Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнение физико-химических свойств цитохрома Р450 2В4, встроенного в протеолипосомы, со свойствами микросомального цитохрома Р450

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнение физико-химических свойств цитохрома Р450 2В4, встроенного в протеолипосомы, со свойствами микросомального цитохрома Р450"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНО - ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

СРАВНЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЦИТОХРОМА Р450 2В4, ВСТРОЕННОГО В ПРОТЕОЛИПОСОМЫ, СО СВОЙСТВАМИ МИКРОСОМАЛЬНОГО ЦИТОХРОМА Р450

На правах рукописи УДК 577.158.022

АПЛЕТАЛИНА Екатерина Владимировна

03.00.04 — биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1996

Работа выполнена в НИИ Биомедицинской Химии Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор УВАРОВ В. Ю.

кандидат биологических наук ДАВЫДОВ Д. Р.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор ВАНИН А. Ф.

Доктор биологических наук СОКОЛОВ Н. Н.

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 1996 года в

часов на заседании специализированного Ученого Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН.

Автореферат разослан "

сентября 1996 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Основные компоненты цитохром Р450 — содержащей микросомальной монооксигеназной системы печени являются мембраносвязанными белками. Поэтому после выделения этих белков в очищенном состоянии необходимо поместить их в некоторое гидрофобное окружение, чтобы воссоздать функциональную активность полной монооксигеназной системы или отдельных её компонентов. Реконструкция данной ферментной системы может быть осуществлена в растворе в присутствии ионных или неионных детергентов или фосфолипидов (Miwa et al.r 1979; Kaminsky et al., 1987; Kanaeva et al., 1992). Но поскольку естественным окружением мембранных белков является липидный бислой, то встраивание очищенных компонентов микросомальной монооксигеназной системы в фосфолипидные везикулы (получение протеолипосом) является в большинстве случаев предпочтительным способом реконструкции. В этой реконструированной системе условия функционирования ферментов наиболее приближены к таковым в нативной мембране.

В настоящее время существуют разные методы, позволяющие реконструировать цитохром Р450 в фосфолипидных везикулах. Получаемые протеолипосомы функционально активны в окислении различных субстратов, могут быть подобны микросомам по липидному составу, соотношению белок/липид, размеру и по кинетике некоторых реакций. Поэтому цитохром Р450 — содержащие везикулы нашли широкое применение для изучения структуры фермента (Uvarov et al., 1993, 1994; Kunz et al., 1991; Vergeres et al., 1989), его взаимодействия с редокс — партнерами (Gut et al., 1982; Taniguchi et al., 1987; Taniguchi and

Pyerin, 1988) и липидным бислоем (Kawato et al., 1982; Bosterling and Stier, 1983).

Однако, как бы ни были подобны протеолипосомы микросомам, они являются всего лишь моделью последних. Поэтому вполне возможно, что какие—то структурно — функциональные характеристики цитохрома Р450, встроенного в фосфолипидные везикулы, могут быть отличны от таковых микросомального гемопротеина. На свойства цитохрома Р450 могут оказывать влияние, в частности, условия и метод получения прогеолипосом. Однако, до настоящего времени не было проведено сравнительного изучения свойств цитохрома Р450, реконструированного в протеолипосомах различными методами.

С другой стороны, функциональное состояние цитохрома Р450 может в значительной степени зависеть от присутствия в протеолипосомах других белков — компонентов микросомальной монооксигеназной системы, в первую очередь цитохрома Ь5. Большинство данных о влиянии цитохрома Ь5 на цитохром Р450 было получено при реконструкции гемопротеинов в растворе или липидных мицеллах. Поэтому представляло интерес изучить влияние цитохрома Ь5 на функциональные свойства цитохрома Р450 в мембране протеолипосом.

Цель настоящей работы — сравнить функциональные свойства цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4, реконструированного в протеолипосомах различными методами, в отсутствии или присутствии цитохрома Ь5.

Задачи исследования: 1. Сравнить кинетические параметры Н202 — и ГПК — зависимого окисления бензфетамина цитохромом Р450 микросом и цитохромом Р450 2В4, встроенным в протеолипосомы.

Исследовать влияние метода получения протеолипосом, а также встраивания в них цитохрома Ь5 на данные параметры. 2. Сопоставить цитохром Р450 микросом с цитохромом Р450 2В4, встроенным в протеолипосомы, по значениям констант равновесия и термодинамическим параметрам спиновых переходов гемопротеина и образования его комплекса с субстратом. Исследовать влияние встраивания цитохрома Ь5 в мембрану протеолипосом на эти величины.

Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенного исследования установлено, что цитохром Р450 2В4, реконструированный в протеолипосомах в отсутствии других белков, и цитохром Р450 микросом существенно отличаются друг от друга по значениям констант равновесия и термодинамическим характеристикам процессов спиновых переходов гемопротеина и взаимодействия его с бензфетамином, а также по значениям Кт для Н2О2 в реакции Ы—деметилирования бензфетамина. Показано, что высокое значение Кт для Н2О2, полученное для цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, не может быть полностью объяснено более глубоким, чем в микросомах, погружением гемопротеина в липидный бислой. Обнаружено, что метод реконструкции цитохрома Р450 2В4 в фосфолипидных везикулах не оказывает существенного влияния на исследованные свойства фермента. Это в значительной степени облегчает сопоставление экспериментальных данных, полученных с использованием протеолипосом, реконструированных различными методами. Установлено, что различия в функциональных свойствах цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4 протеолипосом заметно уменьшаются при совместном встраивании в протеолипосомы цитохромов Р450 2В4 и Ь5. Эти результаты подтверждают существенное влияние взаимодействий цитохрома

Ь5 с цитохромом Р450 на функциональные свойства последнего. Данные о влиянии цитохрома Ь5 на термодинамические параметры спиновых переходов цитохрома Р450 и его взаимодействия с субстратом позволяют сделать некоторые предположения о механизмах модулирующего эффекта цитохрома Ь5 на цитохром Р450 и определить перспективные направления дальнейших исследований этих механизмов.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 9 —й Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Цюрих, Швейцария, 1995) и на 11—ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Лос Анжелес, США, 1996). Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН и кафедры биохимии МБФ РГМУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на стр. машинописного текста, включает 5 таблиц и 7 рисунков и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований", "Обсуждение полученных результатов", "Выводы" и "Список литературы".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В работе использовали фракцию микросом, выделенную методом дифференциального центрифугирования из печени получавших фенобарбитал кроликов — самцов; высокоочшценный препарат цитохрома Р450 2В4, выделенный из микросом по методу Карузиной и соавт. (1979); и цитохром Ь5, выделенный из микросом по методу Бра1г и 81пИщаиег (1971).

Содержание цитохрома Р450 и цитохрома Ь5 измеряли по дифференциальной схеме по методу Omura и Sato (1964) на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония). В расчетах использовали коэффициенты молярной экстинкции 91 мМ"1 см-1 и 165 мМ-1 см-1, соответственно.

Протеолипосомы (ПЛС), содержащие цитохром Р450 2В4, получали следующими методами:

а) Холатные протеолипосомы — холатно—диализным методом (Bosterling et al., 1979; Etter et al., 1991);

б) Ультразвуковые протеолипосомы — методом непосредственного встраивания белка в липосомы, полученные путем ультразвуковой обработки липидной суспензии (Archakov et al., 1981);

в) Гигантские протеолипосомы — методом непосредственного встраивания белка в гигантские липосомы, полученные согласно Szoka и Papahodjopoulos (1978).

Протеолипосомы, содержащие цитохром Р450 2В4 и цитохром Ь5, получали методом непосредственного встраивания белков в липосомы, сформированные путем озвучивания липидной суспензии (Archakov et al., 1981).

В качестве липидного компонента протеолипосом использовали обычно смесь фосфатидилхолин (ФХ): фосфа — тидилэтаноламин (ФЭ): фосфатидилсерин (ФС) (10:5:1, по весу).

Реакции Н202— и ГПК —зависимого N — деметилирования бензфетамина (БФ) цитохромом Р450 проводили, как описано Kanaeva и соавт. (1992а). Скорость реакций определяли по накоплению формальдегида. Кинетические параметры реакций рассчитывали по уравнению Михаэлиса — Ментен с использованием пакета программ SpectraLab (Davydov et al., 1995).

Спектры связывания цитохрома Р450 с бензфетамином регистрировали по дифференциальной схеме при температуре 25°С на спектрофотометре Hitachi 557 (Япония).

Определение термодинамических параметров спинового равновесия и связывания бензфетамина для цитохрома Р450 проводили по методу Renaud и соавт. (1996), основанном на применении метода главных компонент (Malinowski and Howery, 1980; Durrel et al., 1990) к сериям абсолютных спектров гемо — протеина, снятых в диапазоне 340 — 600 нм в зависимости от температуры при разных концентрациях субстрата.

Абсолютные спектры протеолипосом и микросом снимали при температуре 8, 15, 20, 25 и 30°С на спектрофотометрах Beckman DU-62 (США) или Aminco DW2 (США).

Размер протеолипосом определяли с помощью электронной микроскопии.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Определение пероксилазной активности цитохрома Р450 в реакции ГПК — зависимого N — леметилирования бензфетамина.

На первом этапе работы было проведено сравнительное изучение каталитической активности цитохрома Р450 2В4, встроенного в холатные и ультразвуковые протеолипосомы, а также находящегося в составе микросом, в реакции ГПК — зависимого окисления субстрата I типа бензфетамина. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы, оба типа протеолипосом характеризовались одинаковыми значениями Vmax. Значения Кт для субстрата и косубстрата несколько отличались: для протеолипосом, полученных холатно —диализным методом, они были, соответственно, в 1.5 и 1.8 раза ниже, чем для ультразвуковых везикул. Таким образом, в реакции ГПК — зависимого окисления бензфетамина не было выявлено

существенных различий в каталитических свойствах цитохрома Р450 2В4, реконструированного в фосфолипидных везикулах двумя разными методами.

Сравнение кинетических параметров реакции, измеренных для протеолипосом, с параметрами, полученными для микросом, показало следующее. Протеолипосомы и микросомы имели достаточно близкие значения Кт для субстрата, а величины Утах, определённые для везикул, в 1.5 раза превышали таковое для микросом. Значение Кш для ГПК, полученное для холатных протеолипосом, было в 2 раза выше, а полученное для ультразвуковых протеолипосом — в 4 раза выше значения, измеренного для микросом. На наш взгляд, различия в значениях Кт для ГПК, хотя и не являются значительными, могут указывать на существование определенных различий между цитохромом Р450 микросом и цитохромом Р450 2В4 протеолипосом по доступности активного центра гемопротеина для ГПК.

Таблица 1.

Кинетические параметры ГПК — зависимого 14— деметилирования

бензфетамина.

мМ

Система ддя ГПК для БФ мкмоль/мин

Микросомы 0.12 ± 0.01 0.35 ± 0.05 0.02 ± 0.001

Холатные ПАС 0.26 ± 0.01 0.41 ± 0.02 0.03 ± 0.001

Ультразвук. ПАС 0.46 ± 0.02 0.64 ± 0.08 0.03 ± 0.004

Инкубационная смось (конечный объём 0.5 мл) содержала бензфетамин и 1 нмоль цитохрома Р450 в 50 мМ калий фосфатном буфере, рН 7.2. Реакцию запускали добавлением ГПК и проводили в течение 1 мин при 30*С. При определении Кго для ГПК концентрация бензфетамина в инкубационной смеси была 3 мМ. При определении Кт для бензфетамина использовали концентрацию ГПК 1.5 мМ.

2. Сравнительное изучение каталитической активности цитохрома Р450 в реакции Н2Р-> — зависимого Ы — деметилирования бензфетамина.

На следующем этапе работы были определены кинетические параметры реакции N—деметилирования бензфетамина, в которой в качестве донора активного кислорода использовался Н202. В отличие от ГПК, пероксид водорода является сильно гидрофильным соединением, поэтому он поступает в активный центр цитохрома Р450 скорее из водной фазы, чем из липидного бислоя.

2.1. Определение каталитической активности цитохрома Р450 2В4, реконструированного в холатньгх или ультразвуковых протеолипосомах, и цитохрома Р450 мякросом.

В таблице 2 приведены кинетические параметры реакции Н202 — зависимого окисления бензфетамина, катализируемой цитохромом Р450 2В4 холатных или ультразвуковых протеолипосом или же цитохромом Р450 микросом. Видно, что оба типа протеолипосом характеризовались достаточно близкими значениями Утах, а также Кш для бензфетамина. Величина Кш для Н202, определенная для холатных протеолипосом, была приблизительно в 1.5 раза ниже, чем измеренная для ультразвуковых протеолипосом. Т.о., в реакции Н202 — зависимого И —деметилирования бензфетамина, как и в ГПК — зависимой реакции, не было выявлено существенных различий в каталитических свойствах цитохрома Р450 2В4, реконструированного в фосфолипидных везикулах разными методами.

Следует отметить, что липидный состав как холатных, так и ультразвуковых протеолипосом не влиял на кинетические параметры данной реакции: если для получения протеолипосом в качестве липидного компонента использовался только ФХ, то

значения всех трех кинетических параметров были практически такими же, как при использовании смеси трех липидов ФХ:ФЭ:ФС (в табл. 2 приведены данные для протеолипосом с липидным составом ФХ:ФЭ:ФС).

Таблица 2.

Кинетические параметры реакции Н202 — зависимого N — деметилирования бензфетамина.

Кш, мМ V у тах'

Система для Н202 для БФ мкмоль/мин

Микросомы 99 + 9 0.28 + 0.01 0.17 ± 0.02

Холатные ПЛС 689 ± 27 0.33 ± 0.06 0.32 ± 0.01

Ультразвук. ПЛС 995 ± 80 0.44 ± 0.04 0.31 1 0.02

Ультразвук. ПЛС, не

4- ДОХ N3 786 ± 60 определяли 0.24 + 0.02

Гигантские ПЛС 1011 ± 130 не опред. 0.20 + 0.02

Ультразвук. ПЛС, не

2В4 + Ь5 494 + 33 определяли 0.26 ± 0.02

Инкубационная смесь (конечный объём 0.5 мл) содержала бензфетамин и 0.5 нмоль цитохрома Р450 в 50 мМ калий фосфатном буфере, рН 7.2. Реакцию запускали добавлением Н202 и проводили в течение 1 мин при 30 С. При определении Кт для Н202 концентрация бензфетамина в инкубационной смеси была 2 мМ. При определении Кт для бензфетамина использовали концентрацию перекиси водорода 1000 мМ.

Сравнение кинетических параметров реакции, определённых для реконструированных систем, с аналогичными параметрами, полученными для микросом, выявило интересный факт. Если протеолипосомы и микросомы незначительно отличались (или вообще не отличались) друг от друга по значениям Кт для бензфетамина, то различия по значениям Кш для Н202 были существенными. Так, данное значение для

холатных протеолипосом было в 7, а для ультразвуковых протеолипосом — в 10 раз выше, чем для микросом.

Высокие значения Кт для Н202 в реакции, катализируемой реконструированным в фосфолипидных везикулах цитохромом Р450 2В4, вероятно, свидетельствуют о том, что доступ молекул в активный центр гемопротеина протеолипосом затруднен по сравнению с доступом в активный центр цитохрома Р450 микросом. Затруднение доступа, в свою очередь, может быть обусловлено возможными конформационными различиями между двумя гемопротеинами и/или более глубоким погружением молекул протеолипосомалыюго цитохрома Р450 в липидный бислой мембраны. Второе предположение основано на том, что пероксид водорода — сильно гидрофильное соединение, поэтому он поступает в активный центр цитохрома Р450 скорее из водной фазы, чем из липидного бислоя. При более же глубоком погружении молекулы цитохрома Р.450 в мембрану "вход" в его активный центр "спрячется" в ней. Для проверки второго предположения реакция Н202 — зависимого окисления бензфетамина, катализируемая цитохромом Р450 2В4 ультразвуковых протеолипосом, была проведена в присутствии низкой концентрации (0.015%) дезоксихолата натрия. В этих условиях происходит разрыхление липидного бислоя везикул, но сами везикулы не распадаются. Как видно из табл. 2, присутствие детергента в инкубационной среде вело лишь к небольшому уменьшению значения Кт для Н202. Таким образом, высокие значения Кт для Н202, полученные для цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, не могут быть полностью объяснены более глубоким, чем в микросомах, погружением цитохрома Р450 в мембрану везикул.

В отличие от Кт для Н202, значения Кт для бензфетамина различались незначительно. Следует полагать, что введение в

систему значительных концентраций перекиси водорода сдвигает спиновое состояние цитохрома Р450 в сторону низкоспиновой формы за счет гидратации гемового кармана. Такой сдвиг вызывает резкое снижение сродства фермента к субстрату, который связывается прежде всего с высокоспиновым гемопротеином. Таким образом, Кт для бензфетамина в реакции Н202 — зависимого гидроксилироваяия, очевидно, не - отражает сродства фермента к субстрату в нативных условиях. В то же время, взаимодействие цитохрома Р450 с бензфетамином может быть зарегистрировано непосредственно, по сдвигу спинового равновесия гемопротеина. Результаты таких исследований будут изложены ниже.

2.2. Определение каталитической активности цитохрома Р450 2В4 гигантских протеолипосом.

На следующем этапе работы было решено проверить, не является ли разница в значениях Кт для Н202, определенных для цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, следствием различия размеров микросом и протеолипосом. Средний диаметр микросомальных пузырьков печени кроликов составляет 250 нм, что заметно больше среднего диаметра использованных нами протеолипосом (54 нм и 41 нм у холатных и ультразвуковых протеолипосом, соответственно).

Для проверки данного предположения были получены гигантские протеолипосомы путем непосредственного встраивания цитохрома Р450 2В4 в гигантские липосомы при их совместной инкубации. Средний диаметр этих везикул равен микросомальному (Voznesenskii, 1989). Гигантские протеолипосомы аналогичны ультразвуковым по способу получения (непосредственное встраивание гемопротеина в преформиро — ванный липидный бислой). Поэтому в случае обнаружения различий в кинетических параметрах реакции, катализируемой

цитохромом Р450 2В4 гигантских или же ультразвуковых протеолипосом, они, в целом, должны быть интерпретированы как следствие различий в размерах везикул.

Кинетические параметры реакции Н202 — зависимого И — деметилирования бензфетамина, катализируемой цитохромом Р450 2В4 гигантских протеолипосом, представлены в таблице 2. Видно, что величина Кт для Н202 практически совпадает со значением, определенным для ультразвуковых протеолипосом.

Таким образом, разница в значениях Кт для Н202, полученных для цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, не является следствием различия размеров везикул.

2.3. Исследование влияния цитохрома Ь5 на каталитические свойства цитохрома Р450 2В4.

Для исследования влияния цитохрома Ь5 на каталитические свойства цитохрома Р450 2В4, реконструированного в фосфолипидных везикулах, были получены ультразвуковые протеолипосомы, содержащие цитохром Р450 2В4 и цитохром Ь5 (1:2, моль/моль). Кинетические параметры реакции Н202 — зависимого окисления бензфетамина, катализируемой цитохромом Р450 2В4 таких протеолипосом, представлены в таблице 2. Видно, что присутствие цитохрома Ь5 в фосфолипидных везикулах приводит к уменьшению Кт для Н202 в 2 раза.

3. Сравнительное исследование процессов образования фермент—субстратного комплекса и спиновых переходов цитохрома Р450 микросом и протеолипосом.

Важными функциональными характеристиками цитохрома Р450 являются кинетические и термодинамические параметры процесса образования фермент—субстратного комплекса и спиновых переходов этого гемопротеина. В данной части

исследования мы сравнивали цитохром Р450 микросом и цитохром Р450 2В4 протеолипосом по величинам констант равновесия и термодинамическим параметрам этих взаимосвязанных процессов.

На начальном этапе был проведен сравнительный анализ связывания бензфетамина цитохромом Р450 микросом и цитохромом Р450 2В4, реконструированным в протеолипосомах в отсутствии других белков двумя различными методами. Взаимодействия регистрировали по разностным спектрам поглощения в области Соре. Как известно, взаимодействие цитохрома Р450 с бензфетамином вызывает сдвиг спинового равновесия гемопротеина в сторону высокоспиновой формы. В результате этого разностные спектры поглощения комплекса Р450 с субстратом по отношению к свободному гемопротеину ("спектры связывания") имеют максимум при 387 — 392 нм и минимум при 416 — 420 нм. Измерение амплитуды таких разностных спектров как функции концентрации субстрата позволяет определить эффекивную константу диссоциации фермент—субстратного комплекса, Результаты таких исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Параметры разностных спектров связывания цитохрома Р450 с

бензфетамином.

Система ^ШП. НМ ^гаах' НМ ДАтах, хЮЗ Кй, мкМ

Микросомы 421 387 36.8 ± 5.1 16 ± 3

Холатные ПАС 421 387 57.4 ± 1.0 68 + 5

Ультразвук. ПАС 421 387 43.8 ± 1.6 71 ± 4

Смесь объемом 1 мл содержала 50 мМ калий фосфатный буфер, рН 7.4, и 1 нмоль цитохрома Р450.

Как видно из таблицы, метод получения протеолипосом практически не влиял на связывание цитохрома Р450 2В4 с бензфетамином. Оба типа везикул характеризовались одинаковыми или близкими значениями всех четырёх измеренных параметров.

В то же время, сравнение цитохрома Р450 микросом и цитохрома Р450 2В4 протеолипосом по величине Кй комплекса с бензфетамином показывает, что в последнем случае гемопротеин обладает существенно меньшим сродством к этому субстрату. Величина Кй для цитохрома Р450 2В4, реконструированного в фосфолипидных везикулах, была более чем в 4 раза выше значения, характерного для микросомального фермента.

Поскольку метод реконструкции цитохрома Р450 2В4 в фосфолипидных везикулах практически не сказывался на сродстве Р450 к субстрату, в дальнейших исследованиях были использованы протеолипосомы, полученные только методом непосредственного встраиванния.

Взаимосвязь между процессами спиновых переходов и взаимодействия с субстратом можно представить следующей схемой (ЭНдаг, 1976):

4

КЬ

> рь

N1 кз

V

V

5 --------» 8

1 <-Я- Ь

К

кь-[Рь]/[Р1]; кь5=[Рь3]/[Р15]; к^1=[Р1К]/[Р1]; кйь= [РьБ]/[РЫ,

где Р и Р! соответствуют цитохрому Р450 и его комплексу с субстратом, соответственно, а индексами "Ь" и "1" обозначены высоко— и низкоспиновая формы гемопротеина.

Таблица 4.

Термодинамические параметры спинового равновесия и связывания субстрата (бензфетамина) цитохромом Р450.

К ДН, ДБ, АС,

Система (25°С) кДж/моль Дж/моль К кДж/моль (25°С)

ПАС, 2В4 0.14 35.0 101 4.86

Кь ПАС, 2В4 + Ь5 0.64 23.7 76 1.09

Микросомы 1.06 16.3 55 -0.15

ПАС, 2В4 0.96 22.0 74 0.10

ПАС, 2В4 + Ь5 2.19 23.8 86 -1.94

Микросомы 2.27 27.6 99 -2.03

ПАС, 2В4 175 /¿М -47.2 -230 21.4

Ка1 ПАС, 2В4 + Ь5 51.7 рМ -9.8 -115 24.5

Микросомы 15.1 ¿¿М -1.4 -97 27.5

ПАС, 2В4 26.6 цМ -29.3 -186 26.1

ПАС, 2В4 + Ь5 15.2 рМ -10.2 -127 27.5

Микросомы 7.3 ^М -8.7 -128 29.3

Измеренные выше величины эффективных констант диссоциации представляют собой сложную комбинацию элементарных констант равновесия К^1, Кь5. Для

определения величин констант равновесия и термодинамических параметров всех четырех элементарных процессов, показанных на этой схеме, необходимо измерение концентраций высоко— и низкоспинового гемопротеина в растворе. С этой целью регистрировались абсолютные спектры поглощения микросом и протеолипосом в зависимости от концентрации субстрата и температуры. Анализ таких спектров затруднен сильным, зависящим от температуры светорассеянием суспензии микросом и протеолипосом. Для преодоления этого затруднения

был использован метод итерационной коррекции спектров поглощения с использованием метода главных компонент (Renaud et al., 1996).

Как указывалось выше, протеолипосомы, использованные в этих экспериментах, были получены только одним методом — непосредственного встраивания, и содержали либо только цитохром Р450 2В4 (протеолипосомы типа I в дальнейшем изложении), либо цитохром Р450 2В4 и цитохром Ь5 (1:1.4, моль/моль) (протеолипосомы типа II).

Термодинамические параметры спинового равновесия и связывания бензфетамина, определенные для цитохрома Р450 микросом и протеолипосом, представлены в таблице 4. В таблице 5 дано процентное содержание высокоспиновой формы цитохрома Р450 (P450hs) в микросомах и двух типах протеолипосом при температуре 25°С в отсутствии и присутствии бензфетамина.

Таблица 5.

Микросомы ПАС, 2В4 + Ь5 ПАС, 2В4

-БФ + БФ -БФ + БФ -БФ + БФ

P450hs, (%) 52 69 39 69 12 49

Как видно из таблицы 5, доля Р450ьэ в протеолипосомах, содержащих только цитохром Р450 2В4, значительно меньше таковой в микросомах. Особенно велика разница между этими двумя системами в отсутствии субстрата. Цитохром Ь5, реконструированный в протеолипосомах совместно с цитохромом Р450 2В4, значительно увеличивает содержание его высокоспиновой формы, причем в присутствии насыщающих концентраций бензфетамина — до цифр, определенных для микросом.

Как видно из таблицы 4, значения К(]' и К^11, определенные для цитохрома Р450 микросом, значительно ниже соответствующих значений для цитохрома Р450 2В4 протеолипосом, не содержащих цитохром Ь5, т.е. сродство как высоко —, так и низкоспиновой формы микросомального цитохрома Р450 к бензфетамину выше, чем это характерно для гемопротеина протеолипосом. Однако, введение цитохрома Ь5 в мембрану протеолипосом существенно снижает эти различия.

Одним из наиболее существенных результатов этого анализа являются, на наш взгляд, обнаруженные различия трех исследованных систем по значениям энтальпии и энтропии диссоциации комплексов как высоко — так и низкоспинового цитохрома Р450 с субстратом (табл. 4). Связывание бензфетамина цитохромом Р450 2В4 протеолипосом типа I вне зависимости от спинового состояния гемопротеина характеризуется значительно большими изменениями энтальпии и энтропии, чем связывание его с цитохромом Р450 микросом. Встраивание цитохрома Ь5 в протеолипосомы (протеолипосомы типа II) заметно снижает эти различия (табл. 4). Небольшие значения энтальпии связывания бензфетамина цитохромом Р450 микросом и цитохромом Р450 2В4 протеолипосом типа II говорят о том, что в этих системах нет существенных различий во внутренней энергии между свободным гемопротеином и его комплексом с субстратом. Напротив, высокие величины изменения энтальпии при связывания бензфетамина цитохромом Р450 2В4 в отсутствии цитохрома Ь5 могут рассматриваться как свидетельство того, что в этих условиях связывание бензфетамина ведет к разрыву значительного числа ван —дер — ваальсовых контактов в области центра связывания субстрата. Таким образом, полученные данные говорят о том, что если в присутствии цитохрома Ь5 в мембране связывание бензфетамина

как высоко — , так и низкоспиновой формой цитохрома Р450 не сопровождается существенными перестройками в центра связывания субстрата, то в отсутствии цитохрома Ь5 связывание субстрата заметно меняет конформацию субстратного кармана фермента. Можно предположить, что в присутствии цитохрома Ь5 в мембране субстрат—связывающий центр цитохрома Р450 имеет лучшее стерическое соответствие бензфетамину, чем в отсутствии этого цитохрома (в протеолипосомах типа I). Полученные результаты, однако, не позволяют сделать вывода о том, является ли обнаруженный эффект цитохрома Ь5 прямым (непосредственное изменение конформации активного центра цитохрома Р450 2В4 в результате взаимодействия гемопротеина с цитохромом Ь5) или опосредован влиянием цитохрома Ь5 на структуру липидного бислоя, олигомеризацию цитохрома Р450 в мембране и т.п.

ВЫВОДЫ

1. Метод реконструкции цитохрома Р450 2В4 в фосфолипидных везикулах не оказывал существенного влияния на кинетические параметры реакций Н2О2— и ГПК — зависимого 1ч( — деметилирования бензфетамина, катализируемых реконструированным гемопротеином, а также на спектральные параметры связывания им этого субстрата. Липидный состав везикул не влиял на кинетические параметры реакции Н2О2 — зависимого 14—деметилирования бензфетамина, катализируемой цитохромом Р450 2В4 протеолипосом, при любом из двух использованных методов их реконструкции.

2. Цитохром Р450 2В4, реконструированный в протеолипосомах в отсутствии других белков, и цитохром Р450 микросом существенно отличались друг от друга по значениям Кт для Н202 в реакции Н2О2 — зависимого И —деметилирования бензфе —

тамина, по положению спинового равновесия и по значениям энтальпии и энтропии связывания бснзфетамина. 3. При реконструкции цитохрома Р450 2В4 в фосфолипидных везикулах совместно с цитохромом Ь5 значение Кт для Н2О2 в реакции Н2С>2 — зависимого окисления бензфетамина уменьшалось в 2 раза. Термодинамические параметры спинового равновесия и связывания бензфетамина, определенные для реконструированного в этой системе цитохрома Р450 2В4, приближались к таковым для цитохрома Р450 микросом. Таким образом, цитохром Ь5 облегчает образование каталитически активной конформации цитохрома Р450 2В4 в мембране.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Uvarov V.Yu., Apletalina E.V. Structure and function of cytochrome P450 2B4 surface. Phys. Chem. Biol. Med., 1993, v.1-2, pp. 201-210.

2. E.V. Apletalina, E.A. Yakousheva, V.Yu. Uvarov, V.I. Popenko, A.I. Archakov. The comparative study of peroxidase activity and substrate binding propertities of cytochrome P450 2B4 incorporated into phospholipid vesicles with the use of two different methods. Biochemistry and Mol Biol Internat., 1995, 37, pp. 965-975.

3. E.V. Apletalina, E.A. Yakusheva, V.Yu. Uvarov, A.I. Archakov. Comparative study of peroxidase activity of cytochrome P450 2B4 — containing proteoliposomes prepared by different methods. Abstracts of the 9th International Conference on Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology. Zurich, Switzerland, 23-27 July 1995, p. 16.

4. E.V. Apletalina, V.Yu. Uvarov, D.R. Davydov, A.I. Archakov. Role of lipid — protein and protein — protein interactions in formation of catalytically active conformation of cytochrome P450 2B4. Abstracts

of the Xlth International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation, Los Angeles, USA, 21-24 July 1996, p. 170.