Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий"

ииа4Ь7828

На правах рукописи

Гусейнов Олег Аладдин оглы

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВОГО СУБСТРАТА НА ГИДРОГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ И КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИТОХРОМОВ В КЛЕТКАХ ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

t г Д£\\

Красноярск - 2008

003457828

Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Татьяна Григорьевна Волова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Судачкова Нина Евгеньевна

доктор биологических наук Бондарь Владимир Станиславович

Ведущая организация

ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет»

Защита диссертации состоится «>¿3 » А. 200 3 г. в <79 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу: 660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50. Факс:+7 (391) 243-34-00 E-mail: ibp@ibp.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН

Автореферат разослан « ^У» 200 ff г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биол. наук

JI.A. Франк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшим направлением биотехнологии является получение целевых продуктов с помощью микроорганизмов. Представляет интерес использование в качестве продуцентов хемолитотрофных бактерий, энергетическим субстратом которых служит водород. Человечество все чаще обращается к использованию Нг, как экологически чистого и возобновляемого источника энергии. Расширение масштабов использования энергии водорода открывает возможности внедрения все большего количества биотехнологий с использованием этого субстрата.

Перспективными продуцентами целевых продуктов являются бактерии ^аШегяга еи1горка (Alcaligenes eu.troph.us) Z-l и БеНЬепа сагЪохуйокуйго%епа. 21062, ввиду их быстрого роста на газовых субстратах, содержащих водород.

Конструктивный обмен и фиксация СО2 у данных бактерий реализуются в цикле Кальвина. Их энергетическая система состоит из полной цепи переноса электронов и ферментов, окисляющих водород - гидрогеназ. Единственными общими соединениями для катаболизма и анаболизма являются НАДН и АТФ, которые образуются при окислении водорода и потребляются при фиксации СОг и на путях синтеза макромолекул.

Эффективность использования энергетического субстрата определяется уровнем сопряжения систем катаболизма и анаболизма и функциональным состоянием энергетической системы бактерий, которая является центральным звеном регуляции метаболизма. Для получения высокого выхода целевого продукта с эффективным использованием субстрата необходимо знать, как условия среды при культивировании бактерий влияют на состояние энергетической системы клеток. Воздействие на этом уровне может положительно влиять на эффективность биотехнологических процессов. Для управления режимом культивирования водородокисляющих бактерий \Vautersia еиггорка 2-1 и БеИЬепа carboxydohydrogena 2-1062 существенно знать, как меняются гидрогеназная активность и концентрации цитохромов в их клетках, а также энергетическая эффективность их роста при изменении параметров газового субстрата.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение влияния условий газового питания на активности гидрогеназ и концентрации цитохромов в клетках ¡УаМегяга еиХгорка 2-1 и БеПЬепа сагЪохуйокуйго^епа Ъ-1062 с учетом энергетической эффективности их роста, а также оценка перспектив биотехнологического применения гидрогеназ.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние концентраций Нг, СОг и Ог в культуральной среде на уровень активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий \У.еШгорка 2-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 и энергетическую эффективность роста культуры.

2. Исследовать взаимосвязь уровня активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках с другими физиолого-биохимическими

характеристиками культуры (удельной скоростью роста, эффективностью использования субстратов и конструктивным обменом бактерий).

3. Изучить динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов, а также других физиолого-биохимических параметров клеток IV.еШгорка 2-1 и S.carЪoxydohydrogena 2-1062 в зависимости от концентрации моноксида углерода в газовом субстрате.

4. Определить условия культивирования, положительно влияющие на активность гидрогеназ в клетках данных бактерий.

5. Оценить биотехнологический потенциал препаратов гидрогеназ eu.trорка для разработки систем детекции водорода и восстановления НАД1".

Научная новизна работы. Впервые исследована динамика активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках Ж.еШгорИа 2-1 и X carЪoxydohydrogena 2-1062 в зависимости от условий культивирования. Установлено, что наибольшие активности гидрогеназ достигаются при лимитировании роста бактерий по энергетическому субстрату; наименьшие — при ингибировании кислородом. Максимальные концентрации цитохромов характерны для клеток, выращенных при лимитировании роста по Ог, а наименьшие - при ингибировании 02. Установлено, что повышение гидрогеназной активности и концентраций цитохромов при лимитировании роста по Нг не сопровождается снижением эффективности использования энергии водорода. Установлена специфическая СО-устойчивость Ж. еШгорИа 2Л и S.carboxydohydrogena 7-1062: под воздействием токсиканта в клетках возрастает гидрогеназная активность и концентрации цитохромов, а также укрепляется мембранный аппарат. Эти изменения сопровождаются снижением эффективности использования энергии водорода при сохранении белковой направленности конструктивного обмена бактерий.

Практическая значимость. Установлены параметры процесса культивирования, позволяющие получать партии биомассы Жеи^орИа 2-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 с высокой гидрогеназной активностью (до 11 и 5 и / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ ТУ.еМгорНа 2-1 и 2 и / мг белка для гидрогеназы S.carboxydohydrogena 2-1062). Определены условия, при которых в присутствии СО возможен устойчивый и продуктивный рост этих бактерий; результатами обоснована возможность их выращивания на водородсодержащих субстратах, получаемых конверсией природного газа или переработкой углей. Показана пригодность аналитической системы, содержащей НАД-зависимую гидрогеназу Ж.еШгорка 2-1, редуктазу и люциферазу, для детекции водорода (с точностью до 0,1 нмоль в пробе). Показана пригодность иммобилизованных в альгинатный гель высокоактивных по гидрогеназам клеток ¡У.еиЪ-орИа 2-1 для использования в системах восстановления НАД+.

Положения, выносимые на защиту:

1. Реакция Ж.еиГгорка 2-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 на изменение условий газового питания включает изменения их гидрогеназной

активности и концентраций цитохромов, сопровождающиеся изменением энергетической эффективности роста.

2. W.eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрациях до 20% без изменения биохимической направленности синтеза за счет адаптивных изменений: повышения синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиления мембранного аппарата. При этом удельные траты энергетического субстрата возрастают (предельное увеличение - в 1,4-1,9 раза при 20% СО).

3. Препараты НАД+-зависимой гидрогеназы и биомасса клеток W.eutropha Z-1 перспективны для создания систем регистрации водорода и восстановления НАД".

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на 7 съезде Всес. микробиол. общества (Алма-Ата, 1986), 4 съезде Всес. конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всес. конференции. "Биоконверсия-88" (Рига, 1988), Всес. конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущино, 1989), Всес. конференции. "Лимитирование и ингибирование роста микроорганизмов" (Пущино, 1989),

4-м Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988),

5-м Международном конгрессе по экологии микроорганизмов (Киото, 1988), семинарах Института биофизики СО РАН (1986-2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 6 в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах текста, содержит 38 рисунков и 24 таблицы. Список цитируемой литературы включает 269 источников, из которых 180 иностранных.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н., проф. Т. Г. Воловой за неоценимую помощь в работе над диссертацией, д,х.н., проф. В.О. Попову (Институт биохимии РАН), к.б.н. Г.С. Калачевой, к.б.н. В.Н. Петушкову, к.б.н. O.A. Могильной, В.Ф. Плотникову за сотрудничество при проведении работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Проведен анализ состояния исследуемого вопроса, рассмотрены основные научные направления, связанные с технологиями культивирования водородокисляющих бактерий. Выявлены проблемные области и обоснована постановка целей и задач настоящего исследования. Обосновано изучение влияния газового субстрата на динамику гидрогеназной активности и концентраций цитохромов в клетках бактерий в условиях непрерывного культивирования.

Глава 2. Объекты и методы исследования

Объектами исследования были штаммы водородокисляющих бактерий Wautersia (Alcaligenes) eutropha Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062,

переданные Институту биофизики СО АН СССР академиком Г.А.Заварзиным из коллекции Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН.

Культивирование бактерий проводили в периодическом и проточном режиме в ферментерах, сконструированных и изготовленных в Институте биофизики СО РАН.

Смену газового режима в экспериментах по изучению влияния параметров газового субстрата на характеристики культуры производили следующим образом: Бактерии выращивали в непрерывной культуре, поддерживая объемные концентрации газов на уровне насыщения при отсутствии ингибирования роста кислородом (70-80% Н2, 5-10% С02, 15-20% 02), все остальные параметры среды поддерживали на уровне оптимальных (контрольные условия). В ходе опытов изменяли концентрацию одного из газовых компонентов в смеси, поддерживая концентрации остальных компонентов на уровне насыщения. После прохождения переходного состояния, через несколько часов наступало новое стационарное состояние культуры (при заданных условиях проходило не менее 10 циклов удвоения биомассы). Это позволяло изучать не переходный процесс, а популяцию, состоящую из микроорганизмов, адаптированных к новым условиям и способных расти при этих условиях. Во всех вариантах были использованы культуры со значениями концентраций клеток близкими к 1,5-2,5 г/л, что позволяло вести процесс с максимальными удельными скоростями роста и продуктивностями по биомассе. Концентрации газов в культуральной среде определяли с использованием хроматографа марки ЛХМ-80, в газовой среде - с использованием серийных газоанализаторов.

Энергетическую эффективность роста при заданном соотношении компонентов газовой смеси оценивали по скорости поглощения газов культурой, и расчета экономических коэффициентов. Продуктивность культуры определяли стандартным методом.

Для энзимологических исследований клеточную суспензию центрифугировали при 4°С (5500g), полученный осадок дважды отмывали 50мМ калий-фосфатным буфером (pH 7,8). Затем клетки (1-2 г сырого вещества) гомогенизировали в 50-100 мл калий-фосфатного буфера (50мМ, pH 7,8) и обрабатывали ультразвуком. Полученные гомогенаты использовали для определения активностей гидрогеназ и концентаций цитохромов. Параллельно в гомогенатах определяли содержание белка по Лоури. Измерения активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов проводили на спектрофотометрах "Schimadzu UV-300" и "Hitachi-370" по методикам Schneider, Schlegel (1977), Schink, Schlegel (1978) и Probst, Schlegel (1976).

Все эксперименты были выполнены в 3-4 повторностях. Полученные экспериментальные данные обрабатывались статистически (Плохинский, 1980). Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стьюдента для 5%-ного уровня значимости. В таблицах указаны средняя арифметическая ± ошибка средней.

Глава 3. Влияние условий газового питания на рост и физиолого-биохимические характеристики водородокисляющих бактерий

Представлены результаты исследования динамики гидрогеназной активности, концентраций цитохромов в клетках и других физиолого-биохимических параметров культуры водородокисляющих бактерий в зависимости от концентраций компонентов газового субстрата в культуральной среде. Изучен рост водородокисляющих бактерий в широком диапазоне концентраций компонентов газового субстрата (от 20 до 80% Н2, от 3 до 30% 02, от 1 до 20% С02).

Максимальные значения удельной скорости роста (р) были получены при использовании газовой смеси состава: 70-80% Н2> 5-10% С02, 15-20% 02. В исследуемом режиме культивирования это соответствовало 0,8-1,1 мг/л Н2, 4291 мг/л С02, 2,4-4,3 мг/л 02 в культуральной среде. Данное соотношение газов использовали в качестве контрольного варианта (отсутствовие лимитирования и ингибирования роста бактерий), в котором обеспечивался рост W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 с высокими значениями ц (до 0,38 - 0,40 ч"1), наибольшая продуктивность по биомассе и эффективность использования энергетического субстрата. Концентрации белка и липидов в биомассе обоих штаммов в этих условиях составляли около 60 и 10% сухого вещества соответственно.

Установлено, что лимитирование роста S.carboxydohydrogena Z-1062 и W.eutropha Z-1 по кислороду приводило к повышению гидрогеназной активности клеток, ингибирование кислородом приводило к ее падению. Самые высокие значения гидрогеназной активности в клетках получены при лимитировании роста культуры по водороду (рис. 1,2).

Максимальные концентрации цитохромов зарегистрировны при лимитировании роста S.carboxydohydrogena Z-1062 и W.eutropha Z-1 по кислороду (увеличивались более чем в два раза при 0,3 мг/л 02). Ингибирование кислородом приводило к их падению (до 40% при 6,8 мг/л 02). Лимитирование по водороду вызывало повышение концентраций цитохромов (в 1,5 раза при 0,18 мг/л Н2). Изменялось и соотношение концентраций цитохромов: при лимитировании по кислороду отношение с/Ь увеличивалось, при ингибировании кислородом и лимитировании по Н2 - уменьшалось (рис. 3,4).

Полученные данные о повышенной гидрогеназной активности клеток водородокисляющих бактерий при лимитировании их роста по водороду хорошо согласуются с выводами Ленца (Lenz et al., 2002) о том, что дефицит водорода в культуральной среде приводит к активации генов гидрогеназного регулона водородокисляющих бактерий. При этом концентрации гидрогеназ и цитохрома Ъ в клетках повышаются, отношение с/Ь уменьшается.

в]

1,2

0,8

о,е

0,4

£ 0,2

0,8-1,1 мг/л Н3 2,4-4,3 мг/л 02 42-90 мг/л СО,

0,5 мг/л 02 5,2 мг/л 02 0,37 мг/л Нг

0,3 мг/л 02 6,8 мг/л О, 0,18 мг/л Н2

Рис. 1. Влияние лимитирования роста по 02 и Н2 и ингибирования 02 на активность гидрогеназы в клетках 51. carboxydohydrogena Z-1062.

5

ю

а.

2,4 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0

йростеоримаягисЗрогг/юзо

Лимостироедное Н2

Контроль

Ингибирование 02

Лимитирование 02

0,8-1,1 мг/л Н2 2,4-4,3 мг/л Ог 42-90 мг/л С02

0,5 мг/л 02

5,2 мг/л 02

0,3 мг/л О,

6,8 рлг/л Ог

0,37 мг/л Нг

0,18 мг/л Н2

Рис. 2. Влияние лимитирования роста по Ог и Нг и ингибирования 02 на активность гидрогеназы в клетках 1¥.еШгорка Ъ-1.

5,2мг/л 02

0,8-1,1 мг/л Н2 0,5 мг/л 02 0,37 мг/л Н2

2,4-4,3 мг/л 02

42-90мг/л СО2_0,3 мг/л О,_6,8мг/лОг_0,18 мг/л Н2

ЛцмутиВвеШШНг

Ингибироеание 02

Рис. 3. Влияние лимитирования роста по 02 и Н2 и ингибирования 02 на концентрации цитохромов а, Ь и с в клетках Ъ.сагЪохуйокуйго^епа 2-1062.

ЛУМШПивЯШШМ. Н2

Контроль ¡¡а Ингибироеание 02

0,5 мг/л О, 5,2 мг/л О, 0,37 мг/л Н2

0,8-1,1 мг/л Н, 2

газа од8мг/лнг

Рис. 4. Влияние лимитирования роста по 02 и Нг и ингибирования Ог на концентрации цитохромов а, Ь и с в клетках \V.eutropha Ъ-\.

Изменение концентраций компонентов газового субстрата существенно изменяло энергетическую эффективность роста (табл. 1,2).

Таблица I

Показатели газового питания S.carboxydohydrogena 2-1062 при различных условиях непрерывного культивирования

Условия культивирования: концентрации газов в культуральной среде, мг/л Экономические коэффициенты, г АСБ/М Поглощение газовой смеси, л/г АСБ Удельная скорость роста, ц, час"'

Ун2 У02

Контроль 3,82 9,64 9,3 0,38±0,01

Лимитирование роста 02: 0,3 мг/л 02 2,10 8,32 14,3 0,15±0,01

Ингибирование роста 02: 6,8 мг/л 02 1,44 4,48 21,6 0,19±0,01

Лимитирование роста Н2: 0,18 мг/л Н2 3,74 9,49 9,4 0,17±0,01

Лимитирование роста С02: 4 мг/л С02 2,26 7,36 14,0 0,14±0,01

Таблица 2

Показатели газового питания Ш.еЫгорИа 1-Х при различных условиях непрерывного культивирования

Условия культивирования: концентрации газов в культуральной среде, мг/л Экономические коэффициенты, (г АСБ/М) Поглощение газовой смеси, (л/г АСБ) Удельная скорость роста, ц, час"1

Тн2 У02

Контроль 4,18 9,51 9,1 0,40±0,01

Лимитирование роста 02: 0,3 мг/л 02 1,94 6,76 11,9 0,10±0,01

Ингибирование роста 02: 6,8 мг/л 02 1,36 3,84 20,7 0,18±0,01

Лимитирование роста Н2: 0,18 мг/л Н2 4,07 9,32 9,2 0,15±0,01

Лимитирование роста С02:4 мг/л С02 2,15 6,43 12,6 0,14±0,01

Наиболее высокие значения экономического коэффициента по водороду (Ун2) зарегистрированы в контроле и при лимитировании роста бактерий по водороду. Лимитирование роста бактерий по кислороду и С02, а также ингибирование кислородом, приводящие к изменениям концентраций переносчиков электронов, снижали энергетическую эффективность роста (Ун2) до 2 г АСБ/М при 0,3 мг/л 02 и 4 мг/л С02; и до 1,4 г АСБ/М при 6,8 мг/л кислорода. Расход газовой смеси на синтез биомассы увеличивался до 12, 13 и 21 л/г АСБ, удельная скорость роста ц уменьшалась до 0,10; 0,14 и 0,18 час"1, соответственно.

Выявлено, что условия газового питания не влияют на белковую направленность конструктивного обмена у 5.carboxydohydrogena 2-1062. Концентрация белка в клетках бактерий сохранялась на высоком уровне (около 65% сухого вещества), содержание липидов не изменялось. Культивирование IV. еШгорИа Ъ-1 при неоптимальных соотношениях 02, Н2, и С02, за

исключением лимитирования кислородом, также не изменяло направленность в синтезе клеточных макромолекул.

Этими исследованиями установлено, что наибольшие значения активностей гидрогеназ характерны для клеток Цг.еи&орка Ъ-\ и S.carboxydohydrogena 2-1062, выращенных при лимитировании роста энергетическим субстратом, а наименьшие - при гипероксии. Наибольшие концентрации цитохромов зарегистрированы в клетках, выращенных при дефиците кислорода, а наименьшие - при избытке кислорода. Изменения концентраций компонентов газовой смеси, за исключением случая лимитирования кислородом Ж.еиКорка ЪЛ, не приводили к изменению направленности биохимического синтеза. Наибольшая энергетическая эффективность роста имела место при оптимальных условиях и лимитировании по водороду.

Глава 4. Энергетическая эффективность роста и физиолого-биохимические характеристики культуры водородокисляющих бактерий при ингибировании моноксидом углерода

Рассматривается влияние концентрации моноксида углерода в культуральной среде на динамику гидрогеназной активности, концентрации цитохромов и других физиолого-биохимических параметров культуры. Это актуально, поскольку водород, получаемый конверсией природного газа или газификацией углей (более доступный по себестоимости энергетический субстрат) содержит примесь моноксида углерода. Для оценки приемлемости этих источников Н2 исследован рост РГ.еи1горИа Ъ-1 и S.carboxydohydrogena 21062 в диапазоне концентраций СО от 1 до 30-40%.

Рис. 5. Зависимость концентраций цитохромов а, Ь и с в клетках З.сагЪохуйокуйго^епа г-1062 от содержания СО в культуральной среде при непрерывном культивировании

Таблица 3

Влияние СО на активность гидрогеназы и концентрации цитохромов а, Ь и с в клетках S.carboxydohydrogena Х-\062 в условиях непрерывного автотрофного культивирования

Условия культивирования: концентрация СО в культуральной среде, мг/л Концентрация цитохромов, нМ/мг белка Отношение с/Ь Активность гидрогеназы, и/мг белка Удельная скорость роста, ц, час"'

а Ь с

Рост без СО (контроль) 0,09±0,01 0,45±0,05 0,60±0,05 1,33 0,29±0,04 0,38±0,01

1,0 мг/л 0,09±0,01 0,47±0,05 0,59±0,06 1,25 0,30±0,04 0,38±0,01

2,1 мг/л 0,09±0,01 0,50±0,05 0,62±0,06 1,24 0,31±0,04 0,38±0,01

4,1 мг/л 0,09±0,01 0,54±0,03 0,66±0,03 1,22 0,50±0,04 0,23±0,01

6,3мг/л 0,11 ±0,01 0,57±0,03 0,69±0,03 1,21 0,14±0,02 0,16±0,01

8,2мг/л 0,09±0,01 0,69±0,03 0,81±0,04 1,17 0,12±0,01 0,06±0,01

Таблица 4 Влияние СО на активность мембраносвязанной гидрогеназы и концентрации цитохромов в клетках Ф.еШгорИа Z-l в условиях непрерывного автотрофного культивирования

Условия культивирования: концентрация СО в культуральной среде, мг/л Концентрация цитохромов, нМ/мг белка Отношение с/Ь Активность гидрогеназы, 11/мг белка Удельная скорость роста, ц, час"'

а Ь с

Рост без СО (контроль) 0,07±0,02 0,35±0,11 0,56±0,10 1,60 0,54±0,04 0,40±0,01

1,0 мг/л 0,08±0,01 0,36±0,09 0,59±0,12 1,64 0,55±0,03 0,39±0,01

2,1 мг/л 0,10±0,03 0,57±0,10 0,93±0,14 1,63 0,56±0,04 0,25±0,01

3,1 мг/л 0,14±0,03 1,03±0,16 1,51±0,15 1,47 0,90±0,04 0,21±0,01

3,4 мг/л 0,15±0,02 1,06±0,13 1,58±0,14 1,49 0,93±0,03 0,19±0,01

4,1 мг/л 0,16±0,03 0,96±0,17 1,45±0,16 1,51 0,94±0,02 0,17±0,01

5,2мг/л 0,14±0,02 0,88±0,15 1,32±0,14 1,49 0,91±0,02 0,07±0,01

Полученные данные о зависимости активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках бактерий от концентрации СО приведены в таблицах 3, 4. Активность гидрогеназы в клетках 5. carboxydohydrogena Ъ-1062, выращенных при концентрациях СО до 2,1 мг/л (10% СО в газовой смеси) мало отличалась от её значений в отсутствие СО (контроль) и составляла около 0,30 и/мг белка. Увеличение концентраций СО до 4,2 мг/л вызывало повышение активности гидрогеназы до 0,52 и/мг белка. Дальнейшее повышение концентрации СО снижало активность гидрогеназы до 0,14 и/мг белка при 6,3 мг/л СО (30% в газовой смеси). Активность мембраносвязанной гидрогеназы в клетках W.eutropha Ъ-1 при концентрациях СО до 2,1 мг/л имела

значения близкие к её значениям в контроле. Повышение концентрации СО приводило к увеличению активности гидрогеназы на 70%.

Рост S.carboxydohydrogena 2-1062 (рис. 5) и Ш.еи^орка 2-1 в присутствии СО сопровождался увеличением содержания цитохромов в клетках. Зависимость одинакова для обоих штаммов.

Культивирование бактерий при концентрациях СО свыше 1,0 и 2,1 мг/л, соответственно, для 1У.еи1горка 2-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 приводило к уменьшению удельных скоростей роста и экономических коэффициентов. При концентрациях моноксида углерода 4,1 и 6,3 мг/л (20 и 30% состава газовой смеси) коэффициенты Ун2 и Уо2 составляли менее 50% от их значений в контроле. При воздействии на культуры Ж.еМгоркж 2-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 концентраций СО более 4,1 и 6,3 мг/л, соответственно, в характере ингибирования происходили качественные изменения, удельная скорость роста бактерий ^ резко падала (рис. 6).

-0-2

2 4 6

концентрация СО, мг/л

Рис. 6. Зависимость удельной скорости роста, экономических коэффициентов по водороду и кислороду культур

Ж.еШгорка (1) и £ сагЬохус1оЬус1^епа 2-1062(2)

от концентрации СО в культуральной среде

При ингибировании роста моноксидом углерода содержание белков и липидов в клетках Ш.еШгорка Z-l и ¿>.carboxydohydrogena Ъ-1062 было таким же, как в контроле. Клетки не накапливали резервных соединений типа полимера Р-гидроксимасляной кислоты, однако повышение концентрации СО увеличивало долю насыщенных и циклопропановых кислот в липидах (табл. 5,6), по-видимому, для обеспечения адаптации цитоплазматической мембраны к воздействию токсиканта.

Таблица 5

Химический состав клеток £ carboxydohydrogena г-1062 при различных концентрациях СО в культуральной среде при культивировании на протоке

Условия культивирования: концентрация СО в культуральной среде, мг/л Химический состав клеток, % к весу сухого вещества Удельная скорость роста, р., час"' Коэффициент насыщенности липидов

Общий азот Белок Липиды Полиокси-бутират

Рост без СО (контроль) 11,0 58,7 9,1 следы 0,38±0,01 0,68

2,1 мг/л 10,8 59,5 10,8 0,2 0,38±0,01 0,74

4,1 мг/л 10,9 57,9 10,6 - 0,23±0,01 0,86

6,3мг/л 10,9 59,2 11,0 2,2 0,16±0,01 0,87

8,2мг/л 11,2 60,2 7,2 1,2 0,6±0,01 0,92

Таблица 6

Химический состав клеток ]¥.еШгор1га Ъ-\, выращенных при различных концентрациях СО в культуральной среде при культивировании на протоке

Условия культивирования: концентрация СО в культуральной среде, мг/л Химический состав клеток, % к весу сухого вещества Удельная скорость роста, ц, час'1 Коэффициент насыщенности липидов

Общий азот Белок Липиды Полиокси-бутират

Рост без СО (контроль) 10,8 57,2 10,3 следы 0,40±0,01 0,53

2,1 мг/л И,4 60,2 10,1 0,6 0,25±0,03 0,63

4,1 мг/л 11,0 60,0 10,1 следы 0,17±0,03 0,96

6,3 мг/л 11,2 59,4 10,0 следы 0,05±0,01 0,89

Дополнительные траты энергии были необходимы также для увеличения поверхности клеток, что достигалось образованием на ней складок (рис. 7).

Рис. 7. Ультраструктура и морфология водородокисляющих бактерий, выращенных при контрольных условиях культивирования (1, 3, 5) и при ингибировании СО (2,4,6).

1 и 2 - ультратонкие срезы клеток

5. сагЪохус1окус1го%епа

г-1062

3 и 4 - поверхность клеток 51. carboxydohydrogena

г-1062

5 и 6 - ультратонкие срезы клеток IV. еМгорИа Х-1

Таким образом, показано, что для культивирования Ж.еи^орка Ъ-1 и S.carboxydohydrogena Ъ-1062 пригодны газовые субстраты с содержанием СО до 20 и 30% соответственно. Воздействие СО сопровождается повышением активности гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках. В липидах цитоплазматической мембраны возрастает доля насыщенных и циклопропановых кислот, что приводит к её упрочнению. Поверхность клеток увеличивается за счет образования складок, что, наряду с повышением активности гидрогеназ и увеличением концентраций цитохромов, обеспечивает более благоприятные условия для потребления субстрата клетками. Бактерии увеличивают удельные затраты энергетического субстрата на синтез биомассы. Увеличение затрат водорода на синтез биомассы обеспечивает сохранение белковой направленности конструктивного обмена бактерий.

Глава 5. Биотехнологический потенциал гидрогеназ водородокисляющих бактерий

Гидрогеназы и препараты, содержащие гидрогеназы, имеют потенциал применения для детритирования воды, получения водорода, конверсии солнечной энергии, в процессах органического синтеза. Для биотехнологических применений необходимо получение биомассы с высокой гидрогеназной активностью.

Таблица 7

Влияние условий автотрофного периодического культивирования на активность гидрогеназы в клетках S.carboxydohydrogena Ъ-1062

Условия культивирования: концентрации газов в культуральной среде, мг/л Активность гидрогеназы, и/мг белка Время культивирования до достижения наибольших значений гидрогеназной активности, ч

Контроль 0,92±0,04 52±2

Лимитирование роста О2: 0,5 мг/л О2 1,06±0,06 63±3

Лимитирование роста 02: 0,3 мг/л Ог 1,03±0,06 98±3

Лимитирование роста Н2: 0,37 мг/л Н2 1,23±0,05 61±4

Лимитирование роста Н2: 0,18 мг/л Н2 1,56±0,08 68±3

Лимитирование роста Н2: 0,10 мг/л Н2 1,73±0,07 83±5

Ингибирование роста 02: 5,2 мг/л Ог 0,58±0,04 67±3

Лимитирование роста СО2: 4 мг/л СОг 0,74±0,03 65±3

Таблица 8

Влияние условий автотрофного периодического культивирования на получение максимальных значений активностей гидрогеназ в клетках ¡¥.еШгорИа Z-l

Условия культивирования: концентрации газов в культуральной среде, мг/л Активность гидрогеназ, и/мг белка Время культивирования до достижения наибольших значений активностей гидрогеназ, ч

Растворимая Мембрано-связанная

Контроль 0,62±0,06 2,1 ±0,2 26±2

Лимитирование роста Ог: 0,5 мг/л 02 1,1±0,1 3,1 ±0,4 43±2

Лимитирование роста 02: 0,3 мг/л Ог 1,4±0,2 3,3±0,2 56±3

Лимитирование роста Н2: 0,18 мг/л Н2 7,2±0,4 4,7±0,2 76±4

Лимитирование роста Н2: 0,10 мг/л Н2 9,1 ±0,3 5,1 ±0,2 98±3

Ингибирование роста 02: 5,2 мг/л 02 0,29±0,04 1,3±0,2 45±2

Лимитирование роста С02: 4 мг/л СОг 0,34±0,05 1,8±0,3 47±3

Выявлены условия культивирования водородокисляющих бактерий, максимализирующие активность гидрогеназ в их клетках. Показано, что в условиях непрерывного культивирования наиболее высокие активности гидрогеназы в клетках S.carboxydohydrogena 2-1062 составляли около 0,8 ТГ/мг белка при лимитировании роста по водороду. Выращивание S.carboxydohydrogena 2-1062 в периодическом режиме позволило получить биомассу с более высокими значениями активности, до 1,7 ТГ/мг белка в фазе замедления роста при лимитировании по водороду (табл. 7). Автотрофный рост Ж.еМгорка Z-l в периодической культуре также позволил получить биомассу с

более высокими значениями активностей гидрогеназ по сравнению с непрерывным культивированием - до 9 и 5 и/мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ в фазе замедления роста при лимитировании по водороду (табл. 8).

Разработанный режим гетеротрофного культивирования И^.еи^орИа Z-l с переключением роста на бедный энергией субстрат (глицерин) позволил получать активности 11 и 5 и/мг белка соответственно для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ (рис. 8).

Цитрзт + глицерин

Субстраты культивирования

5 т а аз

Глуташт+ глицерин

Омембраносвязанная гидрогеназо Шрастворимая гидрогеназа ■^бремя достижения наибольшей гидрогеназной активности

Рис.8. Влияние условий гетеротрофного периодического культивирования со сменой субстрата на получение максимальных значений гидрогеназной активности в клетках УУ.еЫгорка Ъ-1.

Таким образом, создание условий лимитирования по энергетическому субстрату в фазе замедления роста при периодическом культивировании позволило получить партии биомассы \¥.еи1гор}ш Ъ-\ с высокой активностью гидрогеназ и приступить к оценке ее биотехнологического потенциала.

Сконструирована аналитическая биолюминесцентная система, состоящая из НАД+-зависимой гидрогеназы Цг.еи1горка Ъ-1, редуктазы и люциферазы светящихся бактерий и исследована динамика интенсивности люминесценции этой системы в зависимости от концентрации НАД+, Н2, активности гидрогеназы и рН (рис.9).

В диапазоне концентраций 20-100мкМ НАД* скорость нарастания люминесценции максимальна и не зависит от концентрации НАД*. Дальнейшее увеличение концентрации НАД+ приводило к убыванию сигнала. Скорость нарастания люминесценции пропорциональна активности гидрогеназы. В пределах рН от 8 до 9 величина сигнала практически не зависит от значений рН. В диапазоне концентраций водорода от 0,1мкМ до 0,1мМ скорость нарастания люминесценции пропорциональна концентрации водорода. Такое свойство данной системы позволяет использовать её для измерения концентрации водорода. Чувствительность разработанной системы к водороду -ОДнмоль в пробе.

dl/dt^i/uan 710 -

гго

-« -j 1д([НАДЧ,М)

-0,5

I t,s г

Lg (А, U/мг белка)

-7,5 -7 -6,5 -6 -5,5 -5 -1.5 -1 le ММ)

Рис. 9. Динамика интенсивности люминесценции аналитической системы гидрогеназа-редуктаза-люцифераза в зависимости от начальной концентрации НАД+, M (1), активности гидрогеназы, U/мг белка (2), рН среды (3) и начальной концентрации Нг, M (4)

Для стабилизации гидрогеназной активности клеток W.eutropha Z-1, использованы методы их иммобилизации в полиакриламидные и альгинатные гели и исследована их эффективность. Наиболее эффективным матриксом оказался альгинат кальция. Бактерии, иммобилизованные в альгинатном геле в виде гранул, сохраняли около 80% исходной гидрогеназной активности в

течение 7 суток хранения и до 50% исходной активности после 14 суток хранения при 4°С (рис. 10).

Неиммобили-зованные клетки

10% ПААГ

7% ПААГ

0,8% альгинат

■ в реакции восстановления НАД □ б реакции восстановления метипенового синего

Рис.10. Стабильность препаратов иммобилизованных клеток бактерий ЖеШгорИа Ъ~ 1 при температуре 4° С.

Иммобилизованные в альгинатный гель клетки ¡У.еМгорка Ъ-\ использовали для конструирования систем регенерации НАДН. Была исследована динамика восстановления НАД1" водородом в реакторе непрерывного действия с перемешиванием, а также в проточном реакторе колоночного типа с вытеснением. Рабочий объем каждого реактора содержал суспензию сферических частиц диаметром около 1мм, представляющих из себя препараты клеток 1¥.еи1горка Ъ-1, иммобилизованных в альгинатный гель.

60 мин

Накопление продукта (НАДН)

(1) в реакторе непрерывного действия с перемешиванием Ур = 30 мл,

Угеля = 4 мл,

0,1 М К-фосфатный буфер, рН 7,8, [НАДН]о = 1 мМ, 20°С

(2) в проточном реакторе колоночного типа с вытеснением Угеля = 4 МЛ,

0,1 М К-фосфатный буфер, рН 7,8, [НАДН] о = 1 мМ, 20°С

Рис. 11. Каталитическая активность иммобилизованных в альгинат кальция клеток Ц^.еиКорИа в реакции восстановления НАД1" водородом.

Данные системы обеспечивали более 98% конверсии НАД1" менее чем за час. Их преимуществами являются: относительная доступность восстановителя (водород), абсолютная стереоспецифичность восстановления НАД+, отсутствие побочных продуктов в реакции восстановления, простота отделения субстрата от катализатора (рис. 11).

Таким образом, показано, что высокоактивная по НАД+-зависимой гидрогеназе биомасса Ж.еМгорка Ъ-1 эффективна для для получения технологичных препаратов. Анлитическая система, включающая НАД+-зависимую гидрогеназу Ж. еШгорИа Ъ-1, а также редуктазу и люциферазу обладает высокой чувствительностью к водороду. Устойчивые к хранению препараты клеток Ш.еи^орИа Ъ-1, иммобилизованных в альгинатный гель, эффективно использовали как катализаторы для регенерации НАД1".

ВЫВОДЫ

1. Исследована динамика активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках Ж.еиКорНа 1-1 и S.carboxydohydrogena 2-1062 и энергетической эффективности роста культур в зависимости от условий культивирования. Установлено, что изменения активности гидрогеназ и концентраций цитохромов не связаны напрямую с энергетической эффективностью роста. Максимальные значения активностей гидрогеназ зарегистрированы при лимитировании роста бактерий по водороду, а наименьшие — при ингибировании роста кислородом. Наибольшие концентрации цитохромов в клетках наблюдались при лимитировании роста по кислороду, а наименьшие - при ингибировании роста кислородом.

2. Выявлено, что изменения концентраций компонентов газового субстрата (Н2+СО2+О2), вызывающие изменения гидрогеназных активностей и концентраций цитохромов в клетках бактерий, не изменяют белковую направленность биохимического синтеза. Исключение составляет лимитирование роста \¥.еи&ор1га Ъ-\ кислородом, приводящее к накоплению резервного соединения поли-Р-гидроксимасляной кислоты.

3. Установлено, что Ж.е^горИа Ъ-\ и 5.carboxydohydrogena 7-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрации до 20% в результате повышения удельных трат энергетического субстрата (в 1,41,9 раза при 20% СО), обеспечивающих адаптивные изменения: повышение синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиление мембранного аппарата. При этом белковая направленность синтеза не меняется.

4. Разработаны режимы культивирования, позволяющие в автотрофных и гетеротрофных условиях получать биомассу, высокоактивную по гидрогеназам (до 11 и 5 и / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ \V.eutropha Ъ-1 и 2 и/мг белка для гидрогеназы S.carboxydohydrogena 2-1062).

5. С использованием НАД+-зависимой гидрогеназы W.eutropha Z-1 сконструирована аналитическая полиферментная система, позволяющая регистрировать Н2, с высокой чувствительностью (до 0,1 нмоль в пробе) в диапазоне рН 8 - 9.

6. Отработаны условия иммобилизации клеток W.eutropha Z-1 в альгинатный гель, с получением препаратов, сохраняющих более 50% исходной гидрогеназной активности в течение двух недель. Использование данных препаратов для регенерации НАДН обеспечивает более 98% конверсии НАД+ в час.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волова, Т. Г. Особенности метаболизма и ультратонкой организации карбоксидобактерий при выращивании их на средах с окисью углерода / Т. Г. Волова, О. А. Гусейнов, Г. С. Калачева, Е. Н. Кондратьева, С. Е. Медведева,

A. П. Пузырь, Я. В. Федорова // Микробиология. - 1988. - Т. 57, вып. 5. - С. 793798.

2. Петров, Р. Р. Использование иммобилизованных клеток водородных бактерий Alcaligenes eutrophus для получения НАДН / Р. Р. Петров, О. А. Гусейнов, Н. Д. Савельева, В. О. Попов, В. В. Карзанов // Прикладная биохимия и микробиология. - 1989. - Т. 25, вып. 6. - С. 781-784.

3. Плотников, В. Ф. Влияние окиси углерода на метаболизм водородных бактерий Alcaligenes eutrophus Z-1 / В. Ф. Плотников, О. А. Гусейнов, Т. Г. Волова, Я.В.Федорова, О. А. Могильная // Микробиология. - 1990. - Т. 59, вып. 2.-С. 226-233.

4. Гусейнов, О. А. Влияние параметров культивирования на уровень гидрогеназной активности в клетках Alcaligenes eutrophus Z-1/ О. А. Гусейнов,

B. Ф. Плотников//Микробиология. -1991. -Т. 60, вып. 2. - С. 221-226.

5. Петушков, В. Н. Биолюминесцентный метод определения активности НАД-зависимой гидрогеназы / В. Н. Петушков, О. А. Гусейнов // Прикладная биохимия, и микробиология. - 1992. - Т. 28, вып. 6. - С. 907-911.

6. Volova, Т. G. Effect of carbon monoxide on metabolism and ultrastructure of carboxydobacteria / T. G. Volova, O. A. Guseinov, G. S .Kalacheva, S. E. Medvedeva, A. P. Pusir// World Journal of Microbiology and Biotechnology. - 1993. - Vol. 9, N. 2. -P. 160-163.

7. A. c. 1242523 СССР, МКИ4 С 12 P 1/06. Способ получения цитохрома С. / А. В .Кондрасенко, О. А. Гусейнов, И. Н. Трубачев, В. К. Филиппова (СССР). -№ 3575412/28-14 ; заявлено 24.01.83 ; опубл. 05.04.86, Бюл. № 25. - 2с.

Гусейнов Олег Аладдин оглы Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 17.11.2008. Заказ ^//Оё Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано в ИПК СФУ 660074, Красноярск, ул. Киренского, 28

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гусейнов, Олег Аладдин оглы

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ БАКТЕРИИ: ВИДОВОЙ СОСТАВ И РАСПРОСТРАНЕНИЕ, МЕТАБОЛИЗМ, МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ИММОБИЛИЗАЦИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Видовой состав и распространение водородокисляющих бактерий.

1.2. Метаболизм аэробных водородокисляющих бактерий.

1.3. Особенности метаболизма водородокисляющих бактерий, способных расти на моноксиде углерода.

1.4. Специфика культивирования водородокисляющих микроорганизмов.

1.4.1. Методы и техника культивирования.

1.4.2. Особенности газового питания.

1.5. Биосинтез и трансформация веществ иммобилизованными клетками микроорганизмов.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Микроорганизмы.

2.2. Культивирование и методики измерения параметров процесса.

2.3. Физиологические исследования.

2.4. Контроль химических параметров культивирования, определение биохимического состава и энзиматические исследования биомассы.

2.5. Использование препаратов гидрогеназ и иммобилизованных клеток водородокисляющих бактерий для регистрации концентрации водорода в среде и восстановления НАДН.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ГАЗОВОГО ПИТАНИЯ НА РОСТ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ.

3.1. Энергетическая эффективность роста и физиолого-биохимические характеристики культуры в условиях, обеспечивающих максимальную скорость роста.

3.2. Влияние лимитирования и ингибирования роста культуры компонентами газовой среды на характеристики системы энергообмена.

3.2.1. Лимитирование и ингибирование роста кислородом.

3.2.2. Лимитирование роста двуокисью углерода и водородом.

3.3. Физиолого-биохимические характеристики клеток при лимитировании и ингибировании роста культуры компонентами газовой среды.

Глава 4. ЭНЕРГЕТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РОСТА И

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КУЛЬТУРЫ ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ ПРИ ИНГИБИРОВАНИИ МОНОКСИДОМ УГЛЕРОДА.

4.1. Зависимость активностей гидрогеназ и концентраций цито-хромов в клетках бактерий от концентрации моноксида углерода

4.2. Влияние моноксида углерода на энергетическую эффективность роста водородокисляющих бактерий.

4.3. Влияние моноксида углерода на физиолого-биохимические характеристики клеток.

Глава 5. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ ГИДРОГЕНАЗ

ВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ.

5.1. Определение условий культивирования, обеспечивающих высокую гидрогеназную активность в клетках водородокисляющих бактерий.

5.1.1. Определение параметров культивирования

S. carboxydohydrogena Z

5.1.2. Определение параметров культивирования

W. eutrophaZ-l

5.2. Исследование аналитической полиферментной системы, содержащей НАД+-зависимую гидрогеназу W.eutropha Z-1, редуктазу и люциферазу светящихся бактерий.

5.3. Исследование иммобилизованных клеток W.eutropha Z

5.3.1. Стабилизация гидрогеназной активности клеток водородных бактерий при их иммобилизации.

5.3.2. Использование иммобилизованных клеток W.eutropha

Z-1 для получения НАДН.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние газового субстрата на гидрогеназную активность и концентрации цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий"

Одним из важнейших направлений биотехнологии является получение целевых продуктов с помощью микроорганизмов. Возрастающие темпы потребления невозобновляемых энергетических ресурсов, накопления неутили-зируемых и трудно утилизируемых продуктов деятельности людей ставят перед учеными задачи разработки экологически приемлемых технологий. Поэтому становится актуальным использование в качестве продуцентов бактерий, энергетическим субстратом которых служит водород. Человечество все чаще обращается к его использованию, поскольку водород является экологически чистым и возобновляемым источником энергии. Расширение масштабов использования энергии водорода ведет к удешевлению этого субстрата, что открывает путь к внедрению технологий на водороде. В связи с этим, весьма привлекательно использование для получения целевых продуктов автотрофных (хемолитотрофных) бактерий, для которых ростовым субстратом служит водород. Конструктивный обмен и фиксация С02 у данных бактерий реализуются в цикле Кальвина. Их энергетическая система состоит из полной цепи переноса электронов и ферментов, окисляющих водород — гидрогеназ.

Перспективными продуцентами целевых продуктов являются хемоли-тотрофные водородокисляющие бактерии Wantersia eutropha (Alcaligenes еи-trophus) Z-1 и Seliberia carboxydohydrogena Z-1062, ввиду их быстрого роста и хорошей приспособляемости к различным условиям культивирования. Представляют интерес исследования возможности использования этими бактериями водорода промышленного происхождения для поточного получения полиоксиалканоатов, аминокислот, липидов, белковых препаратов, ферментов, витаминов и других биологически активных продуктов. Кроме того, ключевые ферменты водородного метаболизма - гидрогеназы, могут использоваться при создании биосенсорных систем для мониторинга содержания водорода и других параметров в среде культивирования.

Эффективность использования энергетического субстрата определяется уровнем сопряжения систем катаболизма и анаболизма и функциональным состоянием энергетической системы бактерий. Для получения высокого выхода целевого продукта с эффективными тратами субстрата при культивировании бактерий необходимо знать, как условия среды влияют на состояние энергетической системы клеток, которая является центральным звеном регуляции метаболизма. Воздействие на этом уровне может положительно влиять на эффективность биотехнологических процессов. Для управления режимом культивирования водородокисляющих бактерий Wantersia eutropha Z-1 и Se-liberia carboxydohydrogena Z-1062 предстояло выяснить, как меняются гидро-геназная активность и концентрации цитохромов в их клетках, а также энергетическая эффективность их роста при изменении параметров газового субстрата.

Цель работы: Целью настоящей работы было изучение влияния условий газового питания на уровень гидрогеназных активностей и концентраций цитохромов в клетках W. eutropha Z-1 и S. carboxydohydrogena Z-1062 с учетом энергетической эффективности их роста, а также оценка перспектив биотехнологического применения гидрогеназ.

Основные задачи работы:

1. Исследовать влияние концентаций Н2, СО2 и 02 в культуральной среде на уровень активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках водородокисляющих бактерий W. eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 и энергетическую эффективность роста культуры.

2. Исследовать взаимосвязь уровня активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках с другими физиолого-биохимическими характеристиками культуры (удельной скоростью роста, эффективностью использования субстратов и конструктивным обменом клеток).

3. Изучить динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов, а также других физиолого-биохимических параметров клеток W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от концентрации моноксида углерода в газовом субстрате.

4. Определить условия культивирования, положительно влияющие на активность гидрогеназ в клетках данных бактерий.

5. Оценить биотехнологический потенциал препаратов гидрогеназ W. еи-tropha для разработки систем детекции водорода и восстановления НАД\

В результате выполнения работы было получены данные, характеризующие динамику активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 в зависимости от условий культивирования. Установлено, что наибольшие активности гидрогеназ достигаются при лимитировании роста бактерий по энергетическому субстрату; наименьшие - при ингибировании кислородом. Максимальные концентрации цитохромов характерны для клеток, выращенных при лимитировании роста по Ог, а наименьшие — при ингибировании 02. Показано, что повышение гидрогеназной активности и концентраций цитохромов при лимитировании роста по Н2 не сопровождается снижением эффективности использования энергии водорода. Установлена специфическая СО-устойчивость W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062; под воздействием токсиканта в клетках возрастает гидрогеназная активность и концентрации цитохромов, а также укрепляется мембранный аппарат. Эти изменения сопровождаются снижением эффективности использования энергии водорода при сохранении белковой направленности конструктивного обмена.

Установлены параметры процесса культивирования, позволяющие получать партии биомассы W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 с высокой гидрогеназной активностью (до 11 и 5 U / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ W.eutropha Z-1 и 2 U / мг белка для гидроге-назы S.carboxydohydrogena Z-1062). Определены условия, при которых в присутствии СО возможен устойчивый и продуктивный рост этих бактерий; результатами обоснована возможность их выращивания на водородсодержащих субстратах, получаемых конверсией природного газа или переработкой углей. Показана пригодность аналитической системы, содержащей НАД+-зависимую гидрогеназу W.eutropha Z-1, редуктазу и люциферазу, для детекции водорода (с точностью до 0,1 нмоль в пробе).

Положения, выносимые на защиту:

1. Реакция W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 на изменение условий газового питания включает изменения их гидрогеназной активности и концентраций цитохромов, сопровождающиеся изменением энергетической эффективности роста.

2. W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрациях до 20% без изменения биохимической направленности синтеза за счет адаптивных изменений: повышения синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиления мембранного аппарата. При этом удельные траты энергетического субстрата возрастают (предельное увеличение - в 1,4-1,9 раза при 20% СО).

3. Препараты НАД^-зависимой гидрогеназы и биомасса клеток W. eutropha Z-1 перспективны для создания систем регистрации водорода и восстановления НАД*.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гусейнов, Олег Аладдин оглы

ВЫВОДЫ

1. Исследована динамика активностей гидрогеназ и концентраций цитохромов в клетках W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 и энергетической эффективности роста культур в зависимости от условий культивирования. Установлено, что изменения активности гидрогеназ и концентраций цитохромов не связаны напрямую с энергетической эффективностью роста. Максимальные значения активностей гидрогеназ зарегистрированы при лимитировании роста бактерий по водороду, а наименьшие - при ингибировании роста кислородом. Наибольшие концентрации цитохромов в клетках наблюдались при лимитировании роста по кислороду, а наименьшие -при ингибировании роста кислородом.

2. Выявлено, что изменения концентраций компонентов газового субстрата (Н2+СО2+О2), вызывающие изменения гидрогеназных активностей и концентраций цитохромов в клетках бактерий, не изменяют белковую направленность биохимического синтеза. Исключение составляет лимитирование роста W.eutropha Z-1 кислородом, приводящее к накоплению резервного соединения поли-р-гидроксимасляной кислоты.

3. Установлено, что W.eutropha Z-1 и S.carboxydohydrogena Z-1062 способны к росту на газовом субстрате, содержащем СО в концентрации до 20% в результате повышения удельных трат энергетического субстрата (в 1,4-1,9 раза при 20% СО), обеспечивающих адаптивные изменения: повышение синтеза гидрогеназ и цитохромов, усиление мембранного аппарата. При этом белковая направленность синтеза не меняется.

4. Разработаны режимы культивирования, позволяющие в авто-трофных и гетеротрофных условиях получать биомассу, высокоактивную по гидрогеназам (до 11 и 5 U / мг белка для растворимой и мембраносвязанной гидрогеназ W.eutropha Z-1 и 2 U/мг белка для гидрогеназы S.carboxydohydrogena Z-1062).

5. С использованием НА Д+-зави си мой гидрогеназы W.eutropha Z-1 сконструирована аналитическая полиферментная система, позволяющая регистрировать Н2, с высокой чувствительностью (до 0,1 нмоль в пробе) в диапазоне рН 8-9.

6. Отработаны условия иммобилизации клеток W.eutropha Z-1 в альгинатный гель, с получением препаратов, сохраняющих более 50% исходной гидрогеназной активности в течение двух недель. Использование данных препаратов для регенерации НАДН обеспечивает более 98% конверсии НАД1" в час.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гусейнов, Олег Аладдин оглы, Красноярск

1. Балашова, В. В. Анаэробное восстановление окисленного железа в водородных бактериях / В. В. Балашова, Г. А. Заварзин // Микробиология. - 1979. - Т. 48, № 5. - С. 773-778.

2. Бекер, М. Е. Системы с иммобилизованными клетками для получения биогаза и этанола: Иммобилизованные клетки в биотехнологии. / М. Е. Бекер и др. Пущино: Издательство Научного центра биол. Исследований АН СССР, 1987. - С. 56-62.

3. Беляева, М. И. Усвоение молекулярного азота водородными бактериями / М. И. Беляева // Уч. Зап. Казанского ун-та. Сер. биол. -1954а. — Т. 114,№ 1.-С. 13-21.

4. Вальтер, О. А. Практикум по физиологии растений с основами биохимии. / О. А. Вальтер, JI. М. Пиневич, Н. И. Варасова. Москва: Издательство сельхоз. литературы, 1957. - 341 с.

5. Веденина, И. Я. Автотрофная ассимиляция углекислоты водородными бактериями Hydrogenomonas Z1 : автореф. дис. канд. биол. наук : 03.00.07 / И. Я. Веденина. М.: ИНМИ, 1968. - 21 с.

6. Веденина, И. Я. Влияние кислорода на превращение рибулозо-1,5-дифосфата у водородной бактерии Hydrogenomonas eutropha / И. Я. Веденина, А. К. Романова // Микробиология. — 1975. Т. 44, вып. 6. — С. 111-120.

7. Веселов, В. В. Катализаторы конверсии углеводородов / В. В. Веселов, Н. П. Галенко. Киев: Наукова думка, 1979. - 190 с.

8. Владимирова, М. Г. Интенсивная культура одноклеточных водорослей / М. Г. Владимирова, В. Е. Семененко. М.: Изд-во АН СССР, 1962. -59 с.

9. Войтович, Я. В. Автотрофное выращивание водородных бактерий в непрерывной культуре / Я. В. Войтович и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 1971. - Т. 7, № 2. - С. 183-186.

10. Войтович, Я. В. Эксперименты по непрерывному культивированию Alcaligenes eutrophus / Я. В. Войтович, П. И. Пономарев, И. А. Тер-сков // Изв. СО АН СССР. Сер. биол. 1969, Вып. 1. - С. 57-60.

11. Волова, Т. Г. Биосинтез на водороде / Т. Г. Волова. Новосибирск: Издательство СО РАН, 2004. - 398с. - ISBN 5-7692-0693-4.12.