Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние модификации цитохрома Р-450 2В4 янтарным ангидридом на межмолекулярные взаимодействия в системе микросомальной моноксигеназы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние модификации цитохрома Р-450 2В4 янтарным ангидридом на межмолекулярные взаимодействия в системе микросомальной моноксигеназы"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи \> [ ^ ^ | УДК 577.15.-018.1-35:541.127

1 8 МАР 13У6

КНЮШКО Татьяна Владимировна

"влияние модификации цитохрома р-450 2в4 янтарным ангиариаом на межмолекулярные взаимодействия в системе микросомальной монооксигеназьг

(специальность 03.00.04 — биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -

1996

работа выполнена в нии биомедицинской химии российской академии медицинских наук

научные руководители: академик РАМН, профессор кандидат биологических наук

официальные оппоненты: профессор

доктор химических наук Б. И. Курганов

профессор

доктор биологических наук А. В. Карякин

Ведущая организация: НИИ питания РАМН

_ .

защита диссертации состоится "<И % " 1995 года часов на

заседании Диссертационного Совета Д 001. 10. 01 при НИИ биомедицинской

химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан "_______'______" 1996 г.

А. И. Арчаков Д. Р. Давыдов

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат биологических наук

В. С. Былинкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Мультиферментная цитохром Р —450—зависимая монооксигеназиая система микросом (МОС) печени является ключевой системой метаболизма ксенобиотиков. Она участвует также в окислении эндогенных субстратов (стероидных гормонов, холестерина и т.п.]. Центральная роль МОС в метаболизме лекарственных веществ, активации канцерогенных ксенобиоткков, в ряде биосинтетическш: процессов обуславливает пристальное внимание исследователей к ее структурно —функциональной организации и механизмам катализируемых ею реакций.

Одной из центральных проблем в изучении механизмов функционирования МОС является исследование белок—белковых взаимодействий. До настоящего времени не существует однозначного представления о молекулярных механизмах взаимодействия главных компонентов МОС — цитохрома Р —450 и NADPH —цитохром Р — 450 редуктазы. Большинство результатов, полученных с помощью химической модификации этих белков, свидетельствуют о важной роли электростатических: взаимодействий, в которых участвуют аминогруппы гемопротеина и карбоксильные группы NADPH — ФП*. Однако, при использовании бифункциональных сшивающих агентов не удалось получить ковалентно сшитый комплекс этих белков2. Более того, некоторые данные о влиянии ионной силы и диэлектрической проницаемости среды на взаимодействие компонентов МОС были интерпретированы как свидетельство того, что поверхностные заряды цитохрома Р—450 и NADPH — ФП не только не участвуют в специфическом взаимодействии этих белков, но и мешают образованию их комплекса за счет электростатического отталкивания молекул^.

1 Nadler S.C.. Strobe] H.W. Arch. Biochem. Biophys., 1988, V. 261, P. 418-429

Nadler S.G., Strobel H.W. Aich. Biochem. Biophys., 1991, V. 290,. P. 277-284

Bernhardt R. et al., in; Biochemistry, Biophisics and Regulation of Cytochrome P—450, P. 595 — 598.

J.A. Gustafsson et el. (Eds.) Elsevier/Noth - Holland Biomedical Press, 1980.

Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys. Acta,. 1983, V. 745, P. 140-148.

Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys Acta, 1984, V. 785, P.186-I90.

Bernhardt R„ Kraft R„ Otto A, and Ruckpaul K. Biomed. Biochim. Acta, 1988, V. 43, P. 581-592.

Shen S., Strohe! H.W. АгсЛ. Biochem. Biophys, 1992. V. 294, P. 83 - 90.

2 Bernhardt R. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1984, V. 785, P. 186- 190.

Tamburini P.P. et al„ Biochem. Biophys. Res. Com.rn.un, ¡986, V. 134, P.519—526.

Schenkman John B. Proc. NATO Adv. Study Inst., Cesme, Aug.27-Sept.7, 1989. New York, London,

1991, P. 1-10.

Kanaeva I.P. et al, Arch. Biochem. Biophys, 1992, V. 298, P. 403 - 412.

3 VoznesenskyAl., Schenkman J B. J. Biol. Chem, 1992, V. 2S7, P. 14669-14676.

Voznesensky A.I., Schenkman J.B. J. Biol. Chem, 1994, V. 269, P. 15724-15731.

В to же время, из литературных данных известно, что лишенная гидрофобного фрагмента NADPH — цитохром Р —450 редуктаза не способна к образованию комплексов с цитохромом Р— 450^, что указывает на то, что в образовании комплексов этих белков определенную роль играют также и гидрофобные взаимодействия. Учитывая противоречивость перечисленных выше фактов, большой интерес представляет исследование вклада электростатических взаимодействий в образование функциональна — активных комплексов микросомальных белков.

Целью настоящей работы явилось исследование роли электростатических взаимодействий в образовании комплексов цитохрома Р-450 2В4 с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой.

Были поставлены следующие задачи исследования:

1. Получить модифицированный янтарным ангидридом цитохром Р —450 2В4 с различным числом сукцинилированных аминогрупп.

2. Исследовать электрон — транспортные и каталитические свойства сухцинилированного цитохрома Р —450.

3. Разработать подходы для прямой регистрации процессов образования олигомеров цитохрома Р—450 и его комплексов с NADPH — цитохром Р —450 редуктазой, основанные на принципах переноса энергии и тушении флуоресценции зондов, введенных в молекулы цитохрома Р —450 2В4 и NADPH - цитохром Р— 450 редуктазы.

4. Исследовать влияние сукцинилирования цитохрома Р — 450 2В4 на его взаимодействие с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой.

научная новизна и практическая значимость работы

Подобраны флуоресцентные метки и условия модификации цитохрома Р — 450 и NADPH — цитохром Р—450 редуктазы для применения методов, основанных на переносе и тушении энергии флуоресценции ковалентно связанных с белками флуоресцентных меток. Показано, что такая модификация не нарушает белок —белкового взаимодействия цитохрома Р—450 2В4. Разработанные таким образом методы использованы для регистрации образования олигомеров цитохрома Р—450 2В4 и его комплексов с NADPH— цитохром Р —450 редуктазой.

В результате проведенных экспериментов были получены препараты цитохрома Р—450 2В4 с различным числом сукцинилированных остатков лизина.

^ Coon. M.J. et al., Liver microsomal membranes: recanstitution of the hidroxylation system, containing cytochrome P—450.; The structural basis of membrane function., Ed. by Y. I-fatefi and LDjavadi — Ohaniance., N.Y., Academic Press; 1976, P.4.09-427.

Показано, что модификация до 30% свободных аминогрупп гемолротеина не влияет на его спектральные свойства, взаимодействие с N,N —диметиланилином и каталитическую активность в пероксидазной системе.

Установлено, что модификация аминогрупп цитохрома Р — 450 2В4 янтарным ангидридом приводит к существенному сдвигу равновесия агрегации гемопротеина в сторону мономеров, в результате ускорения распада агрегатов. Показано так же, что в результате такой модификации увеличиваются константы диссоциации комплекса гемопротеина с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой , что обусловлено как увеличением константы скорости распада, так и снижением константы скорости образования комплекса. Таким образом, показано, что заряд аминогрупп цитохрома Р—450 необходим для увеличения прочности образовавшегося комплекса цитохрома Р—450 с NADPH — цитохром Р —450 редуктазой.

Полученные результаты представляют интерес для выяснения механизмов функционирования монооксигеназной системы печени животных и человека. Разработанные методические подходы используются в лаборатории микросомалького окисления ИБМХ РАМН и лаборатории биоспектроскопии (IîlSERM U.310) института физико-химической биологии (Франция).

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Результаты исследований были доложены на 7 —ой, 8—ой и 9 —ой Международных: конференциях по цитохрому Р —450: "Biochemistry & Biophysics of Cytochrome P —450; Structure & Function, Biotechnological & Ecological Aspects" (Москва, 1991); "Cytochrome P —450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology" (Лиссабон, 1993); "Cytochrome P — 450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology" (Цюрих, 1995), а также на совместном заседании учебно—научного комплекса кафедры биохимии МВФ РГМУ и института биологической и медицинской химии РАМН.

публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных

работ.

структура и объем работы. Диссертация изложена на ......страницах

машинописного текста, включая ......рисунка и ......таблиц: Состоит из введения,

обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего........источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сукцинилирование цитохрома Р—450 проводили по методу Ульриха^ путем инкубации смеси, содержащей 100 мМ К —фосфатный буфер, pH 8,0 — 8,2,

5 мкМ цитохром Р—450 и различный избыток янтарного ангидрида, в течение 15 — 20 мин на льду. Степень сукцинилирования цитохрома Р — 450 определяли по содержанию свободных аминогрупп.

Препараты цитохрома Р—450, меченые 7—этиламино—3—(4'— малеимидалфеиил)—4-метилкумаршюм (КФМ) или Ы—(1—пиренил) малеимидон (ПМ), получали путем инкубации смеси, содержащей 100 мМ Na — HEPES буфер, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА, 0,2% Тритон N-.101, 15-20 мкМ LM2 и избыток КФМ или ПМ, в течение 1 — 1,5 час при 25<>С. При получении цитохрома Р — 450, меченого флуоресцеинизотиодианатом (ФИТЦ), инкубационная смесь содержала дополнительно 0,5 мМ ДТТ, а инкубацию проводили в течение 3,5 час при 4°С. Содержание метки в полученных препаратах составляло 0.9— 1.2 моль на моль цитохрома Р — 450.

Получение NADPH—цитохром Р—450 редуктазы, меченой КФМ, проводили путем инкубации 20 мкМ ФП с избытком КФМ в 0,1 М Na—HEPES буфере, pH 7,4, содержащем 1 мМ ЭДТА, 1 мМ NADP, 0,2% Тритон N- 101 и 20% глицерин, в течение 2 час при 25°С Молярное отношение КФМ/ФП для различных препаратов меченого флавопротеина составляло 0,7—1,3.

Препараты очищенных цитохрома Р—450 2В4 и NADPH— цитохром Р— 450 редуктазы были предоставлены препаративной группой при кафедре биохимии МВФ РГМУ (к.б.н. Я.М. Коеном и сотр).

Кинетику дитионит—зависимого и NADPH—зависимого восстановления цитохрома Р—450 регистрировали по изменению разности оптической плотности при 450 и 490 нм в присутствии СО^.

Кинетику взаимодействия цитохрома Р—450 с NADPH—цитохром Р— 450 редуктазой регистрировали по переносу энергии и тушению флуоресценции на спектрофлуориметрах Bayrd Nova (Bayrc! Atomic, Англия) или SPF 4000 (SLM Aminco, США). Инкубацию проводили в 0,1 М Na-HEPES буфере, pH 7,4, содержащем 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ. При использовании растворимой мокомеризованной реконструированной системы в буфер добавляли 0,025% Эмульгена—913. Сбор и обработку экспериментальных данных осуществляли при помощи пакета программ SpectraLab7.

Ullrich V., Kuthan Н. Biochemistry, biophysics and regulation of cytochrome P—4S0., Elsevier: North

Holland Biomedical Press, 1S80, P. 267-272.

6 Davydov D.R. et al., Ear. J Biochem, 1985, V. 150, P.155-159.

Ksnaeva I.P. et al., Aich. Biochem. Biophys, 1992, V. 298, P. 403-4t2.

7 Davydov D.R. et al., Arch. Biochem. Biophys, 1995, V. 320, P. 330-344.

Активность NADPH—цитохрон с редуктазы определяли по скорости восстановления цитохрома с®.

Взаимодействие цитохрома Р—450 с динетиланилилом (ДМА) и скорость реакций N—деметилировсшия определяли как описано Канаевой и АР9-

Моиомеризацию цитохрома Р—450 и NADPH—цитохром Р—450 редуктазы (ФП) проводили по методу Бачмановоя и др.1^.

Содержание цитохрома Р—450 определяли по методу Омура и Сато11. Содержание NADPH—цитохрон Р—450 редуктазы (ФП) определяли по методу Френча и Куна12. Свободные аминогруппы определяли по образованию комплекса с тринитробензосульфоновой кислотой1-*. Электрофорез белков в ПААГ геле проводили по Леммли14. Для оценки молекулярной массы сукцинилированного цитохрома Р — 450 электрофорез проводили в неденатурирующих условия« (в отсутствие додецилсульфата натрия). Содержание белка определяли по методу Лоури15.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. Получение и характеристика препаратов цитохрома Р-450 2В4, модифицированного янтарным ангидридом.

Сукцинилирование цитохрома Р—450. Степень модификации аминогрупп цитохрома Р—450 2В4 линейно зависела от концентрации янтарного ангидрида в реакционной среде. Варьируя эту концентрацию удалось получить ряд препаратов гемопротеина с различной степенью сукцинилирования.

Обработка 500-кратным избытком янтарного ангидрида, сопровождавшаяся модификацией 70 — 80% аминогрупп, не вызывала каких-либо изменений дифференциального спектра восстановленного дитионитом СО —комплекса цитохрома Р-450. Дальнейшее увеличение числа модифицированных аминогрупп приводила к частичному переходу цитохрома

8 Dignam J.D., Strobel H.W. Biochemistry, 1977, V. 16, P. 1116- 1123

9 Kanaeva I.P. et al., Aich. Biochcm. Biophys, 1992. V. 298, P. 395-402.

10 Bachmanova G.I. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm, 1986, V. 139, P.833-888. Kanaeva i.P. et al., Arch. Biochem. Biophys, 1992, V. 298, P.395 - 402.

" Omura T, Sato R. J. Biol. Chem, 1964, V. 239, P. 2370-2385.

12 French J.S., Coon M.J. Arch. Biochem. Biophys, 1979, V. 195, P. 565 - 577.

13 Habeeb A.F.S.A. Anal. Biochem, 1966, V. 14, P. 328-336.

14 Laemmly U.K. Nature, 1970, V. 227, P. 680-685.

15 Lowry O.N. et al., J. Biol. Chem, 1951. V. 193, P. 265-275.

Р —450 в цитохром Р —420. В связи с этим в дальнейших экспериментах использовались препараты, содержащие от 30% до 80% модифицированных аминогрупп.

Влияние суки,пиилчрования на размер агрегатов цитохрона Р—450.

Электрофорез сукцинилированного на 80% 2В4 в полиакриламидном геле (7,5%) в неденатурирующих условиях (в отсутствие SDS) выявил 3 белковые фракции с молекулярной массой от 140 кДа до 250 кДа, в то время как немодифицированный цитохром Р — 450 обнаруживался лишь на старте (молекулярная масса выше 660 кДа). Это свидетельствует о частичной диссоциации агрегатов цитохрома после обработки его янтарным ангидридом. Наличие нескольких фракций с разной молекулярной массой указывает на присутствие нескольких пофракцин цитохрома Р — 450 с различной степенью сукцинилирования.

Взаимодействие сукцинилированного на 70—80% цитохрома Р—450 с диметиланилином (ДМА) характеризовалось, как и в случае интактного гемопротеина, появлением типичных спектров связывания I типа. Значения спектральной константы диссоциации комплекса (Кд) и максимальной амплитуды дифференциального спектра (A-xnax) ^ случае интактного и модифицированного цитохромов достоверно не различались и составляли 72 — 96 мкМ и 0,9-!02 — 1,3'102 ед.ОП/нмоль Р—450, соответственно. Таким образом, сукцинилировэние цитохрома Р—450 не оказывает влияния на его взаимодействие с субстратом I типа ДМА.

Влияние сукцинилирования на скорость пероксидазной и гидроксилазной реакций. С целью установления приводит ли сукцинилировакие к нарушению каталитических свойств цитохрома Р—450 было проведено сравнение активности интактного и модифицированного цитохромов Р — 450 2В4 в реакциях NADPH— и ГПК —зависимого гидроксилирования ДМА в условиях MPC. Реакции проводили в условиях насыщения субстратом, поскольку, как показано выше, сукцинилировакие не влияет на константу диссоциации комплекса цитохрома Р — 450 с ДМА. Как видно из таблицы 1, сукцинилированне цитохрома Р-450 не влияет на скорость ГПК —зависимой реакции. В то же время скорость NADPH — зависимого гидроксилирования снижается с увеличением степени модификации. Эти результаты показывают, что модификация аминогрупп цитохрома Р—450 не влияет на пероксидззную активность цитохрома Р — 450, т.е. его каталитическую активность. Снижение скорости NADPH — зависимого гидроксилирования в

результате сукцинилирования цитохрома Р —450 2В4 обусловлено нарушением взаимодействия гемопротеина с МАОРИ — ФП.

Таблица 1

Скорость Ы— деметилирования НЬ' —диметиланилина различными препаратами цитохрома Р —450 в (А)— ГПК— и (В) — NADPH— зависимой системах

Степень модификации цитохрома Р — 450 v0, нмоль формальдегида/мин нмоль Р — 450

А В

0% 18,2 + 2,7 7,49jL2,04

34% 21,3 4:4,0 1,69 +0,62

63% 19,5+_3,3 0,82Jt0,47

Влияние сукцинилирования на кинетику восстановления цитохрома Р—450 дитионитом. Известно, что кинетика восстановления дитионитом цитохрома Р — 450, находящегося в микросомах, протеолипосомах и в агрегатах описывается уравнением суммы двух экспонент с долей быстрой фазы 65 — 70%16. Солюбилизация мембран и диссоциация агрегатов 0,2% Тритоном N —101 приводит к исчезновению быстрой фазы реакции. Таким образом, кинетика восстановления цитохрома Р — 450 дитионитом отражает степень его олигомеризации^.

В таблице 2 представлены кинетические параметры постановления дитионитом интактного цитохрома Р — 450 и сукцинилированного гемопротеина с различной степенью модификации аминогрупп. Во всех случаях кинетика восстановления хорошо описывалась уравнением суммы двух экспонент. Для препарата с 80% модификацией доля быстрой фазы снижается почти вдвое по сравнению с наблюдаемой для интактного цитохрома, что свидетельствует о существенном сдвиге равновесия в сторону мономеров в результате сукцинилирования.

16 Давыдов Д.Р., Курганов Б.И. Биохимия, 1982, Т. 47, С. 1476-1482.

17 Davydov D.R. et al, Eut. J. Bioc.hem, 1985, V. 150, P. 155-159.

Таблица 2

Кинетические параметры восстановления интактного и модифицированного цитохрома Р —450 дитионитом

Степень модификации N1^2 — групп кНО2, с-1 к2 Ю2, с-1

0% 66 4115 6.0 + 2.0 0,94+0,32

34% 62^М5 11.0.+ 3,5 1,90_+_0,60

64-80% 37 +.10 13,9 + 2,5 3,45^.1,12

2. Влияние сукцинилирования на межмолекулярные взаимодействия цитохрома Р-450 2В4.

Влияние сукцинилирования на кинетику обмена субъединиц и константу диссоциации агрегатов цитохрома Р450. .Для регистрации процессов обмена субъединиц в агрегатах цитохрома Р450 были использованы методы, основанные на переносе энергии между молекулами гемопротеина, меченного КФМ (донор) и ФИТЦ (акцептор), и на тушении флуоресценции меченного КФМ гемопротеина при взаимодействии с цитохромом, не содержащим метки.

При совместной инкубации КФМ —2В4 и ФИТЦ-2В4 наблюдались медленные изменения в спектре эмиссии, которые указывают на появление переноса энергии флуоресценции между КФМ (донор) и ФИТЦ (рис. 1а). Этот процесс свидетельствует об обмене субъединиц между агрегатами и образовании смешанных комплексов, состоящих из молекул, меченных КФМ и ФИТЦ18. Кинетические кривые падения флуоресценции донора (КФМ) хорошо описываются уравнением реакции первого порядка (рис. 16). Константа скорости этого процесса равна 0,12+ 0,024-10 ~ '.

Такое поведение системы свидетельствует о том, что процесс обмена субъединиц протекает через стадию диссоциации олигомеров, а препараты 2В4 — КФМ и 2В4 — ФИТЦ не отличаются по параметрам реакций образования и распада олигомеров.

Максимальная амплитуда переноса энергии флуоресценции практически не изменяется в использованном диапазоне концентраций гемопротеина (0.05 — 1 мкМ) и равна 30+_!2% (по уменьшению эмиссии донора). Это позволяет

18 Егцшап \Veber в. Вг'осйетм^, 1991, V. 30, Р. 1595-1599.

полагать, что в данных условиях весь гемопротеин находится в составе агрегатов и эффективная константа диссоциации олигомеров 2В4 столь мала (<< 0.01 мкМ), что не может быть достоверно измерена этим методом.

Рис. 1. Обмеп субъеднпиц между агрегатами 2В4-КФМ и 2В4 —ФИТЦ. Препараты 2В4-КФМ и 2В4 — ФИТЦ смешивались в молярном соотношении 1:1, общая концентрация 2В4 — 2 мкМ. Условия: 100 мМ Na-HEPES буфер, рН 7,4, i мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ; 25°С, длина волны возбуждения — 385 нм. а) — спектры флуоресценции, измеренные через 2,4, 18, 60, 136 и 276 минут после начала реакции, б) — кипепзка изменения интенсивности флуоресценции LM2 — КФМ при 455 нм. Сплошной линией показано описание экспериментальных данных уравнением реакции первого порядка с константой скорости распада ОЛг-Ю-Зс"" I и амплитудой равной 27%. Квадрат коэффициента корреляции для этого описания равен 0.99.

За процессом обмена субъединиц в агрегатах 2В4 следили также и по тушению флуоресценции КФМ (максимальная амплитуда тушения — 30%) в результате взаимодействия интактного 2В4 с 2В4 —КФМ. Кинетические кривые процесса обмена, зарегистрированные двумя предложенными методами, не отличались друг от друга, что указывает на то, что введение флуоресцентных меток (КФМ и ФИТЦ) не оказывает влияния на процессы агрегации гемопротеина.

Кинетика обмена субъединиц между агрегатами сукцинилированного 2В4, регистрируемая по тушению флуоресценции, также хорошо описывается уравнением реакции первого порядка (рис. 2а), а константа скорости не зависит от концентрации белка и равна 0,23±0,1 с-Таким образом, диссоциация агрегатов сукцинилированного Р —450 протекает более чем на 3 порядка быстрее, чем в случае интактного гемопротеина. В отличие от интактного

цитохрома, для сужцинилированного 2В4 амплитуда тушения флуоресценции имеет отчетливую зависимость от концетрации гемопротеина (рис. 26), что указывает на наличие заметных концентраций мономеров, сукцинилированного гемопротеина в растворе в исследуемом диапазоне концентраций.

Время, сек. )2B4],|jM

Рис. 2. Обмен мономеров между агрегатами 2B4s —КФМ и 2B4s. Условия: 100 мМ Na — HEPES, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ. 25°С. Белки смешивались в соотношении 1:1. а) — кинетнка обмена субъединнц между агрегатами 2B4s—КФМ и 2B4s (при длине волны возбуждения — 385 нм. флуоресценции — 455 нм). Общая концентрация 2B4s — 0,4 мкМ. Сплошной линией показано описание экспериментальных данных уравнением реакции первого порядка с константой скорости 0,19 с-' и амплитудой равной 19% от исходной интенсивности флуоресценции. Квадрат коэффициента корреляции для этого описания равен 0,96. б). — определение параметров реакции взаимодействия 2В4.Ч—КФМ и 2B4s методом последовательных разведений. Зависимость амплитуды тушения флуоресценции 2B4s—КФМ от концентрации белков. На рисунке указаны суммарные концентрации гемопротеина в пробе.

Была исследована кинетика обмена мономеров между агрегатами 2В4 — КФМ и 2В4 в условиях MPC (табл.3). Процесс диссоциации олигомеров 2В4 здесь протекает много быстрее, чем в отсутствие детергента. Кинетика обмена хорошо описывается уравнением реакции первого порядка с константой скорости равной 0.054 + 0.1 Î0~^c~ V а эффективная константа диссоциации равна 0.06-10— 6 м Весьма важным представляется тот факт, что кинетика обмена мономеров в агрегатах сукцинилированного цитохрома в этих условиях совпадает с наблюдаемой для интактного гемопротеина.

Из данных таблицы 3 видно, что константа скорости образования олигомера цитохрома Р450 во всех случаях, когда ее удалось определить, была одинакова. Как следует из литературы1^ такая величина типична для процессов образования комплексов с фиксированной ориентацией протомеров. Результаты

19 Scott H.N., Erickson Н.Р., Ргос. NalL Асad. Sci. USA., 1992, V. 89., P. 3338-3342.

с в идет ельств уют о том, что модификация гемопротеина не влияет на процесс его агрегации, а лишь ускоряет процесс распада агрегатов. Таким образом, как сукцинилирование гемопротеииа, так и введение 0.025% Эмульгена—913 сущестекяо ускоряют процесс диссоциации агрегатов 2В4, сдвигая, тем самым, равновесие в сторону мономерной формы (табл. 3).

Таблица 3

Кинетические константы процессов образования и распада агрегатов цитохрома

Р — 450 2В4.

"Условия k], M-ic-Mo-6 к_1, с 1-10 3

2B4 в отсутствие детергента 0,12_±0,02 4

2B4s в отсутствие детергента 232 + 91

2В4, 0,025% Э —913 0,9 54.+31

2B4S, 0,025% Э — 913 0,9 54.+ 23

Влияние сукцинилирования на кинетику NADPH—зависимого восстановления цитохрома Р—450 2В4 в условиях MPC. На рис.За представлена кинетика восстановления сукцинилированного 2В4 (степень модификации 80%) NADPH — цитохром Р — 450 редуктазой в условиях MPC. Следует отметить, максимальная степень восстановления сукцинилированного цитохрома Р—450 в NADPH — зависимой реакции составляет лишь 5% от общего содержания гемопротеина. Однако, из литературных данных известно, что интактный гемопротеин в условиях MPC восстанавливается также не полностью (50 —60%)20. Причины такого поведения цитохрома Р — 450 в мономеризованной реконструированной системе до сих пор неясны. Понижение уровня восстановления 2В4 при сукцинилировании можно отчасти объяснить возможной негомогенностью модифицированного препарата.

Как и в случае интактного цитохрома, кинетика NADPH — зависимого восстановления 2B4s подчиняется уравнению реакции первого порядка, Однако, константа скорости восстановления 2B4s составляет 2,6-10— ^ с~ что более чем на два порядка ниже соответственной величины для интактного цитохрома (6,9-10~~2 с-1) — рис.Зб. Таким образом, в результате сукцинилирования 2В4

20 Kanaeva Г.Р. et al., Arch. Biochem. Biophys, 1992. V. 298, P. 403 - 412.

происходит нарушение его взаимодействия с редуктазой, что приводит к изменению его электрон —транспортных свойств,

дСЮ 4-50-490

Время, мин

aOD 450-490

Время, сек

Рис 3. Влияние сукциииллровання на кинетику NADPH — зависимого восстановления цитохрома Р — 450 2В4 в MPC. Кинетические кривые восстановления цнтохромов 2B4s (а) и 2В4 (б) представлена в линейных и полулогарифмических (вставка) координатах. Вставка: по оси ординат отложено изменение оптической плотности в момент времени ! к максимальному изменению, наблюдающемуся после окончания реакции. Условия: MPC, 1 мМ NAJDPH, 50 мМ глюкоза, 30 ед/мл глюкоэооксидазы, 1000 ед/мл к.аталазы, 2.5 мкМ 2В4 и 2.5 мкМ NADPH—ФП - (а): 0,5 мкМ 2В4 и 0,5 мкМ NADPH — ФП — (б). Реакцию начинали смешиванием равных объемоь раствора NADPH и предынкубировавного раствора 2В4 (2B4s) и NADPH —ФП. Непрерывной линией показано описание экспериментальных данных кинетическим уравнением реакции первого порядка с константами скоростей 2.6-10-4с~ 1 (а) и 6,9 10~2С— I (б).

Влияние сукцимилирования на процессы образования и распада комплексов цитохрома Р450 с NADPH- цитохром Р—450 редуктазой. Для

регистрации процессов взаимодействия цитохрома Р450 с NADPH — цитохром Р450 редуктазой был использован методический подход, основанный на тушении флуоресценции меченного КФМ флавопротеина (ФП —КФМ) гемом цитохрома Р450 при образовании их комплекса.

Анализ процессов образования и распада комплексов 2В4 с ФП —КФМ в условиях MPC показал, что кинетика образования комплекса является двухфазной и может быть описана как сумма двух независимых реакций второго порядка (рис. 4а).

Рис. 4. Взаимодействие 2В4 с ФП-КФМ в условиях MPC. а) — кинетика образования комплексов 2В4 с ФП —КФМ, зарегистрированная по изменению интенсивности флуоресценции КФМ при смешивании 0.1 мкМ ФП—КФМ и 0.1 мкМ 2В4 (при длине волны возбуткдепия - 385 нм, флуоресценции - 455 ни). Сплошной линий представлено описание кинетической кривой уравнением второго порядка. 6) —. зависимость амплитуды быстрой фазы тушения флуоресценции ФП —КФМ цитохромом Р—450 от молярной доли ФП—КФМ. По оси ординат отложена максимальная относительная степень тушения, умноженная на концентрацию NADPH—ФП; по оси абсцисс — концентрация NADPH—ФП. Суммарная концентрация NADPH-ФП и 2В4 поддерживалась постоянной и составляла 0.2 мкМ. Сплошной линией представлено описание экспериментальных данных (Kd = 0.025 мкМ, максимальная амплитуда тушения — 27%).

Результаты титрования ФП—КФМ 2В4 хорошо описываются уравнением равновесия реакции обратимого образования бинарного комплекса. Зависимость общей амплитуды тушения от молярной доли ФП —КФМ представляется ассимметричной кривой с максимумом около ф = 0.6. В то же время, такая зависимость, построенная для амплитуды быстрой фазы, хорошо описывается уранением Джоба и представляет собой симметричную кривую с максимумом при ф = 0.5 (рис. 46), что свидетельствует об образовании комплекса с молярным

соотношением ФП—КФМ:2В4 равным 1. Константа диссоциации комплекса, определенная из этой кривой, равна 0.02 мкМ. Максимальная степень тушения флуоресценции ФП —КФМ составляет около 27%. Величина константы скорости образования комплекса ФП-КФМ с 2В4 в MPC (0,83 Ю6 М-^"1), как и в случае реакции олигомеризации 2В4, типична для процессов образования комплексов с фиксированной ориентацией протомеров при наличии участков взаимодействия площадью равной 25% от площади поверхности молекулы21.

При сравнении интактного и сукциншшрованного 2В4 мы ограничились рассмотрением быстрой фазы комплексообразования амплитуда которой составляла 60 — 80% от общей амплитуды тушения.

При взаимодействии сукцинилированного гемопротеина с ФП —КФМ в MPC также наблюдается тушение флуоресценции ФП —КФМ, кинетика которого является двухфазной (рис. 5а). Амплитуды быстрой фазы реакции составляет 70 — 90% от общей амплитуды тушения. Величина константы диссоциации комплекса здесь более чем на порядок выше, чем в случае интактного гемопротеина (рис. 56).

Время, сек [2B4sl ¡iM

Рис. 5. Взаимодействие 2B4s с ФП-КФМ в условиях MPC. Условия: 100 мМ Na —HHPES, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,025% Эмульген-913, 25°С. а) - кинетика образования комплексов 2B4s с ФП-КФМ (при длине волны возбуждения - 385 нм, флуоресценции - 455 нм), зарегистрированная по тушению флуоресценции КФМ. Белки смешивались в соотношении 1:1, суммарная концентрация белков 1 мкМ. Сплошной линией показано описание кинетической кривой уравнением суммы двух экспонент (максимальная амплитуда тушения составляет 16%, из которой 80% составляет амплитуда быстрой фазы). Квадратичный коэффициент корреляции этого описания равен 0,98. б) - титрование ФП — КФМ сукцинилироваииым цитохромон Р — 450 2В4. Концентрация NADPH-ФП составляла 0,1 мкМ. Значение Kd, определенное из описания экспериментальных данных, составляло 0,5 мкМ.

21 Scott H.N., Erickson Н.Р., Pwc. Natt. Acad. Sei. USA., 1992, V. 89., P. 3338-3342.

Таблица 4.

Кинетические константы процессов образования и распада комплекса цитохрома Р—450 2В4 с ЫАБРН — цитохром Р — 450 редуктазой.

Условия к — 1. с-1 ki, М_1с~1 Ю~б Kd, мкМ

ФП + 2В4, 0,025% Э —913 ФП + 2B4s, 0,025% Э — 913 0.021 0.032 0.B3i0.1 0,064ji0.046 0,025_+0.012 0,5.±0.04

Кинетические параметры процессов образования и распада комплексов 2В4 и 2B4s с NADPH —ФП в условиях MPC приведены в таблице 4. Видно, что ускорение диссоциации комплекса цитохрома Р —450 2В4 с NADPH — ФП в результате сукцинилирования гемопротеина вызвано как уменьшением константы скорости комплексообразования, так и увеличением константы скорости распада Таким образом, сукцинилирование гемопротеина не только увеличивает скорость распада комплекса, но и заметно затрудняет его образование.

ВЫВОДЫ

1. Сукцинилирование до 80% свободных аминогрупп гемопротеина не влияет на его спектральные свойства, взаимодействие с N,N—диметиланилином и активность в реакции ГПК—зависимого гидроксилирования N,N — диметиланилина, а модификация гемопротеина использованными флуоресцентными ме тками не ведет к нарушению его белок. - белковых взаимодействий.

2. Диссоциация олигомеров цитохрома Р —450 2В4 при сукцинилировании обусловлена увеличением константы скорости их распада при неизменной константе скорости образования, таким образом свободные аминогруппы 2В4 непосредственно не вовлечены во взаимодействие протомеров в агрегатах гемопротеина.

3. Изменение поверхностного заряда 2В4 в результате сукцинилировании ведет к снижению скоростей NADPH — зависимого восстановления гемопротеина и гидроксилирования ДМА за счет нарушения взаимодействия цитохрома Р —450 с NADPH — цитохром Р—450 редуктазой.

4. Сукцинилирование цитохрома Р —450 2В4 вызывает как увеличение константы скорости распада, так и снижение константы скорости образования его комплексов с NADPH — цитохром Р —450 редуктазой. Таким образом свободные аминогруппы гемопротеина принимают непосредственное участие в образовании его комплексов переноса электронов с NADPH — цитохром Р —450 редуктазой.

Список публикаций по теме диссертации

1. Davydov D.R., Knyushko T.V. and Hui Bon Hoa G. High pressure indused inactivation of ferrous cytochrome P — 450 LM2 (2B4) CO complex: Evidence for the presense of two conformers in the oligomer. Biochem. and Biophys. Res. Commun., 1992, 188, 216-221.

2. Knyushko T.V., Koen Ya.M., Davydov D.R., Kuznetsova G.P. and Scotselyas E.D. Functional properties of cytochrome P —450 LM2 modified by succinic anhydryde. In: Cytochrome P—450: Biochemistry and Biophysics (Archakov A.I. and Bachmanova G.I., Eds.), Moscow, INCO-TNC, 1992, 69-71.

3. Bachmanova G.I., Kanaeva I.P., Sevrukova I.F., Nikityuk O.V., Stepanova N.V., Knyushko T.V., Koen Ya.M., Archakov A.I. Electron transfer and protein — protein interactions in soluble reconstituted liver monooxygenase systems. In: Cytochrome P—450. Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology. Proc. 8th Int.Conf.(Lechner M.C., Ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 1994, 395-401.

4. Davydov D.R., Deprez E., Hui Bon Hoa G., Knyushko T.V., Kuznetsova G.P., Koen Y.M., Archakov A.I. High —pressure —induced transitions in microsomal cytochrome P450 2B4 in solution: evidence for conformational inhomogenity in the oligomers. Arc. Biochem. Biophys., 1995, 320, 330-344.

5. Davydov D.R., Knyushko T.V., Kanaeva I.P., Koen Ya.M., Hui Bon Hoa G., Archakov A.I. Intramolecular interactions of cytochrome P450 2B4 studied by fluorescence enegy transfer. 9th International Conlerence on Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology. Zurich, 3995.