Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 1А2, 2В4 и апоцитохрома Р450 2В4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 1А2, 2В4 и апоцитохрома Р450 2В4"

. £

О'

_ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

^ ------

О^4 НАУЧНО-ЯССЛЕДОВЛТЕЛЬСКНЙ

' ИНСТИТУТ ШОМКДИЦИНСКОЙ ХИМИЙ

На правах рукописи

УДК 576.80/85 УДК 577.15.158

КИСЕЯАРЬ Ханна Георгиевна

ЛИНЕЙНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ЦИТОХРОМОВ Р450 1А2, 2В4 и МТОЦИТОХРОМА Р450 2В4.

(специальность 03.00.04 - биологическая химия)

Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1337

Работа выполнена в НИИ биомедицинской химии Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

академик РАМН, профессор Арчаков А.И.

к.б.н. Кодесанова Е.Ф.

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук

доктор химических наук

Карякин А. В. Габибов А.Г.

Ведущая организации: Институт иммунологии ИЗ РФ

Защита диссертации состоится "¿б"Июня 1997 года в 10-часов на заседании специализированного Ученого Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д.10

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Афтореферат разослан "22 " моя 1997 года

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета, кандидат биологических наук

£ылинкина В.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность прпбдемн- Цитохромы Р450 - надсемейство гемопротеинов, являющиеся ключевыми ферментами метаболизма ксенобиотиков в живых системах (krchakov and Bachaanova, 1990). Надсемейство включает в себя множественные формы цитохромов Р450, в значительной степени различающихся по аминокислотному составу, субстратной специфичности, однако имеющие близкие спектральные характеристики и одинаковый механизм катализа. Данные о структуре, расположении и свойствах как общих, так и специфичных функционально-активных участков цитохромов Р450 важны для изучения механизма действия этих ферментов. Большинство цитохромов Р450 представляют собой мембранные белки, что затрудняет изучение их структуры методом кристаллографии. Структурно-функциональное картирование цитохромов Р450 путем пептидного сканирования линейных антигенных детерминант в случае этих белков может бить использовано для изучения их структуры.

Антигенными детерминантами нативного белка являются участки, на которые вырабатываются и с которыми связываются при иммунном ответе специфические антитела. Эти участки располагаются главным образом на поверхности белка (Green et al., 1982). Следовательно, выявление антигенных детерминант дает представление о структуре поверхности исследуемых белков. Данные антигенного картирования позволяют получать антипептидные антитела, которые могут аспользоваться в структурно-функциональных исследованиях Зелковых молекул (Atassi, 1984; Arnon, 1S88; Milich, 1989). Определение антигенных детерминант одного и того же белка в разных конформационных состояниях дает возможность выяснить 5окализацию участков, чья антигенностъ зависит от 1ространственной конформации белка.

В настоящее время определение антигенных детерминант »озможно осуществлять с помощью метода пептидного сканирования PEPSCAN (Geysen et al . , 1987), использующего

последние достижения белковой инженерии в области пептидно синтеза на твердофазных носителях, а также мет иммуноферментного сорбционного анализа.

Цель_и_задачи исследования.- Целью настояще

исследования явилось полное антигенное картирован зукариотических микросомальных цитохромов Р450 1А2, 2В4 апо-цитсхрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования последующим соотнесением локализации найденный ливейь антигенных детерминант с известными структур* Функциональными областями исследуемых цитохромов, а таи сравнением антигенных структур холо- и апо-форм Р450 меэ собой. В связи с поставленной целью необходимо бь решить следующие задачи:

1.Методом пиновой технологии синтезировать гексапегт для антигенного картирования цитохрома Р450 1А2.

2.Получить и охарактеризовать мышиную и курт-антисыворотки к цитохрому Р450 1A2, а также антисыворо1! курицы к нативному цитохрому Р450 2В4 и его апо-форме.

3.Методом ELISA гексапептидов цитохрома Р450 1А2 ранее синтезированных в НИИ биомедицинской хи* гексапептидов цитохрома Р450 2В4 определить линей» антигенные детерминанты исследуемых белков, испольг полученные поликлональные антисыворотки.

4.С помощью поиска пептидных мотивов в базе данных < выявить индивидуальные и группоспецифические антиген» детерминанты цитохромов Р450 1А2 и 2В4.

5.Сопоставить расположение антигенных детерминант известными структурно-функциональными элементами исследуен белков.

8.Сравнить экспериментально найденные антигена детерминанты цитохромов Р450 1А2 и 2В4 с детерминанта* предсказанными с помощью различных алгоритмов.

Научная новизна данной работы состоит в установлен антигенных детерминант- цитохрома Р450 1А2 и апо-фо? цитохрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования, а та;

в сопоставлении антигенных карт холо- и апо-цитохрома Р450 2В4 и оценки возможности использования результатов антигенного картирования для исследования динамики пространственной структуры белков. Впервые сравниваются антигенные карты одного и того же белка, полученные с использованием антисывороток от животных различных видов.

Полученные данные могут быть использованы для: 1) получения моно- и группоспецифических антипептидних антител к цитохромам Р450; 2) получения антипептидних антител, взаимодействующих с определенными участками цитохромов Р450 1А2 и 2Б4 с целью поиска и исследования функционально важных участков этих белков; 3) моделирования пространственной структуры Р450 1А2 и 2В4; 4) изучения конформационных изменений цитохрома P45Q, отражающихся на структуре его поверхности; 5) разработки новых методов предсказания антигенных детерминант.

Апробация работы, Основные результаты работы были представлены на 10-м и 11-м Международных симпозиумах по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994 и США, Лос Анджелес, 1996), на 9-й Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Цюрих, Швейцария, 1995) и на 3-й Международной конференции по молекулярному узнаванию (Сингапур, 1995). fi-пробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН.

ПхбДИкашиь. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

142 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 22 рисунка, и состоит из следующих основных разделов; "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Оксибензотриазиновые эфиры Fmoc-защищениых L-серина и L-треонина, пентафторфениловые зфиры остальных Fmoe-a-L-

аминокислот, а также блоки полиэтиленовых игл с привитым амидным носителем для твердофазного синтеза пептидов являются продуктами фирмы "Cambridge Research Biochenicsls" (Нортвич, Великобритания). Гомогенные препараты цитохромов Р450 1А2 и 2В4 из макросом печени были любезно предоставлены к.б.н. Я.М.Коеном (РГМУ им. Н.И.Пирогова, Москва).

Апофермент цитохрома Р450 2В4 получали путем обработки холо-формы белка 0.5М Н2О2 в анаэробных условиях (Uvsrov el al., 1989). Было получено два вида антисывороток к цитохрому P45G 1А2 путем иммунизации мышей и куриц, йнтисыворотки ь цитохрому Р450 2В4 и апоцитохрому Р450 2В4 были получена путем иммунизации куриц. Контрольные сыворотки - отбором крови у тех же животных за неделю до nepBof иммунизации. Специфическое взаимодействие этих антисыворотоь с нативными цигохромами Р450 1А2 и 2В4 устанавливалось путе» иммуноферментного адсорбционного анализа. Аналогичн< проверяли отсутствие антигеневязывающей активности j контрольных сывороток. Специфическое взаимодействи« полученных антисывороток с апоцитохромом Р450 2В4 проверял! методом Оухтерлони.

Синтез связанных с твердофазным носителем пептидов перекрывающих всю поверхность цитохрома Р450 1А2 проводил) методом активированных эфиров по шшовой технологии фирм1 "Cambridge Research Bioohemicals" (Нортвич, Великобритания) Пептиды синтезировали на поверхности полиэтиленовых игл объединенных в блоки по 96 штук с габаритами 96-луночны иммунологических планшетов. Для полного выявления антигенны детерминант цитохрома Р450 1А2 синтезировали совокупность и перекрывающихся с шагом в один а/к остаток следующи гексапептидов: первий гексапептид соответствует N-концу а/ последовательности цитохрома, а последний является ее с концом, каждый из остальных гексапептидов представляет собо такой линейный участок а/к последовательности белка, что ег порядковый номер совпадает с порядковым номером а/к остатка являющегося N-концом соответствующего гексапептида. Конгрол

правильности синтеза был проведен путем а/к анализа выборочных пептидов на а/к анализаторе LKB (Upaala, Швеция).

Гексапептиды, полностью перекрывающие а/к поверхность цитохрома Р450 2В4, были синтезированы ранее Колесановой Е.Ф. и Козиным С. А. (НИИ биомедицинской химии).

Исследования антигенной активности пептидов проводили с помощью иммуноферментного сорбционного анализа (ELISA) с использованием пероксидазы хрена в качестве Ферментной метки для вторичных антител. Для измерения оптической плотности (А405) при проведении ELISA был использован многоканальный спектрофотометр "Hultisoan-Plus" (Labsysteœs, Финляндия). Статистическую обработку и графическое представление данных, полученных при ELISA, осуществляли с помощью программы SigaaPlot for Windows. Величину Ä4os, соответствующую линии отсечения значимых величин от фоновых, определяли согласно рекомендациям Worthingtcm and Morgan (1994). При обработке результатов ELISA пептидов с антисывороткой к нативным цитохромам Р450 1Ä2, 2В4 и апоцитохрому Р450 2В4 из 80% наименьших (из всей совокупности данных Ä4os) значений А-зоз расчитывали среднее значение A40S (М) и величину среднеквадратичного отклонения сг. За высоту линии отсечения принимали значение iuos, равное М+Зо-. Расчет проводили для каждого эксперимента в отдельности, предварительно вычитая соответствующие значения контроля.

Сведения об а/к последовательности цитохрома Р450 1А2 были получены из специализированной базы данных CPD (Archakov et al., 1992). Предсказания антигенных детерминант были проведены с помощь}» программы ESC (Dedinsky et al., 1994) и PCGene (IntelliGenetios).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Антигенное картирование цитохрома Р450 1А2. Для

проведения антигенного картирования цитохрома Р450 1А2 были использованы нативный цитохром Р450 гаМА2 и антитела от двух эволюционно удаленных еидов животных : мыши и курицы. Разные объекты для получения поликлондльннх антисывороток к

нативному цитокрому Р450 1А2 были взяты с целью выяснения изменяется ли антигенная карта данного цитохрома i зависимости от иммунного ответа эводюционно удаленных видое животных. Было синтезировано 511 гексапептидов, перекрывающих со сдвигом рамки в 1 а/к остатои последовательность цитохрома Р450 1А2. Антигенная активность, то есть связывание с первичными антителаму каждого из синтезированных гексапептидов, определяли < помощь» ELISA с использованием поликлональньи антисывороток, полученных от мышей и кур. Связывание гексапептидных фрагментов цитохрома Р450 1А2 с антителам! против нативного белка изучали, инкубируя иглы с пептидами с мышиной поликлоналъной антисывороткой, разведеной 1:2000, 1:1000 и 1:500 и с контрольной сывороткой в тех ж разведениях с целью исключения неспецифического связывания При разведениях 1:1000 и особенно 1:500 IgG из контрольно! сыворотки связывались с рядом гексапептидов, в то время Kai при разведении 1:2000 - не связывались. Посл<

статистической обработки результатов ELISA были выявлен! гексапептиды, которые связывались с антисывороткой при все; трех разведениях. Такие пептиды были признаны антигенными. 1 табл.1 представлены гексапептиды, связывающиеся -антисывороткой. В табл.2 приведены данные о числ< антигенных гексапептидов, антигенных зон и аминокислотны: остатков в составе этих антигенных зон при различны: разведениях антисыворотки. Видно, что число найденны: антигенных гексапептидов при разведениях антисыворотк! 1:2000 и 1--1000 остается неизменным, тогда как пр дальнейшем уменьшении разведения до 1:500 увеличивается Такая зависимость может быть результатом того, что по мер увеличения концентрации IgG (уменьшения разведени: антисыворотки) выявляются антигенные гексапептиды обладающие слабой иммуногенностью, а также увеличиваете, неспецифическое связывание антител с гексапептидами Разведение антисыворотки 1:2000, по-видимому, являете: оптимальным для выявления линейных антигенных детерминан

1бл.1. Антигенные гексапелтиды цитохрома Р450 1А2, .¡явленных с ^^омощью мышиной антисыворотки.____

»мер и Л/к структура Связывание с антисывороткой,

¡сположение гексапептида разведенной в отношении гсапептида

1:500 1:1000 1:2000

29-34 КАЗКРК 4 4 -

35-40 УРКбЬК 44 - -

36-41 РКОЬКЙ 4 - -

37-42 квьккь 4 - -

38-43 еьккьр 4 - -

42-47 ьрарща 4 4 4

43-48 рср«а« + 4 +

44-49 ОРНЙИР +4 44 44

95-100 К9АЬ7К 4 - -

105-110 ж ЯР о 4 - -

107-112 - 44 -

100-113 КРОЬУЭ 44 444 44

113-118 533Р1Т - - 4

120-125 бНЭНТР 4 4 4

121-126 НЗНТРЗ + 4 4

122-127 БЙТРЭР 4 4 4

126-131 ЭРОЗОР + - -

129-134 ЭбРУМ 44 44 44

130-135 бРУИАА 4 4 4

131-138 РУЙААК 4 44 44

132-137 УЯААЕШ 4 4 4

133-138 «ААКИК 4 4 4

135-140 АВВИЬА + 4 4

136-141 лкЕ&ад + 4 4

137-142 иньдео 4 4 4

146-151 ЗРЭХАБ 4 - -

152-157 НРАЭЗЗ 4 - -

153-158 РАБЗЗЭ + - -

164-169 нугавд + - -

165-171 УЗЙЕАЕ + - -

180-185 МААУЙЙ 4 - -

205-210 Р6НЕ?РР 4 4 4

206-211 44 44 44

207-212 НВРРйй 4+ 44 44

208-213 КЕРЗОБ 4 4 4

209-214 РРО&ЗЕ 4 - -

210-215 РавЗЕЕ 4 - -

242-247 4 4 4

243-248 НУЬРНР 4 4 4

244-249 УЬРНВР 44 4 4

245-250 ЬРНВРЬ 4 - -

249-251 рьенрк 44 - -

250-255 ЬОЕРКО 4 + 4

251-256 ЭВРКОР 44 44 44

одолжение табл.1, см. стр. 3

Номер и А/к структура Связывание с антисывороткой,

расположение гексапептида разведенной в отношении гесапептида

1:500 1:1000 1:2000

45 252-257 РККОУВ + 4 4

48 253-258 БИРИв 44 4 4

47 254-259 МЭРИОН + 4 4

48 262-267 ВИЖТ + - -

49 288-271 гтЕн 44 4 4

50 274-278 + - -

51 275-280 РОНЙЗГ + - -

52 276-281 ОЕШБЩ ++ - -

53 277-282 {«шео 4 - -

54 278-283 Н51601 ++ - -

55 279-284 эгаохт + + 4 ++ 44

56 280-285 100170 444 ++ 44

57 281-286 001ТСА + 4+ 44 + 44

53 338-343 РЕШП 4 4 4

59 347-352 ЬОАУУб + + 4

60 348-353 0АУ7в£? 4 4 4

61 343-354 АУУЗЯА 44 4 4

62 350-355 УУОВАК 4 4 4

63 399-404 РН1РКЕ 44+ - -

64 400-405 Н1РКЕС 44 - -

65 434-439 ТА1ЮАА 4 - -

66 438-443 АА1НКР + - -

67 433-444 А1НКР1. + - -

68 458-464 К»ЕТ1А 4 + 4

69 499-504 МККРЕС 44 44 44

70 500-505 ЕНРИСЕ 44 44 44

71 501-506 НРКСЕН 44 4 +

72 502-507 РКСЕНУ + 4 +

73 510-515 КРНРЭБ 44 44 +4

74 511-516 РИРБВД 44 44 4

; ¿405 < М+з; "+": А40& > М+ А-405 > М4^в;

"444": Й405 > М+ЗБ.

цитохрома Р450 1А2, поскольку при этом определяются в

возможные пептиды, обладающие сильной и средне; антигенностью, и не наблюдается неспециФическог<

взаимодействия пептидов с контрольной сывороткой, Таки] образом, при антигенном картировании кроличьего цитохром. Р450 1А2 с помощью мышиной антисыворотки было выявлено 1 линейных антигенных детерминант длиной от 6 до 1 а/к остатков. В состав найденных антигенных детерминан входит 118 аминокислотных остатков, что составляет 23% от и

5л.2. Число непрерывных антигенных детерминант, антигенных ссапетидов и аминокислотных остатков в составе антигенных герминант цитохрома Р450 1А2 кролика, выявленных при зличных разведениях антисыворогки. _ ___

<ер антигенный Разведение антисиворотки в отношении элемент 1:500 1:1000 1:2000

Непрерывная 23 16 15 детерминанта

Гексапептид 72 48 45

А/к остаток 200 123 113

\его числа в белке.

ELISA гексапептидных фрагментов Р450 1А2 с ¡ользованием куриной поликлональной антисыворотки водили аналогично описанному ранее ELISA с исывороткой мыши. Были проведены иммунологические анализы 1 трех разведениях куриной антисыворотки: 1:1000, 1:800,

00 и при таких же разведениях контрольной сыворотки.

1 разведениях 1:1000 и 1:800 связывание гексапептидов с трольной сывороткой не наблюдается, а при разведении 00 Igfl из контрольной сыворотки связывались с рядом сапептидов, но и при этом неспецифическое связывание о значительно ниже, чем в случае с мышиной сывороткой, денные после соответствующей статистической обработки ультатов антигенные гексапептиды представлены в табл.3. В л.4 приведены данные о числе антигенных гексапептидов, игенных зон и аминокислотных остатков в составе этих игенных зон при различных разведениях антисыворотки. но, что при достижении оптимальных условий биологического анализа число найденных антигенных :апептидов при разведениях антисыворотки 1:1000 и 1:9000 ается неизменным, тогда как при дальнейшем уменьшении ведения антисыворотки до 1:400 увеличивается. Таким азом, при антигенном картировании полной а/к 1едовательности цитохрома Р450 1А2 кролика с помощью

Табл.3. Антигенные гексапептиды цитохрома Р450 Ífi2 кролика, выявленные с помощью куриной антисыворотки.

Номер и Структура Связывание с антисывороткой

расположение гексапептмда разведенной в отношении

антигенного 1:400 1:800 1:1000

1 98-111 QALVRG 4 4 4

о и 10S-113 RPDLYS + 4 4

3 127-132 PDSGPV 4 4 4

4 131-136 PVWAAR + 4 4

5 132-137 VWAARR + 4 4

8 136-141 RRRLAQ + 44 4

7 163-168 EHVSQE + - -

8 164-169 HVSGEA + - -

9 165-170 VSQEAE 4 - -

10 193-196 VVSAAR + 4 4

11 194-199 VSAARV + 4 4

12 196-201 AARVIG + 4 4

13 205-210 FGRRFP 4 4 4

14 206-211 GRRFPQ + 4 44 44

15 207-212 RRFPQG 44 44 44

16 208-213 RFPQGS 4 4 4

17 219-224 VVRHSS 4 44 4

18 220-225 VRHSSK 44 44 44

19 238-243 FEPILR 4 - -

20 239-244 FPILRY 4 - -

21 240-245 PILRYL 4 - -

22 241-246 ILRYLP 4 - -

23 242-247 LRYLPK 44 4 4

24 243-248 RYLPNR 444 44 44

25 244-249 YLPtíRP 44 44 4

26 245-250 LPNRPL 44 + 4

27 248-251 PSRPLQ 4 4 4

28 249-254 PLQRFK 4 4 4

29 260-285 FLRFLQ 4 - -

30 298-303 NSGLIP 4 - -

31 299-304 SGLIPQ 4 - -

32 333-338 LVTNPR 44 44 4

33 334-339 VTNPRR 44 44 44

34 335-340 TNPRRQ 444 44 4

35 336-341 NFRRQR 444 444 44

36 337-342 PRRQRK 444 444 44

37 338-343 RRQRKI 444 444 44

38 339-344 RQRKIQ + 4 4 4

39 348-353 DAVVGR 4 - -

40 349-354 AVVGRA 444 444 4

41 350-355 VVGRAR 44 44 4

Продолжение таблицы 3 см. на стр. 11.

ю

Яомер и Структура Связывание с антисывороткой,

расположение гексапептида разведенной в отношении антигенного 1:400 1:800 1;1000

42 351-356 УЙВАВд 4 4 4

33 352-357 <;КАР<ЭР + 4 4

44 353-353 ЙАНЙРН 4 4 4

45 362-367 ираьру + 4 -

46 363-368 раьрур 4 - -

17 422-427 (ЮРЕЕР 444 444 444

48 423-428 БРЕЕРЕ + 4 + 444 444

49 424-429 РЕЕРКР 444 444 444

30 426-431 ЕРНРЕЙ + 4 4

31 427-432 РИРЕКР 4 4 4

52 510-515 ИРВЕЗЭ 44 + 444 444

33 511-516 РМ^б 4 4 4

" : А-4 О 5 < И+з; "+": А402 > М4з; "44": А405 > Н4 2э;

"444": А-аоа > М+Зз.

:уриной антисыворотки выявлено 17 линейных антигенных 1етерминант длиной от 6 до 12 а/к остатков. В состав ¡айденных антигенных детерминант входит 126 а/к остатков, по составляет 24% от их общего числа в белке, и количество 1/к остатков, составляющих антигенные детерминанты, >пределенных с помощью мышиной антисыворотки - 23Ж. При >том, однако, не более чем 40% антигенных учачгков, шявленных с помощью куриной антисыворотки совпадают с щтигенными детерминантами того хе белка, выявленными с юмощью мышиной антисыворотки (табл.7).

'абл.4.Число непрерывных антигенных детерминант, антигенных ексапетидов и аминокислотных остатков в составе антигенных ¡етерминант цитохрома Р450 1А2 кролика, выявленных при >азличных разведениях куриной ангисыворотки.

[омер Антигенный Разведение антисыворотки в отношении элемент 1:400 1:800 1:1000

Непрерывная 19 17 17 детерминанта

Гексапептид 53 41 41

А/к остаток 151 126 126

Остальные антигенные детерминанты составляют такие участк: последовательности цитохрома Р450 1А2, которые проявляю1 свою антигенность только при введении белка какому-либ' определенному виду животного.

II. Антигенное картирование цитохрома Р450 2В4. При

ранее проведенном антигенном картировании цитохрома Р450 2В> с использованием мышиной антисыворотки (Ко1езапоуа et а!. 1994, Козин, 1925), как и при антигенном картирована цитохрома Р450 1А2, было обнаружено значительное связывани контрольной сыворотки этих животных с гексапептидами Р45 2В4, что затрудняло анализ полученных данных и выявлени антигенных участков. В связи с этим нами было проведен^ повторное антигенное картирование с использование: антисыворотки, полученной от зволюционно более удаленного о кролика животного - курицы.

Определение линейных алтигенных детерминант цитохром Р450 2В4 с помощью куриной антисыворотки. Для полнот' антигенного картирования цитохрома Р450 2В4 был использованы гексапептиды, перекрывающие со сдвигом рамк в 1 а/к остаток всю аминокислотную поверхность кроличъег цитохрома Р450 2В4. Связывание гекеапептидных фрагменте цитохрома Р450 1А2 с антителами против нативного белк изучали, инкубируя иглы с пептидами с куриной поликлонально антисывороткой, разведенной: 1:2000, 1:1000, 1:500 Контрольные эксперименты, заключавшиеся в анализ взаимодействия этих пептидов с куриной контрольно сывороткой были проведены в тех же разведениях. Пр разведении 1:2000 связывания гексапептидов с контрольно сывороткой не наблюдалось, а при разведении 1:1000 и 1:50 1ёСг из контрольной сыворотки связывались с незначительны количеством гексапептидов, при этом связывание был значительно ниже, чем в случае с мышиной сывороткой (Козин 1995). Найденные после соответствующей статисгическо обработки результатов антигенные гексапептиды представлены

табл.5. В табл.6 приведены данные о числе антигенных гексапептидов, антигенных зон и аминокислотных остатков в составе этих антигенных зон при различных разведениях антисыворотки. Видно, что число найденных антигенных гексапептидов при разведениях антиснворотки 1:1000 и 1:500 остается практически неизменным, тогда как при дальнейшем разведении антисыворотки до 1:2000 уменьшается. При разведениях антисыворотки 1:500 и 1:1000, выявляются все возможные пептиды, обладающие сильной и средней антигенностью. Таким образом, при антигенном картировании полной а/к последовательности цитохрома Р450 2В4 кролика с помощью куриной антисыворотки было выявлено 33 линейные антигенные детерминанты длиной от 6 до 13 а/к остатков. В состав найденных антигенных детерминант входит 244 а/к остатков, что составляет 49% от их общего числа в молекуле белка. Для цитохрома 2В4 характерна наивысшая плотность линейных эпитопов среди трех тестированных белков (Р450саш, Р450 1А2, 2В4). Примерно 60% антигенных участков, выявленных с помощью хуриной антисыворотки полностью

совпадают с антигенными детерминантами того же белка, определенными с помощью мышиной антисыворотки (табл.3). Остальные линейные антигенные детерминанты составляют такие участки последовательности цитохрома Р450 2В4, которые проявляют свою антигенность только при введении белка определенному виду животного - курице или мыши.

Табл.6. Число непрерывных антигенных детерминант, антигенных гексапептидов и аминокислотных остатков в составе антигенных детерминант цитохрома Р450 2В4 кролика, выявленных при р^личных__разведениях куриной_ _ антисыворотки.

Номер Антигенный Разведение анисыворотки

элемент 1:500 1:1000 1:2000

1 Непрерывная 33 33 31 детерминанта

2 Гексапептид 91 91 75

3 А/к остаток 244 244 175

Табл. 5. Антигенные гексапептиды цитохрома Р450 2В4 кролика выявленные с помощью куриной антисыворотки.

Расположение Структура Разведение антисыворотки

гексапептида гексапептида -——--

1:500 1:1000 1:2000

1-6 НЕБЗЫ, + 4 4

3-14 ЬАРЬАЙ + 4 4

10-15 АГЬАвЬ + 4 4

11-16 РЬАОЫ, + 4 4

18-23 4 4 4

19-24 1^1КЗНР 4 4 4

20-25 ркенрк 4 4

39-44 УЬСНЬЬ - 4 -

40-45 ьвнььд 4 4 -

43-48 ьииок 4 4 4

67-72 ттвв 4 + 4 4

79-84 СЙТ0А1 4 4 4

80-85 ОТОА1£1 4 4 4

81-88 1им ИЕ 4 4 4

92-97 АЕкРЁй 4 4 4

93-98 4 4 44

94-99 АРБЙКС 4 4 4

105-110 4 4 44

106-111 44 44 44

107-112 IРвйТв 4 4 44

108-113 Е£50УйУ 4 4 4

103-114 4 4 4

110-115 АУбУГР 4 4 4

112-117 вухглн 4 4 4

117-122 Й0Е1ШК 4 4 -

122-127 ИЛЬВЕР 4 4 -

124-129 ЬКЙРБЬ 4 4 -

141-145 ЗУЕЕМ 44 44 44

142-147 УЕЕИ1д 4» 44 44

143-148 ЕЕМОЕ 44 +'+ 44

144-149 ЕКХОЕЕ 44 44 44

145-150 ЙГаЕБА 44 44 44

146-151 ЮЕЕАИ 4 4 -

151-156 ЕСЬУЕЕ 4 4 -

177-182 1ШС51 4 4 -

184-189 4 4 ' . 4

189-194 0Ш>Р7 444 44 4 4

218-223 ЕЬРРв? 4 4 -

229-234 ОТНЕШ 4 4 -

230-235 ТНЕЕЦУ 4 4 -

315-320 ЬКУРНУ 4 4 4

316-321 КУРНУТ 4 4 4

317-322 УРНУТЕ 44 44 4 +

318-323 РНУТЕК 4 4 44

Продолжение табл.5 см. на стр.15.

Расположение гексапептида Структура гексапептида Разведение антисцворотки 1:500 1:1000 1:2000

330-335 QVIGSH + 4 4

332-337 IGSHRP + 4 4

334-339 SHRPPA 4 + -

336-341 RPPALD 4 4 -

343-348 RAKMPY + 4 4

352-357 VIHEI8 + 4 4

353-353 IHEIQR 44 44 44

354-359 HEIQRL 4 + 44 4 4

363-368 IPFGVP + 4 4

364-369 PFGVPH + 4 4

365-370 FGVPHT +4 44 + 4

374-379 DTQFRG 4 4 4

387-392 EVFPVL 4 4 k-

388-393 7PPVLS + 4 4

392-397 LSSALH + + 44 44

393-398 SSALHD + 4 44 +4

394-339 SALHDP + 4 4

395-400 ALHDPR 44 44 44

398-401 LHDPRY 4 4 4

397-402 HDPRYF 4 -+ 4

399-404 PRYFET 4 4 4

400-405 RYFETP 4 -4- 4

401-406 YFETPH 4 + 4

407-412 TFNPGH 4 + 4

403-413 FMPGHF 4 + 4

409-414 HPGHFL - + 4

410-415 PGHFLD 4 4 4

412-417 HFLDAH 4 4 4

413-418 FLDANG 4 4 44 44

420-425 LKRNEG 44 44 44

421-428 KRNEGF 4 4 4

Î22-427 RNEGFM 4 4 4

124-429 EGFMPF 4 4 4

125-430 GFHFFS 4 4 4

157-462 FS1ASP 4 4 4

tSe-471 ED1DLT f 4 -

167-472 0IDLTP 4 4 4

166-473 IDLTPR 4 4 4

169-474 DLTPRE 4 4 4

170-475 LTPRES 44 44 44

171-476 TPRESG 4 + 4

¡72-477 PRE3GV 4 + 4

,73-478 RESGVG 4 4 4

,80-485 VPPSYQ 4 4 4

.81-488 PPSYQI 4 4 4

82-487 P3YQIR 4 4 +

"-": A-üOü < "444": A40S M+s; "4": Ä405 > > M4 3s. M+s; "44": A-äOS > M4 2s;

III. Сравнение результатов картирования цитохромов Р450 1А2 и 2В4 с помощью миииной и куриной антисывороток.

Использование антисывороток , полученных от двух видов животных - мыши и курицы для антигенного картирования цитохромов Р450 гаЬ1А2 и гаЬ2В4 показывает, что найденные линейные антигенные детерминанты подразделяются на две группы. В первую входят антигенные детерминанты, выявляемые с помощью общих сывороток. Они составляют примерно 40': выявляемых антигенных детерминант цитохрома Р450 1А2 и 805 антигенных детерминант цитохрома Р450 2В4 (см.табл.? и i соответственно). Можно полагать, что антигенность этш

Табл.7. Суммарная антигенная карта цитохрома Р450 1А2, полученная с помощью мышиной и куриной антисывороток.

Расположение ангигеннолго Структура антигенного

участка участка

1 42-49 LPGPWGWP

р 9S-101 QÄL7RQ

3 108-ЦЗ RPDI.YS

4 120-127 GHSMTFSP

127-138 PDSGPVWAARRR

В 135-142 ARRRLAOD

7 193-193 VVSAAÜY

В 205-213 FGRRFP0GS

S 219-225 VVRNSSK

10 242-251 T.RYLPNRPI.0

11 249-259 PLGRFKDFNQR

12 288-271 KTVREH

13 279-286 SIQDITGA

14 333-344 LVTHPRRQRKI0

347-358 IDAVVGRAROPR

16 362-367 RPQLPY

17 422-432 GDPEEFRPERF

18 459-464 IGETLA

19 499-507 MKHPRCEHV

20 .510-516 , . RPRFSD9

Обозначения: подчеркнуты антигенные участки, выявляемые с помощью обеих■сывороток; заглавными буквами обозначены антигенные участки, выявляемые только с помощью мышиной ангисыЕоротки; заглавными буквами курсивом обозначены антигенные участки, выявляемые только с помощью куриной антисыворотки.

1. £j

участков последовательности Р450 мало зависит от видовых особенностей функционирования иммунной системы. Именно эти антигенные детерминанты будут представлять наибольший интерес при получении антипептидных антител, так как вероятность высокоэффективной наработки антител к данным участкам наиболее велика. Вторую группу линейных антигенных детерминант составляют такие участки последовательности цитохромов Р450 1А2 и 284, которые проявляют свою антигенность только при введении белка какому-либо одному животному - мыши или курице. Проявление иммуногенных свойств этими участками белка зависит от особенностей

Табл.8. Суммарная антигенная карта цитохрома Р450 2В4, полученная с помощью мышиной и куриной антисывороток.

Расположение Структура Расположение Структура

антигенного антигенного антигенного антигенного

участка участка участка участка

1 1- ■6 МЕРЯН 19 242- 248 нтрюеБ

7 9- -16 ЬАРЬАвИ 20 258- 267 РЗИРНОРЮУ

5 18- -25 ПРНОНРК 21 283- 289 рннены

39- 22 315- ■323 ЬКУРНУТЕР

67- ■17, TV.Y1.GS 23 330- ■341 вутпзннррмр

6 73- -86 СвТРАТЯЕ 24 343- ■348 ВАКМР7

9 117-122

10 122-129

11 141-151

12 151-158

13 177-132

№ВЯЧП ЕАШНЕЗЬ УЕЕМвЕВАЯ ЯСЬ УЕЕ //11(751

17 223-228 РЬКНРР

99?

26 363-370

27 374-379

387-393

30 407-415

31 412-418

32 420-427

33 . 424-430

34 457-462

36 480-487

ГРРОУРНТ

ЕУЕРУ13 Т?Ш1НРЫ>

.ЖШЕЕЗ.

Р31А5Р

уррвуош

Обозначения: подчеркнуты антигенные участки, выявляемые с помощью обеих сывороток; заглавными буквами обозначены антигенные участки, выявляемые только с помощью мышиной антисыворотки; заглавными буквами курсивом обозначены антигенные участки, выявляемые только с помощью куриной антисыворотки.

Функционирования иммунной системы тех животных, котор! вводится исследуемый белок. Однако выявление таю Фрагментов как антигенных детерминант с помощью хотя 1 одной антисыворогки ухе свидетельствует о наличии у т иммуногенных свойств. По этой причине суммарная антигеннг карта белка должна, по нашему мнению, включать динейт антигенные детерминанты, выявленные с использование антисывороток разных животных.

IV. Поиск среди надсемейства цитохромов Р450 белков а/к последовательностями, идентичными антигеннъ детерминантам цитохромов Р450 2Б4 и 1А2. Нами осуществлю компьютерный поиск антигенных гексапептидов цитохромов Р4Е 1А2 и 2В4 в молекулах других представителей надсемейства ци тохромов Р450, аминокислотные последовательности которы имеются в СРВ, и проведен анализ частоты встречаемости эти гексапептидов в соответствующих подсемействах и семействах Результаты этого анализа приведены в табл. 9 и 10. зависимости от частоты встречаемости в последсвательностя молекулы цитохромов Р450 из соответствующих подсемейств семейств линейные антигенные детерминанты цитохромо гаЬР450 1А2 и гаЬ2В4 можно разделить на нескольк различных групп. Для гаЬР450 1А2 большая часьть эпитопо индивидуальны. Большинство эпмтопов гаЬР450 2В4 класифицированных как индивидуальные, являются общими дл цитохромов Р450 2В4 и 2В5. Эти два бедка представляют собо продукты двух аллельных генов с 98Ж-ой структурно; гомологией. Тем не менее, было найдено, что пять гексапеп тидов абсолютно специфичны для цитохрома Р450 2В4. Сле довательно, при проведении иммунологических анализов эти дв< белка могут различаться между собой даже несмотря на почт! полную идентичность их а/к последовательностей. Важн; отметить, что эти высоксспецифичные гексапептиды находятс! в гипервариабельных областях (0ауус1оу еЪ а1., 1932)

Антигенных гексапептидов цитохромов 1А2 и 2В4, которые

абл.9. Встречаемость антигенных детерминант цитохрома Р450 А2 кролика среди других белков из надсемейства Р450.

о мер

оследова-ельности

Структура пептида

Номер последовательности

Структура пептида

120-127 193-199 196-201 205-213 219-225 242-249 249-259

42-48

347-355

510-515

279-23В

96-101 103-113

127-132

128-137

424-429

425-430

426-431

427-432

Индивидуальные только для гаЫА2

ОНЗИТРЗР УУЗААЙУ ААЕШй ратрдвз уут?35к ЬКУЬРННР

рьенгкормаи

266-271 339-344 351-356 422-427 459-464 499-507 511-516

Видоспецифичные для гаЫА2 и 1А1

Общие для различных 1А2

КТУВЕН

кеткш

вОРЕЕЕ ЮЕТЬА МКИРИСЕНУ ЕРВРЗОб!

ЕРйРИОЙ

ЬОАУУОНАК

КРИРБР

згаоивА

Общие для подсемейства 1А

ОАЬУНО 133-142 «ААКЕКЬАЗБ

ИРОЬУг 333-338 ЬУТНРй

РОБОРУ 352-358 вКАВДРИ

ОЗОРУНААЕВ 362-367 НРеЦ,РУ

Общие для 1А2 (или СУР1А) и других семейств РЕЕЕВ.Р гаЫА2,СУРЗА,СУР73А

ЕЕЕИРЕ гаЬ1А2,СУРЗА,12А,73А

ЕЕКРЕИ гаЫА2, СУРЗА, 12А,13А,52А,

73А,83А,86А

гЕРЕЕЕ СУР1А,ЗА,12А,71А,73А,83А,

93А,СУР6С,СУР40

стречались бы в белках других семейств надсемейства итохромов Р450, найдено не было. Не обнаружено и ниверсальных для всего надсемейства цитохромов Р450 нтигенных гексапептидов. Следовательно, если для белков из внейства СУР2 и СУР1 и могут наблюдаться перекрестные ммунологические реакции внутри семейств и, вероятно, можно олучить группоспецифичные антипептидные антитела, то грекрестные- реакции между цитохромами Р450 из различных гмейств маловероятны.

Табл.10.Встречаемость антигенных детерминант цитохрома Р450 2В4 кролика среди других белков из надсемейства Р450.

Номер Структура

последова- пептида

тельности

Номер Структура

последова- пептида тельности

Индивидуальные только для гаЬ2В4

117-122 ЙЙЕЕШ 284-289 НН£Ш1Л

188-194 РОУИРУ 363-370 РРРСУРНТ

243-248 ТРЮОЗ

Еядивилуаяьнне для 2В4 я 2В5

1-6 МЕРЗП, 262-267

9-16 ЬАРЬАСЫ, 318-323 РНУТЕИ

18-25 ъьркинр 334-341 БНЕРРАБО

79-88 СОТОАШЕ 387-392 ЕУРРУЬ

105-111 БР1Ра<ЗУ 399-404 ЯУЕЕТР

122-127 ЕАЬЕда 401-406 УРЕТРН

218-223 ЕЬРРвР 407-414 ТЕРРвИРЬ

229-236 рстшога 420-427 ЬКННЕОРМ

223-228 Е1ЛШЕР 457-462 ИЕЛАЗР

242-247 гама 468-475 ЮЬТРИЕЗ

482-487 рзуа!Н

Общие дяа подсемейства 2В

41-48 вниемо!* 2В1,3-5,12 ,13

91-97 ЙАЕАРБв 2ВЗ-7,9-12

~112-117 " ~ " ЗУ1МН 2В1,2,4,6, 7,10

141-147 5УЕЕИ£} 2В1,2,4-7, 10,11,13

182-187 1УР03Ш 2В4,5,8,7, 11

212-218 РЗБЙУРЕ 2В1,2,4,5, 12

251-256 КНИАТЬ 2В1,2,4,5, 12

254-259 АТЬОРЗ 2В1,2,4,5, 9,10,12

294-299 ЗЬИРАй 2В1,2,4,6,11, 12,2А1

315-320 ЬКУРНУ 2В1-4,12,15

330-338 ЗУ^ВМ 2В1,4,5,12 ,13 Д5

393-399 ЭЗАШРЕ 2В1-5,12,13,15

412-418 НРЬОАНО 2В1,3,4,11 -13

486-473 ЕОЮЬГ 2В1,4,5,11,12 лз.гп

Общие для семейства СУР2

39-45 уьокььа в 24 Р450 из 2В,2С,2Е

124-129 ЬНИРЗЬ в 17 Р450 из 2В,,2Й,2Ь

141-150

177-182 186-192 260-266

352-358 410-415

УЕЕЕ1£)ЕЕА в 27 Р450 из 2В, 2А,2С, 2в , 23 ,

2Н, 2Ь

МИСЗ! в 12 Р450 из 2В, 2Н , 2Б

КЕ?РОУКО в 23 Р450 из 2В,2С,2Е

ЫР1Ш1 в 51 Р450 из 2А,2В,2С,2Е,

20, 2Р, 2Н

У1НЕ10Н в 26 Р450 из 2А,2В,2С,20,2Н

РОНРЬБ в 27 Р450 из 2В,2С,2Б

V. Сравнение найденных и предсказанных различными методами антигенных детерминант цитохромов Р450 1Л2 и 2В4. Полученные экспериментальные данные антигенного картирования цитохромов Р450 1А2 и 2В4 сравнивали с результатами предсказаний антигенных детерминант этих белков, выполненных с помощью 4-х наиболее распространенных методов: 1) метод антигенного индекса, в котором антигенная детерминанта рассматривается как гидрофильный, с подвижными боковыми группами, обладающий конформациями бета-поворотов или клубка, доступний для молекул воды участок полипептидной цепи (Welling et al., 1985; Jameson and Wolf, 1988). 2) Метод бета-поворотов, в котором предпочтительным свойством антигенной детерминанты считается участие в бета-поворотах (Chou S Fasman, 1987). 3) Метод поиска наиболее гидрофильных участков основан на том, что в состав антигенных детерминант входят линейные пептидные участки с жестко фиксированной альфа-углеродной цепь» (Норр 8 Woods, 1981); 4) Метод поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами (Karplus & Schulz, 1935). Предсказанные антигенные детерминанты соотнесены с суммой эпитопов цитохрома Р450 1А2, выявленных с помощью куриной и мышиной антисывороток (см. табл.7). Статистические параметры эффективности предсказаний эпитопов цитохрома Р450 1й2 кролика разными методами представлены в табл.11.Видно, что из использованных 4-х методов предсказания антигенных детерминант наименее эффективным для цитс/хрома Р450 гаЫА2 оказался метод антигенного индекса: результаты предсказаний с помощью этого метода не имеют статистической значимости. Наиболее эффективны методы поиска Фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами и оценки гидрофильности. Наибольшая точность и чувствительность предсказания антигенных детерминант были отмечены для метода бета-поворотов. В случае цитохрома Р450 rsb2B4 предсказанные антигенные детерминанты соотнесены с суммой эпитопов,

Табл.11.Статистические параметры эффективности предсказаний антигенных детерминант цитохрома Р450 1А2, выявленных с помощью мышиной и куриной антисыворотки.

Метод Распределение Статистические параметры

пред- а/к остатков

сказания по классам Чувстви- Точность

тельность

А В С Ь

1 Антиген- 53 110 88 255 2. .5 0.33 0.37

ный индекс

2 Вета- 95 79 45 237 Ъ Л 0.54 0.67

повороты

3 Гидро- 65 102 64 235 ,17 .6 0.39 0.50

фильносгь

4 Подвижность

боковых 38 128 22 328 30 ,0 0.23 0.63

цепей

Обозначения: А- число правильно предсказанных антигенных а/к остатков; В- число непредсказанных антигенных а/к остатков; С- число ошибочно предсказанных а/к остатков ; число

правильно предсказанных неантигенных а/к остатков.

Китерий Пирсона X2 расчитывали по Формуле (Лакин В.И., 1989):

х2-(г\ А0~БС( -(А+В+С+0 )/2>2( А+В+С-+0) )/(< А+В.)(СчО )(А+С ХВ+Б)); критические значения величины К2 составляют соответственно для уровня значимости 5%- 3.64; 2.5%- 5.02; IX- 6.64; 0.5%- 7.88; 0.1%- 10.83; в таблице значимые величинь критерия Пирсона подчеркнуты.

Чувствительность - отношение числа правильно предсказанных а/к остатков к общему числу а/к остатков в антигенных детерминантах, то есть А/(А+В).

Точность - отношение числа правильно предсказанных антигенных а/к остатков к общему числу предсказанных а/» остатков, то есть А/СА+С).

выявленных с помощью куриной и мышиной антисывороток (см. табл.8). Статистические параметры эффективности предсказаний линейных эпнтопов цитохрома Р450 2В4 различными методами представлены в табл.12. Из этих данных следует, что наиболее эффективными оказались методы поиска бета-поворотов и антигенного индекса. В то же время методы оценки гидрофилъности и поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами давали случайные предсказания. Анализируя данные предсказания, полученные для цитохромов

Табл.12. Статистические параметры эффективности предсказаний антигенных детерминант цитохрома Р450 2В4, выявленных с помощью мышиной и куриной антисывороток.

Метод Распределение Статистические параметры

пред- а/к остатков

сказания по классам Х2 Чувстви- Точность

тельность

А В С D

1 Антиген- 89 191 51 155 íLJ. 0. 31 0.64

ный индекс

2 Бета- 49 230 25 182 _2 0.17 0.66

повороты

3 Гидро- 9 271 12 199 2.6 0.03 0.43

фильность

4 Подвижность

боковых 32 249 39 166 0.12 0.11 0.39

цепей

Обозначения: соответствуют таковым принятым в таблице 11.

Р450 1А2 и 2В4 можно отметить, что точность

предсказательных методов в случае данных белков не превышает 67%. Эффективность каждого из методов предсказания различалась для исследуемых цитохромов Р450. Наиболее эффективным является метод бета-поворотов, он хе обладает наибольшей точностью предсказания. Таким образом для обоих цитохромов этот метод может быть использован для предсказания линейных антигенных детерминант.

VI. Расположение антигенных детерминант относительно функциональных участков цитохромов Р450 1А2 и 2В4. Расположение в а/к последовательностях антигенных детерминант цитохромов Р450 1А2 и 2В4 соотнесено с известными по литературным данным структурно-функциональными участками (рис.1 и 2, соответственно). Антигенные участки 1, 3 и 4 цитохрома Р450 1А2, выявленные с помощью двух видов антисывороток (см. табл.7) расположены в районе предсказанного домена Россмана (Третьяков и соавт., 1989), эпитопы 2 и В содержат а/к остатки Lys-ЮО и Arg-136, Arg-137, Arg-138 (Shimiau et al., 1991) участвующие во взаимодействии с цитохром Р450-редуктазой, антигенные

1: шашэреар1з уЪеЩуаау felvf^íavra 5грНурк£1к гТ.РЯРНЯНр! «»»» #######

2

51: 1йЬ1 ИЛекп рЬуйЬгвяг- £Е1рууу]ве 3Л 1-. :1кОАТ.УЕ

*** ^ +

3 4 5 6

101:МгКкеЕРР Т.УЗя^ 1 -Г.еГт НЯНТРЙРПЭЙ РУИААЕШЬА 0!Ык!зГэ1а + +++

7

151: впраееззоу 1ееЬУЗчеае п1айг?че1к аауй^ёруэ <з1УУ5ААЕУ1

8 9 10

гоивалеяопкер 0аЗееь1с!УУ ЕКЗЗКГуе1а ssgspvdffp 1ЬЕУЬР1'ШРЬ

*

11 12 13

251:еЕЕК1)ЕК£Ш 1г£1<зХТУ]ЗЕ Нуе<^с1гп31 ЙЮТЙАШ*}! векпвкапэг * *

14

301 ПрЧек^п1 УгкПГяаёГа и«а1з«51 юуЬУТИРВТЩ Е7Л9ееЦ)АУ 15 1в

351:УСЕА1ШРР1з аЕР9ЬРУ1еа Ше^г^ fvpftiphst и-гШгШП!

17

401:1ркесс1;Е5.п я^ппЬёрч! «<30РЕЕЕЕРЕ ЙЕиас^&а! пкр1зекуи

.....- ■ ■ »

18

451^й1гкггсГ6 ЕТЬАгвеу« Паз.11яг1е fsvppgvpvd ир1уйПИК

И Н +4@НН + $$$$ $$$$$$$$$$ $$$$$$$

19 20

501:НРЕСЕНУдаЯ РЯВЗОД

Рис, 1. Расположение выявленных антигенных детерминант помощью мышиной и куриной антисывороток и структурно функциональных участков цитохрома Р450 1А2. Обозначения заглавные латинские буквы - а/к остатки из антигенных детер минант (арабскими цифрами обозначены номера эпитопов); <# - участок "мультимерного" трансмембранного якоря ; <$> участок связывания с поверхностью мембраны; подчеркну предсказанный домен Россмана;<@> - Сув-458 (пятый аксиальны лиганд атома железа гема); <н> - а/к остатки, участвующие формировании гемового кармана; <+> - остатки лизинов аргининов, участвующие во взаимодействии с цитохромом Р450 редуктазой и в процессе переноса электронов соответственно <*> - участки отвечающие за связывание субстратов.

12 3 4

1: МЕРЗЫЛ1ЬА ИЛвЬиШ? В0НРКа^г1

$$$$$$$$$$ $$$$$$$$$$ + + -И- + ++-++

5 6 7

51: 1Пге <53грухх1С£ ТОА1ЕЕд1М_адЕАЕ2.8КСк

***

8 9 10 11

101: ДЛУШЫЕСК; УвУтШЕН «НАЬЕШЗЬа гтгс^тйкг ь-УЕЕИЙЕЕА

12 13 14

151: ЕСЬУЕЕ1гкз ква11с1п1Л1 {'Ьвз^зНПС ЭтСККЕБУ КЛЭРУПгПс!

*

15 16 17 18 19

201 : зЕЗЗС1УЕЕ1,Е РСРШ^РСТ НЯв1Угп1че 1МТР1С03уе

***** *********

20 21

251: кЬга"ЬЮР£Н РЕОРЮУуИ гиекс1кзс1ра эеРНВДНЫ! tvlslffagt

***************

22 23 24 ШиЛКУРНУ ТЕЙудке^еЭ 71<;5ННРРАЪ ОййАКМРУгё

*****

25 26 27 28 29

351 :аУ1НЕ19КЬ^ сШРГСУРНГ у!кОТйРЕСу у^ркпЪЕУРР УЬБЗАЬШРР.

30 31 32 33

401: УРЕТРИТЕНР ОНРЬСАНОаЬ КШШ^МРРЗ lgkriclgeg iartelflff

34 35 36

451: ЗРуррЕОЮЬ ТРИЕЗСУСпУ РРЗУЕИгПа г

Рис.2. Относительное расположение антигенных детерминант и структурно-функциональных участков цитохрома Р450 2В4. Обозначения: заглавные латинские буквы - а/к остатки из антигенных детерминант (арабскими цифрами обозначены номера эпитопов); <$> - мембрансвязанный фрагмент; <+> - положительно заряженный кластер; <+> - пролиновый кластер; <#> - предсказанные участки взаимодействия с редокс-парт-нерами; <@> - консервативный пептид, включающий 5-ый аксиальный лиганд гема (Суз 436); <*> - предсказанные субстратсвязнвающие участки; подчеркнуты - предсказанный домен Россмана.

детерминанты 10 и 11 совпадают с участками, еодержащт а/к остатки Lys-250, Gly-251, Phe-253, играют

ключевую роль в определении субстратной специфичности P4i 1А2 (Krainev et al., 1992), антигенный участок 18 содераз а/к остатки Ile-458, Gly-460, участвующие в Формирован! гемового кармана (Shimisu et al. , 198S). Антигенные участь цитохрома Р450 2В4, выявленные с помощью мышиной и куринс антисывороток (см. табл. 8) 1 и 2 расположены в облает мембрансвязанного фрагмента (Tretiakov et al., 1989; Uvarc et al., 1994), эпитоп 3 находится в районе положительь заряженного кластера (Sakaguohi et al, 1994), антигеннг детерминанта 4 - в области пролинового кластера (Sakaguch et al., 1994), эпитопы 4, 5, 6, 7 и 8 локализуются в облает предсказанного домена Россмана (Третьяков и соавт., 1989) антигенные участки 5, 8, 9, 10 и 11 находятся предсказанных участках взаимодействия с редоке-партнерам (Davydov et al., 1992), а эпитопы 7, 21, 26, 27 и с локализуются в предсказанных субстратсвнзываюших участка (Gotoh, 1992; Korzekwa and Jones, 1993). Таким образом некоторые антигенные детерминанты цитохромов Р450 1А2, особенно, 2В4 располагаются в Функционально важных ег участках, расположенных на поверхности, что дае

возможность получать антипептидные антитела к ним для боле точного установления роли данных участков в функционировани цитохромов Р450.

VII. Сравнительный анализ поверхности холо- и аро-фор цитохрома Р450 2В4. Известно, что антигенные детерминант белка располагаются в основном на поверхности молекул (Green et al., 1982). Для того, чтобы выяснить, ка изменение конформации белка влияет на структуру его линейны антигенных детерминант и тем самым оценить возможност использования данных антигенного картирования для изучени динамики поверхности молекулы белка, нами были сопоставлен; полученные методом пептидного сканирования антигенные карт: холо- и апо-форм цитохрома Р450 2В4.

Определение линейных антигенных детерминант апоцитохрома Р450 2В4. Для полного антигенного

картирования апофермента цитохрома Р450 2В4 были использованы ранее синтезированные гексапептиды цитохрома Р450 кролика. Антигенная активность каждого из этих гексапептидов определялась с помощью ELISA при взаимодействии с поликлональной куриной антисывороткой к апоцитохрому Р450 2В4 при трех ее разведениях: 1:2000, 1:1500, 1:1000 и при таких же разведениях контрольной сыворотки. При разведении 1:1500 и особенно 1:1000 IgG из контрольной сыворотки связывались с рядом гексапептидов неспецифически. Найденные после соответствующей

статистической обработки результатов антигенные гексапептиды представлены в табл.13. В табл.14 приведены данные о числе антигенных гексапептидов, антигенных зон и аминокислотных остатков в составе этих антигенных зон при различных разведениях антисыворотки. Видно, что число найденных антигенных гексапептидов при разведениях

антисыворотки 1:2000 и 1:1500 остается практически неизменным, тогда как при дальнейшем уменьшении разведения антисыворотки до 1:1000 это число увеличивается. Следовательно, разведение антисыворотки 1:2000, по-видимому, является оптимальными для определения линейных антигенных детерминант апоцитохрома Р450 2В4, поскольку при этом выявляются все возможные пептиды и не наблюдается неспецифического взаимодействия пептидов с контрольной сывороткой. Непрерывные антигенные участки апоцитохрома Р450 2В4 представлены в табл.15. Таким образом, при антигенном картировании полной а/к последовательности апоцитохрома Р450 2В4 было найдено 20 линейных непрерывных антигенных детерминант длиной от 6 до 8 а/к остатков. В состав найденных эпитопов входит 114 a/'к остатков, что составляет 23% от общего числа в белке.

Табл.13. Антигенные гекеапептиды апоцитохрома Р450 2В'

кролика, выявленные с помощью куриной антисыворотки

Расположение Структура Разведение антисыворотки

гексапептида гексапептида —

1: :1000 1 : 1500 1:2000

28-33 6М,РРС +

32-37 РЙРБРЬ - -

33-38 вРЭРЬР 444 - -

37-42 ЬРУХСН + - -

39-44 УЬЙКЫ. +44 + 4 44

61-66 КУЙВУЕ + - -

62-67 УЭРУРТ ++ 44 -

64-69 ОУРТУУ - 4 + -

73-78 ИРУУУ! +4 - -

74-79 РУУУЪС +++ - -

76-81 УУЬСЙТ + 4 4

77-82 УЬС&ТБ - - 44

94-99 АРЗбйС ++ 44 44

114-119 1ЕАН0Е - - 4

115-120 ЕА№ЕК - 4 -

128-133 БЬАТИЕ +++ 444 44+

146-151 1£}ЕЕАЕ 444 444 44

180-185 С51УЕ0 444 444 444

189-194 тКЪ?У - - 4

208-213 ЫБЗЕБ + 4 4

231-236 Н!Я01У!1 + 4 4

235-241 УЕНЬЙЕ +44 4 4

240-245 Е1МГЕ1 4 4 4

241-246 44 44 44

244-249 Еюазу +4 44 4

265-270 ючхьь 4 4 4

274-279 КБКЗРР 4+4 - -

303-308 тэгай 44 44 44

313-318 ЬМООТ 4 4 4

334-339 2НЕРРА 4 4 4

335-340 НЙРРАЕ + 4 4

348-353 УТОАУ1 444 444 444

381-386 У1РКНТ 4 + 4

383-388 РКНТЕУ 4 4 4

384-389 ОТЕУЕ 4 4 4

385-380 НТЕУРР 4 4 4

388-393 УЕРУЬЗ 4 - -

401-406 УЕЕТРМ 44 44 44

402-407 ЕЕТРНТ 4 4 4

Н+з; "+": А-зоо > М+з ; "44": А-405 > Н+2з;

"+++": А4ОЕ> > М+Зз .

Табл.14. Число непрерывных антигенных детерминант.антигенных гексапетидов и аминокислотных остатков в составе антигенных детерминант апоцигохрома Р450 284 кролика, выявленных при различных разведениях куриной антисыворотки.

Номер Антигенный Разведение антисыворотки в отношении элемент 1:1000 1:1500 1:2000

1 Непрерывная 23 20 20 детерминанта

2 Гексапептид 34 25 25

3 А/к остаток 143 114 114

Сравнение антигенных карт холо- и апо-форм цитохрома Р450 2В4. Сопоставление результатов антигенного картирования холо- и апо-форм цитохрома Р4 50 2В4 указывает на значительные различия в их антигенных свойствах. В апоцитохроме 2В4 поверхность молекулы проявляет меньшую антигенность, чем в холо-Форме этого белка. В апо- Р450 2В4 выявлено только 20 линейных антигенных детерминант, в состав которых входит 23% а/к остатков, в то время как нативннй цитохром Р450 2В4 содержит 33 линейные антигенные детерминанты, охватывающие 49% последовательности. При этом 31% а/к остатков антигенных детерминант апоцитохрома входят в состав таковых нативного Р450 2В4, а 25% антигенных детерминант апофермента полностью совпадает с детерминантами холо-цитохрома (табл.13). Помимо общих, выявлены также линейные В-эпитопы, специфичные для каждой из форм белка. Следует отметить особенности локализации линейных антигенных детерминант в каждой из форм цитохрома Р450 2В4. Так, в нативном цитохроме Р450 2В4 в области мембранного фрагмента выявляются антигенные детерминанты , тогда как в апоферменте Р450 2В4 данный участок не обладает антигенностью. Наблюдается также полное отсутствие эпитопов в области С-конца (начиная с 408 а/к остатка) в апоферменте, б то время как в нативном цитохроме Р450 2В4 в этой части молекулы найдено 7 линейных антигенных

Табл.15. Непрерывные антигенные детерминанты апоцитохром; Р450 2В4 кролика , образованные перекрывающими«:: гексапептидами, выявленные с помощью куриной антисыворотки

Номер Расположение1 Длина2 Структура

1 39-44 6 УЬвНЬЬ

2 62-87 8 УЙОУЕТ

3 76-81 6 УУЬСвТ

4 94-99 6 АРЗОКО

5 128-133 6 ЗЬАТН!!

е 146-151 6 .ШЕЕАИ

7 180-185 6 СБтв

а 208-213 6 ЫВБРБ

9 231-236 6 Н{ШУ1<

10 235-241 8 УЙИЬОЕ

и 240-246 7 Е1НТЕ1С

12 244-249 6 РЮЗЗУ

13 265-270 6 ЮУУЬЬ

14 303-308 6 ТБТТЫ?

15 313-318 6 ЬШЖУР

16 334-340 7 БНКРРАЬ

17 348-353 6 УТОАУ1

18 381-386 6 У1РКНТ

19 383-390 8 РКНТЕУЕР

20 401-407 п * УРЕТРНТ

1> номера соответствуют положениям в а/к последовательности цитохрома Р450 кролика М- и С-концевых остатков; 2> число а/к остатков;

подчеркнуты антигенные детерминанты, которые полность совпадают с антигенными детерминантами нативного цитохром Р450 2В4.

детерминант. Таким образом, конформационная перестройк молекулы цитохрома Р450 2В4, происходящая в результат удаления тема (ТгеЬ1акоу &1, 1989), приводит

значительному изменению антигенной структуры этого белка Выявляемые линейные антигенные детерминанты, специфичные дл одной из форм цитохрома Р450 2В4, могут быть использован для получения соответствующих специфичных антипептидны антител, которые позволят количественно определят содержание той или иной формы белка.

8ВВ0ДН.

1. Получены антигенные карты эукариотических шкросомальных цитохромов Р450 1А2, 2В4 и апоцитохрома P45Q !В4 методом пептидного сканирования.

2. Сравнение антигенных детерминант цитохромов Р450 1А2 и 2В4, выявленных с помощью мышиной и куриной нтисыБороток, показало наличие общих и видоспецифичных нтигенных участков. Это позволяет представить антигенные :арты цитохромов Р450 в двух вариантах: а) "антигенное дро", включающее в себя общие антигенные участки, ыявленные с помощью как мышиных, так и куриных антител; б) олная антигенная карта, включающая в себя все антигенные частки.

3. Изменение конформации цитохрома Р450 2В4 при далении гема приводит к изменению антигенной структуры того белка: в апо-форме Р450 2В4 по сравнению с нативным ерментом наблюдается уменьшение количества выявленных нтигенных детерминант, появление новых, и только 25% нтигенных детерминант ano-фермента полностью совпадают с аковыми нативного цитохрома P45Q 2В4.

4. Обнаружено наличие некоторых антигенных ексапептидов цитохромов Р450 1А2 и 2В4 среди других белков емейства CYP1 и CYP2 соответственно, что позволяет редположить возможность существования перекрестных ммунологических реакций между цитохромами Р450 внутри этих емейств.

5. Сравнение полученных экспериментальных результатов нтигенного картирования цитохромов Р450 1А2, 2В4, с данными редсказаний антигенных детерминант для этих же белков оказало, что метод поиска бета-поворотов может быть :пользован для предсказания антигенных детерминант -1TOXPOMOB Р450.

6. Показано, что некоторые антигенные детерминанты itoxpomob Р450 1А2 и 2В4 находятся в функционально важных 5ластях этих белков, что позволяет получать антипептидиые ■¡титела к таким областям.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kolesanova, E.F., Kozin, .. S. А . , Kiselar, .J.G. anc Arcbakov, A.I.- Comparison of' epitope structures oi microsomal arid nicrobial cytochromes P450 as a basis foi spatial molecular modelling the microsomal P450s. In: Abstr. 10th Int. Symp. on Microsomes and Drug Oxidation, Toronto, Canada, 1994, p. 444.

2. Kolesanova, E.F., Kiselar, J.G., Kozin, S.A., Archakov, A.I. - Antigenic properties of cytochromes P45( revealed by peptide scaning. In: Abstr. 9th Conf. Cytochrome P450: Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Zuerich, 1995, p. 172.

3. Kolesanova, E.E., Kozin, S.A., Kiselar, J.G.; Archakov, A.I.- Antigenic napping of cytochromes P450. In Abstr. 3rd Int. Conference ori Molecular Recognition. Singapore, 1995, p. 175.

4. Kolesanova, E.F., Kiselar, J.G., Archakov A.I. Antigenic mapping of cytochromes P450: an insight ii practical application. In: Abstr. Xlth Int. Syap.o! Microsomes and Drug Oxidations, Los Angeles, USA, 1996, p 225.

5. Kolesanova, E.F., Kiselar, J.G., Jung C., Ko2iri S.A., Hui Bon Hoa, G., Archakov, A.I. - Antigenic mapping o: bacterial and animal cytochromes P-450. Biochimie, 1996, 78 pp. 752-762.

6. Киселарь Ж.Г., Кслесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенное картирование микросомальных цитохромов Р450 Тезисы 2-го съезда Биохимического общества РАН, Москва 19-2: мая 1997, с.