Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Различные подходы к накоплению биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации"

На правах рукописи

МАМЕДОВА ФАХРИЯ ТАХИР КЫЗЫ

РАЗЛИЧНЫЕ ПОДХОДЫ К НАКОПЛЕНИЮ БИОМАССЫ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ CHLORELLA VULGARIS И К ПРОЦЕССАМ ЕЁ БИОКАТАЛИТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

005570248

Москва-2015

005570248

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета

имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, Марквичева Елена Арнольдовна,

ведущий научный сотрудник, руководитель группы биокапсулирования лаборатории полимеров для биологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова

Российской академии наук

доктор биологических наук, профессор, Василов Раиф Гаянович,

начальник научно-технического комплекса Биоэнергетики Национального Исследовательского центра «Курчатовский институт»

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт катализа им. Г.К. Борескова Сибирского отделения Российской академии наук

Защита состоится « $ » июня 2015 года в 1500 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова (http://www.chem.msu.ru).

Автореферат разослан «Л?^» апреля 2015 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук ¿лу^ Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В современном мире в стадии масштабно внедряемых или только разрабатываемых находится большое количество различных технологий использования биомассы в энергетических и сырьевых целях. Согласно концепции устойчивого развития человечества, наибольшую практическую значимость представляют собой процессы, обеспечивающие получение коммерчески ценных продуктов за счет утилизации существующих отходов и трансформации возобновляемых видов сырья. При разработке таких биотехнологических процессов важно не только учитывать возможность получения различных целевых продуктов из используемой биомассы, но и организовать производство с минимальной нагрузкой на окружающую среду. Поиски продуктивных видов биомассы для биотехнологической конверсии выдвигают в разряд перспективных источников фототрофные микроорганизмы. Интерес к ним предопределяется в 20-30 раз более высокой скоростью накопления их биомассы в сравнении с традиционными сельскохозяйственными культурами, необходимостью использования в 10-30 раз меньших площадей для накопления 1 кг биомассы, при этом возможно использование земель, требующих рекультивации или непригодных для сельскохозяйственного культивирования [Моисеев И., 2009]. Клетки микроводорослей представляют собой источник углеводов, белков и липидов, которые могут быть подвергнуты дальнейшей биотехнологической трансформации в различные целевые продукты.

Известно, что некоторые микроводоросли входят в состав активного ила [Roudsari F.P., 2014] и могут использовать не только С02 в качестве основного источника углерода, но и органические соединения. Традиционные процессы очистки сточных вод с использованием активного ила характеризуются наличием ограничений по значениям исходных величин химического потребления кислорода (ХПК1) сточных вод. При этом в процессе очистки происходит накопление биомассы активного ила, которая, как правило, характеризуется непостоянством химического состава из-за исходной гетерогенности микробного состава, изменяющегося в процессе обработки сточных вод, что является существенным ограничением для возможностей ее дальнейшей трансформации в разнообразные целевые продукты. Таким образом, интересен не только сам факт очистки сточных вод, но и актуально получение альтернативных вариантов биомассы, применяемой для этой очистки с возможным последующим ее использованием в качестве сырья в различных биотехнологических процессах. Использование сточных вод, богатых биоорганическими соединениями, в качестве питательных сред для культивирования микроводорослей представляется перспективным, поскольку позволяет

1 Список используемых сокращений: ХПК - химическое потребление кислорода, МК - молочная кислота, ФК - фумаровая кислота, ЯК - янтарная кислота, ПГА - полигидроксиалконоаты, ПВС - поливиниловый спирт, ИБК - иммобилизованный биокатализатор, ВС - восстанавливающие сахара, ИЖ - ионная жидкость, Ц - целлюлазный комплекс (продуцент - Trichoderma viride), А - амилазный комплекс (продуцент - Aspergillus oryzae).

рассчитывать на объединение технологии биологической очистки водных ресурсов и накопления биомассы микроводорослей в качестве сырья для получения различных промышленных продуктов. Такой процесс может стать экономически обоснованным дополнением к традиционно используемому процессу очистки сточных вод на основе активного ила. Важным, с научной и практической точек зрения, является разработка и исследование новых биотехнологических процессов с использованием клеток микроводорослей в процессах очистки сточных вод и последующей трансформацией полученной таким образом возобновляемой биомассы в коммерчески значимые продукты.

Предварительная обработка биомассы является одной из ключевых стадий ее трансформации в различные целевые продукты. Гидролиз углеводных компонентов биомассы важен, так как позволяет получать среды, содержащие восстанавливающие сахара (ВС), конвертируемые на последующих стадиях биотехнологических процессов в разные химические соединения. В этой связи оптимизация процессов предобработки любой биомассы важна для ее дальнейшего эффективного использования.

Внимание к биоразлагаемым полимерным материалам, которые могут заменить полимеры, традиционно используемые и производимые химической промышленностью, постоянно растет. При этом наибольшей научной и практической актуальностью характеризуется получение таких полимерных материалов, мономерами или исходными соединениями для производства которых являются получаемые биотехнологическим способом органические кислоты - молочная (МК), фумаровая (ФК), янтарная (ЯК) (сам процесс полимеризации осуществляется химическим путем), а также полимерных материалов, получаемых биотехнологическим путем, например, полигидроксиалканоатов (ПГА), используемых для производства полимерных изделий. Актуальным является расширение сырьевой базы для их биотехнологического производства, главным образом, за счет использования возобновляемых источников сырья.

Иммобилизация клеток и их использование в качестве биокатализаторов в различных современных биотехнологических процессах экологической направленности на многочисленных примерах подтвердили своё преимущество и перспективность применения за счёт упрощения технологического оформления процессов с их участием, возможности их длительного хранения и многократного использования с улучшением основных характеристик процессов (продуктивности, выхода продукта и т.д.). Криогель поливинилового спирта (ПВС) оказался одним из наиболее перспективных носителей для иммобилизации клеток различных микроорганизмов, применяемых в различных биотехнологических процессах [Lozinsky V.l., 1998]. Особый научный интерес представляет исследование возможности получения новых высокоэффективных иммобилизованных биокатализаторов (ИБК) с использованием этого носителя, изучение их свойств и определение условий их эффективного использования.

Результаты анализа актуальных задач и перспективных направлений исследований легли в основу формирования цели и задач работы.

Целью данной работы являлось исследование различных подходов к накоплению биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris и к процессам её биокаталитической трансформации в органические кислоты (мономеры для получения биоразлагаемых полимеров) и биполимеры в виде ПГА.

В ходе работы решались следующие основные задачи:

- разработать эффективный способ накопления биомассы свободных клеток микроводорослей С. vulgaris, совместив его с заменой традиционно используемых сред на сточные воды разного состава;

усовершенствовать подходы к предобработке биомассы микроводорослей С. vulgaris для получения сред с максимально высокими концентрациями ВС, получаемых из углеводных компонентов биомассы в результате их гидролиза;

определить наиболее эффективные подходы к получению органических кислот путём оптимизации условий применения иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus в процессах биотрансформации ВС, содержащихся в гидролизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris, в МК и ФК;

- разработать биокатализатор в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий Actinobacillus succinogenes и оптимизировать условия его использования для получения ЯК в процессах конверсии ВС, содержащихся в гидролизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris;

- установить возможность получения ПГА с использованием клеток Cupriavidus necator при их культивировании в гидролизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris.

Научная новизна работы. Разработан оригинальный способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов путем их иммобилизации в криогель ПВС, обеспечивающий продолжительное хранение клеток (не менее 1,5 лет) при сохранении у них пролиферативной функции на 9СН-95 %. Действенность способа проверена в отношении 12 культур фототрофных микроорганизмов.

Показано, что применение высококонцентрированного иммобилизованного инокулята позволяет увеличить скорость процессов очистки сточных вод и накопления биомассы микроводорослей С. vulgaris для ее трансформации в различные целевые продукты.

Впервые показано, что для получения максимальной концентрации ВС в гидролизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточных водах, необходимо использовать комбинированную обработку клеток: механическую деструкцию и ферментативный гидролиз с использованием ферментных препаратов класса целлюлаз и амилаз.

Установлены оптимальные условия применения иммобилизованных клеток мицелиальных грибов рода Rhizopus для биотрансформации ВС, содержащихся в ферментолизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris, в МК и ФК.

Предложен подход к утилизации биомассы мицелиальных грибов рода Rhizopus, многократно использованных в процессах получения органических кислот, с применением методов метаногенеза и быстрого пиролиза (500°С,

5 мин) с получением, соответственно, метана и пиролизной нефти. Показана возможность увеличения выхода метана с 41,4±1,3% до 61,3±1,9% при обогащении биомассы мицелиальных грибов биомассой микроводорослей С. vulgaris. Установлено присутствие длинноцепочечных нитрилсодержащих соединений в образцах пиролизной нефти, которые можно рассматривать в качестве перспективных компонентов высокоэнтальпийного топлива.

Впервые установлено, что для биотехнологического получения ПГА с применением в качестве продуцентов клеток бактерий С. necator (с накоплением полимера в клетках до 59,57±1,75%) могут быть использованы гидролизаты биомассы микроводорослей С. vulgaris.

Практическая значимость работы. Разработанный способ получения иммобилизованного высококонцентрированного инокулята может быть использован не только для ускоренного накопления биомассы клеток фототрофных микроорганизмов непосредственно после его размораживания, но и применен при хранении данных микроорганизмов в мировых коллекциях, заменив менее эффективные традиционно используемые методы.

Установлено, что применение иммобилизованного инокулята на основе клеток микроводорослей С. vulgaris возможно для обработки сточных вод различного химического состава с целью значительного снижения уровня ХПК. Такая предобработка стоков перед их подачей на основные очистные сооружения может позволить избежать необходимости их разбавления с увеличением объёма для достижения уровня ХПК, приемлемого для использования аэробного активного ила.

Разработан оригинальный высокоэффективный биокатализатор в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий A. succinogenes для получения ЯК, позволяющий значительно расширить спектр возможных источников сырья (биомассы фототрофных микроорганизмов, макроводорослей, целлюлозосодержащих отходов) для получения ЯК.

Обобщение полученных результатов может быть использовано при создании биотехнологического комплекса, сочетающего в себе эффективные биокаталитические процессы, направленные на накопление биомассы микроводорослей, сопряженное с очисткой сточных вод различного состава, и проведение трансформации ее гидролизатов в различные целевые продукты в виде природных полимеров (ПГА) или мономеров (МК, ФК, ЯК) для синтеза биоразлагаемых полимеров.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Подход к накоплению биомассы микроводорослей С. vulgaris в сточных водах, основанный на использовании концентрированного инокулята в виде клеток, иммобилизованных в криогель ПВС.

2. Разработанный способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов путем их иммобилизации в криогель ПВС, обеспечивающий продолжительное хранение клеток.

3. Разработанный биокатализатор в виде иммобилизованных клеток A. succinogenes для получения ЯК из различных субстратов.

4. Условия предобработки биомассы микроводорослей С. vulgaris,

обеспечивающие максимальный уровень накопления ВС в среде.

5. Способы получения органических кислот (МК, ФК, ЯК) и ПГА при конверсии ВС, содержащихся в ферментолизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris.

Личный вклад автора состоял в критическом анализе литературных данных, планировании, подготовке и проведении экспериментов, обобщении и обсуждении полученных результатов, участии в подготовке публикаций и в популяризации полученных результатов в форме докладов на международных и российских научных конференциях различного уровня.

Апробация работы. Результаты диссертации были представлены на 8 научных форумах, в том числе: XII Ежегод. междунар. молод, конф-ции «ИБХФ РАН-ВУЗы» (Россия, Москва, 2012); Internat, symposium of marine enzyme and polysaccharides (Vietnam, Nha Trang, 2012), V Междунар. науч.-практ. конф-ции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (Россия, Ростов-на-Дону, 2013); Internat, conf. «Biocatalysis-2013: Fundamentals and Applications» (Россия, Москва, 2013), Междунар. конф-ции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Россия, Казань, 2013), Междисциплин, науч. форуме Moscow Science Week (Россия, Москва, 2014); Рос. конф-ции «85 лет: Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова 1929-2014» (Россия, Москва, 2014), I Междунар. конф-ции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов (Россия, Новосибирск, 2014).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи в журналах из Перечня ВАК, 1 Патент РФ на изобретение и 9 тезисов на международных и российских конференциях.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 176 страниц печатного текста, включая 50 рисунков, 36 таблиц, 221 ссылку.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Экспериментальная часть

Объекты исследования. В работе использовались клетки зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris С-1, С. vulgaris С-2, С. vulgaris С-7, С. vulgaris С-75, С. vulgaris С-82, Nannochloropsis sp. штамм rsemsu-N-1, Chlamydomonas sp., Chlorococcum sp., Cosmarium sp., Dunaliella salina Teod. штамм rsemsu-D-1, клетки красных микроводорослей Galdieria partita Sentz. штамм rsemsu-G-3, Haematococcus pluvialis, клетки диатомовых микроводорослей Thalassiosira weissflogii, клетки цианобактерий Arthrospira /Spirulina platensis (NORDST.) GEITL. штамм 1/02-П, Nostoc sp., Gloeotrichia echinulata. Клетки были получены из Коллекции института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Коллекции института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Коллекции Биологического и Географического факультетов МГУ имени М.В. Ломоносова. В работе использовались штаммы мицелиальных грибов Rhizopus oryzae F-814, R. oryzae F-1032, полученные из Всероссийской коллекции промышленных

микроорганизмов, а также штаммы бактерий Actinobacillus succinogenes В-10111, Cupriavidus necator В-8619, полученные из ВКПМ и Photobacterium phosphoreum №311 КМ МГУ, полученные из Коллекции микроорганизмов МГУ [Куц В.В., 2009].

Коммерческие препараты ферментов: целлюлазный комплекс из клеток Trichoderma viride (Sigma), ферментный комплекс, содержащий а-амилазу, из клеток Aspergillus oryzae (Sigma).

Методы исследования. Получение образцов иммобилизованных в криогель ПВС клеток микроорганизмов проводилось путем смешивания раствора ПВС с суспензией клеток фототрофных микроорганизмов, бактерий или спор мицелиальных грибов и дальнейшем замораживании/оттаивании сформированных гранул из полученной смеси. Формирование иммобилизованных мицелиальных грибов проводилось на глюкозосодержащей среде согласно известному способу [Спиричева О.В., 2006].

Определение ВС проводилось по методу Шомоди-Нельсона [Синицын А.П., 1995]. При определении состава основных биоорганических компонентов биомассы клеток микроорганизмов экстракция липидов проводилась по методу Фольша [Folch J., 1957], определение содержания липидов проводилось спектрофлуорометрически (по взаимодействию с флуоресцентным красителем Нильский красный). Экстракция и определение содержания белка проводились согласно известному способу [Досон Р., 1991]. Определение общего содержания углеводов проводилось с использованием фенольного метода [Dubois М., 1956]. Определение ХПК проводилось бихроматным методом [Dubber D., 2010]. Экстракция и определение внутриклеточного содержания ПГА проводились согласно известному способу [Мышкина B.JL, 2010]. Для определения концентрации МК, ФК, ЯК и глюкозы использовались стандартные ферментативные наборы. Определение концентрации муравьиной кислоты, фурфурола и оксиметилфурфурола проводилось с использованием метода ВЭЖХ на хроматографе Knauer Smartline Pump 1000 с УФ-детектором. Оценка токсичности сред проводилась согласно разработанному способу с использованием иммобилизованных клеток фотобактерий Р. phosphoreum [Ефременко E.H., 2010].

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывались средние значения и значения стандартных отклонений. Все эксперименты проводились не менее, чем в трех повторностях.

Результаты и обсуждение 1. Исследование процесса накопления биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris в сточных водах разного состава

Культивирование свободных клеток микроводорослей С. vulgaris в сточных водах

С целью выбора штамма с высокой удельной скоростью роста и высокими значениями продуктивности (скорости) процесса по биомассе (Qc) на примере 5 культур был проведен скрининг и изучены кинетические

параметры процесса накопления биомассы различных образцов клеток микроводорослей С. vulgaris в традиционно применяемой среде Тамийя [Tamiya Н., 1953] с добавлением 5 г/л глюкозы. В результате был отобран штамм С. vulgaris С-1, удельная скорость и продуктивность по биомассе которого в указанной среде составили 0,42±0,02 сут"1 и 306±10 мг сух. в-в/л/сут. Именно этот штамм использовался в дальнейших экспериментах. Для проведения исследований по накоплению биомассы были выбраны наиболее распространенные и значимые с практической точки зрения разновидности сточных вод: пищевого производства, агропромышленного комплекса и бытовых стоков (Таблица 1).

Таблица 1 — Состав сточных вод, используемых для культивирования микроводорослей С. vulgaris_

Сточная вода Состав, мг/л

№1 Модельная питательная среда, имитирующая бытовые стоки рЧореш I., 2001] ХПК - 620, CO(NH,), - 91,7. CH,C00Nax3H,0 -131,6, триптон — 17,4, дрожжевой экстракт — 52,2, крахмал - 122,0, молочный порошок — 116,2, масло подсолнечное - 29,0, NH4C1 - 12,8, MgHP04x3H20 - 29,0, КН2Р04 - 23,4, FeS04x7H20 - 5,8, раствор микроэлементов - 1 мл. Раствор микроэлементов содержит: Cr(N03)3x9H20 - 770, CuC12x2H20 -536, MnS04xH20 - 108, NiS04x6H20 - 336, РЬС12 -100, ZnCl2-208 (pH 7,1)

№2 Модельная питательная среда, имитирующая стоки пищевой промышленности [ЯетЬоЫ В., 2012] ХПК — 1644, сахароза — 1282, крахмал — 173.6. СаС12 - 185,0, MgS04x7H20 - 252,8, K2S04 -1062,7 NaHC03 - 128,9, FeCl3x6H20 - 7,1, KH2P04 — 17,5, (NH4)2S04 - 72,3, раствор микроэлементов — 1 мл. Раствор микроэлементов содержит: MnS04xH20 - 350,9, ZnS04x7H20 - 879,7, CuC12x2H20 - 268,2, СоС12 - 44,1, Na2B4O7xl0H2O - 352,8, Na2Mo04x2H20 - 25,2, NiN03x6H20 -346,9 (pH 7,0)

№3 Реальные стоки Совхоза Декоративного Садоводства (г. Москва) ХПК - 990, N-NH4 - 41.4. N общ - 52.5 : P общ -8,8 (pH 7,2)

№4 Реальные стоки Останкинского Молочного Комбината (г. Москва) ХПК -1610, N-NH4 - 34.6. N общ - 61.5. P общ -10,6 (pH 7,6)

После 13 сут культивирования клеток при исходной их концентрации Сбмо=0,10-И),14 г сух. в-в/л во всех использованных видах сточных вод наблюдалось накопление биомассы микроводорослей С. vulgaris в

концентрациях более 0,55±0,02 г сух. в-в/л. Было отмечено, что интенсивность роста клеток С. vulgaris зависит от состава сточных вод и от исходной концентрации клеток в среде. Скорость роста клеток увеличивалась при достижении их концентрации в среде 0,2^0,4 г сух. в-в/л. В связи с этим далее была исследована кинетика накопления клеток С. vulgaris в сточных водах при исходной концентрации биомассы Сбмо = 0,4 г сух. в-в/л. При этом в зависимости от среды прирост биомассы составил 0,6-^1,7 г сух. в-в/л, средняя скорость накопления биомассы Qc = 75-^-210 мг сух. в-в/л/сут (Рисунок 1). При этом уровень ХПК сред был снижен в 2-^8 раз, скорость снижения ХПК составила в зависимости от среды 51-И 79 мг/л/сут.

Рисунок 1 — Средняя скорость накопления за 8 сут биомассы клеток С. vulgaris в сточных водах №1 - №4 (см. Таблицу 1) при исходной концентрации клеток С. vulgaris в среде 0,4 г сух. в-в/л

Был проведен анализ состава основных биоорганических компонентов биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на среде Тамийя и в указанных выше сточных водах (Таблица 2).

Таблица 2 - Состав основных биоорганических компонентов биомассы клеток С. vulgaris, накопленной в различных средах __

Среда Липиды,% Белки, % Углеводы, %

Тамийя 16,5±1,7 7,0±0,8 55,6±4,3

Сточная вода № 1 22,5±1,0 9,3±0,4 50,7±2,2

Сточная вода №2 17,1 ±0,9 9,9±0,5 55,5±2,5

Сточная вода №3 26,1±1,2 7,7±0,4 51,4±2,1

Сточная вода №4 18,4±0,9 12,4±0,6 52,3±2,2

Было установлено, что во всех случаях культивирования в сточных водах так же, как и на «классической» среде Тамийя, биомасса клеток С. vulgaris характеризовалась практически одинаковым достаточно высоким содержанием углеводов (50-^55 % сухого веса). Это делает такую биомассу весьма привлекательным субстратом для дальнейшей биокаталитической трансформации клетками микроорганизмов в различные значимые продукты, а указанные виды сточных вод - пригодной средой для накопления биомассы микроводорослей С. vulgaris, богатой углеводами.

Одним из вариантов оптимизации исследуемого процесса, с точки зрения получения максимальной скорости накопления биомассы и скорости

снижения ХПК сред, было решено попробовать использовать в качестве инокулята иммобилизованные клетки микроводорослей в исходно более высокой концентрации.

Влияние иммобилизации клеток микроводорослей С. vulgaris на процесс накопления их биомассы

Был разработан способ иммобилизации клеток микроводорослей С. vulgaris в криогель ПВС при -70°С, обеспечивающий сохранение способности к пролиферации клеток на 95±3%. Был определен наиболее эффективный исходный состав суспензии клеток в растворе полимера для получения иммобилизованного препарата: 4% (по сухим веществам) биомассы в 7% растворе ПВС в среде Тамийя.

Была исследована возможность многократного использования разработанного иммобилизованного инокулята для накопления биомассы клеток микроводорослей С. vulgaris в сточных водах различного состава путем замены питательной среды на свежую (Рисунок 2). Показано, что за 1 цикл при оптимизированной концентрации иммобилизованных клеток, используемых в качестве инокулята (1,2 г сух. в-в/л), может быть получено в зависимости от среды культивирования до 0,6-4,7 г сух. в-в/л биомассы микроводорослей со средней скоростью накопления Qc=203^-557 мг сух. в-в /л/сут, а ХПК - снижено в 2-^8 раз со средней скоростью снижения 139^-479 мг/л/сут. За 4 цикла использования иммобилизованного инокулята показатели Qc снижались не более, чем на 12-ИЗ %.

Рисунок 2 - Средняя скорость накопления биомассы свободных клеток С. vulgaris в сточных водах №1 - №4 при концентрации

внесенных во все среды иммобилизованных клеток С. vulgaris 1,2 г сух. в-в/л (■ - 1 -ый, □ -2-ой, □ - 3-ий, К - 4-ый цикл культивирования)

Анализ состава основных биоорганических компонентов биомассы показал его идентичность составу биомассы, накопленной при использовании в качестве инокулята свободных клеток С. vulgaris (Таблица 3).

Таблица 3 — Состав основных биоорганических компонентов биомассы клеток С. vulgaris, накопленной в сточных водах в результате культивирования иммобилизованных клеток С. vulgaris___

Сточная вода Липиды, % Белки, % Углеводы, %

№1 20,8±1,4 10,3±0,7 49,1±2,8

№2 19,8±0,8 8,4±0,4 54,8±2,1

№3 24,5±1,0 8,5±0,8 52,7±3,0

№4 20,1±0,9 13,5±0,9 50,3±2,7

Таким образом, был продемонстрирован новый подход к быстрому и продуктивному накоплению биомассы свободных клеток микроводорослей в среде сточных вод при использовании оригинального иммобилизованного инокулята.

2. Выбор способа гидролиза полисахаридов, входящих в состав биомассы микроводорослей С. vulgaris

Был проведен сравнительный анализ эффективности различных способов предобработки биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточных водах, с целью получения максимальной концентрации ВС, в том числе глюкозы, из углеводных компонентов биомассы (Таблица 4). При проведении кислотной обработки максимальный выход ВС (76,13±2,41%) может быть получен при проведении кислотного гидролиза в среде с 1,2 н H2SO4 в течение 25 мин при повышенных температуре и давлении с предварительной механической дезинтегрирацией клеток С. vulgaris на шаровой мельнице в течение 4 мин. Но оказалось, что в полученных гидролизатах присутствовали муравьная кислота (0,21 г/л), оксиметилфурфурол (0,28 г/л) и фурфурол (0,06 г/л), токсичные для микробных продуцентов. В этой связи такие гидролизаты могут использоваться для целей химической промышленности.

Оптимальным, с точки зрения получения максимальных выходов ВС и глюкозы при гидролизе полисахаридов биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточных водах, можно считать подход, сочетающий последовательно метод её механической деструкции в течение 4 минут на шаровой мельнице и метод её ферментативной обработки в подобранных условиях (рН 5,5, 37°С, с использованием ферментных препаратов класса целлюлаз (8 мг/г сух. в-в биомассы) и амилаз (2 мг/г сух. в-в биомассы) (Таблица 4).

Анализ токсичности полученного ферментолизата с использованием чувствительных к токсикантам клеток фотобактерий P. phosphoreum показал его нетоксичность для клеток микроорганизмов.

С целью получения высококонцентрированных растворов ВС было исследовано влияние начальной концентрации в среде механически дезинтегрированной биомассы микроводорослей С. vulgaris (Сбмо) на эффективность ферментативного гидролиза (Таблица 5).

Из полученных данных следовало, что в целом при увеличении исходной концентрации биомассы конечная концентрация ВС в гидролизате увеличивалась. Однако с увеличением концентрации биомассы от 100 до 120 г сух. в-в/л наблюдаемого повышения максимальной концентрации ВС уже практически не происходило. Таким образом, оказалось, что для ферментативного гидролиза в подобранных условиях целесообразно использовать биомассу микроводорослей С. vulgaris в начальных концентрациях до 100 г сух. в-в/л, так как при этом возможно достижение наибольших значений конечной концентрации ВС, а полученный нетоксичный гидролизат может быть рекомендован для использования на последующих стадиях биотехнологических процессов биотрансформации сырья в различные продукты с помощью биокатализаторов.

Таблица 4 - Основные показатели различных способов предобработки биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточной воде №2 (Сбмо~ 20 г сух, в-в/л, Сугл= 4,1 г/л)*______

№ Способ предобработки Свс, г/л Сгл, г/л YBC,% УГл,% Qbc, г/л/ч Qui, г/л/ч

1 Кислотный гидролиз и термолиз (1,2н НС1 25 мин, 121 °С, 1 ати) 6,86±0,25 2,30±0,07 61,80±2,20 20,72±0,59 16,33±0,60 5,48±0,17

2 Кислотный гидролиз и термолиз (1,2н Н2804 45 мин, 121 °С, 1 ати) 7,71±0,27 3,38±0,08 69,46±2,39 30,45±0,71 10,28±0,36 4,51 ±0,11

3 Механическая деструкция (4 мин) + Кислотный гидролиз и термолиз (1,2н Н2804 25 мин, 121 °С, 1 ати) 8,45±0,27 4,55±0,12 76,13±2,41 40,99±1,09 20,12±0,64 10,83±0,29

4 Ферментативный гидролиз (20 ч, 37 °С, рН 5,5): Ц (8 мг/г сух. в-в биомассы) + А (2 мг/г сух. в-в биомассы) 2,98±0,09 1,43±0,04 26,85±0,82 12,88±0,39 0,15±0,01 0,07±0,01

5 Термолиз (0,5 ч, 108 °С, 0,5 ати) + Ферментативный гидролиз (20 ч, 37 °С, рН 5,5): Ц (8 мг/г сух. в-в биомассы) + А (2 мг/г сух. в-в биомассы) 8,35±0,26 5,88±0,16 75,23±2,33 52,97±1,42 0,37±0,01 0,29±0,01

6 Обработка ИЖ 1Втнп]С1 (1 ч, 120 °С) + Ферментативный гидролиз (20 ч, 37 °С, рН 5,5): Ц (8 мг/г сух. в-в биомассы) + А (2 мг/г сух. в-в биомассы) 5,72±0,18 3,83±0,11 51,53±1,61 34,50±1,02 0,32±0,01 0,21±0,01

7 Механическая деструкция (4 мин) + Ферментативный гидролиз (20 ч, 37 °С, рН 5,5): Ц (8 мг/г сух. в-в биомассы) + А (2 мг/г сух. в-в биомассы) 9,87±0,34 7,98±0,22 88,92±3,12 71,89±2,01 0,49±0,02 0,40±0,01

* СБМ0- исходная концентрация биомассы, г сух. в-в/л, СУГл - исходная общая концентрация углеводов, г/л, СВс - концентрация ВС, г/л, Сгл - концентрация глюкозы, г/л, YBc - выход ВС (% от общей исходной концентрации углеводов), Yr jI - выход глюкозы (% от общей исходной концентрации углеводов) QBC - продуктивность процесса по ВС, г/л/ч, Qr_q - продуктивность процесса по глюкозе, г/л/ч, Ц - целлюлазный комплекс (продуцент - Trichoderma viride), А - амилазный комплекс (продуцент - Aspergillus oryzae), ИЖ [Bmim]Cl - ионная жидкость 1-бутил-З-метилимидазолий хлорид

Таблица 5 - Основные показатели ферментативного гидролиза предварительно дезинтегрированной на шаровой мельнице биомассы микроводорослей С. vulgaris при варьировании ее исходной концентрации в реакционной среде_

СБмо, Г сух. в-в/л Свс, г/л YBC,% Qbc. г/л/ч

20 9,87±0,34 88,92±3,12 0,49±0,02

40 19,51±0,66 87,88±3,01 0,98±0,03

50 24,10±0,85 86,85±3,09 1,10±0,04

60 28,55±1,03 85,74±3,13 1,19±0,04

70 33,00±1,18 84,94±3,01 1,38±0,05

100 45,19±1,69 81,42±3,02 1,61±0,06

120 46,06±1,70 69,16±2,62 1,64±0,06

3. Трансформация ферментативных гидролизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris в органические кислоты (мономеры для получения биоразлагаемых полимеров) и биополимеры (полигидроксиалканоаты)

Получение молочной и фумаровой кислот с использованием биокатализаторов в виде иммобилизованных в криогель ЛВС клеток мицелиальных грибов

Для исследования и оптимизации процессов получения МК и ФК из ферментолизатов биомассы С. vulgaris были использованы разработанные ранее в лаборатории экобиокатализа Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова высокоэффективные биокатализаторы в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток мицелиальных грибов: Rhizopus oryzae F-814 - продуцент МК [Спиричева О.В., 2006], R. oryzae F-1032 -продуцент ФК [Сенько О.В., 2013].

Были оптимизированы условия биокаталитической трансформации ВС, содержащихся в ферментативных гидролизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточных водах, в МК при использовании ИБК на основе клеток мицелиальных грибов R. oryzae F-814. При оптимальных условиях (28°С, рН 6,6±0,2, длительности цикла - 40ч, исходной концентрации ВС в ферментолизате СВсо=45,2±1,7 г/л, концентрации ИБК Сибк=30 г сух.в-в/л) максимальная концентрация МК составила Смкмакс = 28,4±1,1 г/л, продуктивность процесса по МК QMK=0,71±0,03 г/л/ч, степень конверсии потребленных ВС в МК YMK/bc=0,65±0,03.

Полученные результаты были в 142 раза лучше по показателям Смкмакс и Qmk, чем в единственном известном из литературы аналогичном процессе [Сенько О.В., 2013].

Впервые была показана возможность длительного эффективного использования ИБК в периодическом процессе получения МК из ВС, входящих в состав ферментолизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris (Рисунок 3 А). Период полуинактивации ИБК составил ПП ибк=480 ч.

Были оптимизированы условия биокаталитической трансформации ВС, содержащихся в ферментолизатах биомассы микроводорослей С. vulgaris, накопленной на сточных водах, в ФК при использовании ИБК на основе клеток мицелиальных грибов R. oryzae F-1032. При оптимальных

условиях (28°С, длительности цикла - 40ч, исходной концентрации ВС в ферментолизате СВсо=45,2±1,7 г/л, концентрации ИБК СИбк=30 г сух.в-в/л) максимальная концентрация ФК составила СФкМакс=24,2±0,9 г/л, продуктивность процесса по ФК (Зфк=0,61±0,03г/л/ч, степень конверсии потребленных ВС в ФК Уфк/вс=0,55±0,02. При этом показатели СфкмаксИ Офк оказались выше более, чем в 200 раз в сравнении с единственным известным из литературы аналогичным процессом [Сенько О.В., 2013].

Время, ч

Время, ч

Рисунок 3 — Изменение концентрации МК (А) и ФК (Б) в среде в процессе многократного использования ИБК на основе клеток мицелиальных грибов R. oryzae (СИбк=30 г сух. в-в/л). Каждая «точка» соответствует максимальному уровню накопления кислоты в конце каждого периодического цикла. На «врезке» представлена кинетика потребления ВС (•) и накопления в среде кислоты (о) в 2-х циклах использования ИБК для получения кислоты из ферментативных гидролизатов биомассы С. vulgaris при исходной концентрации ВС в них 45,2±1,7 г/л. Пунктирными линиями на «врезке» отмечено время замены культуральной жидкости в реакторе с ИБК на свежую питательную среду

Впервые была показана возможность длительного эффективного использования ИБК в периодическом процессе получения ФК из ВС, входящих в состав ферментолизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris (Рисунок 3 Б). Период полуинактивации ИБК составил ПП НБК=600 ч.

Получение янтарной кислоты с использованием биокатализатора в виде иммобилизованных в криогель ЛВС клеток бактерий Acrínobacillus succinogenes В-10111

Для получения ЯК был разработан биокатализатор в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий A. succinogenes, был определен наиболее эффективный и целесообразный к применению исходный состав ИБК: 2 % (по сухим веществам) биомассы в 13% растворе ПВС. Показана возможность и оптимизированы условия проведения периодического биотехнологического процесса получения ЯК из глюкозы при использовании разработанного ИБК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий A. succinogenes: исходная концентрация глюкозы Сгло=70 г/л, концентрация ИБК СИбк=20 г сух. в-в/л, длительность цикла - 38ч, максимальная концентрация ЯК СЯкмакс=52,3±2,1 г/л, продуктивность процесса по ЯК Сяк=1,38±0,05 г/л/ч, степень конверсии потребленной глюкозы в ЯК УЯк/гл=0,77±0,03, период полуинактивации ИБК ПП ибк=Ю70 ч (Рисунок 4А).

При сравнении процессов получения ЯК из глюкозы при использовании свободных и иммобилизованных клеток в этой работе было установлено, что использование ИБК значительно более эффективно. При иммобилизации обеспечивается увеличение показателя длительности возможного эффективного использования продуцента как минимум в 19 раз, продуктивности процесса - в 1,2 раза, максимальной концентрации ЯК за 1 цикл - в 1,4 раза.

Получение ЯК с использованием разработанного ИБК по сравнению с известными биотехнологическими процессами получения ЯК из глюкозы на основе как свободных, так и иммобилизованных клеток [Liu Y.-P., 2008, Corona-González R. I., 2008, 2014, Xi Y., 2013], обеспечивает одну из самых высоких степеней конверсии глюкозы в ЯК, длительность его эффективного функционирования в 3,5 и более раз превышает лучшие из известных результатов, при этом при использовании одной и той же иммобилизованной биомассы, входящей в состав ИБК, удается получать как минимум в 3,5 раза большие количества ЯК.

Из полученных результатов следует, что иммобилизация клеток бактерий A. succinogenes в криогель ПВС, сформированный при использовании 13% раствора ПВС с ресуспендированной в нем биомассой клеток (2% сух. в-в по массе), является оригинальным методом получения ИБК, применение которого позволяет существенно повысить эффективность биотехнологического процесса получения ЯК по основным показателям.

60

2 50 S

I 40

| 30 -I

я

в.

I 20

10 -

A)

iHiii И iiiiii ijx _

„ ? * i

200

400

600 Время, ч

800

1000

30

=f 25 |

i 20 н

Ы

Sr я

е- ю

£ 5

iHliiii j

20 40 Время, ч

Б)

о

100

200

400

500

600

300 Время, ч

Рисунок 4 — Изменение концентрации ЯК в среде в процессе многократного использования ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenes (СИбк=20 г сух. в-в/л). Каждая «точка» соответствует максимальному уровню накопления ЯК в конце каждого периодического цикла. На «врезке» представлена кинетика потребления глюкозы (А) и ВС (Б) (•) и накопления в среде ЯК (■) в 2-х циклах использования ИБК на основе клеток бактерий A. succinogenes (А) - при использовании в качестве субстрата - глюкозы при исходной концентрации в среде Сгло=70 г/л. (Б) - при использовании в качестве субстрата - ферментативных гидролизатов биомассы С. vulgaris при исходной концентрации ВС в них 45,2±1,7 г/л. Пунктирными линиями на «врезке» отмечено время замены культуральной жидкости в реакторе на свежую питательную среду

Впервые была показана возможность и оптимизированы условия проведения периодического биотехнологического получения ЯК из ферментолизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris при использовании разработанного ИБК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий A. succinogenes: исходная концентрация ВС СВсо=45,2±1,7 г/л, концентрация ИБК Сцбк=20 г сух. в-в/л, длительность цикла - 28ч,

максимальная концентрация ЯК Сжмакс=29,5±1,7 г/л, продуктивность процесса по ЯК QSk=1,05±0,06 г/л/ч, степень конверсии потребленных ВС в ЯК Уяк/вс = 0,69±0,03, период полуинактивации ИБК ПП ибк=594ч (Рисунок 4Б).

Использование ферментативных гидролизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris в качестве субстрата для накопления ПГА бактериями Cupriavidus necator В-8619

На примере синтетических глюкозосодержащих питательных сред была показана возможность и оптимизированы условия накопления ПГА в составе биомассы клеток С. necator'. исходная концентрация биомассы клеток Сбмо — 5,0 г сух. в-в/л, исходная концентрация глюкозы СГло = 20 г/л, длительность процесса 15 ч, концентрация ПГА СПга=7,76±0,21 г/л, продуктивность процесса по ПГА Qnra=461±12 мг/л/ч.

Впервые установлено, что перспективной основой сред для культивирования клеток С. necator с целью накопления в них ПГА является ферментолизат биомассы микроводорослей. Были оптимизированы условия получения ПГА в клетках С. necator при их исходной концентрации СБмо = 5,0 г сух. в-в/л с использованием ферментолизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris в качестве среды культивирования с разной исходной концентрацией ВС в них. Было показано, что максимальная концентрация ПГА накапливается в течение 15 ч при исходной концентрации ВС в ферментолизате 24,10±0,85 г/л (Таблица 6). При этом скорость накопления ПГА (405±12 мг/л/сут) в установленных условиях в 4,6 и более раз превосходит известные из литературы данные, полученные при использовании для накопления ПГА разных гидролизатов и отходов производства [Oliveira F.C., 2004, Yu J., 2008, Baei M. S., 2009, Castilho L. R., 2009, SangyokaS., 2012].

Таблица 6 - Характеристики процесса накопления ПГА клетками С. necator в среде с ферментолизованной биомассой С. vulgaris при варьировании исходной концентрации ВС в среде____

Исходная концентрация ВС в ферментолизатах СпСо, г/л 14,70±0,41 24,10±0,85 33,00±1,18

Длительность процесса, ч 10 15 20

Максимальная концентрация ПГА, С пга г/л 4,57±0,12 6,91±0,20 6,71±0,19

Внутриклеточное содержание ПГА, % 51,00±1,31 59,57±1,75 58,81±1,72

Средняя скорость накопления ПГА, Рига, мг/л/ч 373±10 405±12 294±8

4. Оценка научно-практического потенциала полученных в данной работе результатов

Определение возможности и эффективности использования разработанного способа иммобилизации клеток микроводорослей С. vulgaris в отношении клеток различных фототрофных микроорганизмов

Показано, что предложенный способ иммобилизации и

16

криоконсервации клеток микроводорослей С. vulgaris пригоден для широкого спектра клеток фототрофных микроорганизмов - зеленых, сине-зеленых, красных и диатомовых микроводорослей. При этом разработанный способ обеспечивает длительный срок хранения клеток (не менее 1,5 лет) при сохранении у них способности к пролиферации на 9(Н95 % (Таблица 7).

Таблица 7 - Применение разработанного способа иммобилизации клеток С. vulgaris в криогель ПВС к клеткам различных фототрофных микроорганизмов в оптимизированных для них условиях_

Вид фототрофных Концентрация раствора ПВС, использованного для иммобилизации клеток, % Концентрация биомассы (по сух. в-вам) в иммобилизованном препарате, % Жизнеспособность* после

микроорганизмов 1,5 лет хранения, %

Зеленые микроводоросли

С. vulgaris 7,0 4,0 95 ±3

Dunaliella salina 8,0 4,3 94 ±4

Nannochloropsis sp. 7,5 3,8 93 ±4

Chlamydomonas sp. 6,5 4,3 90 ±3

Chlorococcum sp. 7,0 4,2 92 ±3

Cosmarium sp. 8,0 3,7 94 ±4

Красные микроводоросли

Galdieria partita 8,0 4,1 91 ±3

Haematococcus pluvialis 7,0 4,3 92 ±3

Диатомовые микроводоросли

Thalassiosira weissflogii 8,7 4,0 95 ±4

Сине-зелёные микроводоросли (цианобактерии)

Nostoc sp. 6,5 4,0 91 ±3

Spirulina platensis 6,0 3,8 90 ±3

Gloeotrichia 8,5 3,7 93 ±4

echinulata

* отношение скоростей накопления биомассы при использовании в качестве инокулята образца клеток до и после хранения

В сравнении с известными способами криоконсервации [СЬоисШагу К. К., 2010, Таппюи А., 2012,] данный способ позволил не только повысить уровень жизнеспособности клеток (до 2-х раз), но и существенно упростить сам процесс криоконсервации.

Полученные результаты являются абсолютно конкурентоспособными по сравнению с аналогами, имеют высокую научную и практическую значимость, так как они оригинальны (получен Патент РФ на изобретение № 2508397, 2014) и могут быть использованы для хранения большого количества биоматериала, в том числе коллекционного.

Трансформация различного возобновляемого углеродсодержащего сырья в ЯК под действием ИБК, разработанного на основе иммобилизованных клеток бактерий А. succinogenes

Показано, что разработанный ИБК на основе иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий А. succinogenes может применяться для биотрансформации в ЯК широкого спектра возобновляемого сырья (показано на 18 видах субстратов), при этом в зависимости от сырья при Сибк-20 г сух. в-в/л основные показатели процесса за 1 цикл лежат в диапазонах: Сяк макс = 10-34 г/л, УЯК/вс = 0,42-0,69, Сяк = 0,44-1,11 г/л/ч, (Таблица 8).

Таблица 8 - Характеристики процессов трансформации гидролизатов различных видов возобновляемого сырья в ЯК под действием разработанного ИБК на основе клеток бактерий А. .чиссЬт^епе.^, иммобилизованных в криогель ПВС*_

Гидролизат Свсо, г/л Сяк, г/л Уяк/вс Ояк, г/л/ч ПП ибк, ч

Целлюлозосодержащие отходы

Пшеничная солома 66,4±2,6 33,7±1,3 0,68±0,02 1,06±0,03 600

Рисовая солома 66,5±2,1 31,4±1,5 0,60±0,03 1,08±0,03 420

Багасса 32,0±1,3 19,7±0,7 0,64±0,02 0,70±0,01 600

Свекловичный жом 44,2±1,8 23,9±1,2 0,57±0,03 1,01±0,01 410

Осиновые опилки 64,2±2,9 29,6±1,6 0,59±0,03 1,08±0,03 396

Березовые опилки 58,4±2,5 30,8±1,3 0,61 ±0,03 1,04±0,02 420

Сосновые опилки 64,8±2,3 29,4±1,2 0,60±0,03 1,07±0,03 396

Клубни топинамбура 74,6±3,2 16,2±1,1 0,42±0,01 0,63±0,01 596

Стебли топинамбура 62,2±1,9 15,3±0,9 0,43±0,02 0,70±0,02 476

Фототрос )ные микроорганизмы

С. vulgaris 45,2±1,7 29,5±1,7 0,69±0,03 1,05±0,06 594

Аг1Игохр1га рШет'к 36,7±1,1 18,7±0,7 0,62±0,02 0,66±0,01 424

Соятагшт яр. 52,5±1,7 31,1±1,3 0,66±0,02 1,11±0,03 536

БипаНеНа $а1'та 62,3±2,1 29,9±1,0 0,51 ±0,01 0,66±0,01 490

NаппосЫогор$1в вр. 51,1±1,9 20,1±1,3 0,66±0,02 1,07±0,03 408

АТоя(ос 5р. 47,3±1,1 15,4±0,6 0,59±0,02 0,77±0,02 432

Макроводоросли

Ьаттапа вассИагта 36,6±1,1 15,7±0,7 0,52±0,01 0,61±0,01 552

Asparagopsis ¡ах1[огт1я 56,0±1,5 21,6±1,3 0,55±0,02 0,77±0,02 600

\Jlva 1асШса 24,1±0,8 10,1 ±0,4 0,49±0,01 0,44±0,01 504

* Свсо - исходная концентрация ВС, г/л, СЯк - концентрация янтарной кислоты, г/л, Уяк/вс - степень конверсии потребленных ВС в ЯК, С2Як - продуктивность процесса по ЯК, г/л/ч, ПП ИБК - период полуинактивации ИБК, ч

Возможность использования в качестве субстратов для получения ЯК биомассы фототрофных микроорганизмов и макроводорослей при использовании клеток бактерий A. succinogenes была продемонстрирована в этой работе впервые. Оказалось, что разработанный ИБК может длительно использоваться в периодическом процессе получения ЯК из возобновляемого сырья, период его полуинактивации в зависимости от исходного сырья составляет 396^600ч, длительность его эффективного функционирования многократно превышает лучшие из известных аналогов.

Подходы к утилизации биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, использованных в процессах получения органических кислот из ферментолизатов биомассы микроводорослей С. vulgaris

В работе была продемонстрирована возможность утилизации биомассы иммобилизованных клеток мицелиальных грибов, использованных при многократном получении органических кислот из ферментолизатов клеток микроводорослей С. vulgaris, в процессах метаногенеза и быстрого пиролиза (Рисунок 5, Таблица 9).

Получение метана

Сточные воды +

накопленная биомасса клеток С. vulgaris

Иммобилизованный мицелий грибов после получения органических кислот

Получение продуктов пиролиза

Сорбция клеток С. vulgaris на гранулах иммобилизованного мицелия

Рисунок 5 - Схема получения сорбированной на иммобилизованном грибном мицелии биомассы клеток С. vulgaris и ее конверсии в различные виды биотоплива

Таблица 9 - Результаты получения метана и бионефти с использованием различных типов биомассы в качестве исходного субстрата в процессах метаногенеза и быстрого пиролиза_

Субстрат Состав основных биоорганических компонентов. % % конверсии в

липиды белки углеводы метан бионефть

Иммобилизованный мицелий R. oryzae F-1032 8,0±0.8 31.5±1,2 56,8±2,9 41,4±1,3 -

Биомасса С. vulgaris 17,1 ±0,9 9,9±0,5 55,5±2,5 67,6±2.1 50,5±2,1

Иммобилизованный мицелий R. oryzae F-1032 с сорбированной биомассой С. vulgaris 12,8±0,6 22,1 ±0,9 56.3±2,8 61,3±1,9 58,3±2,3

Использование биомассы иммобилизованных мицелиальных грибов в качестве субстрата для получения метана обеспечило выход продукта равный 41,4±1,3%. Была показана возможность увеличения выхода метана при обогащении биомассы мицелиальных грибов клетками микроводорослей С. vulgaris за счет кратковременного помещения гранул иммобилизованных мицелилальных грибов в сточные воды с накопленной биомассой микроводорослей С. vulgaris. Использование полученной «смешанной» биомассы в качестве субстрата для получения метана позволило увеличить выход метана на 20% (Таблица 9), что сделало процесс более интересным с точки зрения его возможной практической реализации. При быстром пиролизе полученной смешанной биомассы (500 °С, 5 мин) выход жидкой фракции (так называемой бионефти или пиролизной нефти) составил 58,3±2,3%. При этом хромато-масс-спектрометрический анализ полученной бионефти показал наличие в ней алифатических длинноцепочечных нитрилов - потенциальных компонентов современных ракетных топлив.

Биотехнологический комплекс для накопления биомассы микроводорослей в процессе очистки сточных вод и ее последующей трансформации в органические кислоты и ПГА

Анализ и обобщение полученных в работе результатов с учетом актуальных задач и перспективных направлений развития современной биотехнологии позволили сформулировать концепцию биотехнологического комплекса (Рисунок 6), которая может иметь в потенциале практическую реализацию.

Рисунок 6 — Концепция биотехнологического комплекса экологически эффективных биокаталитических процессов на основе использования биомассы микроводорослей, накапливающейся при очистке сточных вод, направленных, главным образом, на ее трансформацию в мономеры для полимерного синтеза и получение биополимеров в виде ПГА

В составе комплекса может быть обеспечено накопление клеток микроводорослей с одновременной очисткой сточных вод и последующее использование биомассы для ее трансформации в целевые коммерчески значимые продукты в виде мономеров, пригодных для получения биоразлагаемых полимерных материалов, а также для получения таких биополимеров, как ПГА, и кроме того могут быть получены продукты переработки отходов основного производства (биокатализаторов в виде иммобилизованных клеток мицелиальных грибов) в метан и бионефть.

Выводы

1. Установлена возможность использования иммобилизованных клеток микроводорослей С. vulgaris С-1 в качестве инокулята для накопления биомассы в процессе очистки сточных вод с одновременным снижением уровня ХПК в 2-8 раз. Получаемая при этом биомасса свободных клеток микроводорослей характеризуется постоянством доли углеводов в её составе, обеспечивающим возможность её прикладного использования.

2. Применение кислотного гидролиза биомассы С. vulgaris обеспечивает быстрое получение сред с высоким выходом ВС (76,13±2,41%), но содержащих муравьиную кислоту, фурфурол и оксиметилфурфурол, токсичные для микробных продуцентов. Эти среды могут быть пригодны для химической промышленности. Механическая дезинтеграция клеток микроводорослей С. vulgaris в сочетании с ферментативным гидролизом позволяет получать нетоксичные гидролизные среды с высоким выходом ВС (81-89%) от общего содержания углеводов в исходной биомассе.

3. Предложены условия оптимального применения иммобилизованных клеток мицелиальных грибов R. oryzae в процессах биотрансформации ВС, содержащихся в ферментолизатах биомассы микроводорослей C.vulgaris, в молочную и фумаровую кислоты. В результате в сравнении с ранее известными данными для молочной кислоты показатели продуктивности процесса были увеличены в 142 раза, для фумаровой - более, чем в 200 раз.

4. Создан оригинальный высокоэффективный биокатализатор в виде иммобилизованных в криогель ПВС клеток бактерий A. succinogenes В-10111 для получения янтарной кислоты. Его использование в сравнении со свободными клетками обеспечило повышение уровня максимального накопления ЯК в глюкозосодержащих средах в одном рабочем цикле в 1,4 раза и увеличило общую длительность эффективного использования продуцента, как минимум, в 19 раз. Впервые для получения ЯК продемонстрирована возможность применения в качестве субстратов биомассы различных фототрофных микроорганизмов, включая клетки микроводорослей С. vulgaris, и макроводорослей.

5. Впервые установлено, что для биотехнологического процесса получения ПГА в составе клеток С. necator В-8619 перспективным субстратом является биомасса микроводорослей. Предложенный субстрат обеспечивает увеличение в 4,6 и более раз скорости накопления ПГА в составе биомассы продуцента по сравнению с литературными данными.

21

6. Разработан оригинальный способ иммобилизации клеток фототрофных микроорганизмов в криогель ПВС, апробированный на 12 культурах, обеспечивающий высокую длительность хранения клеток (не менее 1,5 лет) при высоком уровне сохранения у них способности к пролиферации (на 9(Н95%) и до 2-х раз превосходящий по этим характеристикам аналоги.

7. Предложен подход к утилизации иммобилизованной в криогель ПВС биомассы мицелиальных грибов, использованных для получения органических кислот, методами метаногенеза и быстрого пиролиза с получением, соответственно, метана (с выходом 61,3±1,9%) или пиролизной нефти (с выходом 58,3±2,3%), в которой отмечено наличие длинноцепочечных нитрилов.

8. Пошагово разработана и сформулирована оригинальная концепция биотехнологического комплекса, сочетающего в себе эффективные биокаталитические процессы, направленные на трансформацию биомассы микроводорослей, накапливаемой в процессе очистки сточных вод различного состава в коммерчески значимые продукты (молочную, фумаровую, янтарную кислоты, ПГА, метан и пиролизную нефть).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ф. Мамедова. А.Б. Никольская, Е.Н. Ефременко. Исследование возможности использования сточных вод для накопления биомассы микроводорослей. // Вестник КузГТУ, 2013, №1, с. 113 - 115. (ВАК)

2. Е.Н. Ефременко, А.Б. Никольская, Ф. Мамедова. О.В. Сенько, Л.И. Трусов. Полунепрерывный и непрерывный процесс накопления биомассы клеток микроводорослей Chlorella vulgaris в минеральной среде. // Альтернативная энергетика и экология, 2013, №2(119), с. 44 - 49. (ВАК)

3. E.N. Efremenko, А.В. Nikolskaya, I.V. Lyagin, O.V. Senko, T.A. Makhlis, N.A. Stepanov, O.V. Maslova, F. Mamedova. S.D. Varfolomeyev. Production of biofuels from pretreated microalgae biomass by anaerobic fermentation with immobilized Clostridium acetobutylicum cells. // Bioresource Technology, 2012, V.l 14, p. 342 - 348. (ВАК) (IF 5,600)

4. А.Б. Никольская, А.В. Холстов, И.В. Лягин, Ф. Мамедова. Е.Н. Ефременко, С.Д. Варфоломеев. Иммобилизованные клетки Chlorella vulgaris для решения задач альтернативной энергетики и экологии. // Альтернативная энергетика и экология, 2012, № 4 (108), с. 95 - 100. (ВАК)

5. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенько, Т.А. Махлис, Ф. Мамедова. А.В. Холстов, С.Д. Варфоломеев. Способ криоконсервации клеток фототрофных микроорганизмов. // Патент РФ на изобретение №2508397, опубликовано 27.02.2014, Бюл №6.

6. Е.Н. Ефременко, О.В. Сенько, Н.А. Степанов, И.В. Лягин, Ф. Мамедова. О.В. Маслова, Т.А. Махлис. Биомасса фототрофных микроорганизмов - перспективный субстрат биотехнологии. // Рос. конф. "85 лет: Химический факультет МГУ имени М.В. Ломоносова 1929-2014". Москва, 2014, 27 ноября, с. 12 - 13.

7. О.В. Сенько, Н.А. Степанов, Ф. Мамедова. О.В Маслова. Биомасса макроводорослей как перспективный субстрат для биотехнологического получения органических кислот. // I Междунар. конф. молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов. Новосибирск, 2014, 7 октября, с. 7 - 8.

8. О.В. Маслова, Н.А. Степанов, Ф. Мамедова. Е.Н. Ефременко. Новый высокоэффективный биокатализатор на основе клеток Actinobacillus succinogenes для получения янтарной кислоты. // Междисциплин, науч. форум Moscow Science Week. Москва, 2014, 8-12 сентября, с. А44.

9. Ф. Мамедова, О.В. Сенько, Е.Н. Ефременко. Сравнение эффективности предобработки различными способами биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris. II Междисциплин, науч. форум Moscow Science Week. Москва, 2014, 8-12 сентября, с. В13.

10. О.В. Сенько, Ф. Мамедова. Н.А. Степанов, Е.Н. Ефременко Биокаталитическое получение фумаровой кислоты из непищевого возобновляемого сырья. // Междунар. конф. "Биотехнология. Взгляд в будущее". Казань, 2013, 26-27 марта, с. 324.

11. A. Docenko, F. Mamedova. O.V. Senko, E.N. Efremenko. Pretreatment of renewable carbonaceous raw materials for effective biotransformation into organic acid. // Internat. conf. "Biocatalysis-2013: Fundamentals & Applications". Москва, 2013,2-5 июля, с. 106 - 107.

12. О.В. Сенько, Н.А. Степанов, Ф. Мамедова. О.В. Маслова, Е.Н. Ефременко. Сырьевые источники биокаталитического получения органических кислот. // V Междунар. науч.-практ. конф. "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины". Ростов-на-Дону, 2013, 35 октября, с. 182.

13. I.V. Lyagin, O.V. Senko, А.В. Nikolskaya, F. Mamedova. N.A. Stepanov, D.T. Tran, T.S. Do, E.N. Efremenko. Conversion of renewable resources into products useable for chemical and fuel industries. // Internat. symposium of marine enzyme and polysaccharides. Nha Trang, Vietnam, 2012, 10-17 December, p. 19.

14. Ф. Мамедова. Е.Н. Ефременко. Исследование характеристик процесса накопления биомассы микроводорослей в промышленных сточных водах. // XII Ежегод. междунар. молод, конф. "ИБХФ РАН-Вузы". Москва, 2012, 29-31 октября, с. 102 - 104.

Заказ № 60-Р/04/2015 Подписано в печать 15.04.15 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел. (495)649-83-30 www cfr ru • e-mail: zakpark@cfr.ru