Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие живых компонентов в системе искусственного воспроизводства черноморского калкана

ВАК РФ 03.02.10, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие живых компонентов в системе искусственного воспроизводства черноморского калкана"

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ЮЖНЫХ МОРЕЙ им. А. О. КОВАЛЕВСКОГО

РАУЭН ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

УДК 639.3:597.556.35

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЖИВЫХ КОМПОНЕНТОВ В СИСТЕМЕ ИСКУССТВЕННОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА ЧЕРНОМОРСКОГО КАЛКАНА (SCOPHTHALMUSMAEOTICUS) (PISCES: SCOPHTHALMIDAE)

03.02.10 - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание научной степени кандидата биологических наук

'i и 2014

Севастополь - 2014 005553932

005553932

Диссертация является рукописью

Работа выполнена в Институте биологии южных морей им. А. О. Ковалевского

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

Ханайченко Антонина Николаевна

Институт биологии южных морей им. А. О. Ковалевського, старший научный сотрудник отдела аквакультуры и морской фармакологии

Лищук Алефтина Викторовна

Институт гидробиологии HAH Украины вед. научный сотрудник отдела экологической физиологии водных растений

кандидат биологических наук, доцент, Киселёва Галина Александровна Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского доцент кафедры экологии и рационального природопользования

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

Защита состоится <;

Защита состоится <; 014 г. в «//^» часов на заседании

специализированнс ,, .214.01 Института биологии южных морей

им. А.О. Ковалевского по адресу: пр. Нахимова, 2, г. Севастополь,

299011 РФ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии южных морей им. А.О. Ковалевского по адресу: пр. Нахимова, 2, г. Севастополь,

299011 РФ

Автореферат разослан «_ j2/ 2014 г.

г.

Учёный секретарь

специализированного учёного совета Д 50.214.01 кандидат биологических наук

Н.В. Поспелова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Камбала калкан Scophthalmus maeoticus (Pallas, 1814) -традиционный промысловый объект черноморского региона, запасы которого в последнее время значительно снизились. Для восстановления вида необходима организация его промышленного воспроизводства. Учитывая мировой опыт культивирования камбалообразных, можно утверждать, что калкан является высокотехнологичным объектом товарного выращивания. Однако данный вид относят к проблемным объектам марикультуры, так как до сих пор существуют некоторые ограничения его искусственного вопроизводства, в частности: 1. Необходимость использования живых кормовых организмов (КО) - микроводорослей, коловраток, артемий, технологии выращивания которых требуют оптимизации; 2. Вероятность высокой смертности личинок, обусловленной бактериальными контаминациями сред выращивания и отсутствием адекватных методов снижения численности бактерий в них; 3. Низкая выживаемость искусственно выращенной молоди при зарыблении, обусловленная отсутствием её предварительной адаптации к естественной среде обитания. Актуальность данной работы заключается в необходимости изучения взаимодействия живых компонентов (микроводоросли, зоопланктон, бактерии, икра, личинки) в системе искусственного воспроизводства калкана и исследования экологических и этологических особенностей его мальков с целью повышения эффективности выращивания данного вида рыб. Оптимизация культивирования кормовых организмов калкана, разработка комплекса мер по снижению бактериальной контаминации сред выращивания и принципов адаптации молоди к естественным условиям перед зарыблением позволят как повысить эффективность её выращивания для товарного производства, так и увеличить численность данного вида рыб в Черноморском регионе за счет восполнения его естественной популяции адаптированной, жизнестойкой молодью при зарыблении.

Связь работы с научными программами, планами, темами. Диссертационная работа выполнена в отделе аквакультуры и морской фармакологии Института биологии южных морей им А.О.Ковалевского в соответствии с научно-исследовательской тематикой, программами НАНУ и МОН Украины: «Исследование факторов поддержания устойчивости морских экосистем» (№ ГР 0103U001048; 2003-2007 гг.); «Изучение функционирования морских биотехнологических комплексов и их взаимодействия с окружающей средой» (№ ГР OI06U00I586; 2006-2010 гг.); «Систематизированный анализ и комплексная оценка современного состояния изученности биологических ресурсов Азово-Черноморского бассейна и перспектив развития марикультуры, ресурсных био-и нанобиотехнологий» (№ ГР 0107U008034; 2007-2009 гг.); «Экологические взаимодействия в биотехнологических комплексах» (№ ГР 0111U00154; 2011-2015 гг.); «Проведение комплексных экологических, гидробиологических и биотехнологических исследований с целью решения фундаментальных и прикладных проблем постоянного использования ресурсного потенциала, восстановления и сохранения морского биоразнообразия и качества морской среды Азово-

Черноморского региона» (№ ГР 0110U006203; 2010-2012 гг.). В перечисленных темах соискатель участвовал в качестве исполнителя.

Цель н задачи исследования. Цель работы - усовершенствовать технологии культивирования черноморского калкана, изучив взаимодействие живых компонентов в системе его искусственного воспроизводства. Цель работы определила следующие задачи:

• Определить влияние пищевой адаптации на селективность питания коловраток Brachionus plicatilis и их продукционные показатели при питании микроводорослями различных таксономических групп;

• Выявить влияние хлорамфеникола, микроводорослей и их фильтратов на численность бактерий в среде культивирования микроводоросли Isochrysis galbana, коловраток Brachionus plicatilis, ракообразных Artemia salina, икры и личинок-калкана;

• Изучить влияние микроводоросли Chlorella vulgaris на интенсивность бактериальной колонизации поверхности науплиев артемии;

• Сравнить воздействие озона и микроводоросли Chlorella vulgaris на численность бактерий в среде инкубации икры калкана и интенсивность бактериальной колонизации поверхности икринок;

• Разработать схему адаптации выращенных мальков калкана к выпуску в естественную среду, и с этой целью:

• Оценить усвояемость инертных (фарш кальмара, ставриды), и живых (артемия, копеподы, нереис, гаммариды) кормов и размерную избирательность гаммарид выращенной метаморфизированной молодью калкана;

• Определить термопреферендум выращенной молоди калкана, длительность её адаптации и формирования естественных поведенческих реакций при внесении субстрата, свойственного природному биотопу.

Объект исследования — культуры одноклеточных микроводорослей: Chlorella vulgaris Beijer., 1890, Platymonas viridis Rouch, Dunaliella salina, Teod., 1905, Thalassiosira weissflogii (Grunow) G. Fryxell et Hasle, 1977, Isochrysis galbana Parke, 1949, Phaeodactylum tricornutum Bohlin, 1897; коловратки Brachionus plicatilis Müller, 1786; артемия Artemia salina Linnaeus, 1758; гетеротрофные бактерии; икра и личинки Scophthalmus maeoticus Pallas, 1814.

Предмет исследования - трофические и микробиологические аспекты культивирования личинок калкана и их кормовых организмов. Формирование норм естественных поведенческих реакций у искусственно выращенной молоди калкана.

Методы исследования: методы культивирования гидробионтов разработанные в отделе аквакультуры и морской фармакологии, традиционные методы сбора материала, применяемые в ихтиологии; цитометрические методы определения размерных характеристик и численности клеток микроводорослей и бактерий; методы определения численности и биомассы фито- и зоопланктоных организмов (Lavens, 1996); световая и эпифлуоресцентная микроскопия, микро-видеосъёмка; статистические методы анализа данных Excel 7.0, Grapher 2.0).

Научная новизна работы. Впервые выявлено влияние предварительной пищевой адаптации коловраток В. plicatilis к определенному виду микроводорослей на селективность их питания. Определены основные продукционные показатели В. plicatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп, подобраны виды микроводорослей, повышающие продукцию коловраток в короткие сроки, что позволяет оптимизировать методику их культивирования. Впервые разработана новая эффективная методика применения микроводоросли Ch. vulgaris и её фильтрата в качестве антибактериального средства на основных, проблемных в микробиологическом отношении, ранних этапах культивирования калкана и его кормовых организмов. Впервые разработаны основные принципы подготовки выращенной жизнестойкой молоди калкана к естественным условиям обитания перед её выпуском в море.

Практическое значение работы. Полученные результаты и разработанные на их основе рекомендации вносят значительный вклад в решение актуальных проблем культивирования черноморского калкана, связанных с технологическими ограничениями в общепринятой методике производства данного вида.

Введение в рацион коловраток микроводоросли Ph. tricornutum в комплексе с предварительной трофической адаптацией животных к данному виду фитопланктона позволит оптимизировать технологию выращивания В. plicatilis, значительно повысив их продукционные показатели.

Предложенный метод использования микроводорослей Ch. vulgaris с целью снижения численности бактерий в средах выращивания личинок калкана и их кормовых организмов представляется перспективным, поскольку является доступным, эффективным и позволяет снизить риск, сопряженный с применением антибиотиков.

Данные, полученные при исследовании питания, калорийности и усвояемости различных видов корма мальками калкана, являются основой для составления рациона, позволяющего повысить иммунитет, нарастить мышечную массу и выработать навыки пище-поисковых реакций у молоди, подготавливаемой к выпуску в море.

Разработанная оригинальная методика подготовки искусственно выращенных мальков черноморского калкана к выпуску в естественные места обитания позволит повысить процент их выживаемости в природе и восполнить естественную популяцию данного вида рыб.

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно осуществлены все этапы научного исследования: формулировка задач, выбор методов, анализ материалов по биологии, экологии микроводорослей, коловраток и личинок калкана. В диссертации использованы материалы, полученные при активном участии автора в экспериментальных сезонах по искусственному выращиванию камбалы калкан с 2006 по 2013 гг. Диссертант принимал непосредственное участие в проведении экспериментальных работ с икрой, личинками и мальками черноморского калкана, культивировании 8 видов микроводорослей и коловраток В. plicatilis; получении и содержании науплиев артемий. Все экспериментальные исследования были выполнены диссертантом при консультациях с его научным

руководителем. При консультативной помощи с.н.с. отдела физиологии животных и биохимии ИнБЮМ, к.б.н. 3. А. Романовой освоен метод оценки калорийности и усвояемости различных видов корма.

В процессе подготовки к исследованиям по определению влияния различных методов снижения численности бактерий в средах инкубации икры и выращивания личинок калкана автором освоен современный метод проточной цито-метрии. Цитометрические исследования динамики численности микроводорослей и бактерий в средах выращивания личинок калкана и его кормовых организмов проводились автором при совместной работе с сотрудниками отдела планктона ИнБЮМ: зав. лаб. микропланктона к.б.н. В. С. Мухановым и вед. инж. С. С. Свининым.

Апробация результатов дисертации. Основные положения работы были доложены на международных научных конференциях и семинаре: конференциях молодых ученых Pontus Euxinus V, VI, VII, VIII (Севастополь, 2007, 2009, 2011, 2013); II международной научно-практической конференция «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов» (Борок-Москва, 17-20 июля 2007 г.); Международном научно-техническом семинаре «Системы контроля окружающей среды - 2010», (Севастополь, 13-17 сентября 2010 г.);; II всеукраТнськш науково-практичнш конференщ'1 студент]в та молодих вчених: «Актуальш проблеми та перспективи розвитку природничих наук» (Запорожье, 20 мая 2011 г.); II международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых: «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии» (Донецк, 19-22 сентября 2011 г.); World Conference on Marine Biodiversity 2011 (Aberdeen, Scotland (UK), 26 - 30 September 2011); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломо-носов-2013» (Севастополь, 25 -26 апреля 2013 г.)

Публикации. Основные результаты диссертационной работы отражены в 17 публикациях. Из них 5 статей (1 без соавторов и 4 - с соавторами) опубликованы в специализированных изданиях, рекомендованных ВАК; 2 статьи - в других журналах, 9 тезисов конференций, 1 патент. В статьях, опубликованных в соавторстве, вклад соискателя состоял в постановке задач, разработке методики исследования, активном участии в анализе полученных результатов и написании текста статьи. Права соавторов публикаций не нарушены.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 5 разделов, заключения, выводов и списка использованных источников (49 отечественных и 104 иностранных). Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, иллюстрирована 61 рисунком и 8 таблицами.

Благодарности. Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю к.б.н. А. Н. Ханайченко за всестороннюю помощь и интерес к работе, зав. лаб., к.б.н. В. С. Муханову за совместно выполненную часть исследований, постоянную помощь и поддержку в написании работы. За научные консультации проф. д.б.н. А. В. Гаевской, проф. д.б.н. Ю. Н. Токареву, к.б.н. В. И. Холодову, к.б.н. В. Е. Гирагосову, к.б.н. Ю. В. Корнийчук, зав. науч. библ О. А. Акимовой. н.с. J1. А. Манжос. За помощь в проведении экспериментов автор благодарен к.б.н. 3. А. Романовой, вед. инж. Д. В. Ельникову. За ценные советы

и дружескую поддержку автор искренне признателен всему коллективу отдела аквакультуры и морской фармакологии, отдела планктона и сотрудникам других отделов ИнБЮМ.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ АНАЛИЗ ЛИТЕРАТУРНОГО МАТЕРИАЛА

Проанализированы литературные данные по состоянию популяции черноморского калканаХ maeoticus Pallas, 1814 и его биологическим особенностям. Освещен опыт и перспективы искусственного выращивания этого вида. Охарактеризованы живые кормовые организмы, используемые в технологической схеме культивирования калкана: микроводоросли, коловратки, артемии, приведены аспекты их применения. Перечислены основные проблемы выращивания молоди камбалообразных: а) повышение эффективности культивирования живых кормов, б) бактериальная контаминация сред выращивания личинок и их кормовых организмов, в) высокая смертность неадаптированной искуственно выращенной молоди при выпуске в естественные места обитания. Подчёркнута необходимость оптимизации технологии культивирования калкана и его кормовых объектов путём решения перечисленных проблем.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в период сезонных работ 2006 - 2007, 2009 - 2013 гг. в отделе аквакультуры и морской фармакологии ИнБЮМ НАНУ. В ходе исследований обработано 2130 проб. В разделе описаны использованные в работе методические подходы, методы проведения биологических и физиологических экспериментов, культивирования живых организмов, водоподготовки и т.д

В экспериментах были использованы культуры микроводорослей Dimaliella salina, Isochrysis galbana, Phaeodactylum íricornutum, Chlorella vulgaris, Platymo-nas viridis, Thalassiosira weissflogii, которые выращивали в накопительном режиме на среде Уолна (Coutteau, 1996) при температуре 24±1°С. Освещение (5 тыс. люкс) осуществляли круглосуточно с помощью люминесцентных ламп LD - 40 Партеногенетический клон коловраток В. plicatilis культивировали в накопительном режиме при постоянном освещении и температуре 24±1°С. Цисты артемии инкубировали при температуре 28°С, при плотности посадки 5 мг сыр. мас-сы-л"1.

Икру и сперму для оплодотворения получали от диких производителей черноморского калкана. Оплодотворение производили при температуре не превышающей 13 °С в объемном соотношении икры: спермы: морской воды -100:0,5:50. Икру инкубировали в емкостях при пониженном освещении, в аэрируемой воде. Плотность посадки икры составляла 1 - 3 тысячи экз-л"1, температуру постепенно повышали от 15 °С непосредственно после оплодотворения до 17 °С перед выклевом.

Для экспериментальных работ использовали подготовленную морскую воду (ПМВ), которую после грубой очистки и отстаивания, последовательно фильтровали через картриджные фильтры (с размером пор от 10 до 1 мкм), и обрабатывали ультрафиолетом (рис. 1). Для обработки среды инкубации икры (СИИ) озоном использовали водный озонатор Hailea.

Основные продукционные показатели коловраток (прирост численности, скорость фильтрации и потребления пищи, рацион, удельная скорость и валовая эффективность роста численности) при питании различными видами микроводорослей определяли по стандартным формулам (Заика, 1983; Frost, 1972). Численность планктонных организмов (коловратки, артемии, икра) определяли прямым подсчетом с помощью камеры Богорова и бинокуляра.

Численность и размеры клеток микроводорослей и бактерий определяли с помощью проточного цитометра Cytomics™ FC 500. Пробы с бактериями предварительно окрашивали флуоресцентным маркером SYBR Green (Marie, 1997). Сырую массу микроводорослей (сыр. массу) рассчитывали с учётом размеров их клеток. Калибровку цитометрических данных осуществляли микроскопическим методом, учитывая морфологию клеток каждого из видов микроводорослей (Сеничкина, 1978).

1......

H ______ ; Систематомкон очисткии

ьшлейн psxmam j гщ,тт„фящт.

¿J. ;-J

п п

Трубопровод системы раздачи

Центробежный

внутренней перекачки

Центробйжны й

насос закачщиз мщ»п

Бассейн накопителi,-отстойник

Механический фитяр »рубой очистки

Рис. 1 Схема водоподготовки в системе искусственного выращивания личинок камбалы калкан (Ельникова Д. В. 2006).

Фильтраты моновидовых культур микроводорослей, выращиваемых на жидкой питательно среде, готовили с помощью нитроцеллюлозных мембран с диаметром пор 0,2 мкм.

Интенсивность бактериальной колонизации (ИБК) покровов организмов определяли, анализируя данные микрофотосъемки в люминесцентном режиме микроскопа Nikon Eclipse со встроенной видеокамерой. Организмы предварительно окрашивали флуоресцентным маркером SYBR Green. Измерения цветовых характеристик окрашенной поверхности науплиев артемий проводили с помощью программного обеспечения Image Region Color (Дзитский, 2011). Изображения икры обрабатывали в программе ImageJ 1,45s (Collins, 2007) по единому алгоритму.

Вклад /--стратегов (видов-оппортунистов) в общую бактериальную микрофлору оценивали после высева проб на питательную среду М65, позволяющую сравнивать пробы по активности быстрорастущих бактерий в соответствии с методикой (Salvesen, 2000).

В экспериментах по разработке принципов адаптации молоди к естественным условиям среды перед зарыблением использовали молодь калкана в возрасте 2,5 - 3,5 мес., выращенную в лабораторных условиях.

Калорийность кормов (артемии, кальмара, ставриды, гаммаруса, копепод, нереиса) и фекалий мальков определяли методом мокрого сжигания (Винберг, 1968). Усвояемость кормов молодью калкана определяли по процентному отношению разности калорийности корма и калорийности фекалий к калорийности корма.

В экспериментах по определению избирательности гаммарид молодью калкана использовали одновозрастных мальков в возрасте 2,5-3 месяцев, выращенных в искусственных условиях. Гаммариды Echinogammarus olivii Milne-Edwards, 1830 были отловлены в зоне потенциальных мест выпуска. Избирательность калканом каждой размерной группы гаммарид определяли, используя показатель элективности (Ивлев, 1977).

При внесении субстрата (кварцевый песок) определяли время, необходимое для формирования навыков камуфляжных и пищепоисковых реакций молоди калкана. Критериями успешной адаптации калкана являлись: полное соответствие окраски покровов тела окраске грунта, результативное зарывание в песок, характер и результативность атак на внесенных в среду жертв (мальков атерины; морской иглы). Избирательность температурного режима молодью калкана определяли, фиксируя распределение мальков в течение недели в бассейне с искусственным градиентом температуры воды в диапазоне 19-23 °С.

ПРОДУКЦИОННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ И СЕЛЕКТИВНОСТЬ ПИТАНИЯ КОЛОВРАТОК BRA С НЮ N US PLICATILIS ПРИ ПИТАНИИ МИКРОВОДОРОСЛЯМИ РАЗНЫХ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ГРУПП

Данный раздел диссертации посвящен повышению эффективности культивирования коловраток путем оптимизации трофических условий их выращивания. Определены продукционные показатели В. pUcatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп и влияние пищевой адаптации на видовую и размерную селективность их питания.

Максимальная численность коловраток в накопительной культуре на моновидовой диете была получена при их питании клетками Ph. tricornntum (рис. 2 А), при этом скорость потребления Ph. tricornutum коловратками была достоверно ниже, чем скорость потребления других микроводорослей (рис. 2 Б).

Удельная скорость и эффективность роста численности коловраток оказались максимальными при их питании клетками Ph. tricornutum, минимальными -при питании клетками I. galbana (табл. 2), что соответствовало максимумам данных показателей для В. plicatilis (Kureha, 1979; Галковская, 1988).

Анализ влияния предварительной трофической адаптации коловраток к потреблению одного из видов микроводорослей I. galbana, D. salina и Ph. tricornutum на селективность их питания в смеси данных видов показал, что в каждой из адаптационных групп скорость потребления Ph. tricornutum была максимальной, a D. salina - минимальной, т.е. коловратки избирательно питались Ph. tricornutum (рис. 3).

Таблица 2

Продукционные показатели и рацион В. plicatilis_

Продукционные показатели D. salina Ph. tricornutum !. galbana

Удельная скорость роста численности (сут1) * за период 1 - 3 сутки 0,78 0,96 0,16

Эффективность роста К/ (%) 19,8 21,в 11,3

Однако скорость потребления каждого из видов микроводорослей коловратками из разных адаптационных групп отличалась: скорость потребления коловратками клеток I. galbana была выше в группе, которая была адаптирована к этому виду (1,7-103 кл-экз^-ч'1) (рис. 3 А). Такую же зависимость наблюдали и в группе, адаптированной к Ph. tricornutum, где скорость потребления клеток Ph. tricornutum также была выше, чем в других группах (2,1-103 кл-экз"' ч"') (рис. 3 В).

Сутки Сутки

Рис. 2 Динамика численности В. plicatilis (А) и биомассы микроводорослей в контроле (прерывистые линии) и опыте (сплошные линии) (Б) при питании коловраток микроводорослями D. satina, /. galbana и Ph. tricornutum

Таким образом, определено, что на монодиете при равных стартовых биомассах микроводорослей более высокие показатели прироста численности и эффективности роста коловраток были получены при питании Ph. tricornutum, наиболее низкие - при питании /. galbana. При содержании коловраток в смеси

микроводорослей животные также отдавали предпочтение Р!г. /псогпШит, а предварительная трофическая адаптация увеличивала скорость потребления коловратками клеток микроводорослей, к которым они были адаптированы. Предварительная трофическая адаптация коловраток может быть рекомендована с целью увеличения скорости их питания, а использование Рк. IпсогпиШт - с целью повышения продукционных показателей В. рИсайНз.

2.5-

о 1.5-

1 -

Ü0.5-

О

I

120

240 Время, мин.

—I— 360

2.5 ■

2 -

о 1.5-

а ®

; 0.5 ■

О

480

120 240

Время, мин.

360

480

Рис. 3 Скорость потребления клеток микроводорослей коловратками в смеси Ph. tricornutum (phaeo), I. galbana (iso), D. salina (dun) адаптационными группами А (адаптированная к I. galbana), Б (адаптированная к D. salina), В (адаптированная к Ph. tricornutum)

КОНТРОЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КОНТАМИНАЦИЙ В СИСТЕМЕ ВЫРАЩИВАНИЯ КАЛКАНА И ЕГО КОРМОВЫХ ОРГАНИЗМОВ

В данном разделе приводятся данные, полученные в результате экспериментов по определению эффективности различных методов снижения численности бактерий (антибиотики, микроводоросли, озонирование) в средах выращивания личинок и их кормовых организмов.

Применение хлорамфеникола при культивировании микроводорослей I. galbana и коловраток В. plicatilis.

Хлорамфеникол - синтетический антибиотик широкого спектра действия часто используемый в аквакультуре. Данные о его эффективности, степени токсичности и методике применения противоречивы. В работе исследовано влияние хлорамфеникола на численность бактерий в среде культивирования кормовых объектов калкана микроводорослей и коловраток - потенциальных векторов передачи патогенных бактерий личинкам.

Влияние различных концентрациГ! хлорамфеникола на физиологическое состояние клеток микроводорослей I. galbana и динамику численности бактерий в их среде. Установлено, что все концентрации хлорамфеникола (5 - 500 мг л"1) оказывали токсическое действие на клетки микроводорослей, что проявлялось в достоверном увеличении доли клеток с низким содержанием хлорофилла (НСХ-клеток) относительно контроля, не содержащего антибиотик (рис. 4 Б). Степень токсического эффекта была пропорциональна концентрации препарата.

40-J --1-¡-1-1-,-г О ' I-i-1-Г--1-!-!

о ■> 4 6 0 1 2 3 4 5 6

Сутки с>",ки

Рис. 4 Динамика численности бактерий (% от контроля) в культуре I. galbana при разных концентрациях хлорамфеникола (А) и доли НСХ-клеток в общей численности микроводорослей (Б) в культуре I. galbana при разных концентрациях хлорамфеникола

Численность бактерий в среде I. galbana при добавлении хлорамфеникола снижалась (рис. 4 А). Зависимости бактерицидного эффекта от концентрации антибиотика выявлено не было. При всех исследованных концентрациях численность бактерий на шестые сутки снижалась приблизительно на 50% относительно контроля, т.е. около половины численности бактерий, по-видимому, составляли штаммы, не чувствительные к воздействию хлорамфеникола.

Динамика численности бактерий в среде с коловратками при их питании клетками I. galbana, обработанными хло-рамфениколом. Добавление культуры I. galbana, обработанной хлорам-фениколом (концентрация - 5 мгл"1, экспозиция 24 ч), в среду культивирования коловраток не оказывало токсического эффекта на животных. В течение всего эксперимента численность бактерий в среде В. plicatilis при добавлении обработанной культуры I. galbana была достоверно ниже, чем в контроле (рис. 5А), а прирост численности коловраток в этих сосудах был несколько выше такового в контроле (рис. 5 Б). Однако достоверной разницы прироста численности коловраток не наблюдали.

Рис. 5 Динамика численности бактерий в среде выращивания коловраток (А) и численности В. plicatilis, питающихся необработанными и обработанными хло-рамфениколом микроводорослями I. galbana (Б)

Таким образом, токсическое воздействие хлорамфеникола на клетки I. galbana и его незначительный антибактериальный эффект ставит под сомнение целесообразность применения данного антибиотика при культивировании микроводорослей. Однако, методика одноразовой обработки культуры I. galbana хлорамфениколом (5 мг-л"1. экспозиция 24 ч) перед кормлением коловраток может быть рекомендована к использованию для снижения численности бактерий в среде. Негативные последствия использования антибиотика (возможность появления резистентных клонов бактерий, накопления препаратов в аква-культурной продукции, загрязнения окружающей среды) обуславливают необходимость поиска альтернативных методов снижения численности бактерий в среде выращивания.

Влияние микроводорослей и их фильтратов на рост бактериальной микрофлоры в средах инкубации икры и личинок калкана.

Альтернативой использования антибиотиков с целью снижения численности бактерий в средах выращивания марикультурных объектов является применение микроводорослей, обладающих антибактериальным эффектом. Нами исследовано наличие возможного антибактериального эффекта у различных видов микроводорослей: Ch. vulgaris, D. salina, P. viridis, I. galbana, Т. weissflogii и их фильтратов на начальных этапах культивирования калкана, когда проблема бактериальных инфекций стоит наиболее остро.

Влияние смеси микроводорослей Ch. vulgaris и Р. viridis на численность бактерий в среде инкубации икры калкана. Анализ динамики численности бактерий в среде инкубации икры в контрольных (без) и экспериментальных (с добавлением смеси микроводорослей) сосудах показал, что с первых суток рост бактерий происходил во всех сосудах, включая контроль. Однако численность бактерий в сосудах с добавлением смеси Ch. vulgaris и Р. viridis была достоверно ниже до выклева личинок, что указывало на выраженный антибиотический эффект микроводорослей (рис. 6).

3 s

!*• I

1 4

2

Ъ

1>

Рис. 6 Динамика численности бактерий в сосудах с икрой калкана с добавлением микроводорослей (контроль) и без (опыт) до и после выклева личинок.

С начала эксперимента вплоть до выклева соотношение клеток Ch. vulgaris и Р. viridis в экспериментальных сосудах составляло 3:í. Выклев личинок (5-е сут.) спровоцировал нарушение этого баланса. Численность клеток Р. viridis не изменилась, а численность клеток хлореллы снизилась в два раза с 20-10 кл'мл"1, до 10-103 кл-мл"1. Одновременно снижался антибиотический эффект смеси микроводорослей, который выражался в росте численности бактерий в сосудах со смесью (рис. 6). Очевидно, что антибактериальный эффект в экспериментальных сосудах был связан, прежде всего, с хлореллой, поскольку прослеживается связь между снижением численности клеток данного вида микроводорослей и одновременным ростом численности бактерий.

Влияние микроводорослей Ch. vulgaris, D. salina, Р. viridis, I. galbana и Т. weissflogii на микрофлору среды с личинками калкана на стадии эндогенного питания. В среде с эндогенно-питающимися личинками в контрольных сосудах до третьих суток (открытие рта у личинок) численность бактерий изменялась незначительно, т.к. в условиях минимального загрязнения среды продуктами метаболизма бактерии были лишены

дополнительных субстратов для роста. В экспериментальных сосудах (с добавлением микроводорослей Ch. vulgaris, D. salina, P. viridis, I. galbana и Т. weissßogii численность бактерий была выше за счет привнесённой вместе с клетками ассоциированной с микроводорослями микрофлоры (рис. 7).

На четвертые сутки численность бактерий в контроле выросла, а в экспериментальных сосудах с Ch. vulgaris дальнейшего роста не наблюдали, что указывает на антибактериальный эффект хлореллы (рис. 7).

95-

0.5

4-i

¡y!) KütiTixiii. MM 1. gatbawi Щ D mUmt —■ Ch. vulgaris

P. viridis Я т. wnasflvgii

Рис. 7 Динамика численности бактерий в сосудах с личинками на стадии эндогенного питания (без и с добавлением микроводорослей)

Сутки

Таким образом, добавление культуры Ch. vulgaris в среду с личинками на стадии эндогенного питания целесообразно, т.к. она сдерживает рост численности бактерий при переходе личинок на экзогенное питание.

Ингибирующий эффект фильтратов микроводорослей СЛ. vulgaris, I. galbana и Т. weissflogii на микрофлору среды с экзо-генно питающимися личинками. В работе исследовали антибактериальный эффект фильтратов микроводорослей на микрофлору среды с личинками, питающимися коловратками. Определено, что численность бактерий в опыте с фильтратом Ch. vulgaris достоверно ниже, чем в контроле на протяжении 3-х суток (рис. 8).

20-

Г Контроль 58 ' galbana S5 Ch vulgaris

Ш т. weixtfbgti

Рис. 8 Динамика численности бактерий в сосудах с личинками на стадии экзогенного питания (без и с добавлением микроводорослей)

CVíRít

Это свидетельствует о том, что бактерицидное действие фильтрата хлореллы по своей эффективности сравнимо с действием нефильтрованной культуры.

Таким образом, показано, что хорошо выраженным антибактериальным эффектом обладает только Ch. vulgaris и её фильтрат. Использование Ch. vulgaris с целью снижения численности бактерий в средах выращивания калкана целесообразно на стадиях развития от развивающейся икры до стадии-экзогенного питания.

Влияние микроводоросли Cli. vulgaris на динамику численности бактерий в среде выращивания артемии A. salina и интенсивность бактериальной колонизации покровов её науплиев.

В процессе инкубации артемий рост численности бактерий отмечали, как в контрольных, так и в экспериментальных сосудах. Однако в сосудах с добавлением хлореллы этот показатель был значительно ниже такового в контроле, что указывает на антибактериальный эффект данного вида микроводорослей (рис. 9 Б).

Время, ч Время, ч

Рис. 9 Динамика выклева науплиев A. salina (А) и численности бактерий в среде инкубации (Б) в контроле (Chlorella(-)) и в сосудах с добавлением Ch. vulgaris (Chlorella(+))

Присутствие Ch. vulgaris в среде инкубации артемий сокращало время выклева науплиев, обеспечивало их более синхронный метаморфоз (рис. 9 А) и влияло на интенсивность бактериальной колонизации (ИБК) покровов артемии. В экспериментальных сосудах с хлореллой ИБК артемий была ниже, чем в контрольных. В пространстве переменных G (зеленая компонента) и В (яркость свечения) кластер контроля был крупнее, поскольку включал в себя

колонизирование бактериями организмы с ярко-зеленой флуоресценцией (рис. 10).

Таким образом, использование микроводоросли Ch. vulgaris при инкубации цист A. salina можно рассматривать целесообразным методом, позволяющим синхронизировать выклев

науплиев, снизить интенсивность бактериальной колонизации покровов животных и численность бактерий в их среде, предупредить тем самым риск передачи патогенных бактерий личинкам вместе с данным кормовым организмом.

динамика численности оактерии в среде инкубации икры и интенсивность бактериальной колонизации её поверхности при различных методах обработки. Озон и хлорелла оказывали ингибирующее действие на бактерий в среде инкубации икры (СИИ), однако в разных временных диапазонах. Ингибирующий эффект хлореллы начал проявляться после трёх суток, в сосудах с озоном - в период с первых по третьи сутки (рис. 11 А).

Удельная скорость роста бактерий (//) в СИИ с озонированной водой (СИИ) (О) на вторые сутки была выше, чем в сосудах с хлореллой и в контроле (рис. 11 Б), т.е. выжившие после обработки воды озоном бактерии обладали высоким потенциалом роста (рис 11 Б). На это указывает также удельная скорость роста численности бактерий на специализированной среде М65 (//мбб) (Рис- ' 1 В), которая позволяла сравнивать пробы по активности быстрорастущих видов бактерий, т.е. г - стратегов, являющихся частой причиной вспышек инфекционных болезней личинок (Salvesen, 2000). Самые высокие показатели fxM6¡ наблюдали в СИИ (О) (рис. 11 В).

Таким образом, можно предположить, что высокие показатели /л бактерий в СИИ (О) на среде М65 являются следствием нарушения баланса в бактериальном сообществе при использовании озона. Т.е. при использовании озона, начиная с 1-х суток, происходил селективный рост быстрорастущих бактерий, чего не происходило в СИИ (X), куда вместе с клетками микроводорослей были привнесены ассоциированные с ними бактерии. Вероятно, ингибирующий эффект хлореллы, выявленный также при анализе интенсивности бактериальных обрастаний икринок, связан именно с аутентичной микрофлорой Ch. vulgaris.

Показатели ИБК поверхности икры в экспериментальных сосудах были различны. Уже в первые сутки эксперимента в СИИ (X) количество икры с вы-

CQ

100-i 96 928884 80 J

¡A

23% Chiorel 1а(—)

I-Т-1-!-1-1-1-7 I-1-,

80 120 160 200 240 280 G

Рис. 10 ИБК науплиев артемии

сокой степенью бактериальной колонизации было значительно ниже, чем в других сосудах, что указывает на антибактериальный эффект хлореллы.

С'уткн I 3

Сутки

Рис. 11 Динамика численности бактерий (А), удельная скорость роста бактерий в средах инкубации икры (Б) и удельная скорость роста на среде М65 (В) бактерий в контроле (К), после обработки среды озоном (О), при добавлении хлореллы (X)

Результаты позволяют предположить, что данные методы обработки икры целесообразно комбинировать: 1) начальное снижение численности бактерий на поверхности икры перед инкубацией путём обработки ее озонированной водой; 2) предварительное добавление культуры Ch. vulgaris в инкубаторы. Такая методика позволит снизить интенсивность бактериальной колонизации поверхности икры и создать оптимальные микробиологические условия для её развития.

ПОДГОТОВКА МОЛОДИ ЧЕРНОМОРСКОГО КАЛКАНА К ВЫПУСКУ В ЕСТЕСТВЕННЫЕ МЕСТА ОБИТАНИЯ

Выпуск молоди камбалообразных со стереотипом поведения, выработанном при искусственном выращивании, часто сопровождается высокой смертностью в связи с отсутствием у неё адаптивных реакций. Данный раздел диссертации посвящен разработке методов подготовки молоди калкана к выпуску в естественные места обитания, позволяющих повысить её выживаемость путём: 1) оптимизации рациона молоди; 2) запуска механизмов адаптации молоди с помощью введения в среду выращивания дополнительных адаптационных параметров (грунт, кормовые организмы из естественных мест обитания); 3) определения оптимальных температурных условий выпуска.

Установлено, что все предложенные виды корма (кальмар, ставрида, артемия, копеподы, нереис, гаммарус) усваивались калканом более чем на 50%, и их введение в рацион подготавливаемой к выпуску молоди калкана целе-

сообразно. Наиболее высокие показатели элективности молоди калкана в возрасте 2,5-3 мес. получены для размерной группы гаммарид (4 - 6мм).

Изучение развития камуфляжного поведения мальков показало, что, несмотря на то, что культивирование калкана происходило в отсутствие грунта, мотивация к зарыванию и маскировке у них обусловлена генетически. Однако для приобретения данных навыков требовалось время. Малорезультативные попытки мальков зарыться в песок были отмечены через сутки, но быстрое и'ре-зультативное зарывание было отмечено только через 7 дней, а полное соответствие адаптации окраски покровов тела грунту только через 14 дней. Присутствие субстрата также положительно влияло на качество, результативность и скорость атак на жертву (мальки рыб, гаммариды, полихеты) из естественных мест обитания. Определено, что оптимальный температурный режим для выпуска молоди калкана в море 21 °С. На основании полученных результатов разработаны основные критерии адаптации молоди к естественным местам обитания.

ВЫВОДЫ

В диссертационной работе впервые представлен анализ результатов исследования взаимодействия живых компонентов (микроводоросли, коловратки, артемии, икра, личинки, бактерии) в системе искусственного воспроизводства черноморского калкана Scophthalmus maeoticus. Определены основные продукционные показатели В. plicatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп, подобраны виды микроводорослей, повышающие продукцию коловраток в короткие сроки. Исследована степень токсичности различных доз хлорамфеникола и его влияние на численность бактерий в средах выращивания личинок калкана и его кормовых организмов. Выявлен бактериостатический эффект микроводоросли Ch. vulgaris и её фильтрата, позволившие разработать новую методику применения хлореллы в качестве антибактериального средства на проблемных в микробиологическом отношении этапах культивирования личинок калкана и их кормовых организмов. Впервые определены поведенческие особенности и адаптационные характеристики искусственно выращенной молоди калкана, разработаны основные принципы её подготовки к естественным условиям обитания перед выпуском в море.

1. Продукционные показатели коловраток зависят от вида микроводорослей, которыми они питаются, и предварительной трофической адаптации. Максимальная удельная скорость роста численности (0,96 сут"1) и эффективности роста (27,6%) Brachionus plicatilis получены при питании клетками микроводоросли Phaeodactilum tricornutum, а минимальные значения (0,16 сут"1 и 11,3%, соответственно) - при питании Isochrysis galbana.

2. Хлорамфеникол (при концентрациях 5 - 500 мг-л"1) оказывает токсический эффект на клетки микроводоросли Isochrysis galbana и снижает численность бактерий в среде их выращивания только на 50%. Кормление коловраток В. plicatilis культурой I. galbana, предварительно обработанной хлорамфенико-лом (5 мг-л'1), не оказывает негативного влияния на их воспроизводство.

3. Из всех исследованных видов микроводорослей наиболее выраженным антибактериальным эффектом в среде инкубации икры, выращивания личинок и их кормовых организмов, обладает культура Chlorella vulgaris и её фильтрат. Применение Ch. vulgaris с целью снижения численности бактерий в системе выращивания калкана целесообразно на всех ранних этапах культивирования данного вида.

4. В присутствии Chlorella vulgaris в среде инкубации икры и выращивания науплиев артемии снижается интенсивность бактериальной колонизации покровов данных организмов.

5. Обработка среды инкубации икры озоном приводит к неселективному снижению численности бактерий в ней, однако провоцирует быстрый рост численности оппортунистической микрофлоры, чего не происходит в среде инкубации икры с добавлением клеток хлореллы.

6. Разработаны принципы адаптации молоди к естественным условиям перед выпуском и установлено, что:

а) инертные и живые корма, используемые в аквакультуре (артемия, фарш рыб и кальмара), и живые корма из естественного биотопа (нереис, гаммарус, копепо-ды) усваивались молодью калкана более чем на 50%. С целью повышения жизнестойкости мальков и формирования у них пище-поисковых навыков данные виды корма целесообразно вводить в рацион молоди, подготавливаемой к выпуску;

б) наиболее высокие значения избирательности трехмесячными мальками калкана получены для гаммарид размеров (4 - 6мм);

в) длительность адаптации к грунту из предполагаемого места выпуска - не менее двух недель;

г) оптимальная температура воды при выпуске молоди калкана в море составляет 21 °С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Рауэн Т. В. Влияние микроводорослей и их фильтратов на численность бактерий в среде выращивания камбалы калкан / Т. В. Рауэн, А. Н. Ханайченко, В. С. Муханов // Мор. экол. журн. - 2011. - Т. 10, № 3. - С. 4856. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

2. Рауэн Т. В. Продукционные показатели коловраток при питании микроводорослями разных таксономических групп / Т. В. Рауэн, В. С. Муханов, А. Н. Ханайченко // Мор. экол. журн. - 2012. - Т. 11, № 3. - С. 8997. (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

3. Рауэн Т. В. Применение хлорамфеникола при культивировании микроводорослей Isochrysis galbana и коловраток Brachionus plicatilis / Т. В. Рауэн // Мор. экол. журн. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 31-37.

4. Рауэн Т. В. Влияние микроводоросли Chlorella vulgaris на динамику выклева Artemia salina и численность бактерий в среде выращивания артемии / Т. В. Рауэн,

B. С. Муханов, А. Н. Ханайченко // Мор. экол. журн. - 2013. -Т. 12, № 4. -

C. 79-86. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

5. Каротинондный состав каланоидных копепод Calanipeda aquaedulcis и Arctodiaptomus salinus при питании микроводорослями разных систематических групп / А. Н. Ханайченко, Н. А. Поспелова, J1. О. Аганесова, Т. В. Рауэн // Мор. экол. журн.

- 2014. - Т. 13, № 1. - С. 82-87. - (Вклад автора - подготовка экспериментального материала).

Статьи в других изданиях:

6. Структура и фенотипические характеристики нерестовой популяции камбалы калкан как показатели интенсивности промысла и состояния экосистемы Черного моря / В. Е. Гирагосов, А. Н. Ханайченко, Д. В. Ельников, Т. В. Шишкина // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб и других гидробионтов-2 : расшир. материалы междунар. науч.-практ. конф. (17-20 июля 2007 г., Борок-Москва, Россия). - М., 2007. -С. 136-139. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

7. Методы подготовки молоди камбалы калкан к выпуску в прибрежные акватории Черного моря / Т. В. Шишкина, Д. В. Ельников, А. Н. Ханайченко, В. Е. Гирагосов, Т. Б. Ковиршина, Т. Г. Белоиваненко // Риб. госп-во Укра'ши. - № 1-2 (48-49). - 2007. - С. 2-7. - (Вклад автора -проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

Материалы и тезисы конференции:

8. Шишкина Т. В. Подбор оптимального штамма артемий для кормления личинок камбалы калкан / Т. В. Шишкина, Д. В. Ельников // Понт Эвксинский V : тез. V междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых по проблемам водных экосистем (24-27 сент. 2007 г.). - Севастополь, 2007. - С. 118-119. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

9. Ельников Д. В. Избирательность гаммарид молодью черноморской камбалы калкан / Д. В. Ельников, Т. В. Шишкина // Понт Эвксинский V : тез. V междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых по проблемам водных экосистем (24-27 сент. 2007 г.). - Севастополь, 2007. - С. 33-34. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

10. Рауэн Т. В. Применение хлорамфеникола при культивировании основных кормовых объектов аквакультуры - микроводорослей Isochrysis galbana и коловраток Brachionus plicatilis / Т. В. Рауэн, В. С. Муханов // Актуальш проблеми та перспективи розвитку природничих наук : зб. матер1ал1в II Всеукр. наук.-практ. конф. студетчв та молодих вчених (20 травня 2011 р.).

- Запор1жжя, 2011. - С. 196-199. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

11. Белозёрова В. В. Динамика и эффективность выклева артемий разных географических рас в зависимости от температуры / В. В. Белозёрова, Т. В. Рауэн // Pontus Euxinus 2011 : тез. 7ой междунар. науч.-практ. конф. молодых учёных по проблемам водных экосистем, посвящ. 140-летию Ин-та биологии юж. морей HAH Украины (Севастополь, 24-27 мая 2011 г.). -Севастополь, 2011. - С. 37. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

12. Рауэн Т. В. Продукционные показатели коловраток Brachionus plicatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп / Т. В. Рауэн, В. С. Муханов, А. Н. Ханайченко // Pontus Euxinus 2011 : тез. 7ой междунар. науч.-практ. конф. мол учёных по проблемам водных экосистем, посвящ. 140-летию Ин-та биологии юж. морей HAH Украины (Севастополь, 24-27 мая 2011 г.). - Севастополь, 2011. - С. 198. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

13. Рауэн Т. В. Влияние пищевой адаптации на видовую и размерную селективность питания Brachionus plicatilis / Т. В. Рауэн, В. С. Муханов // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии : материалы II междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых учёных (19-22 сент. 2011 г.). - Донецк, 2011. - С. 289. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

14. Rauen T. V. Microalgae and their filtrates as agents for the control of bacterial abundance in cultivation media for the Black Sea turbot / T. V. Rauen, A. N. Khanaichenko, V. S. Mukhanov // Our Oceans, Our Future : World Conference on Marine Biodiversity (26-30 Sept., 2011, Aberdeen, Scotland, UK) : Abstr. -[Aberdeen], 2011. - P. 22. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

15. Стецюк А. П. Экотоксикологическое исследование воздействия ртути на одноклеточные водоросли / С. Б. Гулин, О. А. Рылькова, В. С. Муханов, Т. В. Рауэн, А. Б. Боровков // Научная конф. «Ломоносовские чтения» 2013 : междунар. науч. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2013» (25-26 апреля 2013 г.). - Севастополь, 2013. - С. 250-251. - (Вклад автора - подготовка экспериментального материала, совместное написание текста статьи).

16. Рауэн Т. В. Влияние микроводоросли Chlorella vulgaris на динамику выклева Artemia salina и численность бактерий в среде выращивания артемии / Т. В. Рауэн, В. С. Муханов, А. Н. Ханайченко // Понт Эвксинский VIII : тез. VIII междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых по проблемам водных экосистем, посвящ. 50-летию образования ИнБЮМ HAH Украины (Севастополь, 1-4 окт. 2013 г.). - Севастополь, 2013. - С. 118-119. - (Вклад автора - проведение исследований, обработка и анализ результатов, совместное написание текста статьи).

21

Патенты:

17. Пат. 95428 С2 UA, МПК А01К 61/00 Cnociö ¡нтенсивного вирощування малыав камбали калкан / Ханайченко А. М. (UA), Прагосов В. С. (UA), ельников Д. В. (UA), Рауэн Т. В. (UA); заявник 1нститут бюлош швденних MopÍB ím. О. О. Ковалевського HAH УкраТни (UA). - № 201013904 Заявлено 22.11.2010. Опубл. 25.07. 2011. Бюл. №14.

АННОТАЦИЯ

Рауэн Т.В. Взаимодействие живых компонентов в системе искусственного выращивания черноморского калкана (Scophthalmus maeoticus) (Pisces: Scophthalmidae) - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.02.10 - гидробиология. - Институт биологии южных морей им. А.О. Ковалевского, Севастополь, 2014.

На основании комплексных исследований взаимодействия живых компонентов в системе искусственного выращивания черноморского калкана разработаны рекомендации, позволяющие внести коррективы в общепринятую методику культивирования данного вида и оптимизировать её основные проблемные этапы. Определены основные продукционные показатели коловраток Brachiomis plicatilis при питании микроводорослями разных таксономических групп и влияние пищевой адаптации на их видовую селективность питания. Максимальные значения удельной скорости роста численности (0,96 сут"1) и эффективности роста (27,6%) В. plicatilis получены при их питании клетками Phae-odactyliim tricornutum, а минимальные (0,16 сут"1 и 11,3%, соответственно) - при питании Isochrysis galbana. Предварительная трофическая адаптация к определенному виду микроводорослей увеличивает скорость потребления этого вида коловратками в смеси данных микроводорослей. Однако, из смеси микроводорослей коловратки всегда селективно избирали Ph. tricornutum. Показано, что хлорамфеникол (концентрация 5 - 500 мг-л'1) оказывает токсическое действие на клетки микроводорослей I. galbana и элиминирует только 50% численности бактерий (т.е. остальные 50% бактерий резистентны к хлорамфениколу). Обработанная хлорамфениколом (5 мг-л"1 24 ч) культура I. galbana не оказывала токсического эффекта на коловраток, и при её использовании численность бактерий в среде с коловратками снижалась. Установлено, что из всех исследованных видов микроводорослей антибактериальным эффектом обладает хлорелла и её фильтрат, которые эффективно снижают численность бактерий в средах инкубации личинок и их кормовых организмов, предупреждают вспышку численности бактерий в момент выклева личинок из икры и их перехода на стадию экзогенного питания. Присутствие хлореллы снижает интенсивность бактериальной колонизации поверхности икры и покровов науплиев артемий, положительно влияет на динамику выклева Artemia salina. Обработка среды инкубации икры озоном приводит к неселективному снижению в ней численности бактерий, но, в отличие от хлореллы провоцирует быстрый рост оппортунистической микрофлоры. Разработаны методы подготовки молоди калкана к естественным условиям обитания перед выпуском. Оценены калорийность и усвояемость различных видов корма

молодью калкана. С целью повышения жизнестойкости молоди, и формирования у неё пище-поисковых реакций составлена схема кормления молоди инертными кормами в комплексе с кормовыми организмами из естественного биотопа (нереис, гаммарус, копеподы). Определена длительность адаптации молоди к грунту из предполагаемого места выпуска (не менее двух недель) и термопрефе-рендум молоди калкана (21°С).

Ключевые слова: черноморский калкан Scophthalmus maeoticus икра, личинки, коловратки В. plicatilis, цисты, артемии, микроводоросли Chlorella vulgaris, Platymonas viridis, Dunaliella salina, Thalassiosira weissflogii, Isochrysis galbana, Phaeodactilum tricornutum, бактерии, хлорамфеникол

АНОТАЦ1Я

Рауен T.B. - Взаемод!я живих компоненте у систем! штучного виро-щування чорноморського калкана (Scophthalmus maeoticus) (Pisces: Scophthalmi-dae) - Рукопис,

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещальшстю 03.02.10 - гщробюлопя. - 1нститут бюлогп швденних Mopiß iM. О.О. Ковалевського, Севастополь, 2014.

На шдстав1 комплексних дослщжень взаемодн живих компоненте у систем! штучного вирощування чорноморського калкана розроблено рекомендащУ, що дозволяють внести корективи в загальноприйняту методику культивування да-ного виду i оптим1зувати и основш проблемш етапи. Оцшено основш продук-Шйш показники коловерток Brachionus plicatilis при живленш мкроводоростями pi3Hnx таксоном1чних груп i вплив харчово'У адаптаци на Ух видову селектившсть живлення. Максимальш значения питомоУ швидкосп зростання чиселыгоеп (0,96 доб'1) i ефективностч росту (27,6%) В. plicatilis отримаш при Ух живленш титанами мжроводорос™ Phaeodactylum tricornutum, а мтмалын (0,16 доб"1) (11,3%) - при живленш Isochrysis galbana. Попередня троф1чна адаптащя В. plicatilis до певного виду мпфоводоростей збшыиуе швидюсть споживання цьо-го виду коловертки в cyMiiui даних мжроводоростей. Однак, ¡з cyMiiui мшрово-доростей коловертки завжди селективно обирали Ph. tricornutum. Показано, що хлорамфешкол (концентращя 5 - 500 мг-л"1) надае токсичну дто на клшши мж-роводоростей /. galbana i ел ¡мшу е тальки 50% чисельнот бактерш, тобто решта бактерш е резистентними до хлорамфешколу. Оброблена хлорамфенжолом (5 мг-л" 24 год) культура I. galbana не надавала токсичного ефекту на коловерток, прицьому чиселыпсть бактерш у середовшш В. plicatilis знижувалася.

Встановлено, що з ycix дослщжених вид1в мнсроводоростей антибактер1аль-ний еффект мае хлорела i УУ фшьтрат, ям ефективно знижують чиселыпсть бак-Tepitt у середовииц ¡нкубацп личинок i ix кормових оргашзм1в, попереджають спадах чисельност! бактерии в момент викльову личинок з жри та ix переходу на стадто екзогенного харчування. Присутшсть хлорели знижуе ¡нтенсившсть бак-тср1альноТ колошзащУ поверхш ¡кри i покров1в науплП' артемш, позитивно впли-вае на динамку викльову Artemia salina. Обробка середовища ¡нкубацп ¡кри озоном призводить до неселективного зниження в нш чисельносп бактерш, але

провокуе швидке зростання опортушстичноТ мжрофлори на вщмшу вщ хлорели. Розроблено методи шдготовки молод! калкана до природних умов ¡снування перед випуском. Оцшено калорншють i засвоюваность р1зних видт корму мо-лоддю калкана. 3 метою шдвищення життсстшкосл молодо формування у неТ 1Ж1-пошукових реакцш складена схема год1вл1 молод1 ¡нертними кормами в комплекс! з кормовими оргашзмами з природного бютопу (нереТс, гамарус, копепо-ди). Визначена тривашсть адаптацн молод! до грунту з передбачуваного мюця випуску (не менше двох тижшв) i термопреферендум молод1 калкана (21 °С).

КлючоеЛ слова: чорноморський калкан Scophthalmus maeoticus, ¡кра, личинки, коловертки В. plicaíilis, цисти, артемн, мшроводоросп Chlorella vulgaris, Platymonas viridis, Dunaliella salina, Thalassiosira weissßogii, Isochrysis galbana, Phaeodactilum tricorniitum, бактерп, хлорамфешкол

SUMMARY

Rauen. T.V. - Interactions between living components in the rearing system of the Black Sea turbot (Scophthalmus maeoticus) (Pisces: Scophthalmidae) — manuscript.

Thesis for PhD degree in the specialty 03.02.10 - Hydrobiology. - Institute of Biology of the Southern Seas, Sevastopol, 2014

Recommendations for optimization of cultivation protocol of the Black Sea turbot (BST) were developed based on integrated studies of interactions between live components in the rearing system of this species. General production characteristics of Brachionus plicatilis fed microalgae from different taxonomic groups were assessed. Preliminary adaptation of rotifer culture to feeding on certain microalgae (Phaeodac-tylum tricornutiun, Isochrysis galbana, Dunaliella salina) increased their ingestion rate. However, rotifers from any pre-adapted group showed the preference for grazing on Ph. tricornutum indicating the pronounced selectivity for this microalgae. The highest values of population specific growth rate (0,96 day"1) and growth efficiency (27,6%) were obtained for B. plicatilis fed Ph. tricornutum. Lowest population specific growth rate (0,16 day"1) and lowest growth efficiency (11,3%) were found for rotifers fed I. galbana. Chloramphenicol (concentrations 5 - 500 mg l"1.) was found to have toxic effect on the cells of I.galbana in culture and eliminated only 50% of total bacterial number, suggesting the presence of bacterial strains resistant to chloramphenicol. Pre-treated by chloramphenicol (5 mg-1'1. within 24 hours) I.galbana culture was not toxic for B. plicatilis, and the bacterial number in rotifers culture fed I.galbana was significantly lower in comparison with the control. Among the studied microalgae species only Ch. vulgaris and its filtrate showed significant antibacterial effect. The introduction of Ch. vulgaris effectively decreased bacterial number in BST incubation medium and in the cultures of its planktonic prey; prevented bacterial outbreak from hatching of BST larvae till the end of their exogenous feeding. Addition of Ch. vulgaris to incubation medium decreased bacterial colonization of BST eggs and brine shrimp nauplii surface, and accelerated A. salina hatching rate. Preliminary ozon treatment of BST incubation medium led to non-selective reduction in bacterial number but provoked further fast growth of opportunistic microflora that was not the case

when Ch. vulgaris was added to incubation medium. Based on the studies of biological and behavioral features of hatchery-reared metamorphosed BST, the protocol of their pre-adaptation to natural habitat prior restocking was developed. Energy content and assimilation efficiency of various food items (live and inert) BST juveniles was assessed. A scheme of BST co-feeding by inert food in order to increase their stress tolerance together with natural prey in order to generate the ambush predator skills in reared 0-group juveniles was elaborated. The duration of prior release adaptation of hatchery-reared BST (including the development of burial behaviour needed for escape responses) to the sand substratum originated from the proposed location of release, was found to be minimum 2 weeks; preferred temperature for BST release 21 °C.

Key words: Black Sea turbot, Scophthalmus maeoticus, eggs, larvae, rotifers B. plicatilis, cysts, artemia, microalgae Chlorella vulgaris, Platymonas viridis, Danaliella salina, Thalassiosira weissjlogii, Isochrysis galbana, Phaeodactylum tricornutum, bacteria, chloramphenicol.

Рауэн Татьяна Владимировна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЖИВЫХ КОМПОНЕНТОВ В СИСТ ЕМЕ ИСКУССТВЕННОГО ВОСПРОИЗВОДСТВА ЧЕРНОМОРСКОГО КАЛКАНА (SCOPHTHALMUS MAEOTICUS) (PISCES: SCOPHTIIALM1DAE)

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 10.10.2014. Формат 60 х 84 1/16 . Усл. печ. л. 1.0.

Тираж 100 экз. Заказ К<?(30 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский физико-технический институт (государственный университет)^ От,к:, г оперативной полиграфии «Физтех-полиграфа» 141700. Московская обл., г. Долгопрудный. Институтский пер., 9