Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В4

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В4"

:/ Г " ОД 1 3 <ptfl 1315

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БИОМЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

УДК 576.80/85 УДК 577.15.158

КОЗИН Сергей Александрович

ЛИНЕЙНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ЦИТОХРОКОВ Р450 101 И Р450 2В4.

(специальность 03.00.04 - биологическая химия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1995

Работа выполнена в НИИ биомедицинской химии

Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители:

академик РАМН, профессор Арчаков А.И.

к.б.н. Колесанова Е.Ф.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Елисеева Ю.Б.

кандидат химических наук Иванов B.C.

Ведущая организация: Институт иммунологии ИЗ РФ

Защита диссертации состоится "2. " МАр/ 1995 года в I & часов на заседании специализированного Ученого Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул.Погодинская, д.10

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан

1995

года

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета, кандидат биологических наук

Ларионова Т.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Цитохромы Р450 относятся к внешним гемсодержащим монооксигеназам (ЕС 1.14.4.-) и образуют надсе-мейство из около 200 родственных генов со степенью гомологии кодируемых ими аминокислотных (а/к) последовательностей от 10 до 95%. Белки с гомологией первичных а/к последовательностей свыше 40% объединены в семейства, а свыше 46% - в подсемейства fl]. 1п vivo цитохромы Р450 являются наиболее мощными агентами, которые катализируют окислительный метаболизм самых разнообразных химических соединений эндо- и экзогенной природы, встречающихся в живых клетках. Этими цитохромами обладают все аэробные организмы. Только строго анаэробные прокариоты обходятся без Ферментов-Р450 £2,3,4J.

Наиболее изученными из цитехромов Р450 является водорастворимой бактериальный Р450 101 (Р450сап) и мембрансвязанный микро-сомальный Р450 2В4. Для цитохрома Р450 101 имеются кристаллографические данные о пространственной структуре как собственно самого белка, так и его комплексов с субстратом, аналогами субстрата, а также с ингибиторами каталитической активности [5,6]. Прямых данных о пространственйой структуре цитохрома Р450 2В4 нет, поэтому структурно-Функциональные соответствия для него были установлены косвенными путями.

Вследствие своей важной биологической роли и благодаря наличию большого числа гомологов надсемейство цитохромов Р450 является популярным объектом для изучения теоретических и прикладных аспектов структурно-функциональных зависимостей в белковых молекулах. Для выяснения этих зависимостей наряду с другими экспериментальными методами исследований может быть использован метод пептидного сканирования PEPSCAN [7.8], который является наиболее эффективным способом определения антигенных детерминант.

[1] Nebert et al.,, 1991, DMA and Cell Biology, 10, 1-14.

[2] Archakov and Bachnanova, 1990, Cytochrone P450 and Aotive Oxygen, Suppl. Taylor & Francis, London-New York-Philadelphia.

[3] Guengerich, 1993, American Scientist, 81, 440-447.

£4] Koynans et al., 1993, Drug Metabolisn Reviews, 25 (3), 325387.

[5] Poulos et al, 1987, J. Mol. Biol., 195, 687-700.

[6] Poulos, 1991, Heth. Enzyn., 203, 11-13.

[7] Geysen et al., 1984, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 1984, 81, 3998-4002.

[8] Geysen et al., 1987, J. Iwnunol. Heth., 102, 259-274.

Антигенные детерминанты (эпитопы) нативного белка являются теми его участками, на которые вырабатываются и с которыми связываются во время иммунного ответа специфические антитела. В большинстве случаев синтетические пептиды, идентичные линейным антигенными детерминантам, вызывают образование реагирующих с родительским белком антипептидных антител [9,10]. Такие пептиды могут быть использованы для получения антител, специфически реагирующих с соответствующими участками белков и, следовательно, могут служить основой для создания синтетических вакцин, новых диагностических систем, конструирования аналогов гормонов и модуляторов Фермент-субстратных взаимодействий, а такхе использоваться в структурно-функциональных исследованиях белковых молекул [11,12,131. Таким образом, получение информации об антигенных детерминантах нативного белка (антигенное картирование) является важной стадией для решения целого комплекса как теоретических, так и прикладных задач биомедицинских исследований.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось полное антигенное картирование прокариотического цито-хрома Р450 101 и эукариотического цитохрома Р450 2В4 методом пептидного сканирования PEPSCAN с последующим соотнесением полученных экспериментальных данных с известными структурно-функциональными областями исследуемых цитохромов, а такхе сравнением антигенных структур этих белков между собой. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Методом пиновой технологии синтезировать пептиды для антигенного картирования цитохромов Р450 101 и Р450 2В4.

2. Посредством ELISA-экспериментов определить способность синтезированных пептидов связываться с антисыворотками к цнто-хромам Р450 101 и Р450 2В4 и по этим данным выявить линейные антигенные детерминанты исследуемых белков.

3. Выявить расположение антигенных детерминант относительно известных структурно-функциональных элементов исследуемых белков.

[9] Heloen et al., 1991, Ann. Biol. Clin., 49, 231-242.

[10] Pellequer et al., 1991, Meth. enzyn., 203, 176-201.

[11] Atassi, 1984, Eur. J. Biochea., 145, 1-20.

[12] Arnon, 1986, Trends Biochen. Sei., 11, 521-524.

[13] Milich, 1989, Advances in Innunology, 1989, 45, 195-282.

4. Сравнить экспериментальные данные об антигенных детерминантах цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 с данными, полученными с использованием различных методов предсказаний.

Научная новизна и практическая значимость работы. Научная новизна предлагаемой работы состоит в том, что для цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 методом пептидного сканирования были определены линейные антигенные детерминанты. Результаты проведенного исследования могут быть использованы в целях получения антипептидных антител, взаимодействующих с определенными участками цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 и, следовательно, могут служить основой для создания новых диагностических систем, модуляторов фермент-субстратных взаимодействий, а также использоваться в структурно-функциональных исследованиях цитохромов надсемейства Р450. Полученные данные могут быть использованы и для разработки новых методов предсказания антигенных детерминант белков, а также для компьютерного моделирования процесса укладки полипептидных цепей в пространстве.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 8-ой Международной конференции по биохимии, биофизике и молекулярной биологии цитохрома Р450 (Португалия, Лиссабон, 1993), на 10-ом Международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Канада, Торонто, 1994) и на международных конференциях "Chemical Diversity" и "Drug Design" (США, Сан-Диего, Калифорния, 1994). Апробация диссертации состоялась на научной конференции лабораторий НИН биомедицинской химии РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, включая 15 таблиц и 12 рисунков, и состоит из следующих основных разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение", "Выводы", "Список литературы".

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Оксобензотриазиновые эфиры Fuoc-защищенных L-серина и L-треонина, пентафторфениловые эфиры остальных Fnoc-а-Ь-амино-кислот, а также блоки полиэтиленовых игл с привитым амидным носителем для твердофазного синтеза пептидов являются продуктами фирмы "Canbridge Research Biochenicals" (Нортвич, Великобритания). Антисыворотка мыши к цитохрому Р450 2В4 была любезно предоставлена О.Г.Гребенщиковой (ИБМХ РАМН, лаб. белковой инженерии). Гомогенный препарат цитохрома Р450 101 из Pseudomonas put id в. был любезно предоставлен доктором C.Jung (Берлин, ФРГ).

Антисыворотки к цитохрому Р450 101 были получены путем иммунизации кроликов. Контрольные сыворотки получали отбором крови у тех же кроликов за неделю до первой иммунизации. Специфическое взаимодействие полученных антисывороток с нативным цитохромом Р450 101 устанавливалось путем иммуноферментного адсорбционного анализа. Аналогично проверяли отсутствие антигенсвязывающей активности у контрольных сывороток.

Синтез связанных с твердофазным носителем пептидов проводили методом активированных эфиров по пиновой технологии фирмы "Canbridge Research Biochenicals" (Нортвич, Великобритания) [14]. Синтезированные пептиды были закреплены на поверхности полиэтиленовых игл, объединенных в блоки по 98 штук с габаритами стандартных иммунологических планшетов. Для исчерпывающего выявления антигенных детерминант исследуемого белка синтезировали совокупность из перекрывающихся с шагом в один а/к остаток следующих гексапептидов: первый гексапептид соответствует Н-концу а/к последовательности цитохрома, а последний является ее С-концом, каждый из остальных гексапептидов представляет собой такой линейный участок а/к последовательности белка, что его порядковый номер совпадает с порядковым номером а/к остатка, являющегося Н-концом соответствующего гексапептида. Контроль правильности синтеза был проведен путем а/к анализа выборочных пептидов на а/к анализаторе LKB (Упсала, Швеция).

Исследования антигенной активности синтезированных пептидов проводили с помощью иммуноферментного сорбционного анализа

[14] Epitope napping and the deternination of antibody spécificités [200010/IBM], Tech. doc. of "Canbridge Research Biochenicals".

(ELISA) с использованием пероксидазы хрена в качестве ферментной метки для вторичныхх антител. Для измерения оптической плотности (А405) при проведении ELISA был использован многоканальный спектрофотометр "Multiscan-Plus" (Labsystems, Финляндия). Проблема отсечения значимых сигналов от фоновых при определении антигенных детерминант по профилю интенсивности обычно решается следующим образом: рассчитывается среднее значение интенсивности по профилю (Н) и стандартное среднеквадратичное отклонение от среднего (s). Значимыми считаются те сигналы, величины которых превышают среднее значение на 0,7s [10]. По аналогии с вышеприведенной процедурой связывание с данной сывороткой (или антисывороткой) отдельного пептида исследуемой выборки считалось установленным в том случае, если для этого пептида выполнялось условие: Й405 > M+s. В противном случае считалось, что анализируемый пептид не связывается с данной сывороткой (или антисывороткой). Необходимые статистические расчеты выполнялись с использованием стандартных средств программы "SignaPlot" на IBM-совместимом компьютере РС-ХТ "Amstrad-1640".

Сведения о первичных а/к последовательностях цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 были получены из специализированной базы данных CPD [15]. Анализ расположения антигенных детерминант на трехмерной структуре цитохрома Р450 101 был сделан с помощью программы 0HIX [18]. Предсказания антигенных детерминант были проведены с помощью программ AIDX и ESC [17].

, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Антигенное картирование цитохрома Р450 101. •

Результаты ELISA при сканировании гексапептидамн полной а/к последовательности Р450 101. Для полного антигенного картирования цитохрома Р450 101 по методу PEPSCAN было синтезировано 409 перекрывающихся со сдвигом рамки в 1 а/к остаток гексапептидов из а/к последовательности этого белка. Антигенная активность, то

[15] Archakov et al., 1992, Cytochrome P450: Biochenistry and Biophysics (Archakov, A.I., Bachnanova, G.I., Eds.), 673-879, INCO-TNC, Moscow, Russia.

[16] Программный продукт лаборатории по использованию выч. техники в биохимии, ЙБМК РАМН, зав.лаб. Иванов А.С., 1994.

[17] Dedinsky I.R., Kozin S.A., Archakov A.I., 1994, Proc. of 8th Int. Conf. on Cytochrome P-450 Biochen., Bioph. and Mol. Biol., Lechner M.C. (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 803-610.

есть связывание с первичными антителами, каждого из синтезированных гексапептидов определялась с помощью ELISA при взаимодействии с одним и тем же образцом антисыворотки к нативному ци-тохрому Р450 101 при разведениях 1:4000, 1:2000, 1:1000, 1:700, 1:400. Результаты ELISA приведены на рисунке 1 (а-д). Данные ELISA о взаимодействии синтезированных гексапептидов с контрольной сывороткой при этих же разведениях показали наличие одинакового для всех анализируемых гексапептидов среднего фона оптической плотности на уровне 0,075 единиц, т.е., по сути дела, отсутствие связывания гексапептидов с контрольной сывороткой при данных разведениях. После статистической обработки результатов ELISA были выявлены гексапептиды, которые связывались с антисывороткой при соответствующих разведениях. Такие пептиды были признаны антигенными и представлены в таблице 1. А/к остатки, входящие в состав антигенных гексапептидов, образуют непрерывные антигенные детерминанты, представленные в таблице 2. В таблице 3 приведены данные о числе антигенных гексапептидов, антигенных детерминант и а/к остатков в составе антигенных детерминант, выявленных при различных разведениях антисыворотки. Из этих данных следует, что при увеличении концентрации антисыворотки (соответственно, при уменьшении разведения с 1:4000 до 1:400) число выявленных антигенных гексапептидов сначала увеличивается, а затем, начиная с разведения 1:1000, остается неизменным. Подобная зависимость может быть объяснена тем, что по мере увеличения концентрации антисыворотки выявляются антигенные гексапептиды с меньшей иммунодоминантностью, чем те, которые были определены при минимальных концентрациях антисыворотки. При достижении оптимальных условий иммунологического анализа выявляются уже все возможные гексапептиды, которые реагируют с антителами из данной антисыворотки, и число таких пептидов остается постоянным при дальнейшем увеличении концентрации антисыворотки. Таким образом, при антигенном картировании полной а/к последовательности цитохрома Р450 101 было выявлено восемнадцать линейных антигенных детерминант длиной от в до 11 а/к остатков. В состав найденных антигенных детерминант входит 128 а/к остатков, что составляет 31% от их общего числа в белке.

3,0 2,0 1,0 -0

0

I ЧШ *!ЯМП1*рргг тчтп» ' ЩГЧИЖ*"

(О)

М + 8

100

гоо

300

400

1,0

0,5

I

100

200

300

11 + 3

400

2,0 -! 1.0 I

X

^00

200

300

¡ей)

М+в

400

3,0 2,0

1

100

гоо

300

(Ю

М+з

400

1,0

0,5

0 -Р

(9)

М + в

, „ 0 100 200 300 400

Рисунок 1. Связывание гексапептидов цитохрома Р450 101 с

антисывороткой при разведениях 1:400 (а), 1:700 (б), 1:1000 (в),

1:2000 (г), 1:4000 (д). По оси абсцисс каждого графика показан

номер пептида, по оси ординат - оптическая плотность при 405 нм.

Порядковый номер пептида совпадает с порядковым номером его

Н-концевого а/к остатка в первичной последовательности белка.

О

Таблица 1. Антигенные гексапептиды цитохрома Р4.*|Л 1щ

# Антигенный гексапептид Связывание» с антисывороткой, разведенной- в отношении

Положение. 'Н-конца А/к„последо-• вательность

1:400 1:7001 1:1000 1:2000 1:4000

1 54 У«ТЕ?СН +++ +4-4 +++ +++ +++

2 63 Н1АТ (Ю + 4 + + +

3 64 ХАТЕЮв + + + 4+4 + +++

4 65 АТЕйаЬ + + 4 + +

5 67 кйдьп? + 4 + ++ 4

6 108 ОПОРИА + ++ 4 ++ +

7 109 + 4-4- 4 + -

8 110 £№Е!А1,А + + 4 + -

9 111 РНАЬАН 4- + 4 + -

10 112 НАЬАИ9 + 4 4 + -

11 122 РУУОКЬ + 4 +4-4- +4 + -

12 141 эькрдо + 4- 4 +++ +

13 149 ПЕТЕРУ + + 4 - -

14 174 1РНЬКУ + + + + +

15 181 ТБОИТВ 4+ 4-4- 4- - -

16 182 РОИТИР + 4 + +++ +++ + -

17 183 дитиро + + + +4 - -

18 212 ¡ШРСТ + 4- 4 + +

19 225 НОЗУНО + + 4 - -

20 228 СаУНвИ + 4 4 + + +

21 227 0У1ШР +++ 4+4- +++ +++ ++ +

22 228 +++ 4++ + + 4+ +

23 229 тирп +++ ++ + ++ +++ +++

24 230 вИРПв 4 + + + + + +

25 263 ЕЬАКЗР + + 4 + ++

26 298 вМЬТБ 4 4 4 + +

27 308 нвудьк ++4 + + + + +++

28 309 вУЧЬКК + + 4 ++ +

29 310 уаьккв 4 + + + 4 + ++

30 311 дытео +++ ++ + ++4 + 4+ +++

31 312 +++ + + + +4-4 +++ + 4+

32 313 ккооах + + + + + + + 44 ++ +4+

33 322 + + 4 - -

34 360 ОНЬАЕШ 4 + 4 + +

35 367 ПУТЬК + + + 4 + 4

36 395 тбУб 4 4 + 4 + +

37 407 РРАТТК 4 + ++ ++ + +++

») "-": Й406 < М+б; " + ": Ачюъ > М+Б, "++" Алое > М+2э; "+++": А408 > М+Зэ.

Таблица 2. Непрерывные антигенные детерминанты цитохрома Р450 101, образованные антигенными гексапептидами.

Номер Расположение® Длина6 Последовательность

I 54- 59 6 VWTRCH

II 63- 72 10 »IATRGQLIR

III 108-117 10 - QRQFRALANQ

IV 122-127 6 PVVDKL

V 141-146 6 SLRPSG

VI 149-154 6 HFTEDY

VII 174-179 6 IPHLKY

VIII 181-188 8 TDQMTRPD

IX 212-217 6 RQKPGT

X 225-235 11 HGQVHGRPITS

XI 263-268 6 FLAKSP

XII 298-303 6 GRILTS

XIII 308-318 11 HGVQLKKGDQI

XIV 322-327 6 QMLSGL

XV 360-365 6 QHLARR

XVI 367-372 6 IIVTLK

XVII 395-400 6 IVSGVQ

XVIII 407-412 6 DPATTK

номера соответствуют положениям в а/к последовательности цитохрома Р450 101 И- и С-концевых а/к остатков. е) число а/к остатков

Таблица 3. Число выявленных непрерывных антигенных детерминант, антигенных гексапептидов и а/к остатков в составе антигенных детерминант цитохрома Р450 101 при различных разведениях антисыворотки.

# Антигенный Разведение антисыворотки в отношении

элемент 1:400 1:700 1:1000 1:2000 1:4000

1 Непрерывная детерминанта 18 18 18 16 14

2 Гексапептид 37 37 37 32 26

3 А/к остаток 128 128 128 114 92

Результаты ELISA при сканировании три-, тетра- и пентапеп-тидами выборочных участков а/к последовательности Р450 101.

Известно, что антигенную активность могут проявлять не только гексапептиды, но и более короткие пептидные фрагменты [18]. методом мотивов [17] в а/к последовательности цитохрома Р450 101 были предсказаны три-, тетра- и пентапептиды, которые могли бы

[18] Briggs et al., 1993, Eur. J. Cancer, 29A, 230-237.

'проявлять антигенную активность. Все эти пептиды были синтезированы и' проверены на связывание с антисывороткой так же, как и гексапептиды. В результате было найдено, что с антисывороткой связываются следующие пептиды (номера обозначают положение Н-концевого а/к остатка соответствующего пептида): трипептид 230 (GRP); тетрапептид 308 (HGVQ); пентапептиды 141 (SLRPQ), 142 (LRPQG), 143 (RPQGQ) и 313 (KKGDQ). Найденные пептиды являются составными частями антигенных детерминант, выявленных с помощью перекрывающихся гексапептидов. Характерным примером является антигенная детерминанта XIII (308-318) HGVQ1KKGDQ1, в составе которой обнаружены неперекрывающиеся антигенные тетра- и пентапептиды соответственно на ее Н- и С-концах. Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях проведения ELISA с антителами могут связываться три-, тетра- и пентапептиды из состава антигенных гексапептидов. Вопрос о том, могут ли такие короткие пептиды быть эпитопами нативного белка, остается открытым [10].

Соответствие выявленных антигенных детерминант элементам вторичной структуры цитохрома Р450 101. На рисунке 2 показано расположение антигенных детерминант относительно элементов вторичной структуры цитохрома Р450 101. Из 18 антигенных детерминант две антигенные детерминанты (VII,XV) лежат на концах альфа-спиралей F и L; одна антигенная детерминанта (XVIII) имеет неупорядоченную конформацию клубка и расположена на С-конце а/к последовательности; одна антигенная детерминанта (XVII) расположена в середине бета-листа Ь5; одна антигенная детерминанта (XVI) расположена в середине альфа-спирали L; остальные 13 антигенных детерминант цитохрома Р450 101 находятся в местах перехода элемента одной вторичной структуры в элемент другой вторичной структуры. Таким образом, 18 антигенных детерминант (90% от общего числа) цитохрома Р450 101 расположены в местах перехода различных элементов вторичных структур друг в друга или же в непосредственной близости от таких мест. Этот Факт можно использовать для уточнения существующих предсказательных методов.

Доступность а/к остатков антигенных детерминант цитохрома P4S0 101 для молекул воды. Антигенные детерминанты должны располагаться на поверхности белка. Для цитохрома Р450 101 существуют кристаллографические данные о его трехмерной структуре [5],

10 20 30 40 50

1: ¿ЪеЪ 1чгпап 1ар 1ррЬуреЫу?й1Гс1тупр5п1ззй,/яеаяау1дезпу

@@@@@ @@@@@@@@ @@ < д->----

I. 60 II. 70 80 90 100 51: рс11УКТКСНбёЬК1АТКС9Ь1Неауес1угЬГваесрГ 1ргеайеаус1? 1р а [ ь г-----_ ] <В-> <->@@@@@@@<В'->@~~~

. III IV . 130 . V VI

101: Ьз1^рре8Н0Ка&ЬАНвууётРт>К1.епг1че1ас£;11е31.НРеСдсНР

<С-—-> <Р-> ГЬ5=]

160 . 170 VII VIII. 190 . 200 151: ТЕБУаерГр1г1Гга11ай1рееа1РНЬК?1ТРеМТКРОё5ю1Гаеакеа1

<Е-:-■>" ->@@@@@@@<0-

** *ж

IX 220 X 230 . 240 . 250

201: увуИрНедгН0Ы,СТ0а1Б1УаНедУгНеНР1Т5аеа){гвсз111уйа1

->@@@@<Н->[Ь2~~~=]<1-

XI. 270 . 280 . 290 . XII 251: ^зтеРЬАК5РеЬгяеНегрег1раасее11ггГзГуайОК1

-><а-> ~~~<К->@®[Ьз=

* *** *

. XIII . XIV 330 340 350

301: ЬТвауеШИГвЫШИ)«!ПрОНЬЗбМегепаорт^Г&'Гяку.зЬ«?

Ьэ===] < -->"""~~@<Э '~~@<3(®@@{а(В<а@@"~

XV XVI 380 . 390 XVII 400 351: ghgshlclg«HLARReIIVTLKewltripdfsiapgaqiqhksgIVSGVQ ~@~~~~@@<Ь->@@@[= '=Ьо====

*** ж* * * **

. XVIII 420

401: а1р1уиВРАТТК я V

Рисунок 2. Расположение антигенных участков в а/к последовательности цитохрома Р450 101.

Обозначения: большими одновуквенными кодами выделены антигенные детерминанты (римскими цифрами указаны номера эпитопов); <--> -альфа-спирали. [==] - бета-листы, ~ - повороты, @ - петли и клубки; * - доступные для воды а/к остатки из антигенных участков.

которые позволяют установить поверхностные участки этого белка и сравнить их с полученными данными об антигенных детерминантах. Анализ доступности а/к остатков из состава антигенных детерминант для молекул воды и, следовательно, анализ расположения этих а/к остатков относительно поверхности цитохрома Р450 101 был проведен с помощью компьютерной программы ОЫХХ [16]. Результаты представлены на рисунке 2. Полностью доступными для молекул воды являются а/к остатки 6 антигенных детерминант (IV,V,IX,X,XIII,XVIII). Пять из них лежат в местах перехода одного элемента вторичной структуры в другой, одна находится на С-конце полипептидной цепи и имеет неупорядоченную конформацию. Шесть антигенных детерминант (1,111,VII,VIII,XI,XV) имеют более 602 доступных для воды а/к остатков. Пять антигенных детерминант (II,VI,XII,XVI,XVII) имеют 50-30% доступных для воды а/к остатков. При этом одна их этих детерминант (XVI) является срединным участком альфа-спирали Ь. Наконец, единственная антигенная детерминанта (XIV) не имеет доступных для молекул воды а/к остатков и, следовательно, не находится на поверхности белка. Этот факт может быть объяснен тем, что при иммунизации часть белкового препарата была денатурирована и поэтому были выработаны антитела к данному участку полипептидной цепи, который в нативном белке является недоступным для молекул воды [19]. Важно отметить, что гексапептид 33 (табл.1), который соответствует антигенной детерминанте (XIV), входит в группу наименее нммунодоми-нантных гексапептидов. Таким образом, из 18 определенных методом пептидного сканирования антигенных детерминант цитохрома Р450 101 семнадцать с разной степенью экспонированности находятся в доступных для молекул воды местах поверхности белка.

Расположение антигенных детерминант относительно функциональных участков а/к последовательности цитохрома Р450 101. Если антигенные детерминанты содержат в своем составе Функционально важные а/к остатки или элементы вторичной структуры, то антипептидные антитела к таким участкам являются мощным средством для изучения структурно-функциональных отношений в данном белке. Для цитохрома Р450 101 в составе выявленных линейных антигенных участков (указаны в круглых скобках римскими цифрами) или же в

[19] Arnon R., 1987, Synthetic Vaccines, CRC Press, Florida, USA.

непосредственной близости от них находятся следующие структурно-функциональые элементы [4,5,20,21]: 1) а/к остатки, участвующие во взаимодействии с редокс-партнерами, R72 (II), R112 (III), К314 (XIII), R364 (XV); 2) а/к остатки, взаимодействующие с про-пионовыми остатками гема, Q108 (III), R112 (III), D297 (XII), R299 (XII); 3) пятый аксиальный лнганд железа гема С357 (XV); 4) а/к остаток, принимающий участие в формировании протонного канала, Е366 (XVI); 5) компоненты цепи переноса протона К178 (VII), R186 (VIII); 6) а/к остатки, принимающие участие в связывании с субстратом, Т185 (VIII), V295 (XII), D297 (XII); 7) поверхностная петля, которая расположена над входом в активный центр, RPDGSMT (186-192, VIII).

Сравнение найденных и предсказанных различными методами антигенных детерминант цитохрома Р450 101. Для предсказания эпитопов были использованы следующие пять различных методов:

1) метод антигенного индекса [22] - в этом методе антигенная детерминанта рассматривается как гидрофильный, с подвижными боковыми группами, обладающий конформациями бета-поворота или клубка, доступный для молекул воды участок полипептидной цепи;

2) метод поиска бета-поворотов [23] - предпочтительным свойством антигенной детерминанты считается участие в бета-повортах;

3) метод поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами [24]; 4) метод поиска наиболее гидрофильных участков [25]; 5) метод антигенных мотивов [17] - в этом методе считается, что в состав антигенных детерминант входят линейные пептидные участки с жестко Фиксированной альфа-углеродной цепью белка. Результаты предсказаний и экспериментально найденные эпитопы цитохрома Р450 101 приведены в Приложении, рис. 1. Статистические параметры эффективности предсказаний линейных эпито-

[20] Bernhardt et al., 1990, Proc. of VHIth Int. Sypm. on microsomes and drug oxidations, Ingelnan-Sundberg M., Gustafsson J.-A., Orrenius S. (eds.), Karolinska Institutet, Stockholm, June 25-29, 1990, 47-48.

[21] Gotoh, 1994, Proc. of 8th Int. Conf. on Cytochrome P-450 Biochemistry, Biophysics and Mol. Biology, Lechner M.C. (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 279-284.

[22] Jameson and Wolf, 1988, CABI0S, 1988, 4, 181-186.

[23] Garnier et al., 1978, J. Mol. Biol., 120, 97-120.

[24] Karplus and Schulz, 1985, Naturwissenschaften, 72, 212-213.

[25] Hopp and Woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sei.USA, 78, 38243828.

пов цитохрома Р450 101 различными методами представлены в таблице 4. Из этих данных следует, что наиболее эффективным оказался метод поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами. Статистически достоверными также являются результаты, полученные с помощью метода антигенного индекса. В то же время методы гидрофильности, мотивов и бета-поворотов дают случайные предсказания. Таким образом, антигенные детерминанты цитохрома Р450 101 лучше всего соответствуют тем участкам а/к последовательности, для которых характерно наличие фрагментов с подвижными боковыми группами.

Таблица 4. Статистические параметры эффективности предсказаний антигенных детерминант цитохрома Р450 101 различными методами.

Метод Распределение Статистические

пред- аминокислотных параметры

сказания остатков по -

классам««> Чувст-

- Х2<6> витель- Точность<г>

А В С 0 ность<»>

1 Антигенный

индекс (А) 48 80 72 214 5-Я 0. .38 0, .40

2 Бета

повороты (В) 30 106 39 239 3.68 0, .23 0. .43

3 Подвижность

боковых

цепей (.Г) 35 93 25 261 23. ?Л 0. .27 0. .58

4 Гидро-

фильность(Я) 9 119 19 267 0.004 0. .07 0. .39

5 Мотивы (Я) 24 104 81 205 3.78 0, .19 0, .23

») А - число правильно предсказанных антигенных а/к остатков; В - число непредсказанных антигенных а/к остатков; С - число неправильно предсказанных а/к остатков: й - число непредсказанных неантигенных а/к остатков.

6) Расчет критерия Пирсона X2 был сделан по формуле: К2 = (|АО-ВС|-(А+В+С+О )/2)2(А+В+С+О) )/ < (А+В)(С+Р)(А+С)< В+В)) С26]; критические значения величины X2 составляют соответственно для уровня значимости 5Х - 3.84, для 2,5Х - 5.02, для 1% - 6.64, для 0.5Х - 7.88, для О.IX - 10.83; в таблице значимые величины критерия Пирсона подчеркнуты.

и) Чувствительность есть отношение числа правильно предсказанных а/к остатков к общему числу а/к остатков в антигенных детерминантах, то есть А/(А+В).

г) Точность есть отношение числа правильно предсказанных антигенных а/к остатков к общему числу предсказанных а/к остатков, то есть А/(А+С).

#

[26] Лакин В.И., 1989, Биометрия, М., Высшая Школа.

II. Антигенное картирование цитохрома Р450 2В4.

Результаты ELISA при сканировании гексапептидами полной а/к последовательности Р450 2В4. Для полного антигенного картирования цитохрома Р450 2В4 с использованием пиновой технологии было синтезировано 486 перекрывающихся со сдвигом рамки в 1 а/к остаток гексапептидов из а/к последовательности этого белка. Антигенная активность каждого из синтезированных гексапептидов определялась с помощью ELISA при взаимодействии с антисывороткой мыши к нативному цитохрому Р450 2В4. Результаты ELISA при разведениях антисыворотки 1:800, 1:400, 1:200 приведены на рисунке 3 (а-в). результаты ELISA о взаимодействии синтезированных гексапептидов с контрольной сывороткой при разведении 1:200 приведены на рисунке 3 (г). Данные ELISA о взаимодействии синтезированных гексапептидов с контрольной сывороткой при разведениях 1:800 и 1:400 показали наличие одинакового для всех анализируемых гексапептидов среднего фона оптической плотности, соответственно, на уровне 0,025 и 0,055 единиц, т.е., по сути дела, отсутствие связывания гексапептидов с контрольной сывороткой при данных разведениях. После статистической обработки результатов ELISA были выявлены гексапептиды, которые связывались с антисывороткой и контрольной сывороткой. Антигенными были признаны гексапептиды, которые связываются с антисывороткой и не связываются с контрольной сывороткой при разведении 1:200. В то же время, одиннадцать гексапептидов (со следующими номерами N-концов: 25, 28, 39, 40, 62, 67, 181, 182, 183, 186, 294), выявленные при разведении антисыворотки 1:200 и не выявленные при других разведениях антисыворотки, связывались с контрольной сывороткой и, таким образом, не могут считаться антигенными. Вероятнее всего, данные гексапептиды при разведении антисыворотки 1:200 неспецифически связываются с антителами. Обнаруженные антигенные гексапептиды представлены в таблице 5. А/к остатки, входящие в состав антигенных гексапептидов, образуют непрерывные антигенные детерминанты, представленные в таблице 6. В таблице 7 приведены данные о числе антигенных гексапептидов, антигенных детерминант и а/к остатков в составе антигенных детерминант при различных разведениях антисыворотки. Из представленных в этой таблице данных следует, что при увеличении концентрации антисыворотки (соответственно, при уменьшении раз-

1,0

0,5 -

0

(Си)

М+в

100 200 300 400 500

2.0

1,0 -I 0

■ А

|1, I ]

I I

I. ||

"'^■ТЧТ 'чяррирт*' "гр»»^1^

М-гв

О

100 200 300 400 500

3,0 2,0 1.0

О

Й,0

„ |1, , ,1 .¿1и I.

I . : ||

А тщгттт1 ? *т тщч1^ г|

М + 8

100 200 300 400 500

1,0 4

О -

. А 1 II .¡к

ЧН'И114]

С^)

М + 5

О 100 200 300 400 500

Рисунок 3. Связывание гексапептидов цитохрома Р450 2В4 с антисывороткой при разведениях 1:800 (а), 1:400 (б), 1:200 (в), и с контрольной сывороткой при разведении 1:200 (г). По оси абсцисс каждого графика показан номер пептида, по оси ординат -оптическая плотность при 405 нм. Порядковый номер пептида совпадает с порядковым номером его М-концевого а/к остатка в первичной последовательности белка.

Таблица 5. Антигенные гексапептиды цитохрома Р450 2В4.

# Антигенный гексапептид Связывание" с антисывороткой, разведенной в отношении

Положение N-конца А/к последовательность

1:200 1:400 1:800

1 93 EAFSGR ++ ++ +++

2 94 AFSGRG + + -

3 104 VDPIFQ + ++ ++

4 105 DPIFQG +++ ++ ++

5 108 PIFQGY + + +++

6 107 IFQGYG + ++ +++

7 108 FQGYGV + + ++

8 109 QGYGVI + ++ ++

9 112 GVIFAH + + -

10 143 EERIQE + + -

11 212 FSSQVF 4- + -

12 213 SSQVFE + + -

13 218 ELFPGF + ++ +++

14 219 LFPGFL + ++ ++

15 220 FPGFLK + ++ +++

16 221 PGFLKH +++ + +++

17 222 GFLKHF + + -

18 223 FLKHFP + ++ -

19 224 LKHFPG + ++ -

20 228 PGTHRQ +++ +++ -

21 229 GTHRQI + ++ -

22 230 THRQIY + ++ +++

23 231 HRQIYR + +++

24 242 HTFIGQ ++ + -

25 243 TFIGQS + + -

26 258 PSKPRD + +++ +++

27 259 SHPRDF ++ ++ ++

28 261 PRDFID + + +++

29 280 SSEFHH ++ + -

30 281 SEFHHQ ++ + -

31 282 EFHHQH ++ + -

32 283 FHHQHL +++ + -

33 284 HHQHLI +++ + +++

34 354 HEIQRL ++ +++ +++

35 374 DTQFRG + ++ ++

36 405 PHTFHP ++ ++ ++

37 407 TFHPGH +++ +++ +++

38 408 FNPGHF ++ ++ +++

39 417 HGALKR ++ ++ + 4-

40 422 RNEGFM ++ ++ ++

41 425 GFMPFS + ++ + +

42 467 DIDLTP + + ++ + +

43 468 IDLTPR +++ +++ +++

44 469 DLTPRE +++ +++ +++

45 470 LTPRES + + + +++ ++ +

46 481 PPSYQI ++ +++ +++

я) "-": А405 < M+s; "+": А40& > M+s, "++": A^os > M+2s; "+++": fi4os > M+3s.

ведения с 1:800 до 1:200) число выявленных антигенных гексапеп-тидов, начиная с разведения 1:400, остается неизменным. Подобная зависимость может быть объяснена тем, что по мере увеличения концентрации антисыворотки выявляются антигенные гексапептиды с меньшей иммунодоминантностью, чем те, которые были определены при больших разведениях антисыворотки. По достижении оптимальных условий иммунологического анализа выявляются все возможные гексапептиды, которые реагируют с антителами из данной антисыворотки. При слишком высокой концентрации антисыворотки наряду с действительно антигенными будут выявляться и такие гексапептиды, которые неспецифически взаимодействуют с антисывороткой. Таким образом, при антигенном картировании полной а/к последовательности цитохрома Р450 2В4 было выявлено 13 линейных антигенных детерминант длиной от 6 до 25 а/к остатков. В состав найденных антигенных детерминант входит 128 а/к остатков, что составляет 26% от их общего числа в белке.

Таблица 6. Непрерывные антигенные детерминанты цитохрома Р450 2В4, образованные антигенными гексапептидами.

Номер Расположение Длина Последовательность

I 93-99 7 ЕАРЗОЕЮ

II 104-117 14 УОРтОУвУ^АЫ

III 143-148 6 ЕЕИОЕ

IV 212-236 25 РвЗаУРЕЬРРОРЬКНРРСТНЕШУЛ

V 242-248 7 ЮТЮС^

VI 258-266 9 РБЫРЕШРЮ

VII 280-289 10 зэЕРНнеиы

VIII 354-359 6 НЕЮБЬ

IX 374-379 6 ОТ9Р1«3

X 405-413 9 РИТРИРСНР

XI 417-430 14 НСАЬКЙНЕбРМРРЗ

XII 467-475 9 ОЮЬТРЙЕЗ

XIII 481-486 6 РРБУ01

Таблица 7. Число выявленных антигенных детерминант, гексапепти-дов и а/к остатков цитохрома Р450 2В4 при разных разведениях антисыворотки.

# Антигенный Разведение антисыворотки в отношении

элемент 1:200 1:400 1:800

1 Детерминанта 13 13 11

2 Гексапептид 46 46 30

3 А/к остаток 128 128 93

Расположение антигенных детерминант относитехьно функциональных участков а/к последовательности цитохрома Р450 204.

Расположение в первичной а/к последовательности цитохрома Р450 2В4 антигенных детерминант относительно известных по литературным данным [2,27,28,29,30,31,32] структурно-функциональных участков показано на рисунке 4. Из рисунка видно, что эпитопы (I,II,IV,V,VII,IX,XII) расположены в районах предполагаемых субстратсвязывающих участков, эпитопы (11,111) находятся в местах предполагаемого взаимодействия с редокспартнерами. Таким образом, многие антигенные детерминанты цитохрома Р450 2В4 находятся в предполагаемых Функционально важных областях белка и, следовательно, могут быть использованы для получения антипептидных антител к ним с целью более точного установления роли таких участков в Функционировании цитохрома Р450 2В4.

Сравнение найденных и предсказанных различными методами антигенных детерминант цитохрома Р450 2В4. Для предсказания антигенных детерминант в а/к последовательности цитохрома Р450 2В4 нами были использованы те же самые методы, которые были применены в случае цитохрома Р450 101. Результаты предсказаний и экспериментально найденные эпитопы цитохрома Р450 2В4 приведены в Приложении, рис, 2. Статистические параметры эффективности предсказаний линейных эпитопов цитохрома Р450 2В4 различными методами представлены в таблице 8. Из этих данных следует, что наиболее эффективным оказался метод поиска бета-поворотов. Статистически достоверными являются результаты, полученные с помощью методов мотивов и поиска Фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами. В то же время, методы гидрофильности и антигенного индекса дают случайные предсказания. Таким образом, антигенные детерминанты цитохрома Р450 2В4 лучше всего соответствуют тем участкам а/к последовательности, для которых характерно наличие бета-поворотов.

[27] Uvarov et al., 1994, in press Eur. J. Biochen.

[28] Sakaguchi et al., 1994, Proc. of 8th Int. Conf. on Cytochrone P-450 Biochemistry, Biophysics and Hoi. Biology, Lechner H.C. (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 265-270

[29] Davydov et al., 1992, Arch. Bioche». Bioph., 297, 304-313.

[30] Frey et al., 1985, J. Biol. Chen., 280, 15253-15265.

[31] Gotoh, 1992, J. Biol. Chen., 267, 83-90.

[32] Korzekwa and Jones, 1993, Pharnacogenetics, 3, 1-18.

10 . 20 . 30 . 40 50

1: твГз11111а ^аёИШГ гёЬркаЬ£г1 ppgpsplpvl grlllqmdrkg

>@@@@ ++ ++++ + + + л

60 . 70 . 80 . 90 I . 100 51: 11гБПг1ге kygdvftvyl gsrpvvvlog tdairealvd даЕАРБОВйк

ФФфФФФФФтФ фш

II 110 . 120 . 130 . 140 III 150 101: 1яуУПРТРдг. удутРАНййг игяЧгг^Тя ет^йи^кг зуЕЕЕШЕеа

160 170 . 180 . 190 . 200

151: гс1уее!гкз кйаПапгП fhsitsniic kdpvflrlld

IV 220 . 230 V . 250

201: зРБЗЙУРЕЬР РвРЬКНЕРОТ НЕШУЯгИдв тНТР^ОБуе

. VI . 270 . VII . 290 . 300

251: кИга^РЭН Р{ФЕЮуу11 rmekdksdpS якрннднт.п »-.У! гг^.

310 . 320 . 330 . 340 . 350 301: Ттуд П1т1курЬу 1егудке1ед vigshr■pp&l ddrakJnpytd

VIII 360 . 370 IX 380 . 390 . 400 351: яутНКтдят.р ИТ трауры- vtkDTQ£Bílx у1ркп!еу£р vlsБalhdpr

X 410 . XI 420 . 430 . 440 . 450 401: уГе!РКТЕЯР ОНР^аНОАЬ ККНЕСРМРРЗ lgkriclgeg ха^еИ^

460 . XII XIII. 490 . 500

451: ^Идг^эха ^рурряПТПТ. ТРНЕЯ^удпу РРвУСЦгПа г

Рисунок 4. Относительное расположение антигенных детерминант и структурно-функциональных участков цитохрома Р450 2В4. Обозначения: большие однобуквенные коды - а/к остатки из антигенных детерминант (римскими цифрами обозначены номера эпито-пов); (@) - мембрансвяэанный Фрагмент; (+> - положительно заряженный кластер; - пролиновый кластер; ($) - предсказанные участки взаимодействия с редоке-партнерами; (£) - консервативный пептид, включающий 5-ый аксиальный лиганд гема (циетеин 436); подчеркнуты предсказанные еубстратсвязывающие участки.

Таблица 8. Статистические параметры эффективности предсказаний линейных эпитопов цитохрома Р450 2В4 различными методами.

Метод предсказания

Распределение аминокислотных остатков по классам<а>

Статистические параметры

А

В

С

Чувст-

хг<<з> витель- Точность<г> ность<в>

1 Антигенный

индекс (/3) 44 84 99 264 1.98 0, .34 0. .31

2 Бета

повороты (5) 41 87 30 333 41 .31 0, .32 0, .58

3 Подвижность

боковых

цепей (Л 28 100 41 322 7 87 0. .22 0. .41

4 Гидро-

фильностьСАО 9 119 12 351 2.36 0. .07 0. .43

5 Мотивы (#> 62 66 115 248 ю.7а 0. .48 0. .35

Обозначения: соответствуют принятым в таблице 4.

D

III. Анализ встречаемости антигенных пептидов из Р450 101 и Р450 2В4 среди других белков надсемейства цитохромов Р450.

Появление в каком-либо белке надсемейства цитохромов Р450 фрагмента из антигенных детерминант Р450 101 или же Р450 2В4 может свидетельствовать о том, что этот фрагмент является эпито-пом соответствующего белка-гомолога и, следовательно, между этими белками могут быть перекрестные иммунологические реакции.

Поиск среди надсемейства цитохромов Р450 белков с а/к последовательностями, идентичными антигенными детерминантам цитохрома Р450 101. Результаты поиска а/к последовательностей из антигенных детерминант цитохрома Р450 101 среди других представителей надсемейства цитохромов Р450 приведены в Приложении, табл. 1, и показывают высокую индивидуальность антигенных последовательностей цитохрома Р450 101. Только три пентапептидных фрагмента этого белка были найдены в трех цитохромах дрожжевого, бактериального и животного происхождения. Тетрапептидные фрагменты из антигенных детерминант цитохрома Р450 101 встречаются гораздо чаще и были обнаружены в белках самых разнообразных семейств. Почти все трипептиды из антигенных детерминант Р450 101 были найдены в других цитохронах Р450, причем некоторые

из этих пептидов встречаются часто и по несколько раз в одном и том же белке. Из приведенных данных следует, что, скорее всего, цитохром Р450 101 не будет участвовать в перекрестных иммунологических реакциях с другими представителями надсемейства за исключением, быть может, трех белков, с которыми у него имеются общие пентапептидные антигенные фрагменты.

Поиск среди надсемейства цитохромов Р450 белков с а/к последовательностями , идентичными антигенными детерминантам цитохрома Р450 2В4. Результаты поиска антигенных гексапептидов цито-хрома Р450 2В4 среди других представителей надсемейства цитохромов Р450 представлены в Приложении, табл. 2-4. Можно выделить несколько классов антигенных гексапептидов цитохрома Р450 2В4 в соответствии с их распространенностью среди а/к последовательностей надсемейства. Двадцать пять антигенных гексапептидов цитохрома Р450 2В4 найдено в цитохроме Р450 2В5. Эти два белка являются продуктами двух аллельных генов с 96%-ой идентичностью. Тем не менее, было найдено, что четыре гексапептида являются абсолютно специфичными для цитохрома Р450 2В4. Следовательно, в иммунологических анализах эти два белка будут различаться между собой даже несмотря на почти полную идентичность их а/к последовательностей. Важно отметить, что эти высокоспецифичные гекса-пептиды находятся в гипервариабельных областях [29]. От одного до шести антигенных гексапептидов из цитохрома 2В4 было найдено для каждого белка из подсемейства 2В. Три гексапептида оказались характерными для белков из семейства СУР2. Антигенных гексапептидов из цитохрома 2В4, которые встречались бы в белках других семейств надсемейства цитохромов Р450, найдено не было. В соответствии с вышеприведенными данными, наибольшее сходство антигенных детерминант цитохрома 2В4 наблюдается с цитохромом 2В5, среднее - с остальными представителями подсемейства 2В, слабое - с белками из других подсемейств семейства СУР2. Универсальных для всего надсемейства цитохромов Р450 антигенных гексапептидов обнаружено не было. Следовательно, если для белков из семейства СУР2 могут наблюдаться перекрестные иммунологические реакции и, вероятно, можно получить группоспецифичные антипептидные антитела, то для белков из всего надсемейства цитохромов Р450 сделать это не представляется возможным.

Экспериментальное подтверждение отсутствия перекрестных иммунологических реакций между между гексапептидами цитохромов Р450 101 и Р450 2В4. На основании вышеприведенных данных о том, что антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 не имеют между собой одинаковых антигенных гексапептидов, можно было предположить, что эти белки не будут вступать в перекрестные иммунологические реакции друг с другом. ЕЫЭА-эксперименты по связыванию антисыворотки, полученной к цитохрому Р450 101, с гексапептидами из а/к последовательности цитохрома Р450 2В4, а также антисыворотки к цитохрому Р450 2В4 с гексапептидами из а/к последовательности цитохрома Р450 101, показали отсутствие специфического связывания как в первом, так и во втором случаях. Таким образом, было экспериментально подтверждено, что отсутствие в цитохромах Р450 101 и Р450 2В4 одинаковых антигенных гексапептидов ведет к отсутствию перекрестных иммунологических реакций между такими белками.

ВЫВОДЫ.

1. Определены линейные антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 методом пептидного сканирования полных аминокислотных последовательностей этих белков.

2. С помощью кристаллографических данных о пространственной структуре цитохрома Р450 101 выявлено, что антигенные детерминанты этого белка являются его поверхностными участками и находятся, в основном, в местах перехода различных элементов вторичных структур друг в друга или же в непосредственной близости от таких мест.

3. Установлено, что многие антигенные детерминанты цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 находятся в функционально важных областях этих белков, что позволяет получить антипептидные антитела к таким областям.

4. Сравнение полученных экспериментальных результатов антигенного картирования цитохромов Р450 101 и Р450 2В4 с данными предсказаний антигенных детерминант для этих же белков показало, что метод гидрофильности дает наихудшие предсказания и не может считаться достоверным. Остальные использованные методы не имеют значительных преимуществ друг перед другом и поэтому должны использоваться совместно.

5. Экспериментально установлено отсутствие перекрестных иммунологических реакций между гексапептидами цитохромов Р450 101 и Р450 2В4. Обнаружено наличие некоторых антигенных пептидов цитохрома Р450 2В4 среди других белков семейства СУР2, что позволяет предполагать возможность существования перекрестных иммунологических реакций между цитохромами Р450 семейства СУР2.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kolesanova E.F., Koziri S.A., Lemeshko А.О., and Archakov A.I. (1994) Epitope Mapping of Cytochrome P450 2B4 by Peptide Scanning. Biochem. Mol. Biol. Int., vol. 32, no. 3, pp. 465-473.

2. Kolesanova E.F., Kozin S.A., and Archakov A.I. (1994) Cytochrome P450 2B4 Antigenic Determinants Revealed By Pepscan. Ire Proceedings of 8th International Conference on Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Lisbon, Portugal, 2428 October 1993, Lechner M.C. (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 1994, pp. 183-187.

3. Dedinsky I.R., Kozin 3.A., and Archakov A.I. (1994) Antigenic Determinants of Cytochrome P450 Superfamily and Their Classification. In: Proceedings of 8th International Conference on Cytochrome P450 Biochemistry, Biophysics arid Molecular Biology, Lisbon, Portugal, 24-28. October 1993, Lechner M.C. (ed.), John Libbey Eurotext, Paris, 1994, pp. 603-610.

4. Kolesanova E.F., Kozin S.A., Kiselar J.G. and Archakov A.I. (1994) Comparison Of Epitope Structures Of Microsomal And Microbial Cytochromes P450 As A Basis For Spatial Molecular Modelling The Microsomal P450s. Abstracts on 10th International Symposium on microsomes and drug oxidation, Toronto, Canada, 1994, July 18-21, p. 444.

Работа была выполнена в сотрудничестве с Anton Stier (Мах-Plank-Institute for Biophysical Chemistry, Gottingen, FRG), Gaston Hui Bon Hoa (INSERM-U310, Institut de Biologie PhysicoChimique, Paris. France), Christiane Jung (Max-Delbruck-Centrum fur Molekulsre M*dizin. Berlin-Buoh, FRG'*. Финансирование работы осуществлялось no гранту H.93-04-R227 Российского Фонда Фундаментальных Исследований и гранту М1КООО Международного Научного Фонда.

ПРИЛОЖЕНИЕ.

Таблица 1. Анализ частот встречаемости а/к последовательностей из антигенных детерминант цитохрома Р450 101 среди других белков надсемейства цитохромов Р450.

Положение в Р450 101 Последовательность Число совпадений, наименование белка, положение пептида в белке

Гексапептиды 0

Пентапептиды

63- 67 WIATR 1 (2Е1 13-17)

312-317 LKKGD 1 (СУР106 310-314)

313-318 KKGDQ 1 (52С2 406-410)

Тетрапептиды

63- 66 WIAT 2 (2Е1 13-16, СУР108 51-54)

112-115 RALA 1 (21А2 417-420)

113-116 AL АН 1 (2в1 117-120)

122-125 PVVD 4 (СУР19 368-371, 387-390)

142-145 LRPQ 10 (52А 141-144 - 168-171, 5201

139- 142)

149-152 HFTE 1 (СУРЮЗ 152-155)

213-216 QRPG 1 <2в1 128-131)

214-217 KPGT 1 (1А2 498-501)

228-231 VHGR 1 (2АЗ 333-336)

264-267 LARS 1 (СУР108 292-295)

298-301 GRIL 2 (11В1,11В2 383-386)

300-303 ILTS 3 (2С19 386-389, 2С21 379-372, 2С22

446-449)

312-315 LKKG 5 (СУР17 87-90 - 93-97, СУР106 310-

313)

313-316 KKGO 3 (СУР17р1й 180-183, 52С2 406-409,

СУР106 311-314)

324-327 LSGL 17 (1А1 ,1А2 82-85 - 90-93, 4А4, 4А5,

4А6 15-18, 52С2 44-47, 105С1 194-197)

359-362 GQHL 1 (СУР108 379-382)

360-363 QHLA 3 (11В2, 11ВЗ 436-439)

368-371 IVTL 1 (4А6 410-413)

369-372 VTLK 4 (ЗАЗ-7 169-172 - 170-173)

398-399 SGVQ 1 (4В1 291-294)

т г

Таблица 2. Встречаемость антигенных гексапептидов цитохрома Р450 2В4 среди других белков из надсемейства цитохромов Р450.

Положение Н-конца и Белки

# а/к состав гексапептида

112 212 213

143

261

467

GVIFAK FSSQVF SSQVFE

EERIQE

PRDFID

DIDLTP

Подсемейство 2В

2В1,2,4,6,7,10 2В1,2,4,5 2В1,2,4,5,12 Семейство CYP2

2В1,2,4,5,6,7,10,11, 2АЗ,4,5,6,7, 2СЗ, 2G1, 2Н1,2, 2J1 2В1,2,3,4,5,10,11,12, 2АЗ, 2А4,5,6,8, 201,2,4,5,8,11, 2012,13,14,16,21,26,27,28, 2Е1,2, 2F2, 2G1, 2Н1.2 2В1,2,4,5,6,7,9,10,11,12, 2F1,2

4

5

6

Таблица 3. Индивидуальные и общие с 2В5 антигенные гексапептиды цитохрома Р450 2В4.

Цитохромы Р450 Положение Н-конца

антигенных гексапептидов

2В4 243,281,284,417

2В4 и 2В5 104,105,106,107,218,219,220,221,222,

223,224,229,230,231,242,280,374,405, 407,408,422,425,468,469,470

Таблица 4. Встречаемость антигенных гексапептидов цитохрома Р450 2В4 среди цитохромов из подсемейства 2В.

# Белок Сходство а/к Число идентичных

последовательности с 2В4, % гексапептидов

1 2В1 rat 77 6

2 2В2 rat 77 6

3 2ВЗ rat 69 1

4 2В5 rabbit 98 25

5 2В6 human 77 3

6 2В7 human 77 3

7 2В9 mouse 72 1

8 2В10 mouse 67 4

9 2В11 dog 77 3

10 2В12 rat 70 3

10 . 20 . 30 . 40 50

1: ТТЕМчзпап 1ар1ррЬуре Ы'^с!Гс1туп рэпХяайуде анау^еЗИУ А

1: ^еМдзНАН Ьар1РРНУре hlvfdfdmyH РБЫХваауде аиау1че5ПУ В

1: ttetiqsnaп 1ар1ррЬуре hlvfdfdшyn psnls8gvqe анауЬЩЕБЫУ Е

1: ^еМдзпап 1ар1ррЬуре ЫvfdFdшyn psnlsagvqe аиау1яезпу Я

1: ^еМдэпап ТаРЬРРНУРЕ Ыvfdfdlnyn psnlsagvqe аиау1дезпу М

60 70 . 80 . 90 100

51: рН1уц*тч>п<* тИКАУЕПУГт Е53ЕсрПРР ЕАОЕауаПр А

51: pdlzнtrCHG ОНихаХЕйШ_iteayedyrh ГЗБЕСрПрг В

51: ghиint.rgq^ дгеауег!угЬ ГззесрГ1рг eageaydfip Р

51: рНТуи^гопй ^Ьитя^т^дТ 1грну^угЪ ГззесрМрг eageaydfip Я

51: ра1хн£гсп.й йЬнХаЬсааЗ-Огеау^угЬ ГевеоРЕ1РВ ЕА0ЕауРР1Р И Г II

110 120 130 . 140 150

101: 13М0РРЕвВв_£га1аш}УУй щазгШШгНВ 1де1аевНе ЗЬВЕ0^еп£ А

101: 15ваРРЕагц_Сга1апаууй тпрууНкТепг 1че1аезНе я1гРЯб9сп£ В

101 •. 1зтОРРЕОВа-Еха1апа'/уй вдшШепг 1де1ях-зИе зЬВЕЩКЗСпг Е

101: ^тНрррд-гд <У»1япдуу? трууПКТ.КН В 19Е1ас51ле аЗхрвечхлЕ Я

101: ТзякЗрреага ГгпТвпд-^ Чпрт?ак1КМВ 10Е1асзИЕ ЗЬВОД19сп£ И III IV V VI

160 . 170 . 180 . 190 . 200

151: ХЕПХАерГр1 г1Гш11ае1Р ЕЕРТрЫку! ¡^ШИВЕйОз ю!ГаеАКеа1 А

151: ¿еЛуаерГр! rifв^laglp ееатрЫку! ±х!аи1ЛЕШЗ и!Гаеакеа1 В

151: 1е£1уаерГрх г1Гп11ад1,Р ЕЕПТРЫЦу! каГаеакеа1 Г

151: 1аЛуаерГр1 rifnllaglp £с1ов£хв*&5 и^аеакеа1 Я

151: ¿е£1хаеРГР1 г1?т11айЪР eed^^ph^^hyl ¿аяиЬгЕШэ вОТАЕакеа1 И

VII VIII

210 . 220 . 230 . 240 . 250

201: ydylipiiEQ КВаШИМа! 51уапааУНа ЧРТТЯПЕАКг lncglllvggl А

201: ydylipiieq гзсцКЕОЗМа! дхУАНОдупа гртТЯРЕакг юcglllvggl В

201: ydylipiieQ ЯЯдКРЯТГ)я1 ятуяпДдуНЯ ИРТТЯПЕАЬг mcglllvggl Р

201: ydylipiiEQ ВЙЯКРйТ0а1 з1уапа$утя_«и±заеакг mcglllvggl Я

201: ydy^ipiiEQ ВЯдкреМа1 эхуапйдупП ЙРИ.^еакг псб11Ьгвв1 М IX X

Рисунок 1. Найденные и предсказанные линейные эпитопы цитохрома Р450 101 (начало).

260 . 270 . 280 . 290 . 300

251: с^уупПеГб теПпКЯРЕН КбЕГДЕРРЕЯ 1раасЕЕ1Лг гГе1уас!йг1 А

251: те£1ак£ЕЕН rqelieRPER храасееПг г£б1УА0Сг1 В

251: dtvvnflsfs гоеП.АКйРЕН ^еПегрег 1раасее11г г£з1уайеп1 Р

251: dtvvnflsfs иеЮаЬзееЬ К<аЕ1ЛЕКРЕВ 1раасее11г гГе1уайй£х Я

251: dtvvnflsfs теПаКЯРЕН НОЕЫЕЙРЕН 1Раасее11г гГ51ЛА0£е1 Я XI XII

310 . 320 . 330 . 340 . 350

301: Ц^уеГИду дТ.ШЗДатП ртОзеШЕЙ ЕМаершЬуаЕ ЗИбКузЬиг А

301: ТТЯРУе^ат аТккаааШ рдпТий^ег eпaopшhvdf егякУзИЪгГ В

301: ЦдауеШГУ аТ.ККДПЙТП раь1г5йиег епасрп^Р srqkvshttf ^

301: Н.г^уеГЬеу д!ккй»1д111 равТг^^ег епасртЬуйГ згакУаМ^Г Я

301: ЛЬаОУЕЕНаХ-ШЯЕШШИ епасрюЬуРЕ SRQKVSHttf Я

XIII XIV

360 . 370 . 380 . 390 400

351: ёЬгёзЫс^д МАЯНет ТУЪ 1кеу11:г1^ fsiapgaqiq Ькей1згз£1са А

351: ghgshlclga■.Jl^arгeiту|. 1 кечПгipd fsiapgaqiq НКБОхзгавед. В

351: ghëshlclgq ЫпггеЛу!. Ткеч^гз^ fsiapgaqiq Ьк8й±каез£о. ?

351: ghgshlclga Ы аггеЛ у Е ^kewltripd fsiapgaqiq ЬкЕ^ту^уа Я

351: дЬ^Ы г-1 рг| Ыя1^^^p^^vt И.рцЧТ1?ТРП fsiapgaqiq Я XV XVI XVII

410 . 420 . 430 . 440 . 450

401: а1р1уис1ра1__Ц£.ау А

401: яТрТуиПРАТ 1кяу В

401: а1р1у«<1ра±_£кау Р

401: я 1 р! уыНряЕ 1-кяу Я

401: яТрТуцНря*. ^кяу Я XVIII •

Рисунок 1. Найденные и предсказанные линейные эпитопы цитохрома Р450 101 (окончание).

Обозначения: экспериментально определенные линейные эпитопы обозначены подчеркнутыми символами и римскими цифрами; в строке А заглавными буквами обозначены участки, предсказанные методом антигенного индекса, в строке В - методом поиска бета-поворотов, в строке Р1 - методом поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными боковыми группами, в строке Я - методом поиска наиболее гидрофильных участков, в строке Я - методом мотивов.

10 . 20 . 30 40 50

1: mefsllllla flaglllllf rgHPKAHGRl ppgpsplpvl gnllqmDRKG A

1: mefsllllla flaglllllf rghpkahgrl PPGPSPlpvl gnllqmDRKG В

1: mefsllllla flaglllllf rghpkahgrl PPGPSPLpvl gnllqmdrkg F

1: mefsllllla flaglllllf rghpkahgrl ppgpsplpvl gnllqmdrkg Я

1: mefsllllla flaglllllf rGHPKAHGRL PPGPSPLPVL Gnllqmdrkg fi

60 . 70 . 80 . 90 100

51: llrsf1RLRE Kygdvftvyl gsrpvvvlcg tdaiREalvd qaeAESGRGK A

51: llrsfIrire kygdvftvyl gsrpvvvlcg tdairealvd qaeafsGBGK В

51: llrsfIrire kygdvftvyl gsrpvvvlcg tdairealvd qafiaESGBSK F

51: llrsfIrire kygdvftvyl gsrpvvvlcg tdairealvd qaeafs£r£k H

51: llrsf1RLRE KYGDVFTvyl GSRPvvvlcg TDAlRealvd qaEAESGBGK H

I

110 . 120 130 . 140 . 150

101: iavyrlpifag ygvifanGER WF.ALRrfsla tmrdfGHGKR SVEEHIflEEA A

101: i я wripi fqg yg-gifan^py wralrrfsla tmrdfgmgkr sveexiafiea В

101: Iawrtpifqg ygYifanger wralrrfsla tmrdfgmgkr sveeriafiea F

101: ixwripifqg yggifungar wralrrfsla tmrdfgmgkr svEEHIQEEA H

101: invrgnPTPqñ ygg-ifBWnKR wralRRFSla tmrdfgmgkr svaeniijfiea M II III

160 . 170 180 . 190 . 200

151: RclvEELRKS Kgalldntll fhsitsniic sivfgKRFDY KDpvflrlld A

151: rclveelrks kgalldntll fhsitsniic sivfgkrfdy kdpvflrlld В

151: rclveeLRKS KGAlldntll fhsitsniic sivfgkrfdy kdpvflrlld F

151: Rclveelrks kgalldntll fhsitsniic sivfgkrfdy kdpvflrlld H

151: rclveelrks kgalldntll fhsitsniic sivfgKRFDy kdpvflrlld И

210 . 220 . 230 . 240 . 250

201: lffqsfslis Bfwtijvfftif ppfihhfpfíT ьвдтутЩдя intfigaavE A

201: lf fqsfslis PfíVThhFPRT ЬтдтутпТд» intUlfioave В

201: lffqsfslis «fi^vft.if pgflfchfpgt hTqivi-nlqg int.figqBve F

201: lffqsfslis ^fw^fglf pgnfchfpgt hyqiyrnlQft int.figqsve Я

201: lffqsfslis Rfa^qvft-lf pgflhHFPr.T hrqiyrnlqft int.fi ЙЯЯУЕ M IV V

Рис. 2. Найденные и предсказанные линейные эпитопы цитохрома Р450 2В4 (начало).

260 . 270 . 280 . 290 . 300

251: кЬгаИСЕаН_ЕШ1£1£1уу11 гтекОКЗОРЗ-ЗиТЫищИ! ^^ит&ёЬ В

251: кЬга110Е2Ы_ЕВП£Ыуу11 гшекаКЗОРБ-БЕШщШ-П tvlslffagT Р

251: кЬгаГЛавкп_рпШи1уу11 ВМЕКОКЗОРБ-аЕШищиИ Я

251: КНВАТЬОЕай-ЕШШД^И гтЕКПКЯНрК ЯЕРННдпТт! tvlвlffagt М VI VII

310 . 320 . 330 . 340 . 350 301: уё Г11ш1курЬу у1бЗНКРРАЬ ООИАКшруъа .4

301: е(:Ьз^1гу£ Г11т1курЬу tervqkeieq vigshrppal Йс1гакиру1с1 В 301: ЕТТЗТТ1гуй Шт1курЬу tervqkeieq vigshrppal ас1гактру1а ¥ 301: ettsttlryg П1т1курЬу tervqkeieq vigshrppal ddrakюpytd И 301: П1ю1курЬу tERVQKEieq уЮЭНВРра! аагактру!а М

360 . 370 . 380 . 390 . 400

351: ауШилШй ¿Нргбур^ УТКВТаЕгйу vipk¡-|tevfp у1зза1Н0РК А

351: ауШелшО^ dlipfgvpht уТКОХо£е£У у1РКНТ&УГр у1зза1Ь0РВ В

351: аУ1Ъвтдг1ё dlipfgvpht у1к1Иа£хбУ У1РКИТЕУГР у1ззэ.1Ьдрг ¥

351: яутЬятдт-Тд dllpfgvpht у1кги.дГгеу у1ркп!еуГр у1зза1Мрг И

351: ъуЦШЩВЬв ПИРГвУРНТ УТКс1±а££СУ У1Ркп1еуГр у135АЬНРрг Н VIII IX

410 . 420 430 440 . 450

401: YFRt.pnt.fnp йЫПг1япйАТ. КИН^еУдрГя 1аг1е1ПГГ А

401: уяртрнтгнр онгтняп^а! ктпярГИРРк 1акПс1йей ¿а^еШГГ В

401: yfet.pnt~.fnp ДЬПазпаяТ. КЯНКЯРир^ 1ёкг1с1ёей ¥

401: yfetpnt■fnp йЬПаэпав! ктпеДГирГк lgkric•lgeg ха^еиНГ И

401-. yfet.pnt.fnp аЬГЫяНЯДТ. УННК^вРРЯ ЬОкПсЫЕС 1АИ1е1ПГГ Н X XI

460

451: ^¿.^г^э^а э 451: ttilqгlfsia Б 451: з

451: ttilqnfsia 451:

470

XII

480

490

V №зуо±гГ1а

IV ЕЕ5Хц±гГ1а рряудтгГ1а

V рряудт1 я

еоЯХШЖХа XIII

500

А В ¥ Я

а

Рис. 2. Найденные и предсказанные линейные эпитопы цитохрома Р450 2В4 (окончание).

Обозначения: экспериментально определенные линейные эпитопы обозначены подчеркнутыми символами и римскими цифрами; в строке А заглавными буквами обозначены участки, предсказанные методом антигенного индекса, б строке В - методом поиска бета-поворотов, в строке ^ - методом поиска фрагментов полипептидной цепи с подвижными Соковыми группами, в строке Н - методом поиска наиболее гидрофилышх участков, в строке И - методом мотивов.

Типография - ИБМХ РАМН.

Отпечатано на Ризографе "Gestetner CopyPrinter 532&'

Институт Биомедицинской химии Российская Академия Медицинских Наук

119832 Москва, Россия, ул Погодинская 10

Телефон: (095) 246-6980, (095) 246-3466 Факс: (095) 245-0857

Эл. почта: ¡nst@ibmh.msk.su