного полистеролового планшета в 150 мкл среды N с добавлением источников углерода и азота в различных сочетаниях и различных концентрациях (г/л): Среда 1: глюкоза 1, хлорид аммония 5,3 Среда 2: ацетат натрия 10, хлорид аммония 5,3 Среда 3: ацетат натрия 20, хлорид аммония 5,3 Среда 4: ацетамид 2,9 Среда 5: ацетамид 5,9 Среда 6: ацетамид 29,5 Среда 7: ацетонитрил 1 Среда 8: ацетамид 5,9, хлорид аммония 5,3 Рост суспензии оценивали по оптической плотности, измеренной при 540 нм на планшетном ридере Tecan infinite М200 pro (Швейцария). Параметры роста вычисляли следующим образом (Ждан-Пушкина, и др., 1983). Удельная скорость роста, ц

ц = dx/dt'1/x, где ц - прирост биомассы в единицу времени на единицу биомассы, х - начальная биомасса, мг/мл; t - время, ч

Урожай культуры - максимальное количество сухих клеток, мг в 1 мл среды Экономический коэффициент, У

У = (Х/С)100%, где X - количество образовавшейся биомассы, мг сухих клеток/мл, С - количество потребленного субстрата, мг/мл

Продолжительность лаг-фазы определяли по графику зависимости количества биомассы от времени роста.

Статистическая обработка. Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990).

Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office ХР Excel и Statistica 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Видовое разнообразие грамотрицательных бактерий активного ила и осадков БОС, утилизирующих ароматические нитрилы. На первом этапе работы были исследованы пробы активного ила, отобранного из аэротенков биологических очистных сооружений г. Перми (ООО «Новогор-Прикамье») в июне 2011 г. Было проанализировано видовое разнообразие бактерий активного ила биологических очистных сооружений, утилизирующих ароматические нитрилы.

Методом накопительных культур на синтетической минеральной среде с 3-цианопиридином в качестве единственного источника углерода и азота было выделено 40 изолятов грамотрицательных гетеротрофных бактерий. Выделенные изоляты обладали способностью к активному росту на агаризованной минеральной среде с 3-цианопиридином и не теряли эту способность при многократных пересевах, что говорит об их способности к утилизации этого соединения.

По-видимому, утилизация 3-цианопиридина происходит посредством его гидролиза до никотиновой кислоты с последующим ее окислением до фумаровой кислоты с включением последней в цикл Кребса (Behrman, et al., 1957, Hughes, 1955, Pinsiky, et al., 1952) (Рис.1).

3 - шшнопнрщш

N ™ -N'

никотиновая кислота б - гвдроксшшкопиовая 15-длпыроксш1нрпднн

+ О:

2.5 - диптлрокснпиридпн оксид аза

-NHj

+Н.О

'С'

НООС Н Н CI

фумаровая кислота малеиновая кслсга К-форышматенноБаякислота

Рис. 2. Метаболический путь утилизации 3-цианопиридина.

По результатам анализа секвенированых фрагментов гена 16S рРНК, изоляты с более чем 99% гомологией отнесены к родам Acinetobacter, Alcaligenes, Delftia, Ochrobactrum, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Xanthobacter (Табл. 1).

Для идентификации генов, кодирующих ферменты гидролиза нитрилов, проведен ПЦР-анализ 32 наиболее активно растущих изолятов с применением набора праймеров, специфичных к различным генам известных в настоящее время видов нитрилаз как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Также был использован один праймер, специфичный к гену амидазы.

Посредством ПЦР анализа было выявлено, что 13 изолятов имеют последовательности размером около 1070 п.н., гомологичные генам нитрилаз, ранее обнаруженных у А. faecalis JM3 GenBank, D13419.1. (Рис. 2, Табл.1). 12 из данных изолятов идентифицируются по 16S рРНК как Alcaligenes sp., 1 как Pseudomonas sp. Гомологии к другим генам известных нитрилаз и амидаз при ПЦР анализе обнаружено не было.

Таблица 1

Видовое разнообразие бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений, утилизирующих цианопиридины.

% сходства Количество Наличие

Изолят Типовой вид проверенных нуклеотидов нитрилаз, группы

8h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 100 853

13 Alcaligenesfaecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,88 852 1

12 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,77 860 I

2 3 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,11 99,77 856 856

11 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,77 853 1

4h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 882

9 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 847 1

13h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99.76 847

А6 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 825 1

9h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 844

A10 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 824 1

8 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,76 823

A8 2h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) Alcaligenesfaecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,75 99,75 811 810 1

3h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99.75 796

A7h Alcaligenes faecalis subsp^parafaecalis GT (AJ242986) 99,72 713

A7 Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99.70 673 1

A6h Alcaligenes faecalis subsp. parafaecalis GT (AJ242986) 99,57 797

1 Pseudomonas monteilii CIP 104883T (AF064458) 100 835

5 Pseudomonas monteilii CIP 1048837 (AF064458) 100 858

lh Pseudomonas monteilii CIP 104883T (AF064458) 100 844

5h Pseudomonas monteilii CIP 104883T (AF064458) 100 843

il Pseudomonasputida NBRC 14164T (APO13070) 100 820 2

A5 Pseudomonas monteilii CIP 104883T (AF064458) 100 636

A3 Pseudomonas monteilii CIP 104883T (AF064458) 100 606

12h Ochrobactrum anthropi ATCC 49188T ( CP000758) 100 858

visev Delfiia lacustris DSM 21246T ( EU888308) 100 854

osv 10h Alcaligenes aquatilis LMG 22996T ( AJ937889) Stenotrophomonas acidaminiphila AMX19T (AF273080) 100 99,89 568 870 2

4 Xanthobacter flavus 3 01T (X94199) 99,88 847

11h Acinetobacter guillouiae CIP 63.46T (APQS01000028) 99,17 846

Для более детального исследования генов нитрилаз было предпринято секвенирование полученных ПЦР-фрагментов. В результате анализа последовательностей секвенированных генов нитрилаз исследуемых изолятов установлено, что 8 из них содержат нитрилазу одного вида, а 5 (в том числе, Pseudomonas sp. il) - другого. Нуклеотидные последовательности генов нитрилаз внутри каждой группы были идентичны, а между группами гомология генов составляла 91,1% (Табл. 2), а сходство аминокислотной последовательности - 96,6% (Табл. 3).

Рис. 2. Электрофорез ПЦР-продуктов ДНК изолятов, соответствующих по размеру гену нитрилазы А. /аесаИз ШЗ.

Таблица 2

Сравнение нуклеотидной последовательности генов нитрилаз

А]саИ%епен /аесаНз (DI34I9.11 РьеисЛотопаз рШИа МТСС5110 Alcaligenes ар (ЕСи0401) МсаИ^епез ¡р. 12 А/са/^епея зр. А4Ь

А \caligenes /аесаШ (013419.1) Ю

РзеиАотапаз риМа МТСС5110 99,6% ГО

АкЫ^епев йр (ЕСШ401) 89,8% 89,4% ГО

А1саИ%епен эр 12 89,7% 89,3% 99,9% ГО

А1саН%епе$ яр А4Ь 94,3% 94% 91% 91,1% ГО

При сравнении с известными гомологичными генами, представленными в базе данных вепВапк, установлено, что нуклеотидная последовательность первого вида нитрилаз (обнаруженный у Л/са%еие.5 эр. 12 и др.) имеет набольший процент гомологии к таковой из Alcaligenes эр. ЕСШ401 (РЛ943638.1) и составляет 99,9%, при этом сам белок полностью идентичен. Последовательность гена нитрилазы другого

вида (обнаруженный у Ака^епех ер. А4Ь и др.), имеет наиболее близкое сходство с последовательностью 013419.1 из А./аесаШ (94,3%), что составляет 98,3% гомологии по белку (Табл. 2, Табл. 3).

Таблица 3

Сравнение аминокислотной последовательности нитрилаз

Alcaligenes faecalis (D13419.1) Pseudomonas putida MTCC 5110 Alcaligenes sp (ECU0401) Alcaligenes sp. 12 Alcaligenes sp. A4h

Alcaligenes faecalis (D13419.1) ID

Pseudomonas putida MTCC5110 99,6% ID

Alcaligenes sp (ECU0401) 89,8% 89,4% ID

Alcaligenes sp 12 89,7% 89,3% 99,9% ID

Alcaligenes sp A4h 94,3% 94% 91% 91,1% ID

Активность ферментов метаболизма нитрилов штаммов, выделенных из активного ила и осадков БОС г. Перми. Была изучена трансформация ароматических нитрилов и алифатических нитрилов и амидов выделенными изолятами. В качестве субстратов были использованы 3-цианопиридин, ацетонитрил, акрил- и ацетамид. Способность трансформировать нитрилы и амиды при росте на минимальной солевой среде обнаружена у 12 изолятов (Табл. 4).

Все 12 изолятов обладали амидазной активностью, которая составляла от 0,5 до 46,3 ммоль/г/ч. В их числе были обнаружены штаммы, способные трансформировать ароматические и алифатические нитрилы: АстеюЬааег эр. 11И и АкаПяепе.*; ер. ОБУ, нитрилгидратазная активность которых при трансформации 3-цианопиридина составила 4,4 и 0,4 ммоль/г/час соответственно. При использовании в качестве субстрата ацетонитрила полная конверсия субстрата наблюдалась за первые 4 часа реакции.

Таблица 4

Активность ферментов метаболизма нитрилов изолятов, выделенных из активного ила и осадков БОС г. Перми

Активность нитрилгидратазы (ммоль/г/час) субстрат реакции: 3-цианопиридин Активность амидазы (моль/г/час)

Изоляты субстрат реакции: ацетамид субстрат реакции: акриламид

Alcaligenes sp 2 0 7 -

Alcaligenes sp 2h 0 1 -

Alcaligenes sp 4h 0 2,4 -

Acinetobacter sp 1 lh 4,4 0,6 6,7

Pseudomonas sp A5 - - 0,5

Alcaligenes sp A6 0 3,1 -

Alcaligenes sp A7 - - 1,2

Alcaligenes sp A7h 0 0,5 -

Alcaligenes sp A8 0 46,3 -

Alcaligenes sp A10 - - 8,4

Pseudomonas sp il 0 1,4 -

Alcaligenes sp OSV 0,4 1,6 7,7

Не все изоляты, в которых были обнаружены гены метаболизма нитрилов, показали высокую активность нитрилутилизирующих ферментов при трансформации 3-цианопиридина. Однако, так как эти штаммы были выделены и способны расти при многократных пересевах на 3-цианопиридине как единственном источнике углерода и энергии, можно предположить, что они способны к утилизации цианопиридинов и включению их продуктов в дальнейший метаболизм, но лишь в физиологических концентрациях, увеличение которых приводит к ингибированию ферментативных систем.

Оптимизация условий культивирования новых штаммов нитрилутилизирующих бактерий. Для дальнейшего изучения был выбран изолят 2, идентифицированный методом 168 рРНК и по физиолого-биохимическим тестам как А. /аееаИ.$. Установлено, что данный изолят имеет ген нитрилазы, но, как следует из анализа способности к трансформации ароматических нитрилов и амидов, по-видимому, обладает всеми ферментами метаболизма нитрилов, в том числе и нитрилгидратазно-амидазной системой. При этом нитрилгидратаза и нитрилаза имеют низкие активности в сравнении с амидазой этого штамма.

Известно, что скорость роста, выход биомассы и синтез ферментов во многом зависят от субстрата, используемого для культивирования биотехнологически значимого штамма. Кроме того, до 60% стоимости продуктов микробной ферментации может приходиться на компоненты среды и прежде всего на источник углерода (Полтавская, и др., 2004). Поэтому необходимо оптимизировать среду культивирования бактериального штамма, который потенциально может быть интересен для биотехнологического производства, таким образом, чтобы внесенные источники углерода и азота давали максимальный выход активной биомассы.

При подборе оптимального состава среды для данного штамма были исследованы различные вещества в разных концентрациях в качестве источников углерода и азота. Для сравнения влияния различных источников углерода и азота на рост и определения их оптимальной концентрации устанавливали следующие параметры, характеризующие процессы роста культуры микроорганизмов: удельная скорость роста, урожай, экономический коэффициент, длительность лаг-фазы (Табл. 5).

Было подтверждено, что глюкоза не используется штаммом А. /аесаНя 2 в качестве источника углерода, что является типичным для представителей этого вида (Вейант и др., 1999). Как видно из таблицы 5, наилучшими субстратами для роста А. /аесаШ 2 являлись ацетамид как единственный источник углерода и азота; ацетат натрия (источник углерода) в сочетании с хлористым аммонием (источник азота).

Таблица 5

Зависимость ростовых параметров А./аесаШ 2 от источников углерода и азота

Источник углерода, г/л Источник азота, г/л Скорость роста (д, ч"1) Урожай (мг/мл) Эконм. коэффициент, % Длительно сти лаг-фазы (ч)

Глюкоза, 1 Хлористый аммоний, 5,3 0,13 ±0,02 0,23 ±0,10 - 15

Ацетат натрия, 10 Хлористый аммоний, 5,3 0,18 ±0,00 1,45 ±0,10 14,53 ± 0,18 21

Ацетат натрия, 20 Хлористый аммоний, 5,3 0,16 ±0,00 1,85 ±0,28 9,26 ± 1,43 33

Ацетат натрия, 20 Ацетонитрил, 1 0,01±0,00 0,06 ± 0,00 - 12

Ацетонитрил, 1 - 0,19 ±0,07 0,09 ± 0,06 - 30

Ацетамид, 5,9 - 0,19 ±0,01 1,56 ±0,08 26,54 ± 1,52 15

Ацетамид, 2,9 - 0,36 ± 0,01 0,28 ± 0,05 12,53 ±0,63 9

Ацетамид, 29,5 - 0,31 ±0,01 0,26 ± 0,04 0,89 ±0,14 18

Ацетамид, 5,9 Хлористый аммоний, 5,3 0,16 ±0,02 1,66 ±0,22 28,28 ±3,88 18

Ацетамид может использоваться в качестве единственного источника и азота и углерода. Оптимальной является концентрация 5,9 г/л. При данной концентрации продолжительность лаг-фазы составила 15 ч, скорость роста в логарифмической фазе, урожай и экономический коэффициент составили 0,19 ± 0,01 ч"1, 1,56 ± 0,08 мг/мл, 26,54 ± 1,52 % соответственно.

При использовании в качестве источника углерода ацетата натрия в концентрациях 10 и 20 г/л, и в качестве источника азота хлористого аммония в концентрации 5,3 г/л наблюдались высокие показатели роста культуры, схожие с таковыми при использовании ацетамида. Достоверных отличий при использовании 10 г/л и 20 г/л ацетата натрия не наблюдалось, скорость роста составила 0,18 и 0,16 ч"1, урожай 1,45 и 1,85 мг/мл соответственно. Однако продолжительность лаг-фазы была ниже при концентрации ацетата натрия 10 г/л, чем при концентрации 20 г/л, и составила 21 и 33 ч„ а экономический коэффициент был в выше - 9,26 и 14,53 % соответственно.

Таким образом, A. faecalis 2, обладающий амидазной активностью, гидролизует ацетамид до ацетата натрия, который в дальнейшем включается в метаболические пути. Ионы аммония, которые выделяются при гидролизе, служат источником азота для роста бактерий.

На основании результатов, полученных при изучении параметров роста штамма А. faecalis 2 на различных субстратах в микрообъемах, были выбраны наиболее оптимальные питательные среды для дальнейшего масштабирования эксперимента и определения амидазной активности штамма. При масштабировании культивирование проводили в 150 мл минеральной среды с 5,9 г/л ацетамида в качестве источника углерода и азота (1 вариант) и 10 г/л ацетата натрия в качестве источника углерода с 5,3 г/л хлорида аммония в качестве источника азота (2 вариант).

Нами было выявлено, что пик амидазной активности клеток, выращенных на ацетамиде, приходился на первые сутки выращивания и составил 0,32 мкмоль/мг/мин. Максимум активности был сопряжен с минимальным количеством клеток (1,08 мг/мл по сухой массе). Максимум накопления биомассы (11,27 мг сухих клеток/мл) наблюдали на пятые сутки выращивания, что было сопряжено с минимальной активностью фермента - 0,07 мкмоль/мг/мин. К концу эксперимента, на седьмые сутки, количество клеток уменьшилось до 5,42 мг/мл, а амидазная активность выросла до 0,173 мкмоль/мг/мин.

При выращивании клеток на ацетате натрия первые шесть суток наблюдалась примерно одинаковая активность со снижением до 0,036 мкмоль/мг/мин после трех суток роста. Также в это время наблюдался максимум накопления биомассы, равный 7,21 мг/мл. К седьмым суткам количество клеток снижалось до 0,83 мг/мл, а активность фермента достигала своего максимума - 0,32 мкмоль/мг/мин.

При сравнении двух источников углерода - ацетамида и ацетата натрия в качестве субстрата для роста клеток, можно сделать вывод, что биомасса при росте на ацетате натрия накапливается несколько быстрее, чем при росте на ацетамиде, достигая максимума на 3 и 5 сутки соответственно. Амидазная активность при росте клеток на ацетамиде достигает своего максимума в первые сутки роста, в отличие от активности клеток, выращенных на ацетате натрия, когда максимум достигается на 7-е сутки роста. Вероятнее всего, присутствие ацетамида в среде как единственного источника углерода и энергии индуцирует накопление и активность амидазы, необходимой для усвоения этого субстрата.

Трансформация 3-цианопиридина свободными клетками R. ruber gtl. Изучена динамика трансформации растворов 3-цианопиридина (50-800 мМ) свободными клетками R. ruber gtl, обладающими нитрилгидратазной активностью. (Рис. 3)

Время реакции (мин)

Рис 3. Конверсия 3-цианопиридина свободными клетками R.ruber gtl, 1- 3-цианопиридин, 2-никотинамид, А - 50 мМ, Б-100 мМ, В - 200 мМ, Г - 400 мМ, Д - 600 мМ, Е - 800 мМ.

Из рисунка 3 видно, что для образования никотинамида клетками R. ruber gtl концентрация 3-цианопиридина 200 мМ является оптимальной, т.к. в этом случае его конверсия наиболее эффективна. Во время конверсии раствора данной концентрации нитрилгидратазная активность свободных клеток составляет 21 мкмоль/мг/мин.

Интересно отметить, что при концентрации субстрата более 200 мМ количество образующегося никотинамида в пробе не превышает 20,0-26,0 г/л даже при увеличении времени реакции, после достижения данной концентрации в среде количество образующегося продукта с течением времени не увеличивается. Также было обнаружено, что клетки могут накапливать и цианопиридин, и никотинамид, что, вероятно, приводит к ингибированию нитрилгидратазы.

Скрининг носителей для иммобилизации клеток R. ruber gtl с целью использования в гетерогенном биокатализе ароматических нитрилов. Для иммобилизации каталитически активных клеток родококков и дальнейшего их использования в реакции трансформации цианопиридинов применяли метод адсорбции на твердом носителе. В качестве носителей для иммобилизации бактериальных клеток использовали БАУ, активированный углеродсодержащий материал Карбопон-В-актив, Сапропель активированный и карбонизированную вискозную ткань Урал ТМ-4.

Было показано, что для целей биокаталитической трансформации цианопиридинов более подходящим носителем для иммобилизации клеток R. ruber gtl является карбонизированная вискозная ткань Урал ТМ-4. При ее использовании в качестве носителя трансформация 200 мМ раствора 3-цианопиридина проходит более полно. При использовании в качестве носителей для иммобилизации клеток активированных адсорбентов (БАУ, карбопон-В-актив и Сапропель) не происходило эквимолярной

трансформации субстрата в продукты реакции, при этом активность клеток составила 0,4, 0,8 и 0,3 мкмоль/мг/мин соответственно (Рис. 4).

Время реакции (мин)

10 20 30 40 S0

Время реакции (мин)

10 20 30 40 50 Время реакции (мин)

30 45 60 75 90 105 120 Время реакции (мин)

Рис. 4. Конверсия 3-цианопиридина (200 мМ) клетками К.гиЪег иммобилизованными на: А - БАУ, Б - Карбопон-В-актив, В - сапропеле активированном, Г - материале Урал ТМ-4, 1- 3-цианопиридин, 2-никотинамид.

Следовательно, присутствие в гетерогенной системе активированного носителя влияет на концентрацию субстрата и продукта в реакционной среде. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты по адсорбции 3-цианопиридина и никотинамида на изученных носителях.

Определено, что на БАУ за 1 ч адсорбируется около 80% 100 мМ раствора НА и 90% 100 мМ раствора 3-цианопиридина. На карбопон-В-актив - 2 и 29% соответственно; на Сапропеле - 2 и 11% соответственно. Адсорбция субстрата и продуктов реакции на Урал ТМ-4 была минимальной. Таким образом, несмотря на то, что клетки родококков данного штамма, обладающие гидрофобной поверхностью, более эффективно адгезируются на активированных материалах, в качестве носителей для иммобилизации клеток в реакции трансформации ароматических нитрилов предпочтительнее использовать неактивированные адсорбенты, т.к. они не сорбируют субстрат и продукт реакции.

Показано, что наибольшую активность проявили свободные клетки родококков, которая при трансформации возрастающих концентраций 3-цианопиридина составила 6,5 - 79,5 мкмоль/мг/мин. Активность клеток, иммобилизованных на ткани Урал ТМ-4, составила от 2,8 до 30,9 мкмоль/мг/мин.

При трансформации 50-200 мМ растворов не наблюдалось больших различий между активностью свободных и иммобилизованных клеток. При конверсии 200-800 мМ растворов активность свободных клеток нарастала линейно с увеличением концентрации субстрата, тогда как возрастание активности иммобилизованных клеток было незначительно (Рис. 5).

Концентрация ЗЦП, ммоль/л

Рис. 5. Нитрилгидратазная активность клеток R. ruber gtl в реакции трансформации 3-цианопиридина. 1 - суспензия клеток, 2 — клетки иммобилизованные на ткани Урал ТМ-4.

Следовательно, при трансформации ароматического субстрата возрастают диффузионные ограничения, которые становятся более выраженными в гетерогенной системе. Эти затруднения массопереноса, возможно, проявляются при полислойной адсорбции, которая имеет место при иммобилизации клеток на активированных адсорбентах.

Трансформация 2-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluorescens С2. Проведена трансформация 2-цианопиридина до пиколинамида свободными и иммобилизованными на угле-сырце клетками R. ruber gtl; до пиколиновой кислоты свободными и адсорбированными на каолине клетками P. fluorescens С2. Определено, что нитрилгидратазная активность по 2-цианопиридину у иммобилизованных клеток R. ruber gtl была ниже, чем у свободных в 1.4-2.6 раза (Табл. 6). Динамика трансформации 2-цианопиридина иммобилизованными и свободными клетками R. ruber gtl показана на рисунке 6.

Таблица 6.

Активность суспензированных и иммобилизованных нитрилутилизирующих бактерий по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч

Образен

2-Ш1анопирилнн 4-п11анопиридин

R. ruber gtl, нитрилгнлратазная активность Суспензия 887.70+106.43 803.70 + 53.51

Иммобнлизо- 460.20 + 84.74 702.40 + 25.49 ванные клетки

P. fluorescens С2, нитрилазная активность

Суспензия 8.81 ± 1.18 19.63+ 1.65

Иммобилизо- 5.35+ 1.37 21.53 + 3.32

ванные клетки

Изучена возможность получения пиколиновой кислоты из 2-цианопиридина в одну стадию, без образования пиколинамида. В качестве катализатора данного процесса использовали клетки Р. Аиогезсепх С2 с высокой нитрилазной активностью.

Было установлено, что адсорбированные на каолине клетки трансформируют 2-цианопиридин с незначительно меньшей скоростью, чем свободные. (Табл. 6).

Время реакции (мин) Время реакции (мин)

Рис.6. Динамика трансформации 2-цианопиридина суспензией клеток R. ruber gtl (А) и клетками и адгезированными на угле-сырце (Б). 1 - 2-цианопиридин, 2 - пиколинамид.

Динамика трансформации 2-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками P.jluorescens С2 показана на рисунке 7.

Рис. 7. Динамика трансформации 2-цианопиридина суспензией клеток P. fluorescens С2 (А) и клетками, адгезированными на каолине (Б). 1 - 2-цианопиридин, 2 - пиколинамид.

Трансформация 4-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluorescens С2. Проведена трансформация 4-цианопиридина до изоникотинамида суспендированными и адсорбированными на угле-сырце клетками R. ruber gtl; до изоникотиновой кислоты суспендированными и адсорбированными на каолине клетками P. fluorescens С2. Нами не было выявлено достоверного снижения активности при иммобилизации клеток, либо оно было незначительным (Табл. 6). Динамика трансформации 4-цианопиридина иммобилизованными и свободными клетками R. ruber gtl и P. fluorescens С2 показана на рисунках 8 и 9.

Время реакции (мин) Время реакции (мин)

Рис.8. Динамика трансформации 4-цианопиридина суспензией клеток R. ruber gtl (А) и клетками, адгезированными на угле-сырце(Б). 1 - 4-цианопиридин, 2 - изопникотинамид.

г/л 16

2 3

Время реакции (ч)

2 3

Время реакции (ч)

Рис.9. Динамика трансформации 4-цианопиридина суспензией клеток P. fluorescens С2 (А) и

клетками, адгезированными на каолине (Б). 1 - 4-цианопиридин, 2 - изоникотинамид.

Ранее было установлено повышение нитрилгидратазной и нитрилазной активностей при трансформации акрилонитрила адсорбированными на углеродсодержащих носителях клетками тех же штаммов родококков и псевдомонад в сравнении с ферментативными активностями суспендированных клеток (Максимова, и др., 2010). При трансформации ароматических субстратов не было обнаружено возрастание нитрилгидролизующих активностей у иммобилизованных клеток. Следует отметить, что эффективность гетерогенного биокатализа во многом зависит от того, приводит иммобилизация клеток к ограничениям массопереноса или нет. Определенную роль в диффузионных затруднениях могут играть не только физико-химические характеристики носителя, но и химическая природа субстратов и продуктов ферментативной реакции. Можно предположить, что ароматические нитрилы, амиды и карбоновые кислоты в большей степени подвержены этим диффузионным затруднениям, чем алифатические. Для данного процесса были подобраны носители, которые позволили получить иммобилизованный биокатализатор, активность которого сохранялась либо незначительно снижалась по сравнению с суспендированными клетками.

Сравнивая трансформацию 2 и 4-цианопиридина клетками штаммов R. ruber gtl и P. fluorescens С2, можно заключить, что 2-цианопиридин является более сложным субстратом как для нитрилгидратазы, так и для нитрилазы, т.к. образует в водной среде эмульсию. Диспергированные частицы 2-цианопиридина, по-видимому, сначала адсорбируются клеточной стенкой бактерий и затем проникают в клетку, т.к. после смешивания суспензии бактерий с эмульсией дисперсная фаза не визуализируется.

Совместная конверсия 4-цианопиридина клетками R. ruber gtl, содержащими нитрилгидратазу, и R. erythropolis 11-2, обладающими амидазной активностью.

Как описывалось ранее, гидролиз нитрилов может быть осуществлен двумя способами: одно- и двустадийным. При двустадийном способе амид является промежуточным продуктом, который затем конвертируется в конечный, целевой продукт. В случае конверсии 4-цианопиридина целевым продуктом является изоникотиновая кислота, т.к. именно это соединение является промежуточным продуктом в синтезе противотуберкулезных препаратов группы гидразида изоникотиновой кислоты и промежуточным продуктом в синтезе антидепрессантов (фенкарол, оксилидин, ацеклидин).

Изучали возможность получения изоникотиновой кислоты при совместной трансформации 4-цианопиридина смешанной суспензией клеток двух штаммов нитрилутилизирующих бактерий: R. ruber gtl с высокой активностью нитрилгидратазы в сочетании с низкой амидазной активностью и R. erythropolis 11-2 с

выраженной амндазной активностью, в соотношении 1:9. Было показано, что при конверсии 50 мМ раствора 4-цианопиридина полный гидролиз происходил за первые 30 мин с образованием 88,1 мг изоникотинамида и 4 мг изоникотиновой кислоты. Основной вклад в трансформацию 4-цианопиридина до соответствующего амида, по-видимому, вносил штамм R. ruber gtl, обладающий высокой нитрилгидратазной активностью. Последующая конверсия амида в соответствующую карбоновую кислоту происходила за счет ферментативной системы клеток штамма R. erythropolis 11-2, активность амидазы которого была значительно выше. В результате в реакционной смеси возрастало количество изоникотиновой кислоты, которое через 180 мин реакции составило 23,2 мг в 20 мл (Рис. 10).

Рис. 10. Совместная трансформация 4-цианопиридина штаммами R. ruber gtl и Л. erythropolis 11-2: 1 - изоникотинамид; 2 - изоникотиновая кислота; 3-4-

цианопиридин.

Скорость конверсии была ограничена активностью амидазы, которая не превышала 10 ммоль/г/ч, что более чем на порядок ниже нитрилгидратазной.

При сравнении двух способов получения изоникотиновой кислоты было показано, что гидролиз цианопиридина нитрилазой штамма P. Jluorescens С2 более эффективен, т.к. его активность по данному субстрату превышает таковую амидазы штамма R. erythropolis 11-2 в два раза. Таким образом, пиколиновая и изоникотиновая кислота могут быть получены при гидролизе соответствующих цианопиридинов как суспендированными клетками штаммов P. Jluorescens С2, содержащими нитрилазу, так и совместной конверсией смешанной суспензией клеток штаммов R. ruber gtl и R. erythropolis 11-2, обладающими высокой нитрилгидратазной и амидазной активностью соответственно. Следует отметить, что в данном случае конверсия нитрилазой была предпочтительнее в результате ее более высокой активности по сравнению с амидазой.

ВЫВОДЫ

1. Из активного ила и осадков БОС выделено 40 изолятов, утилизирующих 3-цианопиридин как единственный источник углерода и азота. Изоляты идентифицированы методом 16S рРНК как представители родов Acinetobacter, Alcaligenes, Delftia, Ochrobactrum, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Xanthobacter. У 13 изолятов обнаружены гены нитрилаз, гомологичные A. faecalis JM3 GenBank, D13419.1.

2. Оптимизирована среда культивирования для штамма A. faecalis 2, проявляющего амидазную активность по отношению к пиридинзамещенным амидам. Среда представлена минеральной солевой основой с 5,9 г/л ацетамида в качестве единственного источника углерода и азота. Параметры роста на данной среде составляют: удельная скорость роста в лог-фазе - 0,19 ч"1, урожай - 1,56 мг/мл, экономический коэффициент - 26,54 %.

3. Определено, что при трансформации 3-цианопиридина, катализируемой свободными клетками R. ruber gtl, оптимальной концентрацией субстрата является 200 мМ, при этом нитрилгидратазная активность при конверсии 200 мМ растворов 2-, 3- и 4-цианопиридинов до пиколин-, никотин- и изоникотинамида составляет в среднем 887,7, 1260, 803,7 ммоль/г/ч соответственно.

4. Было установлено, что свободные клетки Р. ßuorescens С2 трансформируют 200 мМ растворы 2- и 4- цианопиридина до пиколиновой и изоникотиновой кислоты, проявляя нитрилазную активность 8,8, и 19,6 ммоль/г/ч.

5. Установлено, что трансформация цианопиридинов может осуществляться иммобилизованными клетками R. ruber gtl и Р. ßuorescens С2, причем неактивированные адсорбенты более предпочтительны для создания гетерогенных биокатализаторов, чем активированные, т.к. не сорбируют ароматические нитрилы и продукты их гидролиза. Максимальная активность R. ruber gtl по 3-цианопиридину при адгезии клеток на неактивированном носителе Урал ТМ-4 достигала 30,9 мкмоль/мг/мин, тогда как при адгезии на активированных носителях составляла от 0,3 до 0,8 мкмоль/мг/мин.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в гаданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Васильев, Д.М., Динамика трансформации 3-цианопиридина иммобилизованными и свободными клетками Rhodococcus ruber GT1 / Д.М. Васильев, Ю.Г. Максимова, В.А Демаков // Вестник уральской медицинской академической науки.-2011.-№4/1 (38).-С. 191-192.

2. Максимова, A.B. Гидролиз акрилонитрила и 3-цианопиридина клетками бактерий рода Rhodococcus / A.B. Максимова, Д.М. Васильев, М.В. Кузнецова, В.А. Демаков // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Биология. Химия. Фармация. Воронеж. -2012. -№11. - С. 111-115.

3. Максимова, Ю. Г. Биокаталитическая трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными и суспендированными клетками нитрил-утилизирующих бактерий / Ю.Г. Максимова, Д.М. Васильев, Г.В. Овечкина, В.А. Демаков // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2012. -Т. 8. - № 2. - С 54 - 58.

4. Максимова Ю. Г, Трансформация 2 и 4 цианопириднина свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирубщих бактерий / Ю. Г. Максимова, Д. М. Васильев, Г. В. Овечкина, А. Ю. Максимов, В. А Демаков // Прикладная биохимия и микробиология. - 2013. - Т. 49. - № 4. - С 358-363.

Публикации в других журналах и сборниках

5. Васильев, Д.М. Трансформация цианопиридинов иммобилизованными клетками бактерий. / Д.М. Васильев, Ю.Г. Максимова, В.А. Демаков // Симбиоз Россия 2011. Мат. IV Всеросс. с междунар. участ. конгр. студ. и аспир.-биол. Воронеж.-2011.-Т. 1.-С. 131-133.

6. Васильев, Д.М. Динамика трансформации 2- и 4- цианопиридина клетками штамма Pseudomonas fluorescens С2. / Д.М. Васильев, Ю.Г. Максимова, В.А. Демаков // Сборник трудов международной интернет - конференции Биотехнология. Взгляд в будущее. Казань. -2012. -Т.1. - С. 53 - 55.

7. Васильев Д.М. Разработка микробного биокатализатора для получения гетероциклических амидов и карбоновых кислот из цианопиридинов. / Д.М. Васильев // Материалы Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук. Ульяновск. - 2012. - Част. 2. - С. 191-193.

8. Васильев, Д.М. Получение изоникотиновой кислоты из 4-цианопиридина, катализируемое клетками актинобактерий рода Rhodococcus. / Д.М. Васильев, Ю.Г. Максимова, Г.В. Овечкина, В.А. Демаков // Материалы Международной конференции «Биология наука XXI века». М., - 2012. - С. 148-150.

9. Васильев Д.М. Бактерии активного ила и осадков БОС, утилизирующие ароматические нитрилы / Д.М. Васильев, Ю.А. Павлова, Ю.Г Максимова, В.А Демаков // Материалы VIII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». М., 2012. - С. 108-110.

Ю.Васильев, Д.М. Микробный синтез изоникотинамида и изоникотиновой кислоты / Д.М. Васильев, Ю.Г. Максимова, Г.В. Овечкина, В.А Демаков // Материалы V Всероссийского с международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых «Симбиоз-Россия 2012». Тверь. -2012. - С. 319-321.

П.Васильев, Д. М. Биологическое разнообразие нитрилутилизирующих бактерий активного ила и осадков сточных вод биологических очистных сооружений / Д. М. Васильев, Ю.Г. Максимова, В.А. Демаков, Г.В. Овечкина, Ю.А Павлова // Сборник тезисов VI Всероссийского с международным участием Конгресса молодых учёных-биологов «Симбиоз-Россия 2013». Иркутск. - 2013. - С. 65 - 66.

12. Maksimova, Y. G. Heterogeneous biocatalitic microbial transformation of aromatic nitrilesv [computer file]. / Y. G. Maksimova, D. M. Vasilyev, G. V. Ovechkina, V. A. Demakov // Abstracts of the 5th Congress of European Microbiologists FEMS 2013. -Leipzig, Germany. - 2013. - PDF 619.

ВАСИЛЬЕВ Дмитрий Михайлович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ЦИАНОПИРИДИНОВ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ

БАКТЕРИЙ

03.02.03. Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 04.03.14. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный.

Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Васильев, Дмитрий Михайлович, Пермь

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

04201457038 На правах рукописи

с:

ВАСИЛЬЕВ Дмитрий Михайлович

ТРАНСФОРМАЦИЯ ЦИАНОПИРИДИИОВ СВОБОДНЫМИ И ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ КЛЕТКАМИ НИТРИЛУТИЛИЗИРУЮЩИХ

БАКТЕРИЙ

03.02.03. Микробиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, д.м.н., профессор Демаков В.А.

Пермь-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Обзор литературы.............................................................................................................15

Глава 1 Трансформация ароматических нитрилов ферментативными системами микроорганизмов.........................................................................................15

1.1 .Метаболические пути конверсии нитрилов...............................................................15

1.2 Ферменты гидролиза нитрилов у микроорганизмов.................................................16

1.3 Практическая значимость ароматических карбоновых кислот...............................19

1.4. Способы получения карбоновых кислот - производных ароматических нитрилов..............................................................................................................................21

1.4.1 Химический синтез ароматических карбоновых кислот из нитрилов............21

1.4.2 Биокаталитический синтез ароматических карбоновых кислот из

нитрилов..........................................................................................................................24

1.5 Гетерогенные биокатализаторы. Способы иммобилизации клеток микроорганизмов................................................................................................................30

1.5.1 Связывание клеток микроорганизмов на поверхности нерастворимого носителя...........................................................................................................................34

1.5.2 Включение клеток микроорганизмов в структуру полимерного носителя ....36

1.5.3 Иммобилизация клеток микроорганизмов с использованием

мембранных технологий................................................................................................39

Экспериментальная часть..............................................................................................41

Глава 2. Объекты и методы исследования..................................................................41

2.1. Бактериальные штаммы..............................................................................................41

2.2. Выделение и идентификация нитрилутилизирующих бактерий............................41

2.3. Среды культивирования..............................................................................................42

2.4. Условия культивирования и определение ростовых характеристик.....................42

2.5. Определение активности нитригидратазы, амидазы и нитрилазы.........................42

2.6. Иммобилизация............................................................................................................44

2.7. Определение величины адсорбции субстратов и продуктов реакции трансформации ароматических нитрилов........................................................................44

2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция....................................................44

2.10. Секвенирование ДНК................................................................................................48

2.11. Сравнительный анализ последовательностей ДНК...............................................49

2.12. Определение параметров, характеризующих процессы роста бактериальных штаммов....................................................................................................49

2.13. Статистическая обработка........................................................................................50

Глава 3. Биоразнообразие цианопиридин - утилизирующих бактерий активного ила и осадков биологических очистных сооружений............................51

3.1. Видовое разнообразие грамотрицательных цианопиридин -утилизирующих бактерий активного ила и осадков БОС..............................................51

3.2. Поиск генов, кодирующих нитрилгидролизующие ферменты...............................53

3.3 Активность ферментов метаболизма нитрилов штаммов, выделенных из активного ила и осадков БОС г. Перми............................................................................57

3.4 Оптимизация условий культивирования новых штаммов

нитрилутилизирующих бактерий......................................................................................59

Глава 4. Трансформация цианопиридинов нитрилутилизирующими бактериями.........................................................................................................................66

4.1. Трансформация 3-цианопиридина свободными и иммобилизованными

клетками нитрилутилизирующих бактерий.....................................................................66

4.1.1 .Трансформация 3-цианопиридина свободными клетками R. ruber gtl...........66

4.1.2. Скрининг носителей для иммобилизации клеток R. ruber gtl с целью использования в гетерогенном биокатализе ароматических нитрилов...................71

4.1.3. Синтез концентрированного раствора никотинамида свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl................................................................77

4.1.4.Получение концентрированного раствора никотинамида при помощи клеток Rhodococcus sp. АО.............................................................................................78

4.2. Трансформация 2-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluorescens С2.........................................................................79

4.3. Трансформация 4-цианопиридина свободными и иммобилизованными клетками R. ruber gtl и P. fluor escens С2.........................................................................84

4.3.1. Совместная конверсия 4-цианопиридина клетками R. ruber gtl, содержащими нитрилгидратазу, и R. erythropolis 11-2, обладающими

амидазной активностью.................................................................................................88

Заключение........................................................................................................................91

Выводы...............................................................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................101

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время большое внимание уделяется разработке и внедрению биотехнологических методов синтеза разнообразных химических соединений. Способность ферментов трансформировать органические вещества в более мягких по сравнению с химическими процессами условиях (невысокие температура и давление) позволяет выделить биокаталитические технологии в число приоритетных направлений [69, 44, 39]. В биотехнологических производствах чаще всего используют целые микробные клетки, т.к. в этом случае не требуется проведение дорогостоящего процесса выделения и очистки фермента [38].

Основным природным источником пиридиновых соединений являются продукты коксования каменного угля. В химико-фармацевтическом производстве (З-пиколиновую фракцию (предшественник никотинамида и никотиновой кислоты), содержащуюся в коксовом газе, подвергают конденсации в жестких условиях под давлением с формалином. Присутствующую в ней у-пиколиновую

фракцию (предшественник изоникотиновой кислоты) отделяют формалином с последующей отгонкой и окислением азотной кислотой [29]. Также возможно прямое окисление ß-пиколина кислородом воздуха на ванадий-титановом катализаторе в температурном диапазоне 250-480°С, при этом в настоящее время чаще используют синтетический ß-пиколин [50, 30]. Известен также химический гидролиз цианопиридинов, который инициируется повышенной температурой и характеризуется неконтролируемой экзотермичностью [29,36]. Кроме того, никотиновую кислоту получают химическим синтезом, включающим стадию окисления 2-метил-5-этилпиридина, или гидролизом 3-цианопиридина при высоких температурах (330°С) и давлении (290 атм.) [41]. Биологический способ получения ароматических амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, основанный на ферментативном гидролизе, выгодно отличается от химического мягкими условиями проведения процесса, экологической безопасностью и высокой степенью конверсии.

Ферментативный гидролиз цианопиридинов до соответствующих амидов и карбоновых кислот осуществляется ферментами нитрилгидратазно-амидазной и нитрилазной систем микроорганизмов. Способность к трансформации ароматических нитрилов встречается как у представителей родов бактерий Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter, Agrobacterium, Microbacterium, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter [41,72,88,13], так и среди грибов родов Fusarium, Giberella, Aspergillus, Pinicillum, Talaromyces и др. [50,73]. Известны биотехнологические процессы, основанные на гидролизе алифатических нитрилов. Так, компанией «Биоамид» (г. Саратов, Россия) был внедрен процесс, заключающийся в биокаталитическом производстве акрилата аммония из нитрила акриловой кислоты штаммом Alcaligenes denitrificans С-32 -продуцентом нитрил азы (КФ 3.5.5.1) [37]. Крупнотоннажное производство акриламида основано на гидратации акрилонитрила клетками штамма R. rhodochrous J1 (Япония) [45] и штамма Rhodococcus rhodochrous М8 (Россия) [2], обладающими высокой нитрилгидратазной активностью. Промышленно

значимый штамм Я. гксхЛоскгот Л также применяется в биокаталитическом производстве никотинамида, тогда как в научной литературе не содержится сведений о биокаталитическом синтезе изоникотиновой и пиколиновой кислот с выходом на промышленный уровень.

Состояние вопроса

В последние десятилетия наблюдается неуклонное возрастание интереса к изучению свойств нитрилутилизирующих бактерий, что связано с их успешным применением в промышленных процессах получения акриламида и акрилатов, а также с большим потенциалом использования ферментативных систем этих микроорганизмов для трансформации нитрильных соединений в соответствующие амиды и карбоновые кислоты с высокой степенью хемо-, регио-и энантиоселективности [9].

Конверсия ароматических нитрилов в соответствующие амиды и карбоновые кислоты представляет большой практический интерес. Никотинамид и никотиновая кислота, образующиеся при конверсии 3-цианопиридина, входят в состав витамина РР, а амиды и карбоновые кислоты, образующиеся при

гидролизе 2- и 4-цианопиридина, являются промежуточными соединениями в процессах получения ряда фармацевтических препаратов.

Нитрильные соединения широко распространены в природе, главным образом, присутствуют в растениях в виде цианогликозидов, а также цианолипидов, цианоалкалоидов, рицина, фенилацетонитрила и др. Более 2000 видов растений накапливают цианогликозиды в семенах, корнях и листьях, а также секретируют нитрильные метаболиты в виде основного компонента экссудата ризосферы корней. Вероятно, этот процесс влияет на эволюцию и распространение микроорганизмов, способных к ассимиляции нитрилов [84]. Ряд работ посвящен биологическому разнообразию нитрилутилизирующих бактерий почвенной среды [10,3,23]. Имеющиеся сведения о распространенности нитрилутилизирующих бактерий в природе не затрагивают такую важную часть водной экосистемы, образующуюся на стыке хозяйственной деятельности человека и природной среды, как аэробный активный ил, который, как известно, является резервуаром штаммов микроорганизмов с большим биодеградативным потенциалом.

Микроорганизмы, утилизирующие нитрилы, были обнаружены среди представителей разных систематических групп, в частности, способность к гидролизу ароматических нитрилов встречается у представителей родов актино- и протеобактерий Rhodococcus, Nocardia, Agrobacterium, Microbacterium, Arthrobacter, Alcaligenes, Comamonas, Klebsiella, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter и др. [41, 13] , а также грибов Fusarium, Aspergillus, Giberella, Pinicillum [73].

Трансформация нитрилов микроорганизмами может происходить двумя различными ферментативными путями: 1) одностадийный гидролиз нитрилов до соответствующих карбоновых кислот и аммония с помощью фермента нитрилазы (КФ 3.5.5.1); 2) двустадийный катаболизм нитрилов, заключающийся в том, что нитрилы гидратируются до амидов нитрилгидратазой (КФ 4.2.1.84) и затем трансформируются до карбоновых кислот и аммония амидазой (КФ 3.5.1.4) [76].

На данный момент выделено большое количество штаммов бактерий, обладающих способностью к трансформации ароматических нитрилов и имеющих высокую специфичность к данным субстратам. Исследованы процессы трансформации 3-цианопиридина. В 1988 году был впервые исследован штамм R. rhodochrous J1, содержащий нитрилгидратазу и нитрилазу [85, 87]. М. Cantarella с соавторами опубликовали цикл работ, посвященных трансформации 3-цанопиридина при помощи нитрилутилизирующих ферментов клеток Microbacterium imperiale CBS 498-74 [55, 89, 43]. В 2006 г. S. Prasad с соавторами показали возможность конверсии 3-цианопиридина с помощью покоящихся клеток R. rhodochrous РА-34, содержащих нитрилгидратазу [94]. В 2006 г. N.N. Sharma и др. показали возможность получения никотиновой кислоты путем конверсии 3-цианопиридина нитрилазой из Nocardia globerula NHB-2 в одну стадию без образования никотинамида [89]. В 1999 г A. Qadreyah и др. показали возможность трансформации 3-цианопиридина до никотиновой кислоты термостабильной нитрилазой клеток Bacillus pallidus Dac521 [41].

Встречаются данные о конверсии 4-цианопиридинов. Так, в 2009 г М. Cantarella с соавторами изучили возможность получения изоникотинамида и изоникотиновой кислоты при биотрансформации 4-цианопиридина с помощью нитрилгидролизующих ферментов из Aspergillus niger К10 и Fusarium solani Ol [62].

В 2012 году N.N. Sharma с соавторами показали возможность получения изоникотиновой кислоты путем гидролиза 4-цианопиридина нитрилазой N. globerula NHB-2 [100].

Также М. Cantarella изучены процессы конверсии 3- и 4- цианопиридина в мембранном реакторе. Для проведения многостадийных режимов конверсии, применялись каскадные схемы с применением данных реакторов [62, 55, 43, 89].

Известны работы по трансформации цианопиридинов иммобилизованными клетками бактерий, причем в подавляющем большинстве случаев использован метод включения в структуру гелей.

Проведена трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными клетками бактерий R. equi A4 в структуре сополимера поливинилового спирта и полиэтиленгликоля [52]. Также была изучена возможность трансформации бензонитрила инкапсулированными в альгинате клетками R. rhodochrous [105]. В 2006 году О. Kaplan с соавторами показали возможность гидролиза 3- и 4-цианопиридина при помощи иммобилизованной нитрилазы гриба А. niger К10 [96]. Также изучена трансформация 4-цианопиридина при помощи целых клеток штамма N. globerula NHB-2, включенных в структура агара [50].

Тем не менее, практически не содержится сведений о разработке гетерогенного биокатализатора гидролиза цианопиридинов, основанного на адсорбционно иммобилизованных клетках бактерий, хотя адгезия является естественным процессом, не оказывающим отрицательного влияния на жизнеспособность и ферментативную активность клеток.

Основные задачи исследования:

2) Провести ПЦР-анализ и секвенирование генов ферментов метаболизма нитрилов (амидаз, нитрилаз).

Научная новизна.

Впервые изучено биоразнообразие нитрилутилизирующих

грамотрицательных бактерий активного

Информация о работе

Васильев, Дмитрий Михайлович
кандидата биологических наук
Пермь, 2014
ВАК 03.02.03

Диссертация

Трансформация цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилутилизирующих бактерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы