Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii

Волгушева, Алена Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii"

На правах рукописи

□ОЗОВЗОТ5

Волгушева Алена Александровна

Влияние серного голодания на первичные процессы фотосинтеза и фотоиндуцнрованное образование водорода у зеленой водоросли СМатуйотопаз гетНагйШ

Специальность: 03 00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 МАЙ 2007

Москва-2007

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М В Ломоносова

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Кренделева Татьяна Евгеньевна

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор Балнокин Юрий Владимирович

доктор физико-математических наук, профессор Кукушкин Александр Константинович

Ведущая организация

Институт биохимии им А H Баха РАН

Защита состоится 24 мая 2007 г в 15 ч 30 мин на заседании Совета Д 501 001 96 в Московском Государственном Университете по адресу 119992, г Москва, Ленинские Горы, МГУ им M В Ломоносова, Биологический факультет, кафедра биофизики, Новая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан <£3 апреля 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета Доктор биологических наук, профессор

IТ Е Кренделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Способность микроводорослей к светозависимому образованию водорода (Н2) обнаружена более 60 лет назад (Gaffron, Rubin, 1942) Этот процесс связан с активностью гидрогеназ, восстанавливающих протоны до модекулярного водорода Непосредственным донором электронов для гидрогеназной реакции в зеленых водорослях является ферредоксин, восстановленный фотосинтетической эчектронтранспортной цепью (ЭТЦ), а обязательным условием - отсутствие 02 (Biochenko, Hoffmann, 1994), который даже при очень низких концентрациях ингибирует активность фермента (Ghirardi et al, 1997) и подавляет экспрессию ее генов (Happe, Kaminski, 2002) Механизм выделения Н2 физиологически важен для клеток, он позволяет временно защитить клетку от фотоингибирования и поддержать в неблагоприятных условиях необходимый уровень АТФ (Melis, Happe, 2001, Happe et al, 2002, Цыганков, 2007)

В процессе светозависимого образования Н2 на свету микроводорослями важнейшую роль играет ФС2 С одной стороны она обеспечивает гидрогеназную реакцию электронами за счет разложения воды, с другой - выделяющимся 02 ингибирует активность гидрогеназы Таким образом возникает проблема разделения стадий выделения 02 и образования Н2 Эта проблема была решена при культивировании зеленых водорослей (С reinhardtii) на постоянном свет-у в замкнутом культиваторе в условиях голодания по сере (Ghirardi et al, 2000, Melis et al, 2000) В процессе инкубации культуры С reinhardtii в условиях серного голодания аэробные условия в культиваторе самопроизвольно сменяются анаэробными, что обусловлено, главным образом, падением скорости фотоокисления воды (образования 02), в результате постепенной инактивации ФС2 Когда скорость образования кисторода становится ниже скорости дыхания, культура переходит в анаэробные условия с последующей активацией гидрогеназы и образованием Н2

Несмотря на то, что этот прием активно используется в биотехнологических целях (Biochenko et al, 2004, Цыганков, 2007), в понимании молекулярных механизмов и принципов регуляции процесса еще много белых пятен Исследование функции ФС2 при серном голодании может обеспечить дополнительные сведения об изменениях механизмов первичных процессов фотосинтеза и роли ФС2 в регулировании образования Н2 Но прежде чем изучать процессы, происходящие в клетках в культиваторе, надо понять, что происходит с голодающей по сере культурой в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна Одним из источников информации о функциональном состоянии первичных процессов фотосинтеза и активности ФС2 в частности, является флуоресценция хлорофилла а (ФХ а), зарегистрированная в

различных временных диапазонах (Karapetyan et al, 1990, Krause, Weiss 1991, Strasser and Strasser,1995, Shatz et al, 1998, Lazar, 2006)

Цели и задачи работы Цель настоящей диссертационной работы состояла в исследовании влияния серного голодания на функциональную организацию первичных процессов фотосинтеза и изучение роли ФС2 в процессах, ведущих к фотообразованию Н2 клетками С reinhardtu

Для достижения этой цели бычи поставлены следующие задачи

• Изучить особенности первичных процессов фотосинтеза у готодающей по сере микроводоросли С reinhardtu в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна

• Провести анализ первичных процессов фотосинтеза культуры С reinhardtu в замкнутом культиваторе на всех стадиях, предшествующих выделению водорода (аэробную, переход в анаэробиоз, анаэробную), и на стадии выделения водорода

• Используя саит-специфичные мутанты С reinhardtu D1-R323, исследовать влияние приводящих к уменьшению кислород-выделяющей активности повреждений ЭТЦ на донорной стороне ФС2 на светозависимое выделение Нг в культиваторе

Научная новизна Впервые проведен анализ кинетики затухания флуоресценции, индуцированной пикосекундными лазерными импульсами, у голодающих по сере клеток С reinhardtu Изучение флуоресценции в разном временном диапазоне позволило показать, что увеличение интенсивности флуоресценции при серном голодании С remhaidtu происходит за счет появления долгоживущих состоянии QA" (увеличение вклада медленной, рекомбинационной компоненты) Показано, что серное голодание приводит к перераспределению путей диссипации неиспользованной в фотосинтезе световой энергии нарушаю! ся процессы тепловой диссипации (нефотохимическое тушение, виолаксантиновый цикл) Обнаруженное нами увеличение выхода флуоресценции связано не с нарушениями взаимоотношений антенна - реакционный центр, а является результатом нарушения электронтранспортных процессов внутри пигмент-белкового комплекса (ПБК) ФС2 Кинетики световой индукции и темновой релаксации флуоресценции позволили выявить нарушения ЭГЦ в голодающих но сере клетках С reinhardtu не только на акцепторной, но и на донорной стороне ФС2

Впервые было показано, что голодающая по сере культура С reinhardtu в замкнутом культиваторе переходит в анаэробиоз не только в результате уменьшения фотосинтеза, как считалось ранее, но и в результате увеличения скорости дыхания Методом пикосекундной флуорометрии впервые было показано, что быстрая «скачкообразная» инактивация ФС2 (на фоне медленной,) при переходе в анаэробиоз связана с резким изменением редокс состояния

пула хинонов На мутантах С remhardtu было показано, что светозависимое выделение Нг клеткам снижается при нарушении электронного транспорта на донорной стороне ФС2 Мутант, лишенный способности разтагать воду, водорода не выделял Практическая значимость Проведенное исследование структурно-функциональных изменений в клетках С remhardtu при серном голодании в аэробной фазе позволяет лучше понять механизмы, предшествующие образованию Н2 Результаты, характеризующие функционирование фотосинтетического аппарата при серном голодании в культиваторе, важны для понимания рочи ФС2 в процессе фотообразования водорода клетками водорослей С remhardtu и могут быть основой для разработки методов диагностики состояния культуры в биореакторе, а также для разработки биотехнологических приемов для увеличения выхода Нг Результаты работы могут быть потезными при построении моделей, прогнозирующих фотоиндуцированный выход водорода

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на XI и XII международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005 и 2006» (Москва, 2004, 2005), XVIII Всероссийской конференции «Преобразование энергии света при фотосинтезе» (Пущино, 2005), Международной конференции «Фотосинтез в постгеномную эру структура и функции фотосистем» (Пущино, 2006), семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ им М В Ломоносова

Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 1 в реферируемом научном российском журнале (из списка ВАК), 1 в реферируемом зарубежном журнале, I в сборнике статей международной научной конференции, 5 в тезисах конференций

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на страницах, иллюстрирована ¡¿j[ рисунками и /Стаблицами Список литературы содержит //J» источника (из них /$Уна английском языке)

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объектом исследования являлась культура Chlamydomonas remhardtu Dang cJ37+, выращенная фотогетеротрофно на трис-ацетат-фосфатной среде, pH 7 0 (Harris,1989), при 25°С и освещенности »100 мкЕ м"2 с"1 Дополнительными объектами исследования служили мутанты Chlamydomonas у которых R323 на D1 белке заменен на гистидин, аспартат или лизин (D1-R323H, D1-R323D и D1-R323L) Отмывание культуры от серы производили путем трехкратного осаждения центрифугированием и ресуспендирования в среде без серы В

экспериментах по выделению Н2 отмытые от серы клетки помещали в герметично закрытый культиватор и выращивали в течение 96 ч при постоянном перемешивании и освещенности «80 мкЕ м"2 с1 РАМ-флуорометр РАМ-2000 («Walz, Effelrich», Германия) использовали дая оценки эффективности фотохимического преобразования энергии в ФС2 как в образцах адаптированных к темноте (Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm), так и на постоянном свету (AF/Fm '=(Fm -Ft)/Fm') (Sreiber et al, 1995), где Fo - выход флуоресценции в темноте, Fm - выход флуоресценции при насыщающей вспышке света, Ft - на постоянном свету, Fm' - при действии насыщающей вспышки на фоне постоянного света Нефотохимическое тушение рассчитывали по формуле NPQ=(Fm-/->n ')!Fm' (Bilger, Bjorkman, 1990) Спектры поглощения и спектры испускания ФХ регистрировали на спектрофотометрах Hitachi-557 и Hitachi-850 (Япония), соответственно Кинетики световой индукции фтуоресценции высокого разрешения регистрировали на РЕА-флуорометре (Hansatech, King's Lynn, Norfolk, UK) при интенсивности света 1500 мкЕ м2 с"' ФХ в пико-наносекундном диапазоне регистрировали с помощью созданного на кафедре биофизики импульсного флуорометра с пикосекундным лазером в качестве источника возбуждающего света (Х=532 им, длительность импульса 30 пс, вторая гармоника Nd YAG лазера с частотой 1 Гц) Изменения абсорбции Р700+ измеряли по изменению поглощения (^=830 нм) с помощью флуорометра РАМ-101 (Walz, Effeltrich, Германия) в присутствии 15 мкМ DCMU Скорости выделения кислорода и темпового дыхания измеряли с помощью полярографической ячейки и электрода Кларка Регистрацию содержания растворенного 02 проводили непосредственно в культиваторе с помощью кислородного электрода (МАРК-201, Россия) Концентрацию Н2 в газовой фазе биореапора измеряли с помощью газового хроматографа JIXM-80 с катарометром Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева Содержание хлорофилла определяли спекгрофотометрически (Lichtenthaler, 1987), в этиловом спирте Содержание белка определяли по методу Lowry (1951), содержание крахмала - по (Gfeller, Gibbs,1984) Содержание глюкозы определяли с использованием системы ¡люкозооксидаза-пероксидаза (Barham, Trinder, 1972) Каротиноидный состав определяли методом жидкостной хроматографии (HPLC) (Solovchenko et al, 2001) на хроматографе Knauer К-501 (Германия) с детектором К-2501

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние серного голодания на первичные процессы фотосинтеза в аэробных условиях

Характеристика культуры

Концентрация клеток в контрольных суспензиях удваивалась за первые сутки после отмывания и перенесения на новую среду и далее незначительно нарастала Содержание

хлорофилла (XJI) на клетку микроводорослей, а также отношение XJI alb как в контрольных, так и в голодающих по сере клетках в течение 72 часов эксперимента варьировало слабо, чго свидетельствует об отсутствии значительных изменений в соотношении содержащих ХЛ фотосинтетических ПБК В тоже время голодающие клетки увеличивались в размерах, изменяли форму с эллипсовидной (контроль) на округлую, что согласуется с результатами проведенных ранее исследований (Zhang et al, 2002) Изучение жизнеспособности голодающих по сере клеток микроводорослей С reinhardtu показало, что в течение всего эксперимента мертвые клетки в суспензиях отсутствовали

Исследование состояния фотосинтетического аппарата с использованием ¡модулированной флуорометрии (РАМ) Величина Fv/Fm, которая характеризует максимальную эффективность фотохимического преобразования энергии в ФС2, при серном голодании существенно снижалась, в отличие от контроля В голодающих по сере клетках в наших экспериментальных усчовиях величина Fv/Fm уменьшалась с 0,75 (0 ч) до 0,40 (72 ч) Это согласуется с данными (Wykoff et al, 1998), где показано существенное снижение количества активных реакционных центров и белка D1 РЦ ФС2 в клетках С reinhardtu при серном голодании

На рис 1 приведены изменения интенсивности параметров ФХ (Fo и Fm) в расчете на мг ХЛ (обозначено как Fox, и Fmx,) адаптированных в течение 3 мин к темноте контрольных (+S) и голодающих (-S) по сере культур С reinhardtu У контрольных клеток, как видно из рисунка, интенсивность Fox, и Fmй за время эксперимента почти не изменяется Обращает на себя внимание, значительное увеличение Fox, и Fmx, у голодающей по сере культуры

Увеличение выхода флуоресценции у голодающих клеток четко видно и при измерении спектральных характеристик суспензий водорослей, выравненных по содержанию ХЛ Полученные спектры дополнительно выравнены по главному максимуму поглощения (683 им) Как видно из рис 2, в спектрах поглощения контрольной и голодающей культуры небольшие различия наблюдаются только в области поглощения каротиноидов 440-460 нм Интеграл под кривой ФХ в диапазоне 650-770 им для

Время,ч

Рис 1 Изменения параметров флуоресценции Го и /'/я (на мг хлорофилла) клеток С гетИагйШ на полной среде (+в) и среде без серы (-в)

голодающих клеток, был почти в 3 раза выше значения, полученного для контрочьных образцов, это хорошо согласуется с наблюдаемым увеличением выхода флуоресценции, полученным методом РАМ (рис 1)

7! с

6 I

5 I

Ч35 CJ

£30

i25 ^20

§ 1 5

8 1 о

1 05

: -S (а) 1'

+S00\ 1 • Л :

; \ /А' ■

1 1 \

✓ , \+S (5)у

■

оо

400 450 500 550 600 650 700 750 HM

4 ■в-

з|

1 * с

Каковы возможные причины увеличения выхода ФХ при серном голодании'' Поскольку величина Ео как правило, пропорциональна содержанию ХЛ в клетках, небольшое увеличение этого параметра у контроля можно объяснить увеличением количества клеток за время эксперимента У голодающей культуры мы не наблюдали ни изменения концентрации клеток, ни содержания ХЛ в течение 72 часов эксперимента Существенное увели-

Рис 2. Спектры поглощения (а) и спектры

испускания ФХ (б) суспензий клеток С remhardtu через 48 ч инкубации на полной среде (+S) и среде без серы (-S)

чение Fo в данном случае могло бы быть следствием диссоциации части низкомолекулярных антенн от реакционных центров, вызванной частичной деструкцией ФС2 в условиях стресса (Bnantais et al, 1996) Однако этим нельзя объяснить увеличение Fm

Интенсивность ФХ пропорциональна количеству поглощенных квантов света и константе излучательной дезактивации энергии, и обратно пропорциональна сумме констант фотохимической и нефотохимической дезактивации энергии в ФС2 (Рубин, 2004) Параметр Fm характеризует интенсивность флуоресценции в условиях, когда центры ФС2 закрыты, i е квантовый выход фотохимической дезактивации возбуждения равен нулю Поэтому увеличение Fm при недостатке серы может быть связано с уменьшением эффекшвности тепловой диссипации энергии в ФС2, либо с увеличением сечения поглощения света антенными комплексами эюй фотосистемы, что нуждается в проверке

Нефотохимическое тушение флуоресценции Проявлением тепловой диссипации энер1 ии является нефогохимическое тушение (NPQ) и функционирование связанного с ним виолаксантинового цикла Изучение световой индукции NPQ показало существенные различия между контрольными и голодающими культурами В кинетике изменения NPQ выделяют три компоненты (Muller et al, 2001) быструю qE, связанную с ДрН-зависимым ростом тепловой диссипации энергии возбуждения (главным образом в результате накопления антера- и зеаксантина), более медленную qT, обусловленную перераспределением ССК2 между ФС2 и ФС1 (переходы между состояниями 1 и 2), и самую медленную ql, отражающую тепловую диссипацию энергии в реакционных центрах ФС2 при

фотоингибировании Характерные времена процессов тушения составляют несколько десятков секунд (qE) и минут (qT), в то время как компонента ql изменяется в течение часов

На рис 3 приведены кинетические кривые NPQ при разной интенсивности света Кинетики световой индукции измеряли при действии постоянного света разной интенсивности (22 и 500 мкЕ м'2 с"1) в течение 10 мин Предварительно образцы помещали в темноту на 12 ч для исключения вклада ql в тушение флуоресценции Перед измерением образцы продували аргоном, чтобы перевести фотосинтетический аппарат в состояние 2 и исключить вклад компоненты qT (Delepelaire, Wollman, 1985) Таким образом, регистрируемая нами кинетика NPQ соответствовала развитию qE компоненты

Как видно из рис 3 уровень NPQ при высокой интенсивности света у голодающей культуры существенно ниже, чем у контрольной При низкой интенсивности света NPQ у голодающей культуры практически не развивается Таким образом, у голодающей культуры отсутствует вклад быстрой ДрН-зависимой компоненты qE, что свидетельствует о нарушении тепловой диссипации энергии, связанной с ксанто-филловым циклом (Müller et al, 2001) Закисление внутритилакоидного пространства при активном электронном транспорте активирует деэпоксидазу виолаксантина, превращая его в антера- и зеаксантин, который является эффективным тушителем флуоресценции, что, соответственно, вызывает увеличение NPQ Физический механизм тушения и передачи энергии связан с особенностями электронных уровней этих пигментов Первое возбужденное синглетное состояние виолаксантина выше, а зеаксантина ниже энергетического уровня хлорофилла Уменьшение АрН при любых нарушениях электронного транспорта активирует эпоксидазу зеаксантина, которая катализирует обратное превращение его в виолаксантин и цикл замыкается (Demmig-Adams, 1990)

Как видно из табл 1, в контрольных клетках за 15 мин инкубации на свету интенсивностью 540 мкЕ м"2 с"1 содержание виолаксантина на моль XJI снижалось на 20%, концентрация тушителя флуоресценции зеаксантина увеличивалась Несмотря на то, что в голодающих

ОбДОмьЕмЧ1 +S 0540 мкЕмЧ1 -S мкЕм2

4 6

Время мин

Рпс.З. Кинетики индукции нефотохимического тушения флуоресценции клеток С гетНагйШ (ОТ(2=^/п-.Р>я УРт), измеренные через 72 ч инкубации па полной среде (+в) и среде без серы (-Б)

клетках каротиноидов (в частности, виолаксантина) больше, чем в контроле, его содержание под действием света не изменялось Это указывает, что виолаксантиновый цикл н функционирует Эти данные согласуются с результатами полученными ранее (\Vykoff е! а1, 1998) Более высокое содержание каротиноидов, в частности лютеина и виолаксантина : голодающей по сере культуре может вызывать некоторое увеличение поглощения свет, антенной, но не может быть основной причиной столь сильного увеличения выхода ФХ Это предполагает, существование других механизмов, приводящих к увеличению флуоресценции

Таблица 1 Каротиноидный состав С теткатйш, определенный через 72 ч инкубации на полной среде (+в) и среде без серы (-Б)

Клетки выращивали на свету 100 мкЕ ад"2 с и адаптировали к темноте в течение 12 ч Образцы для определения каротиноидов брали до (Т) и после 15 мин экспозиции на сильном свету интенсивностью 540 мкЕ м"2 с"1 (С) В- виолаксантин, А- антераксантин, 3- зеаксантин

Условия В/Хл, ммоль/чоль А/Хл, ммоль/моль З/Хл, ммоль/моль (В+А+3)/Хл, ммоть/моль Лютеин/Хл, ммоль/моль

+8/Т 82 6 3 90 81

65 8 16 89 -

-Б/Т 94 7 18 118 119

-Б/С 98 6 18 122 -

Обратимые переходы ССК между ФС2 и ФС1

Интенсивность ФХ зависит от количества квантов, поглощенных ФС2, которое может изменяться в результате перераспределения ССК между ФС2 и ФС1 (переходы между состояниями 1 и 2) В состоянии 1 (с высокой флуоресценцией) большая часть ССК находится вблизи ФС2 В состоянии 2 (с низкой флуоресценцией) часть ССК перемещается к ФС1 Этот процесс крайне важен для регуляции распределения энергии возбуждения между фотосистемами, особенно у одноклеточных водорослей, где в нем участвует до 80% ССК, имеющихся в клетке феЬэте е1 а1, 1996) Представляло интерес изучить, в каком состоянии находится ФСА голодающих по сере клеток

Механизм перехода в состояние 2 заключается в миграции определенной популяции ССК от ФС2 к ФС1 вследствие фосфорилирования полипептида ССК протеинкиназой, активность которой контролируется редокс состоянием переносчиков электронов в цепи между фотосистемами Когда ЭТЦ между ФС окислена, киназа не активна После восстанавлеиия переносчиков ЭТЦ (белок Риске и цит_/) происходят конформационные изменения в

макромолекуле цитохромного комплекса, что приводит к активации киназы Активная киназа фосфорилирует треониновые остатки ССК, экспонированные в стромальное пространство хлоропласта (Forsberg, Allen, 2001) Фосфорилированныи белок, получивший дополнительный заряд, вследствие электростатических взаимодействий выталкивается из зоны стекинга и перемещается латерально в нестыкованную часть мембраны, где локализована основная часть ПБК ФС1 Обратный переход ССК от ФС1 к ФС2 (состояние 1) происходит после дефосфорилирования ССК, катализируемого фосфатазой, и наблюдается в устовиях, когда пул хинонов окисляется (Wollman, 2001)

В эксперименте переходы между состояниями можно индуцировать in vitro, изменяя редокс состояние пула хинонов Так, например, действие высокой интенсивности света или анаэробные условия приводят к восстановлению переносчиков ЭТЦ между фотосистемами и переводят фотосинтетический аппарат в состояние 2 (Delepelaire, Wollman, 1985) Обратный переход из состояния 2 в состояние 1 можно инициировать постоянным светом высокой интенсивности в присутствии DCMU, что вызывает окисление пласгохинонового пула через ФС1 (Peltier, Schmidt, 1991), либо добавлением на свету DBMIB - ингибитора активности протеинкиназы (Finazzi et al, 2001)

Как видно из рис 4, продувание аргоном (стрелочка 1) адаптированных к темноте суспензий микроводорослей С reinhardtu (0 ч) снижало интенсивность ФХ контрольных клеток на 50%, а голодающих - только на 10% Это позвотяет предпола1 ать, чго в условиях серною гочодания ФСА микроводорослей находится преимущественно в состоянии 2 Добавтение (стрелочка 2) на свету 10~5 М DCMU (кружки) или 10"5 М DBMIB (треугольники) приводило к уве течению интенсивности ФХ суспензий контрольных клеток, в то время как у голодающих клеток изменений не происходило Таким образом, ФСА голодающих по сере клеток, характеризующихся высоким выходом флуоресценции, тем не менее, находятся преимущественно в состоянии 2

40F

1 30 -

-s

£ 20 -е-

■Ck

10 -

4 6 8

Время, мин

Рис 4 Изменения интенсивности флуоресценции хлорофилла, вызванные переходами между состояниями 1 и 2 в контрольных (+в) и голодающих по сере (-Б) в течение 48 ч клетках С гаяйяпйн

Индукционные кривые флуоресценции при высокой освещенности

Для получения кинетик световой индукции флуоресценции с высоким временным разрешением был использован РЕА-флуорометр В кинетике индукции флуоресценции ХЛ в ответ на свет высокой интенсивности, обычно наблюдается несколько компонент, т н 0-J-I-P переходы Они связанны с поступательным снижением фотохимического тушения и развитием нефотохимического тушения флуоресценции в ФС2 (Lazar, 2006) Фаза 0-J обусловлена светоиндуцированным восстановлением QA, тогда как фаза J-I-P отражает, главным образом, дальнейшее накопление восстановленного QA", обусловленное снижением его реокисления в результате восстановления QB и пула хинонов Уровни О и Р на кинетической кривой соответствуют величине Fo и Fm (Heredia, De Las Rivas, 2003, Strasser, 2004)

Как видно из рис 5 А, увеличение Fo (О) и Fm (Р) на кинетических кривых голодающих по сере клеток согласуется с представленными ранее результатами на рис 1 На рис 5 Б приведены эти же кинетические кривые, нормированные по уровню О, т е представтенные в виде F/Fo (F = Fm-Fo) Видно, что по мере голодания значительно изменялась форма кривой О-J-I-P, у голодающей культуры не наблюдалось четкого перехода между фазами J-I и I-P Результаты проведенного JIP-теста, которые позволяют производить количественный анализ О-J-I-P кинетик (Strasser, Strasser, 1995), показали снижение вклада фотохимической фазы J-I-P, что свидетельствует о нарушении потока электронов от ФС2 в пул хинонов (подробнее об этом в диссертации) Последнее указывает на появтение QB-невосстанавтивающих центров ФС2, неспособных восстанавливать пул хинонов Об этом же свидетельствует увеличение времени достижения Fm с 215 (0 ч) до 366 мс (72 ч)

Рис 5 Влияние серного голодания на индукционные кинетики флуоресценции относительно контроля (0 ч), измеренные в клетках С гетИагЛп

А - изменения интенсивности флуоресценции, нормированной по хлорофилту, Б - по уровню О ^о), значения флуоресценции представлены как ^/Го Переходы О-Ы-Р индуцировали акгиничным светом интенсивностью 1500 мкЕ м2 с1 Измерения проводили после 3 мин инкубации клеток в темноте

Как видно из рис 6, при серном голодании скорость роста фазы 0-J значительно увеличивалась по сравнению с контролем Ранее отмечалось, что в условиях стресса, вызванного разчичмыми причинами (Lazar et al, 1997а, Ah et al, 2006), на кривых флуоресценции (примерно на 300 мкс) наблюдается резкий переход от фазы 0-J к фазе J-I, с образованием «ступеньки» или даже дополнительного пика К (Strasser, 1997) Причины его появления не до конца ясны, однако его связывают с нарушениями на донорной стороне ФС2, в частности в функционировании кислород-выделяющего комплекса (КВК) (Strasser, 1997), вследствие увеличения редокс состояния QA (Krieger et al, 1995, Johnson et al, 1995) Этот пик не всегда можно определи гь визуально, но он четко проявляется, если от конгротя отнять опыт (Schmitz et al, 2001) Как видно из рис 6, серное голодание приводит к появлению К-пика, что указывает на повреждение ЭТЦ на донорной стороне ФС2

Û 12

Время, мс

Об этом же можно судить и по кинетикам ретаксации флуоресценции (Fv), измеренным методом РАМ Известно, что кинетика темнового реокисления QA тесно связана с реокисчением пула хиноиов (Corneille et al, 1998)

Медленная компонента в кинетике релаксации Fv отражает рекомбинацию QA с 82-состоянием КВК (Cao, Govindjee, 1990) В клетках, голодающих по сере в течение 24 ч, амплитуда этой компоненты снижалась почти вдвое, а время жизни увеличивалось от 1570 до 2380 мс, что

Рис 6 Начальная фаза (0-.Т) кинетики индукции флуоресценции измеренная в клетках С гетИагЛи при серпом голодании

Кинетики нормированы по уровням О и I Кривые а, б, в соответствующие 12, 48 и 72 ч свидетельствует об уменьшении количества голодания, являются разницей между экспериментальными кривыми и контролем

центров ФС2, способных осуществлять рекомбинацию зарядов между 82 и Од, и о снижении скорости этой реакции Считают, что быстрая и средняя компонента релаксации Р\' обусловлены реокислением ФС2 «быстрым» и «медленным» пулом хинонов, которые расположены в гранах и строме, соответственно (1о1ю1 е1 а1, 1992) Согласно нашим данным, амплитуда быстрой компоненты в голодающих клетках была в 1,5 раза ниже по сравнению с контролем, в то время как амплитуда средней компоненты возрастала в 2 раза Это свидетельствует об уменьшении вклада гранального пула хинонов в окисление СЬ, видимо, вследствие фотоингибирования а-центров ФС2 Содержание <Зв-невостанавливающих Р-

центров ФС2 увеличивается при готодании, о чем свидетечьствует увеличение амплитуды средней компоненты Таким образом, в голодающих по сере клетках С гетИагЛи электронный транспорт нарушен как с акцепторной, так и с донорной стороны ФС2

Пико-наносекундная флуорометрия процессов преобразования энергии света в ФС2 в

голодающей по сере культуре С гешНагсНа Для выяснения природы процессов и понимания механизмов, приводящих к увеличению выхода флуоресценции, нами были изучены изменения кинетик затухания флуоресценции, индуцированной пикосекундными лазерными импульсами у голодающих по сере клеток С гетТгаЫШ Характерные времена и относительные амплитуды компонент кинетик затухания флуоресценции в пико-наносекундном диапазоне позволяют судить о процессах миграции энергии и переноса электрона в ПБК ФС2 и, таким образом, ответить на вопрос, какие именно этапы нарушаются при недостатке серы (Пащенко, 1990, 2000)

Нами были получены кинетики затухания флуоресценции культуры С гетЬагЛи на разных стадиях голодания Измерения проводили на клетках, адаптированных к темноте (3 мин) и после восстановления (2д в РЦ ФС2 светом в присутствии 10 мкМ БСМи (закрытые РЦ ФС2) Кинетики анализировались в двухэкспоненциальном приближении, как описано (8Ьа1г й а1, 1988) Согласно этой модели быстрая компонента кинетики отражает процессы эквилибризации возбужденных состояний в антенне ФС2, миграции возбуждения к Р680 и разделения зарядов Р680*Фео—► Р680+Фео Медленная компонента обусловлена процессами прямого переноса электронов от Фео" к и обратного с (5а~ на Фео с последующим возбуждением Р680 и излучательной диссипацией возбужденного состояния В экспериментах с пикосекундным возбуждением флуоресценции в случае адагггировшшых к темноте клеток, значение площади под кривой затухания флуоресценции ((р„ = ф] + <р2) соответствовало значению Л>, в образцах с закрытыми РЦ (д>„ = (р, + ф2) соответствовало Рт

У клеток С гетИагЛп при двухкомпонентном разложении кривая затухания флуоресценции в адаптированных к темноте контрольных клетках (0 ч) разлагается на 2 экспоненты с временами порядка 80 и 400 не с относительными амплитудами порядка 80 и 20%, соответственно В присутствии диурона, когда увеличивается > оличество (2в-невосстанавливающих центров (РЦ закрыты), Т] изменяется незначитетьно, в то время как т2 возрастает почти вдвое Соответственно, флуоресценция (ф[ + (р2) возрастает за счет медленной компоненты, главным образом из-за увеличения т2

Таблица 2 Изменения амплитуды (А) и времени (т) быстрой (Ль т|5) и медленной (А2, т2,) компонент кинетик затухания флуоресценции клеток С. гетЬагсИи при инкубации на

среде без серы

ф! и ф2 - вклад быстрой и медленной компонент во флуоресценцию, рассчитанный по формуле ф1 = А| • Т] и ф2= А2 • т2 соответственно <р0, <рт - относительный выход флуоресценции адаптированных к темноте клеток и клеток с закрытыми РЦ ФС2, соответственно_

Клетки, адашированные к темноте К тетки с закрытыми РЦ ФС2

Время, А,. A?, т? 9i ф2 (Ро Аь А„ ть т2 Ф1 ф2 <Рт

ч % % пс пс % % пс ПС

0 80 20 83 393 6972 7860 14832 75 25 95 781 7125 19525 26650

24 75 25 91 504 6825 12600 19425 73 27 94 844 6862 22788 29650

48 74 26 89 611 6586 15886 22472 70 30 96 836 6720 25080 31800

72 72 28 91 628 6552 17584 24136 71 29 98 840 6958 24360 31318

В адаптированных к темноте голодающих по сере клетках затухание фтуоресценции замедляется из-за накопления Qu-невосстанавливающих центров Как видно из табл 2, амплитуда (А) и характерное время (т) быстрой компоненты (Аь ti) изменялись от 84 до 75% и 83 до 91 пс, в первые 24 ч голодания и слабо изменялись в дальнейшем Относитетьный выход флуоресценции за счет быстрой компоненты при серном голодании (ф! = Aj'Xi) изменялся незначительно Некоторое увеличение x¡ свидетельствует об уменьшении вероятности захвата энергии центрами ФС2, что может быть обусчовлено большей восстановленностыо QA при серном голодании Следствием этого является снижение скорости первичного разделения зарядов Анализ медленной компоненты кинетики затухания фтуоресценции показал увеличение как А2 так и значительное увеличение т2, что также связано с накоплением QA" Вклад медленной компоненты (ф2 = А2*т2) во фл>оресценцию адаптированных к темноте клеток при голодании значительно возрастал в первую очередь в результате увеличения времени жизни (т2) В клетках с закрытыми РЦ ФС2 (табт 2) при серном голодании вклад медленной компоненты во флуоресценцию (ф2) также изменяется значительно сильнее по сравнению с вкладом быстрой компоненты (фО, и также в большей степени за счет увеличения времени жизни (т2)

Полученный из пико-наносекундной флуорометрии рост <ро и <рт при серном голодании согласуется с описанными выше данными по изменению параметров флуоресценции Fo и Fm, изученных другими методами (РАМ, PEA) Существенное увеличение Fo в ходе серного

голодания связано с тем, что часть цешров ФС2 поддерживается в закрытом состоянии Это может быть связано с восстановлением пула хинонов электронами из стромы через процесс хлородыхания (Melis et al, 2000) Мы также полагаем, что восстановление пула хинонов при голодании приводит к появлению дотгоживущих состояний QA\ а также протонированных QAH2 Протонированный хинон QH2, имея слабое сродство к месту связывания на белке D1, может покинуть его, что сопровождается необратимым ингибированием и повреждением ФС2 (Vass, Styring, 1992)

Увеличение Fm в голодающих по сере клетках позвотяет предположить, что при серном голодании отсутствует какой-то процесс, направленный на тушение флуоресценции в хлоропластах контрольных клеток Таким процессом, например, может быть диссипативный цикл вокруг ФС2 с участием цитЬ559 Этот цикл представляет собой обратный перенос электронов от восстановленных первичных акцепторов к окисленному пигменту РЦ Р680+ Восстановление низкопотенциальной формы цитЬ559 сопровождается переходом его в высокопотенциальную форму, которая может донировать электроны на Р680+ через промежуточный XJI Z (Barber, De Las Rivas, 1993, Poulson, Samson, 1995) Таким образом, функционирование диссипагивного цикла вокруг ФС2 может привести к повторному открытию центров ФС2 и, следовательно, к уменьшению истинной величины Fm Показано, что в присутствии восстановителей эффективность работы цикла понижается (Lazar et al, 2005) В голодающих по сере клетках существует избыток восстановителей (Zhang et al, 2002), который может поддерживать цитЬ559 в восстановленном состоянии Это может быть причиной замедления диссипативного цикла и, следовательно, увеличения Fm в >словиях серного голодания

Влияние отсутствия серы в среде на первичные процессы фотосинтеза культуры С reinhardtn в замкнутом биореакторе.

В замкнутом биореакторе при постоянном освещении голодающая по сере культура С reinhardtn проходит 5 последовательных фаз аэробную, стадию поглощения кислорода, анаэробиоз, выделение Н2 и стадию деградации клеток (Kosourov et al, 2002) В наших экспериментах (рис 7 А), фаза выделения кислорода длилась около 10 ч В это время в культиваторе содержание 02 повышалось за счет выделения его ФС2 Уменьшение скорости фотосинтеза и увеличение дыхания вследствие серного голодания является причиной снижения концентрации 02 в культиваторе и перехода культуры в анаэробиоз Скорость выделения 02, измеренная с помощью электрода Кларка, за первые 24 ч говддания по сере уменьшалась вдвое (с 185 до 91,8 мкмоль/мг хл ч) В то же время скорость дыхания увеличивалась с 34 до 60 мкмоль/мг хл ч Увеличение дыхания обусловлено, по-видимому, избытком субстрата Об этом

свидетечьствует увеличение скорости темнового восстановления Р700 (за первые 24 ч серного голодания полувремя увеличивалось с 8,2 до 0,4 с) Начало регистрируемого выделения Н2 было зафиксировано через 9 ч после установления анаэробных условий (рис 7 А) Общий объем выделившегося газа за 60 ч составлял около 200 мл/л (рис 7 А) Поскольку используемый нами в этом случае волюмомстрический метод не позволяет определять газ, растворенный в жидкости, можно полагать, что процесс выделения водорода начинался раньше Методом газовой хроматографии было показано, что к 80 ч серного голодания концентрация Н2 в газовом пространстве культиватора составляла около 6 ммол/л

Время, ч

Рис 7 Динамика содержания 02 светозависимого выделения Н2 (А) и изменения параметров флуоресценции П, Гт' и АР/Рт' (Б) голодающей по сере культуры С гапкагсИи в замкнутом культиваторе в течение различных фаз

Регистрация параметров флуоресценции Хл а методом РАМ при постоянном освещении непосредственно в культиваторе позвотяет выявить изменения активности ФС2 в клетках С геткагЛп на всех стадиях голодания, предшествующих выделению водорода, и на стадии его выделения Как видно из рис 7 Б, при переходе культуры в стадию поглощения кислорода, а затем и в анаэробиоз Р1 и Рт' возрастали

Увеличение Р! происходило быстрее, чем Рт', поэтому наблюдаемое уменьшение АР/Рт' происходит главным образом за счет роста Л Как отмечалось ранее, на фоне медленного снижения величины АР/Рт' наблюдается быстрое падение эюй величины в момент установления анаэробных условий, что свидетельствует о полной инактивации ФС2 (АЩа1 е1 а!, 2003) В наших экспериментах, мы также наблюдали быстрое (минуты) снижение величины АР/Рт' с 0,16 до нуля Через 9 ч после установления анаэробных условий

величина АР/Рт' и, следоватечьно, активность ФС2 начинали возрастать, что указывает на участие ФС2 в допировании электронов к ФС1 и далее через ферредоксин к гидрогеназе (фаза выделения Н2) При этом наблюдали постепенное снижение как Р1 так и Рт', что иногда объясняют частичной деградацией клеток (Коэоигоу е1 а1, 2005) Однако в наших

Время, мс 1000 2000

экспериментах концентрация хлорофилла в течение всего эксперимента практически не изменялась Проведенная нами микроскопия голодающих по сере клеток С reinhardtu с помощью флуоресцентного микроскопа показала, что до 70 ч все клетки культуры остаются живыми Количество флуоресцирующих клеток снижается на 10% только к 120 ч голодания

Нарушения активности ФС2 в фазе поглощения кислорода и небольшое ее восстановление в фазе выделения Н2 подтверждает анализ кинетических кривых индукции флуоресценции клеток С reinhardtu, отобранных анаэробно из культиватора на разных стадиях голодания В кинетике нарастания флуоресценции как правило, выделяют несколько компонент Начальная, быстрая компонента (Fo-Fi) обусловлена наличием в ФС2 QB-невосстанавливающих центров, медленная (Fi-Fp) - Qg-восстанавчивающих Максимальный уровень флуоресценции (Fp) определяется восстановтепностью пула хинонов, снижение Fp связывают с окислением пула хинонов ФС1 и начинающимся развитием нефотохимического тушения (Lazar et al, 1999)

1000 2000 Время, мс

Рис 8 Кинетики световой индукции ФХ суспензии клеток С reinhardtu отобранных из культиватора

А - контроль, Б - 18 ч серного голодания (фаза поглощения кислорода), В - 32 ч серного Как ВИД"° из Рис 8 Б' чеРез 18 4 сеРН0Г0 голодания (анаэробные условия), Г - 62 ч голодания значительно увеличивалась доля серного голодания (фаза выделения водорода)

Индукционные кривые измеряли после 2 мин <2в-невосстанавливагащих центров по адаптации клеток к темноте Черной и серой сравнению с контролем У голодающей стрелкой обозначены включения зондирующего

и насыщающего фотосинтез света, кучьтуры пока еще, наблюдается снижение соответственно максимального уровня флуоресценции за

счет начинающегося нефотохимического тушения Время перехода от уровня Fi к Fp кривой флуоресценции определяется скоростью восстановления пластохинонового пула (Krause, Weis, 1991) Оно уменьшалось через 18 ч серного голодания от 1300 до 890 мс (рис 8 А, Б), поскольку пул хинонов у голодающих клеток ботее восстановлен В анаэробной фазе (рис 8 В) кривая индукции флуоресценции имела только быструю компоненту, так как к этому времени

все центры становятся С?в-невосстанавливающи-ми Отсутствие снижения уровня Рр указывает, что к этому времени нефотохимическое тушение отсутствует В фазе выделения водорода (рис 8 Г), в отличие от предыдущей фазы, мы наблюдали переход р1-рр, который указывает на появление (^-восстанавливающих центров Это так же как и увеличение параметра ДР/йя' при выделении водорода, является результатом оттока электронов от ФС2 при включении гидрогеназной реакции

Исследование флуоресценции ХЛ а у голодающей по сере культуры С геткагЛи в замкнутом биореакторе в пико-наносекундном временном диапазоне Для выяснения природы процессов и понимания механизмов приводящих к быстрому падению ДРУРт' у голодающих по сере клеток С геткагАп при переходе в анаэробиоз нами были изучены изменения кинетики затухания флуоресценции, индуцированные пикосекундными лазерными импульсами На рис 9 А приведена часть кривои (полученной методом РАМ), аналогичной той, которая описана на рис 7 Б и захватывающая фазы от поглощения 02 до выделения Н2 По техническим причинам в данном эксперименте в отличие от рис 7 Б измерения проводились через час, положение «быстрого скачка» точно не определено Однако видно, что имеет место падение ДР/Р/я', а загем его увеличение, совпадающее с началом выделения Н2 (30-46 ч)

На образцах, взятых анаэробно из культиватора, после 2 мин адаптации к темноте были исследованы кинетики затухания флуоресценции в пико-наносекундном диапазоне Как видно из рис 9 Б, относитечьный выход флуоресценции быстрой компоненты (ф] = А^т^ при ереходе в анаэробиоз (24-29 ч) незначительно увеличивался Увеличение ф] обусловлено величением времени жизни быстрой компоненты Т] (от 79 пс - 24 ч до 140 пс - 29 ч) Это видетельствует об уменьшении вероятности захвата энергии центрами ФС2, что, возможно, бусловлено большей восстановленностью (За при серном голодании При переходе из наэробной фазы (29 ч) в фазу выделения Н2 (30-46 ч) величина ф! изменялась незначительно

Относительный выход фтуоресценции медленной компоненты (ф2 = А2*х2) при переходе в наэробиоз значительно возрастал Анализ кинетики медленной компоненты затухания луоресценции показал увеличение как А2 (от 32% - 24 ч до 40% - 29 ч) так и значительное величение т2 (от 496 пс - 24 ч до 615 пс- 29 ч) Обращает на себя внимание тот факт, что адение параметра ДР/Рт' (рис 9 А) и возрастание ф2 совпадают по времени

Рис 9. Изменение параметров флуоресценции голодающей по сере культуры С геткагёШ на

стадии поглощения О2 и выделения Н2, измеренные методом РАМ (А) и с помощью пико-наносекундной флуорометрии (Б)

Кроме того, кривая, отражающая изменения <р2, фактически повторяет кривую отражающую изменения Л во времени Оба эти параметра отражают состояние пула хинонов Таким образом, быстрое функциональное снижение фотохимической активности ФС2 сопровождается возрастанием вклада флуоресценции за счет медленной компоненты Включение гидрогеназы, о чем свидетельствует увеличение ДР/У/я', также отразилось на величине ц>2, вклад которой в фазе выделения водорода падает в результате уменьшения времени жизни т2 (от 615 пс -29 ч до 537 пс- 46 ч)

Влияние активности ФС2 на выделение водорода на примере мутантов С геткагЛп с нарушениями в Ш-белке

Использование мутантов С гетИагсЗш с нарушениями донорной стороны ФС2 дает возможность подойти к изучению влияния активности ФС2 на выход Н2 без применения ингибиторов, действие которых как правило неспецифично Были использованы мутанты водоросли С гетИагЛа, обладающие различной кислород-выделяющей активностью (Макарова и др , 2006) вследствие замещения аргинина на Г)1 белке в положении 323 (11323) на гистидин (Н), аспартат (Б) или глутамат (Е) Поскольку аргинин 323 локализован на люменальном участке Е-субъединицы 01-белка, принимает участие в обеспечении взаимодействия марганцевого кластера КВК с реакционным центром (Ке, 2001), его замена нарушает донирование электронов от воды Как видно из табл 3, нарушения в функционировании ФС2 у мутантов проявляются в снижении эффективности преобразования

энергии, что видно по уменьшению величины отношения Fv/^гm Скорость выделения 02 у мутантов по сравнению с контролем (р^Т) снижалась у Ю23Н на 40%, Ю230 на 50% и у Ю23Е на 80%

Таблица 3. Характеристики культуры мутантов С гешИапкн до удаления серы.

Объект рШТ Ю23Н Л3230 ГШЗЕ

/ч'/Рот, отн ед 0 74+ 0 02 0 55 ±0 09 0 34 ± 0 07 0 14 ± 0 10

02, мкмоль (мг*Хл)1 ч 148±21 92+18 74±15 30+15

Для проведения опытов по выделению водорода культуры дикого гипа и мутантов были отмыты от серы и помещены в замкнутый культиватор Вследствие низкой кислород-выделяющей активности, все виды мутантов бочее быстро переходили в анаэробное состояние по сравненшо с диким типом (табл 4) Однако, у мутантов 11323 (Н, Б) наблюдалось более позднее начало выдечения и более низкий общий выход водорода Культура мутанта Я323Е характеризующегося самой низкой кислород-выделяющей активностью, переходила в анаэробное состояние в течение 6 ч, но не была способна к образованию Н2

Таблица 4 Характеристики культуры мутантов С тетНагйШ в замкнутом культиваторе

на среде без серы

Объект р\УТ Ю23Н Ю230 Ю23Е

Переход в анаэробное состояние, ч 35+3 25+4 12±2 6±2

Начало выделения Н2, ч 40+3 47±4 60±5 -

Выделено Н2, мл/л 55±10 20+3 10+2 0

Таким образом, несмотря на то, что время перехода в анаэробиоз значительно сокращалось, выход Н2 уменьшался Полученные данные подтверждают, что для светозависимого выделения водорода клеткам изначально (до удаления серы) необходима функционально активная ФС2

Влияние добавлении серы на параметры флуоресценции и выделение Н2 голодающей

культурой С. тетЬатйШ в замкнутом биореакторе Поскольку выделение Н2 связано с активностью ФС2 (Ап1а1 е! а1, 2003), можно было предположить, что добавление небольшого количества серы в фазе выделения Н2 позволит частично реактивировать ФС2 за счет ресинтеза белка (Ковоигоу е1 а!, 2005) и тем самым

увеличить выход Н2 Серу (до конечной концентрации 1 и 5 мкМ в культиваторе)

добавляли после 45 ч серного голодания в фазе выделения Н2 Параметры флуоресценции измеряли методом РАМ непосредственно в культиваторе при постоянном освещении

Как видно из рис 10, в контрольном культиваторе (А) к моменту выделения Н2 величина ДР/Рт' незначительно возрастала в результате включения гидрогеназной реакции В опытном культиваторе (Б) после добавления серы (5 мкМ MgS04 - конечная концентрация) величина АР/Рт' существенно увеличивалась, что свидетельствует о восстановлении активности ФС2 Через 10 ч мы наблюдали падение фотохимической активности ФС2, что скорее всего, связано с потреблением добавленной серы

05 04

.5 0 3 £

^ 02

01 00

Время, ч 50 55

• А

1.1. ¿Р/Рт'

/Л

1 лР/Рт' 1

I ^

50 55 Время, ч

05 04 03* 02 51 01 00

Рис 10 Действие добавления серы в фазе выделения Н2 на параметры флуоресценции голодающей культуры С тетЬагШп

Стрелкой обозначено добавление 90 мкл дистиллированной воды в контрольную культуру (А) и столько же MgS04 до конечной концен фации 5 мкМ в опытную культуру (Б)

Изучение световой индукции флуоресценции показало, что через 8 ч после добавления серы, индукционная кривая становилась похожей на таковую в аэробной фазе (рис 8 Б) Через 18 ч после добавления серы, когда фотохимическая активность ФС2 значительно снижалась, индукционная кривая становилась похожей на таковую в анаэробной фазе (рис 8 В) Видимо, добавленный сульфат к этому времени был полностью израсходован и в культиваторе восстанавливался анаэробиоз

Несмотря на то, что добавление серы позволило возобновить электронный поток от ФС2, количество вылеченного Н2, измеренного волюмометрическим методом, бычо меньше почти на 30%, чем в контроле Уменьшение количества добавленного сульфата магния в 5 раз не приводило к изменению АР/Ртоднако количество выделенного Н2 по сравнению с контролем снижалось в меньшей степени Таким образом, добавление серы на стадии выделения Н2

частично возобновляет электронный поток от ФС2, но не приводит к увеличению выхода Н2 Так как анализатор растворенного в среде 02 в обоих случаях не показал изменения его содержания в культиваторе, можно предполагать, что выделяющегося 02 достаточно для инактивации гидрогеназы внутри клетки, но он сразу же расходуется при дыхании, а не выделяется в среду

Заключение

Полученные результаты показывают, что при голодании культуры С reinhardtu по сере происходит существенное нарушение активности ППФ, хотя содержание XJI и количество клеток в суспензии практически не изменяется Феноменологическая схема организации ППФ в контрольных и голодающих клетках приведена на рис 11 При голодании имеет место перераспределение между путями диссипации поглощенной световой энергии

Фотохимическое тушение уменьшается вследствие нарушения электронного транспорта, вызванного повреждением части РЦ как с акцепторной (появление Qb -невосстанавливаюгцих центров), так и с донорной стороны, на что указывает появление К-пика и замедление темновой релаксации флуоресценции Пул хинонов перевосстановлен в результате увеличения фонда альтернативных восстановителей и снижения скорости восстановления С02 (Zhang et al, 2002) Кроме того, в культиваторе при наступлении анаэробиоза инактивируется альтернативная оксидаза

Снижение эффективности электронного транспорта сопровождается снижением NPQ, главным образом за счет ДрН-зависимой компоненты qE и нарушения работы виолаксантинового цикла Эти данные указывают на нарушение процессов тепловой диссипации энергии Излучательная диссипация, напротив повышается, о чем говорит увеличение выхода флуоресценции в расчете на единицу ХЛ, что показано нами впервые При одинаковой амплитуде спектров абсорбции света суспензиями клеток выход флуоресценции в голодающих клетках превышал выход флуоресценции в контроле в 2 и ботее раза, несмотря на то, что ФСА находтся в состоянии 2 с низкой флуоресценцией

Увеличение Fo обычно связывают с нарушением структуры ПБК - отсоединением низкомотекулярной антенны (Briantais et al, 1996), однако этим нельзя объяснить увеличение Fm Наблюдаемое нами увеличение содержания каротиноидов в голодающих клетках хотя и может несколько увеличить сечение поглощения, однако этого недостаточно, чтобы объяснить увеличение выхода флуоресценции более чем вдвое Это заставляет предполагать, что при голодании нарушается какой-то процесс, снижающий флуоресценцию в контроле Таким процессом может быть диссипативный цикл с участием цит Ь559 Косвенные данные указывают, что в голодающих клетках создаются восстановительные условия, которые снижают

скорость функционирования этого цикла, конечно в дальнейшем необходимо получение прямых доказательств Данные пико-нанасекундной флуорометрии показывают, что флуоресценция увеличивается, главным образом, за счет вклада медленных рекомбинационных компонент Мы полагаем, что восстановление пула хинонов при голодании приводит к появлению долгоживущих состояний Qa\ а также протонированных QAH2 Протонированный хинон QH2, имея слабое сродство к (3А-связывающему сайту D2 белка реакционного центра ФС2, может покинуть его, что сопровождается необратимым ингибированием и повреждением ФС2 (Vass, Styring, 1992)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения функциональной активности ФС2 и редокс состояния переносчиков электронов играют ключевую роль в переключении фаз, предшествующих фотообразованию и в фазе образования Н2 в голодающих по сере клетках Так, в аэробной стадии происходит снижение активности ФС2, а поскольку скорость дыхания возрастает, культура переходит в анаэробиоз Затем наблюдается быстрая (в течение минут) обратимая инактивация ФС2, обусловленная увеличением доли QB-невосстанавливающих центров ФС2 Активация гидрогеназы в анаэробных условиях увеличивает отток электронов из фотосинтетической ЭТЦ (Appel, Schulz, 1998, Цыганков, 2007), что приводит к реактивации части центров ФС2 Роль ФС2 в процессе фотообразования Н2 не ограничивается только непосредственным допированием электронов через ЭТЦ фотосинтеза для гидрогеназной реакции Ее функционирование поддерживает линейный электронный транспорт, который обеспечивает восстановление пиридиннуклеотидов, фиксацию С02, накопление крахмала и других метаболитов, входящих в пул альтернативных восстановителей Наличие такого пула, способного поставлять электроны через пул хинонов и цитохромный комплекс на ФС1, видимо, не является достаточным условием для светозависимого выделения Н2 у С remhardtu, что подтверждено в экспериментах с Мутантами Возможно, что активирование ФС2 в фазе выделения Н2 существенно снижает циклический электронный транспорт вокруг ФС1, конкурирующий с гидрогеназной реакцией за электроны Это предположение согласуется с данными по повышенной скорости выделения Н2 мутантом С remhardtu с нарушенным циклическим транспортом вокруг ФС1 (Kruse et al, 20056)

С02Ч=аНАДФН(

Н20

Фл 0->

-8

Альтернативные восстановители

1>С2

о ^

Рис 11. Схема организации первичных процессов фотосинтеза в мембранах тилакоидов контрольной (+8) и голодающей по сере (-в) культуры зеленой микроводоросли С геткагЛп.

Пунктирным кольцом обозначен возможный циклический поток электронов Обозначения ПХ - пул хинонов, цнт Ь,// - цитохромный Ьг// комплекс, Фд - ферредоксин, ФНР -ферредоксин-НАДФ+-оксидоредуктаза, Гг - гидрогеназа,

Выводы

1 Изучение флуоресценции хлорофилла в разных временных диапазонах позволило показать увеличение выхода флуоресценции при серном голодании клеток С гетИагЛи Серное голодание приводит к образованию закрытых центров ФС2 в результате появления долгоживущих состояний Од' Изучение кинетики затухания флуоресценции ХЛ а свидетельствует о том, что увеличение выхода флуоресценции связано не с изменениями взаимоотношений антенна-реакционный центр, а является следствием нарушения электротранспортных процессов

2 Анализ кинетик индукции и затухания флуоресценции хлорофилла показал, что у голодающих по сере клеток С геткагЛи увеличивается содержание С)в-невостанавливающих центров, а также имеет место нарушение ЭГЦ на донорной стороне ФС2

3 У голодающих по сере клеток С геткагЖп значительно нарушаются процессы тепловой диссипации энергии, в частности обнаружено снижение компонента qE нефотохимического тушения и нарушение функционирования виолаксантинового цикла

4 Показано, что голодающая по сере культура С геткагёШ в замкнутом культиваторе переходит в анаэробиоз в результате не только снижения скорости фотосинтеза, но и увеличения скорости дыхания

5 Быстрая инактивация ФС2 в замкнутом культиваторе при переходе в анаэробиоз сопровождается ростом Л, отражающей восстановленность пластохиноиового пула Как показано методом пико-наносекундной флуорометрии, это связано с увеличением вклада рекомбинационной компоненты (<р2) флуоресценции

6 При культивировании в замкнутом культиваторе мутантов С гетИагЛи (01 - 11323), характеризующихся пониженной скоростью выделения кислорода, показано, что время перехода в анаэробиоз уменьшается, однако, выделение водорода наступает значительно позднее и его выход уменьшается Таким образом, для светозависимого выделения водорода клеткам необходима функционально активная ФС2

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1 Волгушева А А Фотохимическая активность фотосистемы 2 голодающих по сере микроводорослей Chlamydomonas rewhardtu в связи с выделением фотоводорода Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004» M МАКС Пресс 2004 С 24-25

2 Макарова В В , Косоуров С H , Ghiraidi M , Seibert M , Волгушева А А , Кукарских Г П , Кренделева Т Е Фотовыделение водорода клетками мутантов Chlamydomonas remhardtu (D1-R323H, D, Е) с разной активностью фотосистемы 2 // Сборник статей международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" Минск Беларусь 2004 Часть 1 С 66-68

3 Вочгушева А А Влияние серного голодания на активность ФС2 в микроводоросли Chlamydomonas remhardtu Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» M МАКС Пресс 2005 С 51

4 Волгушева А А. Антал Т К, Тусов В Ь Серное голодание вызывает увеличение квантового выхода флуоресценции хлорофилла в Chlamydomonas remhardtu XVIII Пущинские чтения по фотосинтезу и Всероссийская конференция «Преобразование энергии света при фотосинтезе» M НИА - Природа 2005 С 75-77

5 Загидуллин В Э, Волгушева А А Пико-наносекундная флуорометрия процессов преобразования энергии света в ФС2 Chlamydomonas remhardtu в условиях серного голодания Тезисы докладов XIII международной конференции студентов, аспирантов и мочодых ученых «Ломоносов-2006» M МАКС Пресс 2006 С 92-93

6 Антал Т К, Волгушева А А, Кукарских Г П , Кренделева Т Е , Тусов В Б , Рубин А Б Исследование изменений параметров флуоресценции хлорофилла в клетках Chlamydomonas remhardtu в условиях серного голодания // Биофизика 2006 Т 51 Вып 2 С 292-298

7 Antal Т К , Volgusheva А А , Kukarskih G Р , Bulychev А А , Krendeleva Т Е and Rubm А В Effects of sulfur limitation on photosystem II functioning in Chlamydomonas reinhardtu as probed by chlorophyll a fluorescence //Physiologia Plantarum 2006 V 128 P 360-367

8 Zagidullin V E, Volgusheva A A , Antal T К , Korvatovsky В N , Krendeleva T E, Paschenko V 7 , Rubin А В Influence of the sulfur deprivation on the chlorophyll fluorescence kinetics properties of the Chlamydomonas remhardtu cells // International Meeting «Photosynthesis in the Post-Genomic Егэ Structure and Function of Photosystems» M NI A-Nature 2006 P 221

Заказ № 446 Объем 1 п л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г. Москва, ул Палнха-2а, те т. 250-92-06 \vww.postator ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Волгушева, Алена Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Структурно-функциональная организация фотосинтетического ппарата.

1.2. Применение флуоресцентных методов для изучения фотосинтетических реакций у растительных организмов.

1.3. Фотоиндуцированное выделение водорода микроводорослями.

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объект исследования.

2.2. Условия культивирования микроводорослей.

2.3. Отмывание культуры от серы.

2.4. РАМ-флуорометрия.

2.5. РЕА-флуорометрия.

2.6. Лазерная пико-наносекундная флуорометрия.

2.7. Спектральный анализ.

2.8. Регистрация окислительно-восстановительных изменений пигмента РЦ ФС1 (Р700).

2.9. Определение содержания хлорофилла и клеток в суспензии микроводорослей.

2.10. Определение каротиноидов.

2.11. Определение белка.

2.12. Определение крахмала.

2.13. Измерение скорости выделения кислорода и дыхания.

2.14. Газовая хроматография.

2.15. Цитологический анализ.

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Влияние серного голодания на первичные процессы у С. reinhardtii фотосинтеза в аэробных условиях

3.1.1. Характеристика культуры.

3.1.2. Исследование состояния фотосинтетического аппарата с использованием модулированной флуорометрии (РАМ).

3.1.3. Нефотохимическое тушение флуоресценции.

3.1.4. Обратимые переходы светособирающих комплексов между ФС2 и ФС1.

3.1.5. Индукционные кривые флуоресценции при высокой освещенности.

3.1.6. Пико-наносекундная флуорометрия процессов преобразования энергии света в ФС2 в голодающей по сере культуре С. reinhardtii.

3.2. Влияние отсутствия серы в среде на первичные процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное выделение Н2 культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе.

3.2.1. Исследование флуоресценции XJI а у голодающей по сере культуры С. reinhardtii в замкнутом биореакторе в пико-наносекундном временном диапазоне.

3.3. Влияние активности ФС2 на выделение водорода на примере мутантов С. reinhardtii с нарушениями в D1-белке.

3.4. Влияние добавления серы на параметры флуоресценции и выделение Н2 голодающей культурой С. reinhardtii в замкнутом биореакторе.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii"

В настоящее время в связи с уменьшением мировых запасов естественных энергоресурсов большое значение приобретают поиски замены их искусственными. В качестве наиболее перспективного экологически чистого топлива можно рассматривать водород (Н2), единственным продуктом горения которого является вода, и который может использоваться в топливных элементах. Но остается проблема его дешевого производства в достаточных количествах, хранения и транспортировки (см. обзоры Melis, Норре, 2004; Kruse et al., 2005а).

Известны несколько путей получения Н2. Так например, в современной промышленности Н2 получают паровой конверсией метана, каталитической конверсией углеводородов и электролизом воды. Но наиболее перспективным и технологически чистым является получение Н2 биологическим путем. Этот метод основан на использовании субклеточных биологических структур, либо на применении биологических систем (микроводоросли, фототропные бактерии). Микроводоросли легко культивируются, быстро увеличивают массу, за 24 ч их концентрация увеличивается вдвое (Ben-Amotz, Avron, 1990). Наибольший интерес представляют фотосинтезирующие зеленые и сине-зеленые микроводоросли. Гаффрон и Рубин более 60 лет назад показали, что микроводоросль Scenedesmus obliquus способна к светозависимому выделению Н2, однако для индукции этого процесса требуются анаэробные условия, которые создавались после периода темновой адаптации (Gaffron, Rubin, 1942). Позднее было найдено, что к этому процессу способны многие, но далеко не все фототрофные организмы. Так, фотообразования Н2 никогда не наблюдали у нитчатых водорослей или содержащих гидрогеназу (фермент катализирующий образование Н2) одноклеточных водорослей таких как Porphyridium, Euglena и Dunaliella (см. обзор Boichenco et al., 2004).

В настоящее время показано, что способность зеленых микроводорослей (Chlamydomonas, Chlorella, Scenedesmus) к фотоиндуцированному выделению Н2 связана с активностью гидрогеназ, синтезирующих Н2 с использованием протонов и электронов. Это большая группа ферментов, катализирующих реакцию обратимой активации молекул водорода, отличающаяся большим структурным и функциональным разнообразием (см. обзор Цыганков, 2007). В клетках зеленых водорослей содержатся гидрогеназы, содержащие ионы железа в активном центре.

Фотоиндуцированное выделение Нг тесно связано с первичными процессами фотосинтеза, поскольку непосредственным донором электронов для гидрогеназной реакции у зеленых водорослей является ферредоксин, восстановленный фотосинтетической электронтранспортной цепыо (ЭТЦ). Сочетание фотосинтетического фотолиза Н2О и гидрогеназной реакции позволяет микроводорослям синтезировать Нг с использованием неисчерпаемых природных ресурсов - солнечного света и воды (см. обзор Цыганков, 2007). Fe-содержащие гидрогеназы чрезвычайно чувствительны к кислороду, присутствие даже следов которого приводит к ингибированию как каталитической активности фермента (Ghirardi et al., 1997; 2000) так и подавлению экспрессии ее генов (Нарре, Kaminski, 2002), что приходится учитывать при разработке технологических приемов.

При росте клеток в темновых анаэробных условиях основным типом питания микроводорослей является брожение за счет разложения накопленных полимеров, в частности крахмала (хемогетеротрофное анаэробное питание). Известно, что при росте в этих условиях происходит индукция синтеза и активация гидрогеназы. Освещение таких клеток приводит к быстрому накоплению восстановительных эквивалентов за счет функционирования фотосинтетической ЭТЦ. Однако, фиксация углекислоты, требующая большого количества восстановителей и АТФ, начинается не сразу. Поэтому в первый момент (до нескольких минут) после начала освещения может происходить накопление избытка восстановительных эквивалентов внутри клеток, что в ряде случаев разрушительно для клеток. В этот переходный период сброс избытка восстановителя путем образования водорода с помощью активной гидрогеназы позволяет поддерживать концентрацию восстановителей на не токсичном для микроводоросли уровне. Образование Н2 играет важную физиологическую роль, поскольку снижает избыток восстановителя, образующегося в клетках микроводорослей в анаэробных условиях и таким образом защищает клетку от фотоингибирования (см обзоры Melis, Нарре, 2001; Нарре et al., 2002). Когда метаболизм клеток перестраивается с анаэробного хемогетеротрофного типа питания на фотоавтотрофный, накопление в среде кислорода, инактивирующего гидрогеназу, приводит к выключению процесса фотообразования водорода. Таким образом, возникает проблема разделения стадий активного фотосинтеза (аэробной) и образования Н2 (анаэробной). Эта проблема была решена при культивировании зеленых водорослей (С. reinhardtii) на постоянном свету в замкнутом культиваторе в условиях голодания по сере (Ghirardi et al., 2000, Melis et al., 2000).

Сера - один из обязательных элементов, имеющих высокую физиологическую значимость для развития живых организмов. Она необходима для синтеза многих белков, а также вторичных метаболитов, таких как, например, сульфолипиды, входящие в состав мембран тилакоидов. В ее отсутствие прекращается деление клеток С. reinhardtii, разрушаются некоторые энзимы и полипептиды, нарушается эффективность использования поглощенной световой энергии в процессе фотосинтза (см. обзор Esper et al., 2006). В ее отсутствие резко снижается содержание белка Рубиско, который является ключевым ферментом в цикле Кальвина (Zang et al., 2002), наблюдается деградация D1 белка ФС2 и основного гетеродимера ФС1, снижение содержания цитохрома / (Melis et al., 2000). Кроме того, серное голодание, как и любые стрессовые воздействия, нарушает определенный баланс между процессами поглощения и утилизации световой энергии, что приводит к перевосстановлению электрон-транспортной цепи и развитию в ФС2 фотодеструктивных процессов разной степени в зависимости от интенсивности света и эффективности функционирования фотозащитных процессов, регулирующих поглощение света и тепловую диссипацию энергии в ФС2 (Antal et al., 2003; см обзоры Finazzi, 2005; Kruse et al., 2005a).

При выращивании С. reinhardtii в замкнутом культиваторе в условиях серного голодания аэробные условия самопроизвольно сменяются анаэробными. Это обусловлено, главным образом, падением скорости фотоокисления воды и, соответственно, образования 02, в результате постепенной инактивации ФС2, которая происходит в результате развития деструктивных процессов, а также снижения скорости ресинтеза белка D1

Wykoff et al., 1998). Когда скорость образования кислорода становится ниже скорости дыхания, культура переходит в анаэробные условия что приводит к экспрессии генов, ответственных за синтез гидрогеназы (Zang et al., 2002).

Включение гидрогеназной реакции приводит к увеличению оттока части электронов из фотосинтетической ЭТЦ, что снижает степень восстановленности пула хинонов и реактивирует часть центров ФС2 (Антал и др., 2001). В экспериментах с ингибиторами было показано, что добавление диурона, блокирующего электронный транспорт между первичными хинонными акцепторами QA и QB, снижает скорость выделения водорода на 80% (Ghirardi et al., 2000; Antal et al., 2003). Таким образом было показано, что и в анаэробных условиях ФС2 сохраняет некоторую активность и донирует электроны в фотосинтетическую цепь и далее на ферредоксин и гидрогеназу, участвуя таким образом в фотообразовании Н2. Остальные 20% электронов поступают, скорее всего, от продуктов цикла брожения, в частности от крахмала (Posewitz et al., 2004), который накапливается в большом количестве в голодающих по сере клетках в начале аэробной фазы. Для накопления крахмала ФС2 также важна, так как линейный поток электронов через обе фотосистемы необходим для обеспечения восстановительными эквивалентами темновых реакций фотосинтеза (Fouchard et al., 2005). Таким образом, ФС2 участвует на всех этапах роста культуры микроводорослей в условиях серного голодания -аэробной фазе, анаэробной и фазе выделения Н2.

Несмотря на то, что изучение механизмов процесса выделения Н2 на свету и поиск возможностей управлять им приобретают все больший интерес в последние годы, и были достигнуты значительные успехи в изучении разных аспектов этого процесса (см. обзоры Biochenko et al., 2004; Цыганков, 2007), в понимании молекулярных механизмов и принципов регуляции еще много белых пятен. Исследование функции ФС2 при серном голодании может обеспечить дополнительные сведения об изменениях механизмов первичных процессов фотосинтеза и роли ФС2 в регулировании выделения Н2.

Прежде чем изучать процессы, происходящие в клетках в культиваторе, надо понять, что происходит с голодающей по сере культурой в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна. Одним из источников информации о функциональном состоянии первичных процессов фотосинтеза (ППФ) и активности ФС2 в частности, является флуоресценция хлорофилла а (ФХ), которая может характеризовать первичные процессы фотосинтеза, протекающие в диапазоне от пикосекунд до минут (Karapetyan et al., 1990; Krause, Weiss,

1991; Strasser, Strasser, 1995; Shatz et al., 1998; Lazar, 2006).

Цели и задачи работы. Цель настоящей диссертационной работы состояла в исследовании влияния серного голодания на функциональную организацию первичных процессов фотосинтеза и изучение роли ФС2 в процессах, ведущих к фотообразованию Н2 клетками С. reinhardtii.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• Изучить особенности первичных процессов фотосинтеза у голодающей по сере микроводоросли С. reinhardtii в аэробных условиях, когда гидрогеназа неактивна.

• Провести анализ первичных процессов фотосинтеза культуры С. reinhardtii в замкнутом культиваторе на всех стадиях, предшествующих выделению водорода (аэробную, переход в анаэробиоз, анаэробную), и на стадии выделения водорода.

• Используя сайт-специфичные мутанты С. reinhardtii D1-R323, исследовать влияние приводящих к уменьшению кислород-выделяющей активности повреждений ЭТЦ на донорной стороне ФС2 на светозависимое выделение Н2 в культиваторе.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Волгушева, Алена Александровна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Полученные результаты показывают, что при голодании культуры С. reinhardtii по сере происходит существенное нарушение активности первичных процессов фотосинтеза, хотя содержание хлорофилла и количество клеток в суспензии практически не изменяется. Феноменологическая схема организации первичных процессов фотосинтеза в контрольных и голодающих клетках приведена на рисунке 22. При серном голодании (-S) имеет место перераспределение между путями диссипации поглощенной световой энергии.

Фотохимическое тушение уменьшается вследствие нарушения электронного транспорта, вызванного повреждением части РЦ как с акцепторной (появление Qb -невосстанавливающих центров), так и с донорной стороны, на что указывает появление К-пика и замедление темповой релаксации флуоресценции. Пул хинонов перевосстановлен в результате увеличения фонда альтернативных восстановителей и снижения скорости восстановления С02 (Zhang et al., 2002). Кроме того, в культиваторе при наступлении анаэробиоза инактивируется альтернативная оксидаза.

Снижение эффективности электронного транспорта сопровождается снижением NPQ, главным образом за счет АрН-зависимой компоненты qE и нарушения работы виолаксантинового цикла. Эти данные указывают на нарушение процессов тепловой диссипации энергии. Одной из возможных причин снижения qE в присутсвии зеаксантина может быть дисфункция комплекса типа зеаксантин-PsbS, который инициирует тушение флуоресценции в клетках высших растений (Niyogi et al., 2004). Излучательная диссипация, напротив повышается, о чем говорит увеличение выхода флуоресценции в расчете на единицу хлорофилла, что показано нами впервые. При одинаковой амплитуде спектров абсорбции света суспензиями клеток выход флуоресценции в голодающих клетках превышал выход флуоресценции в контроле в два и более раза, несмотря на то, что ФСА находится в состоянии 2 с низкой флуоресценцией. Нарушение перехода ССК между фотосистемами может быть связано с увеличением фракции [3-центров ФС2 у которых отсутсвует переферическая антенна.

Установить единую причину выхода флуоресценции не удалось. Мы полагаем, что увеличение выхода флуоресценции может быть связано со значительными изменениями процессов протекающими как в антенне так и в РЦ ФС2. Увеличение Fo обычно связывают с нарушением структуры ПБК -отсоединением низкомолекулярной антенны (Briantais et al., 1996), однако этим нельзя объяснить увеличение Fm. Наблюдаемое нами увеличение содержания каротиноидов в голодающих клетках хотя и может несколько увеличить сечение поглощения, однако этого недостаточно, чтобы объяснить увеличение выхода флуоресценции более чем вдвое. Это заставляет предполагать, что при голодании нарушается какой-то процесс, снижающий флуоресценцию в контроле. Таким процессом может быть диссипативный цикл с участием цит. Ь559. Косвенные данные указывают, что в голодающих клетках создаются восстановительные условия, которые снижают скорость функционирования этого цикла, конечно в дальнейшем необходимо получение прямых доказательств. Данные пико-нанасекундной флуорометрии показывают, что флуоресценция увеличивается, главным образом, за счет вклада медленных рекомбинационных компонент. Мы полагаем, что восстановление пула хинонов при голодании приводит к появлению долгоживущих состояний Qa", а также протонированных QaH2. Протонированный хинон QH2, имея слабое сродство к qa-связывающему сайту D2 белка реакционного центра ФС2, может покинуть его, что сопровождается необратимым ингибированием и повреждением ФС2 (Vass, Styring, 1992).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что изменения функциональной активности ФС2 и редокс состояния переносчиков электронов играют ключевую роль в переключении фаз, предшествующих фотообразованию и в фазе образования водорода в голодающих по сере клетках. Так, в аэробной стадии происходит снижение активности ФС2, а поскольку скорость дыхания возрастает, культура переходит в анаэробиоз. Затем наблюдается быстрая (в течение минут) обратимая инактивация ФС2, обусловленная увеличением доли СЬ-невосстанавливающих центров ФС2. Активация гидрогеназы в анаэробных условиях увеличивает отток электронов из фотосинтетической ЭТЦ (Appel, Schulz, 1998; см. обзор Цыганков, 2007), что приводит к реактивации части центров ФС2. Роль ФС2 в процессе фотообразования Н2 не ограничивается только непосредственным донированием электронов через ЭТЦ фотосинтеза для гидрогеназной реакции. Ее функционирование поддерживает линейный электронный транспорт, который обеспечивает восстановление пиридиннуклеотидов (основной резервуар электронов в клетке), процессы фиксации С02, накопление крахмала и других темновых метаболитов, входящих в пул альтернативных восстановителей. Восстановители могут образовываться и без участия ФС2 за счет темнового метаболизма. Однако наличие такого пула, способного поставлять электроны через пул хинонов и цитохромный комплекс на ФС1, видимо, не является достаточным условием для светозависимого выделения Н2 у С. reinhardtii, что подтверждено в экспериментах с мутантами. Возможно, что активирование ФС2 в фазе выделения Н2 существенно снижает циклический электронный транспорт вокруг ФС1, конкурирующий с гидрогеназной реакцией за электроны. Это предположение согласуется с данными по повышенной скорости выделения Н2 мутантом С. reinhardtii с нарушенным циклическим транспортом вокруг ФС1 (Kruse et al., 20056). s

С02*-надфн

НАДФ+

Лль т ерна тивны е в о с с т ановпт е ли

Н,0

Альтернативные в о с с т ановпт ели

Рис. 22. Схема организации первичных процессов фотосинтеза в мембранах тилакоидов контрольной (+S) и голодающей по сере (-S) культуры зеленой микроводоросли С. reinhardtii.

Пунктирным кольцом обозначен возможный циклический поток электронов. Обозначения: ПХ - пул хинонов; цит. hjf - цитохромный b^f комплекс; Фд -ферредоксин; ФНР - ферредоксин-НАДФ+-оксидоредуктаза; Гг - гидрогеназа;

По результатам работы были сделаны следующие выводы:

1. Изучение флуоресценции хлорофилла в разных временных диапазонах позволило показать увеличение выхода флуоресценции при серном голодании клеток С. reinhardtii. Серное голодание приводит к образованию закрытых центров ФС2 в результате появления долгоживущих состояний Qa~. Изучение кинетики затухания флуоресценции XJ1 а свидетельствует о том, что увеличение выхода флуоресценции связано не с изменениями взаимоотношений антенна-реакционный центр, а является следствием нарушения электрон-транспортных процессов.

2. Анализ кинетик индукции и затухания флуоресценции хлорофилла показал, что у голодающих по сере клеток С. reinhardtii увеличивается содержание Qe-невостанавливающих центров, а также имеет место нарушение ЭТЦ на донорной стороне ФС2.

3. У голодающих по сере клеток С. reinhardtii значительно нарушаются процессы тепловой диссипации энергии, в частности обнаружено снижение компонента qE нефотохимического тушения и нарушение функционирования виолаксантинового цикла.

4. Показано, что голодающая по сере культура С. reinhardtii в замкнутом культиваторе переходит в анаэробиоз в результате не только снижения скорости фотосинтеза, но и увеличения скорости дыхания.

5. Быстрая инактивация ФС2 в замкнутом культиваторе при переходе в анаэробиоз сопровождается ростом Ft, отражающей восстановленность пластохинонового пула. Как показано методом пико-наносекундной флуорометрии, это связано с увеличением вклада рекомбинационной компоненты (ф2) флуоресценции.

6. При культивировании в замкнутом культиваторе мутантов С. reinhardtii (Dl - R323), характеризующихся пониженной скоростью выделения кислорода, показано, что время перехода в анаэробиоз уменьшается, однако, выделение водорода наступает значительно позднее и его выход уменьшается. Таким образом, для светозависимого выделения водорода клеткам необходима функционально активная ФС2.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Волгушева, Алена Александровна, Москва

1. АН N.A., Dewez D., Didur О., Popovic R. (2006) Inhibition of photosystem II photochemistry by Cr is caused by the alteration of both D1 protein and oxygen evolving complex. Photosynthesis Research, V. 89, P. 81-87.

2. Allen J.F., Forsberg J. (2001) Molecular recognition in thylakoid structure and function. Trends Plant Sci, V. 6, P. 317- 326.

3. Anderson В., Anderson J.-M. (1980) Lateral Heterogeneity in the distribution of chlorophyll-protein complexes of the thylakoid membranes of spinach chloroplasts. Biochim Biophys Acta, V. 593, P. 427-440.

4. Andersson В., Styring S. (1991) Photosystem II: Molecular organization, function, and acclimation. Curr. Top. Bioenerg, V. 16, P.l-81.

5. Andersson J., Walters R.G., Horton P., Jansson S. (2001) Antisense inhibition of the photosynthetic antenna proteins CP29 and CP26: implications for the mechanism of protective energy dissipation. The Plant Cell, V. 13, P. 1193-1204.

6. Aro E.-M., Virgin I., Andersson B. (1993) Photoinhibition of photosystem II. Inactivation, protein damage and turnover. Biochim Biophys Acta, V. 1143, P. 113-134.

7. Barber J. (2002) Photosystem II: a multisubunit membrane protein that oxidises water. Curr. Opin. Struct. Biol, V. 12, P. 523-530.

8. Ben-Amotz A., Avron M. (1990) The biotechnology of cultivating the halotolerant alga Dunaliella. Trends Biotechnol, V. 8, P. 121-128.

9. Bendall D.S., Manasse R.S. (1995) Cyclic photophosphorylation and electron transport. Biochim Biophys Acta, V. 1229, P. 23-38.

10. Benemann J.R. (1996) Hydrogen biotechnology: progress and prospects. Nat Biotechnol, V. 14, P. 1101-1103.

11. Benemann J.R. (2000) Hydrogen production by microalgae. J. Appl Phycol, V. 12, P. 291-300.

12. Bennoun P. (2001) Chlororespiration and the process of carotenoid biosynthesis. Biochim Biophys Acta, V.l, P. 133-142.

13. Bennoun P. (2002) The present model for chlororespiration. Photosynthesis Research, V. 73, P. 273-277.

14. Berthold D.A., Babcock G.T., Yocum C.F. (1981) A highly resolved, oxygen-evolving photosystem II preparation from spinach thylakoid membranes: EPR and electron-transport properties. FEBS Letters, V. 134, P. 231-234.

15. Bilger E., Bjorkman O. (1990) Role of the xanthophyll cycle in photoprotection elucidated by measurements of light-induced absorbance changes, fluorescence and photosynthesis in leaves of Hedera canadensis. Photosynthesis Research, V. 25, P. 173-185.

16. Boichenko V.A., Greenbaum E., Seibert M. (2004) Hydrogen Production by Photosynthetic Microorganisms. In: Archer MD, Barber J (eds.) Molecular to Global Photosynthesis. Series of photoconversion of solar energy, V. II, Imperial College Press, UK.

17. Boichenko V.A., Hoffmann P, (1994) Photosynthetic hydrogen production in prokaryotes and eukaryotes: occurrence, mechanism and function. Photosynthetica, V. 30, P. 527-552.

18. Briantais J.-M., Dacosta J., Goulas Y., Ducruet J.-M., Moya I. (1996) Heat stress induces in leaves an increase of the minimum level of chlorophyll fluorescence, F0: a time-resolved analysis. Photosynthesis Research, V. 48, P. 189-196.

19. Camm E.L., Green B.R. (2004) IIovv the chlorophyll-proteins got their names. Photosynthesis Research, V. 80, P. 189-196.

20. Cao J., Govindjii (1990) Chlorophyll a fluorescence transient as an indicator of active and inactive photosystem II in thylakoid membranes. Biochim Biophys Acta, V. 1015, P.l 80-188.

21. Cape J.L., Bowman M.K., Kramer D.M. (2006) Understanding the cytochrome be complexes by what they don't do. The Q-cycle at 30. Plant Science, V. 11, P. 4655.

22. Carpentier R., Boisvert S., Joly D. (2006) Quantitative analysis of the experimental O-J-I-P chlorophyll fluorescence induction kinetics. FEBS J, V. 20, P. 4770-4777.

23. Codde D., Hefer M. (1994) Photoinhibition and light-dependent turnover of the D1 reaction centre polypeptide of photosystem II are enhanced by mineral-stress conditions. Planta, V. 193, P. 290-299.

24. Cohen J., Kim K., Posewitz M., Ghirardi M.L., Schulten K., Seibert M., King P. (2005) Molecular dynamics and experimental investigation of H2 and 02 diffusion in Fe.-hydrogenase. Biochemical Society Transactions, V. 33, P. 8082.

25. Das D., Dutta Т., Nath K., Kotay S.M., Das A.K., Veziroglu T.N. (2006) Role of Fe-hydrogenase in biological hydrogen production. Current science, V. 90, № 12, P. 1627-1637.

26. Dau H. (1994) Short-term adaptation of plants to changing light intensities and its relation to Photosystem II photochemistry and fluorescence emission. J. Photochem Photobiol, V. 26, P. 3-27.

27. Dekker J.P., Boekema E.J. (2005) Supramolecular organization of thylakoid membrane proteins in green plants. Biochim Biophys Acta, V. 1706, P. 12-39.

28. Delepelaire P., Wollman F.-A. (1985) Correlations between fluorescence and phosphorylation changes in thylakoid membranes of Chlamydomonas reinhardtii in vivo: a kinetic analysis. Biochim Biophys Acta, V. 809, P. 277-283

29. Delosme R., Olive J., Wollman F.-A. (1996) Changes in light energy distribution upon state transition: an in vivo study of the wild type and photosynthesis mutants from Clamydomonas reinhardtii. Biochim Biophys Acta, V. 1273, P. 150-158.

30. Demmig-Adams B. (1990) Carotenoids and photoprotection in plants: a role for the xanthophyll zeaxanthin. Biochim Biophys Acta, V. 1020, P. 1-24.

31. Dominici P., Caffari S., Armenante F., Ceoldo S., Crimi M., Bassi R. (2002) Biochemical properties of the PsbS subunit of photosystem II either purified from chloroplast or recombinant, J. Biol Chem, V. 277, P. 22750- 22758.

32. Duysens L.N., Amesz J., Kamp B.M. (1961) Two photochemical systems in photosynthesis in photosynthesis. Nature, V. 190, № 4775, P. 510-512.

33. Esper В., Badura A., Rogner M. (2006) Photosynthesis as a power supply for (bio-)hydrogen production. Trends in Plant Science, V.l 1, № 11, P. 543-549.

34. Fedorov A.S., Kosourov S., Ghirardi M.L., Seibert M. (2005) Continuous hydrogen photoproduction by Chlamydomonas reinhardtii: using a novel two-stage, sulfate-limited chemostat system. Appl Biochem Biotechnol, V. 121, P. 403-412.

35. Finazzi G. (2005) The Central role of the green alga Chlamydomonas reinhardtii in revealing the mechanism of state transition. J. Exp. Biol, V. 56, P. 383-388.

36. Finazzi G., Furia A., Barbagallo R.P., Forti G. (1999) State transitions, cyclic and linear electron transport and photophosphorylation in Chlanydomon reinhardtii. Biochim Biophys Acta, V. 1413, P. 117-129.

37. Finazzi G., Rappaport F., Furia A., Fleischmann M. (2002) Involvement of state transition in the switch between linear and cyclic electron flow in Chlamydomonas reinhardtii. EMBO reports, V. 3, P. 280-285.

38. Finazzi G., Zito F., Barbagallo R.P., Wollman F.-A. (2001) Contrasted effects of inhibitors of cytochrome b6f complex on state transitions in Chlamydomonas reinhardtii. J. Biol. Chemistry, V. 276, P. 9770-9774.

39. Flynn Т., Ghirardi M.L., Seibert M. (2002) Accumulation of 02-tolerant phenotypes in H2-producing strains of Chlamydomonas reinhardtii by sequential applications of chemical mutagenesis and selection. Int. J. Hydrogen Res, V. 27, P.1421-1430.

40. Forestier M., King P., Zhang L., Posewitz M., Schwarzer S., Нарре Т., Ghirardi M.L., Seibert M. (2003) Expression of two Fe.-hydrogenases in Chlamydomonas reinhardtii under anaerobic conditions. Eur. J. Biochem, V. 270, P. 2750-2758.

41. Forsberg J., Allen J. F. (2001) Protein tyrosine phosphorylation in the transition to light state 2 of chloroplast thylakoids. Photosynthesis Research, V. 68, P. 71-79.

42. Fouchard S., Hemschemeier A., Caruana A., Pruvost J., Legrand J., Нарре Т., Peltier G., Coumac L. (2005) Autotrophic and mixotrophic hydrogen photoproduction in sulfur-deprived Chlamydomonas Cells. Appl Environ Microbiol, V. 71, P. 6199-6205.

43. Frey M. (2002) Hydrogenases: hydrogen-activating enzymes. Chen. Bio. Chem, V.3,P. 153-160.

44. Gaffron H. (1942) Reduction of carbon dioxide coupled with the oxyhydrogen reaction in algae. J. Gen Physiology, V. 26, P. 241-267.

45. Gaffron H. (1944) Photosynthesis, photoreduction and dark reduction of carbon dioxide in certain algae. Biol Cambridge Phil Soc, V. 19, P. 1-20.

46. Gaffron H., Rubin J. (1942) Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae. J. Gen Physiology, V. 26, P. 219-240.

47. Gfeller R.P., Gibbs M. (1984) Fermentative metabolism of Chlamydomonas reinhardtii. I. Analysis of fermentative products from starch in dark and light. Plant Physiology, V. 75, P. 212-218.

48. Ghirardi M.L. (2003) Algal Systems for hydrogen photoproduction. The progress report in Hydrogen, fuel cells, and infrastructure technologies. P. 1-8.

49. Ghirardi M.L., Kosourov S.N., Tsygankov A.A., Seibert M. (2000) Two-phase photobiological algal H2-production system. DOE Hydrogen Program. P. 9-11.

50. Ghirardi M.L., Togasaki R.K., Seibert M. (1997) Oxygen-sensitivity of algal H2 production. Appl Biochem Biotechnol, V.63, P. 141-151.

51. Godde D., Trebst A. (1980) NADH as electron donor for the photosynthetic membrane of Chlamydomonas reinhardtii. Arch Microbiol, V. 127, P. 245-252.

52. Golbeck J.H. (1992) Structure and Function of Photosystem I. Plant Physiology, Plant Mol Biol, V. 43, P. 293-324.

53. Govindjee (1995) Sixty-three years since Kautsky: Chlorophyll a fluorescence. Austr J. Plant Physiology, V. 22, P. 131-160.

54. Grossman A. (2000) Acclimation of Chlamydomonas reinhardtii to its nutrient environment. Protist, V. 151, P. 201-224.

55. Grossman A., Takahasi H. (2001) Macronutrient utilization by photosynthetic eukaryotes and the fabric of interactions. Plant Physiology, V. 52, P. 163-210.

56. Hankamer В., Barbe J., Boekema E.J. (1997) Structure and membrane organization of photosystem II in green plants. Plant Physiology, Plant Mol Biol, V.48, P. 641-671.

57. Нарре Т., Hemschemeier A., Winkler M., Kaminski A. (2002) Hydrogenases in green algae: do they safe the algae's life and solve our energy problems? Trends Plant Sci, V. 7, P. 246-250.

58. Нарре Т., Kaminski A. (2002) Differential regulation of the Fe-hydrogenase during anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Eur. J. Biochem, V. 269, P. 1022-1032.

59. Нарре Т., Mosler В., Naber, J.D. (1994) Induction, localization and metal content of hydrogenase in Chlamydomonas reinhardtii. Eur. J. Biochem, V. 222, P. 769775.

60. Нарре Т., Naber J. (1993) Isolation, characterization and N-terminal amino acid sequence of hydrogenase from the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Eur. J. Biochem, V.214, P. 475-481.

61. Harris E.H. (1989) The Chlamydomonas Sourcebook: A comprehensive guide to biology and laboratory Use. Academic Press, San Diego. P. 780.

62. Hemschemeier А., Нарре T. (2004) The exceptional photofermentative hydrogen metabolism of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemical Society Transactions, V. 33, part 1. P. 39-41.

63. Heredia P., De Las Rivas J. (2003) Fluorescence induction of photosystem II membranes shows the steps till reduction and protonation of the quinone pool. J. Plant Physiology, V. 160, № 12, P. 1499-506.

64. Hill R., Bendall F. (1960) Function of two cytochrome components in chloroplasts: a working hypothesis. Nature. V. 186, № 4761, P. 136-138.

65. Holt N.E., Zigmantas D., Valkunas L, Li X.-P., Niyogi K.K., Fleming G. (2005) Carotenoid cation formation and the regulation of photosynthetic light harvesting. Science.,V. 307, P. 433-436.

66. Horton P., Ruban A.V. (2005) Molecular design of the photosystem II light-harvesting antenna: photosynthesis and photoprotection. J. Experimental Botany, V. 56, №411, P. 365-373.

67. Johnson G.N., Rutherford A.W., Krieger A. (1995) A change in the midpoint potential of the quinone Qa in photosystem II is associated with photoactivation of the primary quinone acceptor Qa. Biochim Biophys Acta, V. 1229, P. 201-207.

68. Joliot P., Lavergne J., Beal D. (1992) Plastoquinone compartmentation in chloroplasts: I. Evidence for domains with different rates of photoreduction. Biochim Biophys Acta, V. 1101, P. 1 12.

69. Kapdan I.K., Kargi F. (2006) Bio-hydrogen production from waste materials. Enzyme and Microbial Technology, V. 38, P. 569-582.

70. Kautsky H., Hirsch A. (1931) Niue Versuche zur Kohlens ureassimilation. Natutwissenschaften, V. 19. P. 964.

71. Ke B. (2001) Photosynthesis. Photobiochemistry and Photobiophysics. Advances in Photosynthesis. Kluwer Acad. Pabl. Dordrecbt/Boston/London, V.10, P. 763.

72. Kessler E. (1973) Effect of anaerobiosis on photosynthetic reactions and nitrogen metabolism of algae with and without hydrogenase. Arch Microbiol, V. 93, P. 91100.

73. Kessler E. (1974) Hydrogenase, photoreduction and anaerobic growth. In: Stewart WDP (ed) Algal Physiology and Biochemistry, University of California Press, Berkeley, P. 456-473.

74. Kopriva S. (2006) Regulation of sulfate assimilation in Arabidopsis and beyond. Annals of Botany 97, V.ll. P 479-495.

75. Kosourov S., Makarova V., Fedorov A., Tsygankov A., Seibert M., Ghirardi M.L. (2005) The effect of sulfur re-addition on H2 photoproduction by sulfur-deprived green algae. Photosynthesis Research, V. 85, P. 295-305.

76. Kosourov S., Seibert M., Ghirardi M.L. (2003) Effects of extracellular pH on the metabolic pathways in sulfurdeprived, H2-producing Chlamydomonas reinhardtii cultures. Plant Cell Physiology, V. 44, P. 146-155.

77. Kosourov S., Tsygankov A., Seibert M., Ghirardi M.L. (2002) Sustained hydrogen photoproduction by Chlamydomonas reinhardtii: effects of culture parameters. Biotech Bioeng, V. 78, P. 731-740.

78. Krause G.H., Weis E. (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics. Plant Physiology, Mol Biol, V. 42, P. 313-349.

79. Krieger A., Rutherford A.W., Johnson G.N. (1995) On the determination of the redox midpoint potential of the primary quinone acceptor, Qa, in photosystem II. Biochim Biophys Acta, V. 1229, P. 193-201.

80. Kriiger G.H.J., Tsimilli-Michael M., Strasser R.J. (1997) Light stress provokes plastic and elastic modifications in structure and function of Photosystem II in camellia leaves. Physiology Plantarum, V.101, P. 265-277.

81. Kruse O., Rupprecht J., Bader K.P., Thomas-Hall S., Schenk P.M., Finazzi G., Hankamer B. (20056) Improved photobiological H2 production in engineered green algal cells. J. Biom Chem, V.280, № 40, P. 34170-34177.

82. Kruse O., Rupprecht J., Mussgnug J.H., Dismukes G., Hankamer C. (2005a) Ben Photosynthesis: a blueprint for solar energy capture and biohydrogen production technologies. Photochem Photobiol, Sci. V.4, P. 957-969.

83. Kurisu G., Zhang H., Smith J.L., Cramer W.A. (2003) Structure of the cytochrome b6f complex of oxygenic photosynthesis: tuning the cavity. Science, V. 302, P. 1009-1014.

84. Laurinavichene T.V., Fedorov A.S., Ghirardi M.L., Seibert M., Tsygankov A.A. (2006) Demonstration of sustained hydrogen photoproduction by immobilized, sulfer-deprived Clamydomonas reinhardtii cells. J. Hydrogen Energy, V. 31, P. 659-667.

85. Laurinavichene T.V., Tolstygina I., Tsygankov A.A. (2004) The effect of light intensity on hydrogen production by sulfur-deprived Clamydomonas reinhardtii. J. Biotechnology, V. 114, P. 143-151.

86. Lavergne J., Briantais J.-M. (1996) Photosystem II heterogeneity. In: Ort DR, Yocum CF (eds) Oxygenic photosynthesis: the light reactions. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, P. 265-287.

87. Lazar D. (1999) Chlorophyll a fluorescence induction. Biochim Biophys Acta, V. 1412, P. 1-28.

88. Lazar D. (2003) Chlorophyll a fluorescence rise induced by high light illumination of dark-adapted plant tissue studied by means of a model of photosystem II and considering photosystem II heterogeneity. J. Theoretical Biology, V. 220, P. 469-503.

89. Lazar D. (2006) The polyphasic chlorophyll a fluorescence rise measured under high intensity of exciting light. Functional Plant Biology, V. 33, P. 9-30.

90. Lazar D., Ilik P., Naus J. (1997) An appearance of K-peak in fluorescence induction depends on the acclimation of barley leaves to higher temperature. J. Luminescence, V. 72, P. 595-598.

91. Leustek Т., Martin M.N., Bick J.-A., Davies J.P. (2000) Pathways and regulation of sulfur metabolism revealed through molecular and genetic studies. Plant Physiology, Plant Mol Biol, V. 51, P.l 41-165.

92. Lichtenthaler H.K. 1(987) Meth. Enzymol, V. 148, P. 350-382.

93. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951) J. Biol Chem, V. 194, P. 265-275.

94. Makarova V., Kosourov S., Krendeleva Т., Semin В., Kukarskikh G., Rubin A., Sayre R., Ghirardi M., Seibert M. (2007) Photoproduction of hydrogen by sulfur-deprived C. reinhardtii mutants with impaired Photosystem II photochemical activity.

95. Malkin R., Niyogi K. (2000) Biochemistry and molecular biology of plants. Eds. Buchanan B.B., Gruissem W., Jones R.L. Rockville, Maryland: American Society of Plant Physiology, P. 568-628.

96. Maxwell К., Johnson G.N. (2000) Chlorophyll fluorescence. Journal of Experimental Botany, V. 51, № 345, p. 659-668.

97. Melis А., Нарре T, (2001) Hydrogen production: green algae as a source of energy. Plant Physiology, V.127, P. 740-748.

98. Melis А., Нарре T. (2004) Trails of green alga hydrogen research from Hans Gaffron to new frontiers. Photosynthesis Research, V. 80, P. 401-409.

99. Melis A., Zang L., Forestier M., Ghirardi M.L., Seibert M. (2000) Sustained photobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygen evolution in the green algae Clamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, V. 122, P. 127-136.

100. Mitchell P. (1975) Protonmotive redox mechanism of the cytochrome b-cl complex in the respiratory chain: protonmotive ubiquinone cycle. FEBS Lett, V. 56, №56, P. 1-6.

101. MQller P., Li X.-P., Niyogi K.K. (2001) Non-photochemical Quenching. A. Response to Excess Light Energy. Plant Physiology, P. 1558-1566.

102. Nelson N., Ben-Shem A. (2004) The complex architecture of oxygenic photosynthesis. Mol Cell Biol, V. 5, P. 971-982.

103. Nicolet Y„ Lemon B.J., Fontecilla-Camps J., Peters J.W. (2000) A novel FeS cluster in Fe-only hydrogenases. Trends Biochem Sci, V. 25, P. 138-143.

104. Niyogi K.K., Li X.-P., Rosenberg V., Jung H. S. (2004) Is psbS the site of non-photochemical quenching in photosynthesis? Exp Bot, V. 56, P. 375-382.

105. Osyczka A., Moser C.C., Dutton P.L. (2005) Fixing the Q cycle Biochemical Sciences V.30,№4, P. 176-182.

106. Paschenko V.Z., Evstigneeva R.P., Gorokhov V.V., Luzgina V.N., Tusov V.B., Rubin A.B. (2000) Photophysical properties of carborane-containing derivatives of 5,10,15,20-tetra(p-aminophenyl)porphyrin, J. Photochem Photobiology, V. 54, P.162-167.

107. Peltier G., Schmidt G. (1991) Chlororespiration: An adaptation to nitrogen deficiency in Chlamydomonas reinhardtii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 88, P. 4791-4795.

108. Peter G.F., Thornber J.P. (1991) Biochemical Composition and Organization of Higher Plant Photosystem II Light-Harvestiong Pigment Proteins. J. Biol Chem, V. 266, P. 16745-16754.

109. Peters J.W. (1999) Structure and mechanism of iron-only hydrogenases. Curr. Opin. Struc. Biol, V. 9, P. 670-676.

110. Peters J.W., Lanzilotta W.N., Lemon B.J., Seefeldt L.C. (1998) X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase (Cpl) from Clostridium pasteurianum to 1.8A E ngstom resolution. Science, V. 282, P. 1853-1858.

111. Posewitz M.C., Smolinski S.L., Kanakagiri S., Melis A., Seibert M., Ghirardi M.L. (2004) Hydrogen photoproduction is attenuated by disruption of an isoamylase gene in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell, V. 16, P. 2151-2163.

112. Pospisil P., Dau H. (2002) Valinomycin sensitivity proves that lightinduced thylakoid voltages result in millisecond phase of chlorophyll fluorescence transients Biochim Biophys Acta, V. 1554, P. 94-100.

113. Poulson M., Samson G., Whitmarsh J. (1995) Evidence that cytochrome b559 protects photosystem II against photoinhibition. Biochemistry, V. 34, P. 10932— 10938.

114. Prince R.C., Kheshgi H.S. (2005) The photobiological production of hydrogen: potential efficiency and effectiveness as a renewable fuel. Microbiology, V. 31, P. 19-31.

115. Renger G. (2001) Photosynthetic water oxidation to molecular oxygen: apparatus and mechanism. Biochim Biophys Acta, V. 1503, № 1-2, P. 210-228.

116. Ripley B.S., Redfern S.P., Dames J. (2004) Ozone foliar symptoms in woody plant species assessed with ultrastructural and fluorescence analysis. South African J. Science, V.100, P. 615-618.

117. Roffey R.A., Kramer D.M., Govindjee, Sayre R.T. (1994) Lumenal side histidine mutations in the D1 protein of photosystem II affect donor side electron transfer in Chlamydomonas reinhardtii. Biochim Biophys Acta, V. 1185, P. 257-270.

118. Schreiber U (2002) Assessment of maximal fluorescence yield: donor-side dependent quenching and QB-quenching. In 'Plant spectrofluorometry: applications and basic research'. (Eds О van Kooten, JFH Snel) P. 23-47. (Rozenberg Publishers: Amsterdam)

119. Shatz G.H., Brock H„ Holzwarth A.R. (1998) Picosecond kinetics of fluorescence and absorbtion changes in photosystem II particles exited at low photon density. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 84, P. 8414-8418.

120. Shreiber U, Hormann H, Neubauer C, Klughammer С (1995) Assessment of photosystem II photochemical quantum yield by chlorophyll fluorescence quenching analysis. Plant Physiology, V. 22, P. 209-220.

121. Shreiber U., Bilger W. (1993) Progress in chlorophyll fluorescence research: Major developments during the past years in retrospect. In: Luttge U. and Ziegler H. (eds) Progress in Botany, V. 54, P. 151-153. Springer Verlag, Berlin.

122. Shreiber U., Klughammer C., Neubauer C. (1988) Measuring P700 absorbance changes around 830 nm with a new type of pulse modulation system. Z. Naturforschung, V. 43, P. 686-698.

123. Shreiber U., Neubauer C., Schliwa U. (1992) РАМ fluorometer based on mediumfrequency pulsed Xe-flash measuring light: A highly sensitive new tool in basic and applied photosynthesis research. Photosynthesis Research, V. 36, P. 6572.

124. Shreiber U., Schliwa U, Bilger W. (1986) Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometre. Photosynthesis Research, V. 10, P. 51-62.

125. Smith J.L., Zang H., Yan J., Kurisu G., Cramer W.A. (2004) Cytochrome be complex: a common core of structure and function surrounded by diversity in the outlying provinces. Curr. Opin. Struct. Biol, V. 14, P. 432-439.

126. Solovchenko A.E, Chivkunova O.B, Merzlyak M.N, Reshetnikova I.V. (2001) Spectrophotometric pigment analysis in apple fruit. Plant Physiology, V. 48, P. 693-700.

127. Stewart D.H., Brudvig G.W. (1998) Cytochrome b559 of photosystem II. Biochim Biophys Acta, V. 1367, P. 63-87.

128. Strasser B.J. (1997) Donor side capacity of Photosystem II probed by chlorophyll a fluorescence Transients. Photosynthesis Research, V. 52, P. 147-155.

129. Strasser B.J., Strasser R.J. (1995) Measuring fast fluorescence transients to address environmental questions: The JlP-test. In: Mathis P (ed) Photosynthesis: From Light to Biosphere. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, P. 977-980.

130. Stuart Т., Gaffron H. (1972) The mechanism of hydrogen photoproduction by several algae. I. The effects of inhibitors of photophosphorylation. Planta, V. 106, P. 91-100.

131. Tomek P., Laz.ar D., Ilik P., Naus J. (2001) On the intermediate steps between the О and P steps in chlorophyll a fluorescence rise measured at different intensities of exciting light. Australian J. Plant Physiology, V. 28. P. 1151-1160.

132. Tsygankov A., Kosourov S., Seibert M., Ghirardi M.L. (2002) Hydrogen photoprodution under continuous illumination by sulfur-deprived, synchronous Chlamydomonas reinhardtii. Int. J. Hydrogen Energy, V. 27. P. 1239-1244.

133. Tsygankov A.A., Kosourov S.N., Tolstygina I.V., Ghirardi M.L., Seibert M. (2006) Hydrogen production by sulfur-deprived Chlamydomonas reinhardtii under photoautotrophic conditions. Int. J. Hydrogen Energy, V. 31, P. 1574-1584.

134. Van Kooten O., Snel J.F.H. (1990) The use of chlorophyll fluorescence Nomenclature in plant stress physiology. Photosynthesis Research, V. 25, P. 147150.

135. Vass I., Styring S. (1992) Spectroscopic characterization of triplet forming states in Photosystem II. Biochem, V. 31, P. 5957-5963.

136. Vavilin D.V., Polynov V.A., Matorin D.N., Venediktov P.S. (1995) Sublethal concentrations of copper stimulate photosystem II photoinhibition in Chlorella pyrenoidosa. Plant Physiology, V. 146, P. 609-614.

137. Vener A.V., Ohad L., Andersson, B. (1998) Protein phosphorylation and redox sensing in chloroplast thylakoids. Current Opinion in Plant Biol, V.l, P. 217-223.

138. Vignais P.N., Billoud В., Meyer J. (2001) Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol, V. 25, P. 455-501.

139. Winkler M., Hemschemeier A., Gotor C., Melis A., Happe T. (2002) Fe.-hydrogenases in green algae: Photo-fermentation and hydrogen evolution under sulfur deprivation. Int. J. Hydrogen Energy, V. 27, P. 1431-1439.

140. Wollman F.-A. (2001) State transitions reveal the dynamics and flexibility of the photosynthetic apparatus, EMBO J, V. 20, P. 3623-3630.

141. Wykoff D.D., Davies J.P., Melis A., Grossman A. (1998) The effects of phosphorus and sulfur deprivation on photosynthetic electron transport in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiology, V. 117, P. 129-139.

142. Zhang L., Нарре Т., Melis A. (2002) Biochemical and morphological characterization of sulfur-deprived and H2-producing Chlamydomonas reinhardtii (green alga). Planta, V. 214, P. 552-561.

143. Zito F„ Finazzi G., Delosme R„ Nitschke W., Picot D., Wollman F.A. (1999) The Qo Site of Cytochrome 6/ Complex Control the Activation of the LHCII Kinase. EMBO J., V. 18, P. 2961-2969.

144. Балнокин Ю.В. Растения в условиях стресса. Физиология растений под ред. И.П. Ермакова М: Издательский центр «Академия», 2005. 640 с.

145. Бухов Н.Г, Попова Е.В., Попов А.С. (2006). Влияние глубокого замораживания протокормов орхидеи Bratonia методов витрификации на фотохимическую активность двухфотосистем. Физиология растений, Т.53. № 6. С. 895-902

146. Бухов Н.Г. (2004) Динамическая световая регуляция фотосинтеза. Физиология растений. Т. 51, № 6, С. 825-837.

147. Бухов Н.Г., Егорова Е.А. (2006) Механизмы и функции альтернативных путей переноса электронов в хлоропласте, связанных с фотосистемой I. Физиология растений, Т.53, № 5, С. 645-657.

148. Вавилин Д.В., Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. (1994) Изменения фотосинтетического аппарата хлореллы при адаптации к низким температурам. Физиология Растений, Т. 41, №2, С. 197-202.

149. Корватовский Б.Н., Пащенко В.З., Рубин А.Б., Рубин Л.Б., Тусов В.Б. (1982) Автоматизированный импульсный флуорометр высокого временного разрешения и чувствительности. Биол. науки, Т.11, С. 105.

150. Корнеев Д.Ю. (2002) Информационные возможности метода индукции флуоресценции хлорофилла. К.: Альтерпрес. С. 188.

151. Кузык Б.Н., Кушлин В.И., Яковец Ю.В. (2005) На пути к водородной энергетике. Второй международный симпозиум. Сборник документов и материалов. Москва, С. 160.

152. Кукарских Г.П., Граевская Е.Э., Кренделева Т.Е., Тимофеев К.Н., Рубин А.Б. (2003) Влияние митилртути на первичные процессы фотосинтеза у зеленой микроводоросли Clamydomonas reinhardtii. Биофизика Т. 48, вып. 5, С. 853859.

153. Кукушкин А.К., Тихонов А.А. (1988) Лекции по биофизике фотосинтеза растений. М.: МГУ, С. 320.

154. Пащенко В.З. (1990) Пикосекундная спектроскопия процессов миграции энергии и переноса электрона в пигментном аппарате высших растений и пурпурных бактерий. Известия академии наук. №3. С. 343-352.

155. Пащенко В.З. (2000) Связь структурно-динамической организации РЦ пурпурной бактерии Rb.sphaeroides. Биофизика, Т.45. вып. 3. С. 461-468.

156. Полынов В.А., Маторин Д.Н., Вавилин Д.В., Венедиктов П.С. (1993) Действие низких концентраций меди на фотоингибирование фотосистемы II у Chlorella vulgaris (Beijer). Физиология растений. Т. 40, № 5, С. 754-759.

157. Рубин А.Б. (1997) Первичные процессы фотосинтеза. Соросовский образовательный журнал. № 10. С. 79-84.

158. Рубин А.Б. (2000) Биофизические методы в экологическом мониторинге. Соросовский образовательный журнал, Т.6, № 4. С. 7-13.

159. Рубин А.Б., Кренделева Т.Е. (2004). Регуляция первичных процессов фотосинтеза. Биофизика, Т. 49. С. 239-253.

160. Рубин. А.Б. (2004) Биофизика. В 2т.: Учеб. для вузов. 2-е изд., исп. и доп. М.: Книжний дом «Университет» С. 448.

161. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие (1983) / Под ред. Н.С. Егорова. 2-е изд. М.: Изд-во Моск. Ун-та, С. 215.

162. Тихонов А.Н. (1999) Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза. Соросовский образовательный журнал. № 11. С. 8-15.

163. Цыганков А.А. (2006) Получение водорода биологическим путем. Российский химический журнал. T.L, № 6, С. 26-33.

164. Чемерис Ю.К., Шендерова JI.B., Лядский В.В, Венедиктов П.С. (1990) Связь между инактивацией ФС2 и накоплением продуктов фотосинтетического метаболизма углерода при азотном голодании клеток хлореллы . Физиология Растений, Т. 37, № 2, С. 241.

165. Шувалов В.А. Климов В.В. (1987) Первичные процессы переноса электрона и структурная организация реакционных центров фотосинтеза. Биофизика, Т. 22. вып. 5, С. 814-829.

166. Эдварде Дж., Уокер Д. (1986). Фотосинтез СЗ и С4 растений: механизмы и регуляция // под ред. А.Т. Мокроносова, М.: Мир. С. 598.

Информация о работе

Волгушева, Алена Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.02

Диссертация

Влияние серного голодания на первичном процессы фотосинтеза и фотоиндуцированное образование водорода у зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы