Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование in vivo природы фоторецепторного пигмента фототаксиса жгутиковых водорослей и связи фототаксиса с фотосинтезом

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Исследование in vivo природы фоторецепторного пигмента фототаксиса жгутиковых водорослей и связи фототаксиса с фотосинтезом"

МОСКОВСКИМ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИМ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ГОВОРУНОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ IN VIVO ПРИРОДЫ ФОТОРЕЦЕПТОРНОГО'ПИГМЕНТА ФОТОТАКСИСА ЖГУТИКОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ И сеязи ФОТОТАКСИСА С ФОТОСИНТЕЗОМ

03.00.12 - Физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена на кафедре Физико-химической, биологии МГУ (зав. кафедрой доктор биол.наук профессор Ф.Ф.Литвин) и в лаборатории биомембран Института биофизики Центра биологических исследований Венгерской академии наук (Сегед, Венгрия).

Научные руководители: акадеМик РАН А.А.Красновский,

кандидат биологических наук О,А.Синецеков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Л.М.Чайлахян,

доктор биологических наук М.С. Крицкий

Ведущая организация - Институт почвоведения и Фотосинтеза РАН, Пуцино

/е.ог.

Защита диссертации состоится / О / • 1993 г. '

в / ^ час. на заседании Специализированного совета К.053.05.14 по адресу: 119079, Москва, МГУ им.М.В.Ломоносова, биологический Факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического Факультета МГУ.

Автореферат разослан

2. У.

-У 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук

О.Г.Полесская

Актуальность проблемы. В настоящее время большое внимание Физиологов растений уделяется исследованию приспособительных реакций, направленных на оптимизацию процесса фотосинтеза в зависимости от постоянно меняющихся условий освещения.

Световой контроль движения одноклеточных фотосинтезирующих микроорганизмов представляет, собой зволюционно наиболее раннюю форму таких приспособительных реакций. Одним из самых интересных типов Фоторегуляции движения клеток является Фототаксис жгутиковых водорослей - способность ориентироваться в соответствии о направлением распространения света. С одной стороны, Фототаксис жгутиковых водорослей тесно связан с Фотосинтезом, но, с другой стороны, он имеет некоторые черты сходства с процессами зрения животных и Фоторегуляции движения бактерий.

Известно, что Фототаксис жгутиковых водорослей опосредован работой специализированного фоторецепторного аппарата (Синецеков и Литвин, 1974; |Ми115сИ и Нас1ег, 1979). Определение направления светового потока основано на модуляции освещенности Чюторецептора при вращении клетки вокруг продольной оси (БгеИп, 1973$ Вобсоу и Ре1п1е1Ь, 1979). В трансдукции светового стимула ключевую роль играют электрические реакции (Синэщеков, 1978; Синецеков й др., 1978; и др., 1978). Однако многие принципиальные вопросы,

касающиеся механизма Фототаксиса, все еще остаются невыясненными (например, проблема химической природы Фоторецепторного пигмента). Кроме того, в точности неизвестно, каким образом осуществляется "обратная связь" Фототаксиоа и Фотосинтеза.

Цель и задачи исследования. Представленная работа имела целью исследование некоторых деталей механизма фототаксиса одноклеточных жгутиковых водорослей и выяснение путей контроля Фототаксиса со стороны Фотосинтеза.

Конкретные задачи заключались в следующем:

1) экспериментальная проверка гипотезы, о родопсиновой природе Фоторецепторного пигмента;

2) исследование роли антенного комплекса - в Формировании спэк!ральной чувствительности фототаксиса?

3) исследование влияния Фотосинтеза на процессы регуляции движения клетки, и,,в частности,, выяснение Функциональной роли контролируемой Фотосинтезом системы , цитоплазматически-: осцилляторов, обнаруженной ранее в клетках .жгутиковые водорослей.

Научнан новизна.. В работе . представлены результаты комплексного исследованияФототаксиса, .проводимого как на уровне? регистрации Фотоэлектрических - реакций .(наиболее раннил детектируемы•• янлекий ьэ цепи транедукции светового стимула) , так и на уровне3 регистрации Фотоиндуциросанног""о двигательного ответа (конечного физиологического эффекта). . Основное внимание уделено применению су.слбмзмального метола .фотоэлектрмчес* их . измерений (51п.е£»ИсМе1 с^, 1991), использованного для изучения не только первичны-: процессов фоторецепторного акта, но и Фототаь сической ориентации клеток.

Показано, что подавление Фототаксиса жгутиковые: водорослей гидроксиламином, .агентом, вызывающим отщепление .хромофорной группы от ретиналь-содержащих белков, а также восстановление Фототаксиса клеток "слепы.::" мутантов после добавления ретиналч проявляется уже на стадии генерации Фоторецепторного тока. Эти. данные представ ляк>т собой новое экспериментальное свидетельства в пользу гипотезы о том, что фототаксис жгутиковых водорослей сенсибилизируется ретиналь-содержащим белком, подобным зрительному родопсину и сенсорным родопсинам галобактерий.

Путем длительной регистрации и анализа траектории движения

индивидуальных клеток установлено, что знак ориентированного движения при фототаксисе находится под - контролен Фотосинтеза. Показано, что регуляция поступательного ' движения 4 клетки обеспечивается управляемой Фотосинтезом системой эндогенны^ цитоплаэпатически осцилляторов.

значимостьПолученные в работе данные способствуют выяснению механизма Фототаксиса жгу гик овы /. водорослей и общих закономерностей функционирования фоторег ул *торнысистем клетки, которые могут иметь значение для разработки биосенсорных устройств на оснйве природных моделей. Результаты проведенных исследований еззимосеязи фототаксиса и Фотосинтеза могут быть использованы ' с целью повышения продуктивности промышленных установок для выращивания фототрофных микроорганизмов„

Апробация работы. Материалы диссертации были до/южоны на VI Всесоюзном симпозиуме "!*!«:■:анизмы сенсорной рецепции" <Моск ва, 1988) и на V Международной конференции по ретиналь-содержашим белнам (Дурдан, Франция, 1992), а также на научны::-: семинара-: кафедры Физико-химической биологии МГУ и лаборатории биомембран Института биофизики Центра биологически* исследований Венгерской академии наук <Сегед, Венгрия).

0у^1ли_ка_цни._ материалам диссертации опубликовано 7 работ.

1Д структура работы. Диссертация изложена содержит ^ рисунков. Рукопись состоит из введения, обзора литературы, объяснения целей и задач исследования, изложения результатов экспериментов, обсуждения полученных данных, выводов и списка цитированной литературы (содержит¿¿^наименовант'О .

ОБ'ЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы одноклеточные жгутиковые водоросли рода Haematococcus <Н. pluvialis и Н. lacustris ), .полученные из лаборатории проф. Б. В.Громова (Биологический институт

Санкт—Петербургского университета, Санкт—Петербург), а также ряд штаммов Chiamydomonas .reinhardtii, любезно предоставленных д.б.н. А.С.Чунаевым из того же института.

Ниже приведена характеристика использованных штаммов Chalmydoroonas: штамм 494(-)— дикий тип, штамм 495 <+) - мутант с повышенной чувствительностью Фоготаксиса, штамм СС1101 еу mt(-) "бесстигменый" Мутант, штаммы 516 бел/1, 516 бел/3, 494/30, 494/31, N164, N178, СС2359 -, мутанты, у которых синтез каротиноидов блокирован на стадии фитоена (бескаротиноидные), отличающиеся, кроме того, гуэниженным содержанием хлорофилла.

Все микроорганизмы, кроме бескаротиноидных мутантов Chlamydomonas, выращивались автотрофно при постоянном освещении лампами дневного света на средах с добазлением 1.2.'/. агара в течение 7-10 дней для Haematococcus и 3-5 дней для Chlamydomonas при температуре 20-24° С. Выращивание бескаротиноидных мутантов производили на среде с добавлением триптона в темноте в течение 5-7 дней при температуре 28°С. За сутки до опытов клетки переносили в жидкую среду для образования подвижных Форм.

Фотоаккумуляцинз клеток под действием света регистрировали при помощи Фотодиода по изменению пропускания суспензии для измерительного красного света низкой интенсивности. Траектория движения индивидуальных клеток в поле зрения микроокопа прослеживалась путем электромеханической регистрации перемещения подвижного столика микроскопа или наблюдалась на экране телевизора посредством соединенной с микроскопом видеокамеры на установке, собранной В.В.Судницыным.

Регистрации» Фотоэлектрических реакций индивидуальной клетки Haematococcu<3 проводили по методу, разработанному О.А.Синещековым при помощи установки, собранной на каф. Физико-химической биологии биологического Ф-та МГУ. Клетка втягивалась в кончик стеклянной микроприсоски, заполненной средой роста клеток. Регистрация Фотоиндуцированной разности потенциалов между двумя участками поверхности клетки производилась при помощи ^- лор -ссог^рпчы -электродов, один из которых помещался внутри присоски, а другой находился в экспериментальной камере с суспензией водорослей. Электрический сигнал подавален на вход катодного повторителя с высоким входным сопротивлением и затем записывался с помощью быстродействующего регистрирующего прибора Н3030. Сопротивление об'екта измеряли путем пропускания по цепи импульсов постоянного тока.

Часть работы, связанная с суспензигльным методом

Фотоэлектрических измерений, была выполнена в лаборатории проф.

Л.Кестхейи в Институте биофизики Центра биологических исследований

Венгерской академии наук (г. Сегед, Венгрия) по методу,

разработанному O.A. Синещековым. Для регистрации Фотоэлектрически*:

сигналов использовали платиновые электроды. погруженные в

суспензию клеток. Возбуждение суспензии производилось в основном

при помощи фотовспышки Hanimex Pz 1*44 (время нарастания

нарастания 0.3 мс). В ряде "случаев для возбуждения суспензии

1

использовали лазер на красителя;; с накачкой от импульсного лазера (длительность вспышки 10 не, максимальная энергия 5 10 ~ Дж).

Для измерений Фотоэлектрических. сигналов при зозе'уждонии Фотовспышкой исполь зов ал и предусилитель на базе интеграл ьной о.>-емы LF 356 1С. Сигналы трансформировались в цифровую Форму при помощи адаптора Thurlby DSA—524 и вводились в компьютер PC IBM ЗВ6 для

последующей обработки с использованием программы SPSERV 2.2. Для измерений Фотоэлектрических сигналов в случае лазерного возбуждения использовали предусилитель на базе интегральной схемы Burr Brown без дополнительной Фильтрации.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ФОТОЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИИ В СУСПЕНЗИИ КЛЕТОК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФОТОТАКСИСА ЖГУТИКОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

а) Характеристика Фотоэлектрические реакций, регистрируемых в суспензии случайно ориентированных клеток Chiamydomonas reinhardtii

При возбуждении суспензии клеток жгутиковых водорослей юроткини вспышками света регистрируются электрические сигналы, которые характеризуются наличием нескольких компонентов в различны)': временны:-:" диапазонам.

СвайотЕза самого быстрого компонента сигнала (время

нарастания, спектральная чувствительность, характер влияния красного фонового освещения и добавления DCMU) показывают,, что он огражает функционирование Фотосинтетических реакционных центров и может быть легко дифференцирован от других фото .электрических

реакций клетки, связанных с Фототаксисом. Механизм генерации »

Фотссинтетических сигналов в суспензии клеток жгутиковых водорослей, по всей вероятности, аналогичен описанному в литературе механизму генерации сигналов при одностороннем возбч'ждении вспышками света суспензии хлоропластов (Trissl и др.,

1982).

Исследование двух других компонентов сигнала, регистрируемого

в суспензии клеток Chiamydomonas reinhardtii, показало, что они обладают свойствами, типичными для Фоторецепторного тока и регенеративной реакции жгутиковых 'Еодорослей, измеряемых микроэлектродным методом на одиночной клетке. Только эти компоненты сигнала изучались в данной работе и поэтому ниже под "Фотоэлектрическими реакциями (сигналами I в суспензии клеток" всегда подразумеваются только реакции, связанные с работой системы Фоторецепции. Параметры этих реакций определяются свойствами лакзльныг. генераторов тока индивидуальных клеток и анизотропией чувствительности их Фоторецепторного аппарата.

б) Влияние постоянного освещения на Фотоэлектрические реакции в суспензии клеток

Фотоэлектрические реакции, генерируемые в суспензии клеток в ответ на вспышку света, чрезвычайно чувствительны к *предосвещению суспензии слабым постоянным светом, причем степень проявления эффекта постоянного освещения зависит от вязкости среды, в которой находятся клетки, а его характер определяется направлением приложенного освещения по отношению к измерительным электродам.

Путем параллельного наблюдения движения клеток под микроскопом показано, что характер влияния одностороннего постоянного освещения на Фотоэлектрические реакции соответствует знаку Фототаксиса клеток.

Эти данные свидетельствуют о том, что эффект постоянного освещения на возбуждаемые вспышками Фотоэлектрические сигналы в суспензии отражает Фототаксическую ориентацию клеток. Таким образом, метод измерения Фотоэлектрических сигналов в суспензии может быть использован не только в целях исследования первичны:-'

процессов Фоторецепторного акта, но и для изучения двигательного ответа (фотоориентации) клеток при Фототаксисе.

в) Измерение фототаксической ориентации клеток при возбуждении суспензии вспышками, направленными под углом н'линии, соединяющей электроды

'Рототаксическую ориентацию ' клеток изучали путем измерения зависимости амплитуды Фотоэлектрических сигналов от угла между направлением вспышки и линии, соединяющей электроды, закрепленные в круглой вращающейся кювете. Увеличение интенсивности постоянного света приводит к сдвигу кривой зависимости амплитуды Фоторецепторного тока от этого угла и увеличению максимальной амплитуды сигнала, что отражает увеличение степени ориентации клеток. Наиболее показательным является частный случай этих измерений, ког да возбуждение суспензии производится вспышками, направленными перепендикулярно линии, соединяющей электроды. При этом способе измерений регистрация Фотоэлектрических сигналов определяется только Фототаксической ориентацией клеток.

г) Использование метода Фотоэлектрических измерений для выяснения природы медленных Фотоиндуцированных изменений светорассеяния суспензии клеток

Освещение суспензии клеток коротковолновым постоянным светом, направленным под углом 90 градусов к лучу измерительного длинноволнового света, вызывает изменение интенсивности его рассеяния. Путем параллельной регистрации интенсивности светорассеяния и Фотоэлектрически* сигналов показано, что причина

этого изменения светорассеяния заключается в фототаксической ориентации клеток.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДЫ ФОТОРЕЦЕПТОРНОГО ПИГМЕНТА И СВОЙСТВ АНТЕННЫ

а) Ретиналь-зависимые Фотоэлектрические реакции в суспензии клеток бескаротиноидных мутантов Chiamydomonas reinhardtii

Клетки бескаротиноидных мутантов, выращенные в темноте, не обладают Фототаксисом, т.е., являются "слепыми". Обнаружено, что такие клетки не способны генерировать электрический сигнал при возбуждении суспензии вспышками света. Добавление all-trans ретиналя к суспензии мутантных клеток приводит к восстановлению у них способности генерировать Фотоэлектрические сигналы. Эти сигналы содержат компоненты, соответствующие Фоторецепторному току и регенеративной реакции клеток нормального пигментного состава (Рис.1).

Пороговая чувствительность Фоторецепторного тока в суспензии мутантных клеток и ее спектральная зависимость оказались близки к соответствующим характеристикам Фоторецепторного тока клеток нормального пигментного состава (хотя у мутантных клеток отмечено снижение относительной чувствительности фоторецепторного тока к овоту в коротковолновой "части спектра).

Появление способности генерировать Фотоэлектрические сигналы наблюдается практически немедленно после добавления ретиналя к суспензии мутантных клеток, и амплитуда Фоторецепторного тока достигает насыщения в минутной шкале. Измерение зависимости амплитуды фоторецепторного тока от концентрации ретиналя показало,

1 с

а ъ л I L

it

Ч >

ь

I с с

£

Рис.1. Появление фотоэлектрического сигнала в суспензии клеток бесиаротиноидного мутанта Chiamydomonas reinhardtii (516

бел/3) пгэсле добавлении 5 нМ all-trans ретиналя и его сравнение с

сигналом в суспензии клеток штамма 495t+>.

что эффек^ ретиналя достигает насыщения при концентрации, соответствующей нескольким сотням тысяч молекул ретиналя на

клетку.

Таким образом, на основании изложенных данных можно сделать

вывод о том, что появление Фотоэлектрической активности в

суспензии клеток беокаротиноидных мутантов после добавления

all-trans ретиналя связано о реконструкцией собственно

Фоторецепторного пигмента, а не вызвано встраиванием экзогенного

и

хромофора в другие структуры клетки.

Установлено, что диметил-октатриеналь, аналог ретиналя, лишенный бета-иононового кольца, но имеющий систему . треч сопряженных двойных связей, также способен индуцировать генерацию Фоторецепторного тока в суспензии клеток "слепыхн мутантов. В то же время цитраль (аналог триеналя, у которого одна из двойных связей восстановлена), не эффективен даже в микромолярных концентрациях. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что наличие в молекуле системы по крайней мере трех сопряженных двойных связей является необходимым условием Функциональной активности хромофора.

Фотоэлектрические сигналы, регистрируемые в суспензии клеток бескаротиноидных мутантоз, имеют знак, противоположный знаку сигналов, измеряемых в суспензии клеток нормального пигментного состава (Рис.1). По всей вероятности, этот эффект не может быть связан с обращением ориентации генераторов тока в мембране мутантйых клеток. Поэтому обращение знака сигнала в суспензии мутантных клеток отражает, по-видимому, особенности работы антенны у этих клеток. Мутантные клетки лишены стигмы и хлоропласта, поэтому нормальный механизм Функционирования Фоторецепторнаго аппарата у них нарушен. Обращение знака Фотоэлектрических сигналов в суспензии мутантных клеток свид«тельствут о том, что работа Фоторецепторного аппарата этих клеток может быть основана на преломлении света сферическим телом клетки, т.е., "эффекте линзы", как это описано для Фототропизма у грибов.

Показано, что Фотоэлектрические реакции, измеряемые в суспензии клеток бескаротиноидных мутантов после добавления экзогенного хромофора, обладают чувствительностью к слабому постоянному свету, характеризующей клетки нормального пигментного

состава. При этом кинетика сигналов, измеряемых о условиях постоянного освещения, аналогична в суспензии мутантных и нормальных клеток. Отсюда можно заключить, что и в случае клеток бескаротиноидных мутантов эффект слабого постоянного освещения на Фотоэлектрические сигналы заключается в Фототаксической ориентации клеток. Это означает, что реконструированный экзогенным ретиналем Фоторецепторный пигмент мутантных клеток обладает полной Функциональной активностью, т.е. способен запускать всю цепь трансдукции сигнала, которая обеспечивает Фототаксис клетки.

На основании измерения световых кривых была определена спектральная чувствительность эффекта постоянного освещения на Фоторецепторный ток в суспензии клеток бескаротиноидных мутантов. Показано, что область максимальной спектральной чувствительности этого эффекта приходится на 500 нм, что соответствует спектральной чувствительности фототаксиса клеток нормально пигментированных штаммов этого микроорганизма.

При измерении ретиналь-зависимых фотоэлектрических реакций в суспензии клеток бескаротиноидных мутантов Chiamydomonas reinhardtii были обнаружены особенности, связанные с расположением электродов в экспериментальной кювете. При использовании кюветы с электродами, расположенными в вертикальной плоскости, знак сигналов в суспензии мутантных клеток не зависит от направления возбуждающей вспышки. При добавлении к суспензии клеток агарозы и образовании геля знаки сигналов соответствуют измеряемым в кювете с горизонтальным расположением электродов. Описанный эффект свидетельствует о том, что в отсутствие светового стимула клетки в суспензии ориентированы в верикальной плоскости за счет гравитаксиса.

6) Действие гидроксиламина на Фоторегуляцию движения клеток жгутиковых водорослей

Все известные ретиналь-содержачие белки обладают

чувствительностью к гидроксиламину - этот агент вызывает отаепление хромофорной группы от белковой части молекулы.

В данной работе показано, что инкубирование суспензии клеток Haematococcus pluvial is с гидроксиламином приводит к снижению пороговой чувствительности Фотоаккумуляции клеток без изменения наклона световых кривых. Специфичность действия гидроксп.камина на Фототаксис подтверждается результатами определения индекса Фототаксиса путем подсчета клеток, пересекающих условную границу в поле зрения микроскопа. При использовании низких (1-2 мМ) концентраций эффект гидроксиламина на Фототаксис проявлялся только в том случае, если инкубацию суспензии проводили на свету. Такая светоэависимость весьма характерна для действия гидроксиламина на ретиналь-содержание белки.

Изучение действия гидроксиламина на Фототаксис проводили параллельно с исследсванием влияния агента на Фотоэлектрические реакции клеток, связанные с работой системы Фоторецепции. Микроэлектродные измерения с использованием одиночных клеток Haematococcus поназали, что предварительная инкубация суспензии клеток с гидроксиламином на свету приводит к снижению стационарного уровня Фоторецепторного тока.

Изучение действия гидроксиламина на Фотоэлектрические реакции Chiamydomonas reinhardtii проводилось методом измерений в суспензии. Показано, что предварительная инкубация суспензии клеток дикого типа на свету в присутствии гидроксиламина приводит к параллельному снижению амплитуды Фоторецепторного тока и

регенеративной реакции. Установлено, что гидр оке ил.амин оказывает влияние и на ретинапь-эаеисимые Фотоэлектрические реакции в суспензии клеток "слепых" мутантов. Добавление гидроксиламина приводит к снижению пороговой чувствительности Фоторецепторного тока, индуцированного ретиналем в суспензии мутантных клеток, причем эффект гидроксиламина имеет отчетливый светозависимый характер.

Таким образом, при помощи Фотоэлектрических измерений было . показано, что подавление Фототаксиса жгкутиковых водорослей гидроксиламином при инкубации на свету, описанное в литературе для Chiamydomonas reinhardtii и обнаруженное в данной работе для Haematoccccus, связано с действием агента на фоторецепторный пигмент, а не вызвано нарушением более поздних стадий транедукции светового стимула.

На основании результатов исследований, изложенных выше* в раздела« а) и в), можно сделать вывод о том, что восстановление Фототаксиса и леток бескаротиноидных мутантов Chi amydomonas reinhardtii после добавления экзогенного ретиналя и подавление Фототаксиса жгутиковых водорослей гидроксиламином отражает функционирование у этих микроороганизмоь Фоторецепторного пигмента родопсиновой природы.

в) Изучение Фототаксиса бесстигменного мутанта Chiamydomonas rei.nhiardti 1

Исследования проводили путем регистрации Фотоиндуцированного двигательного отеета (Фотоаккумуляции клеток у освещенной стенки экспериментальной кюветы) и при помощи измерения Фоторецепторного

тока <суспензйальнч!м метолом) .

Показано, . что' область максимальной спектральной

чувствительности Фотоаккумуляции клеток бессти^менного мутанте, существенно сдвинута в сторону коротких длин волн по сравнению с диким типем. Применение суспенэиального метода Фотозлектричес.ких измеренений показало, что клетки бесстнгменного мутанта Chi amydofnonas reinhardtii способны к генерации Фоторецепторного тока и к регенеративной реакции, по кинетике? не ' отличающихся от таковых у нормальных клеток. При этом Фотоэлектрические реакции бесстигменного мутанта характеризуются больией относительной чувствительностью к коротковолнозому свету <425 им). "

На осназании полученных данных можно сделать вывод а том, что наличие стигмы не только обеспечивр>-. г' ..Фтектиэнссть ориентации клеток (как это была известно ранее]. на и существенно влияет на спектральную чувствительность «¡ютотАксиса ягу тиков ы* водорослей.

3. КОНТРОЛЬ ФОТОТАКСИСА ЖГУТИКОВЫХ ВОДОРОСЛЕЙ СО СТОРОНЫ ФОТОСИНТЕЗА

а). Действие красного Фонового освещения на Фототаксис жгутиковых водорослей

Длинноволновая граница спектральной чувствительности Фототаксиса жгутиковых зодорослей находится в области 550- нм, и красный свет сам по сэЗэ не способен вызывать ориентированного движения этих микроорганизмов. "Однако включение дополнительного красного фонов'ого освещения существенно влияет на фототаккумуляцию клеток под действием сине-эеленсго Фоготаксически активного свата. В той или иней степэни это влияние было обнаружено у клеток все--.

.Исследованных штаммов зеленых водорослей, однако наиболее отчетливо эффект проявляется у клеток штаммов 494 (-) и 495 (+) Chiamydomonas reinhardtii после длительной темновой адаптации.

Сравнение результатов измерения скорости Фотоаккумуляции клеток у освещенной и удаленной от света стенок кюветы показывает, что включение красного фонового освещения вызываем быстрое изменение направления ориентированногр движения клеток с позитивного на негативное. Этот вывод подтверждается данными, полученными путем длительной регистрации движения одиночной клетки под микроскопом. Включение красного света приводит к тому, что клетка, движущаяся по направлении к источнику света (т.е., обладающая позитивным Фототаксисом), в течение 1—2 сек изменяет направление своего движения на противоположное - от источника света (Рис.2).

Длинноволновая граница эффекта стимуляции негативного

фототаксиса под действием красного фонового освещения находится в

области 700 им, т.е. совпадает с границей поглощения

Фотосинтетических пигментов й коротковолновой Формы Фитохрома.

Однако быстрая обратимость стимуляции негативного Фототаксиса

после выключения красного света и отсутствие эффекта предосвещения

•позволяет исключить участие Фитохромной системы. Вовлеченность

-фотосинтеза подтверждается величиной светового насыщения эффекта

2

красного Фонового освещения (около 2 Вт/м ) и чувствительностью его к DCMU.

Эффекты изменения знака Фототаксиса наблюдаются и при измерении Фотоаккумуляции клеток в отсутствие красного Фонового освещения. Характер спектральной зависимости Формы кинетических кривых фотоаккмуляции и чувствиТельнооть ее к DCMU отражает участие Фотосинтеза в стимуляцию негативного фототаксиса.

включении и выключении аналогично тому, как это Характерно для влияния красного Фонового" освещения на направление > движения индивидуальной клетки. Таким образом, можно заключать, что увеличение амплитуды Фоторецепторного тока в условиях, благоприятных для ' протекания Фотосинтеза, сопровождается изменением знака фототаксиса с позитивного на негативный,

На основании полученных данных можно сделать эывод, что один из механизмов влияния процессов Фо-тосинтеза на . Фоторегуляцию движения клетки заключается в контроле; з^чака ориентированного движения клетки при Фототаксисе.

б) Ритмическая двигательная активность одноклеточных жгутиковых водорослей и ее роль в Фототаксисе * !

Путем длительной регистрации движения индивидуальных клеток жгутиковых водорослей показано, что поступательное 'движение клеток как в отсутствие светового стимула,, так и при Фототаксисе, характеризуется явлениями самопроизвольного'изменения направления движения. Эти явления спонтанной переориентации существенно влияют на скорость перемещения клетки вдоль сои действующего света при Фототаксисе•

Анализ частоты переориентации клеток Haematococcus и Chiamydomonas reinhardtii, наблюдающихся в процессе позитивного Фототаксиса при низких интенсивностях действующего света, показал, что. средняя длительность временного интервала между двумя последовательными сменами направления движения клетки с позитивного на негативное находится в пределах 20-25 сек. При регистрации движения индивидуальных клеток часто наблюдаются аномально длительные интервалы, длительность которых равна

удвоенной или утроенной длительности нормального интервала, что проявляется - дополнительными . максимумами на гистограмме распределения длительностей.

Иногда При.регистрации движения одиночной клетки наблюдается характерное чередование белее коротких и более длиннух временных интервалов, которое может быть интерпретировано как. существование двух ритмических-процессов, близких по частоте, но сдвинутых: по Фазе. Включение фотосинтетически активного, но не выдающего Фототаксис красного-Фонового освещения (с длиной волны > 640 нм> приводит к увеличению частоты спонтанных реверсий направления движения клетки приблизительно в полтора раза как в отсутствие действующего света, так и при Фототаксисе». Наибольшей чувствительностью частоты спонтанны* переориентации к красному Фоновому освещению обладают клетки штамма 495 (+> Chi a.Tvriomonas reinbardtii, организма, знак Фототаксиса которого наиболее отчетливо контролируется Фотосинтезом.

Приведенные выше данные показывают, что при длительной регистрации движения одиночных клеток жгутиконосцев наблюдаются ритмические процессы изменения направления движения. Целый ряд особенностей этой ритмической двигательной активности

(длительность периода, характерное выпадение точек из периодической последовательности, пноже?отЕенность прослеживаемых ритмов, чувствительность к красному Фоновому освещению) позволяет заключить,' что она связана с работой той же контролируемой фотосинтезом системы цитоплазматических осцилляторов, обнаруженной ранее О.А.Синещековым и В.В.Судницыным в клетках Haematococcus pluvialis путем измерения периодической электрической активности и микродвижений протопласта-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ '

Изучение сбойств Фотоэлектрических сигналов, измеряемых в суспензии клеток жгутиковых водорослей при возбуждении короткими1 вспышками света (Sineshchekov, 1991), показало, что наряду с сигналами, отражающими работу Фотосинтетических реакционных центров, в суспензии клеток регистрируются сигналы, связанные с работой системы Фоторецепции жгутиконосцев (Фоторецепторный ток и регенеративная реакция), впервые обнаруженные 'методом микроэлектрс^дных измерений на индивидуальной клетке (Синещеков, 1978; Синещеков и др., 1978; Litvin и др., 1978). Измерение Фотоэлектрических реакций позволяет исследовать Фототаксис на уровне, максимально приближенном к Фоторецепторному пигменту и является, таким образом, наиболее адекватным методом изучения его химической природы in vivo. В отличие от микроэлектродйого, суспензиальмый метод измерения Фотоэлектрических реакции позволяет исследовать не только первичные процессы преобразования светового стимула, но и последующий двигательный ответ клеток при Фототаксисе.

При выполнении данной работы метод Фотоэлектрических измерений в суспензии был применен для исследования эффекта добавления экзогенного all-trans ретиналя и его аналогов на Фоторегуляцию движения клеток бескаротиноидных мутантов Chiamydomonas reinhardti i. Было показано, что добавление наномолярных концентраций ретиналя приводит к быстрому и полному восстановлению у мутантных клеток способности к генерации Фоторецепторного тока и регенеративной реакции, а также к ориентации клеток под действием света. Эти данные свидетельствуют о том, что в нашем случае именно реконструкция Фоторецепторного пигмента, а не встраивание ретиналя в антенные структуры или его

неспецифические эффекты являются причиной оосстановлония Фототаксиса мутантных клеток.

Изучение действия гидроксиламина (агента, вызывающего светоэависимое отщепление хромофорной группы от

ретиналь-содержащих белков) на Фотоэлектрические реакции, связанные с Фототаксисом жгутиковых водорослей, было проведено методом одиночной клетки для Haematococcus и суспензиальным методом для Chiamydomonas reinhardtii. Полученные результаты позволяют заключить, что светоэависимое подавление гидроксиламнноп Фототаксиса, обнаруженное в данной работе у Haematococcus и описанное в литературе у Chiamydomonas reinhardtii, связано с действием этого агента на Фоторецепторный пигмент, а не п нарушением более поздних стадий трансдукцми светового стимула.

Таким образом, полученные в работе данные указывают на то, что восстановление Фототаксиса бесн аротнноидньг; мутантов послр добавления экзогенного ретина л я и подарление Фото г ако tea жгу.гиковых водорослей гидроксилапиноп отражают свойства и--Фоторецепторного пигмента. Строгое доказательство этого имеет большое значение для экспериментального обоснования высказанной ранее гипотезы о родопсиновой природе Фоторецепторного пигмента Фототаксиса жгутиконосцев исследуемой группы (Foster и Smyth, 1984).

Особенности сигналов, регистрируемые в суспензии клеток' бескаротиноидных мутантов после добавления экзогенного хромофора, свидетельствуют о том, что, по всей вероятности, эти клетки (не обладающие нормальными стигмой и хлоропластом) используют для определения направления светового потока "эффект линзы". Такой принцип работы Фоторецепторного аппарата известен у грибов и был теоретически предсказан (хотя экспериментально не об* гружен) и в

•случае1 "кгч'тн^'оноснёв.' "

На ссноиаиии исследований Фототаксиса Сесстигменны^ мутантов, выгюлир»нньг: в ' данной работе', показано, что роль стигмы (ькиюл няющ£уй' Функцию 'антенны ' у клеток нормального пигментного состава* заключается"'' не "ч просто в увеличении точности Фототакс» 1ческой ориентации клеток , как это 'описано в" литературе, но и -о существенном Сдвиге спектральной чувствительности Фототаксис*. • • '''

Изучение эффекта дополнительного красного Фонового освещения на Фототаксис жгутиковы водорослей показало, что Формирование двигательного 'Ответа клетки происходит при участии не только собственно системы • Фоторецепции, обеспечивающей ориентацию клеток в соответствии с направлением светового потока, но и независисмой от нее системы контроля знака Фототаьсиса (т.е., движения клетки к источнику освещения или от него >. Свойства системы контроля знак а (уровень светового насыщения эФФен та красного Фонового освещения, положение длинноволновой границы ого спектральной

чувствительности, его быстрая обратимость и .•••арактер действия DCMU) указывают на то, что функционирование этой системы связано с процессами Фотосинтеза.

Приведенные б работе данные указывают на то, что один из механизмов влияния Фотосинтеза на Фоторегуляцию движения клеток жгутиковы.:. водорослей связан с контролируемой Фотосинтезом системой эндогенных цитоплазматических осцилляторов, обнаруженной ранке при измерении периодической электрической активности (Синещеков и др., 1984; Судницын, 1989) и микродвижений протопласта (Синещекоь и др., 1988) Фиксированной на присоске клетки Haematococcus pluvialis. Эта особенность Фототаксиса жг/тикозыу водорослей напоминает более примитивные

, ТИПА.,

ВЫВОДЫ, . , .

1. Изучение особенностс-й Фотоэлектрически , сигналов, регистрируемы.-:: в суспензии клеток *гути».пбы ; водорослей ■ при. возбуждении короткими вспышками rnera, ползало,- . что суопензиальный метод Фотоэлектрически •. измррэнии поиволяот исследовать как первичные стадии Фогстецептормого акта, так и последующий двигательный ответ (Фототаксическую . ориентацию клеток). ....

2. Методом Фотоэлектричсс^ и : измерении г. суспршии клеток установлено, что добавл^ни^ ]-trans ретиналч (a тан же г-гр аналога , димстил-октат рирнаяп > к суспензии и ло»ток г.сп аро гиноидны мутантов Chi ainydomonas reí nhardt i з приводит ^ и пппс ганок /н;»ни№ у. i-легок эти- мутантов способности . грнррирова гь Фото э лек гримгзски?? реакции, характерные- для работы системы Фотпрецегшми клеток нормального пигментного соцтлг-л, .и пп«в лению опосгы юоти -к нормальной Фототаксической орнент лции у му г am ны.. к л о i г:п .

3. Сравнительное исследовании действия г и дрок, силамина (агента, вызывающего оттспленир ■••ромоФорной группы. , от ретиналь-содержащи--: белков) на Фототаксис „ .и Фотороцептарный toi индивидуальны-; клеток: жгутиковые водорослей рода Hac?mat ос ос с и <5 (Н. pluvialis и Н. lacustrisi, а гакже на Фотоэлок'трич^с> ир реакции и суспензии клеток Chi amydomonas reí nhardti i , по азало, что чувствительность Фототаксиса жгутикоиы • . водорослей , к. гидр окси л амину при освещении обусловлена □ личнием э т ого вещест*за непосредственно на Фоторец*?пторный пигмент,, -л не связана о действием агента на более поздние стадии транедукции . ,спртового

стимула.

4. Совокупность данных, приведенных в пунктах 2) и 3), представляет собой новое экспериментальное свидетельством" пользу гипотезы о родопсиновой природе Фоторецепторного пигмента Фототаксиса жгутиковых иодорослей, что указывает на сходство этого процесса с процессами зрения животных и Фоторегуляции движения галобактерий.

5. Сравнительное исследование Фототаксиса клеток бесстигменного мутанта Chlamydomonas reinhardtii и клеток дикого типа показало, что стигма (выполняющая функцию антенны Фоторецепторного комплекса клеток жгутиковых водорослей) играет сутестгенную роль в определении спектральной чувствительности Фототаксиса.

6. Изучение действия Фотосинтетически активного красного Фонового освещения (£>40-700 нм) на фоторегуляцию движения клеток Chlamydomonas reinhardtii показало, что знак ориентированного движения клеток при Фототаксисе находится под контролем Фотосинтеза, причем изменение знака Фототаксиса с позитивного на негативный в условиях интенсивного Фотосинтеза соответствует увеличению амплитуды Фоторецепторного тока, регистрируемого в суспензии клеток.

7. Путем длительной регистрации траектории движения индивидуальных клеток жгутиковых водорослей обнаружена ритмическая двигательная активность, выражающаяся в периодическом спонтанном изменении направления движения клеток и влияющая на Фототаксис. Целый ряд особенностей этой ритмической активности свидетельствует о том, что она отражает работу контролируемой Фотосинтезом системы эндогенных цитоплазматических осцилляторов, обнаруженной ранее у клеток Haematococcus pluvialie путем регистрации периодической

электрической активности и пикродвижений протопл<аста :эти- клеток.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Синецеков O.A. , Говорунова Е.Г. , Литвин 'Т'.Ф. Роль |>отосинтетического аппрата и стигмы в Формировании спектральной чувствительности фототаксиса жгутиковых водорослей. Биофизика, 1989, т.34, вып.2, с.255-258.

2. Синещеков O.A., Говорунова Е.Г. , Литвин 'Т'.Ф. Роль эндогенны-: периодических процессов в Фототаксисе жгутиковые »одорослей. Материалы VI Всесоюз. симпозиума "Механизмы сенсорной эецепции", Москва, 1988, с. 13.

3. Говорунова Е.Г., Синещеков O.A., Литвин Ф.Ф. Подавление ^ототансиса зеленых жгутиковых водорослей агентами, ингибирующими ^ГМ?'—зависимый путь трансдукции зрительного сигнала. Там же, п. 14.

4. Синещеков O.A., Говорунова Е.Г. , ,Литвин Ф.Ф. ^одспсинсодержащий фоторецептор Haematococcus : и лишние "идроксиламина на Фотоэлектрические реакции и Фототаксис 17К?ток. енсорные системы, 1991, т.5, N1, с.51-55.

5. Синещеков O.A., Говорунова Е.Г., Литвин Ф.Ф. Ритмическая • вигательная активность одноклеточных жгутиковых водорослей и еэе оль в Фототаксисе. Биофизика, 1991, т.36, вып.4, с.603-607.

6. Sineshchekov Q. А. , Govorunova E.G., Der A., fosrthplyi L., lui tsch W. Photoel ect i с responses in phototactic -flaqellated alqae easured in cell suspension. J. Rhotochem. F'hotobiol. B: Biol., 992» v.13, p. 119-134.

7. Sineshchekov O.A., Govorunova E.G., Der A., Kessthelyi L. :etinal-induced photoelectric responses in Ch1amydomonas einhardtii "blind" mutants. Proceedinqs o-f V Int. Conf. on eti nal-contai ning proteins, Dourdan, France, 1992.

1793-100