Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора

Батырова, Хорческа Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора"

На правах рукописи

Батырова Хорческа Александровна

Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка фосфора

03.01.05 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

30 СЕН 2(11

005562824

Пущино-2015

005562824

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН)

Научные руководители:

доктор биологических наук Цыганков Анатолий Анатольевич

кандидат биологических наук Косоуров Сергей Николаевич

Официальные оппоненты:

Кренделева Татьяна Евгеньевна - доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра биофизики, группа физиологии и биохимии фотосинтеза, главный научный сотрудник.

Синетова Мария Андреевна - кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, руководитель группы экофизиологии микроводорослей.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Защита состоится «24» ноября 2015 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.066.01, созданного на базе ИФПБ РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФПБ РАН (http://wwvv.ibbp.psn.ru/).

Автореферат разослан « » сентября 2015 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Назарова Галина Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярный водород является экологически чистым энергоносителем. В настоящее время разрабатываются проекты его хранения, транспортировки и использования в будущей системе энергообеспечения разных стран, включая Россию. Вместе с тем для использования водорода в энергетике необходимо его экологически чистое производство. Возможны разные способы получения водорода, включая биологический. Некоторые микроводоросли способны к светозависимому выделению водорода, осуществляя биофотолиз воды. Такой способ получения водорода является экологически чистым, поскольку водород производится из воды, а продуктом его поглощения в топливных элементах является вода. При его сгорании также образуется в основном вода.

Микроводоросли способны к выделению водорода после анаэробной адаптации [Gaffron, Rubin, 1942]. В этом случае начальные скорости выделения водорода близки к скорости фотосинтеза. Однако, одновременно с водородом микроводоросли выделяют кислород, который токсичен для ключевого фермента выделения водорода, Fe-Fe-гидрогсназы [Янюшин, 1982]. Вследствие накопления кислорода активность гидрогеназы снижается, и через короткое время (в зависимости от условий эксперимента 10-1000 сек) выделение водорода прекращается.

В 2000 г американские ученые предложили способ существенного (до нескольких дней) увеличения длительности процесса выделения водорода [Melis et al.„ 2000]. Для этого культуры микроводорослей подвергали серному голоданию. За последние 15 лет этот метод был использован в десятках лабораторий мира, что позволило существенно продвинуться в понимании процесса выделения водорода микроводорослями [Цыганков, 2014]. Однако для практического использования такого способа получения водорода необходимо решить множество фундаментальных проблем, начиная от увеличения скорости процесса, проходя через повышение его стабильности и завершая поддержанием культур микроводорослей в активном состоянии. Среди этих проблем находится и проблема использования чистой воды. Ресурсы чистой воды на Земле не безграничны, и в случае практического применения фотовыделения водорода микроводорослями этот процесс с неизбежностью вступит в конкуренцию с остальными процессами, требующими чистой воды. В то же время на Земле имеются практически неисчерпаемые запасы морской воды.

К началу наших исследований в научной литературе не встречалось сообщений о возможности выделения водорода морскими микроводорослями в условиях серного голодания в количествах, сопоставимых с пресноводными видами. В то же время было известно, что многие морские микроводоросли, в частности хлорелла, способны к синтезу гидрогеназ и светозависимому выделению водорода. Нами было сделано предположение, что невозможность получения выделения водорода морскими микроводорослями в условиях серного голодания обусловлена тем, что в морской воде находится значительное количество сульфатов. В результате процесс серного голодания не реализуется даже при исключении всех серных соединений из питательной среды.

Известно, что в составе воды морей и океанов находится очень незначительное количество фосфатов [Paytan et. al., 2007]. В ранних работах показано, что недостаток фосфора приводит к падению активности фотосистемы 2 [Wykoff et al., 1998]. Однако выделения водорода в этих условиях не наблюдали. Таким образом, изучение выделения водорода морскими микроводорослями в условиях недостатка фосфора является акту&тьным.

Целью данной работы было выяснение возможности длительного выделения водорода морскими микроводорослями в условиях недостатка фосфора.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• Разработать метод перевода пресноводных культур Clamydomonas reinhardtii в условия недостатка фосфора, когда культуры эффективно выделяют водород.

• Подобрать условия для получения голодающих по фосфору культур морской микроводоросли Chlorella sp. в искусственной и натуральной морской воде.

• Проверить возможность выделения водорода в условиях недостатка фосфора культурами Chlorella sp. с использованием искусственной и натуральной морской воды.

• Изучить влияние углекислоты на выделение водорода культурами морских микроводорослей в условиях недостатка фосфора.

Научная новизна

Впервые было продемонстрировано выделение водорода культурами пресноводных микроводорослей в условиях недостатка фосфора. Впервые показана способность морских микроводорослей к длительному выделению водорода в условиях фосфорного голодания.

Практическая значимость Предложен метод получения голодающих по фосфору фотогетротрофных культур микроводорослей С. remhardtii и Chlorella sp., который отличается простотой и надежностью. Показано, что метод применим как к пресноводным, так и морским микроводорослям. Использование метода в научных исследованиях позволит подключиться к исследованиям выделения водорода микроводорослями лабораториям и группам, владеющим штаммами морских микроводорослей, в том числе в России. Разработанный метод также может явиться основой для постановки лабораторных практикумов для обучения студентов приемам получения водорода с использованием микроводорослей на свету.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на 9-й международной Гидрогеназной конференции (Уппсала, Швеция, 2010), на международной конференции «Исследование фотосинтеза для устойчивого развития» (Баку, Азербайджан, 2011), на технологическом саммите Фраунхофер-Делавер «Энергетика и естественные науки - решения для устойчивого развития» (Ньюарк США, 2011), международной конференции «Исследование фотосинтеза для устойчивого развития» в честь Владимира А. Шувалова (Пущино, Россия, 2014). Работа была поддержана грантом РФФИ (15-54-50032).

Личный вклад соискателя. Диссертация выполнена самостоятельно. Автор участвовал в постановке и решении всех экспериментальных задач, обработке результатов и формулировке выводов. Соавторы, принимавшие участие в совместных исследованиях, указаны в соответствующих статьях и разделах диссертации.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 - в зарубежных журналах, цитируемых базой данных Web of Science, 4 - в сборниках тезисов конференций.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 85 страницах, иллюстрирована 13 рисунками и 7 таблицами. Список литературы содержит 168 источника (из них 154 на английском языке).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы отражает современные представления о процессе фотообразования водорода зелеными микроводорослями, о роли светозависимого выделения водорода в метаболизме, о физиологии процесса выделения водорода в условиях недостатка макро и микро элементов, а также о функционировании гидрогеназ зеленых микроводорослей и их возможной роли в метаболизме.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследований были зеленая микроводоросль С. reinhardtii штамм Dangeard 137С mt*, и зеленая одноклеточная морская водоросль Chlorella sp. Микроводоросль С. remhardtii выращивалась фотомиксотрофно на стандартной среде ТАР, при pH 7,2, температуре 28°С, с постоянной продувкой воздухом с 2% СОг и интенсивностью света равной примерно 40 цМ ш"2 s"1 PAR. Для выращивания морской микроводоросли Chlorella sp. использовались два типа среды стандартная ТАР среда с добавлением 30 г/л NaCl (TAP/NaCl), и ТАР среда где дистиллированная вода была заменена на морскую воду из Черного моря (ТАР/ЧМ), оба типа среды содержали 1 мл смеси витаминов. Культура Chlorella sp. выращивалась фотомиксотрофно в (TAP/NaCl) или в (ТАР/ЧМ) при температуре 28 °С, pH 7,2 с постоянной продувкой воздухом с 2% СОг и интенсивностью света равной примерно 25 цМо1 m"2 S"' PAR. Для экспериментов с фотоавтотрофной культурой Chlorella sp. использовалась среда LI,приготовленная на основе искусственной морской воды. Фотоавтотрофная культура Chlorella sp. выращивалась в течение 12 дней при температуре

28 "С, pH 7,2 и с постоянной продувкой воздухом с 2% СОг. Во время роста, интенсивность света была равна примерно 25 pMol m"2 s"1 PAR.

Отработку метода голодающих по фосфору культур, а также эксперименты по влиянию одновременно удаления серы и фосфора в культурах С. reinhardtii проводили в 500 мл сосудах (диаметром 6 см), где культуру инкубировали с перемешиванием (300 об/мин) при 28'С и интенсивности света равной 45 цЕ т'У. В дальнейшем эксперименты с культурами С. reinhardtii голодающими по фосфору, проводили в фотобиореакторе при 25°С и интенсивности света равной 80 рЕ т'У .

Эксперименты по влиянию фосфорного голодания в культурах Chlorella sp. проводили в сосудиках (45 мл), объем культуры - 30 мл. Сосуды были герметично закрыты резиновыми пробками [Belco Glass Inc., NJ]. Сосуды помещали на орбитальный шейкер (100 об/мин) и культивировали при температуре 25°С. В процессе культивирования культуры освещались сверху лампами дневного света, интенсивность падающего света на поверхность сосудов была равна 45 pEm"2 s"' PAR. Газовую фазу во флаконах анализировали с помощью газового хроматографа. Гидрогеназную активность определяли методом газовой хроматографии по выделению водорода из восстановленного дитионитом метилвиологена [Zorin et al., 1996]. Крахмал, в клетках измеряли как эквивалент глюкозы после ферментативного гидролиза. Супернатант, полученный при центрифугировании проб для определения крахмала (0,8 мл), использовали для определения ацетата. В супернатанте снижали pH до 2 добавлением 50% Н3РО4 и анализировали без какой либо дополнительной обработки. Концентрация ацетата определялась хроматографически, используя газовый хроматограф (Цвет 1000 Россия). Концентрация хлорофилла в клетках С. reinhardtii определялась спектрофотометрически после экстракции 95% этанолом, а в клетках Chlorella sp. после экстракции 100% метанолом. Химический анализ проб воды из Черного моря был сделан в биохимической лаборатории Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт Физико-Химических и Биологических Проблем Почвоведения Российской академии наук.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел 3.1 Выделение водорода Р-дефицитными культурами зеленой микроводоросли С. reinhardtii в фотогетеротрофных условиях.

Ранее было показано, что удаление из среды серы путем отмывания достаточно для создания условий голодания по сере [Melis et al., 2000; Kosourov et. al. 2005]. Нами было проверено, как удаление фосфора и одновременное удаление фосфора и серы из среды влияет на создание анаэробиоза и выделение водорода С. reinhardtii. Для этого культуры отмывали от серы и фосфора путем центрифугирования и помещали в среду без серы, без фосфора и без серы и фосфора (рисунок 1, Таблица 1). Культуры с начальными концентрациями хлорофилла 10-15 мкг/мл в средах TA-S и TA-S-P инкубировали с перемешиванием при 28'С и интенсивности света равной 45 рЕ m"2s"'. В среде без серы культуры, как и было показано ранее, переходили в анаэробные условия и выделяли водород, в свою очередь удаление одновременно серы и фосфора не приводило к увеличению выхода водорода и конечное количество выделившегося водорода в обоих культурах было практически одинаковым. Таким образом, нами было продемонстрировано что при стартовых концентрациях хлорофилла равных 10-15 мкг/мл в S, Р- дефицитных культурах отсутствие фосфора в среде не приводит к повышению выходов водорода по сравнению с голодающими по сере культурами.

О 20 40 60 80 100 120 140 Время, ч

Рисунок 1. Выделение водорода и содержание хлорофилла у культур С. гетИагЛИ в условиях недостатка серы (-Б) и при удалении фосфора и одновременно серы . Удаление серы и фосфора проводили методом отмывания. Измерения произведены в трех независимых повторностях (эксперименты частично проведены С.Н. Косоуровым).

В дальнейшем было решено проверить как удаление только фосфора из среды будет влиять на выделение водорода у культур С. гетНагски. Было показано, что культуры отмытые от фосфора посредством центрифугирования и ресуспендированные в бесфосфорной среде ТА-Р с начальными концентрациями хлорофилла равными 23-25 мкг/мл не выделяли водород. Однако в отличие от культур голодающих по сере, также имеющих начальные концентрации хлорофилла равные 23-25 мкг/мл, Р- дефицитные культуры продолжали расти и накапливать биомассу, это видно по увеличению содержания хлорофилла в клетках (Таблица 1). Примечательно то, что несмотря на отсутствие выделения водорода, Р-дефицитные культуры имели высокий уровень гидрогеназной активности, сопоставимый с уровнем гидрогеназной активности в культурах, голодающих по сере и выделяющих значительные количества водорода (Таблица 1). Так как Р-дефицитные культуры в ходе экспериментов продолжали расти и достигали высоких концентраций хлорофилла, появление высокой гидрогеназной активности могло быть спровоцировано возникновением частичного анаэробиоза в затенённых слоях биореатора. Для подтверждения этого факта была проведена серия экспериментов с плотными культурами растущими на стандартной среде ТАР. Как видно их Таблицы 1, культуры с высокими концентрациями хлорофилла, растущие на стандартной среде ТАР, имели высокую гидрогеназную активность, но выделяли незначительные количества водорода, детектируемые только с помощью газового хроматографа; видимое выделение водорода этими культурами отсутствовало.

Наличие высоких гидрогеназных активностей в культурах, голодающих по фосфору, полученных методом отмывания, обусловлено наличием процессов затенения, происходящих в плотных культурах. В этом случае активное выделение водорода было невозможно в связи с активным перемешиванием культур: так как внешние слои культур выделяли значительные количества кислорода в процессе фотосинтеза, это приводило к ингибированию процесса выделения водорода затененными слоями. Кроме того в этих условиях другие метаболические пути могут более эффективно конкурировать за восстановители, образующиеся в процессе фотосинтеза.

Таблица 1. Изменения в количестве хлорофилла (а+Ь) (мкг/мл), уровне выделения Нг (мл/л суспензии) и гидрогеназной активности (Нг-аза, мкМ/мг Хл./ч) у культур С. геЫюг&П, голодающих по сере (-5), по фосфору (-Р), и в культурах, не испытывающих голодание на стандартной среде ТАР (+Б+Р). Культуры, голодающие по сере и по фосфору, были получены методом отмывания.

Время (часы) -S -Р +S + P

Хл.(а+Ь) Нг Нг-аза Хл.(а+Ь) Нг Нг-аза Хл.(а+Ь) Н2 Нг-аза

0 23,4 ± 0,8 0 0 22,5 ± 1,3 0 0 20,8 0 0

56 28,8 ±2,1 22 156 ±2 34,6 ± 0,4 0 117± 12 34,0 0 148 ±21

104 20,5 ± 0,2 87 164 ± 12 26,4 ± 1,9 0 133 ± 71

128 19,9 ±2,4 109 208 ± 29 31,5 ±0,2 0 272 ± 93

Таким образом, простое отмывание культур от фосфора не приводит к выделению культурами водорода. Это может быть связано с тем, что культуры в условиях фосфорного голодания не способны выделять водород или простое отмывание от фосфора, когда содержание фосфора в среде достигает 28 мМ, не приводит к фосфорному голоданию за счет или высоких стартовых концентраций фосфора или большого содержания фосфора внутри клеток. Наличие внутриклеточного пула полифосфатов показано для ряда микроводорослей [Powell et. al., 2009].

Для проверки способности культур к выделению водорода в условиях фосфорного голодания необходимо найти диапазон начальных концентраций фосфора, когда увеличение фосфора приводит к линейному увеличению конечной концентрации биомассы, т.е. подобрать условия для фосфорного лимитирования. Поэтому нами разработан новый метод достижения фосфорного голодания, основанный на комбинации двух известных: сначала клетки отмывали от избыточных концентраций фосфора в среде путем центрифугирования, а затем инокулировали среду без фосфора малым количеством инокулята, в качестве которого использовали отмытые клетки. В этом случае мы можем избавиться от фосфора в среде путем отмывки, а имеющийся внутриклеточный пул фосфатов разбавляется среди растущих клеток.

Для получения Р-дефицитных культур подбирались различные начальные концентрации инокулята как основного источника фосфора. Концентрацию вносимого инокулята учитывали по концентрации хлорофилла в клетках. Концентрацию выросших клеток оценивали по концентрации хлорофилла через 4-5 дней культивирования, когда увеличение хлорофилла прекращалось. Такую концентрацию хлорофилла называли конечной. Как видно из рисунка 2 клеточный рост (определенный как максимальная концентрация хлорофилла (а+Ь) в культуре) был лимитирован количеством внесенного с инокулятом фосфора только когда начальная концентрация хлорофилла в культурах была ниже 2 мкг/мл. При более высоких начальных концентрациях хлорофилла максимальная концентрация хлорофилла менялась незначительно, что означает, что в этом диапазоне концентраций культуры не испытывали фосфорное голодание, а были лимитированы другими факторами. Изначально все культуры выделяли кислород с последующим переходом в фазу поглощения кислорода. После 80-100 ч роста культуры с низкими начальными концентрациями начинали выделять водород. Как видно из рисунка 2, только узкий диапазон начальных концентраций хлорофилла приводит к эффективному выделению №. Максимальное количество водорода (68 мл/л суспензии) было полученное при начальной концентрации хлорофилла равной примерно 1 мкг/мл. Культуры с начальными концентрациями хлорофилла выше 2 мкг/мл не выделяли водород, так как они не были лимитированы по фосфору.

О 1 2 3 4 5 10 15 20 25 Начальная концентрация Хл. (а+b), мкг/мл

Рисунок 2. Влияние начальных концентраций хлорофилла на накопление биомассы, измеренной как конечная концентрация хлорофилла (белые символы) и выделение водорода (черные символы) у культур С. reinhardtii в условиях недостатка фосфора. Измерения произведены в трех независимых повторностях. Кривая, аппроксимирующая конечную концентрацию хлорофилла, представлена в виде нелинейной регрессии (ГиперболаШ, SigmaPlot 11).

Финальная серия экспериментов проводилась при контролируемом культивировании в фотобиореакторах, для демонстрации способности Р-дефицитных культур С. reinhardtii переходить в анаэробное состояние и выделять водород в фотобиореакторе. На рисунке 3 показано, что культуры, разбавленные до начальной концентрации хлорофилла равной 1,5 ±0,2 мкг/мл, проходили те же фазы адаптации к недостатку фосфора как и S- дефицитные культуры: сначала культуры выделяли кислород, затем наступала фаза поглощения кислорода, анаэробная фаза, и далее культуры выделяли водород с последующей фазой терминации [Kosourov et. al. 2002]. Однако время перехода в анаэробиоз Р- дефицитными культурами (100 часов) было значительно больше, чем у культур, голодающих по сере, полученных методом отмывания (18-40 часов). Это может быть связано с нашим методом получения культур, голодающих по фосфору, включащим стадию разбавления, поскольку, S- дефицитные культуры, полученные методом разбавления, начинали выделять водород только после 70-100 часов культивирования в без серной среде [Laurinavichene et al., 2002]. Как видно из рисунка 3, Р- дефицитные культуры начинали выделять водород после 100 часов культивирования, и выделение останавливалось через 300 часов. Концентрация клеток увеличивалась постепенно начиная с 0,67 х 106 клеток/ мл в начале эксперимента и до 5,16 х 106 клеток/ мл после 150 часов культивирования с последующим снижением до 4,04 х 10б клеток/ мл через 270 часов (рисунок 3). Одновременно содержание хлорофилла в культурах увеличиваливалось с 1,5 ±0,2 мкг/мл до 15,2 ±3,1 мкг/мл к 150 часу инкубирования и далее постепенно снижалось до 13,2 ±2,8 мкг/мл. Эти результаты демонстрируют, что клеточный рост и деление происходило в течение первых 150 часов фосфорного голодания с последующим снижением количества клеток в конце фазы выделения водорода. Подобно S- дефицитным культурам, адаптация культур к недостатку фосфора сопровождалась накоплением крахмала во время фазы выделения кислорода и его последующей деградацией в течение фазы выделения водорода. На рисунке 3 показано, что клетки потребляют ацетат в течение первых стадий фосфорного голодания, когда происходит инактивация ФС2. Однако после установления анаэрообиоза в биореакторе клетки начинают синтезировать ацетат и экскретировать его в среду, очевидно в процессе сбраживания внутриклеточных запасов крахмала (рисунок 3). Переход культуры в анаэробиоз в процессе фосфорного голодания это энерго-затратный процесс, который требует источник углерода для процессов дыхания. Основным субстратом для дыхания в течение первых 150 часов фосфорного голодания является ацетат, как только культуры переходят в анаэробиоз потребление ацетата останавливается, и анаэробиоз в дальнейшем поддерживается за счет потребления крахмала.

Таким образом, с использованием разработанного нами метода нами получены культуры С. reinhardtii, голодающие по фосфору. Впервые показано, что голодающие по фосфору культуры способны к выделению водорода в значительных количествах. При этом, процесс адаптации культур к недостатку фосфора проходит те же стадии, что и у культур, голодающих по сере.

Время, ч

Рнсунок 3. Изменение различных параметров в процессе фосфорного голодания у культуры С. reinhardtii: [А] количество растворенного кислорода в среде и объем выделившегося водорода; [Б] концентрация хлорофилла (а+Ь) и число клеток; [В] количество накопленного клетками крахмала и содержание ацетата в среде. В данном эксперименте культуры, отмытые посредством центрифугирования и разбавленные до начальной концентрации хлорофилла 1,5 мкг/мл, помещались в систему контролируемых биореакторов и закрывались силиконовыми пробками с газооотводными трубками через 80 ч после начала эксперимента. Измерения произведены в трех независимых повторностях.

Раздел 3.2 Выделение водорода зелеными микроводорослями в условиях недостатка макро и микроэлементов.

Помимо света и СО2, рост зеленых микроводорослей в значительной степени зависит от наличия необходимых макроэлементов в окружающей среде, таких как: серы, азота или фосфора [Grossman et а1.,2001]. При отсутствии любого из этих макроэлементов, деление клеток останавливается, и культуры перестают расти [Hase et а1,1958]. Акклиматизация клеток к стрессовым условиям сопровождается значительными изменениями в физиологии клеток, включающими в себя изменение уровня экспрессии белков, а также уровня синтеза/деградации липидов и крахмала. Было показано, что дефицит ряда макро- и микроэлементов вызывает нарушение фотосинтетической активности С. reinhardtii [Melis et al., 2000; Wykoffet al,1998]. Дефицит серы, фосфора, азота и углерода приводит к постепенному понижению скорости выделения кислорода. В тот момент, когда скорость выделения кислорода и его потребления в процессе дыхания становятся равными, культуры начинают переходить в анаэробные условия. К началу наших исследований в научной литературе имелись только сообщения о способности микроводорослей к выделению водорода в условиях серного голодания. В 2012 году Philipps и соавторами было показано выделение водорода у зеленых микроводорослей при недостатке азота, однако физиология этого процесса менее изучена в сравнение с серным голоданием [Aparicio et al.,1985; Philipps et al., 2012]. Подобно серному голоданию, азотное приводит к

снижению активности ФС2, а также накоплению запасов крахмала и липидов в присутствии ацетата [Martin and Goodenough, 1975; Peltier and Schmidt, 1991; Work et al., 2010]. Следует отметить, что в этом же году мы опубликовали работу, в которой показали способность пресноводных микроводорослей к выделению водорода в условиях фосфорного голодания [Batyrova et al., 2012].

Сравнительно недавно было установлено, что зеленые микроводоросли в условиях недостатка магния способны выделять водород в количествах, даже превышающих выделение водорода в условиях серного голодания [Volgusheva et al., 2014]. В условиях недостатка магния происходит снижение активности ФС2 и интенсивное накопление крахмала, в то время как лимитирование по магнию никак не сказывается на митохондриальном дыхании. Выделение водорода при недостатке магния является в основном ФС2 зависимым, добавление диурона приводит к снижению выделения водорода на 74%. На данный момент нет гипотезы, объясняющей почему недостаток магния приводит к увеличению выходов водорода, хотя можно предполагать, что недостаток разных элементов питания приводит к запуску одного механизма адаптации, приводящего к выделению водорода.

Несмотря на то что недостаток таких элементов как S, N, Р и Mg вызывает у зеленых микроводорослей похожий ответ на стресс: снижение активности ФС2, накопление значительных количеств крахмала, и переход в анаэробиоз; тем не менее имеются различия в физиологии выделения водорода при разных видах лимитированния (Таблица 2). К примеру выделение водорода в условиях недостатка Mg [Volgusheva et al., 2014] и S [Kosourov et al., 2003] происходит в основном за счет ФС2 зависимых электрон-транспортных путей, в то время как выделение водорода при недостатке N происходит за счет ФС1, а также внутренних процессов, способствующих восстановлению пула пластохинонов [Aparicio et al., 1985; Philipps et al., 2012]. 20-30 % выделения водорода при недостатке Mg и S происходит посредством ФС2- независимых электрон-транспортных путей, за счет, например, деградации крахмала которая происходит на стадии выделения водорода. Однако в условиях недостатка N, несмотря на присутствие в клетках значительных запасов крахмала, выделение водорода происходит за счет деградации белка. Другое значительное отличие в физиологии лимитированний по Mg, S, Р и N заключается в продолжительности процесса инактивации ФС2 и стадии потребления культурами кислорода. При недостатке Mg и S инактивация ФС2 и стадия потребления кислорода протекает быстрее, чем при недостатке N и Р [Wykoffet al., 1998; Philipps et al., 2012; Volgusheva et al., 2014; Batyrova et al., 2012]. В случае голодания по фосфору , как было показано в наших экспериментах , задержка в процессе инактивации ФС2 происходит в связи с наличием значительных внутриклеточных запасов фосфора за счет которых культуры микроводорослей продолжают расти не испытывая фосфорного голодания. Однако на данный момент нет гипотезы, объясняющей задержку в процессе инактивации ФС2 при азотном голодании. Серное голодание в свою очередь приводит к снижению активности ФС2 на 80% , а голодание по Mg только на 20%. Несмотря на такую большую разницу в функционировании ФС2 при этих видах лимитирования, различий в длительности стадии потребления кислорода практически не наблюдается.

Таблица 2. Сравнительный анализ выделения № при недостатке различных макро и микроэлементов. Данные взяты из [МеПэ й а1., 2000; Ва1уго\-а й а1., 2012; Volgusheva е! а1., 2014; Рараг! е! а1., 2014].

Процент выделения Н2 (TAPS'100%) Относительный вклад ФС2 Выделение 11; за счет брожения посредством ПФОР Источник эндогенных восстановителей Накопление/ потребление крахмала Время до перехода в анаэробиоз (дни) Стадия выделения водорода (дни)

-S 100% 60-90% Остаточное Крахмал Да/да 1-3 1-3

-N 58-86% Незначительный Высокое Белок Да/нет >8 4

-Р 40% Крахмал Да/да 5 6

-Mg 200% 74% Крахмал Да/да 1 2

Раздел 3.3 Выделение водорода Р- дефицитными культурами зеленой микроводорослн Chlorella sp.

Использование морских микроводорослей для фотосинтетического выделения водорода имеет ряд преимуществ. Во-первых, использование морских микроводорослей позволит нам использовать неограниченные ресурсы морской воды, тем самым минимизируя использование ограниченных ресурсов пресной воды. Во-вторых, газы имеют меньшую растворимость в соленой воде, [Weiss, et al., 1970], поэтому содержание растворенного кислорода, ингибитора FeFe-гидрогсназ [Lambertz, et al., 2011], меньше в соленой воде по отношению к пресной воде. Водород также менее растворим в солевых растворах, и, следовательно, легче доступен в газовой фазе. Известно множество видов морской зеленой микроводоросли хлорелла, один из которых Chlorella sp. мы использовали в нашей работе [Komärek et al., 1983; Huss et al., 1989]. Разработанный нами метод получения голодающих по фосфору пресноводных микроводорослей был применен и в этом случае.

Наиболее прямой и эффективный способ подтвердить, что культуры испытывают фосфорной голодание это определение диапазона начальных концентрации фосфора при которых конечное количество биомассы микроводрослей зависит от начальной концентрации фосфора. Такая зависимость может быть линейной и не линейной. В случае линейной зависимости культуры лимитированы по фосфору. Нелинейная зависимость возникает когда культура испытывает двойное лимитирование, как в случае, например, с дефицитной по аммонию культурой пурпурной несерной бактерии Rhodobacter capsultas, которая имеет область двойного лимитирования светом и аммонием [Tsygankov et al., 1998].

Использование фотоавтотрофных культур Chlorella sp. дало нам возможность проведения прямых экспериментов по изменению начальных концентраций фосфатов в среде (рисунок 4). Для определения диапазона начальных концентраций фосфатов при которых лимитирован рост культуры Chorella sp., была изучена зависимость конечной концентрации биомассы (в пересчете на хлорофилл) от начальных концентраций фосфатов в среде LI при фотоавтотрофных условиях (рисунок 4): увеличение количества добавленных фосфатов в среде с 4 мкМ до 12 мкМ не приводило к увеличению конечного количества биомассы. Однако, увеличение начальной концентрации фосфатов с 12 до 36 мкМ в среде привело к значительному повышению конечного количества накопленной биомассы. Можно сделать вывод, что диапазон 4-36 мкМ начатьных концентрации фосфатов является областью, когда культура достигает стационарной фазы по причине отсутствия фосфора. Увеличение количества фосфатов в среде до 108 мкМ также приводит к увеличению конечной концентрации биомассы. Возможно, в диапазоне 36-108 мкМ начальных концентрации фосфатов, фосфор так же является лимитирующим фактором, и на конечных этапах культивирования культуры Chorella sp. начинают испытывать недостаток фосфора, но наряду с ним имеется и дополнительное лимитирование каким-то другим субстратом. К сожалению рост культуры Chorella sp. в фотоавтотрофных условиях в среде LI с использованием искусственной морской воды был не стабилен и культивировать Chorella sp. в этих условиях в течение длительного времени было затруднительно. Также принимая во внимание то, что выделение водорода в фотоавтотрофных культурах возможно только при использовании особого светового режима [Tsygankov et al., 2006], который должен быть оптимизирован для каждой культуры отдельно, все дальнейшие исследования было решено проводить с фотогетеротрофными культурами с использованием сред ТАР/4M и/или TAP/NaCl.

О 50 100 150 200 250 300 350 400 Начальная концентрация фосфатов. рМ

Рисунок 4. Влияние начальных концентраций фосфатов на накопление биомассы (измеренной как конечное содержание хлорофилла) у фотоавтотрофных культур Chlorella sp., выращиваемых в искусственной морской воде. Измерения проведены Ивановой Е.П.

Для достижения устойчивого выделения водорода фотогетеротрофной культурой Chorella sp. нами был применен разработанный на культурах С. reinhardtii, комбинированный метод разбавления и отмывания. Для этого культуры Chlorella sp. выращенные на TAP/NaCl и на ТАР/ЧМ осаждали центрифугированием (3000 х g, 3 мин), отмывали один раз от фосфора средой без фосфора TA-P/NaCl, или в среде ТА-Р/ЧМ, вновь центрифугировали и суспендировали в необходимом объеме соответствующей среды TA-P/NaCl или ТА-Р/ЧМ. Начальная концентрация хлорофилла составляла -0,15-30 мкг/мл. В этом случае определенные количества фосфора вносятся в среду вместе с инокулятом при разбавлении (также небольшое количество фосфора присутствует в искусственной и настоящей морской воде). Таким образом, зависимость конечных концентраций хлорофилла от исходных отражает влияние начальной концентрации фосфора на накопление конечной биомассы. Начальные количества фосфора вносимые в среду регулировались концентрацией клеток (в пересчете на хлорофилл), вносимых с инокулятом. Как видно на рисунке 5, клеточный рост (показанный как конечная концентрация хлорофилла (а + Ь) через -200 часов культивирования) линейно зависит от количества фосфора внесенного в среду, когда начальные концентрации хлорофилла в культуре были ниже 6,5-8,2 мкг/мл. Дальнейшее увеличение начальных концентраций хлорофилла приводило к нелинейному увеличению конечных концентраций хлорофилла. На рисунке 5 показано, что только узкий диапазон начальных концентраций хлорофилла приводит к эффективному выделению Нз. Максимальное количество водорода было получено в культурах с начальной концентрацией хлорофилла равной 0,8 мкг/мл. Культуры с начальной концентрацией хлорофилла выше 2 мкг/мл не выделяли водород, несмотря на то что были лимитированы по фосфору в конце роста (если судить по линейной зависимости конечных концентраций хлорофилла от начальных). Отсутствие выделения Нг в диапазоне начальных концентрации 2-8 мкг/мл можно объяснить тем, что при этих начальных концентрациях культуры дорастают до более высоких конечных концентраций хлорофилла и ацетат потребляется до перехода культуры в анаэробиоз, однако для подтверждения этой версии необходимо проведение дополнительных исследований. Интересно отметить, что как для пресноводной, так и морской микроводоросли, начальные концентрации хлорофилла, при которых происходило выделение водорода, составляли менее 2 мкг/мл. Можно предположить, что при одинаковой концентрации фосфора в среде культивирования подобранный нами метод позволяет воспроизводимо получать голодание по фосфору для разных микроводорослей. Однако для проверки такого предположения требуются дальнейшие исследования. Полученные нами результаты подтверждают, что культура морской микроводоросли Chlorella sp. способна выделять водород в условиях недостатка фосфора.

Начальная концентрация хлорофилла, мкг/мл Рисунок 5. Влияние начальных концентраций хлорофилла на накопление биомассы (измеренной как конечное количество хлорофилла) и выделение водорода у культур Chlorella sp. в условиях недостатка фосфора. Лимитирование по фосфору у культур было получено с использованием метода разбавления. Измерения произведены в трех независимых повторностях. Кривая, демонстрирующая хлорофилл, представлена в виде нелинейной регрессии (Гипербола!!!).

В дальнейшем нами была проведена серия экспериментов, в которых было продемонстрировано, что культуры Chorella sp., отмытые в средах без фосфора ТА- Р / 4M или TA-P/NaCl и разбавленные до начальной концентрации хлорофилла равной ~1 мкг/мл в соответствующей среде ТА-Р /4M или TA-P/NaCl, проходят определенные физиологические стадии. В начале культивирования культуры Chorella sp. выделяли кислород (рисунок 6 среда TA-P/NaCl; рисунок 7 среда ТА-Р/ЧМ), на этом этапе культуры накапливали крахмал. Очевидно, что существование значительных запасов внутриклеточного фосфора позволяло культурам Chorella sp. расти непрерывно в течение нескольких дней до исчерпания фосфатов. За фазой выделения кислорода наступала фаза поглощения кислорода, и это наблюдалось во всех культурах, на этом этапе все культуры вне зависимости от добавления СО2 начинали потреблять крахмал (рисунок 6 Б,Г; рисунок 7 Б,Г). Затем следовала анаэробная фаза, и далее все культуры выделяли водород с последующей фазой терминации. Культуры Chlorella sp., культивируемые в среде TA-P/NaCl, имели более длительные фазы выделения кислорода, поглощения кислорода и выделения водорода в сравнении с культурами, инкубируемыми в среде ТА-Р/ЧМ независимо от добавления СО2 (Таблица 3 ).

Таким образом, нами было продемонстрированно, что Р-дефицитные культуры Chlorella sp. Проходят через следующие физиологические стадии: фаза роста, выделения кислорода и накопления крахмала; стадия поглощения кислорода; стадия выделения водорода и стадия терминации. Переход культуры из стадии выделения кислорода в стадию поглощения происходит в момент, когда скорость фотосинтеза равняется скорости дыхания. Будущие исследования должны прояснить разницу в процессах адаптации Р-дефицитной культуры Chlorella sp. на стадиях поглощения и выделения кислорода. Но очевидно, что эти стадии совершенно различны по своей физиологии и поэтому должны быть разделены на две отдельные стадии, нежели объединены в одну кислородную стадию. Физиологические стадии адаптации Р-дефицитных культур Chlorella sp., описанные выше, отличаются от стадий адаптации к фосфорному голоданию у культур С. reinhardtii отсутствием видимой анаэробной стадии. Однако учитывая то, что мы измеряли кислород в газовой фазе, культуры могли проходить через стадию анаэробиоза, в то время как некоторое количество кислорода еще присутствует в газовой фазе, но полностью отсутствует в жидкости. Это предположение подтверждается тем, что выделение водорода уже начиналось, в то время как концентрация кислорода в газовой фазе была все еще достаточно высокой (рисунок 7 А). Наличие выделения водорода - убедительный показатель анаэробиоза в культуре, и принимая во внимание, что стадия анаэробиоза имеет продолжительность от часов до дней, и это имеет важное значение для экспрессии гидрогеназы в клетках, мы можем сделать вывод что культура Chlorella sp.

проходит через анаэробну ю стадию как и пресноводные микроводоросли, голодающие по сере или по фосфору [Antal et. al., 2003; Ghirardi et. al., 2000 ; Tsygankov et. al., 2006]. Подводя итоги можно утверждать, что морская микроводоросль Chlorella sp. проходит такие же физиологические стадии адаптации к фосфорному голоданию как и пресноводная микроводоросль С. reinhardtii.

Таблица 3. Длительность в часах различных физиологический стадий адаптации культуры Chlorella sp. к фосфорному голоданию.

Среда культивирования Стадия выделения кислорода * Стадия поглощения кислорода ** Стадия выделения водорода ***

TA-P/NaCl 137,6 ±6,1 154,7 ± 15,01 214 ± 13,53

TA-P/NaCl+C02 140,6 ±6,03 124 ±6,56 221,7 ± 10,41

ТА-Р/ЧМ 96,3 ±3,51 93,7 ±3,21 134,3 ±6,02

ТА-Р/ 4M +СО2 98 ±6,56 102,7 ±7,505 131 ±6,56

* Длительность стадии выделения кислорода определена как время с начала эксперимента до максимального количества кислорода в газовой фазе. ** Длительность стадии поглощения кислорода определена как время с момента максимального количества кислорода в газовой фазе до начата выделения водорода. *** Длительность стадии выделения водорода определена как время с начала и до остановки выделения водорода. Данные представленные в таблице представляют собой результаты трех независимых экспериментов со стандартным отклонением, посчитанным в Microsoft Office Excel 2007.

Таким образом, используя разработанный нами метод получения голодающих по фосфору культур нами впервые показано значительное выделение водорода морским штаммом Chlorella sp. как в искусственной, так и натуральной морской воде.

Продемонстрировав, что культура Chlorella sp. способна выделять водород в условиях фосфорного голодания, мы поставили целью увеличение выхода водорода в этих условиях. Одним из способов увеличения выхода водорода является увеличение количества запасенного крахмала на стадии выделения кислорода в процессе фосфорного голодания. Таким образом, в следующей серии экспериментов мы исследовали влияние СОг на количество запасенного крахмала и выделение водорода у Р- дефицитных культур. Диоксид углерода является дополнительным источником углерода для роста и накопления крахмала в культуре микроводорослей. Адаптация культур к недостатку фосфора сопровождается накоплением крахмала на стадии выделения кислорода.

Количество накопленного крахмала в течение первых стадий адаптации к недостатку фосфора в среде TA-P/NaCl увеличилось в 1,84 раза после добавления углекислоты, выделение водорода увеличилось в 1,6 раз (рисунок 6 А-Г). Однако, не наблюдалось существенной разницы как в уровне накопления крахмала, так и в выделении водорода при добавлении диоксида углерода в процессе фосфорного голодания в среде ТА-Р/ЧМ. Химический анализ морской воды Черного моря выявил наличие высоких концентраций карбонатов и гидрокарбонатов, которые служили дополнительными источниками углерода для культуры Chlorella sp. (Таблица 4). Таким образом, в воде Черного моря уже имеется значительное количество СО2. Это объясняет отсутствие увеличения выделения водорода при добавлении СОг и использовании черноморской воды. В обоих случаях при использовании сред ТА-Р/ЧМ и TA-P/NaCl накопление крахмала было максимально на стадии выделения кислорода с последующим потреблением крахмала на стадии поглощения кислорода (рисунок 6 Б, Г; рисунок 7 Б, Г). Значительное количество запасов крахмала было потреблено на стадии поглощения кислорода. Таким образом, в серии экспериментов с добавлением диоксида углерода было продемонстрировано, что выход водорода может быть увеличен. Взаимосвязь количества накопленного крахмала и уровня выделения водорода в процессе фосфорного голодания в среде TA-P/NaCl (рисунок 6 А-Г), предполагает возможность дальнейшего увеличение выхода водорода. Так, например, в случае с голодающей по сере фотоавтотрофной культурой C.reinhardtii удалось увеличить количество выделившегося водорода изменяя условия культивирования и используя разные световые режимы на стадиях выделения

кислорода и водорода. Также принимая во внимание длительность стадии поглощения кислорода и количество потребленного крахмала на этой стадии, возможно искусственно удалять кислород на этом этапе (например, продувая аргоном), таким образом ускоряя процесс перехода в стадию анаэробиоза и сохраняя запасы крахмала для потребления на стадии выделения водорода. Очевидно, для более тщательного определения метаболических путей, вовлеченных в процесс фотовыделения водорода при фосфорном голодании у культур Chlorella sp., необходима серия дополнительных исследований. Тем не менее физиологический ответ культуры Chlorella sp. на недостаток фосфора демонстрирует значительное сходство с пресноводной микроводорослью С. reinhardtii: культуры проходят одинаковые физиологические стадии адаптации, а именно стадию выделения кислорода и накопления крахмала, стадию потребления кислорода, очевидно в связи с инактивацией ФС2 , переход в анаэробиоз, и стадию выделения водорода с последующей стадией терминации.

Таблица 4. Химический состав морской воды Черного моря, используемой в экспериментах по изучению влияния фосфорного голодания в среде ТА-Р/ЧМ.

Компоненты Концентрация, мкг/мл

СОз " 11,4 ±0,8485

НСОз" 184,22 ± 1,7253

CI" 10530 ±330,93

S04" 1402,44 ± 15,373

Са+ + 258 ±2,8284

675,6 ±5,0912

к+ 225,475 ±6,371

Na+ 5857,49 ± 187,37

Р2О5 0,005251 ±0,002

Сухой остаток 21055± 63,639

Время, ч

Рисунок 6. Изменение различных параметров в процессе фосфорного голодания у культуры Chlorella sp., инкубируемой в среде TA-P/NaCl с добавлением 10 % СОг в газовую фазу сосудиков [В, Г] и без добавления [А, Б]. Параметры которые были измерены: [А, В] концентрация кислорода в газовой фазе сосудиков и объем выделившегося водорода; [Б, Г] концентрация хлорофилла (а+b); количество накопленного клетками крахмала и содержание ацетата в среде. Измерения произведены в трех независимых повторностях.

100 200 300 Время, ч

Рисунок 7. Изменение различных параметров в процессе фосфорного голодания у культуры Chlorella sp., инкубируемой в среде ТА-Р/ЧМ с добавлением 10 % СОг в газовую фазу сосудиков [В, Г] и без добавления [А, Б]. Параметры, которые были измерены: [А, В] концентрация кислорода в газовой фазе сосудиков и объем выделившегося водорода; [Б, Г] концентрация хлорофилла (а+b); количество накопленного клетками крахмала и содержание ацетата в среде. Измерения произведены в трех независимых повторностях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наиболее экологически чистым способом получения водорода является разложение воды за счет солнечной энергии, причем конечным продуктом сгорания водорода является также вода. Зеленые микроводоросли могут выделять водород, разлагая на свету воду, но только в анаэробных условиях, так как основной фермент, отвечающий за образование водорода из протонов - гидрогеназа, очень чувствительна к кислороду [ОЫгагсП е1 а1., 2005; ОгеепЬаиш И. а1.,1998]. Таким образом, получение заметных количеств водорода требует постоянного удаления из культуры выделяющегося в процессе фотосинтеза кислорода. Открытие Мелисом в 2000 году длительного выделения водорода культурами микроводоросли в условиях недостатка серы на свету вызвало значительный интерес исследователей к данному процессу. В клетках Б-дефицитных водорослей происходит частичная инактивация ФС-2, что приводит к снижению скорости фотосинтетического выделения О2, переходу культуры в анаэробное состояние и, как следствие, синтезу гидрогеназы [Козоиют й а1., 2002]. Позднее Быковым и соавторами было показано, что помимо серы отсутствие фосфора в среде также приводит к деградации ФС-2 [\Vykoff й а1., 1998], однако к началу наших исследований оставался нерешенным принципиальный вопрос - способны ли зеленые микроводоросли к выделению Н2 в условиях недостатка фосфора, также ничего не было известно и о механизмах, лежащих в основе данного процесса, и об основных факторах внешней среды, влияющих на данный процесс.

В нашей работе был разработан метод получения культур С. гетаЫШ способных к выделению водорода в условиях недостатка фосфора. Необходимость в его разработке была вызвана тем, что обычный способ отмывания не приводил к недостатку фосфора в культурах, очевидно, за счет наличия запасного фосфора в клетках. Для получения Р-дефицитных культур С. гетагЛи подбирались различные начальные концентрации хлорофилла путем внесения фосфора только с клетками инокулята в среду без фосфора. Разработанный нами метод позволил получить культуры, голодающие по фосфору. К сожалению, этот метод обладает тем

же недостатком, что и метод разведения: фаза выделения кислорода за счет длительного роста культур получается протяженной. Однако наш метод позволяет разводить культуры в большей степени, чем метод разбавления.

Нами было показано, что культуры, отмытые от фосфора и разбавленные до начальных концентраций хлорофилла менее 2 мкг/мл, переходят в состояние фосфорного лимитирования после потребления внутриклеточных запасов фосфора в процессе роста с последующим переходом в анаэробиоз и стадию выделения водорода. В экспериментах с Р - дефицитными культурами С. reinardtii в контролируемой системе биореакторов нами показано, что культуры, разбавленные до начальной концентрации хлорофилла равной 1,5 ±0,2 мкг/мл, при инкубации без фосфора проходили те же фазы адаптации к недостатку фосфора, как и S-дефицитные культуры: сначала культуры выделяли кислород, затем наступала фаза поглощения кислорода, анаэробная фаза, и далее культуры выделяли водород с последующей фазой терминации [Kosourov et. al. 2002]. Таким образом, нами впервые обнаружено выделение водорода микроводорослями в условиях голодания по фосфору и показана схожесть процессов адаптации микроводорослей к недостатку фосфора и недостатку серы.

Обнаружив возможность выделения водорода Р-дефицитными культурами С. reinardtii с использованием разработанного нами метода, было решено применить этот метод для получения водорода Р-дефицитными культурами морской микроводоросли Chlorella sp. Нами впервые была продемонстрирована способность морской микроводоросли Chlorella sp. к возникновению анаэробиоза и к значительному выделению водорода в условиях недостатка фосфора при использовании искусственной морской воды и натуральной морской воды Черного моря. Также было показано, что культуры Chlorella sp., разбавленные до начальной концентрации хлорофилла равной 0,5-1,5 мкг/мл, проходили те же фазы адаптации к недостатку фосфора как и Р или S- дефицитные культуры С. reinhardtii: сначата культуры выделяли кислород, затем наступала фаза поглощения кислорода, анаэробная фаза, и далее культуры выделяли водород с последующей фазой терминации. Примечателен тот факт, что к моменту начала наших исследований, работы во всем мире, связанные с морскими микроводорослями, были направлены на получение водорода в условиях недостатка серы, в то время как добиться лимитирования по сере с использованием искусственной воды с добавлением NaCl практически невозможно, т.к. даже сверх очищенный NaCl [Sigma, product No 13423] содержит 200 мг сульфатов на 1 кг NaCl , в то время как содержание фосфатов в NaCl ничтожно мало. Невозможно добиться лимитирования по сере и в натуральной морской воде, в связи со значительным содержанием в ней сульфатов -0.028 М [Lyman, J.; Fleming, 1940], что даже выше насыщающих концентраций серы в среде ТАР (0,016 М). В свою очередь содержание фосфатов в мировом океане очень незначительно, к примеру в Тихом и Атлантическом океане содержание фосфатов варьирует от 0,07 до 0,2 мкМ в зависимости от загрязнения вод. В совокупности все эти факторы приводили к тому, что максимальные выходы водорода, полученные у морских микроводорослей в условиях серного голодания, составляли микролитры Н2 в расчете на 1 л культуры , и увеличение достигалось только при использовании ингибиторов ФС2 типа диурона и СССР [Ran et. al., 2006, Zhang t.al., 2012]. При этом авторы не доказывали, что при удалении серы из среды ими достигалось серное голодание.

Таким образом, тот факт, что нами впервые были продемонстрированы значительные выходы водорода у Р- дефицитных культур морской микроводоросли Chlorella sp., открывает перспективы использования неограниченных ресурсов морской воды для продукции водорода.

ВЫВОДЫ:

1. Разработан метод получения культур пресноводных и морских микроводорослей, голодающих по фосфору.

2. Впервые показана способность к значительному выделению водорода голодающими по фосфору пресноводными культурами С. reinhardtii.

3. Впервые показана способность к значительному выделению водорода голодающими по фосфору культурами Cloretla sp. как в искусственной морской воде, так и в воде Черного моря.

4. Показано, что добавление СОг к голодающим по фосфору культурам морской

Chlorella sp. приводит к значительному увеличению выходов водорода, по-видимому, вследствие повышенного начального накопления крахмала.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых научных журналах:

1. К.А. Batyrova, A.A. Tsygankov and S.N. Kosourov. Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived Chlamydomonas reinhardtii cultures. // International Journal of Hydrogen Energy. 2012. Issue 37: 8834-8839.

2. S.N. Kosourov, K.A. Batyrova, E. Petushkova, A.A. Tsygankov, M.L. Ghirardi, and M. Seibert. Maximizing the hydrogen photoproduction yields in Chlamydomonas reinhardtii cultures: the effect of the H2 partial pressure. //International Journal of Hydrogen Energy 37. 2012. pp. 8850-8858.

3. Khorcheska Batyrova, Anastasia Gavrisheva, Elena Ivanova, Jianguo Liu, Anatoly Tsygankov. Sustainable Hydrogen Photoproduction by Phosphorus-Deprived Marine Green Microalgae Chlorella sp. // Int. J. Mol. Sci. 2015. 16, 2705-2716.

Тезисы в сборниках конференций:

1. К.A. Batyrova, Anatoly A. Tsygankov, Sergey N. Kosourov.

Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived green algae - Abstr. The 9th International Hydrogenase Conference in Sweden, Uppsala, 06/27 - 07/2, 2010.

2. K.A. Batyrova, Anatoly A. Tsygankov, Sergey N. Kosourov.

Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived Chlamydomonas reinhardtii. - Abstr. International conference "Photosynthesis Research for Sustainability", Baku Azerbaijan, from July 24 to 30, 2011.

3. K.A. Batyrova, Anatoly A. Tsygankov, Sergey N. Kosourov.

Sustained hydrogen photoproduction by phosphorus-deprived Chlamydomonas reinhardtii-Fraunhofer-Delaware Technology Summit "Energy and Life Sciences - Solutions for Sustainability", March 5/6 2013 at the University of Delaware.

4. K.A. Batyrova, Anastasia I. Gavrisheva, Anatoly A. Tsygankov. Sustained hydrogen photoproduction by phosphorous-deprived marine green microalgae Chlorella C65. - International conference Photosynthesis Research for Sustainability in honor of Vladimir A. Shuvalov June 2-7 2014 Pushchino, Russia.

Список сокращений:

ТАР — трис-ацетат-фосфатная среда;

ТА-Р — трис-ацетатная среда без фосфора;

TA-S — трис-ацетатная среда без серы;

TA-S-P— трис-ацетатная среда без серы и без фосфора;

ФС1 —Фотосистема 1;

ФС2 — Фотосистема 2;

Хл. — Хлорофилл;

Гд — гидрогеназа;

DCMU — 3-[3,4- дихлорфенил]-1,1-диметилмочевина (диурон);

СССР— карбонил-цианид-3-хлорфенилдразон;

С. vulgaris — Chlorella vulgaris;