Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серы

Толстыгина, Ирина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серы
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серы"

На правах рукописи

ТОЛСТЫГИНА Ирина Викторовна

ВЫДЕЛЕНИЕ ВОДОРОДА СНЬАМУООМОЫАЗ КЕШНАКОТП В УСЛОВИЯХ НЕДОСТАТКА СЕРЫ

03.00.12- биохимия и физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Пущино - 2007

003162326

Работа выполнена в Институте Фундаментальных проблем биологии

РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук Цыганков Анатолий Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Гоготов Иван Николаевич кандидат биологических наук Кукарских Галина Павловна

Ведущая организация: Институт Физиологии растений, РАН

Защита диссертации состоится 14 ноября 2004 г В 11 часов на заседали диссертационного совета Д 002 006.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН по адресу 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН (г. Пущино, Московской обл , ул Институтская, 2)

Автореферат разослан октября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Назарова Г Н

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы

Светозависимое образование водорода зелеными микроводорослями обнаружено более 60 лет назад (Gafron and Rubm, 1942), и до недавнего времени данный процесс рассматривался как пример неэффективного расходования поглощенной световой энергии Считается, что физиологическая роль выделения водорода в анаэробных условиях заключается в сбросе избытка восстановителя (Appel, Shultz, 1998), хотя экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу для зеленых микроводорослей, отсутствуют

Эффективность преобразования энергии света при выделении водорода микроводорослями достигает 50% и более (Boichenko et al, 2004) Поэтому, начиная с 70 годов прошлого века постоянно ведутся исследования в попытках использовать данный процесс для запасания солнечной энергии в виде топлива - водорода (Benemann, 1996, 2002) Принципиальным ограничением на пути исследований стоял тот факт, что выделение водорода микроводорослями происходит одновременно с выделением кислорода (и в стехиометрии близкой к биофотолизу воды) Выделяющийся кислород ингибирует активность гидрогеназы и репрессирует ее синтез Поэтому выделение водорода микроводорослями было кратковременным и останавливалось при появлении кислорода в среде Попытки подавления выделения кислорода (например при добавлении диурона) увеличивали длительность процесса, но снижали его скорость, поскольку фотосистема 2 (ФС2) является основным донором электронов в данных условиях (Boichenko, 1996) Более того, добавление различных ингибиторов делало систему необратимой и непригодной для использования в качестве «преобразователя» солнечной энергии

Значительный интерес исследователей вызвало сообщение из Калифорнийского университета (Mehs et al, 2000) о том, что микроводоросли Chlamydomonas reinhardin способны в фотогетеротрофных условиях к длительному выделению значительных количеств водорода, если их поместить в условия недостатка серы Авторы назвали такую систему двустадийной, поскольку появилась возможность, чередуя избыток и недостаток серы, получать водород в две стадии Показано, что такая система в принципе способна осуществлять несколько циклов Авторы считали, что эта система

использует только фотосистему 1 (ФС1), причем в фазе выделения водорода основными источниками восст ановителя являются продукты разложения белков Значительного изменения содержания крахмала замечено не было К началу наших исследований уже было известно, что, несмотря на анаэробные условия, ФС2 все же принимает участие в донировании электронов ФС1, а образующийся при этом кислород поглощается при дыхании (Антал и др , 2001) В то же время в механизме выделения водорода голодающими по сере микроводорослями оставалось много неясного В частности, оставался нерешенным принципиальный вопрос - является ли наличие ацетата необходимым условием для выделения Н2, т е возможен ли процесс в автотрофных условиях9 Кроме того, неясна физиологическая роль выделения водорода для водорослей Цель и задачи работы.

Целью наших исследований было изучение особенностей выделения водорода зеленой

мироводорослью С гетИагс1П1 в условиях недостатка серы

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

разработать новый метод перевода культур в условия недостатка серы, отличающийся простотой и повышенной надежностью при работе с чистыми культурами,

выявить основные факторы, влияющие на процесс выделения водорода фотогетеротрофными культурами,

выяснить возможность выделения водорода фотоавтотрофными культурами и определить оптимальные условия для протекания данного процесса,

проверить, обеспечивает ли светозависимое выделение водорода поддержание жизнеспособности культур в условиях избытка восстановителя Научная новизна.

водорода фотоавтотрофных культур на разных стадиях процесса Показано, что выделение водорода S-дефицитными культурами является не единственным защитным механизмом сохранения жизнеспособности клеток в условиях избытка восстановителя Практическая значимость

Предложен новый метод получения голодающих по сере фотогетротрофных культур, который отличается простотой, надежностью и по выходу водорода не уступает традиционному методу Результаты по влиянию различных факторов на физиологическое состояние S-дефицитной культуры позволяют рекомендовать оптимальные условия для максимального выделения водорода, а также для выделения водорода при использовании интенсивностей света приближенных к естественным Разработан метод получения водорода в фотоавтотрофных условиях без использования дорогостоящего органического субстрата, что делает процесс экономически более выгодным Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на III Всероссийском съезде биофизиков (Воронеж 2004), XVI зимней школе «Перспективные направления в биохимии и биотехнологии» (Москва, 2004), Международной конференции Biohydrogen 2002 (Нидерланды), 15 Международном конгрессе по водородной энергетике (Йокогама, Япония, 2004), XVIII Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), Международной конференции «Биологические способы выделения водорода» (Порто, Португалия, 2005), Международном конгрессе по водородной энергетике (Стамбул, Турция, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру структура и функции фотосистем» (Пущино, 2006), 16 Международной конференции «Фотохимическое преобразование и сохранение солнечной энер1ии» (Уппсала, Швеция, 2006), Международном Форуме «Водородные технологии для производства энергии», 2006, Москва Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 1 - в зарубежном журнале списка ВАК (J Biotechnology), 2 - в Int J Hydrogen Energy, 9 тезисов докладов на отечественных и международных конференций

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и

их обсуждения, заключения, вывода и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на /^¿страницах, иллюстрирована «//рисунками и таблицами Список литературы содержит /^источника (из них/ 5Уна английском языке)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследования использовали Chlamydomonas remhardtu Dang с137+ Культуру выращивали на трис-ацетат-фосфатной среде (ТАР), pH -6 9, при 28°С на свету (100 дЕт"V1) Для экспериментов по изучению выделения водорода в фотоавтотрофных условиях культура выращивалась на высокосолевой (HS) среде (Harns, 1989) при pH -7 0 и с постоянной продувкой воздухом с 2% С02 В среде без серы сульфаты металлов заменяли на эквивалентные количества хлоридов (MgCl2, CuCl2, FeCI3, ZnCl2) В зависимости от целей экспериментов при выращивании фотоавтотрофной культуры интенсивность света составляла 25 ¿lEm'V1 (низкая интенсивность света) или 120 ¿lEm'V (высокая интенсивность света)

Эксперименты по выделению водорода с использованием S-дефицитных культур, проводили в разных типах сосудов в зависимости от цели эксперимента При отработке метода получения голодающих по сере культур, при изучении выживаемости культур, а также в экспериментах по изучению влияния концентрации водорода и интенсивности света на физиологические параметры культуры использовали герметичные сосудики 14 5 мл или 40 мл Соотношение газовой фазы и культуры, концентрация клеток, интенсивность света, время ипкубации указаны в описании экспериментов Концентрацию Н2 в газовой фазе определяли методом газовой хроматографии В большинстве экспериментов культуры инкубировали в 500 мл сосудах (диаметром 6 см) с перемешиванием (300 об/мин), при интенсивности света, указанной для каждого эксперимента отдельно Сосуды были закрыты силиконовой пробкой с газоотводной трубкой Выделяющийся газ накапливали в мерных цилиндрах, перевернутых днищем вверх и заполненных водой (Рис 1), его состав определяли методом газовой хроматографии

Кроме того, эксперименты с фотоавтотрофиой культурой при контролируемом рН проводили в фотобиорсактope (ФБР). Схема установки для изучения выделения водорода в фотоавтотрофных условиях представлена на Рис. 1. Четыре стеклянных биореактора (550 м.л), помещали в термо стати р уем у ю водяную баню (28 + 0.2 °С), и освещали с двух сторон люминесцентными лампами. Содержание кислорода в культуре и рН измеряли соответствующими датчиками, соединенными с компьютером. Выделяющийся газ накапливали в мерных цилиндрах, рН среды контролировали добавлением стерильного С02 во время фото синтетической фазы.

Рис. 1. Схема экспериментальной установки, 1-компьютер, 2-термостат, 3-цилиндры, 4-электромагнитные клапаны, 5-краны, <5-фо I обиорсактор, 7-датчик температуры, 8-охладитель, У-нагрепатель. Данная установка была разработала Косоуровым С.Н. в лаборатории «Биог^хнолог ии и физиологии фототрофных организмов».

Для получении Я-дефшгитны^ культур методом отмывания клетки, выросшие на среде с серой (ТАР+8 или НЙ-ьЯ среда), осаждали центрифугированием (2000 х g, 5 мин), отмывали от серы средой без сульфатов (ТАР-5, ПЯ-8), внош. центрифугировали и суспсндаровдш« « ТАР-Э среде (Ме1|Ь а1 а!., 2000). Концентрация хлорофилла

составляла 10-17 мг/л. Для получения 5-дефинитных культур методом посева и среду с лимитирующей концентраций» серы в ТАР среду с начальной концентрацией серы (20-250 мкМ) добавляли 1.4% культуры, выросшей на ТАР+З среде. Для получения Б-дефицитных культур методом разбавления средой без

серы культуру, выращенную на TAP+S среде инокулировали в среду, не содержащую серы (концентрация инокулята 7 5-30 %) По мере потребления остаточных концентраций серы культуры переходили в состояние лимитирования серой. Интенсивность падающего света измеряли с четырех сторон в трех точках на различной высоте сосуда и вычисляли среднюю интенсивность света Среднюю интенсивность света рассчитывали при помощи разработанного математического аппарата, учитывая диаметр сосуда, концентрацию клеток и интенсивность падающего света Жизнеспособность, т е долю живых и мертвых клеток определяли отработанным методом окрашивания с метиленовой синью и феносафранином по 0,0025% Общее количество клеток определялось методом счета в камере Горяева При изучении влияния высоких интенсивностей света и концентраций кислорода на физиологические параметры, культуры выращивались при полной обеспеченности серой в фотоавтотрофных условиях при низкой (16 /¿Em'V1) или высокой (94 дЕпЛ"1) интенсивности света, затем отмывались от серы и культивировались на среде без серы при интенсивности света 150 /xEm'V или 420 /lEm'V После 10 ч культивирования в фотобиореакторе (рН статирования) отбирали по 20 мл культуры и инкубировали в 40 мл сосудах при различной интенсивности света (150, 400, 800, 830 pEm'V1) и различной концентрации кислорода в газовой фазе (100% или 21%) Скорость фотосинтеза измеряли при помощи электрода Кларка через определенные промежутки времени Крахмал измеряли как эквивалент глюкозы после ферментативного гидролиза, используя Glucose GOD FS kit (DiaSys, Germany) согласно Gfeller and Gibbs (Gfeller and Gibbs, 1984) Концентрацию хлорофилла определяли спектрофотометрическим методом после экстракции 95% этанолом (метод Шприцера) на спектрофотометре (UV mini 1240)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение голодающих по сере культур различными способами.

Стандартный способ получения голодающих по сере культур включает в себя предварительное выращивание культур при полной обеспеченности серой, отмывание от серы посредством нескольких центрифугирований и инкубацию в среде без серы Это метод достаточно трудоемкий, требует затраты энергии, времени и не гарантирует стерильность культуры Поэтому нами был разработан новый метод получения S-дефицитных культур, при котором культуры сразу же выращиваются при пониженной

концентрации серы Следовало подобрать оптимальную концентрацию серы, которая обеспечивала бы достаточное увеличение биомассы клеток, и в то же время могла быть полностью потребленной Учитывая, что сера может содержаться как в среде, так и в инокуляте, возможны две модификации такого подхода В первой модификации использовали среду без серы, но варьировали долю инокулята Во второй использовали низкий процент инокулята и варьировали количество серы в среде Оптимальными условиями для получения водорода оказалось добавление 40 мкМ серы в среду при низкой доле инокулята или добавление 10% инокулята в среду без серы

Новые методы получения голодающих по сере культур отличаются, прежде всего, длительной фотосинтетической фазой и большим количеством выделившегося кислорода (30-35 мл/л), что может оказаться критическим для дальнейших экспериментальных исследований (Табл 1) Эта особенность связана с совмещением наращивания биомассы и последующего перехода в состояние

лимитирования серой Тем не менее, культуры, полученные первым методом (10% инокулята) выделяли водород в количествах, сравнимых с культурами, полученными стандартным способом (140 мл/л) Вместе с тем этот метод удобнее стандартного, например, при изучении функций гидрогеназ в условиях недостатка серы, поскольку поддержание чистоты культур не вызывает затруднений

Основные факторы, влияющие на выделение водорода голодающими по сере микроводорослями в фотогетеротрофных условиях.

К началу наших исследований выделение водорода голодающими по сере микроводорослями было только обнаружено Поэтому представлялось необходимым изучить влияние ряда факторов на сам процесс и выявить основные из них

Таблица 1. Выделение водорода голодающими по сере культурами, полученными различными способами.

Параметры Метод отмывания (стандартный) Метод посева в ТАР-Э среду 10% инокулята (I) Метод посева 1,4% инокулята в ТАР-Б среду, содержащую 40мкМ серы (П)

Время предварительного наращивания культур в ТАР+Э среде (ч) 63±10 0 0

Время начала анаэробиоза (ч) 24±1,5 42±3 70±2

Общее количество кислорода, выделившегося в фотосинтетическую стадию (мл/л) 10±2 35+2,5 30±3,5

Скорость выделения водорода (мл/ч*л) 2,9±0,1 2,6±0,4 2,4±0,2

Выделение водорода (мл/л) 180±10 140±7 100±10

Влияние повышенных концентраций водорода и протока аргона В наших экспериментах концентрация водорода в газовой фазе достигала 70% Из термодинамических соображений накапливающийся водород может ингибировать сам процесс выделения водорода Это показано как для светозависимого выделения водорода пурпурными бактериями (Tsygankov й а1, 1998), так и для микроводоросли С гетЫгйЫ в условиях избытка серы (ОгеепЬацт е1 а1,1988) И в том, и другом случае подтверждением наличия эффекта служили эксперименты по удалению выделяющегося водорода потоком инертного газа В случае с голодающими по сере микроводорослями мы провели два типа экспериментов добавление водорода перед началом процесса выделения водорода или удаление образующегося водорода при продувании культуры аргоном

В первом случае эксперименты проводили с 40-мл герметичными сосудами (см Методы) Так как выделение водорода продолжалось в течение всего эксперимента, концентрация водорода была переменной величиной, поэтому в качестве характеристики использовали среднюю концентрацию водорода между начальной (определяемой добавлением водорода) и конечной (Рис 2) Поскольку при 100%

концентрации водорода в газовой фазе выделение водорода нельзя измерить с помощью газовой хроматографии, параллельно проводились измерения манометрическим методом, причем данные, полученные двумя методами, оказались близкими

120 100 80

60 40 20

'л

О ГХ метод

# манометрический метод

0 20 40 60 80 100

Средняя концентрация водорода в газовой фазе,'

Рис.2. Влияние добавленного водорода на выделение водорода Б-дефицитными культурами С гетИагМи. Начальная концентрация хлорофилла 12-14 мкг/мл.

Как видно из Рис 2 общее количество выдетяющегося водорода снижается по мере увеличения концентрации добавленного водорода до 40% Добавленный водород в концентрации выше 40 % в газовой фазе не приводил к дальнейшему снижению выделения водорода культурами (40 мкл/мл) (Рис 2) Таким образом, высокие концентрации водорода снижали выделение Н2 примерно в 2 раза В следующей серии экспериментов мы удаляли выделяющийся водород продуванием 500-мл реактора аргоном Продувка начиналась после 24 ч серного голодания, когда культура переходила в анаэробиоз Продувание аргоном позволило поддерживать низкую концентрацию водорода 0,1-0,3 %, при этом выход водорода возрастал в 2,5 раза, а максимальная скорость в 4,6 раз (Рис 3) Таким образом, снижение концентрации водорода в газовой фазе стимулирует выделение водорода Тем не менее, нельзя исключить, что продувка аргоном оказывает стимулирующий эффект не только посредством удаления избытка водорода, но и за счет удаления кислорода, выделяющегося в процессе работы ФС 2 на свету (Рис 3)

10 20 30 40 50 60 70 80 время, ч

Рис. 3. Выделение водорода культурами С гетНагЛи при продувании аргоном. Аргон (30 мл/мин) включали на 24 ч, т.е. при переходе культуры в анаэробные условия.

90 100 110 120 130

Влияние интенсивности падающего света, средней интенсивности света в фотобиореакторе, концентрации ацетата и хлорофилла на выделение водорода Известно, что высокие интенсивности света ингибируют продолжительное выделение водорода у зеленых водорослей, культивируемых на обычных содержащих серу средах и адаптированных к темновым анаэробным условиям Поскольку к началу наших исследований считалось, что в выделении Н2 при серном голодании участвует только ФС 1, то увеличение интенсивности света могло бы привести к увеличению выхода водорода Наши эксперименты показали, что у бессерных культур выделение Н2 действительно возрастает с увеличением интенсивности света, но высокие интенсивности ингибируют выделение Н2 Это ингибирование связано с увеличением активности ФС 2 не только в фотосинтетической фазе, но и в начале выделения водорода Оптимальная интенсивность падающего света не зависела от метода получения культур и концентрации ацетата, но возрастала с увеличением концентрации хлорофилла и толщины слоя культуры (Рис 4)

Рассчитанная с помощью специального математического аппарата, средняя интенсивность света в ФБР, учитывающая интенсивность падающего света, концентрацию клеток и толщину слоя, составляла 20-30 дЕгп V независимо от способа получения культуры Сходный характер зависимости выделения Н2 от интенсивности света наблюдался при различных концентрациях ацетата - 12, 17, 32 мМ

Рис. 4. Влияние интенсивности света на выделение водорода культурами, полученными (А) - методом разбавления (10% инокулята), (В) - методом отмывания. Концентрация ацетата: 12 мМ-в, 17 мМ- А, 34 мМ- о. Содержание хлорофилла: (1)- 8, (2)-15, (3)-22, (4)- 30 мкг/мл.

Но суммарный выход водорода снижался уже при 12 мМ ацетата, а без ацетата выделения Н2 не наблюдалось Однако получение водорода без использования органических субстратов представляется гораздо более перспективным и вполне реальным В фотогетеротрофной культуре ацетат используется клетками СЫатус1отопа5 в фотосинтетической стадии как источник углерода для синтеза крахмала, а в фазе поглощения кислорода - как субстрат для дыхания Естественно было предположить, что в фотосинтетической стадии клетки могут использовать углекислоту, а в фазе поглощения кислорода - накопленный крахмал

Выделение водорода в-дефицитнычи культурами в фотоавтотрофных условиях.

В первых экспериментах с фотоавтотрофными культурами в качестве источника углерода использовали бикарбонат, причем концентрацию буфера удваивали во избежание защелачивания При этом выделение Н2 было небольшим (9 мл/л) и часто вообще отсутствовало В последующих экспериментах в качестве источника углерода использовался углекислый газ, причем была разработана система рН-статирования ФБР, которая регулировала подачу С02 по мере его потребления (т е в ответ на изменение рН) Как выяснилось, существенным фактором является длительность подачи С02

Если С02 подавали в течение первых 20 часов, фотоавтетрофные культуры проходили основные фазы адаптации к недост атку серы: m.iделение кислорода (1), поглощение кислорода (П), анаэробная фаза (III) и фаза выделения водорода (IV). Однако время перехода в анаэробиоз у фотоавтотрофных культур было больше, чем у фотогегер о'фо фиых (50 ч), а количество выделившегося водорода было небольшим (10 мл/л). При этом длительность перехода в анаэробные условия была связана в Основном с увеличением фазы поглощения кислорода. При увеличении времени подачи СО, до 40-45 ч сокращалась фаза перехода в анаэробиоз и выделение водорода возрастало почти вдвое. Тем не менее, воспроизводимость результатов оставалась невысокой, а общий выход водорода был все еще значительно ниже, чем у фото гетеротрофных культур.

i 1 СО? aoftaBjIrciäAc f II , II

\/ t 1 1« 1% I 1 ¡A tí i 1 , ,/ v Ii iL" \ 1 1 Ж1 V > 1 fill \ 1 ! Iii v j

1 1 II 1 III 1 IV i V

k 1 1 M К 1 ' ? * /i t i у

\ ГлЦУ / ! крахмал 2 t /"Os^.

i i

1 Ч I I/

■ г,ч

Рис. 5, Адаптация культур С. reinhardtii к недостатку серы в фотоавтотрофных условия*. I, II, Ш, TV, V фазы серного голодания культуры.

0 20 W 60 S0 100 lio Е40 1Í0 ISO

Известно, что продукты разложения крахмала являются донорами электронов для выделения водорода в условиях недостатка серы у ф ото гетеротрофных культур (Melis, 2002). Мы предположили, что увеличение количества накопленного крахмала может способствовать большему выделению водорода и фотоавто трофными культурами.

Поскольку крахмал - продукт фотосинтеза, его накопление должно зависеть от интенсивности света

Таблица 2. Влияние интенсивности света на накопление/деградацию крахмала и выделение водорода в- дефицитными культурами С. гетНаг&и вотоавтотрофных условиях.

Интенсивность света, (jiEm'V Накопление крахмала, ммоль глюкозы/л Начало анаэробиоза, ч Потребление крахмала, ммоль глюкозы/л Общее количество водорода, мл/л

Выращивание Серное голода ние Анаэро биоз

120 20 20 0,36 ± 0,07 91-оо 0,19 ±0,10 0

120 110 110 0,59 ±0,12 58-°° 0,40 ±0,19 4,4 ± 4,7

25 20 20 0,24 + 0,03 49,5-°° 0,16 ±0,04 7,3 ± 10,4

25 110 110 0,86 ±0,34 22,5-69 0,77 ±0,27 31,8 ±10,8

25 110 20 0,78 ±0,11 22-65 0,71 ±0,11 56,4 ± 16,7

Действительно, содержание крахмала увеличивалось с увеличением интенсивности света во время серного голодания Это было обнаружено у культур двух типов выросших при иизкой (25 /iEm V) и высокой (120 /iErnV1) интенсивности света (Табл 2)

Однако существенное выделение водорода наблюдалось только у культур, выросших при низкой интенсивности света и инкубируемых при высокой интенсивности света во время серного голодания Более того, был подобран переменный световой режим во время фазы серного голодания высокая интенсивность света в фотосинтетической фазе (I, II) и низкая интенсивность света во время анаэробиоза (III) Это позволило дополнительно увеличить выход водорода до 60 мл/л

Полученные данные свидетельствуют о том, что свет играет различную роль в разных фазах серного голодания фотоавтотрофных культур В фазе выделения кислорода (I) повышенная интенсивность света необходима для накопления клетками крахмала В фазе поглощения кислорода (II) и выделения водорода (IV) при пониженной

интенсивности света снижается скорость фотосинтеза, ускоряется потребление кислорода и облегчается поддержание анаэробных условий

Выделение водорода фотоавтотрофными культурами С геткагёш, выросшими при высоких интенсивностях света.

Вместе с тем остается непонятным, почему у культур, выросших при высокой интенсивности света, переход в анаэробные условия был слишком затянут, а выделение Н2 практически отсутствовало Это может объясняться тем, что свет в фазе выделения кислорода (I) не только играет роль источника энергии для накопления крахмала, но и регулирует активность ФС2 Можно предположить, что культуры, выросшие при низкой интенсивности света, впоследствии, при инкубации без серы проявляют большую чувствительность к высокой интенсивности света, чем культуры, выросшие при высокой интенсивности света Поэтому у них сильнее снижается активность ФС2, и, как следствие, они быстрее переходят в анаэробные условия Можно полагать, что снижение активности ФС2 у культур, выросших при высокой интенсивности света, будет наблюдаться при гораздо более высоких интенсивностях света во время серного голодания

Таблица 3. Влияние интенсивности света при серном голодании на время перехода фотоавтотрофных культур С геткагЖи в анаэробные условия и накопление ими крахмала в фазе выделения кислорода

Интенсивность света при серном голодании, fiEm'V1 Время перехода культур в анаэробные условия, ч Количество накопленного крахмала, ммоль глюкозы/л

110 58-<*> 0,59±0,12

175 24-60 0,53±0,20

280 24-25 0,35+0,1

420 24-25 0,25±0,17

Действительно, у таких культур при интенсивности света выше 175 ftEm"2s 1 наблюдался стабильный и воспроизводимый переход в анаэробные условия, но количество крахмала было пониженным, т е видимо, имело место подавление фотосинтеза Выделение водорода в таких опытах было незначительным Результаты

некоторых экспериментов наводили на мысль, что существенным фактором является не только высокая интенсивность света, но и повышенная концентрация кислорода -результат высокой фотосинтетической активности культур

Для проверки этого предположения нами подробно изучалась промежуточная фаза серного голодания между фазами выделения (I) и поглощения (II) кислорода Для этого использовали культуры двух типов (выращенные при низкой или высокой интенсивности света), которые инкубировали в условия серного голодания при интенсивностях света 150 и 420 pEm'V1 соответственно После 10 ч серного голодания определяли скорость выделения 02 при низкой и высокой интенсивностях света и разных концентрациях 02 (21 и 100%) Как видно из Рис 6, увеличение интенсивности света при инкубации вызывало подавление выделения 02 лишь в одном случае, а именно у культур, выросших при низкой интенсивности света и инкубируемых в атмосфере 100% 02 (Рис 6 (А)) Возможно, что у культур выросших при высокой интенсивности света не были достигнуты ингибирующие интенсивности

света (Рис 6 (В))

120 — 110- А

у 100 ■

Рис. б. Зависимость скорости фотосинтеза от интенсивности

света и концентрации кислорода в газовой фазе.

(А) - культуры выращивались при интенсивности света 16 jiEm'V1, Д-830 fiEm"V1+100% 02, А -150 цЕгп V+100% 02, о -830 (iEm'V1+21% Ог, »-150 nEm'V+21% 02.

2-1

0 2 4 6 8 10 12 14

(В)- культуры выращивались при интенсивности света 94 цЕш"2s-1,

120 110

Л-800 nEmV+100% 02, А-400

|iEm"V1+100% 02, о -800 pEm'V 421% 02, »-400 nEmV+21% 02.

20 10 0

0 2 4 6 8 10 12 14 время, ч

Что касается влияния 02, то увеличение его концентрации вызывало снижение

фотосю¡тетической активности у культур обоих типов независимо от интенсивности

света при инкубации. Причем наиболее сильно реагировали культуры, выросшие при

низкой интенсивности света, и особенно тс, которые инкубировались при высокой

интенсивности. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что

именно совместное действие повышенных концентраций кислорода и высоких

интенсивностей света приводит к подавлению фотосинтетического образования

кислорода. На основании полученных данных мы попытались подобрать условия для

значительного выделения водорода фотоавтотрофными культурами, выросшими при

высоких интенсивностях света. Для этого в фазе выделения кислорода использовали

повышенную интенсивность света и обеспечивали удаление фотосинтетического

кислорода, продувая культуру аргоном.

Рис. 7. Выделение водорода фотоавто грофной культурой С. гюнкаг&и при переменной ин генсивности света: 94 рЕпЛ'1 при выращивании, 420 V1 во время фотосинтетической фазы серного голодания и 20 цЕпЛ"1 в фазе выделения водорода. Избыточный кислород удалялся из газовой фазы продуванием аргоном (30 мл/мин) в течение 20 часов. Пунктирной линией отмечен момент прекращения подачи аргона, а сплошная линии указывает на момент уменьшения интенсивности света.

а го га да <0 .«> #> да да ю юопо

время, ч

В анаэробной фазе культуры инкубировали при низкой интенсивности света Такой подход позволил добиться существенного выделения водорода (55 мл/л) даже культурами, выросшими при высокой интенсивности света (Рис 7) Пути дальнейшего увеличения выхода водорода можно связать с изменением баланса расхода крахмала Как литературные данные, так и наши результаты говорят о том, что на свету в анаэробных условиях наряду с водородом образуются и продукты брожения, доля которых увеличивается с уменьшением рН от 8 до 6,5 Мы провели серию экспериментов, в которых уровень рН, поддерживаемого в начальной фазе серного голодания, был повышенным (7,7) В этих условиях культуры также стабильно переходили в анаэробные условия, накапливали значительные количества крахмала (1,5-1,6 ммоль глюкозы/л) образовывали некоторое количество ацетата (меньше 50 мкМ в конце эксперимента) Однако это не привело к увеличению выхода водорода, а рН в конце эксперимента был ниже 7 0 При этом лишь незначительная часть крахмала использовалась культурами для выделения водорода По-видимому, следует поддерживать рН в диапазоне 7,7-7,9 в течение всего процесса выделения водорода

Физиологическое значение процесса выделения водорода.

Кроме практического аспекта - увеличения выхода водорода - представляло интерес выяснить, какова роль фотовыделения Н2 для жизнедеятельности водорослей Считается, что в анаэробных условиях голодающие клетки не в состоянии использовать образовавшиеся в процессе фотосинтеза восстановители для общего метаболизма в связи с отсутствием серы, что приводит к перевосстановленности всей системы Активация гидрогеназы и образование водорода в этих условиях может способствовать частичному сохранению фотосинтетического электронного транспорта в голодающих клетках и поддержанию общего метаболизма Однако экспериментальных подтверждений этой точки зрения в литературе ие встречается Если процесс выделения водорода каким-то образом нарушить, это может сказаться на выживаемости клеток Возможны два экспериментальных подхода для выяснения справедливости указанного предположения Во-первых, можно попытаться замедлить или ускорить сброс восстановленных эквивалентов в условиях недостатка серы Вторым и более прямым способом является сравнительный анализ выживаемости дикого штамма и мутанта, лишенного гидрогеназ, в условиях недостатка серы Мы использовали оба подхода Замедление сброса восстановителей с помощью выделения

водорода возможно при инкубации голодающих по сере клеток при повышенных концентраций водорода, когда сам процесс выделения водорода будет замедлен из термодинамических соображений (Рис. 2).

угсЕ in

Рис. 8. Влияние газовой фазы на жизяеспаСшбность клеток С. геиЖагаЩ природного штамма С 137+ при недостатке серы. Начальная концентрация хлорофилла 14 м к г/мл, интенсивность света составляла 40 дЕт V1.

Однако это не повлияло на жизнеспособность клеток С. reinhardtit, н в контроле, и гтри добавлении водорода доля жизнеспособных клеток начинала снижаться после 6 дней инкубации, причем и в том, и в другом варианте она составляла около 53% к 11 дню инкубации, В присутствии воздуха жизнеспособность оставалась высокой, как и у культур, инкубируемых на среде с ссрой (Рис. 8).

Недавно в NREL Golden, Colorado был получен мутант 103-9, не способный синтезировать гидрогеназу. Это позволило использовать еще один подход для изучения роли выделения Н2 в стрессовых условиях. Мутант (СС425 cw 15, so и-60. arg7-8 mf+) 103-9 получка трап сформацией arg 7 гена в родительский штамм сс 425. Из Табл. 4 видно, что родительский штамм и безгидрогецазный мутант имеют сходные характеристики в условиях адаптации к бессерному стрессу: накопление крахмала, сходную динамику изменения фото синтетической и дыхатслыюй активности и переход в анаэробные условия, по у мутанта полностью отсутствует гадротеназаах актин ость и выделение Ks. Поэтому сравнение их жизнеспособности в условиях серного голодания позволило выявить роль гидр о ген азы в процессе выделения водорода.

Таблица 4, Свойства двух штаммов СгеШшпйи: СС425 (Цу<1+) и мутанта 103-9

щулг

Свойства СС425 (НУ(]+) 103-9 (НусГ)

Гндрогсназная активность (по выделению водорода из вост. гяетилвиологша у культур) (мкл112/мкгХл*ч) 2,8 0

Выделение водорода у культур, голодающих по ссре (мл/л) 75 0

Накопление крахмала (20-40 ч серного голодания) (ммоль глюкозы /л) и 1,3

Исходная фотосинтетическая активность (м км ольОт/мгХл *ч) 187,6 147

Исходная активность дыхания (м км оль ОЬ,мгХл*ч) 64:3 62

Жжшеотоеобнасть клеток ь условиях дефицита с&рчл у мутанта на 6-ой день сохранялась такой же высокой, как и родительского штамма, выделяющий водород. При этом добавление водорода достоверно не влияло на долю жизнеспособных клеток в обоих вариантах (Рис. 9).1 (»лученные результаты свидетельствуют о том, что процесс выделения водорода в условиях серного голодания не является жизненно необходимым микро водород ш м •

сс425{Нус^*; Рис. 9. Влияние высоких концентраций

водорода на выживаемость родительского

"'ил ё

0 80

ю §6С

I 20

штамма С425(Ну(Г) и мутанта 103-9 ШусГ). Водород (40%) вводили на 24 ч серного голодания. Начальная концентрация хлорофилла 14 мкг/мл. Интенсивность света -40 цЕт" V1.

120-,

л 100

| ВО

1 60 Ъ 31 .10

I 20

Одень

6 день

1ВЗ-Э (Нуй")

0 дет.

6 дань

Можно полагать, что в условиях серного голодания имеются другие пути сброса восстановителя (например, брожение) Возможно, процесс выделения водорода позволяет быстрее адаптироваться к переходу культур из темновых анаэробных условий на свет, и это играет существенную роль в конкурентной борьбе с другими видами, но не определяет выживаемость чистых культур

Заключение.

Полученные результаты показывают, что выделение водорода голодающими по сере микроводорослями зависит от ряда факторов Накопление в газовой фазе высоких концентраций водорода подавляет процесс выделения водорода (Рис 2), а при продувании газовой фазы аргоном водород выделяется с наибольшей скоростью (Рис 3) Термодинамически это связано с тем, что понижение парциального давления водорода приводит к снижению редокс - потенциала среды, что облегчает перенос электронов от ферредоксина к гидрогеназе Другим важным фактором является интенсивность света Нами показано, что выделение водорода зависит от интенсивности падающего света и максимально в определенном диапазоне (20-40 цЕш 25 1 для культур с концентрацией хлорофилла 14-16 мкг/мл) Данная интенсивность не зависела от способа получения культур, и содержания ацетата Однако оптимальная интенсивность падающего света зависела от концентрации хлорофилла и формы сосуда, то есть интенсивность падающего света не являлась объективным показателем, характеризующим сам процесс Оптимальная средняя интенсивность света, рассчитанная с помощью разработанного в нашей лаборатории математического аппарата, учитывающего диаметр реактора, концентрацию клеток и интенсивность падающего света, составляла 30-40 рЕм 25 1 и не зависела от концентрации хлорофилла и диаметра реактора

условиях недостатка серы Для этого было необходимо добавление С02 при поддержании рН в области оптимальных значений Однако для получения водорода в количестве, сравнимом с фотогетеротрофными культурами, потребовалось не только использование культур, выросших при низких интенсивностях света, но и введение специального светового режима высокая интенсивность света в фазе выделения кислорода и низкая во всех последующих фазах

Таким образом, оптимальная интенсивность света не является постоянной в процессе адаптации культур к серному голоданию Поэтому возник вопрос, какова же роль света в разных фазах и почему так незначительно выделение водорода культурами, выросшими при высокой интенсивности света9 Последующие эксперименты показали, что само понятие высокой и низкой интенсивности света относительно, и влияние интенсивностей света будут неодинаковым для культур, выросших при разных интенсивностях света Судя по полученным данным, в фазе выделения кислорода необходимо увеличение интенсивности света более чем в 4 раза, по сравнению с интенсивностью света при которой культуры росли (Рис 6) Повышенная интенсивность света нужна как для накопления крахмала, так и для накопления повышенных концентраций кислорода Кислород (а также продукты его восстановления), в свою очередь, вызывают инактивацию ФС2, что необходимо для достижения анаэробных условий Во всех последующих стадиях необходима низкая интенсивность света для снижения скорости выделения кислорода После выяснения роли света в разных фазах серного голодания нам удалось получить выделение водорода культурами, выросшими при высокой интенсивности света При этом его количество (более 50 мл/л) было сопоставимо с количеством водорода, полученным при использовании культур, выросших при низкой интенсивности света Следует отметить, что в ходе выделения водорода рН культур значительно снижался, достигая значений оптимальных для брожения Вместе с тем ацетат практически не обнаруживался При этом лишь незначительная часть крахмала использовалась культурами для выделения водорода По-видимому, в дальнейших исследованиях следует подробно изучить все возможные продукты брожения, уменьшить долю брожения в общем метаболизме клеток (например, путем поддержания рН в диапазоне 7,7-7,9 в процессе выделения водорода) и, тем самым, значительно повысить общий выход водорода

Общепринято, что процесс выделения водорода является своего рода «клапаном», сбрасывающим избыток восстановителя, который может возникнуть при быстром переходе культур в природных условиях от темновых анаэробных условий на свет В этом случае клетки не в состоянии быстро перестроиться с темнового анаэробного метаболизма (прежде всего брожения) на использование света для фиксации углекислоть1 Однако экспериментальных подтверждений этой точки зрения в литературе практически не встречается

Голодающие по сере культуры представляют другой пример, когда клетки не в состоянии использовать восстановители, образуемые в процессе фотосинтеза, для общего метаболизма вследствие недостатка серы Можно полагать, что в этих условиях избыток восстановителя не только приводит к перевосстановленности пула пластохинонов (Ата1 й а1, 2003), но и опасен для всех структур клетки Если это так, то процесс выделения водорода должен быть жизненно важен для микроводорослей в условиях недостатка серы Полученные нами результаты неожиданно показали, что выживаемость культур практически не снижается при подавлении выделения водорода повышенными концентрациями водорода или в случае, когда процесс выделения водорода не идет вследствие нарушения синтеза гидрогеназ в мутанте По-видимому, микроводоросль С гет!гаг&1 обладает альтернативными путями сброса избытка восстановителя, например, брожение Действительно, к настоящему времени уже можно считать установленным, что при серном голодании одновременно проходит несколько считавшихся ранее взаимоисключающих процессов фотосинтез с участием двух фотосистем, несколько типов дыхания, брожение накопленного крахмала и сам процесс выделения водорода (Рис 10)

Хлоропласт

ФС2 PQ (-1 CytWf ФС1

Н2

Митохондрия

пируват

2 формиат +

2 ацетил КоА

2NADH

^ 2 NAD этанол

Рис. 10. Схема путей образования водорода Я-дефицитиыми культурами С гетНат&и. КЛигагД!, неопубл.]

Возможно, при подавлении процесса брожения важность процесса выделения водорода для жизнеспособности культур возрастет Однако, это предмет следующих исследований

ВЫВОДЫ:

1 Предложен новый способ получения культур С геигагЖи, способных к выделению водорода, при котором культуры переходят в состояние серного лимитирования не после отмывания от серы, а в результате потребления низких ее концентраций в процессе роста

2 Установлено, что выделение водорода голодающими по сере

фотогетеротрофиыми культурами максимально при средней интенсивности света 30 дЕпЛ*1 независимо от концентрации хлорофилла и параметров фотобиореактора

3 Впервые продемонстрирована способность к возникновению анаэробиоза и к значительному выделению водорода голодающими по сере культурами С геткаЫш в фотоавтотрофных условиях с использованием углекислого газа и контролем рН

4 Выявлены особенности действия света и кислорода в разных фазах серного голодания фотоавтотрофных культур, что позволило подобрать переменный световой режим обеспечивающий максимальное выделение водорода

5 Обнаружено, что подавление выделения водорода в условиях серного голодания не приводит к снижению жизнеспособности культур Эта может свидетельствовать о наличии у С гетИагЛи других механизмов сброса избытка восстановителя

Список работ опубликованных по теме диссертации.

Статьи

1 Tatyana V Launnavichene, IrenaV Tolstygina. Rumia R Galiulma, Мала L Girardi, Michael Seibert, Anatoly A Tsygankov Dilution method to depnve Chlamydomonas reinhardtu cultures of sulfur for subsequent hydrogen photoproduction U Int J Hydrogen energy 2002 V 27 P 3245-1249

2 Tatyana Launnavichene, Irena Tolstygina. Anatoly Tsygankov The effect of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtu IIJ Biotechnology 2004 V 114 N 1-2 P 149-151

3 Anatoly A Tsygankov , Sergey N Kosourov, InnaV Tolstygina, Мала L Ghirardi, and Michael Seibert Hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtu under photoautotrophic conditions // Int J Hydrogen Energy 2006 V 31 P 1574-1584

Тезисы

2 Толстыгина И В . Лауринавичене Т В , Цыганков А А Зависимость выделения водорода S-дефицитными Chlamydomonas reinhardti от интенсивности света, концентрации ацетата и плотности культуры //

Всероссийская конференция «III съезд биофизиков России» Воронеж

2004 Т 2 С 437

3 Tolstygma IV , Launnavichene Т V, Tsygankov A A The effect of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardti IIXVI winter school "Perspective trends in biochemistry and biotechnology", M 2004 P. 96

4 Tatyana Launnavichene, Irena Tolstygma. Anatoly Tsygankov Influence of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardti // 15th World Hydrogen Energy Conference Yokohama 2004 P544

5. Толстыгина И В . Лауринавичене Т В , Косоуров С.Н , Цыганков А А Роль гидрогеназы в адаптации Chlamydomonas remhardtn к серному голоданию П XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии при фотосинтезе". М НИА Природа

2005 С 79

6 Косоуров С Н , Толстыгина И В . Гирарди М Л , Сейберт М , Цыганков А А Выделение водорода S-дефицитными Chlamydomonas reinhardtu в фотоавтотрофных условиях // XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии при фотосинтезе" М НИА Природа 2005. С 78

7 Tsygankov А А , Kosouov S N , Tolstygma I V , Ghirardi M L, Seibert M Hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtu under photoautotrophic conditions // European Cost "Workshop Biological Hydrogen Production" Porto 2005 P 250

8. Tolstygma IV , Kosourov S N, Girardi M L, Seibert M, Tsygankov A A

Hydrogen production by sulfur-deprived microalga Chlamydomonas reinhardtu under photoautotrophic conditions // International Hydrogen Energy Congress& Exibition Istanbul 2005

9 Tolstygma IV . Launnavichene T V , Kosourov S N , Tsygankov A A Hydrogen photoproduction by Chlamydomonas reinhardtu cultures during sulfur deprivation // International meeting "Photosynthesis in the post-genomic era Structure and Function of Photosynthesis", M NIA-Nuture 2006 P 220

10 Tolstygma IV.. Launnavichene T V, Kosourov S N , Tsygankov A. A The role of hydrogenase m adaptation of Chlamydomonas remhardtn to the sulfur-depnved conditions // "16th International Conference on Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy" Uppsala 2006 P W6

Подписано в печать 09 10 2007 г Исполнено 10 10 2007 г Печать трафаретная

Заказ № 861 Тираж 75 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56 www autorefeiat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Толстыгина, Ирина Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

Глава 1. Общая характеристика зеленой водоросли С. гешЬагсНп. г

Глава 2. Фотообразование водорода зелеными водорослями.

2.1. Общая характеристика процесса.

2.2. Доноры электронов для процесса выделения водорода.

2.3. Выделение водорода при разных интенсивностях света.

2.4. Гидрогеназа.

Глава 3. Выделение водорода С. гешЬаг(1Ш в условиях недостатка серы.

3.1. Образование водорода при недостатке макро и микроэлементов.

3.2. Доноры электронов для процесса выделения водорода при недостатке серы.

3.3. Оптимизация процесса образования водорода в условиях недостатка серы.

3.4. Роль ацетата в процессе выделения водорода микроводорослью при недостатке серы.

3.5. Получение культур с недостатком серы.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

V Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1. Объекты и условия культивирования.

4.2. Постановка экспериментов по изучению выделения водорода 8-дефицитными культурами.

4.3. Получение в-дефицитных культур С. тпЬагсИп.

4.3.1. Получение 8-дефицитных культур методом отмывания.

4.3.2. Разработка нового метода получения Б-дефицитных культур.

4.3.2.1. Подбор концентрации серы в свежей среде при фиксированном объеме инокулята.

4.3.2.2. Подбор концентрации серы за счет добавления разных количеств инокулята.

4.3.3. Сравнение разных методов получения 8-дефицитных культур.

4.4. Изучение влияния концентраций водорода на выделение водорода.

• 4.5. Определение доли жизнеспособных микроводорослей в суспензии.

4.6. Измерение флуоресценции хлорофилла и скорости фотосинтетического выделения кислорода.

4.7. Другие методы. III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 5. Основные факторы, влияющие на выделение водорода голодающими по сере микроводорослями в фотогетеротрофных условиях.

5.1. Влияние повышенных концентраций водорода и протока аргона.

5.2. Влияние интенсивности падающего света, средней интенсивности света в фотобиореакторе, концентрации ацетата и хлорофилла на выделение водорода.

5.2.1. Влияние интенсивности света и концентрации ацетата на выделение водорода культурами, полученными методом разбавления.

5.2.2. Влияние интенсивности света и концентрации хлорофилла на выделение водорода культурами, полученными методом очмывания.

Глава 6. Выделение водорода Б-дефицитными культурами в фогоавготрофных условиях.

6.1. Выделение водорода фотоавтотрофными культурами с использованием бикарбоната.

6.2. Выделение водорода фотоавтотрофными культурами с использованием С02.

6.4. Накопление крахмала фотоавтотрофными культурами нри разных интенсивностях света.

6.5. Влияние интенсивности света на выделение водорода фотоавтотрофными культурами.

Глава 7. Выделение водорода фотоавтотрофными 5-дефицитными культурами, выросшими при высоких интенсивностях света.

7.1. Влияние интенсивности света на переход культур в анаэробиоз и накопление крахмала.

7.2. Влияние высоких интенсивностей света и повышенных концентраций кислорода на фотосинтетическую активность фотоавтотрофной, голодающей по сере культуры.

Глава 8. Физиологическое значение процесса выделения водорода.

8.1. Влияние газовой фазы на выживаемость Э-дефицитных культур С. гапЬапИп.

8 .2. Роль гидрогеназы в адаптации клеток С. гапЬагсип к стрессовым условиям.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серы"

Актуальность проблемы.

Светозависимое образование водорода зелеными микроводорослями обнаружено более 60 лет назад (Gafron, Rubin, 1942), и до недавнего времени данный процесс рассматривался как пример неэффективного расходования поглощенной световой энергии. Считается, что физиологическая роль выделения водорода в анаэробных условиях заключается в сбросе избытка восстановителя (Appel, Shultz, 1998), хотя экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу для зеленых микроводорослей, отсутствуют.

Эффективность преобразования энергии света при выделении водорода микроводорослями достигает 50% и более (Boichenko et al., 2004). Поэтому, начиная с 70 годов прошлого века, постоянно ведутся исследования в попытках использовать данный процесс для запасания солнечной энергии в виде топлива - водорода (Benemann, 1996; 2002). Принципиальным ограничением на пути исследований стоял тот факт, что выделение водорода микроводорослями происходит одновременно с выделением кислорода (и в стехиометрии близкой к биофотолизу воды). Выделяющийся кислород ингибирует активность гидрогеназы и репрессирует ее синтез. Поэтому выделение водорода микроводорослями было кратковременным и останавливалось при появлении кислорода в среде. Попытки подавления выделения кислорода (например, при добавлении диурона) увеличивали длительность процесса, но снижали его скорость, поскольку фотосистема 2 (ФС2) является основным донором электронов в данных условиях (Boichenko, 1996). Более того, добавление различных ингибиторов делало систему необратимой и непригодной для использования в качестве «преобразователя» солнечной энергии.

Значительный интерес исследователей вызвало сообщение из Калифорнийского университета (Melis et al., 2000) о том, что микроводоросли С. reinhardtii способны в фотогетеротрофных условиях к длительному выделению значительных количеств водорода, если их поместить в условия недостатка серы. Авторы назвали такую систему двустадийной, поскольку появилась возможность, чередуя условия избытка и недостатка серы, получать водород в две стадии. Показано, что такая система в принципе способна осуществлять несколько циклов. Авторы считали, что эта система использует только фотосистему 1, причем в фазе выделения водорода основными источниками восстановителя являются продукты разложения белков. Значительного изменения содержания крахмала замечено не было. К началу наших исследований уже было известно, что, несмотря на анаэробные условия, ФС2 все же принимает участие в донировании электронов ФС1, а образующийся при этом кислород поглощается при дыхании (Антал и др., 2001). В то же время в механизме выделения водорода голодающими по сере микроводорослями оставалось много неясного. Оставался нерешенным принципиальный вопрос - является ли наличие ацетата необходимым условием для выделения Нг, т.е. возможен ли процесс в автотрофных условиях? Кроме того, неясна физиологическая роль выделения водорода для водорослей.

Цель и задачи работы.

Целью наших исследований было изучение особенностей выделения водорода зеленой мироводорослью С. геткаЫШ в условиях недостатка серы.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- разработать новый метод перевода культур в условия недостатка серы, отличающийся простотой и повышенной надежностью при работе с чистыми культурами;

- выявить основные факторы, влияющие на процесс выделения водорода фотогетеротрофными культурами;

- выяснить возможность выделения водорода фотоавтотрофными культурами и определить оптимальные условия для протекания данного процесса;

- проверить, обеспечивает ли светозависимое выделение водорода поддержание жизнеспособности культур в условиях избытка восстановителя. Научная новизна.

На основании полученных данных рассчитана оптимальная средняя интенсивность света в фотобиореакторе для максимального выделения водорода фотогетеротрофными культурами С. геткагйШ при недостатке серы. Впервые продемонстрировано выделение водорода фотоавтотрофными культурами и подобран особый световой режим для максимального накопления крахмала и выделения водорода. Установлено неодинаковое влияние интенсивности света на выделение водорода фотоавтотрофных культур на разных стадиях процесса. Показано, что выделение водорода Б-дефицитными культурами является не единственным защитным механизмом сохранения жизнеспособности клеток в условиях избытка восстановителя. Практическая значимость.

Предложен новый метод получения голодающих по сере фотогетротрофных культур, который отличается простотой и надежностью и по выходу водорода не уступает традиционному методу. Результаты по влиянию различных факторов на физиологическое состояние Б-дефицитной культуры позволяют рекомендовать оптимальные условия для максимального выделения водорода, а также для выделения водорода при использовании интенсивностей света приближенных к естественным. Разработан метод получения водорода в фотоавтотрофных условиях без использования дорогостоящего органического субстрата, что делает процесс экономически более выгодным. Апробация работы.

2002 (Нидерланды), 15 Международном конгрессе по водородной энергетике (Йокогама, Япония, 2004), XVIII Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), Международной конференции «Биологические способы выделения водорода» (Порто, Португалия, 2005), Международном конгрессе по водородной энергетике (Стамбул, Турция, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в пост-геномную эру: структура и функции фотосистем» (Пущино, 2006), 16 Международной конференции «Фотохимическое преобразование и сохранение солнечной энергии» (Уппсала, Швеция, 2006), Международном Форуме «Водородные технологии для производства энергии», 2006, Москва. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 1 - в зарубежном журнале списка ВАК (J. Biotechnology), 2 - в Int. J. Hydrogen energy, 9 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, вывода и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на/$траницах, иллюстрирована рисунками и .^таблицами. Список литературы содержит/££ксточника (из них/^на английском языке).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Толстыгина, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ:

1. Предложен новый способ получения культур С. гетагЖИ, способных к выделению водорода, при котором культуры переходят в состояние серного лимитирования не после отмывания от серы, а в результате потребления низких ее концентраций в процессе роста.

2. Установлено, что выделение водорода голодающими по сере фотогетеротрофными

2 1 культурами максимально при средней интенсивности света 30 pEm" s' независимо от концентрации хлорофилла и параметров фотобиореактора.

3. Впервые продемонстрирована способность к возникновению анаэробиоза и к значительному выделению водорода голодающими по сере культурами С. reinhardtii в фотоавтотрофных условиях с использованием углекислого газа и контролем pH.

4. Выявлены особенности действия света и кислорода в разных фазах серного голодания фотоавтотрофных культур, что позволило подобрать переменный световой режим, обеспечивающий максимальное выделение водорода.

5. Обнаружено, что подавление выделения водорода в условиях серного голодания не приводит к снижению жизнеспособности культур. Это может свидетельствовать о наличии у С. reinhardtii других механизмов сброса избытка восстановителя.

Заключение.

Наиболее экологически чистым способом получения водорода является разложение воды за счет солнечной энергии. Такой способ является еще и возобновляемым, поскольку конечным продуктом сгорания водорода является также вода. Зеленые микроводоросли могут выделять водород, разлагая на свету воду, но только в анаэробных условиях, так как основной фермент, отвечающий за образование водорода из протонов - гидрогеназа, очень чувствительна к кислороду (вЫгагсИ е! а\., 2005., ОгеепЬаиш е1 а1.,1998). Таким образом, получение заметных количеств водорода требует постоянного удаления из культуры выделяющегося в процессе фотосинтеза кислорода. Открытие Мелисом в 2000 году длительного выделения водорода культурами микроводоросли в условиях недостатка серы на свету вызвал значительный интерес исследователей к данному процессу. Одновременно с нашими исследованиями изучение этого процесса проводилось и в других лабораториях, прежде всего в тех, где этот процесс был обнаружен (Калифорнийский университет и Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии, США). Уже в следующей своей работе Мелис с соавторами показал, что наиболее вероятным донором электронов для выделения водорода микроводорослями без серы являются не продукты разложения белка, а накопленный крахмал (Zhang et al., 2002). При этом показано, что одновременно с фотосинтезом в микроводорослях протекает и брожение крахмала. По-видимому, описанное в первой работе значительное снижение количества белка было связано с одновременной деградацией клеток, которые находились в неоптимальных условиях. Позднее, исследованиями фотоавтотрофных культур хламидомонады с использованием масс-спектрометрических методов это было подтверждено (Fouchard et al., 2005). Практически одновременно в нескольких лабораториях независимыми методами было показано, что, наряду с продуктами разложения крахмала, ФС2 также может принимать участие в донировании электронов ФС1 для выделения водорода в условиях серного голодания (Ghirardi et al., 2000; Антал и др., 2001; Cournac et al., 2002; Antal et al., 2003). Более того, в нашей лаборатории показано, что ФС2 имеет непостоянный вклад в этот процесс: несмотря на то, что в процессе выделения водорода при серном голодании ее активность снижается, снижение вклада в поток электронов от процесса брожения еще более значительно (Laurinavichene et al., 2004). В нашей лаборатории было также показано, что активность ФС2 не снижается монотонно, а в момент наступления анаэробиоза падает практически до нуля, а с началом выделения водорода частично реактивируется (Antal et al., 2003). В этой же работе показано, что, несмотря на то, что в процессе адаптации культур к серному голоданию дыхание изменяется незначительно, вклад митохондриального цианидзависимого и цианидрезистентного дыхания, а также хлоропластного дыхания неодинаков в разные фазы серного голодания. Таким образом, к настоящему времени уже можно считать установленным, что при серном голодании одновременно проходит несколько считавшихся ранее взаимоисключающих процессов: фотосинтез с участием двух фотосистем, несколько типов дыхания, брожение накопленного крахмала и сам процесс выделения водорода.

Схематически общее понимание процессов, проходящих в С. гетИагЛП при недостатке серы, можно привести на Рис. 29.

Одновременно проводились исследования основных факторов, влияющих на сам процесс выделения водорода голодающими по сере культурами микроводорослей. Показано, что рН во время серного голодания играет важную роль в соотношении процессов брожения и фотосинтеза (Коэоигоу е1 а1., 2003). При рН 7,7-7,9 выделение водорода максимально и образуется меньше всего продуктов брожения, что свидетельствует о сдвиге общего метаболизма в сторону фотосинтеза, завершающегося выделением водорода. Напротив, при рН ниже 7,0 выделение водорода незначительно, а образование формиата, ацетата и спирта максимально, то есть наблюдается преобладание процесса брожения. В нашей работе показано, что наличие высоких концентраций водорода подавляет сам процесс выделения водорода, то есть водород, как продукт реакции, также влияет на направленность процессов внутри клетки. Косвенно этот результат подтверждается тем, что иммобилизованные клетки хламидомонады выделяли водород в условиях серного голодания с наибольшей скоростью при продувке реактора аргоном (Ьаиппау!сЬепе а1., 2006). Термодинамически это связано с тем, что понижение парциального давления водорода приводит к снижению редокс-потенциала среды, что облегчает перенос электронов от ферредоксина к гидрогеназе.

Другим важным фактором является интенсивность света. Высокие интенсивности света ингибируют продолжительное выделение водорода у зеленых водорослей, культивируемых на обычных содержащих серу средах и адаптированных к темновым анаэробным условиям. Поскольку к началу наших исследований считалось, что при серном голодании участвует только фотосистема 1, то увеличение интенсивности света могло бы привести к увеличению выхода водорода. Мы изучили влияние интенсивности света на выделение водорода голодающими по сере культурами в зависимости от различных параметров. Нами показано, что выделение водорода зависит от интенсивности

2 1 падающего света и максимально в определенном диапазоне (20-40 цЕт" в" для культур с концентрацией хлорофилла 14-16 мкг/мл).

02+ 4 Н+

6 02

4С02

Хлоропласт

ФС2

РО

Cyt be/f

ФС1

Н2

NAD(P)H PQ оксидоредуктаза

Крахмал Глюкоза

2NAD 2NADII

2 Ацетил КоА+ 2С02+ 2N.

ЙлГ^"

2пируват

Окислительная цепь ЦТК и окислительное фосфорилирование

6NAD 6FAD

6NADH /6FADH

Митохондрия

2 формиат

2 ацетил КоА Я

2NADH Ч

V 2NAD этанол

Рис. 29. Пути образования водорода S-дефицитными культурами C.reinhardtii. [Ghirardi, неопубл.]

Данная интенсивность не зависела от способа получения культур, и содержания ацетата. Однако оптимальная интенсивность падающего света зависела от концентрации хлорофилла и формы сосуда, то есть интенсивность падающего света не являлась объективным показателем, характеризующим сам процесс. Оптимальная средняя интенсивность света, рассчитанная с помощью разработанного в нашей лаборатории математического аппарата, учитывающего диаметр реактора, концентрацию клеток и

7 1 интенсивность падающего света, составляла 30-40 цЕм" s" и не зависела от концентрации хлорофилла и диаметра реактора. То есть средняя интенсивность является объективным показателем. Одновременно с нашими исследованиями влияния интенсивности света аналогичные исследования проводились и в других лабораториях. Американскими авторами (Hahn et al., 2004), опубликовавшими статью практически одновременно с нами, также показана аналогичная зависимость выделения водорода от интенсивности падающего света. Год спустя корейские коллеги также показали наличие оптимума света (Kim et al., 2006). Однако указанные работы представляли только данные по интенсивности падающего света, что не является объективной характеристикой культур.

Практически все эксперименты, описанные в литературе по изучению выделения водорода голодающими по сере микроводорослями, проводились на фотогетеротрофных культурах, использующих ацетат. В этих условиях ацетат используется клетками в фазе выделения кислорода для накопления крахмала, а в фазе поглощения кислорода - для быстрого потребления кислорода. В фазе выделения водорода ацетат практически не использовался. Тем не менее, очевидно, что истинное запасание и преобразование энергии света происходит лишь в фотоавтотрофных условиях. Нам впервые удалось показать выделение заметных количеств водорода фотоавтотрофными культурами в условиях недостатка серы. Для этого достаточно было удалить ацетат, добавить источник углерода и поддерживать рН в области оптимальных значений. Однако для получения водорода в количестве, сравнимым с фотогетеротрофными культурами, потребовалось не только использование культур, выросших при низких интенсивностях света, но и введение специального светового режима: высокая интенсивность света в фазе выделения кислорода и низкая во всех последующих фазах.

Указанный раздел нашей работы позволил заключить, что оптимальная интенсивность света не является постоянной в процессе адаптации культур к серному голоданию. Одновременно возник вопрос, какова же роль света в разных фазах? Непонятным оставалось также и низкое выделение водорода культурами, выросшими на высокой интенсивности света. Последующие эксперименты показали, что само понятие высокой и низкой интенсивности света неодинаково для культур, выросших на разных интенсивностях света. Судя по полученным данным, интенсивность света, при которой культуры выращивались перед серным голоданием, не является для культур высокой. Для получения высокой интенсивности света необходимо увеличение интенсивности света в 2 и более раза (см. Рис. 22 и 23). При этом выяснилось, что в фазе выделения кислорода высокая интенсивность света нужна, с одной стороны, для высокой скорости накопления крахмала, необходимого в фазе выделения водорода, а, с другой стороны, для накопления в культурах повышенных концентраций кислорода. Повышенные концентрации кислорода (а также продуктов его восстановления), в свою очередь, приводят к инактивации ФС2, что необходимо для достижения анаэробных условий. Во всех последующих стадиях необходима низкая интенсивность света для пониженной скорости выделения кислорода.

После выяснения роли света в разных фазах серного голодания нам удалось получить выделение водорода культурами, выросшими при высокой интенсивности света. При этом его количество (более 70 мл/л) превышало значение, полученное при использовании культур, выросших при низкой интенсивности света. Следует отметить, что рН культур, выросших при высокой интенсивности света, значительно снижался, достигая значений оптимальных для брожения значений. Вместе с тем ацетат практически не обнаруживался. При этом лишь незначительная часть крахмала использовалась культурами для выделения водорода. По-видимому, в дальнейших исследованиях следует подробно изучить все возможные продукты брожения, уменьшить долю брожения в общем метаболизме клеток (например, путем поддержания рН в диапазоне 7,7-7,9 в процессе выделения водорода) и, тем самым, значительно повысить общий выход водорода.

Общепринято, что процесс выделения водорода является своего рода «клапаном», сбрасывающим избыток восстановителя. Такой избыток восстановителя может возникнуть при быстром переходе культур в природных условиях от темновых анаэробных условий на свет. В этом случае клетки не в состоянии быстро перестроиться с темнового метаболизма без кислорода (прежде всего брожение) на использование света для фиксации углекислоты. Однако экспериментальных подтверждений этой точки зрения в литературе практически не встречается.

В анаэробных условиях голодающие по сере культуры представляют другой пример, когда клетки не в состоянии использовать восстановители, образуемые в процессе фотосинтеза, для общего метаболизма вследствие недостатка серы. Можно полагать, что в этих условиях избыток восстановителя не только приводит к перевосстановленности пула убихинонов (Ап1а1 е! а1., 2003), но и опасен для всех структур клетки. Если это так, то процесс выделения водорода должен быть жизненно важен для микроводорослей в условиях недостатка серы. Для изучения роли процесса выживаемости необходимо использование чистых культур микроводорослей. Для этого нами применялся разработанный нами метод получения культур, голодающих по сере, использующий минимальное воздействие на культуры. Полученные нами результаты неожиданно показали, что выживаемость культур практически не снижается при подавлении выделения водорода повышенными концентрациями водорода или вообще процесс выделения водорода не идет вследствие нарушения синтеза гидрогеназ в мутанте. По-видимому, микроводоросль С. геткагс1И обладает другими альтернативными путями сброса избытка восстановителя, например, брожение. Возможно, при подавлении процесса брожения важность процесса выделения водорода для жизнеспособности культур возрастет. Однако, это предмет следующих исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Толстыгина, Ирина Викторовна, Пущино

1. Бойченко В.А. Структурно-функциональная организация фотосинтетического аппарата прокариот и эукариот.// Диссертация на соискание ученой степени. РАН ИФПБ Пущино: Наука. 2002.

2. Бойченко В. А., Сатина Л.Я., Литвин Ф.Ф. Эффективность фотообразования водорода водорослями и цианобактериями. // Физиология растений, 1989, Т.36, с.239-247.

3. Голлербах М.М. Зеленые водоросли.// В кн.: Жизнь растений. (Голлербах-ред.) Москва: Просвещение. 1977. Т. 3. С.226-273

4. Зорин H.A., Гоготов И.Н., Кондратьева E.H. Очистка и свойства гтдрогеназы из фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicirta. II Биохимия. 1976. Т. 41. С. 836-842.

5. Климов В. В. Окисление воды и выделение молекулярного кислоаода при фотосинтезе. // Соросовский образовательный журнал. 1996. №11. С. 9-12

6. Кондратьева Е. Н., Гоготов И. Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. М.: Наука. 1981. С. 146 .

7. Перт С. Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир. 1978. С. 331.

8. Цыганков A.A. Получение водорода биологическим путем. // Российский химический журнал. 2006. Т. 50. С. 26-33

9. Янюшин М. Ф. Гидрогеназная активность синхронной культуры Chlamydomonas reinhardtii J/Физиология растений, 1979, Т. 26, вып. 2. С. 394 -398.

10. Янюшин М.Ф. Влияние ингибиторов электронного транспорта на фотовыделение водорода синхронной культурой Chlamydomonas reinhardtii.// Физиология растений, 1981, Т. 28, вып.4. С. 749-756.

11. Янюшин М.Ф. Активация гидрогеназы и фотовыдеделние водорода в синхронной культуре Chlamydomonas reinhardtii при анаэробной адаптации в темноте.// Физиология растений, 1982, Т.29, вып. 6, С. 1126-1133.

12. Adams M.W.W. The structure and mechanism of iron-hydrogenases.// Biochim. Biophis. Acta. 1990. N.1020. P.l 15-145

13. Appel J., Schulz R. Hydrogen metabolism in organisms with oxygenic photosynthesis: hydrogenase as important regulatory devices for proper redox poising? // Journal of Photochemistry And Photobiology B-Biology. 1998. V. 47, № 1. C. 1-11.

14. Apparicio J. P., Azuara P., Ballesteros A., Fernandes V. M. Effects of light and oxidized nitrogen sources on hydrojen production by Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 1985. V. 78. P. 803-806.

15. Arp D.J. and Burris R.H. Purification and properties of the particulate hydrogenase from the bacteroids of soybean root nodules. // Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 570. P. 221230.

16. Arp D.J. Rhysobium japonicum hydrogenase: purification to homogeneity from soybean nodules, and molecular characterization. II Arch. Biochem. Biophys. Acta. 1985. V. 237. P. 504-512.

17. Bamberger ES, D King,DL Erbbes, M Gibbs 1982. H2 and CO2 evolution by anaerobically adapted Chlamydymonas reinhardtii F-60. // Plant Physiol. 1982. V. 69. P. 1268-1273.

18. Bennoun P. Chlororespiration, sixsteen years later.// In:The molecular biology of chloroplasts and mitochondria in Chlamydomonas reinhardtii. Kluwer, Dordrecht, The Netherlands, 1998. P. 675-683.

19. Bennoun P. Effect of mutations and ionophores on chlororespiration in Chlamydomonas reinhardtii. II PN AS. 1982. V. 79. P. 4352-4356.

20. Bernhard M., Buhrker T., blejlevens B., De Lacey AL., Fernandes V.M., Albracht P.J., Freidrich B. The H2 Sensor of Ralstonia eutropha. II J. Biol. Chem. 2001. V. 76. P. 1559215597

21. Bock A., King P., Blokesch M., Posewitz M. Maturation of hydrogenase.// Adv. Microb. Physiol. 2006. V.51.P. 1-71

22. Boichenko V. A., Allakhverdiev S. I., Ladygin V. G. and Klimov V. V. (1986), 'Functional conjunction of hydrogenase with Photosystem II in the whole cells of Chlamydomonas reinhardtii mutants', Dokl. Akad. NaukSSSR. V. 290. P. 995-998

23. Boichenko V. A. and Litvin F. F. (1988), 'Maximum quantum yield of hydrogen photoproduction by cells of green algae', Dokl. Akad. NaukSSSR. V. 301. P. 1497-1500.

24. Boichenko V. A., Satina L. Y. and Litvin F. F. (1989), 'Efficiency of hydrogen photoproduction in algae and cyanobacteria', Fiziol. Rast. V. 36. P. 239-247.

25. Boichenko V. A. (1996), 'Can photosystem II be a photogenerator of low potential reductant for C02 fixation and H2 photoevolution?', Photosynth. Res. V. 47. P. 291-292.

26. Bryant F.O. and Adams M.W. characterization of hydrogenase from the hypertermophilic archaebacterium, Pyrococcus furiosus. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 5070-5079.

27. Chen F. and Johns M.R. Substrate inhibition of Chlamydomonas reinhardtii by acetate in heterotrophic culture.// Proc. Biochem. 1994. V 29. P. 245-252.

28. Chen F. and Johns M.R., Heterotrophic growth of Chlamydomonas reinhardtii on acetate in chemostat culture.// Process Biochem. 1996. V. 31. P. 601-604.

29. Chen J.S. and Mortenson L. E., Purification and properties of hydrogenase from Clostridium pasteurianum W5. // Biochim. Biophys. Acta. 1974. V. 371. P. 283-298.

30. Cohen J., Kim K., Posewitz M.C., Ghirardti M.L., Schulten K., Seibert M., King P.W. Molecular dynamics and experimental investigation of H2 and O2 diffusion in Fe.-hydrogenase. II Biochem. Cos. Trans. 2005. V. 33. P. 80-82.

31. Cournac L., Latouche G., Cerovic Z., Redding K., Ravenel J., Peltier G. In vivo interactions between photosinthesis, mitorespiration and chlororespiration in Chlamydomonas reinhardtii. H Plant Physiol. 2002. V. 129, P. 1921-1928.

32. Davies J.P., Yildiz F. Grossman A. R. Sac 1, putative regulator that is critical for survival of Chlamydomonas reinhardtii during sulfur deprivation. // EMBO j. 1996. V. 15. P. 21502159.

33. Endo T. and Asada K., Dark induction of the non-photochemical quenching of chlorophyll fluorescence by acetate in Chlamydomonas reinhadrtii.il Plant Cell Physiol. 1996. V. 4. P. 283-295.

34. Fedorov, A.S., Kosourov, S., Ghirardi, M.L., Seibert, M. Continuous hydrogen photoproduction by Chlamydomonas reinhardtii: using a novel two-stage, sulfate-limited chemostat system. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. V.121-124. P.403-412.

35. Fett J.P. and Coleman J.R., Regulation of periplasmic carbonic anhydrase expression in Chlamydomonas reinhardii by acetate and pH.// Plant Physiol. 1994. V. 106. P.103-108.

36. Finazzi, G., Rappaport, F., Furia, A., Fleischmann, M., Rochaix, J.D., Zito, F., Forti, G. Involvement of state transitions in the switch between linear and cyclic electron flow mChlamydomonas reinhardtii. EMBO. 2002. Rep. 3. P. 280-285

37. Florin L., Tsokoglou A., Happe T. A novel type of Fe-hydrogenase in the green alga Scenedesmus obliquus is linked to the photosynthetic electron transport chain. // J. Boil. Chem. 2001. V. 276. P. 6125-6132

38. Forester M., King P., Zhang L.P., Posewitz M., Schwarzer S., Happe T., Ghirardi M.L., Seibert M. // Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 2750-2758.

39. Gafron H., Rubin J. // Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae. // J Gen Physiol. 1942. V. 26. P. 219-240.

40. Gfeller R. P., Gibbs M. Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. I. Analysis of fermentative products from starch in dark and light. // Plant Phisiol. 1984. V. 75. P. 212-218

41. Gfeller R.P., Gibbs M. Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. II. Role of plastoquinone. // Plant Phisiol. 1985. V. 77. P. 509-511

42. Gibbs M., Gfeller. R.P.,Chen C. Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. III. Photoassimilation of acetate. II Plant Physiol. 1986. V. 82. P. 160-166.

43. Ghirardi M.L. Hydrogen production by photosynthetic green algae.// Indian Biochem. Biophys. 2006. V. 43. P. 201-203.

44. Ghirardi M. L., Kosourov S., Tsygankov A., Seibert M., Two-phase photobiological algal H2-production system. // Proc. 2000. DOE Hydrogen Program Review. 2006. NREL.: CP-570-28890.

45. Ghirardi M.L., King P.W., Posewitz M.C., Mabess P.C., Fedorov A., Kim K., et al. Approaches to developing biological H2- producing organisms and processes.// Biochem. Soc. Trans. 2005. V. 33. P. 70-72.

46. Ghirardi M.L., Togasaki R.K., Seibert M. Oxygen sensitivity of algal ^-production.// Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V.63-65. P. 141-151.

47. Ghirardi M. L., Zhang L., Flyn T., Seibert M., Greenbaum E., Melis A. Microalgae: a green source of renewable H2. // Trends in Biotechnol. 2000. V.18. P. 506-511

48. Goldschmidt-Clermont M., The two genes for the small subunit of RuBp carboxylase/oxygenase are closely linked in Chlamydomonas reinhardtii.il Plant Mol Biol. 1986. V. 6. P. 13-21.

49. Graham A., Boxer D.H., Haddock B.A., Mandrand Berthelot A.M., and Jones R.W. Immunochemical analysis of the membrane-bound hydrogenase of Escherichia coli. 11 FEBSLett. 1980. V. 113. P. 167-172.

50. Greenbaum E. The photosynthetic unit of hydrogen evolution. // Science. 1977. V. 196. P. 879-880.

51. Greenbaum E. Energetic efficiency of hydrogen photoevolution by algal water-splitting.// Biophys.J. 1988. V. 54. P. 365-368.

52. Greenbaum E., Blankinship S.L., Lee J.W., Ford R.M. Simultaneous Photoproduction of hydrogen and oxygen in a confined bioreactor.// J. Phys. Chem. B. 2001. V. 105. P. 36053609.

53. Greenbaum E., Lee J.W. Photosynthetic hydrogen and oxygen production by green algae: an overview. In : Zaboesky O, editor. Biohydrogen, New York, London: Premium press; 1998. P.235-241.

54. Guan Y.F., Deng M.C., Yu X.J., Zhang W. Two-stage photo-biological production of hydrogen by marine alga Platymonas subcordiformis.il Biochem Engin. 2004. Y. 19. P. 6973

55. Guenther J.E. and Melis A. The physiological significance of Photosystem II heterogeneity in chloroplasts. // Photosynth. Res. 1990. V. 23. P. 105-109.

56. John J. Hahn, Maria L. Ghirardi, and William A. Jacoby. Effect of Process variables on photosynthetic algal hydrogen production.1/ American Chemical Society and American Institute of Chemical Engineers. 2004.

57. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerande. // J. Exp. Bot. 2002. V. 53. P. 1-11.

58. Hallenbeck P. C., Benemann J.R. Biological hydrogen production; fundamental and limiting processes.// Int. J.Hydrogen energy. 2002. V. 27. P. 1185-1193

59. Happe T., Mosler B., Naber J.D. Induction, Localisation and metal content of hydrogenase in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II Eur. J. Biochem. 1994. V. 222. P. 769774.

60. Happe T., Naber J. D. Isolation, characterization and N-terminal amino acid sequence of hydrogenase from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II Eur. J. Biochem. 1993. V. 214. P. 475-478

61. Happe T., Kaminski A. Differential regulation of the Fe-hydrogenase during anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii.il Eur. J. Biochem 2002. Y. 269. P. 1022-1032.

62. Happe T., Hemschemeier A., Winkler M., Kaminski A. Hydrogenases in green algae : do they save the algae's life and solve our energgy problems.// Plant Science 2002. V. 27. N. 6.

63. Harris E. H. The Chlamydomonas soursebook: a comprehensive guide to biolohy and laboratory use. // San Diego. Aad. Press. 1989. P.780

64. Healey F.P. a Hydrogen evolution by several algae. // Planta 1970. V. 91, P. 220-226.

65. Healey F. P. b The mechanism of hydrogen evolution by Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 1970. V. 45. P. 153-159.

66. Hillmer P., Gest H. H2-metabolism in the photosynthetic bacterium Phodooseudomonas capsulata : H2 production by growing cultures.// J. Bacteriol. 1977. V. 129. P. 724-731.

67. Jansen M.A.K., Mattoo A.K., Edelman M. D1-D2 protein degradation in the chloroplast. Complex light saturation kinetics.// Eur. J. Biochem. 1990. V. 260. P. 527-532.

68. Ji Hye Jo., Dae Sung Lee, Jong Moon Park. Modeling and optimization of Photosynthetic hydrogen gas production by Green alga Chlamydomonas reinhardtii in Sulfur-deprived circumstance. // Biotechnol Prog. 2006. V. 22. P. 431-437.

69. Kaltwasser H., Straut T. S., Gaffron H. Light-dependent hydrogen evolution by Scenedesmus. //Planta (Berl.) 1969. V. 89. P. 309-322.

70. Kim Jun Pyo, Chang Duk Kang, Tai Hyun Park, Mi Sun Kim, Sang Jun Sim. Enhanced hydrogen production by controlling light intensity in sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardii culture.// Int. J. Hydrogen energy. 2006. V. 31. P. 1585-1590.

71. Kindle K.L., Expression of the gene for a light-harvesting chlorophyll a/b-binding protein in Chlamydomonas reinhardtii.// Plant Mol Biol. 1987. V. 9. P. 547-563

72. King P.W., Posewitz M.C., Ghirardi M.L., Seibert M. Functopnal studies of FeFe. hydrogenase maturation in an Escherichia coli biosynthetic system. // J.Biotechnol. 2006. V. 188. P. 2163-2172.

73. Klein U., Betz A. Fermentative metabolism of hydrogen-evolving Chlamydomonas moewussi.//Plant Physiol. 1978. V. 61. P. 953-956.

74. Kruse, O., Rupprecht, J., Bader, K.P., Thomas-Hall, S., Schenk, P.M., Finazzi, G., Hankamer, B. Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biol. Chem. 2005. V.80. P. 34170-34177

75. Kosourov S., Ghirardi M.L., Seibert M. The effect of growth mode on hydrogen production by sulfur-depleted green algae. -Abstr. 23th symposium on biotechnology for fuels and chemicals., 2001 May 6-9; Breckenrige, Colorado. P. 2-86.

76. Kosourov S.N., Makarova V., Fedorov A., Tsygankov A., Seibert M., Ghurardi M.L. The effect of sulfur re-addition on H2-photoproduction by sulfur-deprived green algae. // Photosynthesis research. 2005. V. 85.P. 295-305.

77. Kosourov S. N., Patrusheva E.V., Ghirardi M.L., Seibert M., Tsygankov A.A. A comparison of hydrogen photoproduction by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhadrtii under different growth conditions.// J. Biotechnology. 2006. in press.

78. Kosourov S., Tsygankov A., Seibert M., Ghirardi L. M. Sustained Hydrogen photoproduction by Clamydomonas reinhardtii: effects of culture parameters. // Biotecnology and Bioenginering. 2002. N. X.

79. Kosourov S., Seibert M., Ghirardi M. L. Effects of extrscellular pH on the metabolic pathways in sulfur-deprived, H2- producting Chlamydomonas reinhardtii Cultures. // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. P. 146-155.

80. Kreuzberg K., Martin W. Oscillatory starch degradation and fermentation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. II Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 799. P. 291-297.

81. Laurinavichene T.V., Tolstygina I.V., Tsygankov A.A. The effect of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhadrtii. II J.Biotechnol. 2004. V. 114. P. 143-151,

82. Lein T. and Schreiner Q. Purification of a derepressible arylsulfatase from Chlamydomonas reinhardtii. II Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 384. P. 168-179.

83. Levin D.B., Pitt L., Love M. Biohydrogen production: prospects and limitations to practical application. II Int.J. Hydrogen. Energy. 2004. V. 29. P. 173-185.

84. David B. Levin, Rumana Islam, Nasim Cicek, Richard Sparling. Hydrogen production by Clostridium tennocellum 27405 from cellulosic biomass substrate. // Int. J. Hydrogen Energy. 2006. V. 31. P. 1496-1503.

85. Lindholm J., Gustafsson P., Oquist G. Photoinhibition of photosynthesis and its recovery in green alga Chlamydomonas reinhardtii.// Plant Cell Physiol. 1987. V. 28. P. 11331140.

86. Lissolo T., Choi E.S., Legall J., Peck H.D.J. The presence of multiple intrinsic membrane nickel-containing hydrogenase in Desulfovibrio vulgaris.II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 139. P. 701-708.

87. Maeda I., Miyashiro M., Hikawa H., Yagi K., Miura Y., Mizoguchi T. Acceleration of starch degradation by suppression of H2 evolution in Chlamydomonas reinhardtii sp. MGA 161 JlBiosci. Biotech. Biochem. 1996. V. 60. P. 975-978.

88. Markov A., Eivazova E.R., Greenwood J. Photostimulation of H2 production in the green alga Clamydomonas reinhadrii upon photoinhibition of its 02-evolving system. // Int J Hydrogen Energy. 2006. V.31. P. 1314-1317.

89. Martines-Rivas J.M. and Vega J.M., Effect of culture conditions on the isocitrate dehydrogenase and isocitrate lyase activities in Chlamydomonas reinhardtii.il Physiol Plant. 1993. V. 91 P. 599-603.

90. Mattoo A.K., Edelman M. Intramembrane translocation and posttranslational palmitoylation of the chloroplast -32 kDa herbicide-binding protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 1497-1501.

91. Melis A. Green alga hydrogen production: progress, challenges and prospects. // International Journal of Hydrogen Energy. 2002. V. 27. P. 1217-1228.

92. Melis A., Happe T. Hydrogen production Green algae as a source of energy. // Plant Phisiol. 2001. V. 127. N.3. P. 740-748.

93. Melis A., Seibert M., Happe T. Genomics of green algal hydrogen research. // Photos. Res. 2004. V. 82. P. 277-288.

94. Melis A., Zhang L., Forester M., Ghirardi M.L., Seibert M. Sustained photobiological Hydrogen gas production upon reversible inactivation of Oxygen evolution in the Green Alga Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Phisiol. 2000. V. 122. P. 127-135.

95. Meyer J. and Gagnon J. Primary structure of hydrogenase I from Clostridium pasteurianum.il Biochemistry. 1991. V. 30. P. 9697-9704.

96. Mura G.M., pedroni P., Pratesi C., Galli G., Serbolisca L., grandi G. The NiFe. hydrogenase from the thermofilic bacterium Acetomicrobium flavidum.H Microbiology. 1996. V. 142. P. 829-836.

97. Nenoff T.M. Defect-free thin film membranes for H2 separation and isolation. // Proceedings of the 2000 Hydrogen Program Review, NREL/CP-570-28890. 2000.

98. Nicolet Y., Piras C., Legrand P., Hatchikian C.E., Fontecilla-Camps J.C. Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure swhows unusial coordination to an active site Fe binuclear center J I Structure. 1999. V. 7. P. 13-23.

99. Niyogi K.K. Photoprotection revisited: genetic and molecular approaches. // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 333-359.

100. Noctor G., Arisi A-C., Jouanin K.L., Kunert H., Rennenberg H and Foyer C. glutathione: biosynthesis, methabolism and relationship to stress tolerance explored in transgenic plants. II J. Exp. Bot. 1998. V. 49. P. 623-647.

101. Peters J. W., Lanzilotta W. N., Lemon B. J., Seefeldt L. C. X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase (Cpl) from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution. // Science. 1998. V. 282. P. 1853-1858

102. Posewitz M.C., Smolinski S.L., Kanakagiri S., Melis A., Seibert M., Ghirardi M.L. Hydrogen photoproduction is attenuated by disruption of an isoamylase gene in Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Cell. 2004. V. 16. P. 2151-5163.

103. Pow T., Rrasana A.I. photoproduction of hydrogen from water in hydrogenase-containing algae.// Arch. Biochem. Biophiys., 1979, V.194. P. 413-421.

104. Prince R.C., Haroon S. K. The photobiological production of hydrogen: potential efficiency and effectiveness as a renewable fuel. // Critical Rev. Microbiol. 2005. V. 31. P. 19-31.

105. Rajagopal B.S., Lespant P.A., Fauque G., Legall J., Berlier Y.M. Mass-spectrometric studies of the interrelations among hydrogenase, carbon monoxide dehydrogenase, and methane-forming activities in pure and mixed cultures of Desulfovibrio vulgaris,

106. Desulfovibrio desulfuricans, and Methanosarcina barkeri.il Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 2123-2129.

107. Reeves M., Greenbaum E. Long-term endurance and selection studies in hydrogen and oxygen Photoproduction by Chlamydomonas reinhardyii. /I Enzyme Microbial Technol, 1985. V. 7.P.169-174.

108. Reider R., Cammack R., Hall D.O. Purification and properties of the soluble hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans.// Eur.J.Biochem. 1984. V. 145. P. 637-643.

109. Roessler P. G., Lein S. Purification of hydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii.il Plant Phisiol. 1984. V. 75. P. 705-709.

110. Roessler P.G., Lein S. Activation and de novo synthesis of hydrogenases in Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Physiol. 1984. V. 76. P. 1086-1089.

111. Saito K. Regulation of sulfate transport and synthesis of sulfur-containing amino acids. // Curr. Opin. Plant. Biol. 2000. V. 3. P. 188-195.

112. Samuelson G., Lonnenborg A., Rosenquist E., Photoinhibition and reactivation of photosynthesis in cyanobacterium Anacystis nidulans.ll Plant Physiol 1985. V. 79. P. 902905.

113. Sawers R.G., Ballantine S.P., Boxer D.H. Differential expression of hydrogenase isoenzymes in Escherichia coli K-12: evidence for a third isoenzyme. // JBacteriol. 1985. V. 164. P.1324-1331.

114. Schneider K. and Schlegel H.G. Purification and properties of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H 16. IIBiochim. Biophys. Acta. 1976. V. 452. P. 66-80.

115. Schnackenberg J., Schultz R., Senger H. Characterization and purification of hydrogenase from the eukaryotic green alga Scenodesmus.il FEBSlett. 1993. V. 327 P. 21-24.

116. Schreiner Q., Lein T., Knutsen G. The capacity of arylosulfatase synthesis in synchronous and synchronized cultures of Chlamydomonas reinhardtii. II Biochem. Biophys. Acta. 1975. V. 384. P. 180-193.

117. Seefeldt L.C. and and Arp D.J. Purification to homogeneity of Azotobacter vinelandii hydrogenase: a nickel and iron containing alpha beta dimmer. // Biochimie. 1986. V. 68. P. 25-34.

118. Seibert M. Regulation of photosystem II activity, H2 production, and O2 consumption pathways in sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii cultures. // BioHydrogen 2002. The Netherlands. 2002

119. Senge M. and Seinger H., Response of the Photosynthetic apparatus during adaptation of Chlorella and Ankistrodesmus to irradiance changes.// J. Plant. Physiol. 1990. V. 136. P. 675-679.

120. Serebryakova L.T., Zorin N.A., Linblad P. Reversible hydrogenase in Anabaena variabilis ATCC 29413. Presence and localization in non-N2-fixing cells.// Arch. Microbiol. 1994. V. 161. P.140-144.

121. Stuart T. S., Gaffron H. The mechanism of hydrogen photoproduction by several algae. // Planta. 1972. V. 106. P. 101-112.

122. Styring S., Virgin I., Ehrenberg A., Anderson B. Strong light photoinhibition of electron transport in photosystem II. Impartment of the fuction of the first quinine acceptor Qa. // Biochem Biophys Acta. 1990. V. 1015. P. 269-279.

123. Tsygankov A., Kosourov S., Seibert M., Girardi M.L. Hydrogen photoproduction under continuous illumination by sulfur-deprived, synchronous Chlamydomonas reinhardtii cultures.// Int. J. of Hydrogen Energy. 2002. V. 27. P. 1239-1224.

124. Vignais P.M., Billoud B., Meyer J. Ckassification and phylogeny of hydrogenases. //. FEMSMicro rev. 2001. V. 25. P. 455-501.

125. Volbeda A., Montet Y., Vernede X, Hatchikian E.C., Fontecilla-Camps JC. Hugh-resolution crystallographic analysis of desulfovibrio fructosovorans NiFe. hydrogenase. // Int. J Hydrogen Energy. 2002. V. 27. 1449-1461.

126. Wikoff D. D., Davies J. P., Melis A., Grossman A. R. The regulation of photosynthetic electron transport during nutrient deprivation in Chlamydomonas reinhardtii. II Plant Phisiol. 1998. V. 117. P. 129-139.

127. Winkler M., Heil B., Happe T. Isolation and molecular characterization of the Fe-hydrogenase from the unicellular green alga Chlorella fusca. II Biochem. Biophys. Acta. 2002. V. 1576. P. 330-334.

128. Winkler M., Maeurer C., Hemschemeier A., Happe T. The isolation of green alga strains with outstanding H2-productivity. Biohydrogen III, (miyake J. Igarashi Y, Roegner M.,), // Elsevier Science, Oxford, 2004. in press.

129. Zenk M. H. Heavu metal detoxification in higher plants -a review. // Gene. 1996. V. 179. P. 21-30.

130. Zhang L., Happe T., Melis A. Biochemical and morphological characterization of sulfur-deprived and H2-producing Chlamydomonas reinhardtii (green alga). // Planta. 2002. V.214 P. 552-561.

131. Zhang L. and Melis A. Probing green algal hydrogen production.// Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2002. V. 357. P. 1499-1509.

132. Zorin N.A., Lissolo T., Colbeau A., Vignais P.M. Increased hydrogen photoproduction by Rhodobacter capsulatus strains deficient in uptake hydrogenase.// J. Mar. Biotech. 1996. V. 4. P. 28-33.

133. Выражаю глубокую благодарность моему научному руководителю, доктору биологических наук Анатолию Анатольевичу Цыганкову за постоянную помощь и содействие в работе.

134. Искренне благодарю сотрудников лаборатории биотехнологии и физиологии фототрофных организмов и лаборатории биохимии и биотехнологии фо готрофных микроорганизмов за дружескую поддержку и содействие в работе.

135. Выражаю глубокую признательность моим близким за моральную поддержку и дружеское участие.

Информация о работе

Толстыгина, Ирина Викторовна
кандидата биологических наук
Пущино, 2007
ВАК 03.00.12

Диссертация

Выделение водорода Chlamydomonas reinhardtii в условиях недостатка серы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы