Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Окислительная модификация гема и апофермента цитохрома Р450 2В4 в процессе его самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительная модификация гема и апофермента цитохрома Р450 2В4 в процессе его самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе"

российская академия медицинских наук научно-исследовательский институт биомедицинской химии

РГи С.'

ЗГОДА Виктор Гаврилович "Окислительная модификация гема иапофермента

цргтохрома Р450 2В4 в процессе его самоинактивации в монооксигеназной реконструированной системе"

(специальность 03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи УДК 612.015.1:577.152.162].08

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в НИИ биомедицинской химии Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: академик РАМН, профессор Кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты: член — корреспондент РАМН, профессор

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: защита диссертации состоится

Арчаков А. И. Карузина И. И

Егоров А.М.

Прозоровский В.Н. НИИ питания РАМН

1995 года в

__часов на заседании специализированного Ученого Совета

Д 001. 10. 01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ био — медицинской химии РАМН

Автореферат разослан "__________" 1995 г.

Ученый секретарь

специализированнного Ученого Совета, кандидат биологических наук

Былинкина В.С.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Одним из основных направлений исследований в биохимии является изучение процессов метаболизма белков в организме. И если в вопросах синтеза белков мы обладаем значительным объемом информации, то другая сторона проблемы — катаболизм белков — остается пока недостаточно изученной. Среди многочисленных проблем деградации белков в клетке вопросы распознавания поврежденных белков эндогенными протеазами остаются на настоящий момент практически невыяснеными. Существует ряд данных, указывающих на то, что самоинактивация ферментов в ходе катализа и изменения в структуре белка, которыми она сопровождается, могут быть начальной стадией универсального механизма деградации белков в организме1.

Одним из белков, способных инактивироваться в ходе катализа, является цитохром Р4502.

Микросомальная монооксигеназная система, локализованная в эндоплазматической сети клеток печени, выполняет в организме важную функцию по окислительной модификации неполярных физиологически активных веществ, как поступающих в организм извне — ксенобиотиков, так и образующихся в клетке: холестерин, стероидные гормоны, жирные кислоты, простагландины и т.д.3 В процессе некоторых из этих реакций цитохром Р450 может самоинактивироваться как реакционно—способными метаболитами субстратов, так и продуктами неполного восстановления кислорода (02-, Н202, ОН), которые, как правило, появляются в результате разобщения основного каталитического цикла цитохрома Р4504.

Механизм инактивации цитохрома Р450 активными интермеди— тами, которые образуются в реакциях окисления суицидных субстра —

• Oliver C. N. et al., in: Cellular Regulation and Malignant Growth, Tokio, Japan Sei. Soc. Press, 1985, pp. 320- 331.

2 Karuzina 1. I., Archakov A. I., Free Rad. Biol. & Med., 1994. v. 17. pp. 557 - 567.

3 Archakov A, et al., Cytochrome P450 biochemistry and biophysics Moscow: 1NCO—TNC, Joint Stock Company. 1992, pp. 673 - 679.

4 Archakov A.. Zhukov A., Drug metabolism—from molecules to man, London: Taylor & Francis. 1987. P. 473-476.

тов, исследован в достаточной мере подробно. В его основе лежит модификация гема, реже апофермента5.

Второй путь, являющийся следствием разобщенности моно — оксигеназных реакций, исследован в гораздо меньшей степени. Цитохромы Р450 микросом печени, в отличие от бактериальных цитохромов Р450, не окисляют ни один из известных субстратов с полным сопряжением и часть редокс эквивалентов расходуется в побочных оксидазных реакциях. Продукты неполного восстановления кислорода, которые, как правило, появляются при распаде окси— и пероксикомплексов цитохрома Р450 в результате разобщения монооксигеназного цикла, могут быть вовлечены в инактивацию цитохрома Р4506.

Окислительная модификация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях может быть начальной стадией в процессе его распада, и выяснение молекулярных механизмов этой реакции открывает новые возможности для понимания путей обновления белков в клетке.

Цель и задачи исследования:

В настоящей работе исследовалась инактивация изолированного цитохрома Р450 2В4 в монооксигеназной реконструированной системе в процессе окисления бензфетамина с целью выявления изменений в структуре гемопротеина под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре фермента.

Исходя из основной цели исследования,были поставлены следующие задачи:

1. Провести исследования инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназной реконструированной системе при различном соотношении Р450 2В4 и НАДФН — зависимого флавопротеина.

2. Исследовать влияние каталазы и цитохрома Ь5 на скорость инактивации цитохрома Р450 и накопление продуктов реакции.

3. Исследовать причины обесцвечивания цитохрома Р450 в процессе его инактивации, провести исследование механизма модификации гема цитохрома Р450.

4. Исследовать возможность модификации апофермента цитохрома Р450 в процессе окислительной самоинактивации гемопротеина.

Ortiz de Montellano P., Stearns R.A, Drug. Metab. Rev., 1989, v. 20, pp. 183- 191.

Karuzina I. I., Archakov A. I., Free Rad. Biol. & Mcd., 1994, v. 16, pp. 73-97.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В результате проделанной работы удалось показать, что изолированный цитохром Р450, функционирующий в монооксигеназной реконструированной системе, инактивируется Н202, которая образуется в активном центре цитохрома Р450 прямым путем при распаде пероксикомплекса. Окислительная самоинактивация цитохрома Р450 в монооксигеназных реакциях сопровождается потерей гема с последующим его разрушением под действием Н202, накопленной в инкубационной среде. Наряду с деградацией гема в процессе окисли — тельной инактивации цитохрома Р450 была обнаружена модификация апофермента, которая сопровождалась агрегацией и полимеризацией гемопротеина. Также было показано, что в процессе инактивации Р450 происходит модификация первичной структуры белка. Выяснение молекулярных механизмов окислительной модификации цитохрома Р450 в процессе катализа открывает новые возможности для понимания путей обновления белков в клетке и возникновения ряда патологических состояний в организме.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8 —ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, Лиссабон, 1993), на 10-ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994) и на 9 —ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Швейцария, Цюрих, 1995). Апробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы и 18 рисунков, и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты собственных исследований", "Обсуждение полученных результатов", "Выводы", "Список литературы".

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Высокоочищенный препарат цитохрома Р450 2В4 получали по методу Карузиной и соавт.7 с некоторыми модификациями аффинной хроматографии, предложенной Imai и Sato8.

НАДФН —цитохром Р450 редуктазу выделяли по методу Yasukuchi и Masters9.

Мономеризацию цитохрома Р450 2В4 и НАДФН — цитохром Р450 редуктазы проводили по методу Бачмановой и соавт10.

Концентрацию цитохромов Р450 и Ь5 измеряли на спектрофотометре "Hewlett Packard" 8451А (США) по дифференциальному спектру поглощения его восстановленного СО—комплекса при длинах волн 450

и 490 нм п. При расчетах использовали коэффициенты молярной

— i — i

экстинкции 91 и 165 мМ см , соответственно.

Содержание свободного гема определяли пиридингемохромоге — новым методом 11.

Содержание гема, связанного с цитохромом Р450, измеряли методом гель—проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке BioSil Sec250 фирмы "BioRad", США Содержание гема в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с проточной кюветой фирмы Waters при 418 нм.

Содержание белка измеряли по методу Lowry и соавт.12, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Содержание свободных аминогрупп измеряли в процессе проведения гель—фильтрации методом постколоночной модификации с ортофталевым альдегидом (реактив "Fluor" фирмы "Beckman"). Смешивание буфера (100 мкМ К —фосфатным буфером (рН 7.4) с эмульгеном 913) и ортофталиевого альдегида происходило в постколоночном реакторе (диаметр 0.14 мм, общий объем 0.3 мл) в соотношении 5:1, соответственно. Через 30 сек после смешивания

7 Карузина И., и др., Биохимия, 1979, т. 44, с. 1049-1057.

8 Imai Y., Sato R„ BBRC, 1974, v. 60, pp. 8-14.

9 Yasukuchi Y., Masters В., J. Biol. Chem., 1976. v. 251, pp 5337-5344.

10 Bachmanova G. et al., BBRC, 1986, v. 139. P. 883 -888.

11 Omura T., Sato R„ J. Biol. Chem., 1.964, v. 239, pp. 2379 - 2385.

12 Lowry O., et al., J. Biol. Chem., 1951, v. 193. P. 265 - 275.

флуоресценцию регистрировали на флюориметре "Шимадзу" (Япония) с проточной кюветой при длине волны возбуждения 340 нм и испускания 455 нм.

Гель—проникающую высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили в нативных и денатурирующих условиях:

а) В нативных условиях гель — проникающую хроматографию проводили на колонке BioSil Sec250 фирмы "BioRad", США (диапазон фракционирования 300—1 кДа). Содержание белка в элюате регистрировали методом иостколоночной модификации с ортофталевым альдегидом, с последующим измерением флюоресценции (см. измерение NH2 — групп).

б) В случае определения молекулярной массы в денатурирующих условиях гель — проникающую хроматографию проводили на колонке TSK4000 фирмы "LKB", Швеция (диапазон фракционирования в присутствии 0.1% SDS 450 — 5 кДа). Содержание белка в элюате регистрировали с помощью спектрофотометра с проточной кюветой в диапазоне длин волн 210 — 280 нм.

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в присутствии SDS по методу Laemmli 13.

Образование карбонильных групп регистрировали по методу Levine и Federici14.

Определение содержания SH —групп проводили с использованием пиренмалеимида в качестве флюоресцирующей метки с последующим применением метода пептидного картирования ,5.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Инактивация цитохрома Р450 2В4 в монооксигеназной

реконструированной системе.

С целью выяснения структурных изменений в молекуле цитохрома Р450 2В4 в процессе катализа исследовалась самоинактивация гемопротеина в монооксигеназной реконструированной системе (MPC), состоящей из мономеров цитохрома Р450 2В4 и NADPH —

13 Laemmli U., Nature, 1970, v. 227, pp. 680 - 685.

4 Levine R., Federici M., S/ochem., 1982, v. 21, pp. 2600 - 2606.

15 Weltman J., et al., J. В/о/. Chcm.. 1973, v. 248, pp. 3173-3177.

специфичного флавопротеина в присутствии детергента эмульгена 913. Как видно из данных, приведенных на рис. 1, скорость инактивации цитохрома Р450 2В4 в монооксигеназной реконструированной системе зависит от соотношения белков — переносчиков. Цитохром Р450 инактивировался с более высокой скоростью в системе, где соотношение гемопротеина и флавопротеина было равно 1:1. В этом случае уже после 20 —ти минут инкубации при 30°С цитохром Р450 инактивировался на 70%.

Уменьшение концентрации '-НАДФН — зависимого флавопротеина в 20 раз, при которой соотношение белков — переносчиков становилось приблизительно таким же, как в микросомальной мембране, приводило к замедлению инактивации фермента. В этом случае содержание цитохрома Р450 снижалось на 85% лишь через 8 часов после начала реакции. Содержание цитохрома Р450 в отсутствии КАПРИ уменьшалось через 8 часов инкубации не более чем на 10%, что свидетельствовало о том, что инактивация гемопротеина в моно — оксигеназных реконструированных системах является НАДФН — зависимой реакцией. Инактивация цитохрома Р450 коррелировала со скоростью образования перекиси водорода и сопровождалась снижением бензфетамин гидроксилазной активности.

Несмотря на значительные различия в скоростях инактивации цитохрома Р450 в монооксигеназных системах, содержащих гемо — протеин и флавопротеин в соотношениях 1:1 и 1:0.05, расчет количества инактивированных молекул Р450 на 1000 молекул перекиси водорода показывает одинаковые значения этих параметров (табл. 1).

Таблица 1. Коэффициенты инактивации цитохрома Р450 2В4 для НАДФН — зависимых оксигеназной и оксидазной реакций (количество инактивированных молекул цитохрома Р450 в расчете на 1000 молекул образовавшейся Н202).

Цитохром Р450 Коэффициент инактивации

При окислении бензфетамнна Без субстрата

В составе микросом 5.2±0.5 7.0±0.5

В составе MPC Соотношение Р450 : ФП : Ь5 1 1 0 1 0.05 0 . 1 0.05 1 11.0+0.4 12.2±0.2 6.4+0.1 13.0±0.3 13.0+0.1

Содержание Р450, %

[ФА]. [Ц q ], мкМ

ю

Минуты

Содержание Р450, %

[ФА], [НрЗ , мкМ

4

Часы

Рисунок 1. Инактивация цитохрома Р450 2В4 в MPC при соотношении цитохрома Р450 и НАДФН-специфичного флавопротеина 1 : 1 (А) и 1:0.05 (Б). -•- Р450 ( — НАДФН) (1); -+-Р450 ( +НАДФН) (2); -В- Н2<Э2 ( +НАДФН) (3); * Н^ (-НАДФН) (4); * Формальдегид (ФА) (5).

При этом более высокая скорость инактивации Р450 в системе с содержанием переносчиков, равной 1:1, коррелировала с более быстрым образованием перекиси водорода (рис. 1). Эти данные указывают на участие Н202 в процессе инактивации гемопротеина. Ранее это было показано для цитохрома Р450, находящегося в составе микросомальной мембраны6.

При исследовании влияния цитохрома Ь5 на скорость инактивации цитохрома Р450 было получено замедление скорости обесцвечивания Р450 на 30%, которое коррелировало с замедлением

о

2

б

8

скорости генерации перекиси водорода на начальном участке реакции (рис. 2). При этом коэффициент инактивации, расчитанный длл монооксигеназной системы в присутствии Ь5, приближался к таковому, полученному в экспериментах с микросомами (см. табл. 1). Очевидно, замедление скорости инактивации цитохрома Р450 в присутствии цитохрома Ь5 связано с уменьшением генерации прямой перекиси водорода, так как известно, что цитохром Ь5, являясь донором второго электрона, снижает концентрацию оксикомплекса и способствует более быстрому распаду пероксикомплекса цитохрома Р450 с образованием продукта, а не Н2021617.

Содержание Р450, % [Н2°2^ мкМ

Время, часы

Рисунок 2. Изменение содержания цитохрома Р450 2В4 h накопления перекиси водорода в MPC в присутствии и отсугствии Ь5.

-В- содержание Р450 без Ь5 (1); -в- то же в присутствии Ь5 (2). -©-концентрация Н2О2 без Ь5 (3); -•-то же в присутствии Ь5 (4)

Результаты по влиянию каталазы на инактивацию цитохрома Р450 2В4 в MPC в процессе окисления бензфетамина представлены на рис. 3. Добавление каталазы в систему в концентрации 50 ед/мл защищает цитохром Р450 от инактивации в среднем на 40%. Увеличение концентрации каталазы до 100 ед/мл и более не вызывало дальнейшего снижения скорости инактивации цитохрома Р450 (рис. 3).

16 Bonfils е., et al., J. ВЫ. Chem., 1981, v. 256. pp. 9457-9465.

17 Arcliakov A.I., Zhukov A.A., Front. Biolransform., 1989, v. 1, pp. 151-175.

Содержание Р450, %

20

40

80

60

0

О

2 3 4 5 6 7 8

Время, часы

РИСУНОК 3. Влияние каталазы на инактивацию цитохрома Р450 2В4 в MPC в процессе окисления безфетамина. 1 - Р450 ( + НАДФН) (—Н—); 2 - Р450 (+НАДФН; + каталаза 30 и более ед/мл) (-»-); 3 - Р450 {— НАДФН) (*)

Тот факт, что каталаза имеет ограниченное ингибирующее действие, предполагает наличие не доступной для ее действия перекиси водорода, т.е. прямой перекиси, генерируемой в активном центре цитохрома Р450. Ингибирующее действие каталазы, очевидно, связано с изменением градиента концентрации перекиси водорода между активным центром фермента и окружающей средой. В присутствии каталазы в инкубационной среде происходит разрушение перекиси водорода, которое увеличивает градиент концентрации и тем самым ускоряет диффузию перекиси водорода из активного центра в окружающую среду. Уменьшение концентрации перекиси водорода в активном центре приводит к снижению скорости инактивации цитохрома Р45018.

Исследование модификации гема в процессе инактивации

Исследование механизма окислительной модификации гема цитохрома Р450 в MPC показало, что инактивация цитохрома Р450 сопровождается снижением содержания связанного с белком гема. При этом площадь пика, соответствующая по объему элюции нативному цитохрому Р450 2В4, использовалась как количественный параметр для определения содержания связанного с белком гема. Как

ЦИТОХРОМА Р450 2В4 в MPC.

18 Karuzina L.I., Archakov A.!.. Frcc Rad. Biol. &Med„ 1994, v. 17, pp. 557 - 567

видно из рисунка 4, в процессе инактивации наблюдается уменьшение площади этого пика, что указывает на уменьшение содержания связанного с цитохромом Р450 гема. В контрольных экспериментах, при инкубации реконструированной системы в отсутствии НАДФН в течение 8 часов снижение количества связанного гема не превышало 5% от исходного уровня.

Поглощение 418 нм (опт. ед)

Объем элюции (мл)

Рисунок 4. Изменение содержания связанного гема цитохрома Р450 2В4 в процессе инактивации в MPC. 1 — контроль; 2 — 8 часов инкубации при 30°С в присутствии 1 мМ бензфетамина. 3 — 8 часов инкубации при 30°С в присутствии 1 мМ бензфетамина и 2 мМ НАДФН.

Для того чтобы решить вопрос, происходит ли в процессе инактивации Р450 разрушение гема или только его потеря белком, было измерено содержание общего гема пиридингемохромогеновым методом11. Этот метод позволяет определять общее содержание гема в среде независимо от того, связан он с белком или находится в растворе. На следующем рисунке представлена корреляционная зависимость между скоростью инактивации цитохрома Р450 в MPC в процессе окисления бензфетамина и содержанием связанного и общего гема (рис. 5). Как видно из рисунка, содержание общего гема снижается в процессе инактивации так же, как и содержание связанного гема.

Учитывая полученные нами данные о высокой степени корреляции между скоростью инактивации цитохрома Р450 и уменьшением содержания гема можно предположить, что обесцвечивание цитохрома Р450 в процессе инактивации связано либо с деструкцией, либо с потерей гема цитохромом Р450.

Содержание, %

Время, часы

Рисунок 5. Зависимость между инактивацией цитохрома Р450 2в4 и изменением содержания связанного и общего гема в процессе НАДФН зависимого окисления бензфетамина в MPC

Цитохром Р450: Связанный гем Общий гем

1 без каталазы ("О") 3 без каталазы (-в-) 5 без каталазы ("в")

2 + каталаза 4 + каталаза (—в—] 6 + каталаза ("♦")

Так как содержание общего гема, измеренного пиридингемо — хромогеновым методом, снижалось с той же скоростью, как и содержание связанного гема, то можно заключить, что в процессе инактивации цитохрома Р450 происходит деструкция гема. Этот вывод находится в соответствии с данными, полученными Guengerich19, где было показано, что перекись водорода, образующаяся в оксидазной реконструированной системе, может вызывать деградацию гема цитохрома Р450, продукты распада которого в дальнейшем способны ковалентно связываться с апоферментом, что может лежать в основе механизма окислительной инактивации цитохрома Р450. Добавление каталазы в MPC (рис. 5) в концентрации 50 ед/мл защищало цитохром Р450 от инактивации на 40%. В такой же степени уменьшалась скорость снижения содержания связанного с ферментом гема. В то же время каталаза полностью защищала от разрушения общий гем. Сопоставляя результаты, полученые при исследовании модификации гема в присутствии каталазы и без нее, можно предположить, что в деструкции гемовой части цитохрома Р450 участвует как перекись водорода, локализованная в активном центре цитохрома Р450, так и,

19 Guengerich F., Biochcm., 1978. v. 17, pp. 3633-3639.

частично, перекись водорода, накапливающаяся в инкубационной среде. Однако, по нашему мнению, их роль в деградации тема различна. Вероятно, что сначала под действием перекиси водорода, образующейся в активном центре при распаде пероксикомплекса, нарушается связь между гемом и апоферментом, на что указывают данные о корреляции процессов инактивации и потери связанного гема как в присутствии, так и в отсутствии каталазы. На основании защитного эффекта каталазы на содержание общего гема можно предположить, что следующей стадией деградации гема является его разрушение под действием перекиси водорода, накапливающейся в инкубационной среде.

Окислительная модификация апофермента

Хроматографические исследования показали, что в процессе инактивации цитохром Р450 изменяет свое агрегатное состояние (рис. 6). При этом уменьшение площади пика, соответствующего нативному мономерному цитохрому Р450, сопровождалось образованием агрегатов белка с молекулярными массами 95 — 300 и более кДа, общая площадь пиков хроматограммы в процессе инактивации Р450 не изменялась.

На рис. 7 показана зависимость между инактивацией цитохрома Р450 в MPC в процессе окисления бензфетамина и агрегацией цитохрома Р450. Как видно из графика, процессы инактивации и уменьшение содержания белка в области 50 кДа проходили параллельно. Введение в инкубационную среду каталазы в одинаковой степени замедляло как инактивацию, так и агрегацию цитохрома Р450 (рис. 7).

Исходя из приведенных выше результатов, можно предположить два механизма образования агрегатов в ходе инактивации Р450. Первый — за счет изменения физико-химических свойств апофермента, как следствие окислительной модификации аминокислот, которая может вести к изменению поверхностного заряда фермента, увеличению гидрофобности при денатурации белка. Второй механизм — это образование межмолекулярных ковалентных сшивок20 .

20 Rice R.H., et al., ABB. 1983. v. 221, pp. 417-427.

Флюоресценция (niV)

>î001d 95vd 501d

4, г 4.

40 А "

20 А Л

0 У ^

0 5 10 15 20

Объем элюции (мл)

рисунок 6. Гель— проникающая высокоэффективная жидкостная хроматография нативного (1) и инактивировапного в MPC цитохрома Р450 в течение четырех (2), восьми (3) и двадцати четырех (4) часов. Хроматографию проводили на колонке BioSil Sec250 уравновешенную 100 мМ натрий—фосфатным буфером, рН 7.4, содержащим 0.25% эмульген 913, при скорости элюции 1 мл/мин. Регистрацию профиля разделения проводили с использованием метода постколоночной модификации NH2- групп с

ортофталевым альдегидом и последующей регистрацией флюоресценции. %

Время, часы

Рисунок 7. Корреляция между агрегацией цитохрома Р450 2В4 и его инактивацией в MPC. 1 — Изменение содержания цитохрома Р450 2В4 регистрируемое по СО — дифференциальному спектру поглощения 2 — то же в присутствии каталаэы Ф-);

3 — Уменьшение площади пика в области 50 кДа. ( В ); 4 — то же в присутствии каталазы (' Ш ); 5 — Образование агрегатов (сумма площадей пиков с молекулярной массой более 95 кДа ( О ); 6 — то же в присутствии каталазы 7 — Суммарная

площадь пиков с молекулярными массами более 5 кДа ( X ).

Подтверждением изменения физико-химических свойств белка являются данные, полученные при хроматографическом разделении компонентов монооксигеназной системы на ионнообменной DEAE колонке. Как видно из рисунка 8, при хроматографии компонентов MPC в начальный момент инкубации цитохром Р450 не связывался с носителем и элюировался в свободном объеме колонки. В процессе инактивации цитохрома Р450 наблюдалось появление новой белковой фракции. Скорость образования новой фракции коррелировала со скоростью инактивации цитохрома Р450.

Поглошение 240 нм (опт. ед.)

Объем элюции (мл)

Рисунок 8. Иоинообменная ОЕАЕ —НРЮ нативного (а) и инактивированного (Ь) в монооксигеназной реконструированной системе цитохрома Р450 2В4. Фракции 1 и 2 содержали иативпий и ииактивированпый цитохром Р450 соответственно. Хроматографию проводили на колонке ТЭК ПЕАЕ, уравновешенную 100 мМ натрий-фосфатным буфером. рН 7.4, содержащим 0.25% эмулыен 913, при скорости элюции 0.5 мл/ мин.

Высокая степень корреляции между процессами самоинактивации цитохрома Р450 и агрегации гемопротеина, атакже одинаковое ингибирующее действие каталазы на эти процессы указывает на единый механизм их возникновения. Среди причин, вызывающих агрегацию цитохрома Р450, можно предположить окислительное действие перекиси водорода на боковые цепи аминокислот, которое приводит к изменению физико-химических свойств белка. Из данных представленных на рис. 9, видно, что инактивация цитохрома Р450 сопровождалась изменением содержания БН — групп белка.

Флюоресценция (mV)

Рисунок 9. Содержание SH —групп н молекуле нативного и инактивированного цитохрома P450, измеренное методом пептидного картирования. А — 0 часов инактивации; В — после 3 часов инактивации; С — после б часов инактивации. D — 6 часов инактивации в отсутствии бензфетамина,

Как видно из рисунка 9 общая площадь флюоресцирующих пиков уменьшалась за 3 часа на 38% и за 6 часов на 60% от их исходного содержания. При этом уровень флюоресценции 1 —го пика в течении всего срока инактивации оставался постоянным, а флюоресценция трех остальных убывала со скоростью, равной скорости инактивации цитохрома Р450. Так, через 3 и 6 часов инактивации суммарная площадь 2, 3 и 4 —го пиков уменьшалась до 50% и 20%, соответственно.

Исследования инактивации, проведенные в отсутствии бензфетамина, не показали принципиальных различий с экспериментами, проведенными в присутствии субстрата. Как и в случае присутствия субстрата, свободное окисление NADPH сопровождалось снижением уровня флюоресценции тех же трех пептидов, при этом большая скорость инактивации цитохрома Р450 сопровождалась более быстрым уменьшением площади пиков.

С целью выяснения возможности образования ковалентных межмолекулярных сшивок были проведены исследования с использованием SDS —PAGE и гель—проникающей хроматографии в присутствии 0.1% SDS в элюирующем буфере. Как видно из рисунка 10 в процессе инактивации цитохрома Р450 происходит полимеризация гемопротеина с образованием ди —, тримеров и т.д. белка.

Поглощение 210 нм (опт. ед.)

Объем элюцни (ил)

Рисунок 10. Гель—проникающая ВЭЖХ пативного (1) и инактивированного в MPC цитохрома Р450 в течение четырех (2), восьми (3) и двадцати четырех (4) часов. Хроматографию проводили на колонке TSK4000 уравновешенной 100 мМ натрий — фосфатным буфером, рН 6.9. содержащим 0.1% SDS, при скорости элюции 1 мл/мин.

Использование меркаптоэтанола при подготовке пробы к разделению, а также присутствие его в элюирующем буфере не изменяло профиль разделения белков. Факт образования межмолекулярных сшивок в процессе окислительной инактивации Р450 был подтвержден с использованием SDS —PAGE. Как видно из рис. И, истощение полосы, соответствующей цитохрому Р450 2В4,

сопровождается образованием белковых полимеров с молекулярными массами 94 и 178 кДа.

ззо - ~ ^ <>~<• 220 : % Л

94 > х —- ЭД^ < 94

67 > 60 > 43 >

30 >

20.1 > 18.5>

РИСУНОК 11. ДСН—ПЛАТ электрофорез нативного (1) и инактивированного в течение двух (2), четырех (3), шести (4) и восьми (5) часов цитохрома Р450.

Сравнение скоростей образования полимеров со скоростью инактивации Р450 показало отсутствие корреляции между этими процессами (рис. 12). Так, к восьми часам работы монооксигеназной системы инактивировалось 85% цитохрома Р450, в то время как уменьшение площади пика в области 50 кДа не превышало 40%. Низкая скорость образования межмолекулярных сшивок между агрегатами указывала на вторичность этого процесса. Данные, полученные при исследовании процесса полимеризации в присутствии каталазы, которая замедляла процесс полимеризации на 75% (см. рис. 12), указывают на ведущую роль перекиси водорода находящейся в растворе в образовании межмолекулярных ковалентных сшивок. Исходя из литературных данных о возможности полимеризации гемопротеинов под действием перекиси водорода, можно предположить, что в модификацию апофермента цитохрома Р450

вовлечены неспецифические радикальные реакции18. Вероятно, ведущую роль в этом процессе могут играть высоко реакционные гидроксильные радикалы, образующиеся при распаде перекиси водорода в реакции Фентона при участии железа гема в качестве катализатора21.

%

Время, часы

Рисунок 12. Зависимость между скорость образования ковалентных межмолекуляриых сшивок и инактивацией цитохрома Р450 2В4 в монооксигеназной реконструированной системе. 1 — Изменение содержания цитохрома Р450 2В4 регистрируемое но СО — дифференциальному спектру поглощения 2 — то же в присутствии каталазы ( Ф );

3 — Уменьшение площади пика в области 50 кДа. ("В"); 4 — то же в присутствии каталазы ( В ); 5 — Образование полимеров (сумма площадей пиков с молекулярной массой более 100 кДа ( О ); 6 — то же в присутствии каталазы ( • );

Одним из показателей участия гидроксильных радикалов в модификации апофермента цитохрома Р450 является образование карбонильных групп. На рис. 13 представлены результаты измерения содержания карбонильных групп белка, образующихся в процессе инактивации Р450. Как видно из хроматограмм, через 6 часов инактивации наблюдается значительное увеличение содержания карбонильных групп белка, причем наибольший их прирост происходит за счет высокомолекулярной фракции (100 кДа и более) полимеризованного белка. Каталаза ингибировала процесс образования карбонильных групп на 35%.

21 гтд!ег J., о1 а!., АВВ, 1985, V. 241, рр. 103- 172.

Поглощение 390 нм (опт. ед, *

1(TJ)

6

4

2

0

>ÍOOkDa 50kDa

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Объем злюции (мл)

Рисунок 13. Изменение содержания карбонильных групп в процессе окислительной инактивации цитохроиа Р450 2В4 в монооксигеназной реконструированной системе регистрируемое методом гель—проникающей хроматографии. 1. контроль 2. 6 часов инактивации в MPC без каталазы. 3. б часов инактивации в MPC присутствии каталазы.

Исходя из вышеизложенных данных, можно предложить для рас — смотрения следующую схему модификации цитохрома Р450 в моно — оксигеназной реконструированной системе (рис. 14). Как следует из данных, представленных в первой части работы, цитохром Р450 самоинактивируется в основном под действием Н202, образованной прямым путем при распаде пероксикомплекса в реакции окисления бензфетамина. При действии перекиси водорода на апофермент происходит модификация некоторых аминокислот, в том числе цистеина 436, окисление которого ведет к потере гема цитохромом Р450. Следствием потери гема и окислительной модификации аминокислот цитохрома Р450 являются конформационные изменения гемопротеина, что выражается в увеличении гидрофобности, денатурации и изменении поверхностного заряда белковой молекулы. Именно эти изменения физико-химических свойств апофермента цитохрома Р450, по нашему мнению, являются причиной образования белковых агрегатов. С другой стороны, перекись водорода, накопленная в инкубационной среде, является причиной неспецифических свободнорадикальных процессов. Так, при взаимодействии Н202 с гемом происходит разрушение последнего с образованием продуктов

распада гема, освобождением ионов железа и генерацией высоко — реактивных гидроксильных радикалов, которые, в свою очередь, являются причиной полимеризации и способны модифицировать некоторые аминокислоты с образованием карбонильных групп на молекуле цитохрома Р450.

РИСУНОК 14. Общая схема инактивации цитохрома Р450 2В4 в MPC.

- 21 -ВЫВОДЫ:

1. Цитохром Р450 2В4 инактивируется в МРС под действием перекиси водорода по одинаковому с инактивацией цитохрома Р450 в микросомальной мембране механизму.

2. В процессе инактивации происходит потеря гема цитохромом Р450 с последующим нарушением структуры протопорфирина под действием Н202, накопленной в инкубационной среде.

3. Инактивация гемопротеина сопровождается окислительной модификацией SH — групп цистеинов и образованием карбонильных групп на молекуле цитохрома Р450.

4. Инактивация цитохрома Р450 в МРС сопровождается агрегацией апофермента с последующим образованием межмолекулярных копалентных сшивок под действием Н2Оа

список опубликованных работ по теме диссертации

1. Zgoda V.G., Karuzina I.I., Koen Ia.M., Bachmanova G.I., Archakov A.I., Cytochrome P450 degradation in monooxygenase reaction by H202 produced at the enzyme's active center. Abstracts on 10th International symposium on microsomes and drug oxidations., Toronto, Canada, July 18-21 1994, p. 567.

2. Zgoda V.G., Proschlyakov D.A., Ipatova O.M., Prosorovsky V.N., Bachmanova G.I., Prediction and experimental confirmation of the cytochromes b5 and P450 peptide mapping. In Proceedings of 8th International Conference on Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics and molecular Biology, Lisbon, Portugal, Lechner M.C., (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, pp. 853-856, 1994

3. I. Karuzina, V. Zgoda, Ya. Koen, O. Nikityk, G. Bachmanova, A. Archakov, NADPH —initiated self—catalyzed cytochrome P450 oxidative modification during monooxygenase reactions. I. Apoenzyme modification. Abstracts on 9th International Conference on Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics and molecular Biology, Zurich, Switzerland, 23-27 July 1995, p. 253.

4. V. Zgoda, I. Karuzina, Ya. Koen, O. Nikityk, G. Bachmanova, A. Archakov, NADPH — initiated self—catalyzed cytochrome P450 oxidative modification during monooxygenase reactions. II. Heme modification. Abstracts on 9th International Conference on Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics and molecular Biology, Zurich, Switzerland, 23-27 July 1995, p. 254.

5. Zgoda V.G., Ipatova O.M., Bachmanova G.I., Archakov A.I., Prediction and experimental confirmation of the cytochromes b5 three-dimensional peptide map, PCBM, v. 2, N. 3, 1995, pp. 33-37

© ИЗДАТЕЛЬСТВО - НИИ БМХ РАМН.

Отпечатало па Ризографе " Gestetner CopyPrinter 5325'

Институт Биомедицинской Химии Российская Академия Медицинских Наук

119832 Москва, Россия, ул Погодинская 10

Телефон: (095) 246-8465, (095) 246-3466 Факс: (095) 245-0857

Эл. почта: inst@ibmh.msk.su