Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Самоинактивация цитохромов Р450 при химическом восстановлении и в процессе катализа

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Карузина, Ирина Ивановна

Актуальность проблемы.

Цель и задачи исследования.

Положения, выносимые на защиту.«.-.

Научная новизна работы.

Научно-практическаязначимость работы.

Апробация работы.—

Публикации.-.-. Ю

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.П

1. САМОИНАКТИВАЦИЯ РАСТВОРИМЫХ ИЗОЛИРОВАННЫХ ЦИТОХРОМОВ Р450 ПРИ ХИМИЧЕСКОМ ВОССТАНОВЛЕНИИ.И

1.1. Сравнительное исследование скорости инактивации восстановленных дитиовитом натрия карбоксикомплексов изолированных микросомальных в бактериальных цитохромов Р450.

12. Влияние фосфолшщдов на инактивацию цитохромов Р4502В4 н Р450лня.

1.3. Кинетические характеристики реакции инактивации.:.

2. ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИНАКТИВАЦИИ ВОССТАНОВЛЕННЫХ ЦИТОХРОМОВ Р4502В4 И Р450ЛИН В ПРОЦЕССЕ АВТООКИСЛЕНИЯ.-.И

2.1. Влияние окиси углерода» анаэробных условий на процесс инактивации.

2.2. Исследование инактивации цитохромов P4S02B4 и Р450лин в присутствии каталазы, супероксвдяисмутазы (СОД), ЭДТА и аитйоксидавтов.

2.3. Исследование влияния аминокислот- и SH-содержащих соединений на скорость инактивации.

3. ИНАКТИВАЦИЯ ЦИТОХРОМА Р450 В МОНООКСИГЕНАЗНЫХ РЕАКЦИЯХ В МИКРОСОМАХ 20 3.1 .НАДФН-инициируемая инактивация цитохроыа Р4502В4 в реакциях гндроксилирования Q субстратов 1-го и П-ro типов в микросомах печени кролшсов, получавших фенобарбитал.

3.2. Сравнительное исследование скоростей инактивации различных форм цитохрома Р450 в микросомах печени крыс.

3.3, Выяснение роли перекиси водорода, образующейся в активном центре цитохрома Р450 и вне его, в инактивации гемопротеина.

3.3.1- Сравнение скоростей шюкгавацвн цитохрома Р450 в НАДФН-оксидазной и глюкозооксидазной системах.,.

3.3.2. Влияние перекиси водорода, добавленной извне, на скорость инактивация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях.—.

3.3.3.Выяснение роли перекиси водорода, образующейся в активном центре цитохрома Р450 прямым и непрямым путем, в инактивации гемопротеина.—.

3.3.4. Влияние хеджеров железа ва инактивацию цитохромаР450 и перекасное окисление лишвдовЗО

4. ИЗБИРАТЕЛЬНОСТЬ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ИНАКТИВАЦИИ ЦИТОХРОМА Р450 В МИКРОСОМАЛЬНОЙ МЕМБРАНЕ.«

5. ИНАКТИВАЦИЯ РАСТВОРИМОГО, ИЗОЛИРОВАННОГО ЦИТОХРОМА Р4502В4 ИОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕРЕКИСИ ВОДОРОДА.«.

6. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ САМОИНАКТИВАЦИЯ ЦИТОХРОМА Р4502В4 В МОНООКСИГЕНАЗНОЙ РЕКОНСТРУр®ОВАННОЙ СИСТЕМЕ (MPC).,—.

6.1. Сравнительное исследование скорости инактивации цитохрома Р4502В4 в MPC при различном молярном сггаошещгагемопротеишиНАДФН-спевдфичного флавопротеина.

6.2.Инакгавация цитохрома P45Ô2B4 в присутствии цитохрома Ь5.

6.3. Влияние каталазы на скорость инактивации цитохрома Р4502В4.:.

7. МОДИФИКАЦИЯ ГЕМА ЦИТОХРОМА Р4502В4 В ПРОЦЕССЕ ИНАКТИВАЦИИ.

8. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ АПОФЕРМЕНТА ЦИТОХРОМА Р4502В4. следование агрегатного состояния. ' 'г онение физико-химических свойств цитохрома Р4502В4 в процессе инактивации. лфикация SH-групп. .-Ьтние межмолекулярных ковалентных сшивок я роль гндроксильных радикалов в этом

ШИН ПРОТЕОЛИГИЧЕСКОЙ ДОСТУПНОСТИ НАГИВНОГО и

5 JBAHHOro ЦИТОХРОМА Р450 2В4.—.

§1 *.5«

ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Самоинактивация цитохромов Р450 при химическом восстановлении и в процессе катализа"

Цитохром Р450 (ЕС 1.14.14.1) относится к числу наиболее интенсивно исследуемых ферментов в связи не только с его важной ролью в организме, но и с особенностями строения и механизма функционирования. Он способен окислять сотни тысяч низкомолекулярных химических соединений, как попадающих в организм извне (лекарственные вещества, яды, пищевые добавки, атмосферные загрязнения), так и образующихся в клетке (холестерин, насыщенные и ненасыщенные жирные кислоты, стероидные гормоны, простагландины и т.д.), являясь ключевым звеном в процессах детоксикации и выведения из организма вредных соединений (Archakov and Bachmanova, 1990; Coon et al., 1992). Образующиеся в процессе окисления соединения более гидрофильны, чем исходные субстраты; что облегчает их последующий метаболизм и удаление экскреторными органами. Однако, выполняя эту важную для организма функцию, цитохром Р450 или, по крайней мере, некоторые его формы, может самоинактнвироваться в ходе реакций как под действием реакционноспособных метаболитов, образующихся в результате активации субстратов, так и в результате окислительного, действия продуктов неполного восстановления кислорода, которые образуются в результате разобщения основного каталитического цикла шггохрома Р450 (Ortiz de Montellano and Reich, 1989; Estabrook et al., 1979; Archakov and Zhukov, 1987; Guengerich, 1978; Karuzina and Archakov, 1994); Таким образом, цитохром P450 действует в каталитическом'цикле как "фермент-самоубийца". Защищая организм от вредных соединений, он расплачивается за это своей гибелью.

Окисление ,и удаление из организма огромного количества низкомолекулярных соединений, встречающихся в природе, возможно благодаря множественности форм цитохромов Р450, которые в настоящее время объединяют в одно надсемейство, состоящее из 80 различных семейств и более 130 подсемейств. В настоящее время известно уже более 1000 различнщ,пергачньк ^уктур цитохромов Р450

Особенностью цитохрома Р450 является так же и множественность его функций. По механизму действия цитохром Р450 является типичной монооксигеназой. В то же время он способен катализировать и ряд оксидазных и пероксидазных реакций (Ruckpaul et ai., 1989; Zhukov et al., 1989). Огромное разнообразие химических реакций, катализируемых цитохромом P45Ö, а так же большая его функциональная значимость делают интерес исследователей к этому ферменту вполне оправданным.

Дополнительным стимулом к изучению цитохрома P4S0 послужили работы, в которых было показано, что некоторые ферменты способны инактивироваться в каталитическом цикле под действием активных форм кислорода, таких как суперокисные, гидроксильные радикалы, перекись водорода, которые являются продуктами иликосубетратами реакций (Blech and Borders, 1983; Уашакша and Suzuki, 1986; Beyer and Fridovich, 1987). Эти ферменты, обнаруженные в последнее время, привлекают к себе все более пристальное внимание исследователей, так как их существование открывает перед биохимиками новые перспективы дня выяснения регулирующей роли кислородных радикалов в механизме как распада белков, так и возникновения многих патологических процессов в организме.

К числу таких ферментов можно отнести и цитохром Р450, который обладает уникальной способностью, наряду с основными продуктами реакции, генерировать активные формы кислорода в процессе катализа в результате разобщения монооксигеназного цикла. Цитохром Р450 макросом печени, в отличии от других монооксигеназ и бактериального цитохрома Р450, не окисляет ни один из известных субстратов с полным сопряжением, и часть редокс-эквивалентов расходуется в сопутствующих оксидазных реакциях. Продукты неполного восстановления кислорода (Ог", перекись водорода, ОН), образующиеся при распаде окси-и пероксикомплексов цитохрома Р450, могут быть вовлечены в инактивацию цитохрома Р450. Самоинактивация цитохрома Р450 в монооксигенззных реакциях и роль этой реакции в физиологии и патологии клетки до конца не выяснены. В то же время достаточно подробно исследован механизм самоинактивации фермента в реакциях окисления суицидных субстратов активными метаболитами, в основе которого лежит ковалентаая модификация гема, реже апофермента. Успехи в исследовании суицидной инактивации цитохрома Р450 позволяют сосредоточить внимание на синтезе фермевтселективных субстратов, которые в процессе катализа могут превращаться в соединения с направленным терапевтическим, инсектицидным и гербицидным действием.

Возросший в последние годы интерес исследователей к выяснению молекулярных механизмов реакций окислительной модификации белков и ферментов обусловлен тем, что эта реакция может быть начальной и универсальной стадией механизма деградации макромолекул в клетке. Для целого ряда ферментов в белков показано, что активные формы кислорода могут участвовать в модификации определенных аминокислотных остатков, что приводит к изменению физико-химических свойств белка. Эти изменения могут служить сигналом для узнавания эндогенными протеазами модифицированных белков. Ускоренная протеолитическая деградация является физико-химической основой процессов обновления белков, старения и возникновения ряда патологических состояний в организме. .

Выяснение механизмов окислительной модификации цитохрома Р450 в ходе его самоинактивации в монооксигеназных реакциях позволит получить дополнительную информацию о механизмах* лежащих в основе регуляции распада белков в клетке. Процесс обновления белков, по-видимому, не случаен, как считалось до последнего времени,, а имеет характер селективного целенаправленного удаления только тех молекул, которые были модифицированы в ходе катализа.

С другой стороны, важность исследования механизма этой реакции состоит и в том, что многие лекарственные средства, являясысубстратами для цитохрома Р450, способны вызывать его самоинактивацшо и приводить, таким образом, к нарушению детоксшщрукяцей функции монооксигеназной системы печени. Следствием этого может быть изменение скорости и путей метаболизма лекарственных препаратов и других ксенобиотиков, поступающих извне в организм. Кроме того, активные формы кислорода, генерируемые цитохромом Р450 в процессе катализа, могут модифицировать не только фермент, но и другие макромолекулы клетки, что может стимулировать опухолевой рост и приводить к мутагенным, аллергенным и другим токсическим эффектам.

Таким образом, выяснение механизмов окислительной самоинактивации цитохрома Р450, как одной из начальных стадий его деградации имеет важное значение для познания закономерностей де1радации белков в клетке.

Цель и задачи исследовании

Целью настоящей работы являлось: 1) исследование механизмов инактивации цитохрома Р450 в процессе автоокисления в условиях химического восстановления и в ходе катализа в НАДФН-зависимых частично сопряженных монооксигеназных реакциях; 2) выяснение особенностей модификации гема и апофермента цитохрома Р4502В4 в процессе окислительной инактивации в монооксигеназной реконструированной системе. Решение этих вопросов позволит получить важную информацию о биохимических механизмах окислительной самоинактивации ферментов в процессе катализа. Выяснение молекулярных механизмов реакции окислительной модификации открывает новые возможности для понимания путей обновления белков в клетке.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи.

1) Провести сравнительное исследование инактивации восстановленных дитионитом натрия карбоксикомплексов очищенных микросомальных и бактериальных цитохромов Р450 и выяснить механизм их инактивации при авгоокислении.

2) Охарактеризовать механизм самоинактивации цитохромов Р450 в НАДФН-зависимых гидроксилазных реакциях в микросомах и выяснить роль оерекиси водорода, образующейся в активном центре цитохрома Р450, и вне его, в инактивации гемопротеина.

3) Изучить избирательность окислительной инактивации цитохрома Р450 в микросомальной мембране.

4) Исследовать особенности инактивации цитохрома Р450, изолированного в олигомерной форме и в мономерном состоянии, под действием перекиси водорода.

5) Исследовать инактивацию цитохрома Р4502В4 в растворимой реконструированной системе в НАДФН-зависимых оксигеназных и оксидазных реакциях.

6) Выяснить особенности модификации гема и апофермента цитохрома Р4502В4 в процессе окислительной инактивации в монооксигеназной реконструированной системе.

7) Исследовать протеолитическую доступность нативного и модифицированного цитохрома Р450.

Положения, выносимые на защиту

1. Цитохром Р450 является самоитактивирующимся ферментом; Инактивация происходит под действием активных форм кислорода, которые образуются в активном центре фермента, как в процессе автоокисления в химических модельных системах после восстановления дитионитом натрия карбоксикомплексов изолированных микросомальных и бактериальных цитохромов Р450, так и в ходе катализа в разобщенных НАДФН-зависимых монооксигеназных реакциях, в которых перекись водорода и другие активные формы кислорода образуются в качестве сопутствующих продуктов монооксигеназного цикла. Инактивация цитохрома Р450 как при химическом восстановлении, так и в монооксигеназных реакциях имеет избирательный характер.

2. Перекись водорода, образующаяся в активном центре цитохрома Р450 прямымпутем при распаде пероксикомплекса, играет ведущую роль в инактивации цитохрома Р450 в НАДФН-зависимых г монооксигеназных реакциях. Перекись водорода, генерируемая в реакции дисмутации суперокисных радшеалов, которые высвобождаются при распаде оксикомплексацитохрома Р450, не играет существенной роли в инактивации гемопротеина.

3. В основе инактивации цитохрома Р450, восстановленного химическим путем, лежит переход цитохрома Р450 в неактивную форму - цитохром Р420, в то время как в НАДФН-зависимых монооксигеназных реакциях . наблюдается обесцвечивание гемопротеина вследствие разрушения тема.

4. Цитохром Р450 инактивируется в монооксигеназной системе, реконструированной из мономеров изолировавногр цитохрома - Р4502В4 и НАДФН-зависимого флавопротеина, так же как и в микросомах, под действием перекиси водорода, Образующейся в активном центре фермента. Окислительная инактивация цитохрома Р450 сопровождается разрушением гема. и модификацией апофермента, которая включает окисление определенных аминокислотных остатков, изменение физико-химических свойств и агрегатного состояния белка.

Научная новизна работы

Впервые показано, что изолированные формы цитохрома Р450, как мембраносвязанные (2В4, 1А2), так и водорастворимые (бактериальные - Р450кам, Р450лин и Р450цим) различаются по стабильности в восстановленном состоянии. Инактивации подвергаются только восстановленные карбоксикомплексы цитохрома Р45О204, изолированного из микросом печени кроликов, получавши^ фенобарбитал, и Р450лин, бактериальная форма, выделенная из культуры Рз. Рийёа. Инактивация гемопротеинов сопровождалась их переходом в неактивную форму- цитохром Р420. Обнаружены различия , в механизме инактивации цигохромов Р4502В4 и Р450лин. В инактивации восстановленного цитохрома Р4502В4 участвуют активные формы кислорода, образующиеся в активном центре фермента при распаде его оксикомплекса. Инактивация восстановленного Р450лин происходит вследствие прямого переноса электронов в карбоксикомплексе на близлежащий аминокислотный остаток. Установлено, что при инактивации цитохрома Р4502В4 возможна модификация только БН-содержащих аминокислот, а в процессе инактивации Р450лин возможна так же модификация и ароматических аминокислот. Показано, что фосфолипиды оказывают стабилизирующее действие только на мембраносвязанный цитохром Р4502В4 и не влияют на скорость инактивации бактериального цитохрома Р450лин.

Впервые показано, что ведущую роль в инактивации цитохрома Р450 в микросомах в реакциях гидроксилирования субстратов, как типа I - диметиланилин, аминопирин, бензфетамин, так и типа П - анилин играет перекись водорода, образующаяся в активном центре фермента прямым путем при распаде пероксикомплекса. Обнаружено, что окислительная инактивация является НАДФН-зависимой реакцией и коррелирует с накоплением перекиси водорода и снижением ферментативной активности цитохрома Р450. В процессе инактивации не происходит образования неактивной формы фермента -цитохрома Р420, как это наблюдалось в случае химической инактивации цитохрома Р450. Наблюдалось только обесцвечивание гемопротеина, что указывает на разрушение гема; такой тип инактивации реализуется для различных субстратов и форм цитохромов Р450, катализирующих частично сопряженные монооксигеназные реакции.

Показана высокая избирательность окислительной инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях. Другие ферменты и переносчики электронов микросомальной мембраны: цитохром Ь5, НАД(Ф)Н-специфичные флавопротевны, а так же глюкозо-6-фосфатаза не ииакгивируются перекисью водорода, образующейся в монооксигеназных реакциях.

Установлено, что изолированный цитохром Р4502В4 инактивируется под действием лерекиси водорода как в олигомерном состоянии, так и в мономеризованной форме. Инактивация сопровождается изменением агрегатного состояния и уменьшением содержания вН-групп в молекуле фермента.

Показано, что в монооксигеназной системе, реконструированной из изолированного цитохрома Р4502В4 и НАДФН-зависимого флавопротеина, так же как я в микросомах, в инактивация гемопротеина участвует перекись водорода, образующаяся в активном центре фермента. Обнаружено сходство в механизмах инактивации цитохрома Р4502В4 в растворимой реконструированной системе и в микросомах. И в том и другом случае происходит разрушение гема, о чем свидетельствует обесцвечивание гемопротеина в процессе инактивации. Впервые показано, что скорость инактивации цитохрома Р4502В4 в монооксигеназной реконструированной системе, зависит от молярного отношения цитохрома и флавопротеина.

Показана двухстадийность деградации гема цитохрома Р4502В4 в процессе окислительной инактивации и обнаружена различная роль перекиси водорода в этом процессе. Под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре, нарушаются гидрофобные взаимодействия между гемом и апоферментом, в результате чего гем выходит из активного центра. Перекись водорода, накапливающаяся в растворе, участвует в деструкции гема.

Впервые показано, что окислительная самоинактивация цитохрома Р4502В4 в монооксигеназных реакциях сопровождается модификацией апофермента. Разработанный в нашей лаборатории комбинированный метод, для определения содержания вН-групп, включающий гидролиз цитохрома Р4502В4, мечено пиренмалеимидом, с последующим применением метода пептидного картирования, а 1 же усовершенствованный нами метод определения карбонильных групп, позволи выявить специфичность изменений в первичной структуре цитохрома Р4502В4 при е инактивации. Показано, что перекись водорода, образующаяся в активном центре модифицирует 8Н-группы цистеинов, приводит к образованию свободных карбонильи групп, изменяет физико-химические свойства белка. Обнаружено, что в процесс окислительной инактивации цитохрома Р4502В4 может изменяться его агрегата состояние.

Научно-практическая значимость работы

Полученные в ходе выполнения работы результаты являются необходим фундаментом для понимания специфичности механизмов деградации и обновлен цитохрома Р450 в клетке, а так же открывают новые возможности в плане выяснен^ причин возникновения ряда патологических состояний организма, связанных нарушением катаболизма этого белка.

Проведенныенами исследования нозвшяют получить допоиительную информащ о биохимических механизмах окислительной самоинактивации ферментов в ход катализа, о роли перекиси водорода в регуляции внутриклеточного распада «итохро Р4502В4, а так же о путях его обновления.

Избирательность окислительной инактивации цитохрома Р450 в гидроксилазнь реакциях имеет важный общебиологический смысл. Процесс обновления белков в клетк

РОССШЖЖАй ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА будет носить не случайный характер, как это считалось до последнего времени, а приобретает характер направленного удаления только тех молекул, которые модифицировались в ходе катализа. Реакция окислительной самоинактивации может лежать в основе механизма, с помощью которого эндогенные протеазы способны узнавать ферменты, отслужившие свой срок, и быстро удалять их из клетки.

Обнаруженная в работе идентичность механизмов разрушения цитохрома Р450 в реконструированной монооксигеназной системе и микросомальной фракции печени имеет важное практическое значение, так как указывает на целесообразность изучения скорости инактивации цитохрома Р450 при проведении исследований по токсиколого-гигиенической оценке поступающих в организм ксенобиотиков. Полученные результаты мохут служить теоретической предпосылкой для разработки скрининг-тестов на токсичность лекарственных препаратов, химических загрязнений окружающей среды и пищевых продуктов.

Окислительную самоинактивацию цитохрома Р450 в процессе катализа необходимо принимать в расчет, так как она может приводить к нарушению функции гидроксилирующей системы печени и, как следствие, вызывать изменение скорости и путей метаболизма лекарственных препаратов и других ксенобиотиков, а так же нарушать обмен холестерина, стероидных гормонов и других эндогенных субстратов, что может являться важным звеном в патогенезе различных заболеваний.

Апробация работы

Основные положения диссертации были доложены на 9-ом Международном биохимическом конгрессе (Стокгольм, 1973); на 12 Международной конференции "Структура и функция цитохрома Р450" (Дрезден, 1978); на 9-ой Международной конференции "Цитохром Р450" (Будапешт, 1974); на Всесоюзном симпозиуме "Цитохром Р450: структура и функция" (Минск, 1982); на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана внутренней среды человека" (Москва, 1985); на 9-м Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); на Всесоюзном симпозиуме по медицинской эязимологии (Махачкала, 1986); на Всесоюзной конференции "Цитохром Р450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987); на V Всесоюзной конферетщи "Цитохром Р450 и модификация макромолекул" (Ялта, 1989), на Всероссийской конференции "Эфферентные методы в медицине" (Анапа, 1992); на 7-ой международной конференции "Биохимия и биофизика цитохрома Р450" (Москва, 1991); на 10-ом Международном симпозиуме "Микросомы и .окисление лекарств" (Торонто, 1994), на 9-ой Международной конференции "Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология" (Цюрих, 1995); на 11-ом Международном симпозиуме "Микросомы и окисление лекарств" (Лос Анджелес, 1996); на 10-ой Международной конференции "Цитохром Р450: биохимия, биофизика и молекулярная биология" (Сан Франциско, 1997); на 2-м Биохимическом съезде (Москва, 1997); на 12-ом Международном симпозиуме "Микросомы и окисление лекарств" (Мошпилье, 1998); на 11-ой Международной конференции "Цитохром Р450" (Сендаи, 1999).

Публикация

По материалам диссертации опубликовано 57 работ, из них статей 21 - в отечественных журналах, 14 статей в международных журналах, 5 статей в книгах и сборниках научных трудов и 18 тезисов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Карузина, Ирина Ивановна

выводы

1. Показана возможность самоинактивации некоторых форм цитохрома Р450 в процессе автоокисления восстановленных дитионитом натрия карбоксикомплексов изолированных микросомалышх и бактериальных цитохромов Р450 и в ходе катализа в НАДФН-зависимых частично сопряженных монооксигеназных реакциях. Основную роль в инактивации играют активные формы кислорода, образующиеся в активном центре цитохрома Р450.

2. Перекись водорода, образующаяся в активном центре прямым путем при распаде пероксикомплекса и непрямым путем в реакции дисмутации суперокисных радикалов, образующихся при распаде оксикомплекса, играет различную роль в инактивации цитохрома Р450. Ведущую роль в инактивации играет перекись водорода, образующаяся прямым путем. Инактивирующий эффект непрямой перекиси водорода выражен гораздо слабее.

3. Инактивация восстановленных карбоксикомплексов изолированных цитохромов Р450 сопровождается переходом в форму цитохром Р420, в то время как при инактивации цитохрома Р450 в процессе катализа происходит обесцвечивание гемопротеина, которое связано с разрушением гема и такой тип инактивации характерен для различных типов гидроксилазных реакций и форм цитохромов Р450, катализирующих разобщенные монооксигеназные реакции

4. Окислительная самоинактивация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях является высокоселективной реакцией. Другие белки и ферменты микросомальной мембраны, такие как цитохром Ь$, НАД(Ф)Н-специфичные флавопротеияы, глюкозо-6-фосфатаза не изменяются в процессе катализа. Показано, что реакция окислительной инактивации цитохрома Р430 и процессы перекисного окисления лилидов протекают независимо друг от друга.

5. В основе инактивации цитохрома Р450 в микросомах и в монооксигеназной системе, ' реконструированной из мономеров изолированного цитохрома Р450 и НАДФН-специфичного флавопротеина, лежит один и тот же механизм, что позволяет использовать растворимые реконструированные системы для моделирования инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях.

6. В процессе окислительной инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназной реконструированной системе обнаружена деградация гема и показана различная роль перекиси водорода, образующейся в активном центре фермента и вне его, в этом процессе.

7. Окислительная инактивация цитохрома Р450 в монооксигеназной реконструированной системе сопровождается модификацией апофермента, которая включает окисление БН-групп цистеинов, образование карбонильных групп на поверхности белка, изменение его физико-химических свойств и агрегатного состояния. В образовании агрегатов участвуют как гидрофобные и ионные взаимодействия, так и межмолекулярные коваленгоые сшивки.

8. Цитохром Р450, модифицированный перекисью водорода в монооксигеназной реконструированной системе, становится более доступен действию протеиназы К, чем нативный ^модифицированный белок.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее время в литературе широко обсуждается роль кислородных радикалов в регуляции внутриклеточного обмена белков. Активные формы кислорода (АФК), такие как суперокисные радикалы, перекись водорода, гидроксильные и пергидроксильные радикалы, генерируемые многочисленными оксидазными и оксигеназными системами клетки, могут быть вовлечены в окислительную модификацию макромолекул, которая сопровождается специфическим окислением аминокислотных остатков, увеличением гидрофобности, изменением агрегатного состояния белка. Модифицированные белки становятся более доступны действию внутриклеточных протеаз и быстрее утилизируются из клетки, чем нативные молекулы. В связи с этим Stadtman выдвинул гипотезу, согласно которой окислительная модификация белков может быть начальной стадией в механизме их распада в клетке. Эти реакция является своего рода сигналом для того, чтобы модифицированные белки были узнаны эндогенными протеазами, и ускоренная их протеолитическая деградация может служить физико-химической основой процессов обновления белков в клетке, старения и возникновения ряда патологических состояний в организме.

Молекулярный механизм реакций окислительной модификации подробно исследован для различных белков и ферментов, которые добавлялись в качестве молекул-мишеней к химическим и ферментным системам, генерирующим активные формы кислорода. Обнаружена высокая специфичность реакций окислительной модификации (Stadtman, 1986; Davies, 1987; Wolf Mid Dean, 1986; Levine, 1981). АФК окисляют строго определенные аминокислотные остатки в белках. Наиболее подвержены окислительной модификации такие аминокислоты, как гистидин, триптофан, тирозин, метионин, цистеин. Под действием АФК могут изменяться гидрофобные свойства, вторичная и третичная структура белков. Для гемсодержаших белков и ферментов похазана возможность разрушения тема, в результате образования межмолекулярных ковалентных сшивок (Rice et al., 1983). Для некоторых белков обнаружена прямая фрагментация полипептидной цепи (Dean, 1987).

Однако, до сих пор почти не исследован молекулярный механизм окислительной модификации и роль этой реакции в физиологии и патологии клетки для гемсодержащих ферментов, в частности для цитохрома Р450, который способен генерировать АФК в процессе катализа. Образование перекиси водорода и особенно высоко реакционноспособных гидроксильных радикалов в результате распада перекиси водорода в реакции Фентона или Хабер-Вайса может приводить к губительным последствиям для клетки. При этом может инактивироваться как сам цитохром Р450, так и возможна окислительная модификация других биомакромолекул в клетке (белков, нуклеиновых кислот, липидов), что может быть причиной возникновения химического канцерогенеза, появления мутагенных, канцерогенных, аллергических эффектов в организме.

Окислительная модификация цитохрома Р450 и его внутриклеточный распад мало исследованы. Для выяснения механизма самоинактивации цитохрома Р450 было использовано два методических подхода. Один из них - это исследование скорости инактивации восстановленных химическим путем карбоксикомплексов изолированного цитохрома Р450. Другой подход - это исследование самоинактивации цитохрома Р450 в процессе катализа в НДДФН-зависимых монооксигеназных реакциях.

Как было показано ранее инактивация восстановленного дитиониггом натрия цитохрома Р4502В4, изолированного из микросом печени кроликов, обработанных фенобарбиталом, сопровождается быстрым его переходом в неактивную форму Р420 (ВасЬтапоуа е1 а1., 1980). Основную роль в инактивации играют активные формы кислорода, образующиеся в активном центре фермента в процессе его автоокисления. Сравнительное исследование инактивации восстановленных форм цигохромов Р450 бактериального и животного происхождения позволило получить дополнительную информацию о механизме их инактивации. Из пяти исследованных форм цитохрома Р450, только микросомалышй Р4502В4 и бактериальный линолульный цитохром Р450 (Р450лин), инактивировались в химической системе окисления. Микросомалышй цитохром Р4501А2, а так же бактериальные- камфорный и н-цименовый цитохромы Р450 были стабильны и не инактивировались в условиях химического восстановления дитионитом натрия.

Обнаружены различия в механизме инактивации восстановленного Р4502В4 и Р450лин. Так, если для Р4502В4 формы наблюдалось замедление инактивации в условиях отсутствия кислорода, то на скорость инактивации Р450лин анаэробиоз не оказывал влияния. Присутствие окиси углерода так же замедляло инактивацию Р4502В4. Прямо противоположный результат был получен для цитохрома Р450лин, который инактивируется в восстановленном состоянии только в присутствии окиси углерода. В инактивации Р4502В4, по-видимому, участвуют активные формы кислорода, о чем свидетельствует замедление перехода цитохрома Р450 в форму Р420 в анаэробных условиях и в присутствии СО, т.е. в условиях, когда из активного центра дополнительно вытесняется кислород. В этом случае инактивируется оксикомплекс (Ре2^-Ог) Р4502В4 и инактивирующей частицей является восстановленная форма Ог- Стабильность цитохрома Р450лин в присутствии кислорода и стимуляция инактивации в присутствии окиси углерода предполагают другой механизм инактивации. В этом случае, по-видимому, инактивируется карбоксикомплекс (Ре2+-СО) и инактивирующей частицей является электрон, переходящий с железа гема на близлежащую аминокислоту. Показано, что переход цитохрома Р4502В4 в форму Р420 сопровождается модификацией серусодержащих аминокислот-цистеина и метионина. При инактивации Р450лин модифицируются ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, фенил ал анин) и, возможно, цистеин, на что указывает защитный эффект 8Н-содержащих соединений (доггиотреитода и меркаптоэтанола).

Таким образом, для некоторых форм восстановленных карбоксикомплексов цитохрома Р450 показана возможность самоинактивации при автоокислении, сопровождающаяся переходом в форму Р420. Возможно эта стадия является промежуточной в механизме деградации цитохрома Р450 в клетке, так как форма цитохрома Р420 нестабильна в присутствии кислорода и легко теряет гем (ЬщеЬпап-8иш1Ьег§, Раи1,1986).

Другим подходом для исследования механизма самоинактивации цитохрома Р450, является исследование его инактивации в процессе катализа в присутствии НАДФН. Усиление инактивации различных форм цитохрома Р450 в присутствии ингибиторов каталазы (азида натрия я гидроксиламина), а также медленная скорость инактивации в их отсутствии указывает, что перекись водорода, образующаяся в реакции, вовлечена в инактивацию гемопротеина. Цитохром Р450 инакгавировался в реакциях гидроксилирования как субстратов 1-го типа (диметилаиилин, аминопирин, бензфетамин, п -нитроанизол, так и 11-го типа (анилин) и принципиальным отличием данного типа инактивации от инактивации цитохрома Р450, восстановленного дитионитом натрия, было снижение содержания цитохрома Р450 без образования неактивной формы -цитохрома Р420. В процессе инактивации наблюдалось лишь обесцвечивание гемопротеина, что указывало на деструкцию гема. Как было отмечено выше, наблюдаемые различия могут быть результатом стабильности цитохрома Р420 в анаэробных условиях в случае инактивации цитохрома Р450 в присутствии дитионита и его высокой лабильности в присутствии кислорода в НАДФН-зависимых реакциях гидроксилирования. Вполне возможно, что обе реакции инактивации имеют один и тот же универсальный механизм.

Показано, что в инактивации цитохрома Р450 в гидроксилазных реакциях ведущую роль играет перекись водорода, а не конечные продукты реакции гидроксилирования. На это указывало постоянство коэффициентов инактивации цитохрома Р450 для различных монооксигеназных реакций при расчете на перекись водорода, образующуюся в каталитическом цикле. При этом коэффициенты инактивации в расчете на конечный продукт реакции различались для некоторых субстратов почти на порядок (например, при окислении диметиланилина и анилина). Исследование инактивации цитохрома Р450 в присутствии гидроксиламина, который ингибировал не только каталазу, но так же оказывал ингибирующее действие на скорость образования формальдегида в процессе окисления бензфетамива, подтверждало опосредованность инактивации гемопротеина перекисью водорода, а не конечным продуктом реакции.

Более низкий коэффициент инактивации цитохрома Р450 в присутствии субстратов гидроксилирования, чем при свободном окислении, указывал на стабилизирующее действие субстратов.

Высокие коэффициенты инактивации цитохрома Р450 в пересчете на перекись водорода при низких значениях рН и в отсутствии ионов т.е. в условиях благоприятных для генерации прямой перекиси водорода в монооксигеиазном цикле, указывали, что ведущую роль в инактивации играет перекись водорода, образующаяся в активном центре фермента при распаде пероксикомолекса. Перекись водорода, накапливающаяся в растворе, оказывает более слабый инактивирующий эффект. В связи с этим возникает вопрос, почему наблюдается усиление инактивации цитохрома Р450 в присутствий ингибиторов каталазы, т.е. в условиях, когда происходит накопление перекиси водорода вне активного центра. По-видимому, перекись водорода, накапливающаяся в растворе, снижает градиент концентрации между раствором я активным центром цитохрома Р450, что затрудняет ее диффузию из активного центра. Локальная концентрация перекиси водорода повышается, что влечет за собой усиление инактивации. Выраженный аддитивный эффект перекиси водорода, добавленной к микросомам в процессе инактивации цитохрома Р450 в НАДФН-зависимой монооксигеназной реакции, подтверждало правильность такого предположения.

Возможность инактивации в процессе катализа под действием перекиси водорода была показана для различных форм цитохрома Р450. Обнаружено, что инактивация цитохрома Р450 в микросомах печени крыс, обработанных фенобарбиталом, метилхолантреном и интактных животных так же характеризуется обесцвечиванием гемопротеина, без перехода в форму Р420. Инактивация усиливается в присутствии ингибитора катал азы азида натрия и коррелирует с накоплением перекиси водорода и снижением ферментативной активности. Более устойчива к действию перекиси водорода оказалась форма цигохрома Р4501А2, что вероятно можно объяснить присутствием в его активном центре прочно связанного индуктора, метилхолашрена (1вш е1 а1., 1980). Таким образом^ в основе окислительной инактивации цигохрома Р450 (по крайней мере некоторых его форм) лежит один и тот же механизм. Перекись водорода, образующаяся в качестве сопутствующего продукта в частично сопряженных монооксигеназных реакциях, может вызывать либо потерю, либо разрушение гема цитохрома Р450.

Показано, что перекись водорода, образующаяся в каталитическом цикле, оказывает избирательное инактивирующее действие на белки микросомальной мембраны. В процессе функционирования происходит снижение содержания исключительно цитохрома Р450, т.е. фермента, на котором генерируется перекись водорода. Активность глкжозо-6-фосфатазы я содержание цигохрома не изменялись, а активность НАДН-феррицианид и НАДФН-цигохром с редуктаз даже повышалась. Следовательно, инактивация цитохрома Р450 перекисью водорода носит селективный характер. Избирательность окислительной инактивации цитохрома Р450 в гидроксилазных реакциях имеет важный биологический смысл. Тот факт, что в процессе самоинактивации модифицируются только работающие белки, предполагает, что процесс распада белков в клетке носит не случайный характер, как это считалось до сих пор, а приобретает направленный характер удаления белков, "изношенных" в процессе катализа. Самоинакгивация ферментов может лежать в основе механизма, с помощью которого эндогенные протеазы распознают "изношенные ферменты" и быстро удаляют их из клетки. Модификация ферментов под действием активных форм кислорода, по-видимому, является основой для регуляции их распада в клетке.

Обнаружено, что реакции окислительной модификации и перекисного окисления лшщдов протекают независимо друг от друга, и модификация белков и ферментов является более ранним ответом на повреждающее действие активных форм кислорода, чем процессы перекисного окисления липидов.

Исследование инактивации изолированного цитохрома Р4502В4 в различных системах, генерирующих перекись водорода, позволило обнаружить некоторые особенности окислительной модификации гемопротеина.

Показано, что инактивация олигомерного цитохрома Р4502В4 в глюкозооксидазной-системе и , мономеризованного гемопротеина иод действием- : экзогенной перекиси со сходными .харакидовпшшя (потеря пероксидазиой активности, защитное действие субстрата, окисление SH-rpyrm), имеет определенные различия. Мономеризованный цитохром Р4502В4 в большей степени подвержен инактявирующему действию перекиси водорода; кроме того, в процессе инактивации, в отличии от олигамерной формы, не меняется его агрегатное состояние.

Учитьшая, что эта системы не в полной мере моделировали процесс инактивации цитохрома Р450 в каталитическом цикле, исследована инактивация цитохрома P4S02B4 в растворимой монооксигеназной системе, реконструированной из мономеров очищенного изолированного цитохрома Р4502В4 и НАДФН-зависимого флавопротеина (ФП) в присутствии детергента эмульгена 913.

Показано, что в монооксигеназной реконструированной системе (MPC), так же как и в микросомах, цитохром Р450 инактивируется'под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре фермента, , и скорость инактивации гемопротеина зависит от молярного отношения цитохрома Р4502В4 и ФП. Обнаружено, что механизм инактивации цитохрома Р4502В4 в MPC и в микросомах один и тот же, И в том и другом случае в процессе инактивации не происходит перехода цитохрома Р450 в форму Р420, а наблюдается лишь обесцвечивание гемопротеина, что указывает на деструктивные изменения в геме. Инактивация коррелирует со скоростью накопления: перекиси водорода в монооксигеназной реакции и сопровождается снижением скорости образования продукта, что свидетельствовует о потере гидроксилазной активности цитохрома Р450. Коэффициенты инактивации цитохрома Р4502В4 в пересчете на 1000 молекул, образующейся в реакции перекиси водорода, приблизительно одинаковы в MPC в присутствии цитохрома bs и в микросомах.

Окислительная самоинактивация цитохрома Р4502В4 в MPC сопровождается модификацией как гема, так и апофермента.

Корреляция между скоростью инактивации цитохрома Р4502В4 и снижением содержания связанного с ферментом гема указывает, что обесцвечивание цитохрома Р4502В4 в процессе инактивации связано либо с потерей гема, либо с его разрушением. На основании того, что снижение содержания общего гема и связанного происходит с одинаковой скоростью можно говорить, что в процессе инактивации происходит деструкция гема. Результаты, полученные при исследовании модификации гема в присутствии каталазы и без нее, указывают, что в деградации гема участвует как перекись водорода, локализованная в активном Петре цитохрома Р4502В4, так и, частично, перекись водорода, накапливающаяся в инкубационной среде. Вероятно^ что сначала под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре при распаде перокеикомплекса, нарушаются гидрофобные взаимодействия ' между гемом и апоферментом, на что указывают данные ó корреляции процессов инактивации и потери связанного гема как в присутствии каталазы, так и в ее отсутствии. Возможно, что потеря гема может быть результатом окисления SH-rpynn цистеина 436, который является пятым аксиальным лигандом железа гема. Каталаза полностью предотвращала снижение общего гема в процессе инактивации, что свидетельствует в пользу предположения, что следующей стадией деградации гема является разрушение его структуры под действием перекиси водорода, накапливающейся в инкубационной среде.

Наряду с деструкцией гема, перекись водорода участвует в модификации апофермента, которая сопровождается окислением SH-rpynn, изменением гидрофобных свойств белка, образованием агрегатов и появлением межмолекулярных ковалентных сшивок. Корреляция между скоростью инактивации цитохрома Р4502В4,его агрегацией и модификацией SH-групп гемопротеина, а так же одинаковое ингибирукмцее действие каталазы на эти процессы указывает на единый механизм их возникновения. Среди причин, вызывающих агрегацию цитохрома Р4502В4, Можно предположить окислительное действие перекиси водорода на боковые цепи аминокислот (по крайней мере, на SH-группы цистеинов), которое приводит к изменению физико-химических свойств белка. Данные, полученные Davies et al., указывают, что действие активных форм кислорода на различные белки выражается в модификации определённых аминокислот, среди которых Cys, Ттр, Тут, His наиболее подвержены окислительной модификации. Специфическая модификация определенных аминокислотных остатков повышают гидрофобность белка, что приводит к изменению его агрегатного состояния.

Вместе с тем, как видно из наших результатов, кроме гидрофобных сил, ионные взаимодействия могут так же вносить вклад в образование агрегатов между поврежденными молекулами цитохрома Р4502В4. На основании данных об увеличении времени выхода ияактивированного цитохрома Р4502В4 с ДЕАЕ колонки, мы предположили, что модификация аминокислотных остатков приводит к изменению перераспределения заряда на поверхности фермента, что влечет за собой появление дополнительных ионных взаимодействий и усиление агрегации.

Показано, что в процессе инактивации цитохрома Р4502В4 могут образовываться ковалентные сшивки между агрегатами. Возможно, этот процесс связан с модификацией БН-групп гемопротеияа и разрушением гема. Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок по сравнению со скоростью инактивации цитохрома Р4502В4 указывает на вторичность этого процесса и позволяет предположить, что неспецифические радикальные реакции могут вносить вклад в модификацию апофермента. Замедление процесса полимеризации в присутствии каталазы предполагает, что перекись водорода участвует в образовании межмолекулярных коваленгных сшивок, но ведущую роль в этом процессе, по-видимому, играют гидроксильные радикалы, которые могут образовываться как при взаимодействии Н2О2 с двухвалентным железом в реакции Фентона, так и в реакциях Хабер-Вайса, где в качестве катализатора выступает окисленное железо (На11пуе11 ааё ОиИвп<^е, 1986).

Подтверждением участия ОН радикалов в модификации апофермента является появление карбонильных групп в процессе инактивации цитохрома Р4502В4. Основываясь на литературных данных, можно предположить два механизма образования карбонильных групп. Во-первых, расщепление полипептидной цепи под действием пидроксильных радикалов по альфа-утлеродаому атому аминокислот и, во-вторых, модификация боковых аминокислотных остатков активными формами кислорода, которая может сопровождаться образованием карбонильных производных этих аминокислот (ЕНтев е1 а1„ 1987; БеаЛтап, 1994). Поскольку ни электрофорегически, ни хромагографически в ходе инактивации цитохрома Р4502В4 не было обнаружено пептидных фрагментов, наиболее вероятным кажется путь образования карбонильных групп через модификацию аминокислотных остатков.

Таким образом, в процессе окислительной инактивации цитохрома Р450 модифицируется как гем, так и апофермент, и эта реакция может быть начальной стадией в механизме его распада в клетке., так как модифицированный белок становится более доступен действию протеолитических ферментов, и должен быстрее, чем нативный фермент, утилизироваться из клетки. Окислительная самоинактивация цитохрома Р4502В4 в процессе катализа может лежать в основе механизма, регулирующего его обновление в.клетке.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Карузина, Ирина Ивановна, Москва

1. Карузина И.И., Кузнецова Г.П., Арчаков А.И. О роли свободнорадикальных реакций в механизме инактивирующего действия CCI4 на цитохром Р450. В сб. "Биологические мембраны в норме и патологии", 1972, с.25-26.

2. Karuzina I.L, Archakov A.I. CCLt-induced damage to endoplasmatic reticulum membranes. Biochem. Pharmacol., 1973, v.22, p.2095-2104.

3. Karuzina I.I., Archakov A.I., Kokareva I.S., Bachmanova G.I. The effect of magnesium ions on the dimethylaniline oxidation rate and electron transfer in liver microsomal fraction. Biochem. J., 1973, v.136, p.371-379.

4. Karuzina I.I., Archakov A.I., Devichensky V.M. Participation of cytochrome b5 in hydroxylation reaction. Thesis on IX Intern. Biochem. Congress, 1973, Stockholm, p.336.

5. Арчаков А.И., Карузина И.И. Молекулярные механизмы взаимодействия четыреххлористого углерода с мембранами эвдоплазматического ретшсулума печени. Успеха гепатшоша, 1973, т. 7, с.39-59.

6. Карузина И.И., Арчаков А.И., Кокарева И.С., Бачманова Г .И. Влияние ионов Mg на скорость окисления диметиланилина и перенос электронов в микросомах печени. Биохимия, 1974, т.39, в.З, с.467-475.

7. Арчаков А.И., Девиченский В.М., Карузина И.И. Перенос электронов в мембранах эндоплазмагаческого ретакулума. Взаимодействие НАДФН-и НАДН-спецнфичных цепей электронов в мшфосомах. Биохимия, 1974, т.39, №5, с.903-909.

8. Karuzina I.I., Archakov A.I., Tveritinov V.N., Kokareva LS. Hydroxylation of aniline and aminoantipyrine derivatives in liver endoplasmatic reticulum. Biochem. Pharmacol., 1974, v.23, p.1053-1063.

9. Karuzina I.I., Archakov A.I., Bachmanova G.I., Kuznetsova G.P., Karjakin A.V. Reconstitution of microsomal redox chains. Abstr. Commun. 9ft FEBS Meeting, 1974, Budapest, v.l4,p.l00.

10. Карузина И.И., Арчаков А.И., Кокарева И.С. Гидроксилирование производныханилина и аминоаитипирина в эндоплазматагческом ретикулуме печени. Биохимия, 1975, т.40. в.1, с.32-39.

11. Archakov A.I., Zhimov G.F., Karuzina IX Analyses of the effects of NADPH-dependent electron transport in rat liver microsomes. Biochem. Pharmacol., 1977, v.26, p.389-392.

12. Karuzina I.I., Bachmanova Gi., Archakov A.I. Thermal and proteolytic inactivation of isolated liposomal and microsomal cytochromes P450. Abstr. of 12th FEBS Meeting, 1978, Dresden, p.3-6.

13. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Менгазетдинов Д.Э., Мясоедова К.Н., Кузнецова Г.П., Арчаков А.И. Выделение и свойства дитохрома Р450 из михросом печени кролика. Биохимия, 1979,т.44, С.1049-1057.

14. Archakov A.I., Bachmanova GX, Karuzina IX, Mengazetdinov D.E. The properties of cytochrome P450 and hydroxylase activity of reconstituted proteoliposomal membranes. Acta Biol. Med. Germ., 1979, bd.38, s.299-306.

15. Бачманова Г.И., Карузина И.Й., Меягазетданов Д.Э., Арчаков А.И. Тепловая и протеолитическая инактивация щпохрома Р450. Биохимия, 1981, т.46, №2, с.280-285. : • '■■'■■ " ' ' -■•

16. Арчаков А.И., Кузнецов Б.А., Карузина И.И., Изотов М.В. Электрохимическое восстановление цитохрома Р450 в йрисутствии 4,4-дипиридила. ДАН СССР, 1981, т.258, с.216-220.

17. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Изотов М.В., Осипов А.Н. Исследование механизма ингибирующего действия медь-тнрозинового комплекса на гидроксилазные реакции. Бйохимм, 1981, т.46,с.1754-1760.

18. Арчаков А.И., Кузнецов Б.А., Карузина И.Н., Изотов М.В. Инактивация дитохрома Р450 на катоде. Биофизика, 1981, т.26, с.352-354.

19. Карузина И.И., Арчаков А.И. Роль суперокисных радикалов в мнкросомальных окислительных реакциях. В сб. "Окислительно-восстановительные металлоферменты и их моделирование." 1982, с. 52-61.

20. Карузина И.И., Вареница А.И., Арчаков А.И. Сравнительный ингибиторный анализ гидроксилировання анилина цитохромом Р450 в НАДФН,-ГПК и НгОг-зависимых системах. Биохимия, 1983,т.48, с.1788-1793.

21. Карузина И JH., Арчаков АЛ. Инактивация цитохрома Р450 в гидроксилазных реакциях. Биохимия, 1985, т,50, с.1805-1810.

22. Карузина И.И., Арчаков А.И. Механизм инактивации цитохрома Р450 в реакциях гидроксилнрования субстратов 1-го и 2-го типа. Тезисы Всесоюзной конференции "Цигохром Р450 и охрана внутренней среды человека", 1985, Москва, с. 22.

23. Карузина И.И., Арчаков А.И. Самоинактивация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях. Тезисы на V Всесоюзном биохимическом съезде, 1986, Киев, с.299-300.

24. Карузина И.И., Арчаков А.И. Самоинакгивация ферментов в процессе катализа. Тезисы на Всесоюзном симпозиуме по медицинской эизимологии, 1986, Махачкала, с.4.

25. Карузина ИЛ., Менгазетдинов Д.Э., Капитанов А.Б., Жуков АЛ., Арчаков А.И. Влияние монооксигеназных реакций, катализируемых цитохромом Р450, на микроеомальную мембрану. Биохимия, 1987, т.52, в.7, с.1090-1096.

26. Карузина И.И., Арчаков А.И. Самоинакгивация ферментов в процессе катализа. Вестник АМН СССР, 1987, N7, с.60-67.

27. Карпец JI.3., Адрианов Н.В., Карузина И.И., Арчаков А.И. Исследование влияния перекиси водорода на инактивацию цитохрома Р450. Бюлл. эксп. биологии и медицины, 1988, N5, с.547-549.

28. Арчаков А.И., Карузина И.И. Окисление чужеродных соединений и проблемы токсикологии. Вестник АМН СССР, 1988, N1, с.14-23.

29. Карузина И.И. Окислительная модификация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях. Тезисы V Всесоюзной конференции "Цитохром Р450 и модификация макррмодевул", 1989, Ялта, с.45.

30. Карузина Й.И., Менгазетдинов Д.Э. Роль перекиси водорода, образующейся в каталитическом цикле при распаде пероксикомллекса, в инактивации цитохрома Р450. Там же, с.143.

31. Карузина И.И., Менгазетдинов Д.Э., Арчаков А.И. Самоинактивация цитохрома Р450 в процессе катализа перекисью водорода, образующейся при распаде пероксикомплекса. Биохимия, 1989, т.54, N7, с.1102-1107.

32. Арчаков А.И., Карузина И.И., Адрианов Н.В. Цитохром Р450 и окислительная модификация макромолекул. Вестник АМН СССР, 1990, N2, с.21-27.

33. Карузина И.И., Арчаков А.И. Модификация макромолекул в реакциях окисления низкомолекулярных соединений, как основа развития патологических состояний. Тезисы на Всесоюзной конференции " Эфферентные методы в медицине", 1992, Анапа, с.3-6. . ^

34. Karuzina I.I., Mokhosoev I.M. Oxidative degradation of drthionite-reduced cytochromes P450 2B4 and 1A2. Там же, p.142-144.

35. Karuzina I.I., Mengazetdinov D.E., Archakov A.I. Self-catalyzed inactivation of cytochrome P450 by hydrogen peroxide produced at the hemoprotein active center. Phys. Chem. Biol. Med., 1993, v.l, p.33-36.

36. Karuzina I.I., Archakov Д.1. The oxidative inactivation of cytochrome P450 in monooxygenase reactions. Free Radical Biology Mid Medicine, 1994, v. 16, p.73-97.

37. Karuzina I.I., Archakov Ai. Hydrogen peroxide-mediated inactivation of microsomal cytochrome P450 during monooxygenase reactions. Free Judical Biology and Medicine, 1994, v. 17, p.557-567.

38. Карузина И.И., Бачманова Г.И., Арчаков А.И. Самоинакгавация цитохрома Р450 в каталитическом цикле. Вестник РАМН, 1995, N2, с. 17-29,

39. Карузина И.И., Арчаков А.И. Цитохром Р450. В сб. Белки и пептиды (под ред. В.Т.Иванова, В.МЛишоша), 1995, Наука, с.17-29.

40. Zgoda V.G., Karuzina I.I., Kuznetsova G.P., Samenkova N.F., Archakov AJ. NADPH-initiated seif-catalyzed cytochrome P450 oxidative modification during monooxygenase reactions.il. Heme modification., Там же, 1995, p.254.

41. Karuzina I.I., Zgoda V.G., Archakov A.I. Mechanisms of P4502B4 self-inactivation, heme and apoenzyme oxidative modification during catalytic turnover. Abstr. XI Intern, symposium on microsomes and drug oxidations, 1996, Los Angeles, p. 185.

42. Згода ВТ., Карузина И.И., Ншаток О.В., Арчаков А.И. Модификация апофермента цитохрома Р450 в процессе его окислительной самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе. Вопр. мед. химии, 1996, т.42, в.З, с.203-210

43. Карузина И.И., Згода В.Г., Арчаков АЛ. Самоинактивация цитохрома Р4502В4 в ходе каталитического цикла в монооксигеназной реконструированной системе. Вопр. мед. химии, 1997, т.43, в.4, с.217-225.

44. Karuzina I.I., Zgoda V.G. Heme and apoprotein modification of cytochrome P4502B4 during its self-inactivation in monooxygenase reconstituted system. FASEB J., 1997, p.184.

45. Карузина И.И., Згода В.Г., Арчаков А.И. Модификация цитохрома Р4502В4 в процессе его окислшельной самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе. П-ой биохимический съезд, 1997, Москва, с.425.

46. Арчаков А.Й., Карузина И.И., Згода В.Г. Окислительная модификация цитохрома Р450 и других ма!фомсшекул в процессе их обновления. Вопр. мед. химии, 1998, т.44, в. 1, с.3-27.