Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и функция комплекса цитохрома c с кардиолипином

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Структура и функция комплекса цитохрома c с кардиолипином"

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ КОМПЛЕКСА ЦИТОХРОМА С С КАРДИОЛИПИНОМ

03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

16 май т

Москва-2013

005058008

Работа выполнена в Государственном учебно-научном учреждении Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В Ломоносова.

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Проскурнииа Елена Васильевна

Официальные оппоненты: Красновский Александр Александрович - доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, заведующий лабораторией биохимии синглетного кислорода.

Добрецов Геннадий Евгеньевич — доктор физико-математических наук, профессор, член-корреспондент РАМН, ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, заведующий лабораторией биофизических методов диагностики.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической физики им. H.H. Семенова РАН.

О О

Защита состоится -i^—P 2013 года в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства" по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России.

Автореферат разослан «^»fl-уг-Сл^ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Программируемая смерть клеток (апоптоз) играет важную роль в морфогенезе и в развитии патологических состояний. Центральным событием в развитии апоптоза, как правило, является выход цитохрома с из митохондрий с последующим запуском каскада апоптотических реакций в клетке. Выход цитохрома с (Цит) становится возможным благодаря повреждению внутренней мембраны в результате перекисного окисления липидов (1^ап е1 а1., 2005), при этом пусковым механизмом служит превращение цитохрома в пероксидазу при его взаимодействии с кардиолипином (КЛ). К сожалению, как структура комплекса цитохрома с с кардиолипином, так и механизм его пероксидазного действия па органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало изучены. В данной работе проведено исследование структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином, изучена пероксидазная функция этого комплекса в разных условиях. Показано, что этот комплекс обладает способностью разлагать липогидропероксиды с образованием пероксильных радикалов и липопероксидазным действием. Исследовано влияние антиоксидантов на реакции, катализируемые комплексом Цит-КЛ. Полученные результаты помогут в будущем разработать методы управления апоптозом, что имеет большое значение для лечения ряда важнейших патологий.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить состав и структуру комплекса цитохрома с с кардиолипином.

2. Изучить пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с кардиолипином и жирными кислотами.

3. Исследовать взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами, а так же влияние пероксида водорода на данное взаимодействие.

4. Исследовать влияние антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ и на взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами.

Научная новизна исследования

В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Было определено молярное соотношение КЛ:Цит в комплексах, полученных при различных значениях рН, и показано, что могут формироваться два устойчивых комплекса, один в нейтральной, в другой - в кислой среде (при рН меньше 5,5). Оценено значение растворимости. Показана возможность перехода этого комплекса в гидрофобную среду и определен состав комплекса в гидрофобной среде.

Впервые была изучена структура осадка комплекса Цит-КЛ при различных рН среды методами малоуглового рентгеновского рассеяния. Полученные данные подтвердили вывод о существовании двух типов комплексов, имеющих разное соотношение КЛ:Цит и соответственно разный диаметр наносфер, которые в водном растворе образуют микрокристаллы с различными расстояниями между отражающими плоскостями. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ при различных рН среды.

Впервые методом активированной хемилюминесценции показана способность комплекса цитохрома с с липидами разлагать липогидропероксиды с образованием свободных липопероксильных радикалов. Показана способность комплекса окислять жирную кислоту пероксидом водорода с образованием липопероксильного радикала (липопероксидазная функция комплекса).

Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную

активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование

4

липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов комплексом цитохрома с с линолевой кислотой (Цит-ЛК). Практическое значение работы

Основным результатом работы является углубление фундаментальных знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки.

Данные о структуре комплекса цитохрома с с кардиолипином и механизме реакций, которые он катализирует, имеют решающее значение для контроля апоптоза с целью профилактики и лечения болезней человека.

Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических хемилгаминесцентных методик для определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе. Все эти методы могут найти применение в лабораторной практике.

Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов медицинской биофизики в медицинских вузах и университетах. Положения, выносимые на защиту

1. Комплекс Цит-КЛ представляет собой соединение определенного состава, малорастворимое в воде и хорошо растворимое в гидрофобной среде, причем состав комплекса и структура осадка зависит от рН среды.

2. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса на два порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена. Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой.

3. Комплексы цитохрома с с кардиолипином или с линолевой кислотой катализируют реакцию разложения липидных гидропероксидов, при этом образуются свободные радикалы и вторичные продукты перекисного окисления. Было показано образование пероксильных радикалов при окислении липидов пероксидом водорода, катализируемое комплексом цитохрома с; таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает липопероксидазной активностью.

4. Антиоксиданты действуют на пероксидазную функцию Цит-КЛ путем взаимодействия с продуктом реакции свободных радикалов со вторым субстратом (люминолом). Антиоксиданты также действуют на реакции образования липопероксильных радикалов при разложении липидных гидропероксидов.

Внедрение результатов

Разработанные хемилюминесцентные методики определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и определения липидных гидропероксидов в водной среде являются частью практического курса кафедры медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Полученные данные о структуре и свойствах комплекса Цит-КЛ являются составной частью лекционных курсов указанной кафедры.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных научных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора

Все данные в диссертации, были получены лично автором; в немногих случаях, когда в работе участвовали также и другие сотрудники, это специально оговорено в тексте диссертации. С этой целью автор освоил все используемые в работе методы. Лично автором проведена также и обработка и статистический анализ результатов.

Апробация работы

Основные результаты диссертации были представлены в устных докладах, а также тезисах трех конференций, среди которых: Пироговская студенческая научная медицинская конференция (Москва, 2011); 9-я Международная специализированная выставка по аналитической химии «Аналитика Экспо» (Москва, 2011); научный Симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской биофизики» (Москва, 2012).

Диссертационная работа апробирована 17 сентября 2012 г. на совместном заседании кафедры медицинской биофизики Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова и кафедры общей и медицинской биофизики ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава РФ.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 4 главы результатов и обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 133 источника. Работа выполнена на 128 страницах машинописного текста. Иллюстрированный материал представлен 88 рисунками и 5 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали трис-HCl, КН2РО4, КОН, Na2S03, калия гидрофталат, Н202, хлороформ, н-гексан, метанол, FeS04 (все не ниже х.ч.), цитохром с из сердца лошади, линолевая кислота, линоленовая кислота (все фирмы "Sigma"), 1,Г,2,2'-тетраолеилкардиолипин (КЛ) ("Avanti Polar Lipids"), соевый лецитин ("ICN Biochcmicals"), люминол, 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан)гидрохлорид (АБАП), пероксидаза из корней хрена (ПХ), /я/?<?те-бутилгидропсроксид (все фирмы "Fluka"), кумарин С-525 ("Альфа-Аконис"), антиоксиданты: тролокс ("Aldrich"), кверцетин, аскорбат натрия (все фирмы "Fluka").

Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра SPECORD 200 ("Analytic Jena", Германия). Измерения проводили в стеклянных и пластиковых кюветах с длиной оптического пути 1,00 см.

Для измерения хемилюминесценции (XJI) использовали хемилюминометр SmartLum-5773 ("ИнтерОптика-С", Россия).

Измерения интенсивности малоуглового рассеяния проводились при фиксированной длине волны излучения X = 0,1542 нм (Си£а - линия

острофокусной трубки ISO-DEBYEFLEX 3003 с медным анодом), и коллимационной системой Кратки.

Все измерения проводили при комнатной температуре 22°С.

Математическое моделирование

Для изучения механизма хемилюминесцентных реакций использовали подход, основанный на математическом моделировании кинетики хемилюминесцентной кривой. Математическое моделирование производили при помощи программы "Kinetic Analyser" (автор Д.Ю.Измайлов) путем построения теоретических кинетических кривых при заданных константах скоростей и начальных концентрациях и сопоставления с экспериментальными зависимостями.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего значения M и погрешности S (М± <5). Погрешность S рассчитывали по формуле: S - i(p/)-SD/%'n, где t(p.f) — коэффициент Стьюдента, р — доверительная вероятность, где п — число измерений, / — число степеней свободы (/=и-1). Относительное стандартное отклонение sr рассчитывали по формуле: jr=SD/M. Предел обнаружения cmin рассчитывали по формуле: cmin=3-SDo/k, где SDo - стандартное отклонение фонового сигнала, к - коэффициент чувствительности. За коэффициент чувствительности к принимали коэффициент наклона градуировочной прямой. Линеаризацию данных проводили с использованием метода наименьших квадратов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Исследование структуры комплекса Цит-КЛ

Определение состава осадка комплекса Цит-КЛ и его растворимости

К известному количеству цитохрома с добавляли известные разные количества кардиолипина, при этом кардиолипин связывался с белком с образованием осадка. После добавления кардолипина раствор центрифугировали, супернатант отделяли от осадка и измеряли спектр поглощения в диапазоне 360-460 нм, в котором поглощает цитохром с или его комплекс (полоса Соре 409 нм). Концентрация цитохрома с в растворе линейно

уменьшалась в зависимости от количества добавленного кардиолипина до момента, когда осадок переставал образовываться, а дальнейшее добавление кардиолипина приводило к увеличению экстинкции за счет светорассеяния (рис. 1). В точке А (рис. 1), по всей видимости, присутствует комплекс в растворенном виде, таким образом, по оптической плотности в точке А может быть оценена молекулярная растворимость комплекса.

250-

200-ч

150 -

е*хн

50 Н

о

с(КЛ):с(Ц1гг) = 59

0 2000 4000 6000 800Э 10000 12000 14000 16000 с (КЛ), мкМ

Рис. 1. Определение состава комплекса Цит-КЛ методом спектрофотометрического титрования при рН 7,4. Добавление 1 мМ кардиолипина каждый раз связывает 17 мкМ цитохрома с с образованием осадка. Экстраполяция полученной зависимости на ось абсцисс дает количество кардиолипина, полностью связывающего цитохром с и позволяет рассчитать стехиометрическое соотношение в осадке. В точке А добавление КЛ не приводит к дальнейшему образованию осадка, поглощение, по всей вероятности, обусловлено растворимой формой комплекса.

Предполагаемая схема образования комплекса (без учета протонов): Цит + пКЛ <->Цит-Ю1„ (водн) <-+ Цит-ЮТД (схема 1)

Существование в водной фазе комплекса подтверждено наличием у раствора над осадком пероксидазной активности, характерной для комплекса Цит-КЛ, но не для цитохрома с.

При различных значениях рН установлен стехиометрический состав комплекса и рассчитаны значения растворимости (табл. 1).

Таблица 1. Растворимость 5 и состав комплекса Цит-КЛ, подученного при различных значенияхрН в водной среде.

Буферный раствор КН2Р04 20 мМ КН2Р04 20 мМ КН2Р04 20 мМ 1Ш2Р04 20 мМ Фталатный 50 мМ

рн 7,4 6,5 5,5 4,1 3,7

КЛ:Цит 59±7 38±5 13±3 14±3 13±4

S, мкмоль/л 31 32 28 — —

Таким образом, в нейтральной среде (рН 7,4) вокруг молекулы цитохрома с координируется 59±7 молекул кардиолипина. Эта величина согласуется с вышеизложенной гипотезой о строении комплекса и подтверждается простейшими расчетами. Глобула этого белка имеет форму эллипсоида с соотношением осей 4,0 X 3,5 X 3,0 нм, площадь поверхности составляет примерно 40 нм2. Данные о размерах фосфолипидной головки кардиолипина варьируют, но поперечное сечение трех жирнокислотных цепей (четвертая погружена вглубь цитохрома) составляет примерно 0,6 нм2. Таким образом, на поверхности белка при плотной упаковке могут расположиться до 65 молекул кардиолипина.

При понижении рН среды от 7,4 до 5,5 соотношение КЛ:Цит уменьшается, и далее остается постоянным, что, вероятно, связано с протонированием кислотных групп кардиолипина (р&"а = 6 (Haines, 2002)) и ослабеванием электростатических взаимодействий.

Определение состава комплекса Цит-KJI в гидрофобной среде

Методом спектрофотометрии показано, что цитохром с при взаимодействии с кардиолипином экстрагируется в гидрофобную среду в виде комплекса определенного состава. Готовили смеси цитохрома с с кардиолипином различного состава и экстрагировали в смесь

метанол:хлороформ = 1:2 по объему, далее измеряли оптическую плотность гидрофобной фазы. При увеличении соотношения КЛ:Цит оптическая плотность гидрофобной фазы линейно увеличивалась (рис. 2), что свидетельствовало об увеличении в ней концентрации комплекса.

По тангенсу угла наклона прямой на рис. 2 определено соотношение КЛ: Цит. При рН 7,4 эта величина составляет 57±6, что хорошо согласуется величиной, полученной для осадка (59±7). Таким образом, экстрагируется именно комплекс цитохрома с с кардиолипином. Полученные данные также свидетельствуют в пользу гидрофобности комплекса, в молекуле которого жирнокислотные хвосты кардиолипина направлены наружу, а гидрофильные головки внутрь.

Исследование кристаллической структуры осадка комплекса Цит-КЛ

Цитохром с в присутствии кардиолипина образует нерастворимый в одной среде комплекс. Исследование осадка комплекса Цит-КЛ методом малоуглового рентгеновского рассеяния показало, что при рН 7,4 осадок представляет собой микрокристаллическую структуру с межплоскостным расстоянием между кристаллами 10,5±0,4 нм. При рН 3,7 межплоскостные расстояния равны 7,0±0,3 нм.

Полученные результаты позволяют предположить пространственное строение комплекса. При высоком содержании липида в комплексе (рН 7,4), липидные молекулы ориентированы перпендикулярно поверхности белка (рис. ЗА). Эта гипотеза подтверждается расчетами. Если принять диаметр молекулы

Рис. 2. Зависимость концентрации перешедшего в гидрофобную среду цитохрома с от концентрации КЛ. рН исходного водного раствора 7,4 (г = 0,988).

О 100 200 300 400 500 600 с (КЛ), мкМ

цитохрома с 5 нм (свободный цитохром с имеет диаметр глобулы 4 нм, но данный параметр увеличивается при внедрении жирнокислотных остатков кардиолипина внутрь глобулы), а длину молекулы кардиолипина 3 нм, то при перпендикулярном расположении кардиолипина к поверхности получим диаметр глобулы около 11 нм. При снижении числа молекул липида, окружающих белок, что происходит при кислых рН, липидные молекулы находятся под некоторым углом к поверхности белка, таким образом, размер частицы комплекса Цит-КЛ уменьшается (рис. ЗБ).

Рис. 3. Предполагаемое строение комплекса Цит-КЛ при нейтральных (А) (Владимиров с сотр., 2011) и кислых рН (Б). Частица комплекса состоит из белкового ядра и липидной оболочки. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка липидных молекул, а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно поверхности; при низких рН молекулы липида координированы неплотно, и хвосты располагаются под углом к поверхности, при этом диаметр частицы комплекса уменьшается.

II. Исследование иероксидазной функции комплекса Цит-КЛ Для исследования пероксидазной функции изучена активность комплекса в присутствии органического субстрата (люминол) при различных условиях протекания реакций.

Влияние рН и концентраций субстратов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ

Исследовалось влияние рН на интенсивность хемилюминесценции при окислении люминола в системе с Цит-КЛ при различных соотношениях

А Б

КЛ:Цит. Зависимость максимума амплитуды хемилюминесценции от рН имеет нелинейный ¿'-образный характер с точкой перегиба при рН около 7 (рис. 4). При повышении ионной силы пероксидазная активность незначительно возрастает. При постоянных значениях рН увеличение соотношения КЛ:Цит приводило к возрастанию пероксидазной активности.

ТВ Рис. 4. Зависимости

*тах> л 1(1 -( _____

максимума интенсивности ХЛ от рН при различных соотношениях концентраций КЛ-Цит: 1 - 120; 2 -60; 3 - 40; 4 - 30; 5 - 14. Во всех 20 мМ фосфатный буферный раствор.

4 5 6 7 8 рН 9

Было изучено влияние количества добавляемого пероксида водорода на интенсивность хемилюминесценции. В отсутствие Н202 хемилюминесценция не наблюдается. Добавление Н202 в систему приводит к появлению хемилюминесценции, пропорциональной количеству введенного Н202, при этом сама форма кривых хемилюминесценции почти не изменяется, Аналогичные кривые были получены для пероксидазы из корней хрена. Зависимость максимальной интенсивности (амплитуды) хемилюминесценции от концентрации Н202 была линейной при малых концентрациях, причем эта зависимость имеет такой же наклон, как и в системе с пероксидазой из корней хрена. Влияние концентрации люминола на интенсивность хемилюминесценции может быть описано кривой с насыщением.

Полученные результаты позволяют предположить, что механизм окисления органического субстрата комплексом Цит-КЛ в целом соответствует механизму действия известных пероксидаз. По аналогии с известными реакциями пероксидаз и на основании экспериментальных данных была предложена следующая схема (схема 2) реакций окисления люминола в системе Цит-КЛ:

Схема 2

1) Цит + КЛ —» Е (1)

2) Е + Н202->С,+Н20 (2)

3) С] + Ьит С2 + Ьит* (3)

4) С2 + Ьит —>• Е + Ьит* + Н20 (4)

5) Ьит*-»Р+/гу (5)

Математическое моделирование механизма пероксидазного действия комплекса Цит-КЛ

Было проведено математическое моделирование нестационарной кинетики хемилтоминесценции в системе Цит-КЛ/НгОг/органический субстрат (люминол) на основании экспериментальных кинетических кривых (рис 5А).

|Э

О-Ц-,-.-,-,---. и

0123456 6 12 3 4 5 6

Время, иин Время, мин

Рис. 5. А- Экспериментальная кинетика хемилюминесценции системы, состоящей из 10 мкМ Н2О2, 80 мкМлюминола и различных концентраций комплекса Цит-КЛ - 1, 2.5, 5, 7.5 и 10 мкМ; Б—результаты математического моделирования экспериментальных кривых при использовании схемы 2 иЗи констант скоростей реакций для схемы 3.

В процессе работы моделировали возможные схемы реакций, в том числе схему 2. В целом, эта схема реакций подтвердилась, поскольку опа позволила смоделировать экспериментальную кинетику хемилюминесценции, наблюдаемую при различных условиях. Однако точный подбор всех пяти констант скоростей реакции оказался практически невозможным из-за того, что кинетика зависит от наиболее медленных звеньев в цепи последовательных реакций, а изменение скорости быстрых звеньев в широких пределах на кинетику процесса в целом влияния практически не оказывает. В этом смысле предложенная схема 2 в двух отношениях является избыточной. Прежде всего,

14

очень велика скорость реакции 1 (образование комплекса Цит-КЛ) и можно считать, что в присутствии всех компонентов системы сразу начинается реакция 2 и последующие на схеме 2. Реакции 3 и 4 протекают последовательно и приводят к восстановлению исходного комплекса Цит-КЛ и образованию электронно-возбужденного продукта люминола, поэтому они могут быть описаны одной общей реакцией. Таким образом, можно упростить схему 2 до трех реакций (схема 3). В этом случае константы скоростей всех трех реакций удалось подобрать с достаточной точностью.

Схема 3

1) Е + Н202 —>• С, + Н20 к, = 0,3 мкМ-1 х мшГ1

2)С, + Ьшп->Е + Ьшп* к2 = 0,002 мкМГ'хмшГ1

3)Ьиш* —» Р + Ьу ¿з = 9 мшГ1

Расчеты, проведенные с использованием данной схемы и приведенных констант скоростей дают кривые, весьма сходные с экспериментальными (Рис. 5Б).

Сравнение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ с активностью пероксидазы из корней хрена

Кривые хемилюминесценции при окислении люминола пероксидом в присутствии Цит-КЛ или в присутствии «классической» пероксидазы из корней хрена (ПХ) были очень похожи по форме, что вполне объяснимо сходством механизмов пероксидазного цикла в этих двух случаях. Нами было проведено сравнение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ по отношению к ПХ и оказалось, что при молярном соотношении КЛ:Цит = 30 комплекс Цит-КЛ в 416 раз менее активен, чем ПХ.

Действие антиоксидантов на пероксидазиую активность Цит-КЛ

Влияние антиоксидантов на пероксидазиую активность комплекса Цит-КЛ изучали с помощью разработанной хемшпоминесцентной методики. В качестве модельных антиоксидантов использовали тролокс (водорастворимый аналог витамина Е), аскорбат натрия и кверцетин. Хемилюминесцентные кривые, полученные при добавлении разных количеств тролокса в систему Цит-КЛ/11202/люминол, показаны на рис. 6. После добавления антиоксиданта

хемилюминесценция развивается с некоторой задержкой (рис. 6А); при этом длительность латентного периода пропорциональна количеству антиоксиданта (рис. 6Б).

о 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0.1 OJ 03 0,4 0.5 0,6

Время, мин с тролокса, мкм

Рис. 6. Влияние количества добавленного антиоксиданта (тролокса) на кинетику развития XJI в системе, состоящей из 80 мкМлюминала, 5 мкМЦит, ISOmkMKJI, ЮмкМ И ¡О у, концентрации тролокса указаны на рисунке в мкМ (А). Зависимость площади под кривой хемилюминесценции от концентрации тролокса (r=0,967) (Б).

Аналогичные результаты были получены для аскорбата натрия и кверцетина.

Сходное действие антиоксиданты оказывали на систему ПХ/Н202/люминол, а также на хемилюминесцентную систему, в которой генератором свободных радикалов является 2,2'-азо-бис(2-амидинопропан)гидрохлорид (АБАП), а активатором хемилюминесценции служил люминол. Во всех трех указанных системах каждый из антиоксидантов действовал примерно в одних и тех же концентрациях, а хемилюминесцентные кривые имели схожую кинетику. Можно предположить, что мишенью действия изученных антиоксидантов являются не первичные свободные радикалы, образующиеся при разложении АБАП или взаимодействии Н202 с гемопротеидом (разные в этих случаях), а продукт их взаимодействия с люминолом, вероятно, радикал люминола, который везде один и тот же.

Математическое моделирование действия антиоксидантов

Механизм действия антиоксидантов на кинетику хемилюминесценции в системе АБАП/люминол был смоделирован с использованием компьютерной программы Kinetic Analyser. На рис. 7 на экспериментальные кривые наложены

кривые, полученные в результате математического моделирования. Видно, что формы кривых близки при всех исследованных концентрациях антиоксиданта -тролокса.

Рис. 7. Кинетические кривые, рассчитанные при помощи математического моделирования и экспериментальные данные с антиоксидантом - тролоксом. Концентрации реагентов: АБАП - 3 мМ, люминол -10 мкМ, концентрации тролокса (мкМ) указаны на рисунке.

Моделирование осуществляли по следующей схеме реакций:

Схема 4

1) АБАП —»R + R ¿,=1,7-10'5 мин-1

2) R + Lum -> Lum* k2=7-105 мкХГ'хмин-1

3) Lum* + тролокс —► P kj=3,9-109 мкКГ'хмтГ1

Можно видеть, что результаты моделирования согласуются с предположением, что антиоксидант действует на продукт взаимодействия свободных радикалов с люминолом (Lum*).

III. Образование липопероксильных радикалов при окислении

липидов в присутствии цитохрома с и комплекса Цнт-KJI

В этих исследованиях в качестве липидного субстрата использовали линолевую кислоту. Было показано, что при взаимодействии цитохрома с линолевой кислотой образуется осадок, как и в случае с кардиолипином. В расчете на одинаковое количество цитохрома с этот осадок обладал пероксидазной активностью, даже большей, чем комплекс Цит-KJI. Таким образом, в наших опытах с линолевой кислотой последняя играла роль не

17

только субстрата, но и молекулы, образующей с цитохромом с комплекс (Цит-ЛК), по свойствам и функции аналогичный комплексу Цит-КЛ. В качестве активатора хемилюминесценции во всех экспериментах использовали кумарин С-525, селективно усиливающий свечение при взаимодействии липипероксильных радикалов (LOO").

При добавлении как цитохрома с, так и комплекса Цит-КЛ к полиненасыщенной жирной кислоте (обозначим как LH), содержащей некоторое количество гидропероксидов (LOOH), наблюдалась вспышка хемилюминесценции, свидетельствующая о появлении радикалов LOO" в системе.

Было показано, что амплитуда и светосумма вспышки хемилюминесценции определяются количеством LOOH в системе. Мы готовили растворы линолевой кислоты с разным количеством гидропероксидов путем продувания воздуха через раствор в течение разного времени. Количество гидропероксидов определяли методом ХЛ, при котором в качестве внутреннего стандарта служили растворы /ире/я-бутилгидропероксида известной концентрации. Было показано, что светосумма вспышки хемилюминесценции прямо пропорциональна количеству LOOH в системе (рис. 8).

Было показано, что после взаимодействия цитохромом с липидные гидропероксиды в линолевой кислоте почти полностью исчезают.

Оптические спектры поглощения линолевой кислоты в гептане после ее взаимодействия с цитохромом с и с Цит-КЛ свидетельствуют об образовании триеновых конъюгатов (поглощение при 278 нм) и вторичных

£0

вспышки хемилюминесценции в системе с Цит+линсаевая кислота, либо Цит-КЛ + линолевая кислота от количества гидропероксидов в линолевой кислоте.

Рис. 8. Зависимость светосуммы

о

о

кислородосодержащих продуктов перекисного окисления липидов (максимумы поглощения 257 и 267 нм) (рис. 9).

Рис. 9. Спектры поглощения в УФ области: 1 - линолевой кислота, 2 - линолевой кислоты после взаимодействия с комплексом Цит-KJI, 3 - линолевой кислоты после взаимодействия с Цит. Концентрации реагентов: пинолевая кислота — 4 мМ, Цит — 20 мкМ, КЛ- 600 мкМ. На рисунке вертикальными линиями обозначены основные полосы поглощения с указанием их длин волн.

На основании полученных результатов и литературных данных (Владимиров с сотр., 1972) была предположена схема разложения липогидропероксида LOOH с образованием радикалов LOO- и вторичных продуктов липопероксидации под действием комплекса Цит-JIK (схема 5).

1) LOOH + Цит-ЛК LO' + С2

2) LOOH + С2 + -»LO' + С,

3) LO' + LH —» LOH + L'

4) L" + 02 —i► LOO" —> хемилюминесценция в присутствии С-525

5) LOO' + LOOH —> вторичные продукты липопероксидации

В результате разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина через стадию его окисления (СО и образование пероксил-радикалов LOO", часть из которых атакует липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов окисления липидов.

А

нм

Схема 5

В следующей серии экспериментов было показано увеличение количества липопероксильных радикалов (светосуммы хемилюминеценции) при введении пероксида водорода в систему, содержащую линолевую кислоту, цитохром с и кумарин С-525. При этом концентрация пероксида водорода была в 6,5 раз меньше, чем содержание липидных гидропероксидов в линолевой кислоте, хотя в присутствии Н202 светосумма ХЛ увеличивалась вдвое. Данный факт говорит о том, что Цит-JIK проявляет липопероксндазную активность, а образование дополнительных липопероксильных радикалов можно объяснить, предположив схему реакций 6:

Схема б

1) Цит + ЛК—> Цит-ЛК

2) Цит-Ж + Н202 —» Ci + H20

3) Ci+LH->C2 + L'

4) С2 + LH —>• Е + L" + Н20

5) L'+02->L00'

Таким образом, одна молекула пероксида водорода порождает два липидных алкил-радикала (реакции 3 и 4) и, следовательно, два липопероксильных радикала в реакции 5.

Действие антиоксидантов на взаимодействие цитохрома с с жирными кислотами

Введение в систему антиоксиданта тролокса приводило к уменьшению интенсивности вспышки XJI, что говорит о его взаимодействии с радикалами LOO * (рис. 10). При этом антиоксидантное действие тролокс оказывал при концентрациях 30-100 мкМ, что на два порядка больше концентраций, оказывающих действие на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ, измеренную по хемилюминесценции в присутствии люминола. Причина этого, вероятно, заключается в том, что в водной среде хорошо растворимый в воде тролокс легко реагирует с радикалами люминола, а при разложении липидных гидропероксидов взаимодействие антиоксиданта с радикалами LOO*, образующимися в липидной фазе, ограничено плохой растворимостью тролокса в липидах.

о

тролокса (концентрации

указаны на рисунке) на интенсивность вспышки ХЛ в системах, состоящих из 5 мкМ Цит, 1 мМ линалевой кислоты, 20 мкМ кумарина С-525.

Рис. 10. Действие

О

1

Время, мин

ВЫВОДЫ

1) Цитохром с, взаимодействуя с кардиолипином в водной среде, образует кристаллический осадок, межплоскостные размеры которого зависят от рН (10,5 нм при рН 7,4 и 7,0 нм при рН 3,7). Осадок частично растворим в воде, причем в водной фазе присутствует молекулярная форма комплекса (растворимость при рН 7,4 составляет около 30 мкмоль/л). Предположительно, молекулы комплекса состоят из белка, окруженного липидной оболочкой, причем гидрофильные головки липида направлены в сторону белка, а гидрофобные цепи нарузку. При нейтральных рН реализуется плотная упаковка липидных молекул, а липидные хвосты ориентированы перпендикулярно поверхности; при низких рН молекулы липида координированы неплотно, и хвосты располагаются под углом к поверхности, при этом размер частицы комплекса уменьшается.

2) Комплекс Цит-КЛ характеризуется определенным составом, зависящим от рН (соотношение КЛ:Цит составляет 59±7 при рН 7,4 и 13±4 при рН= 3,7). Комплекс Цит-КЛ может быть переведен в гидрофобную фазу, причем стехиометрический состав комплекса аналогичен составу комплекса в осадке.

3) Пероксидазная активность Цит-КЛ зависит от рН, особенно сильно в области нейтральных значений. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других известных пероксидаз, но активность Цит-КЛ в 416 раз меньше, чем активность пероксидазы хрена. Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой.

4) Комплексы Цит-КЛ и Цит-ЛК катализируют реакции разложения липидных гидропероксидов, при этом расходуются липидные гидропероксиды и накапливаются вторичные продукты перекисного окисления. В результате разложения LOOH происходит разрушение гемопротеина через стадию его окисления и образование пероксил-радикалов LOO", часть из которых атакует липогидропероксиды с образованием вторичных продуктов окисления липидов. В окислении полиненасыщенных жирных кислот, катализируемых комплексом Цит-ЛК, участвует пероксид водорода, таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает липопероксидазной активностью.

5) Антиоксиданты действуют на пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с кардиолипином путем их взаимодействия с продуктом окисления второго субстрата (люминола). Антиоксиданты действуют также и на реакции окисления липидов, катализируемые Цит-ЛК, причем антиоксидантное действие проявляется при концентрациях, на два порядка больших, чем при действии тех же антиоксидантов на пероксидазную активность Цит-КЛ по отношению к люминолу.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеев A.B., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Определение антиоксидантов методом активировашюй хемилюминесценции с использованием 2,2'-азо-бис(2-амидинпропана) И Вест. Моск. Ун-та. сер. 2. Химия. 2012. Т. 53. № 3: 187-193.

2. Алексеев A.B. Разработка методики определения антиоксидантной емкости биологических жидкостей // Вестник РГМУ. 2012. №1: 225.

3. Проскурнина Е.В., Жидкова Т.В., Алексеев A.B., Демин Е.М., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А., Хемилюминесценция как аналитический метод в медико-биологических исследованиях. Тезисы докладов к семинарам «Химический анализ медицинских объектов», Москва, 2011. С. 34-37.

4. Проскурнина Е.В., Алексеев A.B., Жидкова Т.В., Образцов И.В., Полимова А.М., Измайлов Д.Ю., Владимиров Ю.А. Хемилюминесцентные методы клинической лабораторной диагностики. Научный симпозиум с

международным участием «Проблемы медицинской биофизики». Материалы конференции, Москва, 2012. С. 36.

5. Алексеев A.B., Проскурнина Е.В., Владимиров Ю.А. Хемилюминесцентное определение антиоксидантов и гидроперекисей липидов. Научный симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской биофизики». Материалы конференции, Москва, 2012. С. 51.

6. Викулина A.C., Проскурнина Е.В., Алексеев A.B., Владимиров Ю.А. Определение пероксидаз в биологических системах хемилюминесцентным методом. Научный симпозиум с международным участием «Проблемы медицинской биофизики». Материалы конференции, Москва, 2012. С. 60.

Подписано в печать: 18.03.2013

Заказ № 8256 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 w ww. autoreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алексеев, Андрей Владимирович, Москва

Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

На правах рукописи

04201356203

АЛЕКСЕЕВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

СТРУКТУРА И ФУНКЦИЯ КОМПЛЕКСА ЦИТОХРОМА С

С КАРДИОЛИПИНОМ

03.01.02 - Биофизика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доцент, к.х.н.,

Проскурнина Елена Васильевна

г. Москва, 2013

Оглавление

1. Введение 7

1.1. Актуальность работы 7

1.2. Цели и задачи 7

1.3. Научная новизна работы 8

1.4. Практическое значение работы 9

1.5. Положения, выносимые на защиту 9

2. Обзор литературы 10

2.1. Структура и функция цитохрома с 10

2.1.1. Особенности строения молекулы цитохрома с 10

2.1.2. Функция цитохрома с в организме 12

2.2. Апоптоз 14

2.2.1. Определение апоптоза и его значение для организма 14

2.2.2. Механизм апоптоза 16

2.2.3. Роль цитохрома с в апоптозе 18

2.3. Взаимодействие цитохрома с с кардиолипином 21

2.3.1. Кардиолипин: строение и функция 21

2.3.2. Взаимодействия цитохрома с с липидными мембранами 23

2.3.3. Изменение конформации цитохрома с при связывании с мембранами, содержащими кардиолипин 27

2.3.4. Взаимодействие цитохрома с с гигантскими однослойными липосомами 32

2.3.5. Наносферы комплекса Цит-КЛ 33

2.4. Пероксидазная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 35

2.4.1. Пероксидазная активность цитохрома с и её изменение при химической модификации белка 35

2.4.2. Пероксидазная активность мембрано-связанного цитохрома с 37

2.4.3. Механизм пероксидазных реакций, катализируемых комплекса цитохрома с с кардиолипином 38

2

2.4.4. Способы регуляции пероксидазной функции комплекса цитохрома с с

кардиолипином 39 2.5. Взаимодействие комплекса цитохрома с с кардиолипином с липидами 42

2.5.1. Перекисное окисления липидов и липоксигеназная активность 42

2.5.2. Цитохром с как катализатор реакций перекисного окисления липидов 44 3. Материалы и методы 47

3.1. Реагенты 47

3.2. Аппаратура 47

3.3. Методики 48

3.3.1. Определение стехиометрического соотношения липид:белок в осадке комплекса Цит-КЛ 48

3.3.2. Малоугловое рентгеновское рассеяние 48

3.3.3. Спектрофотометрия в гидрофобной среде 49

3.3.4. Исследование системы Цит-КЛ + Н2О2 + люминол 50

3.3.5. Исследование системы ПХ + Н2О2 + люминол 50

3.3.6. Разработка методики определения антиоксидантов 51

3.3.7. Действие антиоксидантов на пероксидазную фукцию комплекса Цит-КЛ 53

3.3.8. Пероксидазная активность раствора над осадком комплекса Цит-КЛ 54

3.3.9. Пероксидазная активность комплекса Цит с линолевой кислотой 54

3.3.10. Подбор физического активатора 55

3.3.11. Исследование аналитической системы липидный субстрат + Со (II) 63

3.3.12. Исследование аналитической системы липидный субстрат + Бе (II) 64

3.3.13. Взаимодействие комплекса Цит-КЛ с гидропероксидами липидов 65

3.3.14. Взаимодействие комплекса Цит с /ирет-бугилгидропероксидом 66

3.3.15. Действие антиоксидантов на липоокислительную функцию комплекса цитохрома с с липидами 67

3.3.16. Определение гидропероксидов липидов после взаимодействия Цит и линолевой кислотой 67

3.3.17. Определение продуктов взаимодействия линолевой кислоты с Цит 67

3.3.18. Липопероксидазная активность цитохрома с 68

3.3.19. Математическое моделирование 68

3.3.20. Статистический анализ 69

4. Разработка методик 69

4.1. Разработка методики определения антиоксидантов 69

4.2. Математическое моделирование действия антиоксидантов 73

4.3. Подбор физического активатора хемилюминесценции 74

4.4. Разработка методики определения гидропероксидов липидов 77

4.4.1. Исследование аналитической системы липидный субстрат + Со (И) 77

4.4.2. Исследование аналитической системы липидный субстрат + Бе (II) 79

5. Изучение структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином 82

5.1. Определение состава осадка комплекса Цит-КЛ и его растворимости 82

5.2. Малоугловое рентгеновское рассеяние 86

5.3. Спектрофотометрия в гидрофобной среде 87

6. Пероксидазная и липоокислительная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 89

6.1. Изучение пероксидазной функции комплекса цитохрома с с кардиолипином и жирными кислотами 89

6.1.1. Влияние рН и концентраций субстратов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ 89

6.1.2. Математическое моделирование механизма пероксидазного действия комплекса Цит-КЛ 92

6.1.3. Пероксидазная функция комплекса Цит с линолевой кислотой 93

6.1.4. Определение пероксидазной активности комплекса Цит-КЛ 94

6.1.5. Действие антиоксидантов на пероксидазную функцию Цит-КЛ 96

6.1.6. Действие антиоксидантов на пероксидазную функцию пероксидазы из корней хрена 97

6.1.7. Пероксидазная активность раствора над осадком комплекса Цит-KJI 98

6.2. Исследование взаимодействия цитохрома с и комплекса Цит-KJI с

липидами 101

6.2.1. Взаимодействие комплекса Цит-KJI с липидами 101

6.2.2. Взаимодействие Цит с Г-ВHP 105

6.2.3. Определение гидропероксидов липидов после реакции между Цит и линолевой кислотой 107

6.2.4. Определение продуктов взаимодействия линолевой кислоты с Цит 108

6.2.5. Разрушение Цит при взаимодействии с линолевой кислотой 108

6.2.6. Действие антиоксидантов на липоокислительную функцию комплекса цитохрома с с липидами 109

6.2.7. Липопероксидазная активность цитохрома с 110

7. Обсуждение результатов 112

7.1. Структура и состав комплекса цитохрома с с кардиолипином 112

7.2. Пероксидазная функция комплекса цитохрома с с кардиолипином 115

7.3. Взаимодействия цитохрома с и комплекса Цит-KJI с липидами 116

8. Выводы 120

9. Список цитируемой литературы 122

Список сокращений Принятые сокращения: Цит - цитохром с; KJ1 - 1,1', 2,2'-тетраолеилкардиолипин; ПХ - пероксидаза из корней хрена; ЛК - линолевая кислота; XJI - хемилюминесценция; ФС - фотосенсибилизатор; ПОЛ -перекисное окисление липидов; ЮО - супероксидный радикал; !02 -синглетный кислород; АФК - активные формы кислорода; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; ЭПР - электронный парамагнитный резонанс; ДМФГ -димистроилфосфадитилглицирин; ФБ - фосфатный буферный раствор; АБАП -2,2'-азобис(2-метилпропионамидин)дигидрохлорид; ДОФГ -

диолеилфосфадитилглицерин; cmin - предел обнаружения; БКЛ - бычий кардиолипин; DOPC - диолеилфосфохолин; ТБК - тиобарбитуровая кислота; СОД - супероксиддисмутаза; SD - стандартное отклонение; sr - относительное стандартное отклонение; М - среднее значение; ^-коэффициент чувствительности; А - оптическая плотность; /4гаах-оптической плотность в максимуме; I - длина оптического пути; t(pf) - коэффициент Стьюдента; р -доверительная вероятность; п — число измерений;/- число степеней свободы; г - коэффициент корреляции; / - ионная сила; /хл - интенсивность ХЛ; S -площадь; 1тах - интенсивность в максимуме; t„ - латентный период; /-ВНР -тре/и-бутилгидропероксид; ПА - пероксидазная активность; SDS -додецилсульфат натрия; CD - циркулярный дихроизм; DOPC -диолеилфосфохолин; ABTS - 2,2'-азинобис(3-этилбензотиазолин 6-сульфонат); ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты; ДГК - дигидрокверцетин; с -концентрация вещества; А, - длина волны; t - время.

1. Введение

1.1. Актуальность работы

В 1972 году была впервые описана одна из форм гибели клеток - апоптоз [1]. Апоптоз играет важную роль в морфогенезе и в развитии патологических состояний. Центральным событием в развитии апоптоза, как правило, является выход цитохрома с из митохондрий с последующим запуском каскада апоптотических реакций в клетке. Выход цитохрома с (Цит) становится возможным благодаря повреждению внутренней мембраны в результате перекисного окисления липидов [2], при этом пусковым механизмом служит превращение цитохрома в пероксидазу при его взаимодействии с кардиолипином (КЛ). К сожалению, как структура комплекса цитохрома с с кардиолипином, так и механизм его пероксидазного действия на органические молекулы, в том числе на липиды, пока мало изучены. В данной работе проведено исследование структуры и состава комплекса цитохрома с с кардиолипином, изучена пероксидазная функция этого комплекса в разных условиях. Показано, что этот комплекс обладает способностью разлагать липогидропероксиды с образованием пероксильных радикалов и липопероксидазным действием. Исследовано влияние антиоксидантов на реакции, катализируемые комплексом Цит-КЛ. Полученные результаты помогут в будущем разработать методы управления апоптозом, что имеет большое значение для лечения ряда важнейших патологий.

1.2. Цели и задачи

Целью данной работы было изучение структуры и состава комплекса Цит-КЛ, полученного в разных условиях, а также его пероксидазной и липопероксидазной функции на основе критического пересмотра литературных данных и разработки новых аналитических методик. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить состав и структуру комплекса цитохрома с с кардиолипином.

2. Изучить пероксидазную функцию комплекса цитохрома с с кардиолипином и жирными кислотами.

3. Исследовать взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами, а так же влияние пероксида водорода на данное взаимодействие.

4. Исследовать влияние антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса Цит-КЛ и на взаимодействие цитохрома с и его комплекса с кардиолипином с жирными кислотами.

1.3. Научная новизна работы

В данной работе было показано, что цитохром с образует с кардиолипином комплексы определенного состава, плохо растворимые в воде. Было определено молярное соотношение КЛ:Цит в комплексах, полученных при различных значениях рН, и показано, что могут формироваться два устойчивых комплекса, один в нейтральной, в другой - в кислой среде (при рН меньше 5,5). Оценено значение растворимости. Показана возможность перехода этого комплекса в гидрофобную среду и определен состав комплекса в гидрофобной среде.

Впервые была изучена структура осадка комплекса Цит-КЛ при различных рН среды методами малоуглового рентгеновского рассеяния. Полученные данные подтвердили вывод о существовании двух типов комплексов, имеющих разное соотношение КЛ:Цит и соответственно разный диаметр наносфер, которые в водном растворе образуют микрокристаллы с различными расстояниями между отражающими плоскостями. Определена пероксидазная активность комплекса Цит-КЛ при различных рН среды.

Впервые методом активированной хемилюминесценции показана способность комплекса цитохрома с с липидами разлагать липогидропероксиды с образованием свободных липопероксильных радикалов. Показана

способность комплекса окислять жирную кислоту пероксидом водорода с образованием липопероксильного радикала (липопероксидазная функция комплекса).

Изучено влияние водорастворимых антиоксидантов на пероксидазную активность комплекса цитохрома с с кардиолипином и на образование липопероксильных радикалов при разложении гидропероксидов липидов комплексом цитохрома с с линолевой кислотой (Цит-ЛК).

1.4. Практическое значение работы

Основным результатом работы является углубление фундаментальных знаний о начальной стадии программируемой смерти клетки.

Данные о структуре комплекса цитохрома с с кардиолипином и механизме реакций, которые он катализирует, имеют решающее значение для контроля апоптоза с целью профилактики и лечения болезней человека.

Автором были разработаны или усовершенствованы ряд аналитических хемилюминесцентных методик для определения антиоксидантной активности, пероксидазной активности и количества липидных гидропероксидов в системе. Все эти методы могут найти применение в лабораторной практике.

Полученные данные могут быть использованы при преподавании курсов медицинской биофизики в медицинских вузах и университетах.

1.5. Положения, выносимые на защиту

1. Комплекс Цит-КЛ представляет собой соединение определенного состава, малорастворимое в воде и хорошо растворимое в гидрофобной среде, причем состав комплекса и структура осадка зависит от рН среды.

2. Механизм пероксидазного действия Цит-КЛ аналогичен механизму действия других пероксидаз; пероксидазная активность комплекса надва порядка величины меньше активности пероксидазы из корней хрена. Пероксидазной функцией также обладает комплекс цитохрома с с линолевой кислотой.

3. Комплексы цитохрома с с кардиолипином или с линолевой кислотой катализируют реакцию разложения липидных гидропероксидов, при этом образуются свободные радикалы и вторичные продукты перекисного окисления. Было показано образование пероксильных радикалов при окислении липидов пероксидом водорода, катализируемое комплексом цитохрома с; таким образом, комплекс цитохрома с с липидами обладает липопероксидазной активностью.

4. Антиоксиданты действуют на пероксидазную функцию Цит-КЛ путем взаимодействия с продуктом реакции свободных радикалов со вторым субстратом (люминолом). Антиоксиданты также действуют на реакции образования липопероксильных радикалов при разложении липидных гидропероксидов.

2. Обзор литературы

2.1. Структура и функция цитохрома с

2.1.1. Особенности строения молекулы цитохрома с

Цитохром с - водорастворимый белок небольших размеров (молекулярная масса около 12 кДА), состоящий из белковой части и гемма с. Гем ковалентно связан с апобелком (через БН-группы с Суз-14 и Суз-17) (рис. 1). Это отличает цитохромы типа с от цитохромов а- и Ъ- типов, где гемы связаны нековалентно.

/

"Л2 з/ Э-Сув

Рис. 1. Гем цитохрома с [5].

Цит в основном находится на внешней стороне внутренней мембраны митохондрии. Формирование цитохрома с происходит в цитоплазме в виде неактивного апофермента, далее он транспортируется в межмембранное митохондриальное пространство, затем происходи присоединение тема [6]. Центральный атом железа в геме способен к обратимому одноэлектронному взаимодействию: Fe3+ + е" Fe2+ [5].

У позвоночных в состав Цит входит 104 аминокислотных остатка, насекомых - 107, низших растений 107-109, высших растений - 111 (в одном случае 110). Последовательности остатков отражают биологическую эволюцию: первичные структуры Цит человека и шимпанзе полностью совпадают, отличаясь от структуры Цит обезьяны резуса одной заменой - у резуса на 102 месте находится аланин вместо триптофана. Сравнивая число аминокислотных замен в Цит некоторых видов по сравнению с Цит человека (табл. 1), легко видеть, что различия тем больше, чем меньше филогенетическое родство.

Таблица 1. Число аминокислотных замен в Цит различных организмов по сравнению с Цит человека.

Вид Количество замен Вид Количество замен

Шимпанзе 0 Лягушка 18

Обезьна резус 1 Карп 18

Кролик 9 Шелковичная бабочка 31

Собака 11 Пшеница 43

Курица 13 Дрожжи (Saccharomyces) 45

Цитохром с - консервативный белок, однако чем дальше филогенетически расположены организмы, тем больше различий в структуре этого белка.

Группа гема соединена пятой и шестой координационными связями атома железа с имидазольным кольцом Гис-18 и атомом серы Мет-80, что также отличает цитохромы от гемоглобина, в которой координационная связь

11

(шестая) железа свободна, что позволяет присоединять, переностить и отсоединять в нужный момент кислород. Структура Цит характеризуется расположением гидрофобных остатков внутри молекулы, тогда как заряженные расположены на ее поверхности. Структуры окисленной и восстановленной форм Цит практически не отличаются [7-10]. 2.1.2. Функция цитохрома с в организме

Одной из важных функций Цит в живом организме является его участие в клеточном дыхании. В клетках эукариот дыхательная цепь расположена во внутренней митохондриальной мембране, у дышащих бактерий ' - в цитоплазматической мембране и специализированных структурах - мезосомах, или тилакоидах. Компоненты дыхательной цепи встроены в митохондриальную мембрану в виде 4 белково-липидных комплексов: НАДН-Ко(ЗН2-редуктаза (комплекс I), сукцинат-КоС^-редуктаза (комплекс II), КоС)Н2-цитохром-с-редуктаза (комплекс III) и цитохром-с-оксидаза (комплекс IV) (рис. 2).

Комплекс I Комплекс III Комплекс IV АТФ-синтаза

Рис. 2. Митохондриальная дыхательная цепь [10].

Перенос электронов между комплексами осуществляется за счет диффузии относительно небольших молекул: в липидной фазе мембран - это коэнзим (убихинон), а в водной фазе - это Цит. Активный центр цитохрома с, имея шесть коордиоционных связей, дает способность к переносу электронов

между III и IV дыхательными комплексами, при этом железо восстанавливается из состояния Бе в Бе на III дыхательном комплексе и отдавать электрон IV комплексу (при этом железо вновь окисляется и приобретает состояние Ре+3) [11,12].

Помимо вышеописанной функции, окисленная форма цитохрома с способна окислять супероксидный радикал с образованием молекулярного кислорода [13]:

02" + Цит(Ре3+) 02 + Цит(Ре2+) При этом возможно спектрофотометрически проследить динамику восстановления цитохрома и, при отсутствии иных восстановителей, оценить скорость образования супероксид-анион радикала. С этой целью часто используют ацетилированный аналог цитохрома с, у которого ацетилировано 60% лизиновых остатков и который не может связываться ни с мембр�