Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Масс-спектрометрическое определение активности и содержания цитохромов P450"

На правах рукописи

Москалева Наталья Евгеньевна

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450

03.01,04-биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2013

Москва 2013

005533339

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Згода Виктор Гаврилович

Официальные оппоненты: Шумянцева Виктория Васильевна

доктор биологических наук,

ФГБУ «ИБМХ» РАМН, зав. лабораторией

«Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук.

Защита состоится «17» октября 2013г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 001.010.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук по адресу: 119121 Москва, улица Погодинская, дом 10, стр. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ИБМХ» РАМН Автореферат разослан «_» _2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Ильина Елена Николаевна

доктор биологических наук,

ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России, зав. лабораторией

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение

кандидат химических наук

Карпова Е. А.

Актуальность проблемы. Ключевая роль первой фазы метаболизма ксенобиотиков

принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450, которые представляют собой гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной системы. Активность монооксигеназной системы в направлении того или иного ксенобиотика определяется главным образом концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохромов Р450. Поэтому для создания моделей лекарственного воздействия необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов изменения концентраций данных ферментов при воздействии различных факторов и определения взаимосвязей между концентрацией цитохромов Р450 и их активностью.

Мыши являются наиболее распространенными объектами для исследования монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов Р450 (Tingle et al., 2006, Environmental Toxicology and Pharmacology, 21, 184-190). В геноме мыши идентифицировано 36 ортологичных генов цитохромов Р450, которые потенциально могут иметь идентичные функции у человека и мыши (Nelson et al., 2004, Pharmacogenetics, 14, 1-18). Также отмечено сходство каталитических активностей и процессов ингибирования CYP1A, CYP2E и CYP3A.

Развитие персонализированной медицины требует создания новых методов оценки концетраций и активностей цитохромов Р450 и их изменений в процессе индукции или ингибирования лекарственными препаратами. Исследование активности и количественных характеристик цитохромов Р450 представляет собой трудную задачу. Факторами, усложняющими разработку методики масс-спектрометрического анализа применительно к цитохромам Р450, являются высокая гомология между белками в одном семействе, а зачастую и между семействами, что приводит к тому, что большая часть пептидов отражают присутствие различных изоформ. Кроме того, цитохромы Р450 являются гидрофобными мембранными белками, которые трудно поддаются анализу. Исследования активности цитохромов Р450 ограничиваются трудностями подбора изоформспецифичных субстратов, ферментативную реакцию с которыми катализировала бы только одна изоформа, а также необходимостью разработки методики количественного анализа метаболитов с высокой чувствительностью и минимальным количеством требуемого биологического материала.

Цель исследования: разработка метода определения активности и концентрации основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием масс-спектрометрии

и валидация методики на пробах микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Основные задачи исследования:

1. Исследовать цитохромы Р450 микросомальной фракции печени контрольных мышей и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном методом общего протеомного профилирования.

2. Создать хромато-масс-спектрометрический метод мониторинга множественных реакций для определения концентраций фармакологически значимых изоформ подсемейств 1А, 2С, 20, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

3. Разработать хромато-масс-спектрометрическую методику определения активности фармакологически значимых подсемейств 1А, 2С, Ю, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

4. Апробировать и валидировать разработанные методики на примере микросомальной фракции печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Сопоставить изменения активности и концентрации исследуемых цитохромов Р450 вследствие индукции.

Научная новизна работы. Впервые разработан изоформспецифичный метод количественного анализа цитохромов Р450 печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Метод требует минимального количества биологического материала, чувствительность составляет до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка, воспроизводимость результатов более 80%. Впервые исследованы диапазоны вариации концентраций и активности цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном, приведена активность в пересчете на молекулу фермента, а также показано, что изменение активности и концентрационных характеристик коррелирует между собой, что подтверждает правильность разработанных методов. Практическая значимость работы. Разработанный метод позволяет проводить измерение концентрации и активности цитохромов Р450 печени мыши в биологическом материале с чувствительностью до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка и воспроизводимостью результатов более 80% без использования изотопных меток. Оценка воздействия различных факторов на цитохромы Р450 необходима при использования мыши как биологической модели при разработке лекарственных препаратов, а также для создания моделей лекарственного воздействия. Описанная концепция и этапы разработки МИМ

метода применимы для разработки методик анализа цитохромов Р450 монооксигеназной системы человека, что требуется для развития персонализированной медицины. Положения, выносимые на защиту.

Протеомное профилирование микросомальной фракции печени мыши для идентификации и оценки количественных характеристик цитохромов Р450.

Разработка методики количественного анализа изоформ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши без использования изотопных меток с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, а также методики определения активности подсемейств 1А, 2С, 2D, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши методом мониторинга множественных реакций на масс-спектрометре с тройным квадруполем.

Определение содержания основных изоформ цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши, а также их вариабельности в процессе индукции.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на международной конференции HUPO-2012, Boston, USA; VIII международной конференции «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12» 2012, Новосибирск, Россия; V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» 2008, Москва, Россия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 6 статей - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 4 публикации - в сборниках докладов научных конференций.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка литературных источников, включающих 123 наименования, и приложения. Работа изложена на 192 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 22 рисунка и 1 приложение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Подготовка пробы к протеомному масс-спектрометрическому анализу.

Для исследования использовали микросомы печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. Мыши (Albino mice, самцы) получали внутрибрюшинные инъекции индуктора в течение 5 дней в дозировке 80 мг/кг веса фенобарбитал (раствор натриевой соли) или 50 мг/кг веса 3-метилхолантрен (в кукурузном масле). Контрольным животным вводили изотонический раствор или масло, соответственно. Выделенную печень перфузировали холодным (4°С) изотоническим КС1 и готовили гомогенаты с использованием гомогенизатора Даунса в 2-х кратном объема калий фосфатного буфера 0.1 М, рН 7.4. Выделение микросом проводили методом, описанным в [Zgoda et. al., 2002, Toxicol in vitro, 16(1), 1-10]. Концентрацию общего белка измеряли методом ВСА (Pierce, США) согласно рекомендациям производителя. Ферментативное расщепление микросомального белка проводили согласно методике, описанной в статье Kopylov с соавт. (Kopylov et al., 2013, Proteomics, 13, 727-742). В качестве матрицы для приготовления стандартов использовали 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде, гидролизованные трипсином микросомы печени человека и «небелковую матрицу» (буфер для проведения гидролиза).

Общее протеомное профилирование микросом печени мыши для идентификации и выявления протеотипических пептидов цитохромов Р450 при помощи ионной ловушки и Q-TOF проводили согласно методам, описанным в работах Москалева с соавт. и Zgoda с соавт. (Москалева Н.Е с соавт., 2011, Биоорганическая химия, 37, 1-16; Zgoda et al., 2009, Proteomics, 9, 4102^105).

Синтез пептидов осуществлялся по протоколу твердофазного пептидного синтеза на автоматическом пептидном синтезаторе Overture (Protein Technologies, Inc) исходя из 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос)-защищенных по a-аминогруппам производных аминокислот. При синтезе изотопно-меченых пептидов использовали вместо обычного лейцина (Fmoc-Leu-OH) изотопно-меченый (Fmoc-Leu-OH-13C6,l5N). Содержание

пептида в образце не менее 95%, измерено согласно "Методике измерения молярной концентрации маркерного пептида в растворе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии" (свидетельство об аттестации № 253.0100/01.00258/2012 от 30.04.2012)

Изоформа Пептид Родительск ий ион m/z щ"л Дочерние ионы Напряжение диссоциации V

1А1 VDMTPTYGLTLK 669,8" 892,4(y„); 993,4(y,); 446,7(y„") 22

1А2 NS1QDITSALFK 669,0" 1022,6 (y9); 894,5 (y8); 315,2 (b,) 20

NSIQDITSA*LFK 672,4" 1028,8 (y9); 900,8 (y8); 315,2 (b3) 20

2С29 NISQSFTNFSK 636,9" 228,0 (Ьг); 1045,0 (у,); 830,4(y7) 20

2С29 GTTVITSLSSVLHDSK 549,1J+ 587,3(y„"); 643,8(y12"); 743,9(уи2+) 15

GTTVITSLSSV'LHDSK 551,2" 590,5(y„"); 647,4(y12"); 747,0(y142t) 15

2С39 FINLVPNNIPR 648,9" 710,5 (y6); 809,5 (у,); 375,3 (b3) 20

2С50.54 VQEEIEHVIGK 427, 7" 582,4(y,o"-H20); 518,3 (y,"-H20); 204,l(y2) 10

2D9 FGDIVPVNLPR 614,0" 695,5(y6); 320,l(bj); 794,3(y7) 19

2D10 FGDIAPLNLPR 607,0" 709,3(y6); 780,l(y7); 319,9(b3) 18

2D26 DLTDAFLAEVEK 676,0" 575,2(ys); 835,5(y7); 906,6(y„) 20

2Е1 DIDLSPVTIGFGS1PR 844,1" 1143,4(y„); 344,l(b3); 733,l(y7) 30

2Е1 DIDLSPVTIGFGSIPR 563,1" 733,4(y7); 529,3(y5); 676,4 (y6) 10

2Е1 MNMPYMDAVVHEIQR 612,1" 729,4(y,2");794,9(y13"); 682,4(y,) 17

ЗА11,41 ALLSPTFTSGK 561,5" 737,4(y,); 824,4(y»); 937,2(y,) 10

AL* LSPTFTSGK 564,9" 737,4(y7); 824,4(yg); 944,4(y,) 10

ЗА11,16 GS1DPYVYLPFGNGPR 584,8" 744,4(y,); 372,2(b4); 895,3(b8) И

ЗА11,16 GSIDPYVYLPFGNGPR 876,6" 744,4(y7); 1020,5(y,); 690,4(yl2") 31

ЗА11,16 FALMNMK 427,8" 636,2(ys); 707,2(y6); 523,2(y4) 8

"пептид синтезированный с включением изотопно-меченого L.

Количественный анализ выбранных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Количественный анализ протеотипических пептидов цитохромов Р450 осуществляли на тандемном масс-спектрометрическом детекторе "Agilent 6410" QQQ в режиме MRM с источником ионизации электроспрей. Хроматографическое разделение осуществляли при помощи микроаналитической колонки Zorbax SB-C 18, 150 х 0.5 mm, 5 urn. Подвижная фаза А - 0,1% муравьиная кислота в воде, фаза В - 0,1% муравьиная кислота в 80% ацетонитриле, скорость потока 4 мкл/мин. Градиент подвижной фазы от 5% до 65% фазы В течение 32 мин, далее до 100% фазы В к 34 мин. Для источника ионизации электроспрей использованы следующие параметры: температура осушающего газа 300°С, давление в небулайзере 20 psi, поток осушающего газа 6 л/мин, напряжение на капилляре 3000 V. В таблице 1 приведены оптимизированные масс-спектрометрические параметры количественного анализа пептидов.

Определение активности изоформ цитохромов Р450 к маркерным субстратам.

Активность цитохромов Р450 оценивали по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом, при этом скорость рассчитывали как количество образующегося метаболита в единицу времени на мг микросомапьного белка (пмоль/мин на мг микросомального белка). В качестве изоформспецифичных субстратов использовали фенацетин, как субстрат подсемейства 1А цитохромов Р450 человека (метаболит -ацетаминофен), тестострон (подсемейство ЗА, бр-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (2Е, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (2С, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (20, 4-гидроксидебризохин), методика подготовки пробы и масс-спектрометрического анализа описана в статье Москалева с соавт. (Москалева Н.Е с соавт., 2011, Биоорганическая химия, 37, 1-16).

Линейность зависимости количества образующегося метаболита от времени исследовали инкубированием определенной концентрации субстрата (тестостерон 50 мкМ, хлорзоксазон 50 мкМ, фенацетин 50 мкМ, дебризохин 50 мкМ, диклофенак 10 мкМ) с 0.5 мг\мл микросомального белка в течение различного периода времени (0, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 60 мин). Зависимость скорости реакции окисления субстрата от концентрации микросомального белка или концентрации NADPH анализировали в диапазоне концентраций белка от 0,2 до 2 мг/мл и ИАОРН от 0,2 до 4 мМ при инкубации в течение 10 мин и фиксированной концентрации субстрата (тестостерон 50 мкМ, хлорзоксазон 50 мкМ, фенацетин 50 мкМ, дебризохин 50 мкМ, диклофенак 10 мкМ).

Для определения активности инкубировали 0,5 мг\мл микросомального белка с 1 мМ КГАОРН и субстратом в концентрации 1000 мкМ для тестостерона, фенацетина, дебризохина и в концентрации 500 мкМ для хлорзоксазона и диклофенака.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование цитохромов Р450 в рамках общего протеомного профилирования.

На первом этапе работы по исследованию цитохромов Р450 в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном провели общее протеомное профилирование с использованием масс-спектрометров на основе ионной ловушки и <ЗТОР. В процессе анализа на ионной ловушке было идентифицировано более 3700 белков.

Согласно результатам, полученным с помощью базы данных иЫРго^ в протеоме мыши обнаружено 60 цитохромов Р450, из них 42 экпрессируется в печени. В процессе общего протемного анализа изоформспецифичные пептиды были обнаружены для 32 изоформ

цитохромов Р450 (1А1, 1А2, 2А4, 2А5, 2А12, 2В9, 2В10, 2Е1, 2F2, 2J5, 2J6, 4V2, 4А14, 4А10, 4А12А, 2D9, 2D10, 2D11, 2D26, ЗА11, 3A13, ЗА16, ЗА25, ЗА41, 2С29, 2С39, 2С38, 2С40, 2С54, 2С37, 2С55, 2С70). Присутствие изоформ CYP2C50, CYP2D55, CYP2A2, CYP2A25, CYP2B19 можно предположить по наличию пептидов общих для нескольких изоформ. Для дальнейшего исследования выбраны представители наиболее фармакологически значимых подсемейств цитохромов Р450, таких как 1 А, ЗА, 2Е, 2С и 2D.

По результатам общего протеомного профилирования количественная оценка может быть проведена путем непосредственного сравнения интенсивности масс-спектрометрических сигналов (площадей под хроматографическими пиками), либо методом подсчета числа тандемных масс-спектров, полученных для различных образцов (метод подсчета спектров). Этот количественный анализ в протеомике получил название «определение концентрации без изотопной метки» (Lable free quantitation) (Walter Т. et al, 2010, J. Cell Biol., 190, 491-500)

На данном этапе для оценки изменения содержания цитохромов Р450 в печени мыши в результате индукции использовали метод сравнения суммарной интенсивности пептидов, рассчитанной при помощи программы Spectrum Mill. Содержание CYP1A1 увеличивается под влиянием метилхолантрена в 6,9, a CYP1A2 в 9,1 раз (по результатам анализа на ионной ловушке). Экспрессия подсемейства 2 С цитохромов Р450 индуцируется фенобарбиталом, причем концентрации изоформ цитохромов Р450, принадлежащих данному посемейству увеличиваются в 3-4 раза. В микросомах печени мыши после индукции фенобарбиталом увеличивается содержание также цитохромов Р450, принадлежащих подсемейству ЗА в 3-5 раз. CYP2E1 не подвержен индуцирующему влиянию метилхолантрена и фенобарбитала.

Данные, полученные на QTOF, позволили использовать другой способ обработки хроматограмм общего протеомного профилирования. Так, для уточнения степени индукции цитохромов Р450, из хроматограмм общего протеомного профиля, полученных при помощи QTOF экстрагировали профили элюирования выбранных пептидов рассматриваемых изоформ цитохромов Р450. Далее по средней площади пиков на хроматограмме рассчитали степень индукции белков данного подсемейства относительно исходного.

а)

Рис. 1. Изменение содержание цитохромов Р450 подсемейств 1А, ЗА, 2Е, 2С и 2D в пробах после индукции фенобарбиталом (а) или метилхолантреном (б), рассчитанное на основании протеомного профилирования при помощи ионной ловушки (п) и QTOF (в) и программы Spectrum Mill и по профилям элюирования отдельных пептидов на QTOF (■).

Изменение содержание цитохромов Р450 подсемейств 1А, ЗА, 2Е, 2С и 2D в пробах после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном, рассчитанное на основании протеомного профилирования при помощи ионной ловушки и QTOF и программы Spectrum Mill и по профилям элюирования отдельных пептидов на QTOF, приведено на рис.1. Необходимо отметить, что изоформы CYP2C37, CYP2C38, CYP2C40, CYP2C70, CYP2D11 и CYP3A13 охарактеризовать по данным QTOF не удалось, вследствие более низкой чувствительности QTOF по сравнению с ионной ловушкой.

Результаты, полученные с использованием как ионной ловушки, так и QTOF позволяют оценить изменение содержания белков до и после индукции цитохромов Р450 фенобарбиталом или метилхолантреном. Однако при сравнении результатов обнаружили

низкую воспроизводимость количественного анализа и некоторое расхождение в результатах, полученных на разных приборах или при разных методах расчета, причем в первую очередь это актуально для белков с низкой концентрацией.

2. Разработка метода масс-спектрометрического количественного анализа с использованием мониторинга множественных реакций и масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Для установления точных концентраций выбранных изоформ цитохромов Р450 был разработан MRM метод и проведен количественный анализ микросом печени мыши с использованием масс-спектрометра с тройным квадруполем. Созданная методика нацелена на обнаружение выбранных пептидов цитохромов Р450, которые отслеживаются на протяжении широкого диапазона концентраций, что позволило повысить чувствительность и воспроизводимость измерений.

2.1 Выбор пептидов для целевого количественного анализа методом MRM.

При выборе пептидов, используемых для количественного определения белка, руководствовались параметрами получаемого масс-спектрометрического сигнала. Поэтому в первую очередь выбор проводили среди пептидов, которые обнаружены как на ионной ловушке, так и на Q-TOF. Также критериями выбора пептида для количественного анализа послужили: а) время удерживания пептида в использованных условиях должно быть в пределах от 15 до 40 мин, Ь) длина пептида - последовательность должна включать не менее 6 и не более 20 аминокислот и при этом не содержать пропущенных сайтов ферментативного гидролиза. Также, предпочтение отдавалось пептидам, не имеющих в последовательности химически лабильных аминокислот, таких как цистеин и метионин. Аналогичные критерии выбора протеотипических пептидов используются в работах, посвященных анализу белка методом MRM (Langenfeld Е. et al, 2009, Proteomics, 9, 2313 -2323; Kawakami H.et al, 2011, J. of Pharm. Sei., 100(1), 341-352).

Вследствие большой степени идентичности, наблюдаемой для цитохромов Р450 в пределах подсемейства, трудно, а иногда невозможно, выбрать специфичные пептиды для всех интересующих изоформ. Так, Kawakami с соавт. (Kawakami H.et al, 2011, J. of Pharm. Sei., 100(1), 341-352) не обнаружили пептида, позволяющего количественно разделить изоформы ЗА4 и ЗА5 цитохромов Р450 человека.

В данной работе общее протеомное профилирование проводили как на ионной ловушке, так и на QTOF, что позволило расширить число обнаруженных протеотипических пептидов, определяющих отдельные изоформы цитохромов Р450 печени мыши. Так, для CYP1A1 и CYP1A2 идентифицировали по одному изоформспецифичному пептиду

(УОМТРТУОЬТЬК для СУР1Л1 и ЫЗКЗШТЗАЕРК для СУР1Л2), для СУР2С29 и СУР2Е1 выбрано по два пептида (№5д5РТЫР8К и СТТУИЗЬЗЗУШОБК для СУР2С29, ОГОЬ8РУТЮРС81Р11 и МММРУМОАУУНЕ1(211 для СУР2Е1), а также по одному пептиду обнаружено для изоформ 2С39, 2Б9, 2Э10, 2Э26 цитохромов Р450 (Р1№ЛФШ1РК, РС01УРУКЬРЯ, РС01АРЬЖРа и ОЬТОАРЬАЕУЕК соответственно).

Для СУРЗА11, ЗА16, ЗА41 а также СУР2С50 и СУР2С54 специфических пептидов, которые воспроизводимо идентифицируются как на ионной ловушке, так и на ()ТОР, и удовлетворяют всем требованиям обнаружить не удалось. Поэтому были выбраны пептиды УС>ЕЕ1ЕНУЮК для СУР2С50.54, АЬЬЗРТРТБСК для СУРЗА11,41, 08ШРУУУЬРР0Ы0РК и РАЬШМК для СУРЗА11,16.

2.2 Разработка МИМ метода количественного анализа протеотипических пептидов выбранных белков при помощи масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Разработка МЯМ метода состояла из двух этапов, первым из которых являлось определение родительского иона и оптимизация МС параметров которые влияют на его интенсивность (таких как оптимизация фрагментора, напряжение на капилляре). На втором этапе выбирали характеристические дочерние ионы и напряжение в ячейке соударений, при котором фрагментация оптимальна. Для выявления характеристических дочерних ионов провели анализ спектров фрагментации пептидов, полученных при помощи ионной ловушки, (З-ТОР и (3(3(3. После анализа полученных данных стало очевидным, что основными фрагментными ионами, присутствующими на спектрах, являются одно и двухзарядные у- и Ь- ионы.

В качестве примера можно привести пептид ОТТУГГ8Е88УиШ8К. СУР2С29, при ионизации которого образуется преимущественно ион [М+ЗН]3+ ш\г 549,13+Оа, выбранный в качестве родительского иона. В ячейке соударений при напряжении фрагментации 15У пептид СТТУ1Т8Е88УиГО8К образует пять характеристических осколков 587,3 (уц2+), 643,8 (у,22+), 743,9 (у|42+), 872,9 (у8); 1072,2 (ую). Спектр фрагментации пептида приведен на рис 2(а). Три наиболее интенсивных фрагмента выбраны для создания МКМ метода. Основанием для количественного анализа служило сочетание родительского и не менее трех дочерних ионов, при этом ион с максимальным откликом использовали для расчета концентрации, а соотношение остальных дочерних ионов подтверждало идентификацию. На рис 2(6) приведена хроматограмма пептида ОТТУГГ8Е88УЫГО8К. по трем выбранным характеристическим ионам. Родительские и дочерние ионы для пептидов остальных исследованных цитохромов Р450 приведены в таблице 1 раздела "Материалы и методы".

Одной из проблем количественного анализа при помощи жидкостной хромато-масс-спектрометрии является необходимость учета влияния компонентов пробы на интенсивность масс-спектрометрического сигнала пептида. Одним из способов решения данной проблемы является использование изотопно-меченых пептидов в качестве внутреннего стандарта. Однако необходимость синтеза для каждого пептида его изотопно-меченого аналога многократно увеличивает стоимость анализа и время на разработку методики, а)

е «

8

I 5

I '

* 3 г

100 200 300 400 500 600 700

900 1000 1100 1200

б)

20 22 24 28

30 32 34 38 38

Рис. 2. Пептид СГтТВГ^УитЗК. (СУР2С29). а) спектр фрагментации, б) хроматограммы по выбранным дочерним ионам.

2.3 Исследование влияния матрицы на результат количественного определения.

В данной работе для подтверждения концентраций, полученных без изотопной метки, провели исследование влияния компонентов пробы на количественное определение. Для этого были синтезированы изотопно-меченые аналоги ^1(301Т5ЛЬ*Ь'К (СУР1А2), СТТу1Т8Ь88уь*НОщСур2С29) и А1Х*8рТрТ8(Ж (СУРЗА11,41), для которых сравнили результаты количественного анализа, полученные при помощи внутренного стандарта и внешней калибровки. При этом для приготовления калибровочных растворов использовали 3% водный раствор муравьиной кислоты, микросомы печени человека после

ферментативного расщепления и смесь буферных растворов и реактивов, использующихся для проведения пиридилэтилирования и ферментативного расщепления, без добавления трипсина и биологической пробы, названную «небелковой матрицей».

180

О 50 100 150 200

Концентрации, рассчитанные методом внутреннего _____стандарта, фмоль/мкл____

Рис 3. Соотношения между концентрациями СУР1А2, СУР2С29 и СУРЗА11,41, определенными методом внутреннего стандарта (с добавлением пептидов №К301Т5АЬ*РК, ОТТ\ТГ5Ь88У1,*ШЭ8К и ЛЬЬ*5РТРТ8СК) и методом абсолютной калибровки с использованием для приготовления стандартов (■) 3% водного раствора муравьиной кислоты, (•) «небелковой матрицы», (А)микросом печени человека после ферментативного расщепления "пептид синтезированный с включением изотопно-меченого Ь.

Корреляции между концентрациями, рассчитанными методом внутреннего стандарта, и по калибровочным кривым с использованием для приготовления стандартов (■) 3% водного раствора муравьиной кислоты, (•) «небелковой матрицы», (А)микросом печени человека после ферментативного расщепления представлены на рис.3. Полученные значения коррелируют между собой для всех изотопно-меченых пептидов во всех исследованных пробах (коэффициент корреляции 0,98-0,99), однако, при использовании для приготовления калибровочных растворов 3% водного раствора муравьиной кислоты коэффициент наклона кривой составил 0,43, что говорит о сильном влиянии компонентов пробы на результат количественного определения. Напротив, коэффициенты полученные при использовании микросом печени человека и «небелковой матрицы» для приготовления калибровочных стандартов составляют 0,89 и 0,86, Следовательно, для приготовления стандартных растворов для которых изотопно-меченный стандарт не был синтезирован, использовали «небелковую матрицу».

2.4 Калибровочные кривые исследуемых пептидов. Динамический диапазон и чувствительность методики.

Для калибровки анализировали растворы пептидов в «небелковой матрице» с концентрациями от 0,1 до 2000 фмоль/мкл и строили калибровочные кривые зависимости площади пика наиболее интенсивного фрагмента от концентрации пептида, которые использовали для расчета концентраций пептидов и соответствующих белков в исследуемых пробах. Калибровочные кривые пептидов СТТУГТЗЬЗЗУШОБК (СУР2С29), МЗдЗРТОТЗК (СУР2С29), РШЬУРШ1РЯ (СУР2С39) и У(2ЕЕ1ЕНУЮК (2С50.54) приведены на рис. 4.

Рис. 4. Калибровочные кривые пептидов: ■- СГТУ1Т51,58УЬН08К(СУР2С29); А-М8<38ПШ8К (СУР2С29); • - НМ1ЛФШ1Р11 (СУР2С39); □- УС>ЕЕ1ЕНУЮК(СУР2С50,54).

2.5 Определение концентраций исследуемых изоформ цитохромов Р450 методом МИМ до после индукции фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ).

На основе разработанных МЯМ методов и построенных для каждого пептида калибровочных кривых были определены концентрации исследуемых изоформ цитохромов Р450 в пробах микросом печени мыши, приведенные в таблице 2. Как видно из таблицы, концентрации отдельных изоформ цитохромов Р450 в контрольной пробе составляют от 2 до 113 фмоль/мкг микросомального белка. Причем, наименьшую концентрацию имели СУР1А1, СУР1А2 и СУР2С39 (1,3, 1,8 и 3,1 фмоль/мкг микросомального белка), а наибольшую СУР2С29 и СУР2Е1 (113,7 и 38,1 фмоль/мкг микросомального белка).

Содержание остальных исследуемых изоформ колебалось в пределах 7-17 фмоль/мкг микросомального белка.

В таблице 2 также представлены результаты по изменению содержания основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши в результате индукции. Как видно из таблицы, наибольшее индуцирующее воздействие для подсемейства 1А цитохромов Р450 наблюдалось после введения метилхолантрена. Так, концентрация изоформы СУР1А1 возрастала в 4,3 раза, а изоформы СУР1А2 в 4,9 раз. Интересно также рассмотреть влияние фенобарбитала на подсемейство 2С цитохромов Р450. В то время как содержание СУР2С50,54 увеличивалось в 2 раза, а СУР2С29 в 1,7 раз, концентрация СУР2С39 практически не изменилась. К сожалению, не удалось выявить изоформспецифичных пептидов для подсемейства ЗА цитохромов Р450, поэтому можно судить только об суммарном индуцирующем влиянии фенобарбитала на белки этого подсемейства, увеличение содержания которого в результате индукции составляет 3,3 раза. Подсемейства 2Е и 2Э цитохромов Р450 не индуцируются фенобарбиталом и метилхолантреном.

Таблица 2. Концентрации исследованных цитохромов Р450 в контрольной пробе микросом и после индукции фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ)._

Изоформа Кол-во пептидов Контроль фмоль/мкг МХ фмоль/мкг МХ /контроль ФБ фмоль/мкг ФБ /контроль

1А1 2 1,3 ±0,13 5,6 ± 0,44 4,3 ± 0,41 0,9 ±0,1 0,7 ±0,12

1А2 2 1,8 ±0,23 7,1 ±0,51 4,9 ±0,51 2,1 ±0,24 1,2 ±0,17

2С29 2 113,8±10,7 33,8 ±3,1 0,33 ±0,07 185,1±16,0 1,7 ±0,16

2С39 1 3,1 ±0,36 2,1 ±0,25 0,7 ± 0,05 3,1 ±0,34 1,0 ±0,12

2С50,54 1 8,3 ± 0,72 5,9 ±0,41 0,7 ±0,10 16,6 ± 1,4 2,0 ±0,14

209 1 10,9 ± 1,1 6,4 ± 0,60 0,6 ± 0,07 8,8 ± 0,93 0,8 ± 0,09

2010 1 16,8 ± 1,55 9,9 ± 1,14 0,6 ± 0,07 14,8 ± 1,69 0,9 ±0,10

2Б26 1 7,9 ± 0,61 7,9 ± 0,8 1,0 ±0,09 9,5 ± 0,86 1,2 ±0,15

2Е1 2 38,8 ±4,51 33,2±3,98 0,9 ± 0,03 32,5± 3,81 0,9±0,04

ЗАИ,41 2 10,2 ± 1,01 4,4 ±0,51 0,5 ±0,12 41,9 ± 5,2 3,3 ± 0,35

ЗА11,16 1 7,0 ± 0,55 2,4 ±0,19 0,3±0,035 23,5 ± 2,69 3,3 ± 0,24

2.5. Оценка содержания цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши по данным общего протеомного профилирования.

Согласно исследованиям Копылова с соавт., для оценки содержания белка в пробе можно использовать суммарное значение интенсивности масс-спектрометрических сигналов трех пептидов, полученных в ходе общего протеомного профилировании (Копылов А.Т. с соавт., 2009, Биомедицинская химия, 2, 125-139). Несмотря на то, что каждый пептид характеризуется собственным коэффицентом зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации, суммарное значение от трех пептидов специфичных для белка, позволяет построить усредненную калибровочную зависимость для всех исследованных цитохромов Р450.

Рис. 5. График зависимости суммы площадей пиков трех наиболее интенсивных (и изоформспецифичных) пептидов исследованных цитохромов Р450 и концентрацией в пробах микросом печени мыши, полученной по результатам МРМ анализа.

Используя описанный выше подход, для построения зависимости интенсивности масс-спеетрометрического сигнала от концентрации выбирали три наиболее интенсивных протеотипических пептида изоформ 1 AI, 1А2, 2С29, 2С39, 2С50,54, 2D9, 2D10, 2D26, 2Е1, 3AI 1,41, 3AI 1,16 цитохромов Р450. Площади 3-х экстрагированных хроматографических пиков пептидов суммировали для каждой исследованной изоформы. Для оценки точности определения концентраций строили зависимость между концентрацией цитохромов Р450 измеренных с использованием МРМ и суммой площадей пиков трех наиболее интенсивных (и изоформспецифичных) пептидов соответствующих цитохромов Р450 (Рис. 5). Как видно из представленных на рисунке 5 данных, суммарная площадь пептидов проявляет линейную зависимость от концентрации белка в пробах. При этом, коэффициент линейной корреляции составляет 0,69. Полученные результаты дают возможность использовать полученное уравнение линейной регрессии для полуколичественной оценки содержания других белков, идентифицированных в ходе протеомных экспериментов и белков монооксигеназной системы, в частности.

Так, для изоформ 4А14, 4А12А, 2А4.5, 2В10, 2В9,19, 2F2, 2А12, 2J5 цитохромов Р450, цитохрома Ь5 и NADPH -цитохром-Р450-редуктазы было выбрано по три наиболее интенсивных изоформспецифичных пептида. Далее, хроматограммы пептидов были экстрагированы из общего профиля микросом, полученного на QTOF, по точной массе родительского иона. Исходя из суммы площадей пептидов и полученного уравнения линейной регрессии можно оценить концентрации данных белков в микросомах печени

мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном без использования стандартов.

Концентрации цитохромов Р450, рассчитанные по результатам общего протеомного профилирования без использования стандартных образцов приведены в таблице 3. Данные получены на основании одного проведенного протеомного профилирования, поэтому трудно оценить ошибку значения концентрации. Кроме того, калибровочные коэффициенты для разных пептидов зависят от их степени ионизации и могут различаться до 10 раз, поэтому коэффициент корреляции полученной общей калибровочной кривой составляет 0,69. Поэтому проведенные в таблице 3 концентрации могут использоваться для оценки концентрации белка в пробе и (более точно) для сравнения количества данного белка в разных пробах. Однако, рассчитанные данным методом концентрации подсемейств 2В, 4А и 2F цитохромов Р450совпадают с приведенными в работе Jerkins с соавт. (Jerkins R. etal, 2006,Proteomics, 6, 1934-1947).

Таблица 3. Концентрации белков монооксигеназной системы, рассчитанные по результатам

общего протеомного профилирования без использования стандартных образцов.

Контроль, фмоль/мкг микросомального белка MX, фмоль/мкг микросомального белка ФБ, фмоль/мкг микросомального белка

NADPH -цитохром-Р450-редуктаза 24 24 44

4А14 12 5 2

4А12А 23 15 9

2А4,5 7 14 26

2В10 9 9 92

2В9Д9 31 29 96

2F2 24 21 20

Цитохром Ь5 266 264 324

2А12 18 18 17

2J5 7 3 2

Как видно из таблицы, рассчитанная концентрация ИАОРН -цитохром-Р450-редуктазы в контрольной пробе составляет 24 фмоль/мкг микросомального белка, причем индукция фенобарбиталом приводит к увеличению концентрации в 1,8 раз, а после введения метилхолантрена она остается неизменной. Индукция фенобарбиталом приводит также к увеличению концентрации СУР2В10 в 10 раз (в контроле 9 фмоль/мкг микросомального белка), СУР2В9Д9 в 3 раза (в контроле 31 фмоль/мкг микросомального белка) и СУР2Д4,5 в 3,7 раз (в контроле 7 фмоль/мкг микросомального белка).

Концентрация цитохрома bs в контрольной пробе составляет 266 фмоль/мкг микросомального белка, причем она лишь незначительно изменяется при индукции фенобарбиталом и практически не изменяется после введение метилхолантрена (324 и 264 фмоль/мкг микросомального белка). Также, по сравнению с контролем не индуцируются CYP4A14, CYP4A12A, CYP2F2, CYP2A12, CYP2J5.

Использованный подход оценки концентрации применим для всех белков, обнаруживаемых при совместном протеомном анализе с цитохромами Р450, концентрации которых точно измерены методом MRM. При этом необходимым условием является использование не менее трех уникальных пептидов белка для количественного расчета суммарной интенсивности.

3. Масс-спектрометрическое определение активности цитохромов Р450.

Активность цитохромов Р450 оценивали по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом, при этом скорость рассчитывали как количество образующегося метаболита в единицу времени на мг микросомального белка (пмоль/мин на мг микросомального белка). Согласно литературным данным, фенобарбитал и метилхолантрен являются индукторами цитохромов Р450, причем метилхолантрен воздействует в основном на подсемейство 1А, а фенобарбитал на 2В и ЗА. Увеличение содержания цитохромов Р450 должно сопровождаться увеличением скорости образования соответствующего метаболита при взаимодействии с изоформоспецифичными субстратами. Для этого были исследованы микросомы печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном. В качестве изоформспецифичных субстратов были использованы фенацетин, как субстрат цитохромов Р450 подсемейства 1А (метаболит - ацетаминофен), тестострон (ЗА, бр-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (2Е, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (2С, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (2D, 4-гидроксидебризохин). (Walsky R. et al, 2004, Drug Metab. Dispos.,32(6), 23-29; Di L. et al, 2007, Intern. J. Pharm., 335, 1-11).

Необходимо отметить, что при микросомальном окислении тестостерона помимо 6ß-гидрокситестостерона образуются также 16а- гидрокситестостерон, 16ß-гидрокситестостерон, 2р-гидрокситестостерон и 2а- гидрокситестостерон. При этом наиболее показательным для определения активности изоформы CYP3A4 является 6ß-гидрокситестостерон (Wang D. et al, 2007, J. Chr. В, 855, 290 - 294). Так как данные соединения являются изомерами и имеют одинаковый спектр фрагментации, а следовательно и MRM переходы, пик бр-гидрокситестостерона был идентифицировали по совпадению времени удерживания со временем стандарта.

Кроме ситуации с бр-гидрокситестостероном, при разработке хроматографического метода нет необходимости достижения полного разделения между аналитами, вследствие высокой селективности МЯМ метода, однако совместное элюирование субстрата и метаболита может привести к супрессии сигнала метаболита вследствие высокой остаточной концентрации субстрата, что учитывали при разработке условий хроматографического разделения (градиента ацетонитрила).

При построении калибровочных кривых для каждого из метаболитов учитывали влияние микросомального белка на степень экстракции соединения из смеси и интенсивность сигнала. Для этого калибровочные образцы готовили аналогично исследуемым пробам, это позволило минимизировать влияние эффектов матрицы на точность определения концентрации метаболита. Калибровочные кривые проявляли линейную зависимость с коэффициентами корреляции более 0.997 в диапазоне концентраций, обнаруживаемых в реальных пробах (до 10 мкМ). Нижний предел количественного определения составляет для ацетаминофена - 5 нМ, бр-гидрокситестостерона - 10 нМ , 4-гидроксидиклофенака - 5 нМ, 4-гидроксидебризохина - 5 нМ, 6-гидроксихлорзоксазона - 5 нМ. Таблица 4. Результаты определения активностей исследуемых цитохромов Р450 в контрольных и

индуцированных фенобарбиталом (ФБ) и метилхолантреном (МХ) микросомах печени мыши.

Маркерный субстрат Контроль, пмоль/мин/мг микросомального белка ФБ, пмоль/мин/мг микросомального белка ФБ, /контроль МХ, пмоль/мин/мг микросомального белка МХ, /контроль

Тестостерон (ЗА) 1135 ± 9,15 2749 ± 27,3 2,42 ±0,44 736± 8,7 0,64±0,13

Дебризохин (2Э) 118,6 ±8,2 121,0 ±7,4 1,0± 0,26 101,3 ±1,8 0,85±0,15

Диклофенак (2С) 687 ± 3,7 2811 ±42,4 4,1± 0,4 728 ± 8,4 1,1± 0,5

Фенацетин (1А) 404,4 ±16,9 395,3 ±68,5 0,98±0,21 1038,1± 115,4 2,6±0,39

Хлорзоксазон (2Е) 980 ±4,3 1040± 130,1 1,1±0,3 964 ±154,0 0,98± 0,2

Активности цитохромов Р450 определенные по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом приведены в таблице 4. Согласно полученным результатам индукция метилхолантреном приводит к увеличению скорости ферментативной реакции с фенацетином (маркерный субстрат подсемейства 1А цитохромов Р450) в 2,57 раза, а индукция фенобарбиталом увеличивает активность по отношению к тестостерону (маркерный субстрат подсемейства ЗА цитохромов Р450) 2,42 раза, а по отношению в диклофенаку (маркерный субстрат подсемейства 2С цитохромов Р450) в 4,1 раз.

4. Сопоставление изменения активности и количества изоформ 1А, 2Е, 2С и ЗА цитохромов Р450 в контрольных пробах и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

Исходя из анализа полученных результатов, представленных в таблицах 2 и 4 можно сделать вывод, что изменения активности и концентрации цитохромов Р450 вследствие индукции, в основном, коррелируют между собой, что отражено на рис.6.

6

СУР1А I

¡2 е ? 14 т 1 ■ Активность

и а Е х (фенацетин)

■и 3 5 8 т 1А1

§ § 2 | |

к и 11' О ■ 1 0 1А2

ФЕН МТХ

СУР2С

мтх

■ Активность (днклофешк)

■ 2С29

□ 2С39

□ 2С50.54

СУРЗА

■ Активность (тестостерон)

■ ЗА11,1б

□ ЗАП.41

ФЕН

МТХ

CYP2D

■ Активность (дебризохин)

■ 2D9

□ 2D10

□ 2D26

■ Активность (хлорзоксазон) I2E1

Рис. 6. Изменение концентрации и активности исследуемых изоформ цитохромов Р450 по отношению к маркерным субстратам при индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Так, наибольшее увеличение концентрации и активности наблюдается для подсемейства 1А цитохромов Р450 при индукции метилхолантреном. При этом скорость ферментативной реакции возрастает 2,57 раз, а концентрации изоформ CYP1A1 и CYP1A2 в 4,3 и 4,9 раз соответственно. Подобные изменения наблюдаются при индукции подсемейства ЗА цитохромов Р450 фенобарбиталом, где увлечение концентрации в 3,3 раза для изоформ CYP3A11,16,41 сопровождаются увеличением скорости ферментативной реакции в 2,4 раза. Методом хромато-масс-спектрометрии измеряется сумма как каталитически активной формы белка (голофермента), так и апофермента, в то время как увеличение скорости ферментативной реакции является показателем изменения только голофермента. В индуцированных пробах соотношение между активной и неактивной формой цитохрома Р450 может отличаться от контрольной, так как часть дополнительно синтезированного фермента может находится в виде апофермента (Wang D. et al, 2007, J. Chr. В, 855, 290 - 294, Yu A.M. et al, 2009, DrugMetab. Dispos., 37(1), 170-177).

Индукция фенобарбиталом приводила к увеличению скорости ферментативной реакции с диклофенаком в 4,1 раза, что можно объяснить суммарным эффектом повышения концентрации CYP2C29 (в 1,7 раз) и CYP2C50,54 (в 2 раза), а также влиянием CYP2C37,38,55,70, для которых не удалось обнаружить изоформспецифичных пептидов, удовлетворяющих условиям количественного анализа. Активности цитохромов Р450 относящиеся к подсемействам 2D и 2Е не изменяются после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном, что коррелирует с отсутствием увеличения концентраций данных белков.

Подобные результаты были получены Williamson с соавт. (Williamson В. et al, 2011, Proteomics, 11, 33 - 41), которые провели относительный количественный анализ CYP1A2, 2В6, ЗА4 и ЗА5 в культуре гепатоцитов человека после индукции метилхолантреном, рифампицином и фенобарбиталом по сравнению с контрольной группой. Наиболее сильная индукция была отмечена для изоформы CYP1A2 при обработке культуры гепатоцитов метилхолантреном, по активности белка увеличение составило 60 раз и по масс-спектрометрическому количественному анализу наблюдали увеличение содержания в 45 раз. Концентрация CYP3A4 после индукции фенобарбиталом по масс-спектрометрическим данным увеличивалась в 16 раз, а активности фермента в 23 раза.

Также в статье Wang с соавт. (Wang М. et al, 2008, Proteomics, 8, 4186-4196) проведено определение концентраций CYP3A4 и CYP3A5 в микросомах печени человека масс-спектрометрически, методом Вестерн блот и активности ферментов по отношению к тестостерону (подсемейство ЗА цитохромов Р450), мидазоламу (подсемейство ЗА цитохромов Р450), интроконазолу (CYP3A4) и винкристину (CYP3A5) в образцах микросом печени человека. Авторами обнаружено, что значения скорости гидроксилирования интроконазола, которое осуществляется главным образом CYP3A5, имели коэффициент корреляции 0,97 с концентрацией фермента, определенной масс-спектрометрически. При этом масс-спектрометрические концентрации и активности коррелировали между собой (коэффициент корреляции более 0,8) у всех исследованных ферментов, а значения, полученные с использованием иммуноферментных методов, не всегда соответствовали активности и масс-спектрометрическим данным, причиной этого, по мнению авторов, является качество используемых антител.

В таблице 5 приведены активности подсемейств цитохромов Р450 в пересчете на сумму молярных концентраций входящих в него изоформ. Согласно полученным данным, после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном не происходит значительного увеличения

количества метаболита, производимого в минуту одной молекулой фермента, а следовательно, общее увеличение активности микросом в целом обусловлено увеличением концентрации специфических изоформ, а не изменением их ферментативной активности.

Таблица 5. Активности подсемейств цитохромов Р450 в пересчете на сумму молярных концентраций входящих в него изоформ._

Маркерный субстрат Контроль ФБ МХ

Тестостерон (ЗА), пмоль продукта/пмоль СУРЗА/мин 66,4 ± 6,3 42,5 ±5,6 109,1 ± 12,5

Дебризохин (2Э), пмоль продукта/пмоль СУР20/мин 3,4 ± 0,5 4,2 ± 0,5 3,7 ± 0,6

Диклофенак (2С), пмоль продукта/пмоль СУР2С/мин 5,5 ± 0,5 13,8 ± 1,4 17,5 ± 1,9

Фенацетин (1А), пмоль продукта/пмоль СУР 1 А/мин 131,2 ± 15,2 134,2 ± 36,4 82,5 ± 15

Хлорзоксазон (2Е), пмоль продукта/пмоль СУРЗА/мин 25,5 ±3,1 31,9 ±7,8 30,3 ± 8,3

выводы

1. В результате протеомного профилирования микросомальной фракции печени мышей идентифицировано около 3700 белков, из которых 32 относятся к суперсемейству цитохромов Р450 ( обнаружены изоформы 1А1, 1А2, 2А4, 2А5, 2А12, 2В9, 2В10, 2Е1, 2Р2, 2:5, 2.16, 4УЗ, 4А14, 4А10, 4А12А, 2Э9, 2010, 2Ш1, 2026, ЗА11, ЗА1Э, ЗА16, ЗА25, ЗА41, 2С29, 2С39, 2С38, 2С40, 2С54, 2С37, 2С55, 2С70 цитохромов Р450). Общее протеомное профилирование позволило оценить изменения концентраций цитохромов р450 в процессе индукции.

2. Создана методика количественного анализа изоформ 1А1,1А2, 2С29, 2С39, 2С50,54, ЗА11,16,41, 2Е1, 2Э9, 2010 и 2026 цитохромов Р450 в микросомах печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Корреляция результатов измерения концентраций Р450 с данными полученными с использованием изотопно-меченных пептидов составляет 0,97.

3. Разработана масс-спектрометрическая методика определения активности подсемейств 1А, 1А2, 2С, ЗА, 2Е1, 20 цитохромов Р450 по скорости ферментативной реакции с маркерным субстратом. В качестве изоформспецифичных субстратов использовали фенацетин для СУПА (метаболит -ацетаминофен), тестострон (СУРЗА, бр-гидрокситестостерон), хлорзоксазон (СУР2Е, 6-гидроксихлорзоксазон), диклофенак (СУР2С, 4-гидроксидиклофенак) и дебризохин (СУР20, 4-гидроксидебризохин).

4. Установлено, что содержание цитохромов Р450 в микросомальной фракции в контрольной пробе составляло от 1 до 113 фмоль/мкг микросомального белка. Индукция метилхолантреном приводит к увеличению содержания цитохромов Р450 подсемейства 1А 4,34 и 4,98 раза (для изоформ 1А1 и 1А2 соответственно), а индукция фенобарбиталом приводит к увеличению концентрации цитохромов Р450 подсемейств ЗА в 3,4 раза, 2С в 1,7 и 2 раза (для изоформ 2С29 и 2С50,54 соответственно) и 2В 10 и 3 раза (для изоформ 2В10 и 2В9,19 соответственно), при этом изменения концентраций коррелировали с изменениями активности.

Список опубликованных работ

1. Москалева Н.Е., Згода В.Г. Современные методы анализа цитохромов Р450 // Биомедицинская химия. 2012. N58(6). С. 617-634.

2. Воскресенская А.А., Медведева Н.В., Прозоровский В.Н., Москалева Н.Е., Ипатова О.М. Особенности всасывания глицирризиновой кислоты в составе лекарственного препарата "Фосфоглив"// Биомедицинская химия. 2012. N 58(5). С. 564-572.

2а. Voskresenskaya А.А., Medvedeva N.V., Prozorovskii V.N., Moskaleva N.E., Ipatova О.М. The absorption features of glycyrrhizic acid in the drug formulation Phosphogliv // Biochemistry (Moscow) Supplement. Series B: Biomedical Chemistry. 2011. N5(4). C. 381-386.

3. Grigoryev A., Savchuk S., Melnik A., Moskaleva N., Dzurko J., Ershov M., Nosyrev A., Vedenin A., Izotov В., Zabirova I., Rozhanets V. Chromatography-mass spectrometry studies on the metabolism of synthetic cannabinoids JWH-018 and JWH-073, psychoactive components of smoking mixtures// J. ofChrom. B. 2011. N879. C. 1126-1136.

4. Москалева H.E., Згода В.Г., Арчаков А. И. Масс-спектрометрическое определение содержания цитохромов Р450 и их ферментативной активности // Биоорганическая химия. 2011. N37(1). С. 1-16.

4а. Moskaleva N.E., Zgoda V.G., Archakov A.I. Mass-spectrometric determination of the quantity and enzyme activity of cytochromes P450 // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. 2011. N37(2). C. 131-145.

5. Писарев B.B, Москалева H.E, Зверков Ю.Б., Смирнова JI.B., Тисейко Н.И., В.Г. Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Определение эналаприла и эналаприлата в плазме крови методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием // Химико-фармацевтический журнал. 2005. N39(2). С. 49-52.

5а. Pisarev V.V., Moskaleva N.E., Zverkov Yu.B., Belolipetskaya V.G., Sukhanov Ya. V. HPLC/MS determination of enalapril and enalaprilat in the blood plasma // Pharmaceutical Chemistry Journal. 2005. N39(2). C.104-107.

6. Писарев B.B, Москалева H.E, Зверков Ю.Б., Смирнова Л.В., Белолипецкая В.Г., Суханов Я.В. Изучение сравнительной фармакокинетики препаратов азитромицина у здоровых добровольцев открытым рандомизированным перекрестным методом // Антибиотики и химиотерапия. 2003. N48(10). С. 7.

7. Zgoda V., Tikhonova O., Novikova S., Kurbatov L., Kopylov A., Moskaleva N., Archakov A. System analysis of human cell line: Transcriptome, proteome // Abstr. 8th International Conference «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12». 2012. Novosibirsk, Russia. P. 342.

8. Tichonova O.V., Zgoda V.G., Archakov A.I., Moskaleva N.E. Mass spectrometry based approach for the Cytochrome P-450'S concentration and activity determination.// Abstr. 8th International Conference «Bioinformatics of genome regulation and structure\systems biology BGRS\SB'12». 2012. Novosibirsk, Russia. P. 214.

9. Zgoda V., Moskaleva N. Mass Spectrometric Determination of the Concentration and Enzyme Activity of Cytochromes P450.// Abstr. HUPO 11th Annual World Congress. Boston, Massachusetts, USA. 2012. C. 269.

10. Воскресенская А. А., Прозоровский B.H., Медведева H.B., Москалева H.E. Мониторинг глицирризиновой кислоты методом хромата - масс - спектрометрии при пероральном приеме лекарственного препарата «Фосфоглив». // Материалы докладов V Конференции молодых ученых России с международным участием: «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, Россия. 2008. С. 96.

Заказ № 23-Р/09/2013 Подписано в печать 05.09.13 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-mail: info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Москалева, Наталья Евгеньевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича» Российской академии медицинских наук

Москалева Наталья Евгеньевна МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ И СОДЕРЖАНИЯ ЦИТОХРОМОВ Р450

03.01.04-биохимия Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Кандидат биологических наук Згода Виктор Гаврилович

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы. 10

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Методы анализа активности 14 и содержания цитохромов Р450

2.1 Методы анализа цитохромов Р450 в биологических 17 объектах.

2.1.1 Дифференциальная спектроскопия 17

2.1.2 Оценка уровня экспрессии цитохромов Р450 по количеству 17 соответствующей мРНК

2.1.3 Иммунологические методы анализа 18

2.2 Методы протеомного анализа цитохромов Р450 19

2.2.1 Методы предварительного разделения белков 19 суперсемейства Р450 в протеомике

2.2.2 Масс-спектрометрический анализ цитохромов Р450. 22

2.2.2.1 Идентификация цитохромов Р450 в биологических 23 объектах методами масс-спектрометрии.

2.2.2.2 Методы количественного масс-спектрометрического 24 анализа.

2.2.3 Особенности абсолютного количественного анализа 29 цитохромов Р450

2.2.3.1 Выбор масс-спектрометрического оборудования. 29

2.2.3.2 Получение стандартов для построения калибровочных 31 кривых

2.2.3.3 Относительное масс-спектрометрическое количественное 33 определение цитохромов Р450 без использования изотопной метки

2.2.3.4 Использование методов с введением изотопной метки для 36 масс-спектрометрического анализа цитохромов Р450

2.3 Фенотипирование как способ оценки функционального 42 состояния монооксигеназной системы

2.3.1 Методы, основанные на измерении радиоактивности. 42

2.3.2 Биолюминесцентные методы. 43

2.3.3 Электрохимические методы оценки актиности 44 цитохромов Р450

2.3.4 Флуоресцентный метод как один из наиболее 44 распространенных при оценке активности цитохромов Р450.

2.3.5 Методы, основанные на ВЭЖХ с ультрафиолетовым и 45 масс-спектрометрическим детектированием.

2.4 Сопоставление параметров активности цитохромов Р450 49 с количественным содержанием.

2.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 51

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 52

3.1 Качественный и количественный анализ цитохромов 52 Р450 в микросомах печени мыши

3.1.1 Подготовка проб микросом печени мыши к масс- 52 спектрометрическому анализу.

3.1.2. Проведение гидролитического ферментативного 52 расщепления белков микросомалъной фракции.

3.1.3 Приготовление "небелковой матрицы" для калибровочных 53 стандартов

3.1.4 Общее протеомное профилирование микросом печени мыши 53 для идентификации и выявления протеотипических пептидов цитохромов Р450 при помощи ионной ловушки и О-ТОЕ

3.1.5 Количественный анализ выбранных изоформ цитохромов 55 Р450 с использованием ()()£).

3.1.6 Синтез пептидов 58

3.1.7 Приготовление стандартов исследуемых пептидов 59 цитохромов Р450 и построение калибровочной кривой

3.1.8 Количественный анализ с использованием изотопно- 60

меченых пептидов в качестве внутреннего стандарта.

3.2 Определение активности цитохромов Р450 к маркерным 61 субстратам

3.2.1. Определение условий проведения ферментативной реакции. 61

3.2.2 Определение активности цитохромов Р450. 63

3.2.3 Приготовление стандартов для определения количества 63 образующегося метаболита.

3.2.4 Хромато-масс-спектрометрическое определение 64 концентрации образующихся метаболитов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ 66

4.1 Основные результаты работы 66

4.2. Идентификация и количественный масс- 69

спектрометрический анализ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

4.2.1 Идентификация изоформ цитохромов Р450 в микросомах 69 печени мыши контрольной группы (К) и после индукции фенобариталом (Ф) и метилхолантреном (М) при помощи ионной ловушки и ОТОР.

4.2.2 Выявление изменений концентрации цитохромов Р450 73 вследствие индукции по результатам общего протеомного анализа.

4.3 Разработка метода масс-спектрометрического 77

количественного анализа с использованием мониторинга

множественных реакций (MRM) и QQQ.

4.3.1 Выбор пептидов для целевого количественного анализа 77 методом MRM.

4.3.2 Выбор родительского иона и оптимизация фрагментора 81 для количественного анализа протеотипических пептидов выбранных белков при помощи масс-спектрометра с тройным квадруполем.

4.3.3 Фрагментация пептидов в ячейке соударений. Выбор 87 дочерних ионов и напряжения фрагментации.

4.3.4 Оптимизация условий хроматографическогоразделения 102 компонентов пробы перед масс-спектрометрическим анализом.

4.3.5 Исследование влияния матрицы на результат 103 количественного определения.

4.3.6 Калибровочные кривые исследуемых пептидов. 105 Динамический диапазон и чувствительность методики.

4.3.7 Определение концентраций исследуемых изоформ 108 цитохромов Р450 методом MRM до и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

4.3.8 Оценка содержания цитохромов Р450 в микросомальной 111

фракции печени мыши по данным общего протеомного профилирования.

4.4 Определение активности изоформ цитохромов CYP450 к 115 маркерным субстратам

4.4.1 Маркерные субстраты 115

4.4.2 Разработка методики масс-спектрометрического 117 определения активности цитохромов Р450.

4.4.2.1 Хромато-масс-спектрометрический анализ концентрации 117 метаболитов в инкубационной среде.

4.4.2.2 Условия проведения ферментативной реакции. 124

4.4.2.3 Определение активности цитохромов Р450. 130

4.5 Сопоставление параметров изменения активности и 131 количества изоформ цитохромов 1А, 2Е, 2С и ЗА в контрольных пробах и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 135

5.1 Введение. Актуальность развития масс-спектрометрических 135 методов исследования цитохромов Р450.

5.2 Особенности разработки методики изоформ-специфичного 138 хромато-масс-спектрометрического количественного анализа цитохромов Р450

5.3 Результаты определения концентрации и активности 142 цитохромов Р450 в микросомах печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном.

6 Выводы 145

7 Список цитируемой литературы 147

8 Приложение 164

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

MALDI-TOF/MS Матрично-активированная лазерная

десорбция/ионизация с времяпролетным масс-спектрометрическим детектированием мРНК Матричная рибонуклеиновая кислота

1-DE Одномерный электрофорез

2-DE Двумерный электрофорез

RPLC-ESI-MS/MS Обращенно-фазовой хроматографии с масс-

спектрометрическим детектированием и электроспрейной ионизацией

IT Ion-trap, масс-спектрометр на основе ионной

ловушки

QTOF Квадруполь-времяпролетный масс-спектрометр

QQQ Масс-спектрометр на основе тройного квадруполя

MRM Мониторинг множественных реакций

р-СРВ 2-бромо-4(-хлорацетофеноном)

р-ВРВ 2-бромо-4(-бромацетофеноном)

ТСРОВОР 1,4-бис-[2-(3,5-дихлоропиридилокси)] бензолом

ЭДТА Этилендиаминтетрауксусная

ВЭЖХ Высокоэффективная жидкостная хроматография

УФ Ультрафиолетовый детектор

Tris-HCl N-гидроксиметиламинометана гидрохлорид

ДТТ 1,4-дитиотриэтол

ТСЕР трис-(2-карбоксиэтил) - фосфин

NADPH Никотинамидадениндинуклеотидфосфат

LOD предел детектирования

1. ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Ключевая роль первой фазы метаболизма

ксенобиотиков принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450, которые представляют собой гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной системы. Активность монооксигеназной системы в направлении того или иного ксенобиотика определяется главным образом концентрацией и активностью специфичных для него изоформ цитохромов Р450. Поэтому для создания моделей лекарственного воздействия необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов изменения концентраций данных ферментов при воздействии различных факторов и определения взаимосвязей между концентрацией цитохромов Р450 и их активностью.

Мыши являются наиболее распространенными объектами для исследования монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов Р450, позволяя предсказать биотрансформацию лекарственных препаратов у человека.

Развитие персонализированной медицины требует создания новых методов оценки концетраций и активностей цитохромов Р450 и их изменений в процессе индукции или ингибирования лекарственными препаратами. Исследование активности и количественных характеристик цитохромов Р450 представляет собой трудную задачу. Факторами, усложняющими разработку методики масс-спектрометрического анализа применительно к цитохромам Р450, являются высокая гомология между белками в одном семействе, а зачастую и между семействами, что приводит к тому, что большая часть пептидов отражают присутствие различных изоформ. Кроме того, цитохромы Р450 являются

гидрофобными мембранными белками, которые трудно поддаются анализу. Исследования активности цитохромов Р450 ограничиваются трудностями подбора изоформспецифичных субстратов, ферментативную реакцию с которыми катализировала бы только одна изоформа, а также необходимостью разработки методики количественного анализа метаболитов с высокой чувствительностью и минимальным количеством требуемого биологического материала.

Цель исследования: разработка метода определения активности и концентрации основных изоформ цитохромов Р450 печени мыши с использованием масс-спектрометрии и валидация методики на пробах микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Основные задачи исследования:

1. Исследовать цитохромы Р450 микросомальной фракции печени контрольных мышей и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном методом общего протеомного профилирования.

2. Создать хромато-масс-спектрометрический метод мониторинга множественных реакций для определения концентраций фармакологически значимых изоформ подсемейств 1А, 2С, 2Б, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

3. Разработать хромато-масс-спектрометрическую методику определения активности фармакологически значимых подсемейств 1А, 2С, 2В, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши.

4. Апробировать и валидировать разработанные методики на примере микросомальной фракции печени мышей контрольной группы и после индукции фенобарбиталом или метилхолантреном.

Сопоставить изменения активности и концентрации исследуемых цитохромов Р450 вследствие индукции.

Научная новизна работы. Впервые разработан изоформспецифичный метод количественного анализа цитохромов Р450 печени мыши при помощи хромато-масс-спектрометра с тройным квадруполем в режиме мониторинга множественных реакций без использования изотопных меток. Метод требует минимального количества биологического материала, чувствительность составляет до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка, воспроизводимость результатов более 80%. Впервые исследованы диапазоны вариации концентраций и активности цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши контрольной группы и после индукции фенобарбиталом и метилхолантреном, приведена активность в пересчете на молекулу фермента, а также показано, что изменение активности и концентрационных характеристик коррелирует между собой, что подтверждает правильность разработанных методов.

Практическая значимость работы. Разработанный метод позволяет проводить измерение концентрации и активности цитохромов Р450 печени мыши в биологическом материале с чувствительностью до 0,1 фмоль/мкг микросомального белка и воспроизводимостью результатов более 80% без использования изотопных меток. Оценка воздействия различных факторов на цитохромы Р450 необходима при использования мыши как биологической модели при разработке лекарственных препаратов, а также для создания моделей лекарственного воздействия. Описанная концепция и этапы разработки МЯМ метода применимы для разработки методик анализа цитохромов Р450 монооксигеназной системы человека, что требуется для развития персонализированной медицины.

Положения, выносимые на защиту.

Протеомное профилирование микросомальной фракции печени мыши для идентификации и оценки количественных характеристик цитохромов Р450.

Разработка методики количественного анализа изоформ цитохромов Р450 в микросомах печени мыши без использования изотопных меток с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, а также методики определения активности подсемейств 1А, 2С, 2В, 2Е и ЗА цитохромов Р450 печени мыши методом мониторинга множественных реакций на масс-спектрометре с тройным квадруполем.

Определение содержания основных изоформ цитохромов Р450 в микросомальной фракции печени мыши, а также их вариабельности в процессе индукции.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Методы анализа активности и содержания цитохромов Р450.

В настоящее время особую актуальность приобретают вопросы оптимизации и персонализации фармакотерапии. Известно, что различия в скорости метаболизма лекарственных средств у разных людей часто оказываются причиной неадекватного фармакологического ответа на введение лекарств, поэтому развитие персонализированной медицины невозможно без изучения метаболизма лекарственных препаратов и ответной реакции организма на препарат [1].

Ключевая роль в метаболизме ксенобиотиков принадлежит ферментам суперсемейства цитохромов Р450 [2], которые представляют собой гем-содержащие монооксигеназы и входят в состав микросомальной монооксигеназной системы. Система локализована на мембранах эндоплазматического ретикулума и включает, кроме цитохрома Р450, КАЛРН -цитохром-Р450-редуктазу и цитохром Ь5 [2].

Цитохромы Р450 широко распостранены в природе и обнаружены во всех аэробных организмах. В натоящее время получены геномные последовательности для более чем 12400 цитохромов Р450, представляющих десятки и сотни семейств и подсемейств, соответственно [3]. Изоферменты цитохрома Р450 - представители разных семейств и подсемейств -отличаются субстратной специфичностью и регуляторами активности (ингибиторами и индукторами), однако, некоторые из них могут иметь перекрестную субстратную специфичность, одинаковые ингибиторы и индукторы. В настоящее время у человека идентифицировано 58 форм цитохрома Р450, 12 из которых участвуют в метаболизме ксенобиотиков [4]. Причем в метаболизме лекарственных средств, в основном, принимают участие изоферменты семейств I, II и III; в частности, изоферменты СУРЗА4, СУР1А2, СУР2С9, СУР2С19,

СУР206, СУР2Е1 катализируют около 90% реакций биотрансформации лекарственных соединений [4].

Активность монооксигеназной системы в отношении того или иного лекарственного препарата определяется главным образом концентрацией и функциональной способностью, то есть активностью специфичных для него изоформ цитохрома Р450. Другие компоненты монооксигеназной системы КАБРН-зависимая редуктаза и цитохром Ь5, как правило, не являются лимитирующими факторами в монооксигеназных реакциях [2]. Поэтому, индивидуальные особенности метаболизма лекарственных соединений, определяются персональным профилем - концентрацией и активностью цитохромов Р450 [1].

Химические соединения, особенно лекарственные средства, могут влиять на содержание и активность цитохромов Р450, как повышая функциональную способность (индукция), так и снижая ее (ингибирование). Свойства индукторов или ингибиторов ферментов могут проявлять не только лекарственные средства, но и компоненты пищи, загрязнители воздуха и воды, соединения, содержащиеся в табачном дыме, алкоголь [1, 4]. Кроме того, изучение межлекарственных взаимодействий на уровне изменения активности монооксигеназной системы имеет важное значение при разработке новых лекарственных препаратов.

Развитие фармакотерапии и ее персонализация требует создания моделей для изучения воздействия лекарственных препаратов и ответной реакции организма. Для создания таких моделей необходимо проведение селективного изоформспецифичного количественного анализа цитохромов Р450 в биологических объектах для выявления диапазонов вариаций концентраций ферментов в норме и при воздействии различных факторов и установления взаимосвязей между содержанием цитохромов Р450 и их активностью.

Животные являются наиболее распространенными объектами для исследования монооксигеназной системы, так как они обеспечивают целостную, физиологически адекватную модель для изучения влияния различных факторов на активность цитохромов Р450. Более того, животные обеспечивают экспрессию системы метаболизма лекарств в целом, и, потенциально, всех метаболизирующих ферментов. Таким образом, одна полная интегрированная модель может быть использована изучения всех аспектов in vivo метаболизма лекарств [5]. Мыши являются одни